JP2021503284A - 形質転換ヒト細胞およびその使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、形質転換ヒト細胞およびその使用に関し、より具体的には、ガイドRNAを使用する遺伝子発現抑制システムを使用することによりMHC I細胞膜レセプターおよびMHC II細胞膜レセプターをコードする遺伝子が変形した細胞およびその使用に関する。かかる形質転換細胞は生体内でさえも細胞の治療効果を効果的に示すことができ、かつ生体内免疫応答により除去されない。したがって、有効成分として当該免疫細胞を含む組成物は癌、感染性疾患、変性疾患または免疫学的疾患の治療のために有効に使用され得ることが期待される。
Description
本発明は、形質転換ヒト細胞およびその使用に関し、より具体的にはガイドRNAを介して形質転換されたヒト細胞およびその使用に関する。
癌または感染性疾患の治療法として、患者の免疫機能を利用した免疫療法が注目されている。免疫療法は、NK細胞、T細胞、樹状細胞等の免疫細胞の相互作用を介する疾患の治療方法を意味する。これらのうち、ある抗原に特異的なキメラ抗原受容体を発現する遺伝子組換えT細胞を用いる免疫療法が現れている。また、生体外で活性化されることにより高い細胞毒性を持たせたNK細胞が白血病などの血液がんに対して優れた治療効果を示すことが報告されている(Blood Cells Molecules&Disease,33:p261−266,2004)。
一方、上述したように癌または感染性疾患の治療薬としての免疫細胞の可能性にもかかわらず、患者の体内に存在する免疫細胞は健康な人に比べて機能および数の観点からは顕著に少ない。したがって、自己免疫細胞を利用するよりも、同種免疫細胞の移植を利用する方がより効果的である。しかし、同種免疫細胞を移植される場合には、移植拒絶反応や生体内での非自己認識による免疫異物除去(immunological elimination)など、いくつかの問題が生じる可能性がある。したがって、これらの欠点を克服するために、同種免疫細胞を自己として認識させつつ、同種免疫細胞を細胞バンク化する代替手段が求められている。
発明の開示
技術的課題
上記課題を解決するために、本発明者らは、細胞においてMHC I細胞膜レセプターをコードする遺伝子およびMHC II細胞膜レセプターをコードする遺伝子を標的化するガイドRNAを合成した。さらに、本発明者らは、有効成分としてガイドRNAおよびNAガイドエンドヌクレアーゼ(RNA−guided エンドヌクレアーゼ)を含む遺伝子発現を阻害するための組成物を使用してMHC I細胞膜レセプターおよびMHC II細胞膜レセプターの発現が阻害されている細胞であって、HLA−Eが前記細胞への生体内における免疫異物除去が防止されるようにそこに導入されてもよい細胞を調製した。
技術的課題
上記課題を解決するために、本発明者らは、細胞においてMHC I細胞膜レセプターをコードする遺伝子およびMHC II細胞膜レセプターをコードする遺伝子を標的化するガイドRNAを合成した。さらに、本発明者らは、有効成分としてガイドRNAおよびNAガイドエンドヌクレアーゼ(RNA−guided エンドヌクレアーゼ)を含む遺伝子発現を阻害するための組成物を使用してMHC I細胞膜レセプターおよびMHC II細胞膜レセプターの発現が阻害されている細胞であって、HLA−Eが前記細胞への生体内における免疫異物除去が防止されるようにそこに導入されてもよい細胞を調製した。
したがって、本発明の目的は、MHC I細胞膜レセプターをコードする遺伝子およびMHC II細胞膜レセプターをコードする遺伝子を標的化するガイドRNAを提供すること、および前記ガイドRNAを使用して形質転換された細胞を提供することである。
課題を解決するための手段
上記目的を達成するために、本発明は、β2−ミクログロブリン(B2M)をコードする核酸配列に相補的に結合するガイドRNAであって、配列番号1、配列番号6、配列番号17、および配列番号26からなる群から選択されるいずれか1つの核酸配列を含むガイドRNA;HLA−DQをコードする核酸配列に相補的に結合するガイドRNAであって、配列番号64、配列番号65、配列番号87、および配列番号90からなる群から選択されるいずれか1つの核酸配列を含むガイドRNA;HLA−DPをコードする核酸配列に相補的に結合するガイドRNAであって、配列番号123または配列番号129の核酸配列を含むガイドRNA;およびHLA−DRをコードする核酸配列に相補的に結合するガイドRNAであって、配列番号186、配列番号188、および配列番号225からなる群から選択されるいずれか1つの核酸配列を含むガイドRNA、を提供する。
上記目的を達成するために、本発明は、β2−ミクログロブリン(B2M)をコードする核酸配列に相補的に結合するガイドRNAであって、配列番号1、配列番号6、配列番号17、および配列番号26からなる群から選択されるいずれか1つの核酸配列を含むガイドRNA;HLA−DQをコードする核酸配列に相補的に結合するガイドRNAであって、配列番号64、配列番号65、配列番号87、および配列番号90からなる群から選択されるいずれか1つの核酸配列を含むガイドRNA;HLA−DPをコードする核酸配列に相補的に結合するガイドRNAであって、配列番号123または配列番号129の核酸配列を含むガイドRNA;およびHLA−DRをコードする核酸配列に相補的に結合するガイドRNAであって、配列番号186、配列番号188、および配列番号225からなる群から選択されるいずれか1つの核酸配列を含むガイドRNA、を提供する。
さらに、本発明は、有効成分としてガイドRNAもしくはガイドRNAをコードするヌクレオチド配列ならびにRNAガイドエンドヌクレアーゼもしくはRNAガイドエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子発現を阻害するための組成物を提供する。
さらに、本発明は、MHC I細胞膜レセプターおよびMHC II細胞膜レセプターの発現が阻害されている形質転換細胞を提供する。
さらに、本発明は、有効成分として形質転換細胞を含む癌、感染性疾患、変性疾患、遺伝性疾患、または免疫疾患を治療するための医薬組成物;および対象に前記組成物を投与することを含む癌、感染性疾患、変性疾患、遺伝性疾患、または免疫疾患を治療するための方法を提供する。
さらに、本発明は、癌、感染性疾患、変性疾患、遺伝性疾患、または免疫疾患を治療するための形質転換細胞の使用を提供し、ここで、形質転換細胞においてMHC I細胞膜レセプターおよびMHC II細胞膜レセプターの発現が阻害されており、かつ形質転換細胞が細胞膜表面で改変MHC I細胞膜レセプターに結合したG−ペプチドなどのペプチド抗原を発現する。
本発明の有利な効果
本発明に従ったガイドRNAを用いる遺伝子発現阻害システムを用いて、MHC I細胞膜レセプターをコードする遺伝子およびMHC II細胞膜レセプターをコードする遺伝子が改変された細胞を調製することができる。また、G−ペプチド等のペプチド抗原が結合したHLA−Eを細胞に追加導入することができる。上記のように形質転換された細胞は、生体内でも治療効力を効果的に示すことができ、生体内での免疫応答によって排除されない。したがって、有効成分として前記細胞を含む組成物は、癌、感染性疾患、変性疾患、遺伝性疾患、または免疫疾患の治療のために有用に使用され得ることが期待される。
本発明に従ったガイドRNAを用いる遺伝子発現阻害システムを用いて、MHC I細胞膜レセプターをコードする遺伝子およびMHC II細胞膜レセプターをコードする遺伝子が改変された細胞を調製することができる。また、G−ペプチド等のペプチド抗原が結合したHLA−Eを細胞に追加導入することができる。上記のように形質転換された細胞は、生体内でも治療効力を効果的に示すことができ、生体内での免疫応答によって排除されない。したがって、有効成分として前記細胞を含む組成物は、癌、感染性疾患、変性疾患、遺伝性疾患、または免疫疾患の治療のために有用に使用され得ることが期待される。
発明を実施するための最良の形態
本発明の一態様では、β2−ミクログロブリン(B2M)をコードする核酸配列に相補的に結合するガイドRNAであって、配列番号1、配列番号6、配列番号17、および配列番号26からなる群から選択されるいずれか1つの核酸配列を含むガイドRNAが提供される。
本発明の一態様では、β2−ミクログロブリン(B2M)をコードする核酸配列に相補的に結合するガイドRNAであって、配列番号1、配列番号6、配列番号17、および配列番号26からなる群から選択されるいずれか1つの核酸配列を含むガイドRNAが提供される。
本明細書中で使用される「B2M」という用語は、MHC Iの構成要素であるβ2−ミクログロブリンタンパク質を指す。B2Mは細胞表面のMHC I細胞膜レセプターの発現に必須であり;B2Mが除去されるか、または改変されると、細胞表面でのMHC I細胞膜レセプターの発現が起こりにくくなる。したがって、MHC I細胞膜レセプターの機能はB2Mの遺伝子を改変することにより除去されてもよい。
B2Mをコードする核酸配列に相補的に結合するガイドRNAは、配列番号1−58からなる群から選択されるいずれか1つであってもよく、具体的には、配列番号1、配列番号6、配列番号17、および配列番号26からなる群から選択されるいずれか1つであってもよい。
さらに、本発明の一態様では、HLA−DQをコードする核酸配列に相補的に結合するガイドRNAであって、配列番号64、配列番号65、配列番号87、および配列番号90からなる群から選択されるいずれか1つの核酸配列を含むガイドRNAが提供される。
本明細書中で使用される「HLA」という用語はMHC遺伝子の産物であるヒト白血球抗原を指す。HLAはHLA IおよびHLA IIから構成される。HLA Iは、HLA−A、HLA−B、およびHLA−Cを含んでもよい;およびHLA IIは、HLA−DQ、HLA−DP、およびHLA−DRを含んでもよい。
本明細書中で使用される「HLA−DQ」という用語は、MHC IIを構成するαβヘテロダイマーを指す。DQはHLA−DQA1およびHLA−DQB1からなる。αサブユニットはHLA−DQA1遺伝子によりコードされ、βサブユニットはHLA−DQB1遺伝子によりコードされる。MHC II細胞膜レセプターの発現はDQの遺伝子を改変することにより阻害されてもよい。
DQをコードする核酸配列に相補的に結合するガイドRNAは、配列番号59−116からなる群から選択されるいずれか1つであってもよく、具体的には、配列番号64、配列番号65、配列番号87、および配列番号90からなる群から選択されるいずれか1つであってもよい。
本発明の別の態様では、HLA−DPをコードする核酸配列に相補的に結合するガイドRNAであって、配列番号123または配列番号129の核酸配列を含むガイドRNAが提供される。
本明細書中で使用される「HLA−DP」という用語は、DPαサブユニットおよびDPβサブユニットからなるコードされたMHC II細胞表面レセプターを指す。DPαはHLA−DPA1によりコードされ、DPβはHLA−DPB1によりコードされる。MHC II細胞膜レセプターの発現はDPの遺伝子を改変することにより阻害されてもよい。
DPをコードする核酸配列に相補的に結合するガイドRNAは、配列番号117−175からなる群から選択されるいずれか1つであってもよく、具体的には配列番号123または配列番号129であってもよい。
さらに、本発明のさらに別の態様では、HLA−DRをコードする核酸配列に相補的に結合するガイドRNAであって、配列番号186、配列番号188、および配列番号225からなる群から選択されるいずれか1つの核酸配列を含むガイドRNAが提供される。
本明細書中で使用される「HLA−DR」という用語は、MHC II細胞表面レセプター、具体的にはMHC II細胞表面レセプターを構成するαβヘテロダイマーを指す。HLA−DRの各サブユニットは2つの細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質尾部を含有する。MHC II細胞膜レセプターの発現はDRの遺伝子を改変することにより阻害されてもよい。
DRをコードする核酸配列に相補的に結合するガイドRNAは、配列番号176−234からなる群から選択されるいずれか1つであってもよく、好ましくは配列番号186、配列番号188、および配列番号225からなる群から選択されるいずれか1つであってもよい。
本明細書中で使用される「ガイドRNA(gRNA)」という用語は、標的DNAを特異的に認識しヌクレアーゼと複合体を形成し、それにより前記ヌクレアーゼを前記標的DNAに誘導するRNA分子を指す。
ガイドRNAは原核生物のクラスター化され、規則的に間隔を空けられた、短いパリンドローム反復(CRISPR)システムに由来するガイドRNAであってもよい。
ガイドRNAは非天然に存在するキメラcrRNA配列を含有してもよく、crRNA配列は標的配列にハイブリダイズできる可変標的ドメインを含有してもよい。
さらに、ガイドRNAはB2M、HLA−DQ、HLA−DP、およびHLA−DR遺伝子のそれぞれについての相補配列を含有する。細胞に送達された後、ガイドRNAは前記標的配列を認識でき、RNAガイドエンドヌクレアーゼと複合体を形成できる。
本発明のさらに別の態様では、有効成分としてガイドRNAもしくはガイドRNAをコードするヌクレオチド配列ならびにRNAガイドエンドヌクレアーゼもしくはRNAガイドエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子発現を阻害するための組成物が提供される。
RNAガイドエンドヌクレアーゼはmRNAまたはタンパク質の形態で送達されてもよいし、またはそれをコードするDNAを担持したベクターを使用して形質転換により標的細胞に送達されてもよい。タンパク質の形態でエンドヌクレアーゼが使用される場合、前記エンドヌクレアーゼはガイドRNAと複合体を形成することにより得られるRNP複合体として機能してもよい。
本明細書中で使用される「RNP複合体」という用語は、有効成分としてガイドRNAおよびRNAガイドエンドヌクレアーゼを含む複合体を指し、ここで前記複合体は標的配列を認識し、結合でき、それにより選択的に前記標的配列にニックを入れ(nicking)または開裂させる。RNA複合体は例えば、Cas9−gRNA複合体であってもよいが、これに限られない。
本発明の実施形態では、RNAガイドエンドヌクレアーゼは、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas13a、Cas13b、Cas13c、Cas13d、Cpf1、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、およびCsf4からなる群から選択されるいずれか1つであってもよく、具体的にはCas9であってもよい。
本発明の一態様では、MHC I細胞膜レセプターおよびMHC II細胞膜レセプターの発現が阻害されている形質転換細胞が提供される。
本明細書中で使用される「発現阻害」という用語は、標的遺伝子の機能における減少を引き起こすヌクレオチド配列上の改変を意味し、好ましくはかかる発現阻害により標的遺伝子の発現は検出不能となるか、または標的遺伝子が無意味なレベルに発現することを意味する。
本発明の実施形態では、形質転換細胞は細胞膜表面でペプチド抗原を発現してもよい。ペプチド抗原の例は、HLA−A、HLA−B、HLA−C、およびHLA−Gのシグナルペプチドを含むがこれらに限定されず、かつ前記ペプチド抗原は具体的にはHLA−Gのシグナルペプチド(G−ペプチド)である。前記ペプチド抗原は、改変MHC I細胞膜レセプターに結合していてもよい。
本発明の実施形態では、改変MHC I細胞膜レセプターはHLA−EおよびB2Mが結合している構造を有する。具体的には、改変MHC I細胞膜レセプターにおいて、B2MのC末端は第一リンカーを介してHLA−Eのα1のN末端に結合していてもよく、かつG−ペプチドのC末端は第二リンカーを介してB2MのN末端に結合していてもよい。改変MHC I細胞膜レセプターはHLA−GおよびB2Mが結合している構造を有していてもよい。
本発明の実施形態では、G−ペプチドは、配列番号236の配列を有していてもよい;HLA−Eは、配列番号240の配列を有していてもよい;B2Mは、配列番号237の配列を有していてもよい;および第一リンカーは、(G4S)n(nは1−5の整数である)であってもよく、ある実施形態では配列番号238の配列を有していてもよい。第二リンカーは、(G4S)n(nは2−6の整数である)であってもよく、配列番号241の配列を有していてもよい。
本発明の実施形態では、MHC I細胞膜レセプターをコードする遺伝子の改変はB2Mをコードする核酸配列に相補的に結合するガイドRNA(例えば、配列番号1、配列番号6、配列番号17、または配列番号26)を使用して実施されてもよい。具体的には、MHC Iの改変は、単一ガイドRNAを使用して単一の欠失により実施されてもよい。
本発明の実施形態では、MHC II細胞膜レセプターをコードするDQ、DP、およびDR遺伝子の改変はDQをコードする核酸配列に相補的に結合するガイドRNA(例えば、配列番号64、配列番号65、配列番号87、または配列番号90)、DPをコードする核酸配列に相補的に結合するガイドRNA(例えば、配列番号123または配列番号129)、およびDRをコードする核酸配列に相補的に結合するガイドRNA(例えば、配列番号186、配列番号188、または配列番号225)を使用して実施されてもよい。MHC IIの改変はMHC Iの改変と共に実施され、複数のガイドRNA(配列番号1、配列番号64、配列番号129、および配列番号188のすべてを含有するなど)を使用して複数の欠失により行われてもよい。
本発明の実施形態では、形質転換細胞は、治療同種細胞であってもよい。本明細書中で使用される「治療同種細胞」という用語は、疾患の進行の抑制、治療、または症状の緩和を目的として対象に注入される非自己同種細胞を指し、その例は、免疫細胞および幹細胞を含むがこれらに限定されない。
本明細書中で使用される「免疫細胞」という用語は、人体の免疫応答に関与する細胞を指し、その例はNK細胞、T細胞、B細胞、樹状細胞、およびマクロファージを含む。
本発明の実施形態では、免疫細胞は、NK細胞またはT細胞であってもよい。
本明細書中で使用される「幹細胞」という用語は、様々な細胞に分化できる多能性細胞を指す。幹細胞の例は、ヒト胚性幹細胞、骨髄幹細胞、間葉系幹細胞、ヒト神経幹細胞、口腔粘膜細胞等を含んでもよい。具体的には、幹細胞は、間葉系幹細胞であってもよい。
さらに、本発明の一態様では、有効成分として形質転換細胞を含む癌、感染性疾患、変性疾患、遺伝性疾患、または免疫疾患を治療するための医薬組成物が提供される。
本発明の実施形態では、癌は、慢性リンパ性白血病(CLL)、B細胞急性リンパ性白血病(B−ALL)、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫(NHL)、多発性骨髄腫、血液癌、胃癌、肝臓癌、膵臓癌、大腸癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、皮膚癌、メラノーマ、肉腫、前立腺癌、食道癌、肝細胞癌、星細胞腫、中皮腫、頭頸部癌、髄芽腫からなる群から選択されるいずれか1つであってもよい。
本発明の実施形態では、感染性疾患は、B型肝炎、C型肝炎、ヒトパピローマウイルス(HPV)感染、サイトメガロウイルス感染、エプスタイン・バーウイルス(EBV)感染、ウイルス性呼吸器疾患、およびインフルエンザからなる群から選択されるいずれか1つであってもよい。
本明細書中で使用される「変性疾患」という用語は、組織が当該組織の不可逆的な量的損失によりその本来の機能を失う病的状態を指す。変性疾患の例は、脳神経疾患、虚血性疾患、皮膚損傷、骨疾患、および変性関節炎を含むがこれらに限定されない。
本明細書中で使用される「遺伝性疾患」という用語は、遺伝子または染色体に有害な変異により起こる病的状態を指す。遺伝性疾患の例は、血友病、アルビニズム、ファブリー病、ハンター症候群、およびグリコーゲン蓄積症を含むがこれらに限定されない。
本明細書中で使用される「免疫疾患」という用語は、過剰または望ましくない免疫応答のために組織が損傷を受ける任意の病的状態を指す。したがって、「免疫疾患」という用語は、「高活性免疫疾患(hyperactive immune disease)」と同様の意味を有し、「免疫疾患を防止するまたは治療するための組成物」という用語は、「免疫抑制剤」と同様の意味を有する。
免疫疾患の例は、移植片対宿主病、移植片拒絶反応、慢性炎症性疾患、炎症性疼痛、神経因性疼痛、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、および自己免疫疾患を含むがこれらに限定されない。
「自己免疫疾患」という用語は、免疫細胞が自己と異物を区別できず、自己を攻撃するときに起こる病的状態を指す。自己免疫疾患の例は、リューマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス(systemic lupus erythematosis)、橋本甲状腺炎、グレイブ病、多発性硬化症、強皮症、重症筋無力症、I型糖尿病、アレルギー性脳脊髄炎、糸球体腎炎、白斑、ベーチェット病、クローン病、強直性脊椎炎、血小板減少性紫斑病、尋常性天疱瘡、自己免疫性溶血性貧血、副腎皮質ジストロフィー(ALD)、および全身性エリテマトーデス(systemic lupus erythematosus)(SLE)を含んでもよいがこれらに限定されない。
本発明の一態様では、対象に医薬組成物を投与することを含む、癌、感染性疾患、変性疾患、遺伝性疾患、または免疫疾患を治療するための方法が提供される。
本発明の実施形態では、投与は、静脈内、筋肉内、皮内、皮下、腹腔内、動脈内、心室内、病巣内、髄腔内、局所、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるいずれか1つの経路を介して行われてもよい。
本発明の別の態様では、癌、感染性疾患、変性疾患、遺伝性疾患、または免疫疾患を治療するための形質転換細胞の使用が提供され、ここでMHC I細胞膜レセプターおよびMHC II細胞膜レセプターの発現が形質転換細胞において阻害されており、かつ形質転換細胞が、細胞膜表面で改変MHC I細胞膜レセプターに結合したG−ペプチドを発現する。
本発明のさらに別の態様では、MHC I細胞膜レセプターについての遺伝子およびMHC II細胞膜レセプターについての遺伝子を改変するためのキットであって、ガイドRNAもしくはガイドRNAをコードするヌクレオチド配列ならびにRNAガイドエンドヌクレアーゼもしくはRNAガイドエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含むキットが提供される。
以下、本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明する。ただし、以下の実施例は本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲はこれに限定されるものではない。
実施例1.HLAを標的化するgRNAの合成および選択
実施例1.1. gRNA配列の検索および合成
gRNA配列について検索するために、NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)により提供される遺伝子の完全なヌクレオチド配列を使用した。gRNAの設計ツールとして、ウェブベースシステムCHOPCHOP(http://chopchop.cbu.uib.no/)、E−CRISP(http://www.e−crisp.org/E−CRISP/designcrispr.html)、CRISPR−ERA(http://crispr−era.stanford.edu/)、RGENツール(http://www.rgenome.net/cas−designer/)を使用した。設計したgRNAのうち、遺伝子ノックアウトに最も適した約60gRNAを所望の標的ごとに得た。これらの配列をもとに、製造元の指示書に従いGeneArt Precision gRNA Synthesis Kit(Thermo Fisher Scientific、A29377)を使用してgRNAを合成した。
実施例1.1. gRNA配列の検索および合成
gRNA配列について検索するために、NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)により提供される遺伝子の完全なヌクレオチド配列を使用した。gRNAの設計ツールとして、ウェブベースシステムCHOPCHOP(http://chopchop.cbu.uib.no/)、E−CRISP(http://www.e−crisp.org/E−CRISP/designcrispr.html)、CRISPR−ERA(http://crispr−era.stanford.edu/)、RGENツール(http://www.rgenome.net/cas−designer/)を使用した。設計したgRNAのうち、遺伝子ノックアウトに最も適した約60gRNAを所望の標的ごとに得た。これらの配列をもとに、製造元の指示書に従いGeneArt Precision gRNA Synthesis Kit(Thermo Fisher Scientific、A29377)を使用してgRNAを合成した。
すなわち、各gRNAをコードするDNAテンプレートの合成に必要なフォワードオリゴヌクレオチドプライマーおよびリバースオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、そして合成プライマーおよびGeneArt Precision gRNA Synthesis Kit(Thermo Fisher Scientific、A29377)に含まれるTracrフラグメント+T7プライマーMixを使用してPCRサーマルサイクラー(FlexCycler2、Analytik Jena)でPCRを実施した。以下のPCRパラメータを使用した:98℃で10秒間でプレ変性、その後98℃で5秒間および55℃で15秒間の条件下で変性およびアニーリングの32サイクル、その後72℃、1分間で最終伸長。テンプレートとして得られたPCR産物を使用して、インビトロ転写反応を37℃で4時間実施し;その後結果物を精製してgRNAを得た。
得られたgRNAが以下の表1から4に示される。具体的には、HLA−ABC(B2M)についてのgRNA配列が表1に示される;HLA−DQについてのgRNA配列が表2に示される;HLA−DPについてのgRNA配列が以下表3に示される;およびHLA−DRについてのgRNA配列が以下表4に示される。
表1
表2
表3
表1
実施例1.2. Raji細胞系統への遺伝子導入によるgRNAの選択
7.5μgの得られたgRNAを65℃、10分間インキュベートし、一本鎖を形成させた。その後、7.5μgのCas9タンパク質(Toolgen、TGEN_CP3またはClontech、M0646T)をそこに加え、インキュベーションを25℃、10分間実施し、Cas9−gRNA複合体(RNP複合体)を調製した。RNP複合体をSG細胞系統4D−Nucleofector(登録商標) X Kit S(Lonza、V4XC−3032)を使用して4D−Nucleofector(TM) X Unit(Lonza、AAF−1002X)で4×105細胞のRaji細胞系統に遺伝子導入した。遺伝子導入された細胞を7日間インキュベートし、その後細胞表面のHLAの発現レベルおよびゲノムDNAにおける変異の存在を確認した。
7.5μgの得られたgRNAを65℃、10分間インキュベートし、一本鎖を形成させた。その後、7.5μgのCas9タンパク質(Toolgen、TGEN_CP3またはClontech、M0646T)をそこに加え、インキュベーションを25℃、10分間実施し、Cas9−gRNA複合体(RNP複合体)を調製した。RNP複合体をSG細胞系統4D−Nucleofector(登録商標) X Kit S(Lonza、V4XC−3032)を使用して4D−Nucleofector(TM) X Unit(Lonza、AAF−1002X)で4×105細胞のRaji細胞系統に遺伝子導入した。遺伝子導入された細胞を7日間インキュベートし、その後細胞表面のHLAの発現レベルおよびゲノムDNAにおける変異の存在を確認した。
実施例1.3. フローサイトメーターを使用するHLAの発現レベルの確認
RNP複合体−遺伝子導入Raji細胞系統およびコントロール群Raji細胞系統のそれぞれの2×105細胞を100μLのFACSバッファー(1%FBS/シース(sheath)バッファー)において懸濁し、5mLチューブで調製した。前記細胞を抗体処理に供した。その後、光を30分間遮断しインキュベーションを4℃で実施した。前記抗体として、PE抗HLA−ABC(Miltenyi Biotec、130−101−448)、PE抗HLA−DR(Biolegend、361605)、PE抗HLA−DQ(Biolegend、318106)、およびPE抗HLA−DP(Leinco Technologies、H130)を使用した。その後、3mLのFACSバッファーをそこに加え、遠心分離を2,000rpm、3分、4℃で実施した。その後、上清を除去し試料を得、および前記試料をLSR Fortessaにより解析した。合計60のgRNAを各回20gRNAを使用して3回試験した。各gRNAの「%HLAネガティブ」値からコントロール群の「%HLAネガティブ」値を引くことにより算出される値(正規化された%HLAネガティブ)についての結果は、図1−4に図示される。さらに、10以上の値を有するgRNA(ただしB2M標的化gRNAについては1以上の値を有するgRNA)について1度に再実験を行うことにより得られた結果は、図5−8に図示される。
RNP複合体−遺伝子導入Raji細胞系統およびコントロール群Raji細胞系統のそれぞれの2×105細胞を100μLのFACSバッファー(1%FBS/シース(sheath)バッファー)において懸濁し、5mLチューブで調製した。前記細胞を抗体処理に供した。その後、光を30分間遮断しインキュベーションを4℃で実施した。前記抗体として、PE抗HLA−ABC(Miltenyi Biotec、130−101−448)、PE抗HLA−DR(Biolegend、361605)、PE抗HLA−DQ(Biolegend、318106)、およびPE抗HLA−DP(Leinco Technologies、H130)を使用した。その後、3mLのFACSバッファーをそこに加え、遠心分離を2,000rpm、3分、4℃で実施した。その後、上清を除去し試料を得、および前記試料をLSR Fortessaにより解析した。合計60のgRNAを各回20gRNAを使用して3回試験した。各gRNAの「%HLAネガティブ」値からコントロール群の「%HLAネガティブ」値を引くことにより算出される値(正規化された%HLAネガティブ)についての結果は、図1−4に図示される。さらに、10以上の値を有するgRNA(ただしB2M標的化gRNAについては1以上の値を有するgRNA)について1度に再実験を行うことにより得られた結果は、図5−8に図示される。
図5−8における結果から、各HLAの発現を効率よく減少できる合計13gRNAを選択し、そのうち2−4gRNAをそれぞれの標的(HLA−ABC、HLA−DQ、HLA−DP、およびHLA−DR)について選択した。具体的には、B2M−01、B2M−07、B2M−18、およびB2M−27gRNAをHLA−ABCについて選択した;DQA−14、DQA−15、DQA−37、およびDQA−40をHLA−DQについて選択した;DPA−07およびDPA−13をHLA−DPについて選択した;およびDRA−18、DRA−20、およびDRA−58をHLA−DRについて選択した。
実施例1.4. 標的遺伝子のゲノムDNAにおける変異の確認
フローサイトメトリーを使用して選択したHLA標的化gRNAがゲノムDNAにおける変異を引き起こすかどうかを確認するため、ゲノムDNAを製造元の指示書に従いGuide−it Mutation Detection Kit(Clontech、631443)を使用して解析した。
フローサイトメトリーを使用して選択したHLA標的化gRNAがゲノムDNAにおける変異を引き起こすかどうかを確認するため、ゲノムDNAを製造元の指示書に従いGuide−it Mutation Detection Kit(Clontech、631443)を使用して解析した。
すなわち、RNP複合体−遺伝子導入Raji細胞系統およびコントロール群Raji細胞系統のそれぞれの5×105細胞を1,200rpm、5分遠心分離し、そして上清を除去した。その後、90μLのGuide−it Mutation Detection Kit(Clontech、631443)に含有する抽出バッファー1をそこに加え、インキュベーションを95℃、10分間実施した。その後、Guide−it Mutation Detection Kit(Clontech、631443)に含有する10μLの抽出バッファー2をそこに加え、ピペッティングで得られたDNA溶解物をPCR用純水で1:8の割合で希釈した。PCRを希釈DNA溶解物、および以下表5に示される選択したgRNAおよび標的ゲノムDNAの解析PCRプライマーを使用してPCRサーマルサイクラー(FlexCycler2、Analytik Jena)で実施した。
以下のPCRパラメータを使用してPCT産物を産生した:98℃、2分間でプレ変性、その後98℃で10秒間、60℃で15秒間、および68℃、1分間の条件下で変性およびアニーリングの35サイクル、その後68℃、5分間で伸長。得られたPCR産物を変性および再ハイブリダイズさせるために、5μLのPCR用純水を10μLのPCR産物に加えた。その後、インキュベーションを95℃、5分間実施し、そして95℃から85℃まで1秒当たり2℃減少し、かつ85℃から25℃まで1秒当たり0.1℃減少する条件下で温度を変化させた。最後に1μLのGuide−it Resolvaseをそこに加え、インキュベーションを37℃、30分間実施した。その後、電気泳動を1.5%アガロースゲルで実施した。結果は、図9−12に図示される。
HLA標的化gRNA−遺伝子導入細胞のPCT産物におけるGuide−it resolvase開裂DNAフラグメントを電気泳動結果において確認した。これらの結果から、13の選択したHLA標的化gRNAがそれらの標的ゲノムDNAで変異を誘発することがわかった。
そうして、Raji細胞における遺伝子導入によりそれぞれのHLAの発現を効率よく減少できるgRNAを選択した。実施例2および3では、選択されたgRNAを使用して、形質転換NK細胞を調製し、そしてその有効性を確認した。
実施例2. HLA−I−欠失細胞の調製および確認
実施例2.1. NK−92MI細胞系統におけるHLA−Iの欠失
37.5μgのB2M−01 gRNAを65℃、10分間インキュベートし、一本鎖を形成させた。その後、37.5μgのCas9タンパク質(Toolgen、TGEN_CP3)をそこに加え、インキュベーションを25℃、10分間実施し、Cas9−gRNA複合体(RNP複合体)を調製した。RNP複合体をCell Line nucleofector Kit R(Lonza、VCA−1001)を使用してNucleofector(TM) 2b(Lonza、AAB−1001)で2×106細胞のNK−92MI細胞系統に遺伝子導入した。遺伝子導入された細胞を3日間インキュベートし、その後細胞分離を細胞セパレーターを使用して実施した。
実施例2.1. NK−92MI細胞系統におけるHLA−Iの欠失
37.5μgのB2M−01 gRNAを65℃、10分間インキュベートし、一本鎖を形成させた。その後、37.5μgのCas9タンパク質(Toolgen、TGEN_CP3)をそこに加え、インキュベーションを25℃、10分間実施し、Cas9−gRNA複合体(RNP複合体)を調製した。RNP複合体をCell Line nucleofector Kit R(Lonza、VCA−1001)を使用してNucleofector(TM) 2b(Lonza、AAB−1001)で2×106細胞のNK−92MI細胞系統に遺伝子導入した。遺伝子導入された細胞を3日間インキュベートし、その後細胞分離を細胞セパレーターを使用して実施した。
実施例2.2. HLA Iネガティブ細胞の分離
B2M−01 RNP複合体−遺伝子導入NK−92MI細胞系統を5mLチューブに移動させ、そしてPE抗HLA−ABC(Miltenyi Biotec,130−101−448)および7−AAD(Beckman Coulter,Inc.,A07704)で処理した。その後、光を30分間遮断しインキュベーションを4℃で実施した。染色した細胞をフィルタートップFACSチューブ(Falcon、352235)を使用してフィルターにかけ、そしてHLA−Iポジティブ細胞およびHLA−Iネガティブ細胞をFACS Aria II(BD)を使用して分離した。結果は、図13に図示される。HLA−Iネガティブ細胞が95.9%の純度を有し、HLA−Iポジティブ細胞が97.2%の純度を有することを確認した。
B2M−01 RNP複合体−遺伝子導入NK−92MI細胞系統を5mLチューブに移動させ、そしてPE抗HLA−ABC(Miltenyi Biotec,130−101−448)および7−AAD(Beckman Coulter,Inc.,A07704)で処理した。その後、光を30分間遮断しインキュベーションを4℃で実施した。染色した細胞をフィルタートップFACSチューブ(Falcon、352235)を使用してフィルターにかけ、そしてHLA−Iポジティブ細胞およびHLA−Iネガティブ細胞をFACS Aria II(BD)を使用して分離した。結果は、図13に図示される。HLA−Iネガティブ細胞が95.9%の純度を有し、HLA−Iポジティブ細胞が97.2%の純度を有することを確認した。
実施例2.3. HLA−I−欠失NK−92MI細胞系統の細胞殺滅能力の評価
細胞分離後4日間インキュベートしたHLA−Iポジティブ細胞およびHLA−Iネガティブ細胞それぞれを使用して、K562細胞系統に対するそれらの細胞殺滅能力を比較した。K562細胞系統を製造元の指示書に従い30μMカルセイン−AM(Invitrogen、C3099)で染色し、そしてE:T比10:1、3:1、1:1、または0.3:1でU底プレートでNK−92MI細胞系統とインキュベートした。4時間後、各インキュベート物を100μLずつ取り、細胞死により分泌されたカルセイン−AMの量をフルオロメーター(VictorTMX3、PerkinElmer)で測定した。結果として、図14に示されるように、HLA−Iポジティブ細胞およびHLA−Iネガティブ細胞はK562細胞系統に対して同等の細胞殺滅能力を有することを確認した。これらの結果から、HLA−Iの欠失が細胞殺滅能力に影響しないことがわかった。
細胞分離後4日間インキュベートしたHLA−Iポジティブ細胞およびHLA−Iネガティブ細胞それぞれを使用して、K562細胞系統に対するそれらの細胞殺滅能力を比較した。K562細胞系統を製造元の指示書に従い30μMカルセイン−AM(Invitrogen、C3099)で染色し、そしてE:T比10:1、3:1、1:1、または0.3:1でU底プレートでNK−92MI細胞系統とインキュベートした。4時間後、各インキュベート物を100μLずつ取り、細胞死により分泌されたカルセイン−AMの量をフルオロメーター(VictorTMX3、PerkinElmer)で測定した。結果として、図14に示されるように、HLA−Iポジティブ細胞およびHLA−Iネガティブ細胞はK562細胞系統に対して同等の細胞殺滅能力を有することを確認した。これらの結果から、HLA−Iの欠失が細胞殺滅能力に影響しないことがわかった。
実施例3. HLA−I−およびHLA−II−欠失細胞の調製および確認
実施例3.1. NK細胞の調製およびインキュベーション
冷凍保存末梢血単核細胞を37℃のウォーターバスに急速溶解し、50mLコニカルチューブに移した。チューブを振盪しながら、融解培地(RPMI、11875−093+10%FBS+55μM β−ME)をそこに滴下して混合した。その後、遠心分離を1,200rpm、10分、4℃で実施し、上清を除去し、10mLのCellGro SCGM(CellGENIX、2001)培地で再懸濁した。その後、細胞数を定量した。前記細胞を培養培地(CellGro SCGM+10ng/mL OKT3+500IU/mL IL−2+5%ヒト血漿)で1×106細胞/mLの濃度で再懸濁し、培養バッグ(NIPRO、87−352)に入れた。インキュベーションを37℃で24時間CO2インキュベーターで実施し、その後、遺伝子導入を実施した。
実施例3.1. NK細胞の調製およびインキュベーション
冷凍保存末梢血単核細胞を37℃のウォーターバスに急速溶解し、50mLコニカルチューブに移した。チューブを振盪しながら、融解培地(RPMI、11875−093+10%FBS+55μM β−ME)をそこに滴下して混合した。その後、遠心分離を1,200rpm、10分、4℃で実施し、上清を除去し、10mLのCellGro SCGM(CellGENIX、2001)培地で再懸濁した。その後、細胞数を定量した。前記細胞を培養培地(CellGro SCGM+10ng/mL OKT3+500IU/mL IL−2+5%ヒト血漿)で1×106細胞/mLの濃度で再懸濁し、培養バッグ(NIPRO、87−352)に入れた。インキュベーションを37℃で24時間CO2インキュベーターで実施し、その後、遺伝子導入を実施した。
実施例3.2. T細胞の調製およびインキュベーション方法
冷凍保存末梢血単核細胞を37℃のウォーターバスに急速溶解し、50mLコニカルチューブに移した。チューブを振盪しながら、融解培地(RPMI、11875−093+10%FBS+55μM β−ME)をそこに滴下して混合した。その後、遠心分離を1,200rpm、10分、4℃で実施し、上清を除去し、40mLのMACSバッファー(PBS+0.5%FBS+2mM EDTA)で再懸濁した。その後、細胞数を定量した。107細胞あたり20μLのCD3マイクロビーズ(Miltenyi Biotec、130−050−101)での処理を実施した。その後、光を15分遮断し、4℃でインキュベートした。その後、遠心分離を1,350rpm、8分、4℃で実施し、上清を除去し、結果物を500μLのMACSバッファーで再懸濁した。その後、再懸濁物をQuadroMACSセパレーター(Miltenyi Biotec、130−090−976)に取り付けたLSカラム(Miltenyi Biotec、130−042−401)にロードした。LSカラムをMACSバッファーで3回洗浄し、QuadroMACSセパレーターから除去した。その後、除去したLSカラムをプランジャーで圧縮し、CD3ポジティブ細胞を得た。前記細胞をT細胞培養培地(X−VIVO15(Lonza、BE02−060Q)+40μL/mL DynabeadsヒトT−アクチベーターCD3/CD28(Gibco、111.31D)+200IU/mL IL−2+5%ヒト血漿)で1×106細胞/mLの濃度で再懸濁し、培養バッグ(NIPRO、87−352)に入れた。インキュベーションを37℃で24時間CO2インキュベーターで実施し、その後、遺伝子導入を実施した。
冷凍保存末梢血単核細胞を37℃のウォーターバスに急速溶解し、50mLコニカルチューブに移した。チューブを振盪しながら、融解培地(RPMI、11875−093+10%FBS+55μM β−ME)をそこに滴下して混合した。その後、遠心分離を1,200rpm、10分、4℃で実施し、上清を除去し、40mLのMACSバッファー(PBS+0.5%FBS+2mM EDTA)で再懸濁した。その後、細胞数を定量した。107細胞あたり20μLのCD3マイクロビーズ(Miltenyi Biotec、130−050−101)での処理を実施した。その後、光を15分遮断し、4℃でインキュベートした。その後、遠心分離を1,350rpm、8分、4℃で実施し、上清を除去し、結果物を500μLのMACSバッファーで再懸濁した。その後、再懸濁物をQuadroMACSセパレーター(Miltenyi Biotec、130−090−976)に取り付けたLSカラム(Miltenyi Biotec、130−042−401)にロードした。LSカラムをMACSバッファーで3回洗浄し、QuadroMACSセパレーターから除去した。その後、除去したLSカラムをプランジャーで圧縮し、CD3ポジティブ細胞を得た。前記細胞をT細胞培養培地(X−VIVO15(Lonza、BE02−060Q)+40μL/mL DynabeadsヒトT−アクチベーターCD3/CD28(Gibco、111.31D)+200IU/mL IL−2+5%ヒト血漿)で1×106細胞/mLの濃度で再懸濁し、培養バッグ(NIPRO、87−352)に入れた。インキュベーションを37℃で24時間CO2インキュベーターで実施し、その後、遺伝子導入を実施した。
実施例3.3. 選択されたgRNAを使用するHLA−欠失NK細胞およびT細胞の調製
37.5μgの各gRNAを65℃、10分間インキュベートし、一本鎖を形成させた。その後、37.5μgのCas9タンパク質(Clontech、M0646T)をそこに加え、インキュベーションを25℃、10分間実施し、Cas9−gRNA複合体(RNP複合体)を調製した。複数の欠失の場合、それぞれのgRNAの量の合計を37.5μgに設定した。P3初代細胞4D−Nucleofector(登録商標) X Kit L(Lonza、V4XP−3024)を使用して4D−Nucleofector(TM) X Unit(Lonza、AAF−1002X)で、RNP複合体を2×106細胞に遺伝子導入した。遺伝子導入された細胞を3日間インキュベートし、その後サイトカインの産物を観察した。遺伝子導入された細胞を14日間インキュベートし、その後HLA発現が減少したかどうかをフローサイトメトリーにより確認した。
37.5μgの各gRNAを65℃、10分間インキュベートし、一本鎖を形成させた。その後、37.5μgのCas9タンパク質(Clontech、M0646T)をそこに加え、インキュベーションを25℃、10分間実施し、Cas9−gRNA複合体(RNP複合体)を調製した。複数の欠失の場合、それぞれのgRNAの量の合計を37.5μgに設定した。P3初代細胞4D−Nucleofector(登録商標) X Kit L(Lonza、V4XP−3024)を使用して4D−Nucleofector(TM) X Unit(Lonza、AAF−1002X)で、RNP複合体を2×106細胞に遺伝子導入した。遺伝子導入された細胞を3日間インキュベートし、その後サイトカインの産物を観察した。遺伝子導入された細胞を14日間インキュベートし、その後HLA発現が減少したかどうかをフローサイトメトリーにより確認した。
実施例3.4. フローサイトメトリーを使用するHLAの減少した発現の確認
RNP複合体−遺伝子導入細胞およびコントロール群細胞のそれぞれについて、2×105細胞を100μLのFACSバッファー(1%FBS/シース(sheath)バッファー)において懸濁し、5mLチューブで調製した。細胞染色を3回にわたり実施した。第一染色について、抗HLA−DP(Abcam、ab20897)を使用し;第二染色についてPEヤギ抗マウスIgG(eBioscience、12−4010−82)を使用し;および第三染色について、V450抗CD4(BD、560345)、APC−Cy7抗CD8(BD、557834)、BV510抗HLA−ABC(Biolegend、311436)、PE−Cy7抗HLA−DR(eBioscience、25−9952−42)、Alexa647抗HLA−DQ(BD、564806)を使用した。一方で、NK細胞の場合、BV421抗CD56(Biolegend、318328)をV450抗CD4の代わりに使用した。各回、抗体処理後、光を30分間遮断しインキュベーションを4℃で実施した。その後、3mLのFACSバッファーをそこに加え、遠心分離を2,000rpm、3分、4℃で実施し、上清を除去した。全染色試料を得、LSR Fortessaで解析した。結果は、図15−17に図示される。
RNP複合体−遺伝子導入細胞およびコントロール群細胞のそれぞれについて、2×105細胞を100μLのFACSバッファー(1%FBS/シース(sheath)バッファー)において懸濁し、5mLチューブで調製した。細胞染色を3回にわたり実施した。第一染色について、抗HLA−DP(Abcam、ab20897)を使用し;第二染色についてPEヤギ抗マウスIgG(eBioscience、12−4010−82)を使用し;および第三染色について、V450抗CD4(BD、560345)、APC−Cy7抗CD8(BD、557834)、BV510抗HLA−ABC(Biolegend、311436)、PE−Cy7抗HLA−DR(eBioscience、25−9952−42)、Alexa647抗HLA−DQ(BD、564806)を使用した。一方で、NK細胞の場合、BV421抗CD56(Biolegend、318328)をV450抗CD4の代わりに使用した。各回、抗体処理後、光を30分間遮断しインキュベーションを4℃で実施した。その後、3mLのFACSバッファーをそこに加え、遠心分離を2,000rpm、3分、4℃で実施し、上清を除去した。全染色試料を得、LSR Fortessaで解析した。結果は、図15−17に図示される。
それぞれのHLAを欠失するgRNAとして、B2M−01、DRA−20、DQA−14、およびDPA−13を使用した。図15における結果から、単一gRNAでの遺伝子導入に際し、標的HLAの欠失が少なくとも70%、最大で99%の高い効率で達成されることがわかった。図16における結果から、複数の欠失の効率は単一欠失の効率と比較して顕著に減少しないことがわかった。複数の欠失の効率を単一欠失と比較する場合、前記効率は単一欠失の「%ネガティブ」値を複数の欠失の「%ネガティブ」値で割ることにより得られた値に、100を乗じることにより示した。さらに、図17における結果を参照すると、RNP複合体−遺伝子導入細胞の14日のインキュベーション率(rate)はコントロール群細胞のものと同様であることがわかった。とりわけ、単一gRNA(DPA−13)−遺伝子導入細胞および複数のgRNA−遺伝子導入細胞間でインキュベーション率(rate)の観点で差異がないことを確認した。
実施例3.5. HLA−欠失T細胞およびNK細胞の活性の解析
RNP複合体−遺伝子導入細胞およびコントロール細胞のそれぞれについて、1×106細胞をPMA、イオノマイシン(Cell Stimulation Cocktail、eBioscience、00−4970−03)、およびAPC抗CD107α(BD、560664)での処理に供し、その後インキュベーションするか、またはAPC抗CD107αおよび2×105K562細胞とインキュベートした。5時間後、PerCP−Cy5.5抗CD3(Tonbo、65−0038−T100)、BV421抗CD56(Biolegend、318328)、FITC抗B2M(Biolegend、316304)、APC−Cy7抗HLA−ABC(Biolegend、311426)、およびPE抗HLA−DR/DP/DQ(Miltenyi Biotec、130−104−827)での処理を実施した。その後、光を30分間遮断しインキュベーションを4℃で実施し、表面染色を行った。
RNP複合体−遺伝子導入細胞およびコントロール細胞のそれぞれについて、1×106細胞をPMA、イオノマイシン(Cell Stimulation Cocktail、eBioscience、00−4970−03)、およびAPC抗CD107α(BD、560664)での処理に供し、その後インキュベーションするか、またはAPC抗CD107αおよび2×105K562細胞とインキュベートした。5時間後、PerCP−Cy5.5抗CD3(Tonbo、65−0038−T100)、BV421抗CD56(Biolegend、318328)、FITC抗B2M(Biolegend、316304)、APC−Cy7抗HLA−ABC(Biolegend、311426)、およびPE抗HLA−DR/DP/DQ(Miltenyi Biotec、130−104−827)での処理を実施した。その後、光を30分間遮断しインキュベーションを4℃で実施し、表面染色を行った。
その後、3mLのFACSバッファーをそこに加え、遠心分離を2,000rpm、3分、4℃で実施し、上清を除去した。その後BD Cytofix/Cytoperm(TM)バッファー(BD、554722)を使用して、固定および浸透を30分実施した。洗浄を1XPerm/ウォッシュバッファー(BD、554723)で2回実施し、PE−Cy7抗TNF−α(eBioscience、25−7349−82)およびV500抗IFN−γ(BD、554701)での処理を実施した。光を30分間遮断しインキュベーションを4℃で実施し、細胞内染色を行った。その後、3mLのFACSバッファーをそこに加え、遠心分離を2,000rpm、3分、4℃で実施し、上清を除去した。その後、洗浄を1XPerm/ウォッシュバッファーで2回実施し、T細胞およびNK細胞におけるサイトカイン産物をフローサイトメトリーで解析した。結果は、図18および19に図示される。
図18において、HLAが欠失されても、T細胞が活性化されると分泌されるTNF−α、IFN−γ、およびCD107αの量がHLAポジティブ細胞と異ならないことを確認した。また、図19において、HLAが欠失されても、NK細胞が活性化されると分泌されるTNF−α、IFN−γ、およびCD107αの量がHLAポジティブ細胞と異ならないことを確認した。これらの結果から、NK細胞の活性はHLA−IおよびHLA−IIが欠失されても維持されることがわかった。
実施例4. HLA−E−発現ベクターの合成および発現の確認
実施例4.1. HLA−I−欠失Raji細胞系統に対するNK細胞の細胞殺滅能力の評価
NK細胞の細胞殺滅能力がHLA−I−欠失細胞において増加しているかどうかを確認するために、Raji細胞系統をB2M−01 RNP複合体で遺伝子導入し、HLA−Iポジティブ細胞およびHLA−Iネガティブ細胞を細胞セパレーターを使用して分離した。それぞれの細胞を製造元の指示書に従いカルセイン−AMで染色し、そして1×104細胞をE:T比10:1、3:1、1:1、または0.3:1でU底プレートでNK−92MI細胞系統とインキュベートした。5時間後、細胞死により分泌されたカルセイン−AMの量をフルオロメーターで測定した。図20に示されるように、NK細胞の細胞殺滅能力がHLA−Iポジティブ細胞と比較してHLA−Iネガティブ細胞において増加することを確認した。
実施例4.1. HLA−I−欠失Raji細胞系統に対するNK細胞の細胞殺滅能力の評価
NK細胞の細胞殺滅能力がHLA−I−欠失細胞において増加しているかどうかを確認するために、Raji細胞系統をB2M−01 RNP複合体で遺伝子導入し、HLA−Iポジティブ細胞およびHLA−Iネガティブ細胞を細胞セパレーターを使用して分離した。それぞれの細胞を製造元の指示書に従いカルセイン−AMで染色し、そして1×104細胞をE:T比10:1、3:1、1:1、または0.3:1でU底プレートでNK−92MI細胞系統とインキュベートした。5時間後、細胞死により分泌されたカルセイン−AMの量をフルオロメーターで測定した。図20に示されるように、NK細胞の細胞殺滅能力がHLA−Iポジティブ細胞と比較してHLA−Iネガティブ細胞において増加することを確認した。
実施例4.2. HLA−Eベクターの合成
実施例4.1と同様にHLA−Iを欠失するためにB2M RNP複合体で細胞が遺伝子導入されると生じるNK細胞により引き起こされる細胞殺滅現象を避けるために、HLA−Eを前記細胞に導入するためのHLA−Eベクターを合成した。すなわち、B2M(配列番号237)が3つの第一G4Sリンカー(配列番号238)を介してB2Mシグナルペプチド(B2M SS;配列番号235)に連結したG−ペプチド(配列番号236)に連結し、そしてB2Mが4つの第二G4Sリンカー(配列番号241)を介してHAタグ(配列番号239)と付着したHLA−E(配列番号240)に結合している形質転換HLA−E(G−B2M−HLA−E)を合成した。それぞれの配列が以下表6に示される。合成形質転換HLA−EをpLVX−EF1α−IRES−Puroベクター(Clontech、631988)への挿入によりクローニングし、その構造は図21に示される。
実施例4.1と同様にHLA−Iを欠失するためにB2M RNP複合体で細胞が遺伝子導入されると生じるNK細胞により引き起こされる細胞殺滅現象を避けるために、HLA−Eを前記細胞に導入するためのHLA−Eベクターを合成した。すなわち、B2M(配列番号237)が3つの第一G4Sリンカー(配列番号238)を介してB2Mシグナルペプチド(B2M SS;配列番号235)に連結したG−ペプチド(配列番号236)に連結し、そしてB2Mが4つの第二G4Sリンカー(配列番号241)を介してHAタグ(配列番号239)と付着したHLA−E(配列番号240)に結合している形質転換HLA−E(G−B2M−HLA−E)を合成した。それぞれの配列が以下表6に示される。合成形質転換HLA−EをpLVX−EF1α−IRES−Puroベクター(Clontech、631988)への挿入によりクローニングし、その構造は図21に示される。
実施例4.3. K562細胞系統への形質導入によるHLA−Eの発現およびその確認
形質転換HLA−E挿入pLVX−EF1α−IRES−Puroベクターを293T細胞系統をレンチウイルスパッケージングベクターと共に遺伝子導入した。3日後、レンチウイルス上清を0.45μmフィルターを通して得た。K562細胞系統をレンチウイルス上清処理に供し、遠心分離を3,000rpm、1時間、32℃で実施した。3日後、1×106細胞を5mLチューブに移し、細胞表面染色をPE−Cy7抗HLA−E(Biolegend、342608)およびAPC抗B2M(Biolegend、316312)で30分実施した。FACSバッファーでの洗浄を実施し、そしてHLA−EおよびB2Mの発現をフローサイトメトリーで検査した。図22にみられるように、HLA−EおよびB2Mが、形質転換HLA−Eを発現するK562細胞系統において高レベルで発現したことを確認した。
形質転換HLA−E挿入pLVX−EF1α−IRES−Puroベクターを293T細胞系統をレンチウイルスパッケージングベクターと共に遺伝子導入した。3日後、レンチウイルス上清を0.45μmフィルターを通して得た。K562細胞系統をレンチウイルス上清処理に供し、遠心分離を3,000rpm、1時間、32℃で実施した。3日後、1×106細胞を5mLチューブに移し、細胞表面染色をPE−Cy7抗HLA−E(Biolegend、342608)およびAPC抗B2M(Biolegend、316312)で30分実施した。FACSバッファーでの洗浄を実施し、そしてHLA−EおよびB2Mの発現をフローサイトメトリーで検査した。図22にみられるように、HLA−EおよびB2Mが、形質転換HLA−Eを発現するK562細胞系統において高レベルで発現したことを確認した。
実施例4.4. HLA−E導入細胞における細胞殺滅能力の評価
形質転換HLA−Eを発現する各K562細胞系統およびコントロール群K562細胞系統を製造元の指示書に従いカルセイン−AMで染色し、そして1×104細胞をE:T比10:1、3:1、1:1、または0.3:1でU底プレートでNK細胞とインキュベートした。5時間後、100μLを各インキュベート物からとり、細胞死により分泌されたカルセイン−AMの量をフルオロメーター(VictorTMX3、PerkinElmer)で測定した。
形質転換HLA−Eを発現する各K562細胞系統およびコントロール群K562細胞系統を製造元の指示書に従いカルセイン−AMで染色し、そして1×104細胞をE:T比10:1、3:1、1:1、または0.3:1でU底プレートでNK細胞とインキュベートした。5時間後、100μLを各インキュベート物からとり、細胞死により分泌されたカルセイン−AMの量をフルオロメーター(VictorTMX3、PerkinElmer)で測定した。
図23にみられるように、コントロール群K562細胞系統(K562)と比較して形質転換HLA−Eを発現するK562細胞系統(K562 G−B2M−HLA−E)の場合では、NK細胞により引き起こされる細胞死現象は顕著に減少したことが確認された。これらの結果から、HLA−Eの発現がNK細胞により引き起こされる細胞死を防止できることがわかった。
実施例5. HLA−I−およびHLA−II−欠失NK細胞へのHLA−Eの導入
実施例4.2と同様にして調製したHLA−Eベクターを使用して実施例3で調製したHLA−I−およびHLA−II−欠失NK細胞にG−ペプチドが結合したHLA−Eを導入して形質転換NK細胞を調製した。
実施例4.2と同様にして調製したHLA−Eベクターを使用して実施例3で調製したHLA−I−およびHLA−II−欠失NK細胞にG−ペプチドが結合したHLA−Eを導入して形質転換NK細胞を調製した。
Claims (28)
- β2−ミクログロブリン(B2M)をコードする核酸配列に相補的に結合するガイドRNAであって、配列番号1、配列番号6、配列番号17、および配列番号26からなる群から選択されるいずれか1つの核酸配列を含むガイドRNA。
- HLA−DQをコードする核酸配列に相補的に結合するガイドRNAであって、配列番号64、配列番号65、配列番号87、および配列番号90からなる群から選択されるいずれか1つの核酸配列を含むガイドRNA。
- HLA−DPをコードする核酸配列に相補的に結合するガイドRNAであって、配列番号123または配列番号129の核酸配列を含むガイドRNA。
- HLA−DRをコードする核酸配列に相補的に結合するガイドRNAであって、配列番号186、配列番号188、および配列番号225からなる群から選択されるいずれか1つの核酸配列を含むガイドRNA。
- 有効成分として:
請求項1−4のいずれか一項に記載のガイドRNAまたはガイドRNAをコードするヌクレオチド配列;および
RNAガイドエンドヌクレアーゼまたはRNAガイドエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列、
を含む遺伝子発現を阻害するための組成物。 - RNAガイドエンドヌクレアーゼが、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas13a、Cas13b、Cas13c、Cas13d、Cpf1、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、およびCsf4からなる群から選択されるいずれか1つである、請求項5に記載の組成物。
- MHC I細胞膜レセプターおよびMHC II細胞膜レセプターの発現が阻害されている、形質転換細胞。
- 形質転換細胞が細胞膜表面でペプチド抗原を発現する、請求項7に記載の形質転換細胞。
- ペプチド抗原がG−ペプチドである、請求項8に記載の形質転換細胞。
- G−ペプチドが改変MHC I細胞膜レセプターに結合している、請求項9に記載の形質転換細胞。
- 改変MHC I細胞膜レセプターがHLA−EおよびB2Mが結合している構造を有する、請求項10に記載の形質転換細胞。
- B2MのC末端が第一リンカーを介してHLA−Eのα1のN末端に結合し、G−ペプチドのC末端が第二リンカーを介して改変MHC I細胞膜レセプターにおけるB2MのN末端に結合している、請求項11に記載の形質転換細胞。
- G−ペプチドが配列番号236の配列を有する、請求項12に記載の形質転換細胞。
- HLA−Eが配列番号240の配列を有する、請求項12に記載の形質転換細胞。
- B2Mが配列番号237の配列を有する、請求項12に記載の形質転換細胞。
- 第一リンカーが配列番号238の配列を有する、請求項12に記載の形質転換細胞。
- 第二リンカーが配列番号241の配列を有する、請求項12に記載の形質転換細胞。
- MHC I細胞膜レセプターをコードする遺伝子における改変が請求項1に記載のガイドRNAを使用して実施される、請求項7に記載の形質転換細胞。
- MHC II細胞膜レセプターをコードするDQ、DP、およびDR遺伝子における改変がそれぞれ請求項2、3、および4に記載のガイドRNAを使用して実施される、請求項7に記載の形質転換細胞。
- 形質転換細胞が治療同種細胞である、請求項7に記載の形質転換細胞。
- 治療同種細胞が免疫細胞または幹細胞である、請求項20に記載の形質転換細胞。
- 免疫細胞がNK細胞またはT細胞である、請求項21に記載の形質転換細胞。
- 有効成分として請求項7に記載の形質転換細胞を含む、癌、感染性疾患、変性疾患、遺伝性疾患、または免疫疾患を治療するための医薬組成物。
- 癌が、慢性リンパ性白血病(CLL)、B細胞急性リンパ性白血病(B−ALL)、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫(NHL)、多発性骨髄腫、血液癌、胃癌、肝臓癌、膵臓癌、大腸癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、皮膚癌、メラノーマ、肉腫、前立腺癌、食道癌、肝細胞癌、星細胞腫、中皮腫、頭頸部癌、髄芽腫からなる群から選択されるいずれか1つである、請求項23に記載の医薬組成物。
- 感染性疾患が、B型肝炎、C型肝炎、ヒトパピローマウイルス(HPV)感染、サイトメガロウイルス感染、エプスタイン・バーウイルス(EBV)感染、ウイルス性呼吸器疾患、およびインフルエンザからなる群から選択されるいずれか1つである、請求項23に記載の医薬組成物。
- 請求項23−25のいずれか一項に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む癌、感染性疾患、変性疾患、遺伝性疾患、または免疫疾患を治療するための方法。
- 投与が静脈内、筋肉内、皮内、皮下、腹腔内、動脈内、心室内、病巣内、髄腔内、局所、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるいずれか1つの経路を介して行われる、請求項26に記載の方法。
- 癌、感染性疾患、変性疾患、遺伝性疾患、または免疫疾患を治療するための形質転換細胞の使用であって、ここで、MHC I細胞膜レセプターおよびMHC II細胞膜レセプターの発現が形質転換細胞において阻害されており、かつ形質転換細胞が、細胞膜表面で改変MHC I細胞膜レセプターに結合したペプチド抗原を発現する、使用。
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