JP2024503291A - ユニバーサルドナー細胞 - Google Patents

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バレンティン スルチ，
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Abstract

多数の対象に適合する遺伝子改変された細胞、例えばユニバーサルドナー細胞、および前記遺伝子改変された細胞を生成する方法が本明細書で提供される。ユニバーサルドナー細胞は、１つもしくは複数のＭＨＣ－ＩもしくはＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原またはＭＨＣ－ＩもしくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の構成成分もしくは転写調節因子をコードする遺伝子の内部またはその近傍に少なくとも１つの遺伝子改変を含み、ここで、遺伝子改変は、免疫寛容原性因子および／または生存因子をコードするポリヌクレオチドの挿入を含む。ユニバーサルドナー細胞は、生存因子をコードする遺伝子の内部またはその近傍に少なくとも１つの遺伝子改変をさらに含み得、ここで、前記遺伝子改変は、第２の免疫寛容原性因子および／または異なる生存因子をコードするポリヌクレオチドの挿入を含む。

Description

関連出願への相互参照
本出願は、それぞれの開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０２０年１２月３１日出願の米国仮出願第６３／１３２，８９０号、２０２１年８月１９日出願の米国仮出願第６３／２３４，９９７号、および２０２１年１２月１０日出願の米国仮出願第６３／２８８，３５６号の利益を主張する。
配列表の参照による組込み
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩフォーマットで提出された、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含有する。ＡＳＣＩＩコピーは、２０２１年１２月２２日に作成され、名称はＣＴ１５４＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔであり、サイズは約１３１，０００バイトである。
発明の分野
本発明は、遺伝子編集の分野に関し、一部の実施形態では、多数の対象に対して適合性をもつ細胞、例えばユニバーサルドナー細胞を生成するための遺伝子改変に関する。
背景
移植されたまたは生着した細胞の同種他家由来拒絶反応を克服するために、ＨＬＡ適合、Ｔ細胞活性化を誘発する経路の抗体を用いた遮断、免疫抑制性薬物のカクテルの使用、および自己細胞療法を含めた種々の手法が提唱されている。移植片拒絶を弱めるための別の戦略は、移植されたまたは生着した細胞とレシピエントの同種他家間差異を最小化することを伴う。細胞表面に発現されるヒト白血球抗原（ＨＬＡ）は、第６染色体上のヒト主要組織適合性遺伝子複合体に位置する遺伝子によってコードされる分子であり、免疫拒絶反応の主要なメディエーターである。ドナーと対象の間での単一のＨＬＡ遺伝子の不適合により、頑強な免疫応答が引き起こされ得る（Fleischhauer K. et al. "Bone marrow-allograft rejection by T lymphocytes recognizing a single amino acid difference in HLA-B44," N Engl J Med., 1990, 323: 1818-1822）。ＨＬＡ遺伝子は、ＭＨＣクラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）とＭＨＣクラスＩＩ（ＭＨＣ－ＩＩ）に分けられる。ＭＨＣ－Ｉ遺伝子（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬＡ－Ｃ）は、ほとんど全ての組織細胞型において発現され、「非自己」の抗原プロセシングされたペプチドをＣＤ８＋Ｔ細胞に提示し、それにより、ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞溶解性ＣＤ８＋Ｔ細胞への活性化を促進する。「非自己」ＭＨＣ－Ｉ分子を発現する移植されたまたは生着した細胞は、これらの細胞を対象とする頑強な細胞性免疫応答を引き起こし、最終的に、活性化された細胞溶解性ＣＤ８＋Ｔ細胞による移植されたまたは生着した細胞の消滅がもたらされる。ＭＨＣ－Ｉタンパク質は、小胞体において、細胞表面上に機能的なＭＨＣ－Ｉ分子を形成するために必須であるベータ２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）と密接に関連する。
ＭＨＣ－Ｉ遺伝子が広範な細胞で発現されるのとは対照的に、ＭＨＣ－ＩＩ遺伝子の発現は、樹状細胞、マクロファージ、およびＢ細胞などの抗原提示細胞に制限される。ＨＬＡ抗原遺伝子は、ヒトゲノムにおいて観察される最も多型性をもつ遺伝子である（Rubinstein P., "HLA matching for bone marrow transplantation--how much is enough?" N Engl J Med., 2001, 345: 1842-1844）。あらゆるＨＬＡ遺伝子型に対する適合性をもつ「ユニバーサルドナー」細胞を生成することにより、免疫回避のための現行の方法体系による免疫拒絶反応および付随する経済的コストを解消し得る代替戦略がもたらされる。
そのようなユニバーサルドナー細胞の株を生成するために、以前にとられた手法の１つは、ＭＨＣ－ＩおよびＭＨＣ－ＩＩクラス遺伝子の発現を機能的に破壊するものであった。これは、例えば、ＭＨＣ－Ｉ軽鎖、Ｂ２Ｍをコードする遺伝学的対立遺伝子の両方の遺伝学的破壊によって実現することができる。得られるＢ２Ｍヌル細胞株およびその誘導体は、表面ＭＨＣ－Ｉの著しい減少、したがって、同種他家ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する免疫原性の低減を示すことが予測される。転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）ターゲティング手法を使用して、Ｂ２Ｍ遺伝子のエクソン２の数ヌクレオチドを欠失させることによってＢ２Ｍ欠損ｈＥＳＣ株が生成された（Lu, P. et al., "Generating hypoimmunogenic human embryonic stem cells by the disruption of beta 2-microglobulin," Stem Cell Rev. 2013, 9: 806-813）。Ｂ２Ｍが標的化されたｈＥＳＣ株は、表面ＨＬＡ－Ｉが欠損したと思われたが、Ｂ２ＭおよびＭＨＣ－Ｉに特異的なｍＲＮＡを依然として含有することが見いだされた。Ｂ２ＭおよびＭＨＣ－ＩのｍＲＮＡは、標的化されていないｈＥＳＣのレベル（構成的なものおよびＩＦＮ－ｇにより誘導されるものの両方）と等しいレベルで発現された。したがって、これらのＴＡＬＥＮがＢ２Ｍを標的としたｈＥＳＣ株では、同じくＢ２Ｍ ｍＲＮＡを発現するＢ２Ｍ２／２マウス細胞で観察されたような免疫拒絶反応を引き起こすのに十分な、残留する細胞表面ＭＨＣ－Ｉが発現される恐れがあることが懸念される（Gross, R. and Rappuoli, R. "Pertussis toxin promoter sequences involved in modulation," Proc Natl Acad Sci, 1993, 90: 3913-3917）。ＴＡＬＥＮがＢ２Ｍを標的としたｈＥＳＣ株は、オフターゲットの切断事象については調査されなかったが、ＴＡＬＥＮを使用した場合に非特異的切断が生じることは、依然として、それらの臨床使用における安全性に対する大きな懸念を生じさせる著しい問題のままである（Grau, J. et al. "TALENoffer: genome-wide TALEN off-target prediction," Bioinformatics, 2013, 29: 2931-2932；Guilinger J.P. et al. "Broad specificity profiling of TALENs results in engineered nucleases with improved DNA-cleavage specificity," Nat Methods 2014, 11: 429-435）。さらに、別の報告では、第１のＢ２Ｍ対立遺伝子をノックアウトし、第２のＢ２Ｍ対立遺伝子にＨＬＡ－Ｅ遺伝子をノックインし、それにより、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、またはＨＬＡ－Ｃの表面発現の非存在下でのＨＬＡ－Ｅ二量体または三量体の表面発現をもたらすことにより、同種他家認識を免れるＩＰＳ細胞が生成されている（Gornalusse, G.G. et al., "HLA-E-expressing pluripotent stem cells escape allogeneic responses and lysis by NK cells," Nature Biotechnology, 2017, 35, 765-773）。
Fleischhauer K. et al. "Bone marrow-allograft rejection by T lymphocytes recognizing a single amino acid difference in HLA-B44," N Engl J Med., 1990, 323: 1818-1822 Rubinstein P., "HLA matching for bone marrow transplantation--how much is enough?" N Engl J Med., 2001, 345: 1842-1844 Lu, P. et al., "Generating hypoimmunogenic human embryonic stem cells by the disruption of beta 2-microglobulin," Stem Cell Rev. 2013, 9: 806-813 Gross, R. and Rappuoli, R. "Pertussis toxin promoter sequences involved in modulation," Proc Natl Acad Sci, 1993, 90: 3913-3917 Grau, J. et al. "TALENoffer: genome-wide TALEN off-target prediction," Bioinformatics, 2013, 29: 2931-2932 Guilinger J.P. et al. "Broad specificity profiling of TALENs results in engineered nucleases with improved DNA-cleavage specificity," Nat Methods 2014, 11: 429-435 Gornalusse, G.G. et al., "HLA-E-expressing pluripotent stem cells escape allogeneic responses and lysis by NK cells," Nature Biotechnology, 2017, 35, 765-773
上記の戦略のいくつかの潜在的な限定は、ＨＬＡ分子がナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に対する主要なリガンド阻害因子として機能することから、ＭＨＣクラスＩ陰性細胞がナチュラルキラー（ＮＫ）細胞による溶解を受けやすいことである。宿主ＮＫ細胞が移植されたまたは生着したＢ２Ｍ－／－ドナー細胞を排除することが示されており、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＭＨＣクラスＩ陰性ヒト白血病株を用いた場合に同様の現象が起こる（Bix, M. et al., "Rejection of class I MHC-deficient haemopoietic cells by irradiated MHC-matched mice," Nature, 1991, 349, 329-331；Zarcone, D. et al., "Human leukemia-derived cell lines and clones as models for mechanistic analysis of natural killer cell-mediated cytotoxicity," Cancer Res. 1987, 47, 2674-2682）。したがって、以前の方法を改善して、免疫応答を回避することができるユニバーサルドナー細胞を生成する必要性、ならびに、生着後に生存することができる細胞を生成する必要性が存在する。本明細書に記載の通り、生着後または移植後の細胞生存は、同種他家拒絶反応とは無関係の多くの他の経路、例えば、低酸素、活性酸素種、栄養分欠乏、および酸化ストレスによって媒介される可能性がある。同じく本明細書に記載の通り、生存因子（遺伝子および／またはタンパク質）の遺伝子導入が生着後の細胞の生存に役立つ可能性がある。本明細書に記載の通り、ユニバーサルドナー細胞株は、同種他家拒絶反応および生着後の生存のどちらにも対処する特性を組み合わせることができる。
要旨
一部の態様では、本開示は、ユニバーサルドナー細胞を生成するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、（ａ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼならびに第１の標的遺伝子座における標的部位を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ならびに腫瘍壊死因子アルファ誘導タンパク質３（ＴＮＦＡＩＰ３）、中脳アストロサイト由来神経栄養因子（ＭＡＮＦ）、分化抗原群３９（ＣＤ３９）および／もしくは分化抗原群７３（ＣＤ７３）をコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸であって、第１の標的遺伝子座を標的部位において切断し、ＴＮＦＡＩＰ３、ＭＡＮＦ、ＣＤ３９および／またはＣＤ７３をコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸を標的遺伝子座に挿入し、それにより、標的遺伝子を破壊する、第１の核酸；ならびに／または（ｂ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼおよびベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子座における標的部位を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）であって、Ｂ２Ｍ遺伝子座を標的部位において切断し、それにより、Ｂ２Ｍ遺伝子を破壊する、ガイドＲＮＡ；ならびに／または（ｃ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼおよびチオレドキシン相互作用タンパク質（ＴＸＮＩＰ）遺伝子座における標的部位を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）であって、ＴＸＮＩＰ遺伝子座を標的部位において切断し、それにより、ＴＸＮＩＰ遺伝子を破壊する、ガイドＲＮＡ；ならびに／または（ｄ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼおよびクラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子座における標的部位を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）であって、ＣＩＩＴＡ遺伝子座を標的部位において切断し、それにより、ＣＩＩＴＡ遺伝子を破壊する、ガイドＲＮＡ；ならびに／または（ｅ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼおよびトランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）遺伝子座における標的部位を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）であって、ＴＧＦβ遺伝子座を標的部位において切断し、それにより、ＴＧＦβ遺伝子を破壊する、ガイドＲＮＡを幹細胞に送達するステップを含む、方法を包含する。
一部の態様では、本明細書で提供される方法は、（ｆ）別のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼならびに標的遺伝子座における標的部位を標的とする別のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ならびに腫瘍壊死因子アルファ誘導タンパク質３（ＴＮＦＡＩＰ３）、中脳アストロサイト由来神経栄養因子（ＭＡＮＦ）、分化抗原群３９（ＣＤ３９）、分化抗原群７３（ＣＤ７３）、ＨＬＡクラスＩ組織適合性抗原、アルファ鎖Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）および／またはプログラム死－リガンド１（ＰＤ－Ｌ－１）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を幹細胞に送達するステップであって、標的遺伝子座を標的部位において切断し、ＴＮＦＡＩＰ３、ＭＡＮＦ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＨＬＡ－Ｅ、および／またはＰＤ－Ｌ－１をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を標的遺伝子座に挿入し、それにより、標的遺伝子を破壊する、ステップをさらに含み得る。
一部の態様では、本明細書で提供される方法は、（ｇ）別のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼならびに標的遺伝子座における標的部位を標的とする別のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ならびに腫瘍壊死因子アルファ誘導タンパク質３（ＴＮＦＡＩＰ３）、中脳アストロサイト由来神経栄養因子（ＭＡＮＦ）、分化抗原群３９（ＣＤ３９）、分化抗原群７３（ＣＤ７３）、ＨＬＡ－Ｅおよび／またはＰＤ－Ｌ－１をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を幹細胞に送達するステップであって、標的遺伝子座を標的部位において切断し、ＴＮＦＡＩＰ３、ＭＡＮＦ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＨＬＡ－Ｅ、および／またはＰＤ－Ｌ－１をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を標的遺伝子座に挿入し、それにより、標的遺伝子を破壊する、ステップをさらに含み得る。
一部の態様では、本明細書で提供される方法は、（ｈ）別のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼならびに標的遺伝子座における標的部位を標的とする別のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ならびに腫瘍壊死因子アルファ誘導タンパク質３（ＴＮＦＡＩＰ３）、中脳アストロサイト由来神経栄養因子（ＭＡＮＦ）、分化抗原群３９（ＣＤ３９）、分化抗原群７３（ＣＤ７３）、ＨＬＡ－Ｅおよび／またはＰＤ－Ｌ－１をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を幹細胞に送達するステップであって、標的遺伝子座を標的部位において切断し、ＴＮＦＡＩＰ３、ＭＡＮＦ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＨＬＡ－Ｅ、および／またはＰＤ－Ｌ－１をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を標的遺伝子座に挿入し、それにより、標的遺伝子を破壊する、ステップをさらに含む。
本開示は、種々の改変および代替形態を許容できるが、その具体的な実施形態が例として図面に示され、本明細書に詳細に記載される。しかし、図面および本明細書に提示される詳細な説明は、本開示を開示される特定の実施形態に限定することを意図するものではなく、それに反して、添付の特許請求の範囲によって定義される本開示の主旨および範囲内に入る全ての改変、等価物、および代替を包含することが意図されていることが理解されるべきである。
本開示の他の特色および利点は、付属の図面を参照し、本発明の実施形態に関する以下の詳細な説明において明らかになろう。
図１は、Ｂ２Ｍ－ＣＡＧＧＳ－ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ドナーベクターのプラスミドマップを示す。
図２は、ＣＩＩＴＡ－ＣＡＧＧＳ－ＣＤ３９ドナーベクターのプラスミドマップを示す。
図３は、Ｂ２Ｍ－ＣＡＧＧＳ－ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ドナーベクターのプラスミドマップを示す。
図４は、Ｂ２Ｍ－ＣＡＧＧＳ－ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ドナーベクターのプラスミドマップを示す。
図５は、ＴＸＮＩＰ－ＣＡＧＧＳ－ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＨＬＡ－Ｅドナーベクターのプラスミドマップを示す。
図６は、Ｌ３Ｖ００３Ｂ細胞株およびＬ３Ｖ００４Ｂ細胞株のＣＤ３９発現に関するフローサイトメトリーを示す。
図７は、野生型（ＷＴ）細胞（上のパネル）またはＸ１細胞（すなわち、ＴＸＮＩＰ ＫＯ／ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＨＬＡ－Ｅ ＫＩ＆Ｂ２Ｍ ＫＯ／ＴＮＦＡＩＰ３（Ａ２０）－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ ＫＩ）から分化させたＰＥＣ細胞および第６段階（Ｓ６）の細胞のモルホロジーを示す。
図８は、野生型（ＷＴ）細胞（上のパネル）またはＸ１（「Ｘ１」）細胞（すなわち、ＴＸＮＩＰ ＫＯ／ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＨＬＡ－Ｅ ＫＩ＆Ｂ２Ｍ ＫＯ／ＴＮＦＡＩＰ３（Ａ２０）－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ ＫＩ）から分化させたＰＥＣ細胞および第６段階（Ｓ６）の細胞における選択された遺伝子発現を示す。
図９は、野生型（ＷＴ）細胞またはＴＸＮＩＰ ＫＯ／ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＨＬＡ－Ｅ ＫＩ＆Ｂ２Ｍ ＫＯ／ＴＮＦＡＩＰ３（Ａ２０）－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ ＫＩ細胞（Ｌ１Ｖ０２８－Ｃ３、Ｌ１Ｖ０２８－２４）から分化させたＰＥＣ細胞におけるＣＨＧＡ、ＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１に関するフローサイトメトリーを示す。
図１０Ａは、野生型（ＷＴ）細胞から分化させた第６段階（Ｓ６）の細胞におけるＣＨＧＡ、ＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１に関するフローサイトメトリーを示す。
図１０Ｂは、Ｘ１細胞（すなわち、ＴＸＮＩＰ ＫＯ／ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＨＬＡ－Ｅ ＫＩ＆Ｂ２Ｍ ＫＯ／ＴＮＦＡＩＰ３（Ａ２０）－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ ＫＩ）から分化させた第６段階（Ｓ６）の細胞におけるＣＨＧＡ、ＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１に関するフローサイトメトリーを示す。
図１１は、Ｌ１Ｖ００９Ｂバルク細胞（ＧＲＰ１）またはＬ１Ｖ００８クローン分離株（Ｂ２Ｍ ＫＯ／ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ ＫＩ；ＧＲＰ２およびＧＲＰ３）または対照細胞（ＧＲＰ４）の細胞凝集体を移植した胸腺欠損ヌードラットから、ＧＲＰ１－３については３ｇ／ｋｇのグルコースの腹腔内投与の９０分後、およびＧＲＰ４については投与の６０分後に得た血液試料中の１２週間、１６週間、２０週間、２４週間目のＣペプチドレベルを示す。
図１２は、Ｂ２Ｍ ＫＯ／ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ ＫＩまたは対照細胞由来の細胞凝集体を移植した胸腺欠損ヌードラットから、３ｇ／ｋｇのグルコースの腹腔内投与の９０分（２４週間時点での読み取りについては６０分）後に得た血液試料中の１２週間、１６週間、２０週間、２４週間目のＣペプチドレベルを示す。
図１３は、改変されていない（ＮＣＧ）またはＢ２Ｍ ＫＯ／ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ ＫＩ＆ＴＸＮＩＰ ＫＯ／ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＨＬＡ－Ｅ ＫＩ（Ｘ１）のＰＥＣ段階または第６段階（Ｓ６）に分化させた細胞凝集体を含有するカプセルを移植したＮＳＧマウスから、グルコース刺激後に得た血液試料中の１２週間および１６週間目のＣペプチドレベルを示す。
図１４は、マウスのＰＥＣ－対照（ＮＣＧ）およびＰＥＣ－Ｘ１（Ｂ２Ｍ ＫＯ／ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ ＫＩおよびＴＸＮＩＰ ＫＯ／ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＨＬＡ－Ｅ ＫＩ）群における、グルコース刺激後の１２週間、１６週間、２０週間、２４週間目の平均Ｃペプチドレベルを示す。
図１５は、Ｂ２Ｍ ＫＯ／ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ ＫＩ＆ＴＸＮＩＰ ＫＯ／ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＨＬＡ－Ｅ ＫＩ（Ｘ１）細胞の改変されていないもの（ＣＯＮ）またはクローン（すなわち、６Ｄ０９、６Ｈ０７、および５Ｃ１０）から分化させた細胞を含有するカプセルを移植したＮＳＧマウスにおける、１２週間、１６週間、および２０週間目のＣペプチドレベルを示す。
図１６は、Ｂ２Ｍ－ＣＡＧＧＳ－ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＣＤ７３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ドナーベクターのプラスミドマップを示す。
図１７は、Ｌ１Ｖ０１７Ｂ細胞（すなわち、ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ ＫＩおよびＢ２Ｍ ＫＯ）、Ｌ１Ｖ０１８Ｂ細胞（すなわち、ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＣＤ７３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ ＫＩおよびＢ２Ｍ ＫＯ）、およびＬ１Ｖ０１９Ｂ細胞（すなわち、ＴＮＦＡＩＰ３（Ａ２０）－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ ＫＩおよびＢ２Ｍ ＫＯ）におけるＳＯＸ１７およびＦＯＸＡ２発現に関するフローサイトメトリーを示す。
図１８は、Ｌ１Ｖ０１７Ｂ細胞（すなわち、ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ ＫＩおよびＢ２Ｍ ＫＯ）、Ｌ１Ｖ０１８Ｂ細胞（すなわち、ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＣＤ７３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ ＫＩおよびＢ２Ｍ ＫＯ）、およびＬ１Ｖ０１９Ｂ細胞（すなわち、ＴＮＦＡＩＰ３（Ａ２０）－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ ＫＩおよびＢ２Ｍ ＫＯ）におけるＣＨＧＡ、ＮＫＸ６．１、およびＰＤＸ１発現に関するフローサイトメトリーを示す。
図１９は、Ｌ１Ｖ０１７Ｂ細胞（すなわち、ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ ＫＩおよびＢ２Ｍ ＫＯ）、Ｌ１Ｖ０１８Ｂ細胞（すなわち、ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＣＤ７３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ ＫＩおよびＢ２Ｍ ＫＯ）、およびＬ１Ｖ０１９Ｂ細胞（すなわち、ＴＮＦＡＩＰ３（Ａ２０）－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ ＫＩおよびＢ２Ｍ ＫＯ）における種々のマーカーの遺伝子発現の時間経過を示す。
図２０Ａは、コード領域にフレームシフトを引き起こす＋１および－７の顕著な編集と共に、Ｘ１（Ｂ２Ｍ ＫＯ／ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ ＫＩ＆ＴＸＮＩＰ ＫＯ／ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＨＬＡ－Ｅ ＫＩ）＋ＴＧＦ－β２ ＫＯ細胞（「Ｌ３Ｖ００２Ｂ」）におけるＴＧＦ－β２遺伝子の９０％のＫＯを示すＴＩＤＥ分析を示す。
図２０Ｂは、コード領域にフレームシフトを引き起こす＋１および－７の顕著な編集と共に、Ｘ４（Ｂ２Ｍ ＫＯ／ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ ＫＩ＆ＴＸＮＩＰ ＫＯ／ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＨＬＡ－Ｅ ＫＩ＆ＣＩＩＴＡ ＫＯ／ＣＤ３９ ＫＩ）＋ＴＧＦ－β２細胞（「Ｌ３Ｖ００４Ｂ」）におけるＴＧＦ－β２遺伝子の９０％のＫＯを示すＴＩＤＥ分析を示す。
図２１は、末梢血単核細胞増殖アッセイを使用した、Ｘ１およびＢ２Ｍ ＫＯ編集された細胞の存在下、培地中にＴＧＦ－β遮断薬が存在するまたは存在しない場合の免疫回避アッセイデータを示す。
図２２Ａは、分化させた野生型、Ｖ１Ｂ（ＨＬＡ－Ｅ ＫＩ、ＴＸＮＩＰ ＫＯ、ＰＤ－Ｌ－１ ＫＩ、Ｂ２Ｍ ＫＯ）、およびＴＧＦ－β２ ＫＯ ＰＥＣ細胞を７２時間存在させた馴化培地中に分泌されたＴＧＦ－β２に対するＥＬＩＳＡアッセイからのデータを示す。
図２２Ｂは、分化させた野生型、Ｖ１Ｂ（ＨＬＡ－Ｅ ＫＩ、ＴＸＮＩＰ ＫＯ、ＰＤ－Ｌ－１ ＫＩ、Ｂ２Ｍ ＫＯ）、およびＴＧＦ－β２ ＫＯ ＰＥＣ細胞を７２時間存在させた馴化培地中に分泌されたＴＧＦ－β１に対するＥＬＩＳＡアッセイからのデータを示す。
図２３Ａは、Ｖ１ＢおよびＴＧＦ－β２ ＫＯ ＰＥＣ細胞から分泌されたＴＧＦ－βについてのデータを提示する。
図２３Ｂは、Ｖ１ＢおよびＴＧＦ－β２ ＫＯ ＰＥＣ細胞から分泌されたＧＤＦ－９についてのデータを提示する。
図２３Ｃは、Ｖ１ＢおよびＴＧＦ－β２ ＫＯ ＰＥＣ細胞から分泌されたＰＤＧＦ－ＡＡについてのデータを提示する。
図２４Ａ～２４Ｂは、ＷＴ、Ｖ１Ｂ、およびＸ１ ＰＥＣ細胞からの馴化培地（図２４Ａ）、ならびにＷＴおよびＴＧＦ－β２ ＫＯ ＰＥＣ細胞からの馴化培地（図２４Ｂ）と共にヒト肺線維芽細胞（ＭＲＣ－５）細胞を使用した線維芽細胞遊走アッセイを示す。
図２５Ａ～２５Ｃは、ＷＴ、Ｖ１Ｂ、およびＸ１ ＰＥＣ細胞からの馴化培地（図２５Ａ）、ＷＴおよびＴＧＦ－β２ ＫＯ ＰＥＣ細胞からの馴化培地（図２５Ｂ）、ならびにＷＴ、Ｘ４（Ｌ３Ｖ００３Ｂ）、およびＸ４＋ＴＧＦ－β２ ＫＯ（Ｌ３Ｖ００４Ｂ）ＰＥＣ細胞からの馴化培地（図２５Ｃ）と共にヒト線維肉腫（ＨＴ１０８０）細胞を使用した線維芽細胞遊走アッセイを示す。 図２５Ａ～２５Ｃは、ＷＴ、Ｖ１Ｂ、およびＸ１ ＰＥＣ細胞からの馴化培地（図２５Ａ）、ＷＴおよびＴＧＦ－β２ ＫＯ ＰＥＣ細胞からの馴化培地（図２５Ｂ）、ならびにＷＴ、Ｘ４（Ｌ３Ｖ００３Ｂ）、およびＸ４＋ＴＧＦ－β２ ＫＯ（Ｌ３Ｖ００４Ｂ）ＰＥＣ細胞からの馴化培地（図２５Ｃ）と共にヒト線維肉腫（ＨＴ１０８０）細胞を使用した線維芽細胞遊走アッセイを示す。
詳細な説明
Ｉ．定義
欠失：本明細書で使用される場合、「欠失」という用語は、「遺伝子欠失」または「ノックアウト」という用語と互換的に使用されることもあり、一般に、任意の分子生物学的方法、例えば、本明細書に記載の方法によって、例えば、ゲノムＤＮＡのある部位にエンドヌクレアーゼおよび少なくとも１つのｇＲＮＡを送達することによって、ゲノムＤＮＡのある部位または領域が除去される遺伝子改変を指す。任意の数のヌクレオチドを欠失させることができる。一部の実施形態では、欠失は、少なくとも１ヌクレオチド、少なくとも２ヌクレオチド、少なくとも３ヌクレオチド、少なくとも４ヌクレオチド、少なくとも５ヌクレオチド、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１５ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、または少なくとも２５ヌクレオチドの除去を伴う。一部の実施形態では、欠失は、１０～５０ヌクレオチド、２５～７５ヌクレオチド、５０～１００ヌクレオチド、５０～２００ヌクレオチド、または１００ヌクレオチドよりも多くの除去を伴う。一部の実施形態では、欠失は、１つの標的遺伝子、例えば、Ｂ２Ｍ遺伝子、ＴＸＮＩＰ遺伝子、ＣＩＩＴＡ遺伝子、またはＴＧＦ－β２遺伝子の一部または全部の除去を伴う。一部の実施形態では、欠失は、２つの標的遺伝子、３つの標的遺伝子、または４つの標的遺伝子の一部または全部の除去を伴う。一部の実施形態では、標的遺伝子の一部の除去は、遺伝子のプロモーターおよび／またはコード配列の全部または一部の除去を指す。一部の実施形態では、欠失は、標的遺伝子の転写調節因子、例えばプロモーター領域の除去を伴う。一部の実施形態では、欠失は、コード領域の全部または一部の除去を伴い、その結果、コード領域によって通常発現される産物がもはや発現されなくなる、短縮された形態で発現される、または低下したレベルで発現される。一部の実施形態では、欠失により、改変されていない細胞と比べて遺伝子の発現の低減が導かれる。一部の実施形態では、欠失により、改変されていない細胞と比べて遺伝子の発現の喪失が導かれる。
破壊：本明細書で使用される場合、「破壊（ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）」、「破壊すること（ｄｉｓｒｕｐｔｉｎｇ）」または「破壊された（ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ）」という用語は、標的遺伝子の発現のレベルを変更する遺伝子改変を指す。一部の態様では、破壊は、上記の通り、標的遺伝子内もしくはその近傍の少なくとも１つのヌクレオチドの欠失または標的遺伝子の一部もしくは全部の欠失に起因し得る。他の態様では、破壊はまた、標的遺伝子内またはその近傍の少なくとも１つのヌクレオチドの置換および／または少なくとも１つのヌクレオチドの挿入に起因し得る。さらなる態様では、破壊は、標的遺伝子の内部またはその近傍への１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドの挿入に起因し得る。一般に、本明細書で使用される場合、発現の破壊とは、標的遺伝子の発現の低減または排除を指す。一部の実施形態では、破壊は、発現のレベルの低下であり得る（例えば、改変されていない細胞のレベルの３０％未満、２５％未満、２０％未満、１０％未満、または５％未満を発現する）。一部の実施形態では、破壊は、発現の排除であり得る（例えば、発現なし、または検出不可能なレベルのＲＮＡおよび／もしくはタンパク質の発現）。発現は、任意の標準のＲＮＡに基づく、タンパク質に基づく、および／または抗体に基づく検出方法（例えば、ＲＴ－ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、免疫細胞化学など）を使用して測定することができる。検出可能なレベルとは、検出限界（ＬＯＤ）よりも高いレベルと定義され、検出限界（ＬＯＤ）は、所与の検出方法によって、統計的有意性を伴って測定（検出）することができる最低濃度である。
エンドヌクレアーゼ：本明細書で使用される場合、「エンドヌクレアーゼ」という用語は、一般に、ポリヌクレオチド内のリン酸ジエステル結合を切断する酵素を指す。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡポリヌクレオチド内のリン酸ジエステル結合を特異的に切断する。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）、メガヌクレアーゼ、ＭｅｇａＴＡＬ、またはＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼである。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼである。ある特定の態様では、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、例えば、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはＶ型ＣＲＩＳＰＲ Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼである。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても公知）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、もしくはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ、またはそのホモログ、その天然に存在する分子の組換え、そのコドン最適化バージョン、またはその改変バージョン、またはこれらの組合せである。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼにより、１つもしくは複数の一本鎖切断（ＳＳＢ）および／または１つもしくは複数の二本鎖切断（ＤＳＢ）を導入することができる。
外因性：「外因性」という用語は、本明細書で使用される場合、レシピエント細胞もしくは生物体の外部に起源を有するポリヌクレオチド配列、レシピエント細胞もしくは生物体の外部でアセンブルされたポリヌクレオチド配列、またはレシピエント細胞もしくは生物体を起源とするがレシピエントゲノムへ天然に存在する位置以外の位置で組み込まれたポリヌクレオチド配列、を指す。外因性ポリヌクレオチド配列は、遺伝子配列を含み得る、遺伝子のコード配列（ＣＤＳ）を含み得る、１つよりも多くの遺伝子由来のコード配列を含み得る、プロモーター配列、エンハンサー配列、および／もしくは他の調節エレメントを含み得る、リボソームスキップ配列を含み得る、ならびに／または人工的な配列を含み得る。外因性ポリヌクレオチドをコドン最適化して、レシピエント細胞または生物体における効率的な翻訳を確実にすることができる。
遺伝子改変：本明細書で使用される場合、「遺伝子改変」という用語は、一般に、任意の分子生物学的方法、例えば、本明細書に記載の方法を使用して、例えば、ゲノムＤＮＡのある部位にエンドヌクレアーゼおよび少なくとも１つのｇＲＮＡを送達することによって、遺伝子編集されたまたは操作されたゲノムＤＮＡのある部位を指す。遺伝子改変の例としては、挿入、欠失、重複、逆位、および転座、ならびにこれらの組合せが挙げられる。一部の実施形態では、遺伝子改変は、欠失である。一部の実施形態では、遺伝子改変は、挿入である。他の実施形態では、遺伝子改変は、挿入－欠失変異（またはインデル）であり、したがって、標的遺伝子の読み枠がシフトし、それにより遺伝子産物の変更が導かれるまたは遺伝子産物がもたらされなくなる。
ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）：本明細書で使用される場合、「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」という用語は、一般に、エンドヌクレアーゼと相互作用する、例えば、エンドヌクレアーゼに結合し、標的ゲノム部位または領域と結合するまたはハイブリダイズすることができる短いリボ核酸を指す。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、スペーサー伸長領域を含み得る。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長領域を含み得る。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、一本鎖である。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、天然に存在するヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、化学修飾されたｇＲＮＡである。一部の実施形態では、化学修飾されたｇＲＮＡは、化学修飾、例えば、２’－Ｏ－メチル糖修飾を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含むｇＲＮＡである。一部の実施形態では、化学修飾されたｇＲＮＡは、修飾された核酸骨格を含む。一部の実施形態では、化学修飾されたｇＲＮＡは、２’－Ｏ－メチル－ホスホロチオエート残基を含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡをＤＮＡエンドヌクレアーゼと予め複合体を形成することができる。
挿入：本明細書で使用される場合、「遺伝子挿入」または「ノックイン」という用語と互換的に使用されることもある「挿入」という用語は、一般に、任意の分子生物学的方法、例えば、本明細書に記載の方法、例えば、ゲノムＤＮＡのある部位にエンドヌクレアーゼおよび少なくとも１つのｇＲＮＡを送達することによって、ゲノムＤＮＡのある部位または領域にポリヌクレオチドが導入または付加される遺伝子改変を指す。一部の実施形態では、外因性ポリヌクレオチドの挿入は、標的遺伝子の内部またはその近傍に行われる。一部の実施形態では、外因性ポリヌクレオチドの挿入は、以前の遺伝子改変、例えば、欠失または挿入－欠失変異の部位にされたゲノムＤＮＡの部位の内部またはその近傍に行われ得る。一部の実施形態では、挿入は、以前の遺伝子改変、例えば、欠失または挿入－欠失変異の部位と部分的に重複する、その部位と完全に重複する、またはその部位内に含有される、ゲノムＤＮＡの部位に行われる。一部の実施形態では、挿入と同時に、挿入の標的とされた部位の遺伝子の破壊が導かれる。一部の実施形態では、挿入は、セーフハーバー遺伝子座に行われる。一部の実施形態では、挿入は、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの導入を伴う。一部の実施形態では、挿入は、免疫寛容原性因子をコードするポリヌクレオチドの導入を伴う。一部の実施形態では、挿入は、生存因子をコードするポリヌクレオチドの導入を伴う。一部の実施形態では、挿入は、ＭＡＮＦ、ＴＮＦＡＩＰ３、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＰＤ－Ｌ－１、および／またはＨＬＡ－Ｅをコードするポリヌクレオチドの導入を伴う。一部の実施形態では、挿入は、外因性プロモーター、例えば、構成的プロモーター、例えば、ＣＡＧまたはＣＡＧＧＳプロモーターの導入を伴う。一部の実施形態では、挿入は、非コード遺伝子をコードするポリヌクレオチドの導入を伴う。一般に、挿入されるポリヌクレオチドは、挿入部位またはその近傍のゲノムＤＮＡに対して実質的な配列相同性を有する配列（例えば、相同アーム）に挟まれている。
主要組織適合性遺伝子複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）：本明細書で使用される場合、「主要組織適合性遺伝子複合体クラスＩ」または「ＭＨＣ－Ｉ」という用語は、一般に、哺乳動物、例えばヒトを含めた脊椎動物における全ての有核細胞の細胞表面上に見いだされ、細胞内に由来する（すなわち、細胞基質）非自己または外来抗原、例えば、タンパク質のペプチドを、免疫応答を刺激するために、細胞傷害性Ｔ細胞、例えばＣＤ８＋Ｔ細胞にディスプレイする機能を果たす、生体分子のクラスを指す。一部の実施形態では、ＭＨＣ－Ｉ生体分子は、ＭＨＣ－Ｉ遺伝子またはＭＨＣ－Ｉタンパク質である。全てのＭＨＣ－Ｉタンパク質の細胞表面発現にはＭＨＣ－Ｉタンパク質のベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）タンパク質との複合体形成が必要である。一部の実施形態では、改変されていない細胞と比べてＭＨＣ－Ｉヒト白血球抗原（ＨＬＡ）の発現を減少させることには、ＭＨＣ－Ｉ遺伝子の発現の減少（または低減）が伴う。一部の実施形態では、改変されていない細胞と比べてＭＨＣ－Ｉヒト白血球抗原（ＨＬＡ）の発現を減少させることには、ＭＨＣ－Ｉタンパク質の細胞表面発現の減少（または低減）が伴う。一部の実施形態では、ＭＨＣ－Ｉ生体分子は、ＨＬＡ－Ａ（ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ Ｎｏ：３１０５）、ＨＬＡ－Ｂ（ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ Ｎｏ：３１０６）、ＨＬＡ－Ｃ（ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ Ｎｏ：３１０７）、またはＢ２Ｍ（ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ Ｎｏ：５６７）である。
主要組織適合性遺伝子複合体クラスＩＩ（ＭＨＣ－ＩＩ）：本明細書で使用される場合、「主要組織適合性遺伝子複合体クラスＩＩ」または「ＭＨＣ－ＩＩ」という用語は、一般に、哺乳動物、例えばヒトを含めた脊椎動物における抗原提示細胞の細胞表面上に通常見いだされ、細胞の外部に由来する（細胞外）非自己または外来抗原、例えばタンパク質のペプチドを、免疫応答を刺激するために、細胞傷害性Ｔ細胞、例えばＣＤ８＋Ｔ細胞にディスプレイする機能を果たす、生体分子のクラスを指す。一部の実施形態では、抗原提示細胞は、樹状細胞、マクロファージ、またはＢ細胞である。一部の実施形態では、ＭＨＣ－ＩＩ生体分子は、ＭＨＣ－ＩＩ遺伝子またはＭＨＣ－ＩＩタンパク質である。一部の実施形態では、改変されていない細胞と比べてＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原（ＨＬＡ）の発現を減少させることには、ＭＨＣ－ＩＩ遺伝子の発現の減少（または低減）が伴う。一部の実施形態では、改変されていない細胞と比べてＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原（ＨＬＡ）の発現を減少させることには、ＭＨＣ－ＩＩタンパク質の細胞表面発現の減少（または低減）が伴う。一部の実施形態では、ＭＨＣ－ＩＩ生体分子は、ＨＬＡ－ＤＰＡ（ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ Ｎｏ：３１１３）、ＨＬＡ－ＤＰＢ（ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ Ｎｏ：３１１５）、ＨＬＡ－ＤＭＡ（ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ Ｎｏ：３１０８）、ＨＬＡ－ＤＭＢ（ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ Ｎｏ：３１０９）、ＨＬＡ－ＤＯＡ（ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ Ｎｏ：３１１１）、ＨＬＡ－ＤＯＢ（ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ Ｎｏ：３１１２）、ＨＬＡ－ＤＱＡ（ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ Ｎｏ：３１１７）、ＨＬＡ－ＤＱＢ（ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ Ｎｏ：３１１９）、ＨＬＡ－ＤＲＡ（ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ Ｎｏ：３１２２）、またはＨＬＡ－ＤＲＢ（ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ Ｎｏ：３１２３）である。
ポリヌクレオチド：本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、「核酸」という用語と互換的に使用されることもあり、一般に、２つまたはそれよりも多くのヌクレオチドを含む生体分子を指す。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、少なくとも２ヌクレオチド、少なくとも５ヌクレオチド、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも３０ヌクレオチド、少なくとも４０ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチド、少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも２５０ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、または任意の数のヌクレオチドを含む。例えば、ポリヌクレオチドは、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも約６００ヌクレオチド、少なくとも約７００ヌクレオチド、少なくとも約８００ヌクレオチド、少なくとも約９００ヌクレオチド、少なくとも約１０００ヌクレオチド、少なくとも約２０００ヌクレオチド、少なくとも約３０００ヌクレオチド、少なくとも約４０００ヌクレオチド、少なくとも約４５００ヌクレオチド、または少なくとも約５０００ヌクレオチドを含み得る。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡもしくはＲＮＡ分子またはハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡ分子であり得る。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であり得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡのある部位または領域である。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、改変されていない細胞またはユニバーサルドナー細胞のゲノム内に含まれる内因性遺伝子である。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡに組み込まれない外因性ポリヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡに組み込まれる外因性ポリヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、プラスミドまたはアデノ随伴ウイルスベクターである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、環状または直鎖状分子である。
セーフハーバー遺伝子座：本明細書で使用される場合、「セーフハーバー遺伝子座」という用語は、一般に、細胞に対する有害効果を伴わずに適応させることが可能であり得るゲノムＤＮＡの任意の位置、部位、または領域を指す。一部の実施形態では、セーフハーバー遺伝子座は、遺伝子内または遺伝子外領域である。一部の実施形態では、セーフハーバー遺伝子座は、一般には転写が行われないゲノムＤＮＡの領域である。一部の実施形態では、セーフハーバー遺伝子座は、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１ Ｒ１２Ｃ）、ＡＬＢ、Ａｎｇｐｔｌ３、ＡｐｏＣ３、ＡＳＧＲ２、ＣＣＲ５、ＦＩＸ（Ｆ９）、Ｇ６ＰＣ、Ｇｙｓ２、ＨＧＤ、Ｌｐ（ａ）、Ｐｃｓｋ９、Ｓｅｒｐｉｎａ１、ＴＦ、またはＴＴＲ遺伝子座である。一部の実施形態では、セーフハーバー遺伝子座は、Sadelain, M. et al., "Safe harbours for the integration of new DNA in the human genome," Nature Reviews Cancer, 2012, Vol 12, pages 51-58に記載されている。
安全スイッチ：本明細書で使用される場合、「安全スイッチ」という用語は、一般に、細胞がアポトーシスを受けるように導く生体分子を指す。一部の実施形態では、安全スイッチは、タンパク質または遺伝子である。一部の実施形態では、安全スイッチは、自殺遺伝子である。一部の実施形態では、安全スイッチ、例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）は、プロドラッグ、例えばガンシクロビルを代謝することにより、細胞がアポトーシスを受けるように導く。一部の実施形態では、安全スイッチの存在の過剰発現自体が、細胞がアポトーシスを受けるように導く。一部の実施形態では、安全スイッチは、ｐ５３に基づく分子、ＨＳＶ－ｔｋ、または誘導性カスパーゼ－９である。
対象：本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、哺乳動物を指す。一部の実施形態では、対象は、非ヒト霊長類または齧歯類である。一部の実施形態では、対象は、ヒトである。一部の実施形態では、対象は、疾患または障害を有する、それを有する疑いがある、またはそのリスクがある。一部の実施形態では、対象は、疾患または障害の１つまたは複数の症状を有する。
生存因子：本明細書で使用される場合、「生存因子」という用語は、一般に、細胞において増加または減少すると、細胞、例えばユニバーサルドナー細胞が、宿主対象への移植または生着後に改変されていない細胞と比べて高い生存率で生存することが可能になる、タンパク質（例えば、本明細書に記載のポリヌクレオチドによって発現される）を指す。一部の実施形態では、生存因子は、ヒト生存因子である。一部の実施形態では、生存因子は、細胞生存に関与する極めて重要な経路のメンバーである。一部の実施形態では、細胞生存に関与する極めて重要な経路は、低酸素、活性酸素種、栄養分欠乏、および／または酸化ストレスと密接に関係するものである。一部の実施形態では、少なくとも１つの生存因子の遺伝子改変、例えば、欠失または挿入により、ユニバーサルドナー細胞が、生着後に、改変されていない細胞よりも長い期間、例えば、少なくとも１．０５倍、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２５倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、または少なくとも５０倍の長い期間生存することが可能になる。一部の実施形態では、生存因子は、ＭＡＮＦ（ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ Ｎｏ：７８７３）、ＺＮＦ１４３（ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ Ｎｏ：７７０２）、ＴＸＮＩＰ（ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ Ｎｏ：１０６２８）、ＦＯＸＯ１（ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ Ｎｏ：２３０８）、またはＪＮＫ（ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ Ｎｏ：５５９９）である。一部の実施形態では、生存因子を、細胞、例えばユニバーサルドナー細胞に挿入する。一部の実施形態では、生存因子を、細胞、例えばユニバーサルドナー細胞から欠失させる。一部の実施形態では、ＭＡＮＦをコードするポリヌクレオチドの挿入により、細胞、例えばユニバーサルドナー細胞が、宿主対象への移植または生着後に、改変されていない細胞と比べて高い生存率で生存することが可能になる。一部の実施形態では、ＴＸＮＩＰ遺伝子の内部またはその近傍の欠失または挿入－欠失変異により、細胞、例えばユニバーサルドナー細胞が、宿主対象への移植または生着後に、改変されていない細胞と比べて高い生存率で生存することが可能になる。
免疫寛容原性因子：本明細書で使用される場合、「免疫寛容原性因子」という用語は、一般に、細胞において増加または減少すると、細胞、例えばユニバーサルドナー細胞が、宿主対象への移植または生着後に、改変されていない細胞と比べて高い率で、免疫拒絶反応を阻害するまたは回避することが可能になる、タンパク質（例えば、本明細書に記載のポリヌクレオチドによって発現される）を指す。一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、ヒト免疫寛容原性因子である。一部の実施形態では、少なくとも１つの免疫寛容原性因子の遺伝子改変（例えば、少なくとも１つの免疫寛容原性因子の挿入または欠失）により、細胞、例えばユニバーサルドナー細胞が、生着後に、改変されていない細胞よりも少なくとも１．０５倍、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２５倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、または少なくとも５０倍の率で免疫拒絶反応を阻害するまたは回避することが可能になる。一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、ＴＮＦＡＩＰ３（ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ Ｎｏ：７１２８）、ＣＤ３９（ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ Ｎｏ：９５３）、ＣＤ７３（ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ Ｎｏ．４９０７）、ＰＤ－Ｌ－１（ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ Ｎｏ：２９１２６）、ＨＬＡ－Ｅ（ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ Ｎｏ：３１３３）、ＨＬＡ－Ｇ（ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ Ｎｏ：３１３５）、ＣＴＬＡ－４（ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ Ｎｏ：１４９３）、またはＣＤ４７（ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ Ｎｏ：９６１）である。一部の実施形態では、免疫寛容原性因子を、細胞、例えばユニバーサルドナー細胞に挿入する。一部の実施形態では、免疫寛容原性因子を、細胞、例えばユニバーサルドナー細胞から欠失させる。一部の実施形態では、ＴＮＦＡＩＰ３、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤ－Ｌ－１、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＴＬＡ－４、および／またはＣＤ４７をコードするポリヌクレオチドの挿入により、細胞、例えばユニバーサルドナー細胞が、宿主対象への移植または生着後に、免疫拒絶反応を阻害するまたは回避することが可能になる。
ＭＨＣ－ＩまたはＭＨＣ－ＩＩの転写調節因子：本明細書で使用される場合、「ＭＨＣ－ＩまたはＭＨＣ－ＩＩの転写調節因子」という用語は、一般に、ＭＨＣ－Ｉおよび／またはＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原の発現をモジュレートする、例えば、増加または減少させる生体分子を指す。一部の実施形態では、生体分子は、ポリヌクレオチド、例えば、遺伝子、またはタンパク質である。一部の実施形態では、ＭＨＣ－ＩまたはＭＨＣ－ＩＩの転写調節因子は、少なくとも１つのＭＨＣ－ＩまたはＭＨＣ－ＩＩタンパク質の細胞表面発現を増加または減少させる。一部の実施形態では、ＭＨＣ－ＩまたはＭＨＣ－ＩＩの転写調節因子は、少なくとも１つのＭＨＣ－ＩまたはＭＨＣ－ＩＩ遺伝子の発現を増加または減少させる。一部の実施形態では、転写調節因子は、ＣＩＩＴＡ（ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ Ｎｏ：４２６１）またはＮＬＲＣ５（ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ Ｎｏ：８４１６６）である。一部の実施形態では、ＣＩＩＴＡまたはＮＬＲＣ５の発現の欠失または低減により、少なくとも１つのＭＨＣ－ＩまたはＭＨＣ－ＩＩ遺伝子の発現が減少する。
ユニバーサルドナー細胞：本明細書で使用される場合、「ユニバーサルドナー細胞」という用語は、一般に、改変されていない細胞と比べて、細胞移植の間に同種他家拒絶反応を受けにくい、かつ／または移植後に生存の増大を示す、遺伝子改変された細胞を指す。一部の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子改変された細胞は、ユニバーサルドナー細胞である。一部の実施形態では、ユニバーサルドナー細胞は、改変されていない細胞と比較して、免疫回避および／または移植後生存の増大を有する。一部の実施形態では、ユニバーサルドナー細胞は、改変されていない細胞と比較して、細胞生存の増大を有する。一部の実施形態では、ユニバーサルドナー細胞は、幹細胞であり得る。一部の実施形態では、ユニバーサルドナー細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、成体幹細胞（ＡＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、または造血幹もしくは前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）（ＨＳＰＣ）（造血幹細胞（ＨＳＣ）とも称される）であり得る。一部の実施形態では、ユニバーサルドナー細胞は、分化した細胞であり得る。一部の実施形態では、ユニバーサルドナー細胞は、体細胞（例えば、免疫系細胞）であり得る。一部の実施形態では、ユニバーサルドナー細胞は、対象に投与される。一部の実施形態では、ユニバーサルドナー細胞は、疾患を有する、それを有する疑いがある、またはそのリスクがある対象に投与される。一部の実施形態では、ユニバーサルドナー細胞は、系列が制限された前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）または完全に分化した体細胞に分化することが可能である。一部の実施形態では、系列が制限された前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）は、膵臓内胚葉前駆体（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）、膵臓内分泌前駆体（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）、間葉系前駆細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）、筋肉前駆細胞（ｍｕｓｃｌｅ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）、芽細胞、造血前駆細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）、または神経前駆細胞（ｎｅｕｒａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）である。一部の実施形態では、完全に分化した体細胞は、内分泌細胞、例えば、膵ベータ細胞、上皮細胞、内胚葉細胞、マクロファージ、肝細胞、脂肪細胞、腎臓細胞、血液細胞、または免疫系細胞である。一部の実施形態では、完全に分化した体細胞は、心筋細胞である。
改変されていない細胞：本明細書で使用される場合、「改変されていない細胞」という用語は、ＭＨＣ－Ｉ、ＭＨＣ－Ｉ、ＭＨＣ－ＩもしくはＭＨＣ－ＩＩの転写調節因子、生存因子、および／または免疫寛容原性因子をコードするポリヌクレオチドまたは遺伝子が関与する遺伝子改変に供されていない細胞を指す。一部の実施形態では、改変されていない細胞は、幹細胞であり得る。一部の実施形態では、改変されていない細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、成体幹細胞（ＡＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、または造血幹もしくは前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）（ＨＳＰＣ）（造血幹細胞（ＨＳＣ）とも称される）であり得る。一部の実施形態では、改変されていない細胞は、分化した細胞であり得る。一部の実施形態では、改変されていない細胞は、体細胞（例えば、免疫系細胞、例えばＴ細胞、例えばＣＤ８＋Ｔ細胞）から選択することができる。ユニバーサルドナー細胞が「改変されていない細胞に対して」比較される場合、ユニバーサルドナー細胞と改変されていない細胞は同じ細胞型であるまたは共通の親細胞株を共有する、例えば、ユニバーサルドナーｉＰＳＣは改変されていないｉＰＳＣに対して比較される。
遺伝子の内部またはその近傍：本明細書で使用される場合、「遺伝子の内部またはその近傍」という用語は、前記遺伝子のイントロンもしくはエクソン構成成分である、または前記遺伝子の近位に位置する、ゲノムＤＮＡの部位または領域を指す。一部の実施形態では、ゲノムＤＮＡの部位は、それが前記遺伝子のイントロンまたはエクソンの少なくとも一部分を含む場合、遺伝子の内部にある。一部の実施形態では、遺伝子の近傍に位置するゲノムＤＮＡの部位は、前記遺伝子の５’または３’末端（例えば、前記遺伝子のコード領域の５’または３’末端）に存在し得る。一部の実施形態では、遺伝子の近傍に位置するゲノムＤＮＡの部位は、前記遺伝子の発現をモジュレートするプロモーター領域またはリプレッサー領域であり得る。一部の実施形態では、遺伝子の近傍に位置するゲノムＤＮＡの部位は、前記遺伝子と同じ染色体上に存在し得る。一部の実施形態では、ゲノムＤＮＡの部位または領域は、それが、前記遺伝子の５’または３’末端（例えば、前記遺伝子のコード領域の５’または３’末端）から５０Ｋｂ以内、４０Ｋｂ以内、３０Ｋｂ以内、２０Ｋｂ以内、１０Ｋｂ以内、５Ｋｂ以内、１Ｋｂ以内、またはそれよりも近くにある場合、遺伝子の近傍に存在する。
本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、包括的またはオープンエンドであり、追加的な、列挙されていない要素、成分、または方法のステップは排除されない；「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ）」という句は、クローズドであり、明記されていない要素、ステップ、または成分はいずれも排除される；「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）または「本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ）」という句は、特定のさらなる構成成分、すなわち、化合物、組成物、または方法に必須の特徴に実質的に影響を及ぼさない構成成分が存在し得ることを意味する。配列に関して使用される場合、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）または「本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ）」という句は、配列が、配列の必須の機能も特性も変化させない置換および／または追加的な配列を含み得ることを意味する。
ＩＩ．免疫応答を回避し、生存を増大させるための戦略
遺伝子改変された細胞、すなわち、ユニバーサルドナー細胞が、対象への生着後のそれらの生存もしくは生存率を増大させる、および／または免疫応答を回避することを可能にするための戦略が本明細書に記載される。一部の実施形態では、これらの戦略により、ユニバーサルドナー細胞が、改変されていない細胞よりも高い成功率で生存するおよび／または免疫応答を回避することが可能になる。一部の実施形態では、遺伝子改変された細胞は、生存因子をコードする少なくとも１つの遺伝子の内部またはその近傍への少なくとも１つの遺伝子改変の導入を含み、ここで、遺伝子改変は、免疫寛容原性因子をコードするポリヌクレオチドの挿入を含む。ユニバーサルドナー細胞は、１つもしくは複数のＭＨＣ－ＩもしくはＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原またはＭＨＣ－ＩもしくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の構成成分もしくは転写調節因子をコードする遺伝子の内部またはその近傍に少なくとも１つの遺伝子改変をさらに含み得、ここで、前記遺伝子改変は、第２の免疫寛容原性因子をコードするポリヌクレオチドの挿入を含む。
一部の実施形態では、遺伝子改変された細胞は、少なくとも１つの遺伝子の内部またはその近傍に、改変されていない細胞と比べて１つまたは複数のＭＨＣ－ＩおよびＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原の発現を減少させる少なくとも１つの遺伝子改変；改変されていない細胞と比べて免疫寛容原性因子をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドの発現を増大させる少なくとも１つの遺伝子改変；ならびに改変されていない細胞と比べて生存因子をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現を変更する少なくとも１つの遺伝子改変の導入を含む。他の実施形態では、遺伝子改変された細胞は、少なくとも１つの遺伝子の内部またはその近傍に、改変されていない細胞と比べて１つまたは複数のＭＨＣ－ＩおよびＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原の発現を変更する少なくとも１つの欠失または挿入－欠失変異；ならびに１つまたは複数のＭＨＣ－Ｉ ＨＬＡおよびＭＨＣ－ＩＩ ＨＬＡの発現を変更する遺伝子の欠失部位と部分的にオーバーラップする、完全にオーバーラップするまたはその中に含有される部位への少なくとも１つの免疫寛容原性因子をコードするポリヌクレオチドの少なくとも１つの挿入を含む。さらに他の実施形態では、遺伝子改変された細胞は、改変されていない細胞と比べて生存因子をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現を変更する少なくとも１つの遺伝子改変を含む。
主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）をコードする遺伝子は、ヒトＣｈｒ．６ｐ２１上に位置する。ＭＨＣ遺伝子によってコードされる、得られるタンパク質は、細胞移植の間のドナーとの適合性に必須の一連の表面タンパク質である。ＭＨＣ遺伝子は、ＭＨＣクラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）とＭＨＣクラスＩＩ（ＭＨＣ－ＩＩ）に分けられる。ＭＨＣ－Ｉ遺伝子（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬＡ－Ｃ）は、ほとんど全ての組織細胞型において発現され、「非自己」抗原がプロセシングされたペプチドをＣＤ８＋Ｔ細胞に提示し、それにより、ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞溶解性ＣＤ８＋Ｔ細胞への活性化を促進する。「非自己」ＭＨＣ－Ｉ分子を発現する移植されたまたは生着した細胞は、これらの細胞を対象とする頑強な細胞性免疫応答を引き起こし、最終的に、活性化された細胞溶解性ＣＤ８＋Ｔ細胞による移植されたまたは生着した細胞の消滅がもたらされる。ＭＨＣ－Ｉタンパク質は、小胞体において、細胞表面上に機能的なＭＨＣ－Ｉ分子を形成するために必須であるＢ２Ｍと密接に関連する。さらに、３種の非古典的ＭＨＣ－Ｉｂ分子（ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、およびＨＬＡ－Ｇ）が存在し、これらは、免疫調節機能を有する。ＭＨＣ－ＩＩ生体分子としては、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、およびＨＬＡ－ＤＲが挙げられる。ＭＨＣ－ＩおよびＭＨＣ－ＩＩ生体分子は、免疫応答におけるそれらの主要な機能に起因して、非宿主細胞の細胞生着後、例えば、再生医療を目的とした細胞生着後の免疫拒絶反応に寄与する。
ＭＨＣ－Ｉ細胞表面分子は、ＭＨＣによりコードされる重鎖（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、またはＨＬＡ－Ｃ）およびインバリアントサブユニットＢ２Ｍで構成される。したがって、細胞内のＢ２Ｍの濃度の低減により、ＭＨＣ－Ｉ細胞表面分子の細胞表面発現を低減させる有効な方法が可能になる。
一部の実施形態では、細胞は、１つまたは複数のＭＨＣ－ＩまたはＭＨＣ－ＩＩ遺伝子のゲノム改変を含む。一部の実施形態では、細胞は、ＭＨＣ－Ｉおよび／またはＭＨＣ－ＩＩの発現を調節する１つまたは複数のポリヌクレオチド配列のゲノム改変を含む。一部の実施形態では、本開示の遺伝子改変は、これだけに限定されないが、本明細書に記載の方法を含めた任意の遺伝子編集方法を使用して実施される。
一部の実施形態では、改変されていない細胞と比べて１つまたは複数のＭＨＣ－ＩおよびＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原の発現を減少させることは、例えば、ＭＨＣ－Ｉおよび／またはＭＨＣ－ＩＩ遺伝子内の少なくとも１つの塩基対を、直接、遺伝子欠失および／または挿入の標的にすることによって実現される。一部の実施形態では、改変されていない細胞と比べて１つまたは複数のＭＨＣ－ＩおよびＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原の発現を減少させることは、例えば、ＣＩＩＴＡ遺伝子を遺伝子欠失の標的とすることによって実現される。一部の実施形態では、改変されていない細胞と比べて１つまたは複数のＭＨＣ－ＩおよびＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原の発現を減少させることは、例えば、ＭＨＣ－ＩまたはＭＨＣ－ＩＩの少なくとも１つの転写調節因子を遺伝子欠失の標的とすることによって実現される。一部の実施形態では、ＭＨＣ－ＩまたはＭＨＣ－ＩＩの転写調節因子は、ＮＬＲＣ５、またはＣＩＩＴＡ遺伝子である。一部の実施形態では、ＭＨＣ－ＩまたはＭＨＣ－ＩＩの転写調節因子は、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸＡＮＫ、ＮＦＹ－Ａ、ＮＦＹ－Ｂ、ＮＦＹ－Ｃ、ＩＲＦ－１、および／またはＴＡＰ１遺伝子である。
一部の実施形態では、細胞のゲノムは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、および／またはＨＬＡ－Ｃ遺伝子の全体または一部が欠失するように改変されている。一部の実施形態では、細胞のゲノムは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、および／またはＨＬＡ－Ｃ遺伝子のプロモーター領域の全体または一部が欠失するように改変されている。一部の実施形態では、細胞のゲノムは、ＭＨＣ－ＩまたはＭＨＣ－ＩＩの転写調節因子をコードする遺伝子の全体または一部が欠失するように改変されている。一部の実施形態では、細胞のゲノムは、ＭＨＣ－ＩまたはＭＨＣ－ＩＩの転写調節因子をコードする遺伝子のプロモーター領域の全体または一部が欠失するように改変されている。
一部の実施形態では、細胞のゲノムは、β２ミクログロブリン、Ｂ２ミクログロブリン、またはＩＭＤ４３としても公知のベータ２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）の発現が破壊されるまたは減少するように改変されている。Ｂ２Ｍは、全ての多型ＭＨＣクラスＩ重鎖の表面発現に必要な共通のタンパク質サブユニットをコードする非多型遺伝子である。ＨＬＡ－Ｉタンパク質は、小胞体において、機能的な細胞表面に発現されるＨＬＡ－Ｉ分子を形成するために必須であるＢ２Ｍと密接に関連する。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、Ｂ２Ｍ遺伝子内の、５’－ＧＣＴＡＣＴＣＴＣＴＣＴＴＴＣＴＧＧＣＣ－３’配列（配列番号１）を含む部位を標的とする。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、Ｂ２Ｍ遺伝子内の、５’－ＧＧＣＣＧＡＧＡＴＧＴＣＴＣＧＣＴＣＣＧ－３’配列（配列番号２）を含む部位を標的とする。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、Ｂ２Ｍ遺伝子内の、５’－ＣＧＣＧＡＧＣＡＣＡＧＣＴＡＡＧＧＣＣＡ－３’配列（配列番号３）を含む部位を標的とする。代替の実施形態では、ｇＲＮＡは、Ｂ２Ｍ遺伝子内の、以下の配列のいずれかを含む部位を標的とする：５’－ＴＡＴＡＡＧＴＧＧＡＧＧＣＧＴＣＧＣＧＣ－３’（配列番号４）、５’－ＧＡＧＴＡＧＣＧＣＧＡＧＣＡＣＡＧＣＴＡ－３’（配列番号５）、５’－ＡＣＴＧＧＡＣＧＣＧＴＣＧＣＧＣＴＧＧＣ－３’（配列番号６）、５’－ＡＡＧＴＧＧＡＧＧＣＧＴＣＧＣＧＣＴＧＧ－３’（配列番号７）、５－ＧＧＣＣＡＣＧＧＡＧＣＧＡＧＡＣＡＴＣＴ－３’（配列番号８）、５’－ＧＣＣＣＧＡＡＴＧＣＴＧＴＣＡＧＣＴＴＣ－３’（配列番号９）、５’－ＣＴＣＧＣＧＣＴＡＣＴＣＴＣＴＣＴＴＴＣ－３’（配列番号１０）、５’－ＴＣＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＣＡＧＣＡＴＴＣ－３’（配列番号１１）、５’－ＴＴＣＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＣＡＧＣＡＴＴ－３’（配列番号１２）、または５’－ＡＣＴＣＴＣＴＣＴＴＴＣＴＧＧＣＣＴＧＧ－３’（配列番号１３）。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号２のポリヌクレオチド配列のＲＮＡバージョンを含む。他の実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号１または３～１３のいずれかのＲＮＡバージョンを含む。ｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ複合体は、Ｂ２Ｍ遺伝子座における標的部位を標的とし、切断する。ＮＨＥＪによる二本鎖切断の修復の結果、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失および／または少なくとも１つのヌクレオチドの挿入をもたらし、それにより、Ｂ２Ｍの発現を破壊または排除することができる。あるいは、Ｂ２Ｍ遺伝子座を、それぞれが異なるｇＲＮＡを含む少なくとも２つのＣＲＩＳＰＲ系によって標的とし、したがって、Ｂ２Ｍ遺伝子座における２つの部位を切断し、２つのカットの間の配列の欠失を導き、それにより、Ｂ２Ｍの発現を排除することができる。
一部の実施形態では、遺伝子改変された細胞は、改変されていない細胞と比べて、ＴＸＮＩＰなどの生存因子をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現を破壊する少なくとも１つの遺伝子改変を含む。一部の実施形態では、細胞のゲノムは、ＥＳＴ０１０２７、ＨＨＣＰＡ７８、ＴＨＩＦ、ＶＤＵＰ１、またはＡＲＲＤＣ６としても公知であるチオレドキシン相互作用タンパク質（ＴＸＮＩＰ）の発現が減少するように改変されている。ＴＸＮＩＰは、酸化還元の調節に関与する、代謝に関わる遺伝子であり、また、腫瘍抑制因子としても機能し得る。ＴＸＮＩＰのダウンレギュレーションまたはノックアウトにより、細胞を代謝ストレスから保護することができる。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ＴＸＮＩＰ遺伝子内の、５’－ＧＡＡＧＣＧＴＧＴＣＴＴＣＡＴＡＧＣＧＣ－３’配列（配列番号３２）を含む部位を標的とする。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ＴＸＮＩＰ遺伝子内の、５’－ＴＴＡＣＴＣＧＴＧＴＣＡＡＡＧＣＣＧＴＴ－３’配列（配列番号３３）を含む部位を標的とする。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ＴＸＮＩＰ遺伝子内の、５’－ＴＧＴＣＡＡＡＧＣＣＧＴＴＡＧＧＡＴＣＣ－３’配列（配列番号３４）を含む部位を標的とする。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ＴＸＮＩＰ遺伝子内の、５’－ＧＣＣＧＴＴＡＧＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＴＧ－３’配列（配列番号３５）を含む部位を標的とする。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ＴＸＮＩＰ遺伝子内の、５’－ＧＣＧＧＡＧＴＧＧＣＴＡＡＡＧＴＧＣＴＴ－３’配列（配列番号３６）を含む部位を標的とする。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ＴＸＮＩＰ遺伝子内の、５’－ＴＣＣＧＣＡＡＧＣＣＡＧＧＡＴＣＣＴＡＡ－３’配列（配列番号３７）を含む部位を標的とする。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ＴＸＮＩＰ遺伝子内の、５’－ＧＴＴＣＧＧＣＴＴＴＧＡＧＣＴＴＣＣＴＣ－３’配列（配列番号３８）を含む部位を標的とする。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ＴＸＮＩＰ遺伝子内の、５’－ＧＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＣＡＴＧＡＧＡＣＣ－３’配列（配列番号３９）を含む部位を標的とする。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ＴＸＮＩＰ遺伝子内の、５’－ＴＴＧＴＡＣＴＣＡＴＡＴＴＴＧＴＴＴＣＣ－３’配列（配列番号４０）を含む部位を標的とする。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ＴＸＮＩＰ遺伝子内の、５’－ＡＡＣＡＡＡＴＡＴＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＴ－３’配列（配列番号４１）を含む部位を標的とする。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号３７のポリヌクレオチド配列のＲＮＡバージョンを含む。他の実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号３２～３６または３８～４１のいずれか１つのＲＮＡバージョンを含む。ｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ複合体は、ＴＸＮＩＰ遺伝子座における標的部位を標的とし、切断する。ＮＨＥＪによる二本鎖切断の修復の結果、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失および／または少なくとも１つのヌクレオチドの挿入をもたらし、それにより、ＴＸＮＩＰの発現を破壊または排除することができる。あるいは、外因性遺伝子をコードするポリヌクレオチドのＴＸＮＩＰ遺伝子座への挿入により、ＴＸＮＩＰの発現を破壊または排除することができる。
一部の実施形態では、細胞のゲノムは、Ｃ２ＴＡ、ＣＩＩＴＡＩＶ、ＭＨＣ２ＴＡ、ＮＬＲＡ、またはクラスＩＩ主要組織適合性遺伝子複合体トランス活性化因子としても公知であるクラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）の発現が破壊されるように改変されている。ＣＩＩＴＡは、主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）遺伝子発現のマスター調節因子である。ＣＩＩＴＡは、タンパク質のヌクレオチド結合性ドメイン（ＮＢＤ）ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）ファミリーのメンバーであり、ＭＨＣエンハンセオソームと会合することによってＭＨＣ－ＩＩの転写を調節する。ＣＩＩＴＡの発現は、発生段階に応じてＢ細胞および樹状細胞において誘導され、大多数の細胞型においてＩＦＮ－γによって誘導可能である。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ＣＩＩＴＡ遺伝子における、５’－ＧＧＴＣＣＡＴＣＴＧＧＴＣＡＴＡＧＡＡＧ－３’（配列番号２５）を含む部位を標的とする。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ＣＩＩＴＡ遺伝子における、５’－ＧＣＴＣＣＡＧＧＴＡＧＣＣＡＣＣＴＴＣＴ－３’（配列番号４８）を含む部位を標的とする。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ＣＩＩＴＡ遺伝子における、５’－ＴＡＧＧＧＧＣＣＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＧＧ－３’（配列番号４９）を含む部位を標的とする。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ＣＩＩＴＡ遺伝子における、５’－ＧＧＣＴＴＡＴＧＣＣＡＡＴＡＴＣＧＧＴＧ－３’（配列番号５０）を含む部位を標的とする。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ＣＩＩＴＡ遺伝子における、５’－ＡＧＧＴＧＡＴＧＡＡＧＡＧＡＣＣＡＧＧＧ－３’（配列番号５１）を含む部位を標的とする。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号２５の配列のＲＮＡバージョンを含む。ｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ複合体は、ＣＩＩＴＡ遺伝子座における標的部位を標的とし、切断する。ＮＨＥＪによる二本鎖切断の修復の結果、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失および／または少なくとも１つのヌクレオチドの挿入をもたらし、それにより、ＣＩＩＴＡの発現を破壊または排除することができる。あるいは、外因性遺伝子をコードするポリヌクレオチドのＣＩＩＴＡ遺伝子座への挿入により、ＣＩＩＴＡの発現を破壊または排除することができる。
一部の実施形態では、細胞のゲノムは、ＴＧＦＢ２、トランスフォーミング増殖因子ベータ２、神経膠芽腫由来Ｔ細胞抑制因子、トランスフォーミング増殖因子ベータ２プロタンパク質プレプロ－トランスフォーミング増殖因子ベータ２、セテルミン（Ｃｅｔｅｒｍｉｎ）、Ｇ－ＴＳＦ、トランスフォーミング増殖因子ベータ２、ＢＳＣ－１細胞成長阻害因子３、ＴＧＦ－ベータ２、ポリエルジン（Ｐｏｌｙｅｒｇｉｎ）、ＬＤＳ４としても公知のＴＧＦ－β２の発現が破壊されるように改変されている。遺伝子は、タンパク質のＴＧＦ－β２スーパーファミリーの分泌型リガンドをコードする。ＴＧＦ－β２は、線維芽細胞の重要な活性化因子、線維化応答の中心的なエフェクターであり、また、免疫細胞および血管細胞における線維形成性の表現型を促進する。ＴＧＦ－β２発現の破壊により、生着したユニバーサルドナー細胞の長期生存を改善することができる。一部の実施形態では、細胞のゲノムは、ＴＧＦ－β２遺伝子が破壊されるように改変されている。ｇＲＮＡは、ＴＧＦ－β２遺伝子における、５’－ＧＴＴＣＡＴＧＣＧＣＡＡＧＡＧＧＡＴＣＧ－３’（配列番号５７）を含む部位を標的とする。ｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ複合体は、ＴＧＦ－β２遺伝子座における標的部位を標的とし、切断する。ＮＨＥＪによる二本鎖切断の修復の結果、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失および／または少なくとも１つのヌクレオチドの挿入をもたらし、それにより、ＴＧＦ－β２の発現を破壊または排除することができる。あるいは、外因性遺伝子をコードするポリヌクレオチドのＴＧＦ－β２遺伝子座への挿入により、ＴＧＦ－β２の発現を破壊または排除することができる。
一部の実施形態では、細胞のゲノムは、ＮＬＲファミリー、ＣＡＲＤドメイン含有５（ＮＬＲＣ５）の発現が減少するように改変されている。ＮＬＲＣ５は、ＭＨＣ－Ｉ媒介性免疫応答の極めて重要な調節因子であり、ＣＩＩＴＡと同様に、ＮＬＲＣ５は、ＩＦＮ－γによって高度に誘導可能であり、また、核に転位置され得る。ＮＬＲＣ５は、ＭＨＣ－Ｉ遺伝子のプロモーターを活性化し、ＭＨＣ－Ｉ、ならびにＭＨＣ－Ｉ抗原提示に関与する関連する遺伝子の転写を誘導する。
一部の実施形態では、１つまたは複数の免疫寛容原性因子をコードするポリヌクレオチドを細胞、例えば、遺伝子改変されたまたは遺伝子改変されていない細胞に挿入して、免疫特権をもつユニバーサルドナー細胞を創出することができる。例示的な免疫寛容原性因子としては、限定することなく、ＴＮＦＡＩＰ３、ＣＤ３９、ＰＤ－Ｌ－１、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ７３、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ、ＣＤ４７、ＣＩ阻害因子、およびＩＬ－３５のうちの１つまたは複数が挙げられる。一部の実施形態では、免疫寛容原性因子は、ＴＮＦＡ１Ｐ３またはＡ２０であり、これは、ＯＴＵＤ７Ｃ、ＴＮＦＡ１Ｐ２、ＡＩＳＢＬ、またはＴＮＦアルファ誘導タンパク質３としても公知である。ＴＮＦＡ１Ｐ３またはＡ２０は、炎症および免疫の重要な調節因子であり、ＮＦ－カッパＢ活性化ならびにＴＮＦ媒介性アポトーシスを阻害することが公知である。一部の実施形態では、免疫寛容原性因子はＣＤ３９であり、これは、ＥＮＴＰＤ１（エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ－１）、ＮＴＰＤａｓｅ１、ＡＴＰＤａｓｅ、またはＳＰＧ６４としても公知である。ＣＤ３９は、免疫寛容原性因子であるが、血管新生の増大、抗炎症活性、および／または他の手段を通じた利益ももたらし得る。一部の実施形態では、免疫寛容原性因子はＰＤ－Ｌ－１（プログラム死リガンド１）であり、これは、分化抗原群２７４（ＣＤ２７４）、Ｂ７ホモログ（Ｂ７－Ｈ、Ｂ７Ｈ１）、ＰＤＣＤ１Ｌ１、ＰＤＣＤ１ＬＧ１、またはＰＤＬ１としても公知である。ＰＤ－Ｌ－１は、免疫系の適応アームの抑制において主要な役割を果たすと思われ、免疫応答の共阻害因子であると考えられている。一部の実施形態では、免疫寛容原性因子はＨＬＡ－Ｅであり、これは、ＥＡ１．２、ＥＡ２．１、ＨＬＡ－６．２、ＭＨＣ、ＱＡ１、または主要組織適合性遺伝子複合体、クラスＩ、Ｅとしても公知である。ＨＬＡ－Ｅは、ナチュラルキラー（ＮＫ）および細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）活性化ならびに阻害機能の重要なモジュレーターである。一部の実施形態では、免疫寛容原性因子はＣＤ７３であり、これは、５’－ヌクレオチダーゼエクト（ＮＴ５Ｅ）、５’－ヌクレオチダーゼ（５’－ＮＴ）、エクト－５’－ヌクレオチダーゼ、ＥＮＴ、ＥＮ、ＮＴ５、ＮＴＥ、またはＥ５ＮＴとしても公知である。ＣＤ７３は、ＡＭＰのアデノシンへの変換を触媒する原形質膜タンパク質である。ＣＤ７３由来アデノシンは、ＤＣ上のＡ２ｂ受容体を活性化することによって樹状細胞（ＤＣ）の異所性分化を促進し、それにより、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＶＥＧＦ、およびＩＬ－８の産生の増大ならびにＩＤＯ、ＴＧＦ－β、アルギナーゼ２およびＣＯＸ２のような免疫抑制性タンパク質の発現によって特徴付けられる免疫寛容原性表現型が促進される。一部の実施形態では、遺伝子改変、例えば、少なくとも１つの免疫寛容原性因子をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドの挿入により、ユニバーサルドナー細胞が、生着後に、改変されていない細胞の少なくとも１．０５倍、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２５倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、または少なくとも５０倍の率で免疫拒絶反応を阻害するまたは回避することが可能になる。一部の実施形態では、ＴＮＦＡＩＰ３、ＣＤ３９、ＰＤ－Ｌ－１、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ７３、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＴＬＡ－４、および／またはＣＤ４７をコードするポリヌクレオチドの挿入により、ユニバーサルドナー細胞が、宿主対象への移植または生着後に免疫拒絶反応を阻害するまたは回避することが可能になる。
一部の実施形態では、ＭＡＮＦなどの１つまたは複数の生存因子をコードするポリヌクレオチドを遺伝子改変されたまたは遺伝子改変されていない細胞に挿入して、生存の増大を有するユニバーサルドナー細胞を創出することができる。一部の実施形態では、生存因子はＭＡＮＦであり、これは、初期腫瘍で変異するアルギニンリッチ（ＡＲＭＥＴ）、アルギニンリッチタンパク質（ＡＲＰ）、または中脳アストロサイト由来神経栄養因子としても公知である。ＭＡＮＦは、膵ベータ細胞の増殖および生存、ならびにドーパミン作動性ニューロンの生存を促進する小胞体（ＥＲ）ストレス誘導性神経栄養因子である。一部の実施形態では、ＭＡＮＦなどの１つまたは複数の生存因子をコードするポリヌクレオチドの挿入により、ユニバーサルドナー細胞が、宿主対象への移植または生着後に、移植または生着後の改変されていない細胞の少なくとも１．０５倍、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２５倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、または少なくとも５０倍の率で生存することが可能になる。
免疫寛容原性因子および／または生存因子をコードするポリヌクレオチドは、一般に、免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列を挟む左側の相同アームと右側の相同アームを含む。相同アームは、標的とされる挿入部位またはその近傍のゲノムＤＮＡに対して実質的な配列相同性を有する。例えば、左側の相同アームは、標的部位またはカット部位の左側または上流に位置する領域と相同なヌクレオチド配列であり得、右側の相同アームは、標的部位またはカット部位の右側または下流に位置する領域と相同なヌクレオチド配列であり得る。各相同アームの近位末端は、カット部位に隣接するゲノムＤＮＡ配列と相同であり得る。あるいは、各相同アームの近位末端は、カット部位から最大約１０、２０、３０、４０、５０、６０、または７０核酸塩基離れたところに位置するゲノムＤＮＡ配列と相同であり得る。したがって、免疫寛容原性因子をコードするポリヌクレオチドを、カット部位から約１０、２０、３０、４０、５０、６０、または７０塩基対以内にある標的とされる遺伝子座に挿入することまたはその遺伝子座と置き換えることができ、カット部位に接する（およびホモログアームとの相同性を有さない）追加的なゲノムＤＮＡを欠失させることができる。相同アームは約５０ヌクレオチドから数千ヌクレオチドの範囲の長さであり得る。一部の実施形態では、相同アームは約５００核酸塩基から約１０００核酸塩基の範囲の長さであり得る。一部の実施形態では、相同アームは約７００、約８００、または約９００核酸塩基の長さである。一部の実施形態では、相同アームは約８００核酸塩基の長さである。相同アームとゲノムＤＮＡの実質的な配列相同性は、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％であり得る。一部の実施形態では、相同アームは、ゲノムＤＮＡと同一である。
一部の実施形態では、相同アームをＢ２Ｍガイド（例えば、配列番号１～１３のＲＮＡバージョンを含むｇＲＮＡ）と共に使用する。一部の実施形態では、相同アームを、Ｂ２Ｍ遺伝子の開始部位を排除する任意のＢ２Ｍガイドと共に使用するために設計する。一部の実施形態では、Ｂ２Ｍ相同アームは、配列番号１５もしくは２２のヌクレオチド配列、または配列番号１５もしくは２２のヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むかまたはそれから本質的になり得る。一部の実施形態では、左側のＢ２Ｍ相同アームは、配列番号１５のヌクレオチド配列、または配列番号１５のヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むかまたはそれから本質的になり得る。一部の実施形態では、右側のＢ２Ｍ相同アームは、配列番号２２のヌクレオチド配列、または配列番号２２のヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むかまたはそれから本質的になり得る。
一部の実施形態では、相同アームをＴＸＮＩＰガイド（例えば、配列番号３２～４１のＲＮＡバージョンを含むｇＲＮＡ）と共に使用する。一部の実施形態では、相同アームを、ＴＸＮＩＰのエクソン１を標的とする任意のＴＸＮＩＰガイド（例えば、配列番号３２～４１のＲＮＡバージョンを含むｇＲＮＡ）と共に使用するために設計する。一部の実施形態では、ＴＸＮＩＰ相同アームは、配列番号２６もしくは２８のヌクレオチド配列、または配列番号２６もしくは２８のヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むかまたはそれから本質的になり得る。一部の実施形態では、左側のＴＸＮＩＰ相同アームは、配列番号２６のヌクレオチド配列、または配列番号２６のヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むかまたはそれから本質的になり得る。一部の実施形態では、右側のＴＸＮＩＰ相同アームは、配列番号２８のヌクレオチド配列、または配列番号２８のヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むかまたはそれから本質的になり得る。
一部の実施形態では、相同アームを、ＣＩＩＴＡガイド（例えば、配列番号２５または４８～５１のＲＮＡバージョンを含むｇＲＮＡ）と共に使用する。一部の実施形態では、ＣＩＩＴＡ相同アームは、配列番号４２もしくは４４のヌクレオチド配列、または配列番号４２もしくは４４のヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むかまたはそれから本質的になり得る。一部の実施形態では、左側のＣＩＩＴＡ相同アームは、配列番号４２のヌクレオチド配列、または配列番号４２のヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むかまたはそれから本質的になり得る。一部の実施形態では、右側のＣＩＩＴＡ相同アームは、配列番号４４のヌクレオチド配列、または配列番号４４のヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むかまたはそれから本質的になり得る。
一部の実施形態では、相同アームを、ＴＧＦ－β２ガイド（例えば、配列番号５７を含む標的配列を標的とするｇＲＮＡ）と共に使用する。
少なくとも１つの免疫寛容原性因子および／または生存因子をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドは、１つまたは複数のリボソームスキップをコードする配列を含み得、したがって、発現されると、単一の転写物が産生されるが、翻訳の間のリボソームスキップに起因して、２つまたはそれよりも多くの別々のタンパク質が産生される。一部の実施形態では、リボソームスキップは、リボソームが、成長しているポリペプチド鎖のＣ末端においてグリシンとプロリンの間のペプチド結合を創出するのを防ぐ短いペプチド（約２０アミノ酸）であり得る。リボソームはグリシンの後で小休止し、その結果、新生ポリペプチド鎖が放出される。翻訳が再開され、プロリンが第２のポリペプチド鎖の最初のアミノ酸になる。この機構により、ポリペプチドの見かけの同時翻訳切断がもたらされる。リボソームスキップペプチドのＣ末端の高度に保存された配列が立体障害およびリボソームスキッピングに寄与する。一部の実施形態では、リボソームスキップペプチドは、２Ａ配列ファミリーメンバーである。適切な２Ａ配列ファミリーメンバーとしては、Ｆ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、およびＰ２Ａが挙げられ、ここで、Ｆ２Ａは口蹄疫ウイルス２Ａに由来し、Ｔ２Ａはｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルス２Ａに由来し、Ｅ２Ａはウマ鼻炎Ａウイルスに由来し、Ｐ２Ａはブタテッショウウイルス－１ ２Ａに由来する。一部の実施形態では、リボソームスキップペプチドはＰ２Ａである。一部の実施形態では、リボソームスキップＰ２Ａをコードする配列は、配列番号１８のヌクレオチド配列を含む、またはそれからなる。他の実施形態では、リボソームスキップは、内部リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）であり得、これは、キャップに依存しない様式での翻訳開始を可能にするＲＮＡエレメントである。したがって、ＩＲＥＳにより、単一の転写単位からの２つの別々のタンパク質の産生が可能になる。ＩＲＥＳエレメントは当技術分野で周知であり、例えば、ウイルスゲノム（例えば、ピコルナウイルス、アフトウイルス、ペスチウイルスＩＲＥＳ）または細胞ｍＲＮＡ（例えば、種々の増殖因子、転写因子、癌遺伝子など）に由来し得る。
少なくとも１つの免疫寛容原性因子および／または生存因子をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを外因性プロモーターに作動可能に連結することができる。外因性プロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、時間特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または細胞型特異的プロモーターであり得る。一部の実施形態では、外因性プロモーターは、ＣＭＶ、ＥＦ１ａ、ＰＧＫ、ＣＡＧ／ＣＡＧＧＳ、またはＵＢＣプロモーターである。一般に、ＣＡＧまたはＣＡＧＧＳプロモーターは、ＣＭＶエンハンサー、ニワトリβ－アクチンプロモーター、およびキメライントロンを含む。一部の実施形態では、ＣＡＧまたはＣＡＧＧＳプロモーターは、配列番号１６のヌクレオチド配列または配列番号１６のヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むまたはそれから本質的になる。
一部の実施形態では、少なくとも１つの免疫寛容原性因子および／または生存因子をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを、セーフハーバー遺伝子座、例えばＡＡＶＳ １遺伝子座に挿入することができる。一部の実施形態では、少なくとも１つの免疫寛容原性因子および／または生存因子をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを、ＭＨＣ－Ｉ遺伝子、ＭＨＣ－ＩＩ遺伝子、ＭＨＣ－ＩもしくはＭＨＣ－ＩＩの転写調節因子、または生存因子遺伝子と部分的にオーバーラップする、完全にオーバーラップする、またはその中に含有される（すなわち、その内部またはその近傍にある）ゲノムＤＮＡの部位または領域に挿入する。
ある特定の実施形態では、本開示は、表１にノックインとして列挙されている遺伝子のいずれかに対応する外因性ポリヌクレオチドのうちの１つもしくは複数の挿入、および／または表１にノックアウトとして列挙されている遺伝子のうちの１つもしくは複数の発現の破壊を有するユニバーサルドナー細胞を想定している。工学的に操作されたユニバーサルドナー細胞は、任意の標的ゲノム位置（例えば、セーフハーバー位置）に、表１に列挙されている遺伝子に対応する１つのポリヌクレオチドの挿入、任意の２つのポリヌクレオチドの挿入、任意の３つのポリヌクレオチドの挿入、任意の４つのポリヌクレオチドの挿入、任意の５つのポリヌクレオチドの挿入、もしくは６つ全てのポリヌクレオチドの挿入を含み得る、および／または、工学的に操作されたユニバーサルドナー細胞は、表１に列挙されている標的遺伝子のうちの１つ、２つ、３つ、もしくは４つの発現の破壊（例えば、発現の低減もしくは排除）を含み得る。細胞は、列挙されている遺伝子ノックインおよび遺伝子ノックアウトの任意の可能性のある組合せを含み得る。一部の実施形態では、２つまたはそれよりも多くの挿入されるポリヌクレオチドを、２Ａペプチドなどのリボソームスキップをコードする１つまたは複数の配列を介して連結することができ、したがって、２つまたはそれよりも多くの別々のタンパク質を単一のＲＮＡ転写物から発現させることができる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドまたは細胞のゲノム内に挿入されるポリヌクレオチドを外因性プロモーターに作動可能に連結する。
Figure 2024503291000002
一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ－１をコードするポリヌクレオチドをＢ２Ｍ遺伝子座の内部もしくはその近傍、ＴＸＮＩＰ遺伝子座の内部もしくはその近傍、ＣＩＩＴＡ遺伝子座の内部もしくはその近傍、またはＴＧＦ－β２遺伝子座の内部もしくはその近傍の部位に挿入する。一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ－１をコードするポリヌクレオチドをＢ２Ｍ遺伝子座の内部もしくはその近傍、ＴＸＮＩＰ遺伝子座の内部もしくはその近傍、またはＣＩＩＴＡ遺伝子座の内部もしくはその近傍の部位に挿入する。一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ－１をコードするポリヌクレオチドをＢ２Ｍ遺伝子座の内部またはその近傍の部位に挿入する。一部の実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子またはプロモーターの全部または一部の欠失と同時にまたは欠失後に、ＰＤ－Ｌ－１をコードするポリヌクレオチドをＢ２Ｍ遺伝子座の内部またはその近傍の部位に挿入する。一部の実施形態では、ＴＸＮＩＰ遺伝子またはプロモーターの全部または一部の欠失と同時にまたは欠失後に、ＰＤ－Ｌ－１をコードするポリヌクレオチドをＴＸＮＩＰ遺伝子座の内部またはその近傍の部位に挿入する。一部の実施形態では、ＣＩＩＴＡ遺伝子またはプロモーターの全部または一部の欠失と同時にまたは欠失後に、ＰＤ－Ｌ－１をコードするポリヌクレオチドをＣＩＩＴＡ遺伝子座の内部またはその近傍の部位に挿入する。他の実施形態では、ＴＧＦ－β２遺伝子またはプロモーターの全部または一部の欠失と同時にまたは欠失後に、ＰＤ－Ｌ－１をコードするポリヌクレオチドをＴＧＦ－β２遺伝子座の内部またはその近傍の部位に挿入する。ＰＤ－Ｌ－１をコードするポリヌクレオチドは、外因性プロモーターに作動可能に連結している。外因性プロモーターは、ＣＡＧまたはＣＡＧＧＳプロモーターであり得る。一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ－１をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２０のヌクレオチド配列、または配列番号２０のヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、ＴＮＦＡＩＰ３をコードするポリヌクレオチドをＢ２Ｍ遺伝子座の内部もしくはその近傍、ＴＸＮＩＰ遺伝子座の内部もしくはその近傍、ＣＩＩＴＡ遺伝子座の内部もしくはその近傍、またはＴＧＦ－β２遺伝子座の内部もしくはその近傍の部位に挿入する。一部の実施形態では、ＴＮＦＡＩＰ３をコードするポリヌクレオチドをＢ２Ｍ遺伝子座の内部もしくはその近傍、ＴＸＮＩＰ遺伝子座の内部もしくはその近傍、またはＣＩＩＴＡ遺伝子座の内部もしくはその近傍の部位に挿入する。一部の実施形態では、ＴＮＦＡＩＰ３をコードするポリヌクレオチドをＢ２Ｍ遺伝子座の内部またはその近傍の部位に挿入する。一部の実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子またはプロモーターの全部または一部の欠失と同時にまたは欠失後に、ＴＮＦＡＩＰ３をコードするポリヌクレオチドをＢ２Ｍ遺伝子座の内部またはその近傍の部位に挿入する。一部の実施形態では、ＴＸＮＩＰ遺伝子またはプロモーターの全部または一部の欠失と同時にまたは欠失後に、ＴＮＦＡＩＰ３をコードするポリヌクレオチドをＴＸＮＩＰ遺伝子座の内部またはその近傍の部位に挿入する。一部の実施形態では、ＣＩＩＴＡ遺伝子またはプロモーターの全部または一部の欠失と同時にまたは欠失後に、ＴＮＦＡＩＰ３をコードするポリヌクレオチドをＣＩＩＴＡ遺伝子座の内部またはその近傍の部位に挿入する。他の実施形態では、ＴＧＦ－β２遺伝子またはプロモーターの全部または一部の欠失と同時にまたは欠失後に、ＴＮＦＡＩＰ３をコードするポリヌクレオチドをＴＧＦ－β２遺伝子座の内部またはその近傍の部位に挿入する。ＴＮＦＡＩＰ３をコードするポリヌクレオチドは、外因性プロモーターに作動可能に連結している。外因性プロモーターは、ＣＡＧまたはＣＡＧＧＳプロモーターであり得る。一部の実施形態では、ＴＮＦＡＩＰ３をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１９のヌクレオチド配列、または配列番号１９のヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、ＭＡＮＦをコードするポリヌクレオチドを、Ｂ２Ｍ遺伝子座の内部もしくはその近傍、ＴＸＮＩＰ遺伝子座の内部もしくはその近傍、またはＣＩＩＴＡ遺伝子座の内部もしくはその近傍、またはＴＧＦ－β２遺伝子座の内部もしくはその近傍の部位に挿入する。一部の実施形態では、ＭＡＮＦをコードするポリヌクレオチドを、Ｂ２Ｍ遺伝子座の内部もしくはその近傍、ＴＸＮＩＰ遺伝子座の内部もしくはその近傍、またはＣＩＩＴＡ遺伝子座の内部もしくはその近傍の部位に挿入する。一部の実施形態では、ＭＡＮＦをコードするポリヌクレオチドをＢ２Ｍ遺伝子座の内部またはその近傍の部位に挿入する。一部の実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子またはプロモーターの全部または一部の欠失と同時にまたは欠失後に、ＭＡＮＦをコードするポリヌクレオチドをＢ２Ｍ遺伝子座の内部またはその近傍の部位に挿入する。他の実施形態では、ＴＸＮＩＰ遺伝子またはプロモーターの全部または一部の欠失と同時にまたは欠失後に、ＭＡＮＦをコードするポリヌクレオチドをＴＸＮＩＰ遺伝子座の内部またはその近傍の部位に挿入する。一部の実施形態では、ＣＩＩＴＡ遺伝子またはプロモーターの全部または一部の欠失と同時にまたは欠失後に、ＭＡＮＦをコードするポリヌクレオチドをＣＩＩＴＡ遺伝子座の内部またはその近傍の部位に挿入する。他の実施形態では、ＴＧＦ－β２遺伝子またはプロモーターの全部または一部の欠失と同時にまたは欠失後に、ＭＡＮＦをコードするポリヌクレオチドをＴＧＦ－β２遺伝子座の内部またはその近傍の部位に挿入する。ＭＡＮＦをコードするポリヌクレオチドは、外因性プロモーターに作動可能に連結している。外因性プロモーターは、ＣＡＧまたはＣＡＧＧＳプロモーターであり得る。一部の実施形態では、ＭＡＮＦをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１７のヌクレオチド配列、または配列番号１７のヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、ＣＤ３９をコードするポリヌクレオチドをＢ２Ｍ遺伝子座の内部もしくはその近傍、ＴＸＮＩＰ遺伝子座の内部もしくはその近傍、ＣＩＩＴＡ遺伝子座の内部もしくはその近傍、またはＴＧＦ－β２遺伝子座の内部もしくはその近傍の部位に挿入する。一部の実施形態では、ＣＤ３９をコードするポリヌクレオチドをＢ２Ｍ遺伝子座の内部もしくはその近傍、ＴＸＮＩＰ遺伝子座の内部もしくはその近傍、またはＣＩＩＴＡ遺伝子座の内部もしくはその近傍の部位に挿入する。一部の実施形態では、ＣＤ３９をコードするポリヌクレオチドをＣＩＩＴＡ遺伝子座の内部もしくはその近傍またはＢ２Ｍ遺伝子座の内部もしくはその近傍の部位に挿入する。一部の実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子またはプロモーターの全部または一部の欠失と同時にまたは欠失後に、ＣＤ３９をコードするポリヌクレオチドをＢ２Ｍ遺伝子座の内部またはその近傍の部位に挿入する。他の実施形態では、ＴＸＮＩＰ遺伝子またはプロモーターの全部または一部の欠失と同時にまたは欠失後に、ＣＤ３９をコードするポリヌクレオチドをＴＸＮＩＰ遺伝子座の内部またはその近傍の部位に挿入する。一部の実施形態では、ＣＩＩＴＡ遺伝子またはプロモーターの欠失と同時にまたは欠失後に、ＣＤ３９をコードするポリヌクレオチドをＣＩＩＴＡ遺伝子座の内部またはその近傍の部位に挿入する。他の実施形態では、ＴＧＦ－β２遺伝子またはプロモーターの全部または一部の欠失と同時にまたは欠失後に、ＣＤ３９をコードするポリヌクレオチドをＴＧＦ－β２遺伝子座の内部またはその近傍の部位に挿入する。ＣＤ３９をコードするポリヌクレオチドは、外因性プロモーターに作動可能に連結している。外因性プロモーターは、ＣＡＧまたはＣＡＧＧＳプロモーターであり得る。一部の実施形態では、ＣＤ３９をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２７のヌクレオチド配列、または配列番号２７のヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、ＨＬＡ－ＥをコードするポリヌクレオチドをＢ２Ｍ遺伝子座の内部もしくはその近傍、ＴＸＮＩＰ遺伝子座の内部もしくはその近傍、ＣＩＩＴＡ遺伝子座の内部もしくはその近傍、またはＴＧＦ－β２遺伝子座の内部もしくはその近傍の部位に挿入する。一部の実施形態では、ＨＬＡ－ＥをコードするポリヌクレオチドをＢ２Ｍ遺伝子座の内部もしくはその近傍、ＴＸＮＩＰ遺伝子座の内部もしくはその近傍、またはＣＩＩＴＡ遺伝子座の内部もしくはその近傍の部位に挿入する。一部の実施形態では、ＨＬＡ－ＥをコードするポリヌクレオチドをＴＸＮＩＰ遺伝子座の内部またはその近傍の部位に挿入する。一部の実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子またはプロモーターの全部または一部の欠失と同時にまたは欠失後に、ＨＬＡ－ＥをコードするポリヌクレオチドをＢ２Ｍ遺伝子座の内部またはその近傍の部位に挿入する。他の実施形態では、ＴＸＮＩＰ遺伝子またはプロモーターの全部または一部の欠失と同時にまたは欠失後に、ＨＬＡ－ＥをコードするポリヌクレオチドをＴＸＮＩＰ遺伝子座の内部またはその近傍の部位に挿入する。一部の実施形態では、ＣＩＩＴＡ遺伝子またはプロモーターの欠失と同時にまたは欠失後に、ＨＬＡ－ＥをコードするポリヌクレオチドをＣＩＩＴＡ遺伝子座の内部またはその近傍の部位に挿入する。他の実施形態では、ＴＧＦ－β２遺伝子またはプロモーターの全部または一部の欠失と同時にまたは欠失後に、ＨＬＡ－ＥをコードするポリヌクレオチドをＴＧＦ－β２遺伝子座の内部またはその近傍の部位に挿入する。ＨＬＡ－Ｅをコードするポリヌクレオチドは、ＨＬＡ－Ｅ三量体をコードする配列を含み、ＨＬＡ－Ｅ三量体は、シグナルペプチドを有さないＨＬＡ－Ｅと融合したＢ２Ｍ膜タンパク質、それと融合したＨＬＡ－Ｇ提示ペプチド、それと融合したＢ２Ｍシグナルペプチドを含む。ＨＬＡ－Ｅをコードするポリヌクレオチドは、外因性プロモーターに作動可能に連結している。外因性プロモーターは、ＣＭＶプロモーターであり得る。一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ｅをコードするポリヌクレオチドは、配列番号４３のヌクレオチド配列、または配列番号４３のヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、ＣＤ７３をコードするポリヌクレオチドを、Ｂ２Ｍ遺伝子座の内部もしくはその近傍、ＴＸＮＩＰ遺伝子座の内部もしくはその近傍、ＣＩＩＴＡ遺伝子座の内部もしくはその近傍、またはＴＧＦ－β２遺伝子座の内部もしくはその近傍の部位に挿入する。一部の実施形態では、ＣＤ７３をコードするポリヌクレオチドを、Ｂ２Ｍ遺伝子座の内部もしくはその近傍、ＴＸＮＩＰ遺伝子座の内部もしくはその近傍、またはＣＩＩＴＡ遺伝子座の内部もしくはその近傍の部位に挿入する。一部の実施形態では、ＣＤ７３をコードするポリヌクレオチドを、Ｂ２Ｍ遺伝子座の内部もしくはその近傍またはＣＩＩＴＡ遺伝子座の内部もしくはその近傍の部位に挿入する。一部の実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子またはプロモーターの欠失と同時にまたは欠失後に、ＣＤ７３をコードするポリヌクレオチドをＢ２Ｍ遺伝子座の内部またはその近傍の部位に挿入する。一部の実施形態では、ＴＸＮＩＰ遺伝子またはプロモーターの欠失と同時にまたは欠失後に、ＣＤ７３をコードするポリヌクレオチドをＴＸＮＩＰ遺伝子座の内部またはその近傍の部位に挿入する。一部の実施形態では、ＣＤ７３をコードするポリヌクレオチドを、ＣＩＩＴＡ遺伝子またはプロモーターの欠失と同時にまたは欠失後に、ＣＩＩＴＡ遺伝子座の内部またはその近傍の部位に挿入する。他の実施形態では、ＴＧＦ－β２遺伝子またはプロモーターの全部または一部の欠失と同時にまたは欠失後に、ＣＤ７３をコードするポリヌクレオチドをＴＧＦ－β２遺伝子座の内部またはその近傍の部位に挿入する。ＣＤ７３をコードするポリヌクレオチドは、外因性プロモーターに作動可能に連結している。外因性プロモーターは、ＣＡＧまたはＣＡＧＧＳプロモーターであり得る。一部の実施形態では、ＣＤ７３をコードするポリヌクレオチドは、配列番号４６のヌクレオチド配列、または配列番号４６のヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、ＭＡＮＦ、ＴＮＦＡＩＰ３、およびＰＤ－Ｌ－１をコードするポリヌクレオチドを、Ｂ２Ｍ遺伝子座の内部もしくはその近傍、ＴＸＮＩＰ遺伝子座の内部もしくはその近傍、ＣＩＩＴＡ遺伝子座の内部もしくはその近傍、またはＴＧＦ－β２遺伝子座の内部もしくはその近傍の部位に挿入する。一部の実施形態では、ＭＡＮＦ、ＴＮＦＡＩＰ３、およびＰＤ－Ｌ－１をコードするポリヌクレオチドを、Ｂ２Ｍ遺伝子座の内部もしくはその近傍、ＴＸＮＩＰ遺伝子座の内部もしくはその近傍、またはＣＩＩＴＡ遺伝子座の内部もしくはその近傍の部位に挿入する。一部の実施形態では、ＭＡＮＦ、ＴＮＦＡＩＰ３、およびＰＤ－Ｌ－１をコードするポリヌクレオチドをＢ２Ｍ遺伝子座の内部またはその近傍の部位に挿入する。一部の実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子またはプロモーターの全部または一部の欠失と同時にまたは欠失後に、ＭＡＮＦ、ＴＮＦＡＩＰ３、およびＰＤ－Ｌ－１をコードするポリヌクレオチドをＢ２Ｍ遺伝子座の内部またはその近傍の部位に挿入する。一部の実施形態では、ＴＸＮＩＰ遺伝子またはプロモーターの全部または一部の欠失と同時にまたは欠失後に、ＭＡＮＦ、ＴＮＦＡＩＰ３、およびＰＤ－Ｌ－１をコードするポリヌクレオチドをＴＸＮＩＰ遺伝子座の内部またはその近傍の部位に挿入する。一部の実施形態では、ＣＩＩＴＡ遺伝子またはプロモーターの全部または一部の欠失と同時にまたは欠失後に、ＭＡＮＦ、ＴＮＦＡＩＰ３、およびＰＤ－Ｌ－１をコードするポリヌクレオチドをＣＩＩＴＡ遺伝子座の内部またはその近傍の部位に挿入する。他の実施形態では、ＴＧＦ－β２遺伝子またはプロモーターの全部または一部の欠失と同時にまたは欠失後に、ＭＡＮＦ、ＴＮＦＡＩＰ３、およびＰＤ－Ｌ－１をコードするポリヌクレオチドをＴＧＦ－β２遺伝子座の内部またはその近傍の部位に挿入する。ＭＡＮＦ、ＴＮＦＡＩＰ３、およびＰＤ－Ｌ－１をコードするポリヌクレオチドは、ＭＡＮＦをコードする配列、それと連結した、ＴＮＦＡＩＰ３をコードする配列と連結した第１のリボソームスキップをコードする配列、それと連結した、ＰＤ－Ｌ－１をコードする配列と連結した第２のリボソームスキップをコードする配列を含む。第１および第２のリボソームスキップは、２Ａ配列ファミリーメンバーであり得、例えば、どちらもＰ２Ａであり得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１コード配列を含む。一部の実施形態では、ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１をコードするポリヌクレオチドは、配列番号５２のヌクレオチド配列または配列番号５２のヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、またはそれからなる。一部の実施形態では、ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１をコードするポリヌクレオチドは、外因性プロモーターに作動可能に連結している。外因性プロモーターは、ＣＡＧまたはＣＡＧＧＳプロモーターであり得る。一部の実施形態では、ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１をコードし、Ｂ２Ｍ相同アームを含むドナーベクターは、配列番号２４のヌクレオチド配列を有する。一部の実施形態では、ドナーベクターは、ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１をコードし、ＴＸＮＩＰ相同アームを含む。一部の実施形態では、ドナーベクターは、ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１をコードし、ＣＴＩＩＡ相同アームを含む。一部の実施形態では、ドナーベクターは、ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１をコードし、ＴＧＦ－β２相同アームを含む。
一部の実施形態では、ＴＮＦＡＩＰ３およびＰＤ－Ｌ－１をコードするポリヌクレオチドを、Ｂ２Ｍ遺伝子座の内部もしくはその近傍、ＴＸＮＩＰ遺伝子座の内部もしくはその近傍、ＣＩＩＴＡ遺伝子座の内部もしくはその近傍、またはＴＧＦ－β２遺伝子座の内部もしくはその近傍の部位に挿入する。一部の実施形態では、ＴＮＦＡＩＰ３およびＰＤ－Ｌ－１をコードするポリヌクレオチドを、Ｂ２Ｍ遺伝子座の内部もしくはその近傍、ＴＸＮＩＰ遺伝子座の内部もしくはその近傍、またはＣＩＩＴＡ遺伝子座の内部もしくはその近傍の部位に挿入する。一部の実施形態では、ＴＮＦＡＩＰ３およびＰＤ－Ｌ－１をコードするポリヌクレオチドをＢ２Ｍ遺伝子座の内部またはその近傍の部位に挿入する。一部の実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子またはプロモーターの全部または一部の欠失と同時にまたは欠失後に、ＴＮＦＡＩＰ３およびＰＤ－Ｌ－１をコードするポリヌクレオチドをＢ２Ｍ遺伝子座の内部またはその近傍の部位に挿入する。一部の実施形態では、ＴＸＮＩＰ遺伝子またはプロモーターの全部または一部の欠失と同時にまたは欠失後に、ＴＮＦＡＩＰ３およびＰＤ－Ｌ－１をコードするポリヌクレオチドをＴＸＮＩＰ遺伝子座の内部またはその近傍の部位に挿入する。一部の実施形態では、ＣＩＩＴＡ遺伝子またはプロモーターの全部または一部の欠失と同時にまたは欠失後に、ＴＮＦＡＩＰ３およびＰＤ－Ｌ－１をコードするポリヌクレオチドをＣＩＩＴＡ遺伝子座の内部またはその近傍の部位に挿入する。他の実施形態では、ＴＧＦ－β２遺伝子またはプロモーターの全部または一部の欠失と同時にまたは欠失後に、ＴＮＦＡＩＰ３およびＰＤ－Ｌ－１をコードするポリヌクレオチドをＴＧＦ－β２遺伝子座の内部またはその近傍の部位に挿入する。ＴＮＦＡＩＰ３およびＰＤ－Ｌ－１をコードするポリヌクレオチドは、ＴＮＦＡＩＰ３をコードする配列、それと連結した、ＰＤ－Ｌ－１をコードする配列と連結したリボソームスキップをコードする配列を含む。リボソームスキップは、Ｐ２Ａなどの２Ａ配列ファミリーメンバーであり得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１コード配列を含む。一部の実施形態では、ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１をコードするポリヌクレオチドは、配列番号５４のヌクレオチド配列または配列番号５４のヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、またはそれからなる。一部の実施形態では、ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１をコードするポリヌクレオチドは、外因性プロモーターに作動可能に連結している。外因性プロモーターは、ＣＡＧまたはＣＡＧＧＳプロモーターであり得る。一部の実施形態では、ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１をコードし、Ｂ２Ｍ相同アームを含むドナープラスミドは、配列番号３１のヌクレオチド配列を有する。一部の実施形態では、ドナープラスミドは、ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１をコードし、ＴＸＮＩＰ相同アームを含む。一部の実施形態では、ドナープラスミドは、ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１をコードし、ＣＩＩＴＡ相同アームを含む。一部の実施形態では、ドナーベクターは、ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１をコードし、ＴＧＦ－β２相同アームを含む。
一部の実施形態では、ＭＡＮＦおよびＨＬＡ－Ｅをコードするポリヌクレオチドを、Ｂ２Ｍ遺伝子座の内部もしくはその近傍、ＴＸＮＩＰ遺伝子座の内部もしくはその近傍、またはＣＩＩＴＡ遺伝子座の内部もしくはその近傍、またはＴＧＦ－β２遺伝子座の内部もしくはその近傍の部位に挿入する。一部の実施形態では、ＭＡＮＦおよびＨＬＡ－Ｅをコードするポリヌクレオチドを、Ｂ２Ｍ遺伝子座の内部もしくはその近傍、またはＴＸＮＩＰ遺伝子座の内部もしくはその近傍の部位に挿入する。一部の実施形態では、ＭＡＮＦおよびＨＬＡ－ＥをコードするポリヌクレオチドをＴＸＮＩＰ遺伝子座の内部またはその近傍の部位に挿入する。一部の実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子またはプロモーターの全部または一部の欠失と同時にまたは欠失後に、ＭＡＮＦおよびＨＬＡ－ＥをコードするポリヌクレオチドをＢ２Ｍ遺伝子座の内部またはその近傍の部位に挿入する。一部の実施形態では、ＴＸＮＩＰ遺伝子またはプロモーターの全部または一部の欠失と同時にまたは欠失後に、ＭＡＮＦおよびＨＬＡ－ＥをコードするポリヌクレオチドをＴＸＮＩＰ遺伝子座の内部またはその近傍の部位に挿入する。一部の実施形態では、ＣＩＩＴＡ遺伝子またはプロモーターの全部または一部の欠失と同時にまたは欠失後に、ＭＡＮＦおよびＨＬＡ－ＥをコードするポリヌクレオチドをＣＩＩＴＡ遺伝子座の内部またはその近傍の部位に挿入する。他の実施形態では、ＴＧＦ－β２遺伝子またはプロモーターの全部または一部の欠失と同時にまたは欠失後に、ＨＬＡ－ＥをコードするポリヌクレオチドをＴＧＦ－β２遺伝子座の内部またはその近傍の部位に挿入する。ＭＡＮＦおよびＨＬＡ－Ｅをコードするポリヌクレオチドは、ＭＡＮＦをコードする配列、それと連結した、ＨＬＡ－Ｅをコードする配列と連結したリボソームスキップをコードする配列を含む。リボソームスキップは、Ｐ２Ａなどの２Ａ配列ファミリーメンバーであり得る。ＨＬＡ－Ｅをコードする配列は、ＨＬＡ－Ｅ三量体をコードする配列を含み、ＨＬＡ－Ｅ三量体は、シグナルペプチドを有さないＨＬＡ－Ｅと融合したＢ２Ｍ膜タンパク質、それと融合したＨＬＡ－Ｇ提示ペプチド、それと融合したＢ２Ｍシグナルペプチドを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＨＬＡ－Ｅコード配列を含む。一部の実施形態では、ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＨＬＡ－Ｅをコードするポリヌクレオチドは、配列番号５５のヌクレオチド配列または配列番号５５のヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、またはそれからなる。一部の実施形態では、ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＨＬＡ－Ｅをコードするポリヌクレオチドは、外因性プロモーターに作動可能に連結している。外因性プロモーターは、ＣＡＧまたはＣＡＧＧＳプロモーターであり得る。一部の実施形態では、ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＨＬＡ－Ｅをコードし、ＴＸＮＩＰ相同アームを含むドナープラスミドは、配列番号４５のヌクレオチド配列を有する。一部の実施形態では、ドナープラスミドは、ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＨＬＡ－Ｅをコードし、Ｂ２Ｍ相同アームを含む。一部の実施形態では、ドナープラスミドは、ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＨＬＡ－Ｅをコードし、ＣＩＩＴＡ相同アームを含む。一部の実施形態では、ドナープラスミドは、ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＨＬＡ－Ｅをコードし、ＴＧＦ－β２相同アームを含む。
一部の実施形態では、ＣＤ３９およびＰＤ－Ｌ－１をコードするポリヌクレオチドを、Ｂ２Ｍ遺伝子座の内部もしくはその近傍、ＴＸＮＩＰ遺伝子座の内部もしくはその近傍、ＣＩＩＴＡ遺伝子座の内部もしくはその近傍、またはＴＧＦ－β２遺伝子座の内部もしくはその近傍の部位に挿入する。一部の実施形態では、ＣＤ３９およびＰＤ－Ｌ－１をコードするポリヌクレオチドを、Ｂ２Ｍ遺伝子座の内部もしくはその近傍、ＴＸＮＩＰ遺伝子座の内部もしくはその近傍、またはＣＩＩＴＡ遺伝子座の内部もしくはその近傍の部位に挿入する。一部の実施形態では、ＣＤ３９およびＰＤ－Ｌ－１をコードするポリヌクレオチドをＢ２Ｍ遺伝子座の内部またはその近傍の部位に挿入する。一部の実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子またはプロモーターの全部または一部の欠失と同時にまたは欠失後に、ＣＤ３９およびＰＤ－Ｌ－１をコードするポリヌクレオチドをＢ２Ｍ遺伝子座の内部またはその近傍の部位に挿入する。一部の実施形態では、ＴＸＮＩＰ遺伝子またはプロモーターの全部または一部の欠失と同時にまたは欠失後に、ＣＤ３９およびＰＤ－Ｌ－１をコードするポリヌクレオチドをＴＸＮＩＰ遺伝子座の内部またはその近傍の部位に挿入する。一部の実施形態では、ＣＩＩＴＡ遺伝子またはプロモーターの全部または一部の欠失と同時にまたは欠失後に、ＣＤ３９およびＰＤ－Ｌ－１をコードするポリヌクレオチドをＣＩＩＴＡ遺伝子座の内部またはその近傍の部位に挿入する。他の実施形態では、ＴＧＦ－β２遺伝子またはプロモーターの全部または一部の欠失と同時にまたは欠失後に、ＣＤ３９およびＰＤ－Ｌ－１をコードするポリヌクレオチドをＴＧＦ－β２遺伝子座の内部またはその近傍の部位に挿入する。ＣＤ３９およびＰＤ－Ｌ－１をコードするポリヌクレオチドは、ＣＤ３９をコードする配列、それと連結した、ＰＤ－Ｌ－１をコードする配列と連結したリボソームスキップをコードする配列を含む。リボソームスキップは、Ｐ２Ａなどの２Ａ配列ファミリーメンバーであり得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１コード配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１をコードするポリヌクレオチドは、配列番号５３のヌクレオチド配列または配列番号５３のヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、またはそれからなる。一部の実施形態では、ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１をコードするポリヌクレオチドは、外因性プロモーターに作動可能に連結している。外因性プロモーターは、ＣＡＧまたはＣＡＧＧＳプロモーターであり得る。一部の実施形態では、ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１をコードし、Ｂ２Ｍ相同アームを含むドナープラスミドは、配列番号３０のヌクレオチド配列を有する。一部の実施形態では、ドナープラスミドは、ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１をコードし、ＴＸＮＩＰ相同アームを含む。一部の実施形態では、ドナープラスミドは、ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１をコードし、ＣＩＩＴＡ相同アームを含む。一部の実施形態では、ドナープラスミドは、ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１をコードし、ＴＧＦ－β２相同アームを含む。
一部の実施形態では、ＣＤ３９、ＣＤ７３、およびＰＤ－Ｌ－１をコードするポリヌクレオチドを、Ｂ２Ｍ遺伝子座の内部もしくはその近傍、ＴＸＮＩＰ遺伝子座の内部もしくはその近傍、ＣＩＩＴＡ遺伝子座の内部もしくはその近傍、またはＴＧＦ－β２遺伝子座の内部もしくはその近傍の部位に挿入する。一部の実施形態では、ＣＤ３９、ＣＤ７３、およびＰＤ－Ｌ－１をコードするポリヌクレオチドを、Ｂ２Ｍ遺伝子座の内部もしくはその近傍、ＴＸＮＩＰ遺伝子座の内部もしくはその近傍、またはＣＩＩＴＡ遺伝子座の内部もしくはその近傍の部位に挿入する。一部の実施形態では、ＣＤ３９、ＣＤ７３、およびＰＤ－Ｌ－１をコードするポリヌクレオチドをＢ２Ｍ遺伝子座の内部またはその近傍の部位に挿入する。一部の実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子またはプロモーターの全部または一部の欠失と同時にまたは欠失後に、ＣＤ３９、ＣＤ７３、およびＰＤ－Ｌ－１をコードするポリヌクレオチドをＢ２Ｍ遺伝子座の内部またはその近傍の部位に挿入する。一部の実施形態では、ＴＸＮＩＰ遺伝子またはプロモーターの全部または一部の欠失と同時にまたは欠失後に、ＣＤ３９、ＣＤ７３、およびＰＤ－Ｌ－１をコードするポリヌクレオチドをＴＸＮＩＰ遺伝子座の内部またはその近傍の部位に挿入する。一部の実施形態では、ＣＩＩＴＡ遺伝子またはプロモーターの全部または一部の欠失と同時にまたは欠失後に、ＣＤ３９、ＣＤ７３、およびＰＤ－Ｌ－１をコードするポリヌクレオチドをＣＩＩＴＡ遺伝子座の内部またはその近傍の部位に挿入する。他の実施形態では、ＴＧＦ－β２遺伝子またはプロモーターの全部または一部の欠失と同時にまたは欠失後に、ＣＤ３９、ＣＤ７３、およびＰＤ－Ｌ－１をコードするポリヌクレオチドをＴＧＦ－β２遺伝子座の内部またはその近傍の部位に挿入する。ＣＤ３９、ＣＤ７３、およびＰＤ－Ｌ－１をコードするポリヌクレオチドは、ＣＤ３９をコードする配列、それと連結した、ＣＤ７３をコードする配列と連結したリボソームスキップをコードする配列、それと連結した、ＰＤ－Ｌ－１をコードする配列と連結したリボソームスキップをコードする配列を含む。リボソームスキップは、Ｐ２Ａなどの２Ａ配列ファミリーメンバーであり得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＣＤ７３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１コード配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＣＤ７３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１をコードするポリヌクレオチドは、配列番号５６のヌクレオチド配列または配列番号５６のヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、またはそれからなる。一部の実施形態では、ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＣＤ７３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１をコードするポリヌクレオチドは、外因性プロモーターに作動可能に連結している。外因性プロモーターは、ＣＡＧまたはＣＡＧＧＳプロモーターであり得る。一部の実施形態では、ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＣＤ７３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１をコードし、Ｂ２Ｍ相同アームを含むドナープラスミドは、配列番号４７のヌクレオチド配列を有する。一部の実施形態では、ドナープラスミドは、ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＣＤ７３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１をコードし、ＴＸＮＩＰ相同アームを含む。一部の実施形態では、ドナープラスミドは、ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＣＤ７３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１をコードし、ＣＩＩＴＡ相同アームを含む。一部の実施形態では、ドナープラスミドは、ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＣＤ７３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１をコードし、ＴＧＦ－β２相同アームを含む。
一部の実施形態では、ＣＤ３９およびＣＤ７３をコードするポリヌクレオチドを、Ｂ２Ｍ遺伝子座の内部もしくはその近傍、ＴＸＮＩＰ遺伝子座の内部もしくはその近傍、ＣＩＩＴＡ遺伝子座の内部もしくはその近傍、またはＴＧＦ－β２遺伝子座の内部もしくはその近傍の部位に挿入する。一部の実施形態では、ＣＤ３９およびＣＤ７３をコードするポリヌクレオチドを、Ｂ２Ｍ遺伝子座の内部もしくはその近傍、ＴＸＮＩＰ遺伝子座の内部もしくはその近傍、またはＣＩＩＴＡ遺伝子座の内部もしくはその近傍の部位に挿入する。一部の実施形態では、ＣＤ３９およびＣＤ７３をコードするポリヌクレオチドをＢ２Ｍ遺伝子座の内部またはその近傍の部位に挿入する。一部の実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子またはプロモーターの全部または一部の欠失と同時にまたは欠失後に、ＣＤ３９およびＣＤ７３をコードするポリヌクレオチドをＢ２Ｍ遺伝子座の内部またはその近傍の部位に挿入する。一部の実施形態では、ＴＸＮＩＰ遺伝子またはプロモーターの全部または一部の欠失と同時にまたは欠失後に、ＣＤ３９およびＣＤ７３をコードするポリヌクレオチドをＴＸＮＩＰ遺伝子座の内部またはその近傍の部位に挿入する。一部の実施形態では、ＣＩＩＴＡ遺伝子またはプロモーターの全部または一部の欠失と同時にまたは欠失後に、ＣＤ３９およびＣＤ７３をコードするポリヌクレオチドをＣＩＩＴＡ遺伝子座の内部またはその近傍の部位に挿入する。他の実施形態では、ＴＧＦ－β２遺伝子またはプロモーターの全部または一部の欠失と同時にまたは欠失後に、ＣＤ３９およびＣＤ７３をコードするポリヌクレオチドをＴＧＦ－β２遺伝子座の内部またはその近傍の部位に挿入する。ＣＤ３９およびＣＤ７３をコードするポリヌクレオチドは、ＣＤ３９をコードする配列、それと連結した、ＣＤ７３をコードする配列と連結したリボソームスキップをコードする配列を含む。リボソームスキップは、Ｐ２Ａなどの２Ａ配列ファミリーメンバーであり得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＣＤ７３コード配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＣＤ７３をコードするポリヌクレオチドは、配列番号５８のヌクレオチド配列または配列番号５８のヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、またはそれからなる。一部の実施形態では、ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＣＤ７３をコードするポリヌクレオチドは、外因性プロモーターに作動可能に連結している。外因性プロモーターは、ＣＡＧまたはＣＡＧＧＳプロモーターであり得る。一部の実施形態では、ドナープラスミドは、ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＣＤ７３をコードし、Ｂ２Ｍ相同アームを含む。一部の実施形態では、ドナープラスミドは、ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＣＤ７３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１をコードし、ＴＸＮＩＰ相同アームを含む。一部の実施形態では、ドナープラスミドは、ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＣＤ７３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１をコードし、ＣＩＩＴＡ相同アームを含む。一部の実施形態では、ドナープラスミドは、ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＣＤ７３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１をコードし、ＴＧＦ－β２相同アームを含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つの免疫寛容原性因子および／または生存因子をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドをベクターの一部として細胞に送達することができる。例えば、ベクターは、プラスミドベクターであり得る。種々の実施形態では、細胞に送達されるプラスミドベクターの量は、約０．５μｇから約１０μｇの範囲であり得る（細胞約１０６個当たり）。一部の実施形態では、プラスミドの量は、約１μｇから約８μｇ、約２μｇから約６μｇ、または約３μｇから約５μｇの範囲であり得る。特定の実施形態では、細胞に送達されるプラスミドの量は約４μｇであり得る。
ある特定の実施形態では、ＭＨＣ－ＩＩ発現を有さず、中程度のＭＨＣ－Ｉ発現を有する細胞を、ＭＨＣ－Ｉの表面発現もＭＨＣ－ＩＩの表面発現も有さないように遺伝子改変する。別の実施形態では、ＭＨＣ－Ｉ／ＩＩの表面発現を有さない細胞を、ＰＤ－Ｌ－１の発現、例えば、ＰＤ－Ｌ－１をコードするポリヌクレオチドの挿入を有するように、ＭＡＮＦの発現、例えば、ＭＡＮＦをコードするポリヌクレオチドの挿入を有するように、ＣＤ３９の発現、例えば、ＣＤ３９をコードするポリヌクレオチドの挿入を有するように、ＣＤ７３の発現、例えば、ＣＤ７３をコードするポリヌクレオチドの挿入を有するように、ＨＬＡ－Ｅの発現、例えば、ＨＬＡ－Ｅをコードするポリヌクレオチドの挿入を有するように、ＴＮＦＡＩＰ３の発現、例えば、ＴＮＦＡＩＰをコードするポリヌクレオチドの挿入を有するように、および／またはこれらの任意の組合せを有するように、さらに編集する。別の実施形態では、ＭＨＣ－Ｉ／ＩＩの表面発現を有さない細胞を、ＰＤ－Ｌ－１の発現、例えば、ＰＤ－Ｌ－１をコードするポリヌクレオチドの挿入を有するようにさらに編集する。さらに別の実施形態では、ＭＨＣ－Ｉ／ＩＩの表面発現を有さない細胞を、ＰＤ－Ｌ－１の発現、例えば、ＰＤ－Ｌ－１をコードするポリヌクレオチドの挿入を有するようにさらに編集し、また、改変されていない細胞と比べて、生存因子をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現が増大または減少するように遺伝子改変する。
一部の実施形態では、細胞は、例えば、生着後または移植後の免疫回避または細胞生存のどちらにも必ずしも関係付けられない１つまたは複数の追加的な遺伝子の遺伝子改変による発現の増大または減少をさらに含む。一部の実施形態では、細胞は、改変されていない細胞と比べた１つまたは複数の安全スイッチタンパク質の発現の増大をさらに含む。一部の実施形態では、細胞は、安全スイッチタンパク質をコードする１つまたは複数の追加的な遺伝子の発現の増大を含む。一部の実施形態では、安全スイッチは、自殺遺伝子でもある。一部の実施形態では、安全スイッチは、単純ヘルペスウイルス－１チミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）または誘導性カスパーゼ－９である。一部の実施形態では、少なくとも１つの安全スイッチをコードするポリヌクレオチドを、ゲノム内、例えば、セーフハーバー遺伝子座内に挿入する。一部の他の実施形態では、遺伝子改変される１つまたは複数の追加的な遺伝子は、構築物と共に組み込まれる、安全スイッチタンパク質；標的化モダリティ；受容体；シグナル伝達分子；転写因子；薬学的に活性なタンパク質またはペプチド；薬物標的候補；ならびに、その生着、輸送、ホーミング、生存率、自己再生、持続性、および／または生存を促進するタンパク質のうちの１つまたは複数をコードする。
本発明の一態様は、ゲノム内の１つまたは複数の選択された部位における少なくとも１つの標的化ゲノム改変を含むゲノム操作されたユニバーサルドナー細胞を生成する方法であって、本明細書に記載の細胞型を、前記細胞に１つまたは複数の構築物を導入して、選択された部位における標的化改変を可能にすることによって遺伝子操作するステップ；前記細胞の選択された部位に、選択された部位を認識することが可能な１つまたは複数のエンドヌクレアーゼを使用して１つまたは複数の二本鎖切断を導入するステップ；および、編集された細胞を培養して内因性ＤＮＡ修復を可能にして、選択された部位における標的化挿入または欠失を生成するステップ；それにより、ゲノム改変されたユニバーサルドナー細胞を得るステップを含む、方法を提供する。標的化遺伝子ノックダウンまたはノックアウトを標的化ポリヌクレオチド挿入の前に、それと同時に、またはその後に実施することができる。ゲノム改変されたユニバーサルドナー細胞をゲノム改変の連続的なラウンドに供し、したがって、複数の部位を標的とし、改変することができる。ゲノム改変された細胞を、当技術分野で周知の技法を使用して培養し、特徴付け、選択し、拡大させることができる。この方法によって生成されるユニバーサルドナー細胞は、少なくとも１つの機能的な標的化ゲノム改変を含み、ゲノム改変された細胞が幹細胞である場合には、前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）または完全に分化した細胞に分化させることが可能である。
一部の他の実施形態では、ゲノム操作されたユニバーサルドナー細胞は、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ－１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＭＡＮＦ、ＣＤ７３、および／またはＣＤ３９のうちの少なくとも１つにおける発現の導入または増大を含む。一部の実施形態では、ゲノム操作されたユニバーサルドナー細胞は、ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤ－Ｌ－１、ＴＮＦＡＩＰ３、および／またはＭＡＮＦの発現の導入または増大を含む。一部の実施形態では、ゲノム操作されたユニバーサルドナー細胞は、ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤ－Ｌ－１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＭＡＮＦ、および／またはＣＤ３９の発現の導入または増大を含む。一部の実施形態では、ゲノム操作されたユニバーサルドナー細胞は、ＰＤ－Ｌ－１およびＣＤ３９の発現の導入もしくは増大、ならびに／またはＰＤ－Ｌ－１、ＣＤ７３、およびＣＤ３９の発現の導入もしくは増大を含む。一部の実施形態では、ゲノム操作されたユニバーサルドナー細胞は、ＨＬＡクラスＩおよび／またはクラスＩＩが欠損している。一部の実施形態では、ゲノム操作されたユニバーサルドナー細胞は、Ｂ２Ｍヌルまたは低Ｂ２Ｍを含む。一部の実施形態では、ゲノム操作されたユニバーサルドナー細胞は、Ｂ２Ｍヌルまたは低Ｂ２ＭおよびＴＸＮＩＰヌルまたは低ＴＸＮＩＰを含む。一部の実施形態では、ゲノム操作されたユニバーサルドナー細胞は、Ｂ２Ｍヌルまたは低Ｂ２Ｍ、ＴＸＮＩＰヌルまたは低ＴＸＮＩＰ、およびＣＩＩＴＡヌルまたは低ＣＩＩＴＡを含む。一部の実施形態では、ゲノム操作されたユニバーサルドナー細胞は、Ｂ２Ｍヌルまたは低Ｂ２Ｍ、ＴＸＮＩＰヌルまたは低ＴＸＮＩＰ、ＣＩＩＴＡヌルまたは低ＣＩＩＴＡ、およびＴＧＦ－β２ヌルまたは低ＴＧＦ－β２を含む。
一部の実施形態では、ゲノム操作されたユニバーサルドナー細胞は、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ－１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＭＡＮＦ、ＣＤ７３、および／またはＣＤ３９のうちの１つまたは複数をコードする、組込み型または非組込み型外因性ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ゲノム操作されたユニバーサルドナー細胞は、ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤ－Ｌ－１、ＴＮＦＡＩＰ３、ＭＡＮＦ、ＣＤ７３、および／またはＣＤ３９のうちの１つまたは複数をコードする、組込み型または非組込み型外因性ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、前記発現の導入は、前記細胞に含まれる発現されないまたは低発現される遺伝子のいずれかからの発現の増大である。一部の実施形態では、非組込み型外因性ポリヌクレオチドを、センダイウイルス、ＡＡＶ、エピソーム、またはプラスミドを使用して導入する。一部の実施形態では、ユニバーサルドナー細胞は、Ｂ２ＭヌルおよびＴＸＮＩＰヌルであり、ＴＮＦＡＩＰ３、ＰＤ－Ｌ－１、ＭＡＮＦ、およびＨＬＡ－Ｅの発現の導入を伴う。一部の実施形態では、ユニバーサルドナー細胞は、ＣＩＩＴＡヌルである。一部の実施形態では、ユニバーサルドナー細胞は、ＴＧＦ－β２ヌルである。一部の実施形態では、ユニバーサルドナー細胞は、（ｉ）Ｂ２Ｍヌルであり、ＴＮＦＡＩＰ３およびＰＤ－Ｌ－１をコードするポリヌクレオチドがＢ２Ｍ遺伝子座の内部またはその近傍に挿入されている、かつ（ｉｉ）ＴＸＮＩＰヌルであり、ＭＡＮＦおよびＨＬＡ－ＥをコードするポリヌクレオチドがＴＸＮＩＰ遺伝子座の内部またはその近傍に挿入されている。一部の実施形態では、ユニバーサルドナー細胞は、（ｉ）Ｂ２Ｍヌルであり、ＴＮＦＡＩＰ３およびＰＤ－Ｌ－１をコードするポリヌクレオチドがＢ２Ｍ遺伝子座の内部またはその近傍に挿入されている、（ｉｉ）ＴＸＮＩＰヌルであり、ＭＡＮＦおよびＨＬＡ－ＥをコードするポリヌクレオチドがＴＸＮＩＰ遺伝子座の内部またはその近傍に挿入されている、かつ、（ｉｉｉ）ＣＩＩＴＡヌルであり、ＣＤ３９をコードするポリヌクレオチドがＣＩＩＴＡ遺伝子座またはその近傍に挿入されている。一部の実施形態では、ユニバーサルドナー細胞は、（ｉ）Ｂ２Ｍヌルであり、ＴＮＦＡＩＰ３およびＰＤ－Ｌ－１をコードするポリヌクレオチドがＢ２Ｍ遺伝子座の内部またはその近傍に挿入されており、（ｉｉ）ＴＸＮＩＰヌルであり、ＭＡＮＦおよびＨＬＡ－ＥをコードするポリヌクレオチドがＴＸＮＩＰ遺伝子座の内部またはその近傍に挿入されており、かつ、（ｉｉｉ）ＣＩＩＴＡヌルであり、ＣＤ３９をコードするポリヌクレオチドがＣＩＩＴＡ遺伝子座またはその近傍に挿入されており、かつ、（ｉｖ）ＴＧＦ－β２ヌルである。一部の実施形態では、ユニバーサルドナー細胞は、（ｉ）Ｂ２Ｍヌルであり、ＴＮＦＡＩＰ３およびＰＤ－Ｌ－１をコードする第１のポリヌクレオチドがＢ２Ｍ遺伝子座における第１の部位の内部またはその近傍に挿入されており、ＣＤ３９およびＰＤ－Ｌ－１をコードする第２のポリヌクレオチドがＢ２Ｍ遺伝子座における第２の部位の内部またはその近傍に挿入されており、かつ、（ｉｉ）ＴＸＮＩＰヌルであり、ＭＡＮＦおよびＨＬＡ－ＥをコードするポリヌクレオチドがＴＸＮＩＰ遺伝子座の内部またはその近傍に挿入されている。一部の実施形態では、ユニバーサルドナー細胞は、（ｉ）Ｂ２Ｍヌルであり、ＴＮＦＡＩＰ３およびＰＤ－Ｌ－１をコードする第１のポリヌクレオチドがＢ２Ｍ遺伝子座における第１の部位の内部またはその近傍に挿入されており、ＣＤ３９およびＰＤ－Ｌ－１をコードする第２のポリヌクレオチドがＢ２Ｍ遺伝子座における第２の部位の内部またはその近傍に挿入されており、（ｉｉ）ＴＸＮＩＰヌルであり、ＭＡＮＦおよびＨＬＡ－ＥをコードするポリヌクレオチドがＴＸＮＩＰ遺伝子座の内部またはその近傍に挿入されており、かつ、（ｉｉｉ）ＴＧＦ－β２ヌルである。さらなる実施形態では、ユニバーサルドナー細胞は、Ｂ２Ｍヌルであり、ＭＡＮＦ、ＴＮＦＡＩＰ３、およびＰＤ－Ｌ－１をコードするポリヌクレオチドがＢ２Ｍ遺伝子座の内部またはその近傍に挿入されている。一部の実施形態では、ユニバーサルドナー細胞は、（ｉ）Ｂ２Ｍヌルであり、ＰＤ－Ｌ－１をコードするポリヌクレオチドがＢ２Ｍ遺伝子座の内部またはその近傍に挿入されており、（ｉｉ）ＴＸＮＩＰヌルであり、ＨＬＡ－ＥをコードするポリヌクレオチドがＴＸＮＩＰ遺伝子座の内部またはその近傍に挿入されており、かつ、（ｉｉｉ）ＣＩＩＴＡヌルであり、ＣＤ３９をコードするポリヌクレオチドがＣＩＩＴＡ遺伝子座の内部またはその近傍に挿入されており、かつ、（ｉｖ）ＴＧＦ－β２ヌルである。さらに他の実施形態では、ユニバーサルドナー細胞は、Ｂ２Ｍヌルであり、ＭＡＮＦ、ＴＮＦＡＩＰ３、およびＰＤ－Ｌ－１をコードするポリヌクレオチドがＢ２Ｍ遺伝子座の内部またはその近傍に挿入されており、必要に応じて、ＣＩＩＴＡヌルであり、ＣＤ３９をコードするポリヌクレオチドがＣＩＩＴＡ遺伝子座の内部またはその近傍に挿入されている。さらに他の実施形態では、ユニバーサルドナー細胞は、Ｂ２Ｍヌルであり、ＭＡＮＦ、ＴＮＦＡＩＰ３、およびＰＤ－Ｌ－１をコードする第１のポリヌクレオチドがＢ２Ｍ遺伝子座における第１の部位の内部またはその近傍に挿入されており、ＣＤ３９およびＰＤ－Ｌ－１をコードする第２のポリヌクレオチドがＢ２Ｍ遺伝子座における第２の部位の内部またはその近傍に挿入されており、必要に応じてＴＧＦ－β２ヌルである。他の実施形態では、ユニバーサルドナー細胞は、（ｉ）Ｂ２Ｍヌルであり、ＭＡＮＦ、ＴＮＦＡＩＰ３、およびＰＤ－Ｌ－１をコードするポリヌクレオチドがＢ２Ｍ遺伝子座の内部またはその近傍に挿入されており、（ｉｉ）ＣＩＩＴＡヌルであり、ＣＤ３９をコードするポリヌクレオチドがＣＩＩＴＡ遺伝子座の内部またはその近傍に挿入されており、かつ、（ｉｉｉ）ＴＧＦ－β２ヌルである。さらなる実施形態では、ユニバーサルドナー細胞は、（ｉ）Ｂ２Ｍヌルであり、ＰＤ－Ｌ－１をコードするポリヌクレオチドがＢ２Ｍ遺伝子座の内部またはその近傍に挿入されており、（ｉｉ）ＴＸＮＩＰヌルであり、ＨＬＡ－ＥをコードするポリヌクレオチドがＴＸＮＩＰ遺伝子座の内部またはその近傍に挿入されており、（ｉｉｉ）ＣＩＩＴＡヌルであり、ＣＤ３９をコードするポリヌクレオチドがＣＩＩＴＡ遺伝子座の内部またはその近傍に挿入されており、かつ、（ｉｖ）ＴＧＦ－β２ヌルである。さらに他の実施形態では、ユニバーサルドナー細胞は、（ｉ）Ｂ２Ｍヌルであり、ＰＤ－Ｌ－１をコードする第１のポリヌクレオチドがＢ２Ｍ遺伝子座における第１の部位の内部またはその近傍に挿入されており、ＣＤ３９をコードする第２のポリヌクレオチドがＢ２Ｍ遺伝子座における第２の部位の内部またはその近傍に挿入されており、かつ、（ｉｉ）ＴＸＮＩＰヌルであり、ＨＬＡ－ＥをコードするポリヌクレオチドがＴＸＮＩＰ遺伝子座の内部またはその近傍に挿入されている。一部の実施形態では、ユニバーサルドナー細胞は、Ｂ２Ｍヌルであり、ＣＤ３９およびＰＤ－Ｌ－１をコードするポリヌクレオチドがＢ２Ｍ遺伝子座の内部またはその近傍に挿入されている。一部の実施形態では、ユニバーサルドナー細胞は、Ｂ２Ｍヌルであり、ＣＤ３９、ＣＤ７３、およびＰＤ－Ｌ－１をコードするポリヌクレオチドがＢ２Ｍ遺伝子座の内部またはその近傍に挿入されており、さらに、必要に応じてＴＧＦ－β２ヌルである。
ある特定の実施形態では、前記ユニバーサルドナー細胞は、少なくとも１つの安全スイッチタンパク質の発現の増大または減少をさらに含む。本明細書に記載の遺伝子改変された細胞のいずれかを生成する方法は、本明細書に記載の遺伝子編集方法の少なくともいずれかを使用して実施されることが企図されている。
ＩＩＩ．ゲノム編集方法
ゲノム編集とは、一般に、ゲノムのヌクレオチド配列を、好ましくは厳密なまたは所定の様式で改変するプロセスを指す。一部の実施形態では、例えば、ユニバーサルドナー細胞を創出するために、本明細書に記載のゲノム編集方法、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－エンドヌクレアーゼ系を使用して、本明細書に記載の細胞を遺伝子改変することができる。一部の実施形態では、例えば、改変されていない細胞と比べて１つもしくは複数のＭＨＣ－Ｉおよび／もしくはＭＨＣ－ＩＩヒト白血球抗原もしくはＭＨＣ－ＩもしくはＭＨＣ－ＩＩ複合体の他の構成成分の発現を減少させる少なくとも１つの遺伝子改変を少なくとも１つの遺伝子の内部もしくはその近傍に導入するため；改変されていない細胞と比べて免疫寛容原性因子をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドの発現を増大させる少なくとも１つの遺伝子改変を導入するため；ならびに／または、改変されていない細胞と比べて生存因子をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現を増大もしくは減少させる少なくとも１つの遺伝子改変を導入するために、本明細書に記載のゲノム編集方法、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－エンドヌクレアーゼ系を使用して、本明細書に記載の細胞を遺伝子改変することができる。
本明細書に記載のゲノム編集の方法の例として、部位特異的ヌクレアーゼを使用して、ゲノム内の厳密な標的位置においてデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）をカットし、それにより、ゲノム内の特定の位置における一本鎖または二本鎖ＤＮＡ切断を創出する方法が挙げられる。そのような切断は、Cox et al., "Therapeutic genome editing: prospects and challenges," , Nature Medicine, 2015, 21 (2), 121-31に記載されている通り、相同組換え修復（ＨＤＲ）および非相同末端結合（ＮＨＥＪ）などの天然の内因性細胞プロセスによって修復され得、通常、修復される。これらの２つの主要なＤＮＡ修復プロセスは、副経路のファミリーからなる。ＮＨＥＪでは、二本鎖切断の結果生じたＤＮＡ末端が直接接合され、時には、ヌクレオチド配列の喪失または付加が伴い、それにより、遺伝子発現が破壊または増強され得る。ＨＤＲでは、切断点において定義されたＤＮＡ配列を挿入するために相同配列またはドナー配列が鋳型として利用される。相同配列は、内因性ゲノム内の、例えば、姉妹染色分体などであり得る。あるいは、ドナー配列は、ヌクレアーゼにより切断された遺伝子座との相同性が高いが、切断された標的遺伝子座に組み入れられ得る追加的な配列または欠失を含めた配列の変化も含有し得る領域（例えば、左側および右側の相同アーム）を有する、外因性ポリヌクレオチド、例えば、プラスミド、一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド、二重鎖オリゴヌクレオチドまたはウイルスであり得る。第３の修復機構は、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）であり得、「代替ＮＨＥＪ」とも称され、切断部位において小さな欠失および挿入が生じ得るという点で、遺伝学的結果がＮＨＥＪと同様である。ＭＭＥＪでは、より有利なＤＮＡ末端結合修復結果を駆動するためにＤＮＡ切断部位を挟む数塩基対の相同配列が使用され得、最近の報告でこのプロセスの分子機構がさらに解明されている；例えば、Cho and Greenberg, Nature, 2015, 518, 174-76；Kent et al., Nature Structural and Molecular Biology, 2015, 22 (3): 230-7；Mateos-Gomez et al., Nature, 2015, 518, 254-57；Ceccaldi et al., Nature, 2015, 528, 258-62を参照されたい。一部の場合では、ＤＮＡ切断部位における潜在的なマイクロホモロジーの分析に基づいて可能性の高い修復結果を予測することが可能であり得る。
これらのゲノム編集機構のそれぞれを、所望の遺伝子改変を創出するために使用することができる。ゲノム編集プロセスのステップは、標的遺伝子座において、意図された変異の部位の近傍に１つまたは２つのＤＮＡ切断を創出するためのものであり得、後者は二本鎖切断または２つの一本鎖切断である。これを、本明細書に記載され、例示されているエンドヌクレアーゼの使用によって実現することができる。
一般に、本明細書に記載のゲノム編集方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ方法またはｅｘ ｖｉｖｏ方法であり得る。一部の実施形態では、本明細書に開示されるゲノム編集方法は、ヒトまたは動物の体の、治療による処置のための方法ではない、および／または、人間の生殖細胞系列の遺伝的同一性を改変するためのプロセスではない。
ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ系
ＣＲＩＳＰＲ－エンドヌクレアーゼ系は、原核生物において天然に存在する防御機構であり、遺伝子編集のために使用されるＲＮＡ誘導型ＤＮＡ標的化プラットフォームとして別の目的で利用されている。ＣＲＩＳＰＲ系には、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、およびＶＩ型系が含まれる。一部の態様では、ＣＲＩＳＰＲ系は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系である。他の態様では、ＣＲＩＳＰＲ系は、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ系である。ＣＲＩＳＰＲ系は、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９、ならびにＤＮＡの切断を標的化するための２つの非コードＲＮＡ－ｃｒｉｓｐｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）に依拠する。
ｃｒＲＮＡは、一般には標的ＤＮＡの約２０ヌクレオチド（ｎｔ）の配列とのワトソン・クリック塩基対合を通じたＣＲＩＳＰＲ－エンドヌクレアーゼ複合体の配列認識および特異性を駆動する。ｃｒＲＮＡの５’の２０ｎｔの配列を変化させることにより、ＣＲＩＳＰＲ－エンドヌクレアーゼ複合体を特定の遺伝子座に標的化することが可能になる。標的配列の後にプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と称される特異的な短いＤＮＡモチーフ（配列ＮＧＧを有する）が続く場合、ＣＲＩＳＰＲ－エンドヌクレアーゼ複合体は、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の最初の２０ｎｔとの配列マッチを含有するＤＮＡ配列にのみ結合する。
ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの３’末端とハイブリダイズしてＲＮＡ－二重鎖構造を形成し、それにエンドヌクレアーゼが結合して、触媒として活性なＣＲＩＳＰＲ－エンドヌクレアーゼ複合体が形成され、次いで、それにより標的ＤＮＡが切断され得る。
ＣＲＩＳＰＲ－エンドヌクレアーゼ複合体が標的部位においてＤＮＡに結合したら、エンドヌクレアーゼ内の２つの独立したヌクレアーゼドメインのそれぞれが、ＤＮＡ鎖の一方をＰＡＭ部位の３塩基上流で切断し、ＤＮＡの両鎖が塩基対で終止した（平滑末端）二本鎖切断（ＤＳＢ）を残す。
一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９）である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するが、他のＣａｓ９ホモログ、例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｃａｓ９、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＣＲＩＳＰＲ １ Ｃａｓ９、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＣＲＩＳＰＲ ３ Ｃａｓ９、またはＴ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ Ｃａｓ９を使用することができる。他の場合では、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、Ｃｐｆ１、例えば、Ｌ．ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６ Ｃｐｆ１またはＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６ Ｃｐｆ１である。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても公知）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼである。一部の実施形態では、野生型バリアントを使用することができる。一部の実施形態では、前述のエンドヌクレアーゼの改変バージョン（例えば、そのホモログ、その天然に存在する分子の組換え、そのコドン最適化されたもの、またはその改変バージョン）を使用することができる。
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、少なくとも１つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）と連結していてよい。少なくとも１つのＮＬＳがＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのアミノ末端またはアミノ末端から５０アミノ酸以内に位置していてよい、および／または、少なくとも１つのＮＬＳがＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのカルボキシ末端またはカルボキシ末端から５０アミノ酸以内に位置していてよい。
例示的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓポリペプチドとしては、Fonfara et al., "Phylogeny of Cas9 determines functional exchangeability of dual-RNA and Cas9 among orthologous type II CRISPR-Cas systems," Nucleic Acids Research, 2014, 42: 2577-2590において公開されているＣａｓ９ポリペプチドが挙げられる。Ｃａｓ遺伝子が発見されて以来、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子命名方式は広範囲にわたって書き換えられている。Ｆｏｎｆａｒａらは、種々の種由来のＣａｓ９ポリペプチドに対するＰＡＭ配列も提示している。
ジンクフィンガーヌクレアーゼ
ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ＩＩ型エンドヌクレアーゼＦｏｋＩの触媒ドメインと連結した工学的に操作されたジンクフィンガーＤＮＡ結合性ドメインで構成されるモジュラータンパク質である。ＦｏｋＩは、二量体としてしか機能しないので、触媒として活性なＦｏｋＩ二量体の形成を可能にするために、ＺＦＮの対を、逆のＤＮＡ鎖上の同類の標的「半部位」配列と厳密な間隔で結合するように工学的に操作しなければならない。それ自体は配列特異性を有さないＦｏｋＩドメインの二量体が形成されると、ゲノム編集の開始ステップとしてＺＦＮ半部位間にＤＮＡ二本鎖切断が生じる。
各ＺＦＮのＤＮＡ結合性ドメインは、一般にはＣｙｓ２－Ｈｉｓ２に富むアーキテクチャの３～６個のジンクフィンガーで構成され、各フィンガーが標的ＤＮＡ配列の１本の鎖上のヌクレオチドのトリプレットを主に認識するが、第４のヌクレオチドとの交差鎖相互作用も重要であり得る。ＤＮＡとの重要な接触をなす位置にあるフィンガーのアミノ酸の変更により、所与のフィンガーの配列特異性が変更される。したがって、４－フィンガージンクフィンガータンパク質は、１２ｂｐの標的配列を選択的に認識し、ここで、標的配列は、各フィンガーが寄与するトリプレット優先性の複合であるが、トリプレット優先性は近接するフィンガーによる影響を種々の程度で受ける可能性がある。ＺＦＮの重要な側面は、単に個々のフィンガーを改変することによってほぼ全てのゲノムアドレスに容易に再標的化可能なことである。ＺＦＮの大多数の適用において、それぞれ１２～１８ｂｐを認識する４～６個のフィンガーのタンパク質が使用される。したがって、ＺＦＮの対は、一般には、半部位間の典型的な５～７ｂｐのスペーサーを含めずに２４～３６ｂｐの組み合わさった標的配列を認識する。結合性部位を、１５～１７ｂｐを含むより大きなスペーサーでさらに分離することができる。反復配列または遺伝子ホモログは設計プロセスの間に排除されると仮定して、この長さの標的配列はヒトゲノムにおいて独特である可能性が高い。それにもかかわらず、ＺＦＮタンパク質－ＤＮＡ相互作用は、それらの特異性に関して絶対的なものではなく、したがって、２つのＺＦＮ間のヘテロ二量体として、またはＺＦＮの一方もしくは他方のホモ二量体として、オフターゲットの結合および切断事象が起こる。後者の可能性は、ＦｏｋＩドメインの二量体形成の境界面を工学的に操作して、互いとしか二量体を形成することができず、それ自体では二量体を形成することができない、偏性ヘテロ二量体バリアントとしても公知の「プラス」および「マイナス」バリアントを創出することによって有効に排除されている。偏性ヘテロ二量体が強いられることにより、ホモ二量体の形成が防止される。これにより、ＺＦＮ、ならびにこれらのＦｏｋＩバリアントが採用される任意の他のヌクレアーゼの特異性が著しく増強されている。
種々のＺＦＮに基づく系が当技術分野において記載されており、その改変が定期的に報告されており、多数の参考文献に、ＺＦＮの設計を手引きするために使用される規則およびパラメータが記載されている；例えば、Segal et al., Proc Natl Acad Sci, 1999 96 (6): 2758-63；Dreier B et al., J Mol Biol., 2000, 303 (4): 489-502；Liu Q et al., J Biol Chem., 2002, 277 (6): 3850-6；Dreier et al., J Biol Chem., 2005, 280 (42): 35588-97；およびDreier et al., J Biol Chem. 2001, 276 (31): 29466-78を参照されたい。
転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）
ＴＡＬＥＮは、ＺＦＮの場合と同様に、工学的に操作されたＤＮＡ結合性ドメインがＦｏｋＩヌクレアーゼドメインと連結されており、ＴＡＬＥＮの対がタンデムに作動して標的化ＤＮＡ切断を実現する、モジュラーヌクレアーゼの別のフォーマットの代表である。ＺＦＮとの主要な差異は、ＤＮＡ結合性ドメインの性質および付随する標的ＤＮＡ配列認識特性である。ＴＡＬＥＮ ＤＮＡ結合性ドメインは、植物細菌病原体Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｓｐに関して最初に記載されたＴＡＬＥタンパク質に由来する。ＴＡＬＥは、３３～３５アミノ酸リピートのタンデムなアレイで構成され、各リピートが一般には最大２０ｂｐ長である標的ＤＮＡ配列内の単一の塩基対を認識し、標的配列の総長が最大４０ｂｐになる。各リピートのヌクレオチド特異性は、１２位および１３位のただ２つのアミノ酸を含むリピート内可変二残基（ｒｅｐｅａｔ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｉｒｅｓｉｄｕｅ）（ＲＶＤ）によって決定される。塩基であるグアニン、アデニン、シトシンおよびチミンは、４つのＲＶＤ：それぞれＡｓｎ－Ａｓｎ、Ａｓｎ－Ｉｌｅ、Ｈｉｓ－ＡｓｐおよびＡｓｎ－Ｇｌｙによって主に認識される。これは、ジンクフィンガーよりもはるかに単純な認識コードを構成し、したがって、ヌクレアーゼ設計に関してジンクフィンガーを超える利点となる。それにもかかわらず、ＺＦＮの場合と同様に、ＴＡＬＥＮのタンパク質－ＤＮＡ相互作用はそれらの特異性に関して絶対的なものではなく、ＴＡＬＥＮについても、オフターゲットの活性を低減するためにＦｏｋＩドメインの偏性ヘテロ二量体バリアントの使用が有益である。
触媒機能が非活性化されたＦｏｋＩドメインの追加的なバリアントが創出されている。ＴＡＬＥＮ対またはＺＦＮ対のいずれかの片方が不活性ＦｏｋＩドメインを含有する場合には、標的部位において、ＤＳＢではなく一本鎖ＤＮＡ切断（ニッキング）のみが生じる。結果は、Ｃａｓ９切断ドメインの一方が非活性化されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１「ニッカーゼ」変異体を使用した場合と同等である。ＤＮＡニックを使用して、ＨＤＲによるゲノム編集を駆動することができるが、ＤＳＢを用いる場合よりも効率が低い。主要な利益は、ＮＨＥＪ媒介性ミス修復を起こしやすいＤＳＢとは異なり、オフターゲットのニックが迅速にかつ的確に修復されることである。
種々のＴＡＬＥＮに基づく系が当技術分野において記載されており、その改変が定期的に報告されている；例えば、Boch, Science, 2009 326 (5959): 1509-12；Mak et al., Science, 2012, 335 (6069): 716-9；およびMoscou et al., Science, 2009, 326 (5959): 1501を参照されたい。「Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ」プラットフォーム、またはクローニングスキームに基づいたＴＡＬＥＮの使用が複数のグループにより記載されている；例えば、Cermak et al., Nucleic Acids Res., 2011, 39 (12): e82；Li et al., Nucleic Acids Res., 2011, 39 (14): 6315-25；Weber et al., PLoS One., 2011, 6 (2): e16765；Wang et al., J Genet Genomics, 2014, 41 (6): 339-47.；およびCermak T et al., Methods Mol Biol., 2015 1239: 133-59を参照されたい。
ホーミングエンドヌクレアーゼ
ホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）は、長い認識配列（１４～４４塩基対）を有し、ＤＮＡを高い特異性で－多くの場合、ゲノム内の独特の部位において切断する、配列特異的エンドヌクレアーゼである。ＨＥは、それらの構造によって分類されるファミリーが少なくとも６つ知られており、それらには、真核生物、原生生物、細菌、古細菌、シアノバクテリアおよびファージを含めた広範囲の宿主に由来するＧＩＹ－ＹＩＧ、Ｈｉｓ－Ｃｉｓボックス、Ｈ－Ｎ－Ｈ、ＰＤ－（Ｄ／Ｅ）ｘＫ、およびＶｓｒ様が含まれる。ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮの場合と同様に、ＨＥを、ゲノム編集の最初のステップとして標的遺伝子座においてＤＳＢを創出するために使用することができる。さらに、一部の天然のおよび工学的に操作されたＨＥは、一本鎖のＤＮＡのみをカットし、それにより、部位特異的ニッカーゼとして機能する。ＨＥの大きな標的配列およびＨＥによりもたらされる特異性により、ＨＥは、部位特異的ＤＳＢを創出するための魅力的な候補になっている。
種々のＨＥに基づく系が当技術分野において記載されており、その改変が定期的に報告されている；例えば、Steentoft et al., Glycobiology, 2014, 24 (8): 663-80；Belfort and Bonocora, Methods Mol Biol., 2014, 1123: 1-26；およびHafez and Hausner, Genome, 2012, 55 (8): 553-69による総説を参照されたい。
ＭｅｇａＴＡＬ／Ｔｅｖ－ｍＴＡＬＥＮ／ＭｅｇａＴｅｖ
ハイブリッドヌクレアーゼのさらなる例として、ＭｅｇａＴＡＬプラットフォームおよびＴｅｖ－ｍＴＡＬＥＮプラットフォームは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合性ドメインと、触媒として活性なＨＥの融合物を使用し、ＴＡＬＥの調整可能なＤＮＡ結合および特異性、ならびにＨＥの切断配列特異性の両方を活用する；例えば、Boissel et al., Nucleic Acids Res., 2014, 42: 2591-2601; Kleinstiver et al., G3, 2014, 4: 1155-65；およびBoissel and Scharenberg, Methods Mol. Biol., 2015, 1239: 171-96を参照されたい。
さらなるバリエーションでは、ＭｅｇａＴｅｖアーキテクチャは、メガヌクレアーゼ（Ｍｅｇａ）の、ＧＩＹ－ＹＩＧホーミングエンドヌクレアーゼＩ－ＴｅｖＩ（Ｔｅｖ）に由来するヌクレアーゼドメインとの融合物である。２つの活性部位は、ＤＮＡ基質上に約３０ｂｐ離れて位置付けられ、非適合性の付着末端を有する２カ所のＤＳＢを生じさせる；例えば、Wolfs et al., Nucleic Acids Res., 2014, 42, 8816-29を参照されたい。既存のヌクレアーゼに基づく手法の他の組合せが展開され、本明細書に記載の標的化ゲノム改変の実現に有用であることが予測される。
ｄＣａｓ９－ＦｏｋＩまたはｄＣｐｆ１－Ｆｏｋ１および他のヌクレアーゼ
上記のヌクレアーゼプラットフォームの構造特性および機能特性を組み合わせることにより、固有の欠陥のいくつかを潜在的に克服することができる、ゲノム編集のためのさらなる手法がもたらされる。例として、ＣＲＩＳＰＲゲノム編集系では、一般には、単一のＣａｓ９エンドヌクレアーゼを使用してＤＳＢを創出する。標的化の特異性は、標的ＤＮＡ（それに加えて、追加的な、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９の場合では隣接するＮＡＧまたはＮＧＧ ＰＡＭ配列内の２塩基）とワトソン・クリック塩基対合するガイドＲＮＡ内の２０または２４ヌクレオチド配列によって駆動される。そのような配列は、ヒトゲノムに独特なものになるのに十分に長いが、ＲＮＡ／ＤＮＡ相互作用の特異性は絶対的なものではなく、特に標的配列の５’側半分について著しい無差別性が時には許容され、特異性を駆動する塩基の数が事実上減少する。これを解決する１つの方法は、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１触媒機能を完全に非活性化させ、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合機能のみを保持させ、その代わりに、ＦｏｋＩドメインを非活性化されたＣａｓ９に融合することであった；例えば、Tsai et al., Nature Biotech, 2014, 32: 569-76；およびGuilinger et al., Nature Biotech., 2014, 32: 577-82を参照されたい。ＦｏｋＩは、触媒として活性になるためには二量体を形成しなければならないので、２つのＦｏｋＩ融合物を極めて近傍につなぎとめて、二量体を形成させ、ＤＮＡを切断するために、２つのガイドＲＮＡが必要である。これにより、組み合わされた標的部位の塩基の数が本質的に倍加し、それにより、ＣＲＩＳＰＲに基づく系による標的化のストリンジェンシーが増大する。
さらなる例として、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合性ドメインの、触媒として活性なＨＥ、例えばＩ－ＴｅｖＩとの融合は、ＴＡＬＥの調整可能なＤＮＡ結合および特異性、ならびにＩ－ＴｅｖＩの切断配列特異性の両方を活用するものであり、オフターゲットの切断がさらに低減され得ると期待される。
塩基編集
一部の実施形態では、塩基編集を使用して、細胞において遺伝子を編集する。塩基編集は、ＤＮＡの二本鎖切断を伴わない１つのヌクレオチドの別のヌクレオチドへの変換を可能にする技法である。塩基編集により、ＣからＴへの変換、ＧからＡへの変換、またはその逆の変換が可能になる。シトシンのエディターの例としては、触媒として不活性な形態のＣａｓ９と融合したｒＡＰＯＢＥＣ１が挙げられる。Ｃａｓ９が目的の部位への結合を補助し、ｒＡＰＯＢＥＣ１シチジンデアミナーゼが点変異を誘導する。本明細書に記載の通り、アデニンの変換には、変異型転移ＲＮＡアデノシンデアミナーゼ（ＴａｄＡ）、Ｃａｓ９ニッカーゼ、およびｓｇＲＮＡが必要である。構築物により、鎖の切断を導入せずに部位特異的変異を導入することが可能である。一部の実施形態では、塩基編集を使用して、本明細書に記載の細胞に１つまたは複数の変異を導入する。
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ系は、本明細書で使用される場合、野生型の例示的なエンドヌクレアーゼ、例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９、ＵＳ２０１４／００６８７９７の配列番号８またはSapranauskas et al., Nucleic Acids Res, 39 (21): 9275-9282 (2011)に対して少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。エンドヌクレアーゼは、野生型エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９、上記）に対して、連続した１０アミノ酸にわたって、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％の同一性を含み得る。エンドヌクレアーゼは、野生型エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９、上記）に対して、連続した１０アミノ酸にわたって、最大で７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％の同一性を含み得る。エンドヌクレアーゼは、野生型エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９、上記）に対して、エンドヌクレアーゼのＨＮＨヌクレアーゼドメイン内の連続した１０アミノ酸にわたって、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％の同一性を含み得る。エンドヌクレアーゼは、野生型エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９、上記）に対して、エンドヌクレアーゼのＨＮＨヌクレアーゼドメイン内の連続した１０アミノ酸にわたって、最大で７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％の同一性を含み得る。エンドヌクレアーゼは、野生型エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９、上記）に対して、エンドヌクレアーゼのＲｕｖＣヌクレアーゼドメイン内の連続した１０アミノ酸にわたって、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％の同一性を含み得る。エンドヌクレアーゼは、野生型エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９、上記）に対して、エンドヌクレアーゼのＲｕｖＣヌクレアーゼドメイン内の連続した１０アミノ酸にわたって、最大で７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％の同一性を含み得る。
エンドヌクレアーゼは、野生型の例示的なエンドヌクレアーゼの改変形態を含み得る。野生型の例示的なエンドヌクレアーゼの改変形態は、エンドヌクレアーゼの核酸切断活性を低下させる変異を含み得る。野生型の例示的なエンドヌクレアーゼの改変形態は、野生型の例示的なエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９、上記）の核酸切断活性の９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満を有し得る。エンドヌクレアーゼの改変形態は、実質的な核酸切断活性を有さない場合がある。エンドヌクレアーゼが実質的な核酸切断活性を有さない改変形態である場合、本明細書では、「酵素として不活性」と称される。
企図されている変異は、置換、付加、および欠失、またはこれらの任意の組合せを含み得る。変異は、変異させたアミノ酸をアラニンに変換する。変異は、変異させたアミノ酸を別のアミノ酸（例えば、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リシン、またはアルギニン）に変換する。変異は、変異させたアミノ酸を非天然アミノ酸（例えば、セレノメチオニン）に変換する。変異は、変異させたアミノ酸をアミノ酸模倣体（例えば、ホスホ模倣体）に変換する。変異は、保存的変異であり得る。例えば、変異は、変異させたアミノ酸をサイズ、形状、電荷、極性、コンフォメーションが類似したアミノ酸、および／または変異させたアミノ酸の回転異性体に変換する（例えば、システイン／セリン変異、リシン／アスパラギン変異、ヒスチジン／フェニルアラニン変異）。変異は、読み枠のシフトおよび／または未成熟終止コドンの創出を引き起こし得る。変異は、１つまたは複数の遺伝子の発現に影響を及ぼす遺伝子または遺伝子座の調節領域の変化を引き起こしあり得る。
ガイドＲＮＡ
本開示は、関連するエンドヌクレアーゼの活性をポリヌクレオチド内の特定の標的部位に方向づけることができるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を提供する。ガイドＲＮＡは、少なくとも、目的の標的核酸配列とハイブリダイズするスペーサー配列、およびＣＲＩＳＰＲリピート配列を含み得る。ＣＲＩＳＰＲ ＩＩ型系では、ｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と称される第２のＲＮＡも含む。ＣＲＩＳＰＲ ＩＩ型ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）では、ＣＲＩＳＰＲリピート配列とｔｒａｃｒＲＮＡ配列が互いにハイブリダイズして二重鎖を形成する。ＣＲＩＳＰＲ Ｖ型系では、ｇＲＮＡは、二重鎖を形成するｃｒＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡはエンドヌクレアーゼを結合し得、したがって、ｇＲＮＡとエンドヌクレアーゼが複合体を形成する。ｇＲＮＡは、エンドヌクレアーゼとの会合によって複合体に標的特異性をもたらし得る。したがって、ゲノム標的化核酸によりエンドヌクレアーゼの活性を方向づけることができる。
例示的なガイドＲＮＡは、１５～２００ヌクレオチドを含むスペーサー配列を含み、ここで、ｇＲＮＡは、ＧＲＣｈ３８ヒトゲノムアセンブリに基づいたゲノム位置を標的とする。当業者には理解される通り、各ｇＲＮＡを、そのゲノム標的部位または領域と相補的なスペーサー配列を含むように設計することができる。Jinek et al., Science, 2012, 337, 816-821およびDeltcheva et al., Nature, 2011, 471, 602-607を参照されたい。
ｇＲＮＡは二重分子ガイドＲＮＡであり得る。ｇＲＮＡは単一分子ガイドＲＮＡであり得る。
二重分子ガイドＲＮＡは、２本のＲＮＡの鎖を含み得る。第１の鎖は、５’から３’の方向に、必要に応じたスペーサー伸長配列、スペーサー配列および最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列を含む。第２の鎖は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列と相補的）、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列および必要に応じたｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列を含み得る。
単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、５’から３’の方向に、必要に応じたスペーサー伸長配列、スペーサー配列、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列、単一分子ガイドリンカー、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列および必要に応じたｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列を含み得る。必要に応じたｔｒａｃｒＲＮＡ伸長は、追加的な機能性（例えば、安定性）をガイドＲＮＡに寄与するエレメントを含み得る。単一分子ガイドリンカーは、最小ＣＲＩＳＰＲリピートと最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を連結してヘアピン構造を形成し得る。必要に応じたｔｒａｃｒＲＮＡ伸長は、１つまたは複数のヘアピンを含み得る。
一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２０ヌクレオチドのスペーサー配列を含む。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２０ヌクレオチド未満のスペーサー配列を含む。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２０ヌクレオチドを超えるスペーサー配列を含む。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に１７～３０ヌクレオチドの可変長のスペーサー配列を含む。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、１ヌクレオチドを超える、５ヌクレオチドを超える、１０ヌクレオチドを超える、１５ヌクレオチドを超える、２０ヌクレオチドを超える、２５ヌクレオチドを超える、３０ヌクレオチドを超える、３５ヌクレオチドを超える、４０ヌクレオチドを超える、４５ヌクレオチドを超える、５０ヌクレオチドを超える、６０ヌクレオチドを超える、７０ヌクレオチドを超える、８０ヌクレオチドを超える、９０ヌクレオチドを超える、１００ヌクレオチドを超える、１２０ヌクレオチドを超える、１４０ヌクレオチドを超える、１６０ヌクレオチドを超える、１８０ヌクレオチドを超える、または２００ヌクレオチドを超える長さを有するスペーサー伸長配列を含む。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、３ヌクレオチド未満、５ヌクレオチド未満、１０ヌクレオチド未満、１５ヌクレオチド未満、２０ヌクレオチド未満、２５ヌクレオチド未満、３０ヌクレオチド未満、３５ヌクレオチド未満、４０ヌクレオチド未満、４５ヌクレオチド未満、５０ヌクレオチド未満、６０ヌクレオチド未満、７０ヌクレオチド未満、８０ヌクレオチド未満、９０ヌクレオチド未満、または１００ヌクレオチド未満の長さを有するスペーサー伸長配列を含む。
一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、別の部分（例えば、安定性制御配列、エンドリボヌクレアーゼ結合性配列、またはリボザイム）を含むスペーサー伸長配列を含む。部分は、核酸標的化核酸の安定性を低下または増大させ得る。部分は、転写ターミネーターセグメント（すなわち、転写終結配列）であり得る。部分は、真核細胞において機能し得る。部分は、原核細胞において機能し得る。部分は、真核細胞と原核細胞のどちらにおいても機能し得る。適切な部分の非限定的な例としては、５’キャップ（例えば、７－メチルグアニル酸キャップ（ｍ７ Ｇ））、リボスイッチ配列（例えば、タンパク質およびタンパク質複合体による安定性の調節および／または接近可能性の調節を可能にするため）、ｄｓＲＮＡ二重鎖（すなわち、ヘアピン）を形成する配列、ＲＮＡを細胞内の位置（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体など）に標的化する配列、追跡をもたらす改変もしくは配列（例えば、蛍光分子との直接コンジュゲーション、蛍光検出を容易にする部分とのコンジュゲーション、蛍光検出を可能にする配列など）、および／またはタンパク質（例えば、転写活性化因子、転写リプレッサー、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストン脱アセチル化酵素などを含めた、ＤＮＡに作用するタンパク質）の結合性部位をもたらす改変もしくは配列が挙げられる。
一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、標的ポリヌクレオチド内の配列とハイブリダイズするスペーサー配列を含む。ｇＲＮＡのスペーサーは、標的ポリヌクレオチドと、ハイブリダイゼーション（すなわち、塩基対合）によって配列特異的に相互作用し得る。スペーサーのヌクレオチド配列は、目的の標的核酸の配列に応じて変動し得る。
ＣＲＩＳＰＲ－エンドヌクレアーゼ系では、スペーサー配列を、系に使用されるエンドヌクレアーゼのＰＡＭに対して５’側に位置する標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズするように設計することができる。スペーサーは、標的配列と完全にマッチし得る、または、ミスマッチを有し得る。各エンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、標的ＤＮＡ内にそれが認識する特定のＰＡＭ配列を有する。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９は、配列５’－ＮＲＧ－３’を含むＰＡＭを認識し、ここで、ＲはＡまたはＧのいずれかを含み、Ｎは任意のヌクレオチドであり、Ｎはスペーサー配列によって標的とされる標的核酸配列に対してすぐ３’側にある。
標的ポリヌクレオチド配列は、２０ヌクレオチドを含み得る。標的ポリヌクレオチドは、２０ヌクレオチド未満を含み得る。標的ポリヌクレオチドは、２０ヌクレオチドよりも多くを含み得る。標的ポリヌクレオチドは、少なくとも５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０ヌクレオチドまたはそれよりも多くのヌクレオチドを含み得る。標的ポリヌクレオチドは、最大で５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０ヌクレオチドまたはそれよりも多くのヌクレオチドを含み得る。標的ポリヌクレオチド配列は、ＰＡＭの最初のヌクレオチドのすぐ５’側に２０塩基を含み得る。
標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズするスペーサー配列は、少なくとも約６ヌクレオチド（ｎｔ）の長さを有し得る。スペーサー配列は、少なくとも約６ｎｔ、少なくとも約１０ｎｔ、少なくとも約１５ｎｔ、少なくとも約１８ｎｔ、少なくとも約１９ｎｔ、少なくとも約２０ｎｔ、少なくとも約２５ｎｔ、少なくとも約３０ｎｔ、少なくとも約３５ｎｔまたは少なくとも約４０ｎｔ、約６ｎｔから約８０ｎｔまで、約６ｎｔから約５０ｎｔまで、約６ｎｔから約４５ｎｔまで、約６ｎｔから約４０ｎｔまで、約６ｎｔから約３５ｎｔまで、約６ｎｔから約３０ｎｔまで、約６ｎｔから約２５ｎｔまで、約６ｎｔから約２０ｎｔまで、約６ｎｔから約１９ｎｔまで、約１０ｎｔから約５０ｎｔまで、約１０ｎｔから約４５ｎｔまで、約１０ｎｔから約４０ｎｔまで、約１０ｎｔから約３５ｎｔまで、約１０ｎｔから約３０ｎｔまで、約１０ｎｔから約２５ｎｔまで、約１０ｎｔから約２０ｎｔまで、約１０ｎｔから約１９ｎｔまで、約１９ｎｔから約２５ｎｔまで、約１９ｎｔから約３０ｎｔまで、約１９ｎｔから約３５ｎｔまで、約１９ｎｔから約４０ｎｔまで、約１９ｎｔから約４５ｎｔまで、約１９ｎｔから約５０ｎｔまで、約１９ｎｔから約６０ｎｔまで、約２０ｎｔから約２５ｎｔまで、約２０ｎｔから約３０ｎｔまで、約２０ｎｔから約３５ｎｔまで、約２０ｎｔから約４０ｎｔまで、約２０ｎｔから約４５ｎｔまで、約２０ｎｔから約５０ｎｔまで、または約２０ｎｔから約６０ｎｔまでであり得る。一部の例では、スペーサー配列は、２０ヌクレオチドを含み得る。一部の例では、スペーサーは、１９ヌクレオチドを含み得る。一部の例では、スペーサーは、１８ヌクレオチドを含み得る。一部の例では、スペーサーは、２２ヌクレオチドを含み得る。
一部の例では、スペーサー配列と標的核酸の間のパーセント相補性は、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％である。一部の例では、スペーサー配列と標的核酸の間のパーセント相補性は、最大で約３０％、最大で約４０％、最大で約５０％、最大で約６０％、最大で約６５％、最大で約７０％、最大で約７５％、最大で約８０％、最大で約８５％、最大で約９０％、最大で約９５％、最大で約９７％、最大で約９８％、最大で約９９％、または１００％である。一部の例では、スペーサー配列と標的核酸の間のパーセント相補性は、標的核酸の相補鎖の標的配列の最も５’側の連続した６ヌクレオチドにわたって１００％である。スペーサー配列と標的核酸の間のパーセント相補性は、連続した約２０ヌクレオチドにわたって少なくとも６０％であり得る。スペーサー配列と標的核酸の長さは、１～６ヌクレオチド異なってよく、これはバルジ（単数または複数）と考えることができる。
ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、細胞内の最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列とハイブリダイズするヌクレオチドを含み得る。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は、二重鎖、すなわち、塩基対合した二本鎖構造を形成し得る。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と最小ＣＲＩＳＰＲリピートは一緒になってＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼに結合し得る。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の少なくとも一部が最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列とハイブリダイズし得る。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列と少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％相補的であり得る。
最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約７ヌクレオチドから約１００ヌクレオチドまでの長さを有し得る。例えば、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約７ヌクレオチド（ｎｔ）から約５０ｎｔまで、約７ｎｔから約４０ｎｔまで、約７ｎｔから約３０ｎｔまで、約７ｎｔから約２５ｎｔまで、約７ｎｔから約２０ｎｔまで、約７ｎｔから約１５ｎｔまで、約８ｎｔから約４０ｎｔまで、約８ｎｔから約３０ｎｔまで、約８ｎｔから約２５ｎｔまで、約８ｎｔから約２０ｎｔまで、約８ｎｔから約１５ｎｔまで、約１５ｎｔから約１００ｎｔまで、約１５ｎｔから約８０ｎｔまで、約１５ｎｔから約５０ｎｔまで、約１５ｎｔから約４０ｎｔまで、約１５ｎｔから約３０ｎｔまでまたは約１５ｎｔから約２５ｎｔまでの長さであり得る。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、およそ９ヌクレオチドの長さであり得る。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、およそ１２ヌクレオチドであり得る。最小ｔｒａｃｒＲＮＡは、Ｊｉｎｅｋら、上記に記載されているｔｒａｃｒＲＮＡ ｎｔ２３～４８からなり得る。
最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、参照最小ｔｒａｃｒＲＮＡ（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列と、連続した少なくとも６、７、または８ヌクレオチドのひと続きにわたって少なくとも約６０％同一であり得る。例えば、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、参照最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と、連続した少なくとも６、７、または８ヌクレオチドのひと続きにわたって少なくとも約６５％同一、約７０％同一、約７５％同一、約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、約９９％同一または１００％同一であり得る。
最小ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと最小ｔｒａｃｒＲＮＡの間の二重鎖は、二重らせんを含み得る。最小ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと最小ｔｒａｃｒＲＮＡの間の二重鎖は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０ヌクレオチドまたはそれよりも多くのヌクレオチドを含み得る。最小ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと最小ｔｒａｃｒＲＮＡの間の二重鎖は、最大で約１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０ヌクレオチドまたはそれよりも多くのヌクレオチドを含み得る。
二重鎖は、ミスマッチを含み得る（すなわち、二重鎖の２本の鎖は１００％相補的ではない）。二重鎖は、少なくとも約１つ、２つ、３つ、４つ、または５つまたはミスマッチを含み得る。二重鎖は、最大で約１つ、２つ、３つ、４つ、または５つまたはミスマッチを含み得る。二重鎖は、２つ以下のミスマッチを含み得る。
一部の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、３’ｔｒａｃｒＲＮＡであり得る。一部の実施形態では、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、参照ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のｔｒａｃｒＲＮＡ）に対して少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％の配列同一性を有する配列を含み得る。
一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列を含み得る。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、約１ヌクレオチドから約４００ヌクレオチドまでの長さを有し得る。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１ヌクレオチドを超える、５ヌクレオチドを超える、１０ヌクレオチドを超える、１５ヌクレオチドを超える、２０ヌクレオチドを超える、２５ヌクレオチドを超える、３０ヌクレオチドを超える、３５ヌクレオチドを超える、４０ヌクレオチドを超える、４５ヌクレオチドを超える、５０ヌクレオチドを超える、６０ヌクレオチドを超える、７０ヌクレオチドを超える、８０ヌクレオチドを超える、９０ヌクレオチドを超える、１００ヌクレオチドを超える、１２０ヌクレオチドを超える、１４０ヌクレオチドを超える、１６０ヌクレオチドを超える、１８０ヌクレオチドを超える、または２００ヌクレオチドを超える長さを有し得る。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、約２０ヌクレオチドから約５０００ヌクレオチドまでまたはそれを超える長さを有し得る。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、５ヌクレオチド未満、１０ヌクレオチド未満、１５ヌクレオチド未満、２０ヌクレオチド未満、２５ヌクレオチド未満、３０ヌクレオチド未満、３５ヌクレオチド未満、４０ヌクレオチド未満、４５ヌクレオチド未満、５０ヌクレオチド未満、６０ヌクレオチド未満、７０ヌクレオチド未満、８０ヌクレオチド未満、９０ヌクレオチド未満、または１００ヌクレオチド未満の長さを有し得る。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１０ヌクレオチド未満の長さを含み得る。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１０～３０ヌクレオチドの長さであり得る。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、３０～７０ヌクレオチドの長さであり得る。
ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、機能的部分（例えば、安定性制御配列、リボザイム、エンドリボヌクレアーゼ結合性配列）を含み得る。機能的部分は、転写ターミネーターセグメント（すなわち、転写終結配列）を含み得る。機能的部分は、約１０ヌクレオチド（ｎｔ）から約１００ヌクレオチドまで、約１０ｎｔから約２０ｎｔまで、約２０ｎｔから約３０ｎｔまで、約３０ｎｔから約４０ｎｔまで、約４０ｎｔから約５０ｎｔまで、約５０ｎｔから約６０ｎｔまで、約６０ｎｔから約７０ｎｔまで、約７０ｎｔから約８０ｎｔまで、約８０ｎｔから約９０ｎｔまで、または約９０ｎｔから約１００ｎｔまで、約１５ｎｔから約８０ｎｔまで、約１５ｎｔから約５０ｎｔまで、約１５ｎｔから約４０ｎｔまで、約１５ｎｔから約３０ｎｔまで、または約１５ｎｔから約２５ｎｔまでの全長を有し得る。
一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、約３ヌクレオチドから約１００ヌクレオチドまでに長さを有するリンカー配列を含み得る。Ｊｉｎｅｋら、上記では、例えば、単純な４ヌクレオチドの「テトラループ」（－ＧＡＡＡ－）が使用された（Jinek et al., Science, 2012, 337 (6096): 816-821）。例示的なリンカーは、約３ヌクレオチド（ｎｔ）から約９０ｎｔまで、約３ｎｔから約８０ｎｔまで、約３ｎｔから約７０ｎｔまで、約３ｎｔから約６０ｎｔまで、約３ｎｔから約５０ｎｔまで、約３ｎｔから約４０ｎｔまで、約３ｎｔから約３０ｎｔまで、約３ｎｔから約２０ｎｔまで、約３ｎｔから約１０ｎｔまでの長さを有する。例えば、リンカーは、約３ｎｔから約５ｎｔまで、約５ｎｔから約１０ｎｔまで、約１０ｎｔから約１５ｎｔまで、約１５ｎｔから約２０ｎｔまで、約２０ｎｔから約２５ｎｔまで、約２５ｎｔから約３０ｎｔまで、約３０ｎｔから約３５ｎｔまで、約３５ｎｔから約４０ｎｔまで、約４０ｎｔから約５０ｎｔまで、約５０ｎｔから約６０ｎｔまで、約６０ｎｔから約７０ｎｔまで、約７０ｎｔから約８０ｎｔまで、約８０ｎｔから約９０ｎｔまで、または約９０ｎｔから約１００ｎｔまでの長さを有し得る。単一分子ガイド核酸のリンカーは、４ヌクレオチドから４０ヌクレオチドの間であり得る。リンカーは、少なくとも約１００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、もしくは７０００ヌクレオチドまたはそれを超え得る。リンカーは、最大で約１００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、もしくは７０００ヌクレオチドまたはそれを超え得る。
リンカーは、種々の配列のいずれかを含んでもよいが、一部の例では、リンカーは、ガイドの他の機能的領域に干渉する恐れがある分子内結合を引き起こし得る、ガイドＲＮＡの他の部分に対して広範囲にわたる相同性の領域を有する配列を含まない。Ｊｉｎｅｋら、上記では、単純な４ヌクレオチド配列－ＧＡＡＡ－が使用されたが（Jinek et al., Science, 2012, 337 (6096): 816-821）、より長い配列を含めた多数の他の配列も同様に使用することができる。
リンカー配列は、機能的部分を含み得る。例えば、リンカー配列は、アプタマー、リボザイム、タンパク質と相互作用するヘアピン、タンパク質結合性部位、ＣＲＩＳＰＲアレイ、イントロン、またはエクソンを含めた１つまたは複数の特色を含み得る。リンカー配列は、少なくとも約１、２、３、４、または５またはそれよりも多くの機能的部分を含み得る。一部の例では、リンカー配列は、最大で約１、２、３、４、または５またはそれよりも多くの機能的部分を含み得る。
一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、例えば、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端にウラシルを含まない。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、例えば、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に１つまたは複数のウラシルを含む。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のウラシル（Ｕ）を含む。
ｓｇＲＮＡは、化学修飾されていてもよい。一部の実施形態では、化学修飾されたｇＲＮＡは、化学修飾、例えば、２’－Ｏ－メチル糖修飾を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含むｇＲＮＡである。一部の実施形態では、化学修飾されたｇＲＮＡは、修飾された核酸骨格を含む。一部の実施形態では、化学修飾されたｇＲＮＡは、２’－Ｏ－メチル－ホスホロチオエート残基を含む。一部の実施形態では、化学修飾は、安定性を増強する、自然免疫応答の可能性もしくは程度を低減させる、および／または当技術分野に記載されている他の特質を増強する。
一部の実施形態では、修飾されたｇＲＮＡは、修飾された骨格、例えば、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、モルホリノ、メチルホスホネート、短鎖アルキルもしくはシクロアルキル糖間連結または短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式糖間連結を含み得る。
モルホリノに基づく化合物はBraasch and David Corey, Biochemistry, 2002, 41 (14): 4503-4510；Genesis, 2001, Volume 30, Issue 3；Heasman, Dev. Biol., 2002, 243: 209-214；Nasevicius et al., Nat. Genet., 2000, 26: 216-220；Lacerra et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 2000, 97: 9591-9596．；および１９９１年７月２３日に発行された米国特許第５，０３４，５０６号に記載されている。
シクロヘキセニル核酸オリゴヌクレオチド模倣体はWang et al., J. Am. Chem. Soc., 2000, 122: 8595-8602に記載されている。
一部の実施形態では、修飾されたｇＲＮＡは、２’位に１つまたは複数の置換された糖部分、例えば、以下のうちの１つを含み得る：ＯＨ、ＳＨ、ＳＣＨ３、Ｆ、ＯＣＮ、ＯＣＨ３、ＯＣＨ３ Ｏ（ＣＨ２）ｎ ＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎ ＮＨ２、またはＯ（ＣＨ２）ｎ ＣＨ３、ここで、ｎは１から約１０である；Ｃ１～Ｃ１０低級アルキル、アルコキシアルコキシ、置換された低級アルキル、アルカリルまたはアラルキル；Ｃｌ；Ｂｒ；ＣＮ；ＣＦ３；ＯＣＦ３；Ｏ－、Ｓ－、またはＮ－アルキル；Ｏ－、Ｓ－、またはＮ－アルケニル；ＳＯＣＨ３；ＳＯ２ ＣＨ３；ＯＮＯ２；ＮＯ２；Ｎ３；ＮＨ２；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリル；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換シリル；ＲＮＡ切断基；レポーター基；インターカレーター；２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）；２’－メトキシ（２’－Ｏ－ＣＨ３）；２’－プロポキシ（２’－ＯＣＨ２ ＣＨ２ＣＨ３）；および２’－フルオロ（２’－Ｆ）。同様の修飾がｇＲＮＡの他の位置、特に３’末端ヌクレオチドの糖の３’位および５’末端ヌクレオチドの５’位にもなされていてよい。一部の例では、糖およびヌクレオシド間連結、すなわち、ヌクレオチド単位の骨格の両方を新規の基で置き換えることができる。
ガイドＲＮＡは、それに加えて、またはその代わりに、核酸塩基（多くの場合、当技術分野では単に「塩基」と称される）修飾または置換も含み得る。本明細書で使用される場合、「修飾されていない」または「天然の」核酸塩基には、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）が含まれる。修飾された核酸塩基には、天然の核酸においてまれにまたは一過性にしか見いだされない核酸塩基、例えば、ヒポキサンチン、６－メチルアデニン、５－Ｍｅピリミジン、特に５－メチルシトシン（５－メチル－２’デオキシシトシンとも称され、多くの場合、当技術分野では５－Ｍｅ－Ｃと称される）、５－ヒドロキシメチルシトシン（ＨＭＣ）、グリコシルＨＭＣおよびゲントビオシルＨＭＣ、ならびに合成の核酸塩基、例えば、２－アミノアデニン、２－（メチルアミノ）アデニン、２－（イミダゾリルアルキル）アデニン、２－（アミノアルキルアミノ）アデニンまたは他のヘテロ置換アルキルアデニン、２－チオウラシル、２－チオチミン、５－ブロモウラシル、５－ヒドロキシメチルウラシル、８－アザグアニン、７－デアザグアニン、Ｎ６（６－アミノヘキシル）アデニン、および２，６－ジアミノプリンが含まれる。Kornberg, A., DNA Replication, W. H. Freeman & Co., San Francisco、pp. 75-77, 1980；Gebeyehu et al., Nucl. Acids Res. 1997, 15: 4513。当技術分野で公知の「普遍的な」塩基、例えばイノシンも含めることができる。５－Ｍｅ－Ｃ置換は、核酸二重鎖の安定性を０．６～１．２℃増大させることが示されており（Sanghvi, Y. S., in Crooke, S. T. and Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278）、塩基置換の態様である。
修飾された核酸塩基は、他の合成および天然の核酸塩基、例えば、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６－メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２－プロピルおよび他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミンおよび２－チオシトシン、５－ハロウラシルおよびシトシン、５－プロピニルウラシルおよびシトシン、６－アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシルおよび他の８－置換アデニンおよびグアニン、５－ハロ、特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチルおよび他の５－置換ウラシルおよびシトシン、７－メチルグアニンおよび７－メチルアデニン、８－アザグアニンおよび８－アザアデニン、７－デアザグアニンおよび７－デアザアデニン、ならびに３－デアザグアニンおよび３－デアザアデニンなどを含み得る。
ゲノム標的化核酸とエンドヌクレアーゼの複合体
ｇＲＮＡは、エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９などのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ）と相互作用し、それにより、複合体を形成する。ｇＲＮＡは、エンドヌクレアーゼを標的ポリヌクレオチドにガイドする。
エンドヌクレアーゼとｇＲＮＡをそれぞれ別々に細胞または対象に投与することができる。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼを、１つもしくは複数のガイドＲＮＡと、またはｔｒａｃｒＲＮＡと一緒に１つもしくは複数のｃｒＲＮＡと、予め複合体を形成することができる。次いで、予め複合体を形成した材料を細胞または対象に投与することができる。そのような予め複合体を形成した材料は、リボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）として公知である。ＲＮＰ内のエンドヌクレアーゼは、例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼであり得る。エンドヌクレアーゼのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端とＣ末端の両方に１つまたは複数の核局在化シグナル（ＮＬＳ）が隣接し得る。例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼには２つのＮＬＳが隣接し、１つのＮＬＳはＮ末端に位置し、第２のＮＬＳはＣ末端に位置し得る。ＮＬＳは、ＳＶ４０ ＮＬＳなどの当技術分野で公知の任意のＮＬＳであり得る。ＲＮＰ内のゲノム標的化核酸のエンドヌクレアーゼに対するモル比は、約１：１から約１０：１の範囲にあり得る。例えば、ＲＮＰ内のｓｇＲＮＡのＣａｓ９エンドヌクレアーゼに対するモル比は３：１であり得る。
系の構成成分をコードする核酸
本開示は、本開示のゲノム標的化核酸、本開示のエンドヌクレアーゼ、および／または本開示の方法の態様を実施するために必要な任意の核酸もしくはタンパク質性分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。コード核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはこれらの組合せであり得る。
本開示のゲノム標的化核酸、本開示のエンドヌクレアーゼ、および／または本開示の方法の態様を実施するために必要な任意の核酸もしくはタンパク質性分子をコードする核酸は、ベクター（例えば、組換え発現ベクター）を含み得る。
「ベクター」という用語は、それが連結している別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指す。ベクターの１つの型は「プラスミド」であり、これは、追加的な核酸セグメントをライゲーションすることができる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。ベクターの別の型はウイルスベクターであり、この場合、追加的な核酸セグメントをウイルスゲノム内にライゲーションすることができる。ある特定のベクターは、それが導入された宿主細胞において自律複製することが可能である（例えば、細菌複製開始点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞に導入されると宿主細胞のゲノム内に組み込まれ、それにより、宿主ゲノムと一緒に複製される。
一部の例では、ベクターは、それが作動可能に（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ）連結した核酸の発現を方向づけることが可能であり得る。そのようなベクターは、本明細書では「組換え発現ベクター」、またはもっと簡単に「発現ベクター」と称され、これらは同等の機能を果たす。
「作動可能に連結」という用語は、目的のヌクレオチド配列が、調節配列（複数可）と、ヌクレオチド配列の発現が可能になるように連結していることを意味する。「調節配列」という用語は、例えば、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。そのような調節配列は当技術分野で周知であり、例えば、Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, 1990, 185, Academic Press, San Diego, CAに記載されている。調節配列としては、多くの型の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を方向づけるもの、およびある特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を方向づけるもの（例えば、組織特異的調節配列）が挙げられる。発現ベクターの設計は、例えば、標的細胞の選択、所望の発現レベルなどの因子に依存し得ることが当業者には理解されよう。
企図されている発現ベクターとしては、これだけに限定されないが、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＳＶ４０、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、レトロウイルスに基づくウイルスベクター（例えば、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ならびにラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳癌ウイルス（ｍａｍｍａｒｙ ｔｕｍｏｒ ｖｉｒｕｓ）などのレトロウイルスに由来するベクター）および他の組換えベクターが挙げられる。真核生物標的細胞に関して企図されている他のベクターとしては、これだけに限定されないが、ベクターｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が挙げられる。他のベクターも、宿主細胞と適合する限りは使用することができる。
一部の例では、ベクターは、１つまたは複数の転写および／または翻訳制御エレメントを含み得る。利用する宿主／ベクター系に応じて、構成的プロモーターおよび誘導性プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含めたいくつかの適切な転写および翻訳制御エレメントのいずれかを発現ベクターに使用することができる。ベクターは、ウイルス配列またはＣＲＩＳＰＲ機構の構成成分または他のエレメントのいずれかを不活化する自己不活化型ベクターであり得る。
適切な真核生物プロモーター（すなわち、真核細胞において機能的なプロモーター）の非限定的な例としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来の長い末端反復（ＬＴＲ）、ヒト延長因子－１αプロモーター（ＥＦ１α）、ニワトリベータアクチンプロモーター（ＣＢＡ）、ユビキチンＣプロモーター（ＵＢＣ）、ニワトリベータアクチンプロモーターと融合したサイトメガロウイルスエンハンサーを含むハイブリッド構築物、ニワトリベータアクチン遺伝子（ＣＡＧまたはＣＡＧＧＳ）のプロモーター、第１のエクソン、および第１のイントロンと融合したサイトメガロウイルスエンハンサーを含むハイブリッド構築物、マウス幹細胞ウイルスプロモーター（ＭＳＣＶ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１遺伝子座プロモーター（ＰＧＫ）、およびマウスメタロチオネイン－Ｉプロモーターに由来するものが挙げられる。
プロモーターは、誘導性プロモーター（例えば、熱ショックプロモーター、テトラサイクリン調節型プロモーター、ステロイド調節型プロモーター、金属調節型プロモーター、エストロゲン受容体調節型プロモーターなど）であり得る。プロモーターは、構成的プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター、ＵＢＣプロモーター、ＣＡＧまたはＣＡＧＧＳプロモーター）であり得る。一部の場合では、プロモーターは、空間的に制限された、および／または時間的に制限されたプロモーター（例えば、組織特異的プロモーター、細胞型特異的なプロモーターなど）であり得る。
本開示の複合体、ポリペプチド、および核酸の細胞への導入は、ウイルスまたはバクテリオファージ感染、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、電気穿孔、ヌクレオフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介性トランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性トランスフェクション、リポソーム媒介性トランスフェクション、パーティクルガン技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション、ナノ粒子媒介性核酸送達などによって行うことができる。
ＩＶ．細胞型
本明細書に記載の細胞、例えば、ユニバーサルドナー細胞（および対応する改変されていない細胞）は、任意の可能性のあるクラスの細胞型に属し得る。一部の実施形態では、細胞、例えばユニバーサルドナー細胞（および対応する改変されていない細胞）は、哺乳動物細胞であり得る。一部の実施形態では、細胞、例えばユニバーサルドナー細胞（および対応する改変されていない細胞）は、ヒト細胞であり得る。一部の実施形態では、細胞、例えばユニバーサルドナー細胞（および対応する改変されていない細胞）は、幹細胞であり得る。一部の実施形態では、細胞、例えばユニバーサルドナー細胞（および対応する改変されていない細胞）は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）であり得る。一部の実施形態では、細胞、例えばユニバーサルドナー細胞（および対応する改変されていない細胞）は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、成体幹細胞（ＡＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、または造血幹細胞もしくは前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）（ＨＳＰＣ）（造血幹細胞（ＨＳＣ）とも称される）であり得る。一部の実施形態では、細胞、例えばユニバーサルドナー細胞（および対応する改変されていない細胞）は、分化した細胞であり得る。一部の実施形態では、細胞、例えばユニバーサルドナー細胞（および対応する改変されていない細胞）は、体細胞、例えば、免疫系細胞、膵臓細胞、または収縮性細胞、例えば骨格筋細胞であり得る。
本明細書に記載の細胞、例えばユニバーサルドナー幹細胞を、ＨＬＡ発現を評定する、ならびにユニバーサル幹細胞株の免疫原性の評価のために、関連性のある細胞型に分化させることができる。一般に、分化は、目的の細胞を、細胞を目的の分化した細胞に分化させるために十分な期間および条件下で維持することを含む。例えば、本明細書に開示されるユニバーサル幹細胞を、間葉系前駆細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）（ＭＰＣ）、低免疫原性心筋細胞、筋肉前駆細胞、芽細胞、内皮細胞（ＥＣ）、マクロファージ、肝細胞、ベータ細胞（例えば、膵ベータ細胞）、膵臓内胚葉前駆体、膵臓内分泌前駆体、膵内分泌細胞、造血前駆細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）、または神経前駆細胞（ｎｅｕｒａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）（ＮＰＣ）に分化させることができる。一部の実施形態では、ユニバーサルドナー細胞を、胚体内胚葉細胞、未分化腸管細胞、後方前腸細胞、膵臓内胚葉細胞（ＰＥＣ）、膵内分泌細胞、未成熟ベータ細胞、または成熟ベータ細胞（ｍａｔｕｒｉｎｇ ｂｅｔａ ｃｅｌｌ）に分化させることができる。
幹細胞は、増殖すること、およびより多くの前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）を生じさせることの両方が可能であり、そして今度は前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）が多数の母細胞を生成する能力を有し、今度は母細胞が分化したまたは分化可能な娘細胞を生じさせることができる。娘細胞自体は、増殖し、続いて１つまたは複数の成熟細胞型に分化する後代を産生するように誘導され得るが、親の発生潜在性を有する１つまたは複数の細胞も保持される。したがって、「幹細胞」という用語は、特定の状況下で、より特殊化されたまたは分化した表現型に分化する能力または潜在性を有し、かつ、ある特定の状況下で、実質的な分化を伴わずに増殖する能力を保持する細胞を指す。一態様では、前駆体または幹細胞という用語は、一般化された母細胞を指し、その後裔（後代）が、分化によって、例えば、胚細胞および組織の進行性の多様化において起こるのと同様に、完全に個別の特徴を獲得することによって、多くの場合異なる方向に特殊化される。細胞分化は、一般には多くの細胞分裂を通じて起こる複雑なプロセスである。例えば、分化した細胞は、それ自体が多分化能細胞から引き出された多分化能細胞から引き出される。これらの多分化能細胞のそれぞれを幹細胞とみなすことができるが、それぞれ生じ得る細胞型の範囲は大幅に変動し得る。一部の分化した細胞は、より大きな発生潜在性を有する細胞を生じさせる能力も有する。そのような能力は、天然であり得る、または様々な因子を用いた処理で人工的に誘導され得る。
例えば、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を、特定の増殖因子および小分子の添加を必要とする７段階のプロセスによってインスリン産生細胞に人工的に分化させることができる。これらの７段階には、１）胚体内胚葉、２）未分化腸管、３）後方前腸、４）膵臓内胚葉、５）膵臓内胚葉前駆体（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）、６）未成熟ベータ細胞、および７）成熟ベータ細胞（ｍａｔｕｒｉｎｇ ｂｅｔａ ｃｅｌｌ）が含まれる。例えば、ヒト多能性幹細胞を、Schulz et al. (2012) PLoS ONE 7 (5): e37004、Rezania et al. (2014) Nat. Biotechnol. 32 (11): 1121-1133、および／またはＵＳ２０２００２０８１１６に記載されている通り、膵臓系列に分化させることができる。多くの生物学的な例において、幹細胞は、１つよりも多くの別個の細胞型の後代を産生することができるので、「多分化能」でもあり得るが、これは「幹細胞性」には必要ない。
「分化した細胞」は、それが比較されている細胞よりも発生経路をさらに下に進んだ細胞である。したがって、幹細胞は系列が制限された前駆細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ）（例えば、筋前駆細胞（ｍｙｏｃｙｔｅ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ））に分化し得、それが今度は経路をさらに下った他の型の前駆細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ）（例えば、筋細胞前駆体（ｍｙｏｃｙｔｅ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ））、次いで、最終段階の分化した細胞、例えば、筋細胞に分化し得、それは、ある特定の組織型において特徴的な役割を果たし、さらに増殖する能力を保持する場合もあり、保持しない場合もある。一部の実施形態では、分化した細胞は膵ベータ細胞であり得る。
胚性幹細胞
本明細書に記載の細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）であり得る。ＥＳＣは、哺乳動物胚の未分化胚芽細胞に由来し、任意の細胞型に分化させ、急速に増やすことができる。ＥＳＣはまた、正常な核型を有し、高いテロメラーゼ活性を維持し、注目すべき長期間にわたる増殖潜在性を示すと考えられており、したがって、これらの細胞がユニバーサルドナー細胞として使用するための優れた候補になる。
成体幹細胞
本明細書に記載の細胞は、成体幹細胞（ＡＳＣ）であり得る。ＡＳＣは、哺乳動物、例えばヒトにおいて見いだすことができる未分化細胞である。ＡＳＣは、それらの自己再生する能力、例えば、数ラウンドの細胞複製を経ながら、それらの未分化の状態を維持する能力、および、いくつかの別個の細胞型、例えば、グリア細胞に分化する能力によって定義される。成体幹細胞は、広範にわたるクラスの幹細胞であり、造血幹細胞、乳房幹細胞、腸幹細胞、間葉系幹細胞、内皮幹細胞、神経幹細胞、嗅覚成体幹細胞、神経堤幹細胞、および精巣細胞を包含し得る。
人工多能性幹細胞
本明細書に記載の細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であり得る。ｉＰＳＣは、成体ヒト細胞から直接、多能性に関与する極めて重要な転写因子をコードする遺伝子、例えば、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃＭＹＣ、およびＫＬＦ４を導入することによって生成することができる。ｉＰＳＣは、その後前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）を投与される対象と同じ対象に由来してもよい。すなわち、体細胞を対象から得、人工多能性幹細胞に再プログラムし、次いで、対象に投与される前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）に再分化させることができる（例えば、自己細胞）。しかし、自己細胞の場合では、生着後の免疫応答および低生存率のリスクが残る。一部の実施形態では、ｉＰＳＣを商業的な供給源から得ることができる。一部の実施形態では、ｉＰＳＣを系列が制限された前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）または完全に分化した体細胞への分化の前に遺伝子編集する。
ヒト造血幹細胞・前駆細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ａｎｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）
本明細書に記載の細胞は、ヒト造血幹細胞・前駆細胞（ｈＨＳＰＣ）であり得る。この幹細胞系列から、赤血球系（赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）または赤血球（ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）（ＲＢＣ））、骨髄系（単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、巨核球／血小板、および樹状細胞）、ならびにリンパ系（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）を含めた全ての血液細胞型が生じる。血液細胞は、自己再生によってそれ自体で補充する能力も有する多能性造血幹細胞（ＨＳＣ）の非常に小さな集団の増殖および分化によって産生される。分化の間、ＨＳＣの後代は、種々の中間の成熟段階を進み、多潜在性かつ系列委任前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）を生成した後、成熟に達する。骨髄（ＢＭ）はヒトにおける造血の主要部位であり、正常な状態下では少数の造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）のみが末梢血（ＰＢ）中に見いだされ得る。サイトカイン、がん処置に使用される一部の骨髄抑制性薬物、および造血細胞とＢＭ間質細胞の相互作用を破壊する化合物を用いた処置により、多数の幹および前駆体が循環中に急速に動員され得る。
細胞の他の細胞型への分化
本開示の方法の別のステップは、細胞を分化した細胞に分化させることを含み得る。分化させるステップは、当技術分野で公知の任意の方法に従って実施することができる。例えば、ヒトｉＰＳＣを、アクチビンおよびＢ２７補充（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含めた種々の処理を使用して胚体内胚葉に分化させる。胚体内胚葉を肝細胞にさらに分化させ、処理としては、ＦＧＦ４、ＨＧＦ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、オンコスタチンＭ、デキサメタゾンなどが挙げられる（Duan et al, Stem Cells, 2010; 28: 674-686；Ma et al, Stem Cells Translational Medicine, 2013; 2: 409-419）。別の実施形態では、分化させるステップを、Sawitza et al, Sci Rep. 2015; 5: 13320に従って実施することができる。分化した細胞は、哺乳動物、例えばヒトの任意の体細胞であり得る。一部の実施形態では、体細胞は、外分泌性上皮細胞（例えば、唾液腺粘液細胞、前立腺細胞）、ホルモン分泌細胞（例えば、下垂体前葉細胞、消化管細胞、膵島）、角化上皮細胞（例えば、表皮ケラチノサイト）、湿潤部重層バリア上皮細胞、知覚変換細胞（例えば、光受容体）、自律神経系ニューロン細胞、感覚器および末梢ニューロン支持細胞（例えば、シュワン細胞）、中枢神経系ニューロン、グリア細胞（例えば、アストロサイト、オリゴデンドロサイト）、水晶体細胞、脂肪細胞、腎臓細胞、バリア機能細胞（例えば、導管細胞）、細胞外マトリックス細胞、収縮性細胞（例えば、骨格筋細胞、心筋細胞、平滑筋細胞）、血液細胞（例えば、赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ））、免疫系細胞（例えば、巨核球、ミクログリア細胞、好中球、肥満細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞）、生殖細胞（例えば、精細胞）、ナース細胞、または間質細胞であり得る。
一般に、本明細書に開示されるユニバーサルドナー細胞の集団は、挿入された１つまたは複数のヌクレオチド配列の発現を経時的に維持する。例えば、ユニバーサルドナー細胞の少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％が、挿入された１つまたは複数の免疫寛容原性因子および／または生存因子を発現する。さらに、本明細書に開示されるユニバーサルドナー細胞に由来する系列が制限されたまたは完全に分化した細胞の集団は、挿入された１つまたは複数のヌクレオチド配列の発現を経時的に維持する。例えば、系列が制限されたまたは完全に分化した細胞の少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％が、１つまたは複数の免疫寛容原性因子および／または生存因子を発現する。
Ｖ．製剤化および投与
遺伝子編集のための製剤化および送達
本明細書に記載のガイドＲＮＡ、ポリヌクレオチド、例えば、免疫寛容原性因子および／もしくは生存因子をコードするポリヌクレオチド、またはエンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、ならびにエンドヌクレアーゼを当技術分野で公知の任意の様式で製剤化し、細胞に送達することができる。
ガイドＲＮＡおよび／またはポリヌクレオチドを、特定の投与形式および剤形に応じて、例えば、担体、溶媒、安定剤、補助剤、希釈剤などの薬学的に許容される賦形剤と共に製剤化することができる。ガイドＲＮＡおよび／またはポリヌクレオチド組成物を、製剤および投与経路に応じて、生理的に適合し、ｐＨ約３からｐＨ約１１まで、ｐＨ約３からｐＨ約７までの範囲のｐＨが実現されるように製剤化することができる。一部の場合では、ｐＨを、ｐＨ約５．０からｐＨ約８までの範囲に調整することができる。一部の場合では、組成物は、治療有効量の少なくとも１つの本明細書に記載の化合物を、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤と一緒に含み得る。必要に応じて、組成物は、本明細書に記載の化合物の組合せを含み得る、または、細菌成長の処置または防止に有用な第２の活性成分（例えば、これだけに限定することなく、抗細菌剤または抗微生物剤）を含み得る、または本開示の試薬の組合せを含み得る。
適切な賦形剤としては、例えば、大きな、緩徐に代謝される巨大分子、例えば、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸共重合体、および不活性ウイルス粒子を含む担体分子が挙げられる。他の例示的な賦形剤としては、抗酸化剤（例えばおよびこれだけに限定することなく、アスコルビン酸）、キレート剤（例えばおよびこれだけに限定することなく、ＥＤＴＡ）、炭水化物（例えばおよびこれだけに限定することなく、デキストリン、ヒドロキシアルキルセルロース、およびヒドロキシアルキルメチルセルロース）、ステアリン酸、液体（例えばおよびこれだけに限定することなく、油、水、生理食塩水、グリセロールおよびエタノール）、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などが挙げられ得る。
ガイドＲＮＡポリヌクレオチド（ＲＮＡもしくはＤＮＡ）および／またはエンドヌクレアーゼポリヌクレオチド（複数可）（ＲＮＡもしくはＤＮＡ）を、当技術分野で公知のウイルスまたは非ウイルス送達ビヒクルによって送達することができる。あるいは、エンドヌクレアーゼポリペプチド（複数可）を当技術分野で公知のウイルスまたは非ウイルス送達ビヒクル、例えば、電気穿孔または脂質ナノ粒子によって送達することができる。さらなる代替の態様では、ＤＮＡエンドヌクレアーゼを１つまたは複数のポリペプチドとして、単独で、あるいは、１つもしくは複数のガイドＲＮＡ、またはｔｒａｃｒＲＮＡと一緒に１つもしくは複数のｃｒＲＮＡと予め複合体を形成させて、送達することができる。
ポリヌクレオチドを、これだけに限定されないが、ナノ粒子、リポソーム、リボ核タンパク質、正に荷電したペプチド、小分子ＲＮＡ－コンジュゲート、アプタマー－ＲＮＡキメラ、およびＲＮＡ－融合タンパク質複合体を含めた非ウイルス送達ビヒクルによって送達することができる。いくつかの例示的な非ウイルス送達ビヒクルがPeer and Lieberman, Gene Therapy, 2011, 18: 1127-1133に記載されている（これは、他のポリヌクレオチドの送達にも有用であるｓｉＲＮＡのための非ウイルス送達ビヒクルに焦点を当てている）。
本開示のポリヌクレオチドに関しては、製剤を、例えば、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６９６１０号において教示されているもののいずれかから選択することができる。
ガイドＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、およびエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどのポリヌクレオチドを脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）によって細胞または対象に送達することができる。
ＬＮＰは、１０００ｎｍ未満、５００ｎｍ未満、２５０ｎｍ未満、２００ｎｍ未満、１５０ｎｍ未満、１００ｎｍ未満、７５ｎｍ未満、５０ｎｍ未満、または２５ｎｍ未満の直径を有する任意の粒子を指す。あるいは、ナノ粒子は、１～１０００ｎｍ、１～５００ｎｍ、１～２５０ｎｍ、２５～２００ｎｍ、２５～１００ｎｍ、３５～７５ｎｍ、または２５～６０ｎｍの範囲のサイズである。
ＬＮＰは、カチオン性、アニオン性、または中性脂質で作られてもよい。融合性リン脂質ＤＯＰＥまたは膜構成成分コレステロールなどの中性脂質を、トランスフェクション活性およびナノ粒子安定性を増強するための「ヘルパー脂質」としてＬＮＰに含めることができる。カチオン性脂質の欠点としては、安定性が乏しく、迅速にクリアランスされることが原因で有効性が低いこと、ならびに炎症性または抗炎症性応答が生じることが挙げられる。
ＬＮＰはまた、疎水性脂質、親水性脂質、または疎水性脂質と親水性脂質の両方で構成されてもよい。
当技術分野で公知の任意の脂質または脂質の組合せをＬＮＰの作製に使用することができる。ＬＮＰを作製するために使用される脂質の例は、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＭＲＩＥ、ＤＣ－コレステロール、ＤＯＴＡＰ－コレステロール、ＧＡＰ－ＤＭＯＲＩＥ－ＤＰｙＰＥ、およびＧＬ６７Ａ－ＤＯＰＥ－ＤＭＰＥ－ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。カチオン性脂質の例は、９８Ｎ１２－５、Ｃ１２－２００、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ（ＫＣ２）、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）、ＸＴＣ、ＭＤ１、および７Ｃ１である。中性脂質の例は、ＤＰＳＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、およびＳＭである。ＰＥＧ修飾された脂質の例は、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＣｅｒＣ１４、およびＰＥＧ－ＣｅｒＣ２０である。
脂質を任意の数のモル比で組み合わせてＬＮＰを作製することができる。さらに、ポリヌクレオチド（複数可）を脂質（複数可）と広範囲のモル比で組み合わせてＬＮＰを作製することができる。
組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを送達のために使用することができる。送達されるポリヌクレオチド、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能を含む、パッケージングされるＡＡＶゲノムが細胞に供給される、ｒＡＡＶ粒子を作製するための技法が当技術分野において標準である。ｒＡＡＶの産生には、一般には、以下の構成成分が単一細胞（本明細書ではパッケージング細胞として示される）内に存在することが必要である：ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムとは分離された（すなわち、ｒＡＡＶゲノム内には存在しない）ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能。ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は、組換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型に由来してもよく、これだけに限定されないが、本明細書に記載のＡＡＶ血清型を含めた、ｒＡＡＶゲノム ＩＴＲとは異なるＡＡＶ血清型に由来してもよい。シュードタイピングされたｒＡＡＶの作製は、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ０１／８３６９２号に開示されている。
細胞、例えばユニバーサルドナー細胞の製剤化および投与
本明細書に記載の遺伝子改変された細胞、例えばユニバーサルドナー細胞を当技術分野で公知の任意の様式によって製剤化し、対象に投与することができる。
「投与すること（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）」、「導入すること（ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ）」、「埋め込むこと（ｉｍｐｌａｎｔｉｎｇ）」、「生着させること（ｅｎｇｒａｆｔｉｎｇ）」および「移植すること（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｉｎｇ）」という用語は、細胞、例えば前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）を、対象内に、導入された細胞の所望の部位における少なくとも部分的な局在をもたらす方法または経路によって入れることに関して互換的に使用される。細胞、例えば、前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）、またはそれらの分化した後代を、埋め込まれた細胞または細胞の構成成分の少なくとも一部分が生存可能なままになる対象内の所望の位置への送達をもたらす任意の適当な経路によって投与することができる。対象への投与後に細胞が生存可能な期間は、数時間、例えば、２４時間という短さから、数日間まで、数年間という長さまで、またはさらには、対象の生涯、すなわち、長期間にわたる生着であり得る。
本明細書に記載の遺伝子改変された細胞、例えばユニバーサルドナー細胞は、対象への投与後に、改変されていない細胞よりも長い期間生存可能であり得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載の細胞を含む組成物を、適切な経路によって投与することができ、適切な経路には、静脈内投与、例えば、ボーラスとしてまたはある期間にわたる連続的な注入によるものが含まれ得る。一部の実施形態では、静脈内投与を、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液嚢内、またはくも膜下腔内経路によって実施することができる。一部の実施形態では、組成物は、固体形態、水性形態、または液体形態であり得る。一部の実施形態では、水性または液体形態は、霧状にまたは凍結乾燥され得る。一部の実施形態では、霧状にされたまたは凍結乾燥された形態を、水溶液または液体溶液を用いて再構成することができる。
乳化手順が細胞生存率に悪影響を及ぼさないという条件で、細胞組成物を乳化させるまたはリポソーム組成物として提示することもできる。細胞および任意の他の活性成分を、薬学的に許容され、活性成分と適合する、本明細書に記載の治療方法における使用に適した量の賦形剤と混合することができる。
細胞組成物に含める追加的な作用剤として、細胞組成物中の構成成分の薬学的に許容される塩が挙げられ得る。薬学的に許容される塩としては、無機酸、例えば、塩酸もしくはリン酸など、または有機酸、例えば、酢酸、酒石酸、マンデル酸などと形成される酸付加塩（ポリペプチドの遊離のアミノ基と形成される）が挙げられる。遊離のカルボキシル基と形成される塩も、無機塩基、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムもしくは水酸化第二鉄など、および有機塩基、例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２－エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来し得る。
生理的に許容される担体は当技術分野で周知である。例示的な液体担体は、活性成分および水に加えて材料を含有しない、または生理的ｐＨ値のリン酸ナトリウムなどの緩衝剤、生理学的食塩水もしくはその両方、例えばリン酸緩衝食塩水を含有する、滅菌水溶液である。さらに、水性担体は、１つよりも多くの緩衝塩、ならびに塩化ナトリウムおよび塩化カリウムなどの塩、ブドウ糖、ポリエチレングリコールおよび他の溶質を含有し得る。液体組成物はまた、水に加えて、および水を除いて、液相を含有し得る。例示的なそのような追加的な液相は、グリセリン、綿実油などの植物油、および水－油エマルションである。特定の障害または状態の処置に有効な、細胞組成物に使用される活性化合物の量は、障害または状態の性質に依存し得、標準の臨床的技法によって決定することができる。
一部の実施形態では、細胞を含む組成物を、疾患または障害を有する、それを有する疑いがある、またはそのリスクがある対象、例えば、ヒト対象に投与することができる。一部の実施形態では、組成物を、疾患または障害を有さない、それを有する疑いがない、またはそのリスクがない対象に投与することができる。一部の実施形態では、対象は、健康なヒトである。一部の実施形態では、対象、例えばヒト対象は、遺伝性疾患または障害を有する、それを有する疑いがある、またはそのリスクがある。一部の実施形態では、対象は、疾患または障害を示す症状に罹患しているまたはそれが発症するリスクがある。一部の実施形態では、疾患は、糖尿病、例えば、Ｉ型糖尿病またはＩＩ型糖尿病である。一部の実施形態では、障害は、膵切除である。
ＶＩ．本開示の特定の組成物および方法
したがって、本開示は、具体的には、以下の非限定的な組成物および方法に関する。
第１の組成物、組成物１では、本開示は、（ａ）破壊されたＢ２Ｍ遺伝子、および破壊されたＢ２Ｍ遺伝子への中脳アストロサイト由来神経栄養因子（ＭＡＮＦ）をコードする第１のポリヌクレオチドの第１の挿入；（ｂ）破壊されたＴＸＮＩＰ遺伝子、および破壊されたＴＸＮＩＰ遺伝子への腫瘍壊死因子アルファ誘導タンパク質３（ＴＮＦＡＩＰ３）をコードする第２のポリヌクレオチドの第２の挿入を含む遺伝子改変された細胞を含む組成物であって、細胞が、ＭＡＮＦおよびＴＮＦＡＩＰ３を発現し、Ｂ２ＭおよびＴＸＮＩＰの発現の破壊を有する、組成物を提供する。
別の組成物、組成物２では、本開示は、第１の挿入が、ＨＬＡクラスＩ組織適合性抗原、アルファ鎖Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）をコードする第３のポリヌクレオチドをさらに含む、組成物１による組成物を提供する。
別の組成物、組成物３では、本開示は、ＨＬＡ－Ｅをコードするヌクレオチド配列が、ＨＬＡ－Ｅ三量体をコードする配列を含み、ＨＬＡ－Ｅ三量体が、シグナルペプチドを有さないＨＬＡ－Ｅと融合したＢ２Ｍ膜タンパク質、それと融合したＨＬＡ－Ｇ提示ペプチド、それと融合したＢ２Ｍシグナルペプチドを含む、組成物１または２による組成物を提供する。
別の組成物、組成物４では、本開示は、ＭＡＮＦをコードする第１のポリヌクレオチドが、ＨＬＡ－Ｅをコードする第３のポリヌクレオチドと、Ｐ２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチドによって連結しており、したがって、第１の挿入が、ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＨＬＡ－Ｅ構築物を含む、組成物１から３までのいずれか１つによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物５では、本開示は、ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＨＬＡ－Ｅ構築物が、配列番号５５から本質的になるポリヌクレオチド配列を含む、組成物４による組成物を提供する。
別の組成物、組成物６では、本開示は、ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＨＬＡ－Ｅ構築物が、外因性プロモーターに作動可能に連結している、組成物４または５による組成物を提供する。
別の組成物、組成物７では、本開示は、第２の挿入が、プログラム死－リガンド１（ＰＤ－Ｌ－１）をコードする第４のポリヌクレオチドをさらに含む、組成物１から６までのいずれか１つによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物８では、本開示は、ＴＮＦＡＩＰ３をコードする第２のヌクレオチド配列が、ＰＤ－Ｌ－１をコードする第４のヌクレオチド配列と、Ｐ２Ａペプチドをコードするヌクレオチド配列によって連結しており、したがって、第２の挿入が、ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１構築物を含む、組成物１から７までのいずれか１つによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物９では、本開示は、ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１構築物が、配列番号５４から本質的になるヌクレオチド配列を含む、組成物８による組成物を提供する。
別の組成物、組成物１０では、本開示は、ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１構築物が、外因性プロモーターに作動可能に連結している、組成物８または９による組成物を提供する。
別の組成物、組成物１１では、本開示は、Ｂ２ＭおよびＴＸＮＩＰの発現の破壊が、Ｂ２Ｍおよび／またはＴＸＮＩＰの発現の低減または排除を含む、組成物１から１０までのいずれか１つによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物１２では、本開示は、ユニバーサルドナー細胞が、ポリヌクレオチド挿入および遺伝子破壊がなされていない同等の細胞と比較して、免疫回避および／または移植後生存の増大を有する、組成物１から１１までのいずれか１つによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物１３では、本開示は、細胞が、幹細胞である、組成物１から１２までのいずれか１つによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物１４では、本開示は、幹細胞が、胚性幹細胞、成体幹細胞、人工多能性幹細胞、または造血幹細胞である、組成物１３による組成物を提供する。
別の組成物、組成物１５では、本開示は、細胞が、分化した細胞または体細胞である、組成物１から１２までのいずれか１つによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物１６では、本開示は、細胞が、系列が制限された前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）または完全に分化した体細胞に分化する、組成物１５による組成物を提供する。
別の組成物、組成物１７では、本開示は、系列が制限された前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）が、胚体内胚葉細胞、未分化腸管細胞、後方前腸細胞、膵臓内胚葉前駆体、膵臓内分泌前駆体、または未成熟ベータ細胞であり、完全に分化した体細胞が、ベータ細胞である、組成物１６による組成物を提供する。
別の組成物、組成物１８では、本開示は、組成物１から１７までのいずれか１つによる複数の遺伝子改変された細胞を含む組成物を提供する。
別の組成物、組成物１９では、本開示は、組成物１８の複数の遺伝子改変された細胞に由来する系列が制限された前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）または完全に分化した体細胞の集団を含む組成物を提供する。
別の組成物、組成物２０では、本開示は、集団が、胚体内胚葉細胞、未分化腸管細胞、後方前腸細胞、膵臓内胚葉細胞、膵臓内分泌前駆細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ）、未成熟ベータ細胞、および／または膵ベータ細胞を含む、組成物１９による組成物を提供する。
別の組成物、組成物２１では、本開示は、組成物１８の複数の細胞または組成物１９の細胞の集団、および少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含む組成物を提供する。
第１の方法、方法２２では、本開示は、それを必要とする対象における膵疾患または障害を処置するための方法、方法２２であって、（ａ）請求項１９に記載の系列が制限された前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）または完全に分化した体細胞の集団を得るまたは得ておくステップであって、系列が制限された前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）または完全に分化した体細胞が、膵臓内胚葉細胞、膵臓内分泌前駆細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ）、未成熟ベータ細胞、および／または膵ベータ細胞を含む、ステップ；ならびに（ｂ）膵臓内胚葉細胞、膵内分泌細胞、未成熟ベータ細胞、および／またはベータ細胞を対象に投与するステップを含む、方法を提供する。
別の方法、方法２３では、本開示は、それを必要とする対象における膵疾患または障害を処置するための方法、方法２３であって、（ａ）請求項１８に記載の複数の遺伝子改変された細胞を得るまたは得ておくステップであって、複数の遺伝子改変された細胞が、幹細胞を含む、ステップ；（ｂ）遺伝子改変された細胞を膵臓内胚葉細胞、膵臓内分泌前駆細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ）、未成熟ベータ細胞、および／または膵ベータ細胞に分化させるステップ；ならびに（ｃ）膵臓内胚葉細胞、膵臓内分泌前駆細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ）、未成熟ベータ細胞、および／または膵ベータ細胞を対象に投与するステップを含む、方法を提供する。
別の方法、方法２４では、本開示は、膵疾患または障害が、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病または膵切除である、方法２２または２３において提供される方法を提供する。
別の組成物、組成物２５では、本開示は、（ａ）中脳アストロサイト由来神経栄養因子（ＭＡＮＦ）をコードする第１の外因性ポリヌクレオチド挿入、腫瘍壊死因子アルファ誘導タンパク質３（ＴＮＦＡＩＰ３）をコードする第２の外因性ポリヌクレオチド挿入、分化抗原群３９（ＣＤ３９）をコードする第３の外因性ポリヌクレオチド挿入、および／または分化抗原群７３（ＣＤ７３）をコードする第４の外因性ポリヌクレオチド挿入を含み、ＣＤ３９、ＭＡＮＦ、ＴＮＦＡＩＰ３、および／もしくはＣＤ７３を発現する；かつ／または（ｂ）トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）タンパク質、ベータ２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）タンパク質、チオレドキシン相互作用タンパク質（ＴＸＮＩＰ）タンパク質、および／もしくはクラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）タンパク質をコードする遺伝子の破壊を含み、ＴＧＦβタンパク質、Ｂ２Ｍタンパク質、ＴＸＮＩＰタンパク質、および／もしくはＣＩＩＴＡタンパク質の発現の破壊を有する、遺伝子改変された細胞を含む組成物を提供する。
別の組成物、組成物２６では、本開示は、遺伝子改変された細胞が、ＭＡＮＦをコードする第１の外因性ポリヌクレオチドを含み、ＭＡＮＦを発現する、組成物２５による組成物を提供する。
別の組成物、組成物２７では、本開示は、第１の外因性ポリヌクレオチドが、外因性プロモーターに作動可能に接続している、組成物２５または２６による組成物を提供する。
別の組成物、組成物２８では、本開示は、第１の外因性ポリヌクレオチドが、配列番号１７から本質的になるヌクレオチド配列を含む、組成物２５から２７までのいずれか１つによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物２９では、本開示は、遺伝子改変された細胞が、ＴＮＦＡＩＰ３をコードする第２の外因性ポリヌクレオチドを含み、ＴＮＦＡＩＰ３を発現する、組成物２５から２８までのいずれか１つによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物３０では、本開示は、第２の外因性ポリヌクレオチドが、外因性プロモーターに作動可能に連結している、組成物２５から２９までのいずれか１つによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物３１では、本開示は、第２の外因性ポリヌクレオチドが、配列番号１９から本質的になるヌクレオチド配列を含む、組成物２５から３０までのいずれか１つによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物３２では、本開示は、遺伝子改変された細胞が、ＣＤ３９をコードする第３の外因性ポリヌクレオチドを含み、ＣＤ３９を発現する、組成物２５から３１までのいずれか１つによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物３３では、本開示は、第３の外因性ポリヌクレオチドが、外因性プロモーターに作動可能に連結している、組成物２５から３２までのいずれか１つによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物３４では、本開示は、第３の外因性ポリヌクレオチドが、配列番号２７から本質的になるヌクレオチド配列を含む、組成物２５から３３までのいずれか１つによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物３５では、本開示は、遺伝子改変された細胞が、ＣＤ７３をコードする第４の外因性ポリヌクレオチドを含み、ＣＤ７３を発現する、組成物２５から３４までのいずれか１つによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物３６では、本開示は、ＣＤ７３をコードする第４の外因性ポリヌクレオチドが、外因性プロモーターに作動可能に連結している、組成物２５から３５までのいずれか１つによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物３７では、本開示は、ＣＤ７３をコードする第４の外因性ポリヌクレオチドが、配列番号４６から本質的になるヌクレオチド配列を含む、組成物２５から３６までのいずれか１つによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物３８では、本開示は、遺伝子改変された細胞が、ＣＤ３９をコードする第３の外因性ポリヌクレオチドおよびＣＤ７３をコードする第４の外因性ポリヌクレオチドを含み、ＣＤ３９およびＣＤ７３を発現し、ＣＤ３９をコードする第３の外因性ポリヌクレオチドが、ＣＤ７３をコードする第４の外因性ポリヌクレオチドと、Ｐ２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチドによって連結しており、したがって、ＣＤ３９をコードする第３の外因性ポリヌクレオチド、Ｐ２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびＣＤ７３をコードする第４の外因性ポリヌクレオチドによりＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＣＤ７３構築物が形成される、組成物２５から３７までのいずれか１つによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物３９では、本開示は、ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＣＤ７３構築物が、外因性プロモーターに作動可能に連結している、組成物３８による組成物を提供する。
別の組成物、組成物４０では、本開示は、ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＣＤ７３構築物が、配列番号５８から本質的になるヌクレオチド配列を含む、組成物３８または３９による組成物を提供する。
別の組成物、組成物４１では、本開示は、ＨＬＡクラスＩ組織適合性抗原、アルファ鎖Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）をコードする第５の外因性ポリヌクレオチドをさらに含み、遺伝子改変された細胞が、ＨＬＡ－Ｅを発現する、組成物２５から４０までのいずれか１つによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物４２では、本開示は、ＨＬＡ－Ｅをコードする第５の外因性ポリヌクレオチドが、ＨＬＡ－Ｅ三量体をコードするポリヌクレオチドを含み、ＨＬＡ－Ｅ三量体が、シグナルペプチドを有さないＨＬＡ－Ｅと融合したＢ２Ｍ膜タンパク質、それと融合したＨＬＡ－Ｇ提示ペプチド、それと融合したＢ２Ｍシグナルペプチドを含む、組成物４１による組成物を提供する。
別の組成物、組成物４３では、本開示は、ＨＬＡ－Ｅをコードする第５の外因性ポリヌクレオチドが、外因性プロモーターに作動可能に連結している、組成物４１または４２による組成物を提供する。
別の組成物、組成物４４では、本開示は、ＨＬＡ－Ｅをコードする第５の外因性ポリヌクレオチドが、配列番号４３から本質的になるヌクレオチド配列を含む、組成物４１から４３までのいずれか１つによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物４５では、本開示は、ＭＡＮＦをコードする第１の外因性ポリヌクレオチドおよびＨＬＡ－Ｅをコードする第５の外因性ポリヌクレオチドを含み、ＭＡＮＦをコードする第１の外因性ポリヌクレオチドが、ＨＬＡ－Ｅをコードする第５の外因性ポリヌクレオチドと、Ｐ２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチドによって連結しており、したがって、第１の外因性ポリヌクレオチド、Ｐ２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチド、および第５の外因性ポリヌクレオチドにより、ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＨＬＡ－Ｅ構築物が形成される、組成物４１から４４までのいずれか１つによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物４６では、本開示は、ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＨＬＡ－Ｅ構築物が、外因性プロモーターに作動可能に連結している、組成物４５による組成物を提供する。
別の組成物、組成物４７では、本開示は、ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＨＬＡ－Ｅ構築物が、配列番号５５から本質的になるポリヌクレオチド配列を含む、組成物４５または４６による組成物を提供する。
別の組成物、組成物４８では、本開示は、プログラム死－リガンド１（ＰＤ－Ｌ－１）をコードする第６の外因性ポリヌクレオチドをさらに含み、遺伝子改変された細胞が、ＰＤ－Ｌ－１を発現する、組成物２５から４７までのいずれか１つによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物４９では、本開示は、ＰＤ－Ｌ－１をコードする第６の外因性ポリヌクレオチドが、外因性プロモーターに作動可能に連結している、組成物４８による組成物を提供する。
別の組成物、組成物５０では、本開示は、第６の外因性ポリヌクレオチドが、配列番号２０から本質的になるヌクレオチド配列を含む、組成物４８または４９による組成物を提供する。
別の組成物、組成物５１では、本開示は、ＴＮＦＡＩＰ３をコードする第２の外因性ポリヌクレオチドおよびＰＤ－Ｌ－１をコードする第６の外因性ポリヌクレオチドを含み、ＴＮＦＡＩＰ３をコードする第２の外因性ポリヌクレオチドが、ＰＤ－Ｌ－１をコードする第６の外因性ポリヌクレオチド配列と、Ｐ２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチドによって連結しており、したがって、第２の外因性ポリヌクレオチド、Ｐ２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチド、および第６の外因性ポリヌクレオチドにより、ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１構築物が形成される、組成物４８から５０までのいずれか１つによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物５２では、本開示は、ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１構築物が、外因性プロモーターに作動可能に連結している、組成物５１による組成物を提供する。
別の組成物、組成物５３では、本開示は、ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１構築物が、配列番号５４から本質的になるヌクレオチド配列を含む、組成物５１または５２による組成物を提供する。
別の組成物、組成物５４では、本開示は、ＣＤ３９をコードする第３の外因性ポリヌクレオチドおよびＰＤ－Ｌ－１をコードする第６の外因性ポリヌクレオチドを含み、ＣＤ３９をコードする第３の外因性ポリヌクレオチドが、ＰＤ－Ｌ－１をコードする第６の外因性ポリヌクレオチドと、Ｐ２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチドによって連結しており、したがって、第３の外因性ポリヌクレオチド、Ｐ２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチド、および第６の外因性ポリヌクレオチドにより、ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１構築物が形成される、組成物４８から５３までのいずれか１つによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物５５では、本開示は、ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１構築物が、外因性プロモーターに作動可能に連結している、組成物５４による組成物を提供する。
別の組成物、組成物５６では、本開示は、ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１構築物が、配列番号５３から本質的になるヌクレオチド配列を含む、組成物５４または５５による組成物を提供する。
別の組成物、組成物５７では、本開示は、ＭＡＮＦをコードする第１の外因性ポリヌクレオチド、ＴＮＦＡＩＰ３をコードする第２の外因性ポリヌクレオチド、およびＰＤ－Ｌ－１をコードする第６の外因性ポリヌクレオチドを含み、第１の外因性ポリヌクレオチドが、第２の外因性ポリヌクレオチドと、Ｐ２Ａペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドによって連結しており、第２の外因性ポリヌクレオチドが、第６の外因性ポリヌクレオチドと、Ｐ２Ａペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドによって連結しており、したがって、ＭＡＮＦをコードする第１の外因性ポリヌクレオチド、Ｐ２Ａペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド、ＴＮＦＡＩＰ３をコードする第２の外因性ポリヌクレオチド、Ｐ２Ａペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド、およびＰＤ－Ｌ－１をコードする第６の外因性ポリヌクレオチドにより、ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１構築物が形成される、組成物４８から５６までのいずれか１つによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物５８では、本開示は、ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１が、外因性プロモーターに作動可能に連結している、組成物５７による組成物を提供する。
別の組成物、組成物５９では、本開示は、ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１構築物が、配列番号５２から本質的になるヌクレオチド配列を含む、組成物５７または５８による組成物を提供する。
別の組成物、組成物６０では、本開示は、ＣＤ３９をコードする第３の外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ７３をコードする第４の外因性ポリヌクレオチド、およびＰＤ－Ｌ－１をコードする第６の外因性ポリヌクレオチドを含み、ＣＤ３９をコードする第３の外因性ポリヌクレオチドが、ＣＤ７３をコードする第４の外因性ポリヌクレオチドと、Ｐ２Ａペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドによって連結しており、第４の外因性ポリヌクレオチドが、第６の外因性ポリヌクレオチドと、Ｐ２Ａペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドによって連結しており、したがって、ＣＤ３９をコードする第３の外因性ポリヌクレオチド、Ｐ２Ａペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド、ＣＤ７３をコードする第４の外因性ポリヌクレオチド、Ｐ２Ａペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドおよびＰＤ－Ｌ－１をコードする第６の外因性ポリヌクレオチドにより、ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＣＤ７３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１構築物が形成される、組成物４８から５９までのいずれか１つによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物６１では、本開示は、ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＣＤ７３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１構築物が、外因性プロモーターに作動可能に連結している、組成物６０による組成物を提供する。
別の組成物、組成物６２では、本開示は、ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＣＤ７３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１構築物が、配列番号５６から本質的になるヌクレオチド配列を含む、組成物６０または６１による組成物を提供する。
別の組成物、組成物６３では、本開示は、遺伝子改変された細胞が、破壊されたＢ２Ｍ遺伝子、破壊されたＴＸＮＩＰ遺伝子、破壊されたＣＩＩＴＡ遺伝子、および／または破壊されたＴＧＦβ遺伝子を含み、細胞が、Ｂ２Ｍタンパク質、ＴＸＮＩＰタンパク質、ＣＩＩＴＡタンパク質および／またはＴＧＦβタンパク質の発現の破壊を有する、組成物２５から６２までのいずれか１つによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物６４では、本開示は、ＭＡＮＦをコードする第１の外因性ポリヌクレオチド、ＴＮＦＡＩＰ３をコードする第２の外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ３９をコードする第３の外因性ポリヌクレオチドおよび／またはＣＤ７３をコードする第４の外因性ポリヌクレオチドが、Ｂ２Ｍ遺伝子、ＴＸＮＩＰ遺伝子、ＣＩＩＴＡ遺伝子、および／またはＴＧＦβ遺伝子の内部またはその近傍にそれぞれ独立に挿入され、それにより、Ｂ２Ｍタンパク質、ＴＸＮＩＰタンパク質、ＣＩＩＴＡタンパク質、および／またはＴＧＦβタンパク質の発現が破壊される、組成物２５から６３までのいずれか１つによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物６５では、本開示は、ＨＬＡクラスＩ組織適合性抗原、アルファ鎖Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）をコードする第５の外因性ポリヌクレオチドをさらに含み、ＨＬＡ－Ｅをコードする第５の外因性ポリヌクレオチドが、Ｂ２Ｍ遺伝子、ＴＸＮＩＰ遺伝子、ＣＩＩＴＡ遺伝子、および／またはＴＧＦβ遺伝子の内部またはその近傍に挿入され、それにより、Ｂ２Ｍタンパク質、ＴＸＮＩＰタンパク質、ＣＩＩＴＡタンパク質、および／またはＴＧＦβタンパク質の発現が破壊され、ユニバーサルドナー細胞が、ＨＬＡ－Ｅをさらに発現する、組成物２５から６４までのいずれか１つによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物６６では、本開示は、プログラム死－リガンド１（ＰＤ－Ｌ－１）をコードする第６の外因性ポリヌクレオチドをさらに含み、ＰＤ－Ｌ－１をコードする第６の外因性ポリヌクレオチドが、Ｂ２Ｍ遺伝子、ＴＸＮＩＰ遺伝子、ＣＩＩＴＡ遺伝子、および／またはＴＧＦβ遺伝子の内部またはその近傍に挿入され、それにより、Ｂ２Ｍタンパク質、ＴＸＮＩＰタンパク質、ＣＩＩＴＡタンパク質、および／またはＴＧＦβタンパク質の発現が破壊され、ユニバーサルドナー細胞が、ＰＤ－Ｌ－１を発現する、組成物２５から６５までのいずれか１つによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物６７では、本開示は、ＭＡＮＦをコードする第１の外因性ポリヌクレオチドが、Ｂ２Ｍ遺伝子、ＴＸＮＩＰ遺伝子、またはＣＩＩＴＡ遺伝子、および／またはＴＧＦβ遺伝子の内部またはその近傍に挿入される、組成物６４から６６までのいずれか１つによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物６８では、本開示は、ＭＡＮＦをコードする第１の外因性ポリヌクレオチドが、Ｂ２Ｍ遺伝子および／またはＴＸＮＩＰ遺伝子の内部またはその近傍に挿入され、それにより、Ｂ２Ｍタンパク質および／またはＴＸＮＩＰタンパク質の発現が破壊される、組成物６４から６７までのいずれか１つによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物６９では、本開示は、ＴＮＦＡＩＰ３をコードする第２の外因性ポリヌクレオチドが、Ｂ２Ｍ遺伝子、ＴＸＮＩＰ遺伝子、またはＣＩＩＴＡ遺伝子、および／またはＴＧＦβ遺伝子の内部またはその近傍に挿入される、組成物６４から６８までによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物７０では、本開示は、ＴＮＦＡＩＰ３をコードする第２の外因性ポリヌクレオチドが、Ｂ２Ｍ遺伝子の内部またはその近傍に挿入され、それにより、Ｂ２Ｍタンパク質の発現が破壊される、組成物６４から６９までによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物７１では、本開示は、ＣＤ３９をコードする第３の外因性ポリヌクレオチドが、Ｂ２Ｍ遺伝子、ＴＸＮＩＰ遺伝子、ＣＩＩＴＡ遺伝子、および／またはＴＧＦβ遺伝子の内部またはその近傍に挿入される、組成物６４から７０までのいずれか１つによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物７２では、本開示は、ＣＤ３９をコードする第３の外因性ポリヌクレオチドが、ＣＩＴＴＡ遺伝子および／またはＢ２Ｍ遺伝子の内部またはその近傍に挿入され、それにより、ＣＩＩＴＡタンパク質および／またはＢ２Ｍタンパク質の発現が破壊される、組成物６４から７１までのいずれか１つによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物７３では、本開示は、ＣＤ７３をコードする第４の外因性ポリヌクレオチドが、Ｂ２Ｍ遺伝子、ＴＸＮＩＰ遺伝子、ＣＩＩＴＡ遺伝子、および／またはＴＧＦβ遺伝子の内部またはその近傍に挿入される、組成物６４から７２までのいずれか１つによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物７４では、本開示は、ＣＤ７３をコードする第４の外因性ポリヌクレオチドが、Ｂ２Ｍ遺伝子の内部またはその近傍に挿入され、それにより、Ｂ２Ｍタンパク質の発現が破壊される、組成物６４から７３までのいずれか１つによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物７５では、本開示は、ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＨＬＡ－Ｅ構築物を含み、ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＨＬＡ－Ｅ構築物が、Ｂ２Ｍ遺伝子、ＴＸＮＩＰ遺伝子、ＣＩＩＴＡ遺伝子、またはＴＧＦβ遺伝子の内部またはその近傍に挿入され、それにより、Ｂ２Ｍタンパク質、ＴＸＮＩＰタンパク質、ＣＩＩＴＡタンパク質、および／またはＴＧＦβタンパク質の発現が破壊される、組成物６４から７４までのいずれか１つによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物７６では、本開示は、ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＨＬＡ－Ｅ構築物が、ＴＸＮＩＰ遺伝子の内部またはその近傍に挿入され、それにより、ＴＸＮＩＰタンパク質の発現が破壊される、組成物６４から７５までのいずれか１つによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物７７では、本開示は、ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１構築物を含み、ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１構築物が、Ｂ２Ｍ遺伝子、ＴＸＮＩＰ遺伝子、ＣＩＩＴＡ遺伝子、および／またはＴＧＦβ遺伝子の内部またはその近傍に挿入され、それにより、Ｂ２Ｍタンパク質、ＴＸＮＩＰタンパク質、ＣＩＩＴＡタンパク質、および／またはＴＧＦβタンパク質の発現が破壊される、組成物６４から７６までのいずれか１つによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物７８では、本開示は、ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１構築物が、Ｂ２Ｍ遺伝子の内部またはその近傍に挿入され、それにより、Ｂ２Ｍタンパク質の発現が破壊される、組成物６４から７７までのいずれか１つによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物７９では、本開示は、ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１構築物を含み、ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１構築物が、Ｂ２Ｍ遺伝子、ＴＸＮＩＰ遺伝子、ＣＩＩＴＡ遺伝子、および／またはＴＧＦβ遺伝子の内部またはその近傍に挿入され、それにより、Ｂ２Ｍタンパク質、ＴＸＮＩＰタンパク質、ＣＩＩＴＡタンパク質、および／またはＴＧＦβタンパク質の発現が破壊される、組成物６４から７８までのいずれか１つによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物８０では、本開示は、ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１構築物が、Ｂ２Ｍ遺伝子の内部またはその近傍に挿入され、それにより、Ｂ２Ｍタンパク質の発現が破壊される、組成物６４から７９までのいずれか１つによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物８１では、本開示は、ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１構築物を含み、ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１構築物が、Ｂ２Ｍ遺伝子、ＴＸＮＩＰ遺伝子、ＣＩＩＴＡ遺伝子、および／またはＴＧＦβ遺伝子の内部またはその近傍に挿入され、それにより、Ｂ２Ｍタンパク質、ＴＸＮＩＰタンパク質、ＣＩＩＴＡタンパク質、および／またはＴＧＦβタンパク質の発現が破壊される、組成物６４から８０までのいずれか１つによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物８２では、本開示は、ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１構築物が、Ｂ２Ｍ遺伝子の内部またはその近傍に挿入され、それにより、Ｂ２Ｍタンパク質の発現が破壊される、組成物６４から８１までのいずれか１つによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物８３では、本開示は、ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＣＤ７３構築物を含み、ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＣＤ７３構築物が、Ｂ２Ｍ遺伝子、ＴＸＮＩＰ遺伝子、ＣＩＩＴＡ遺伝子、および／またはＴＧＦβ遺伝子の内部またはその近傍に挿入され、それにより、Ｂ２Ｍタンパク質、ＴＸＮＩＰタンパク質、ＣＩＩＴＡタンパク質、および／またはＴＧＦβタンパク質の発現が破壊される、組成物６４から８２までのいずれか１つによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物８４では、本開示は、ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＣＤ７３構築物が、Ｂ２Ｍ遺伝子の内部またはその近傍に挿入され、それにより、Ｂ２Ｍタンパク質の発現が破壊される、組成物６４から８３までのいずれか１つによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物８５では、本開示は、ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＣＤ７３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１構築物を含み、ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＣＤ７３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１構築物が、Ｂ２Ｍ遺伝子、ＴＸＮＩＰ遺伝子、ＣＩＩＴＡ遺伝子、および／またはＴＧＦβ遺伝子の内部またはその近傍に挿入され、それにより、Ｂ２Ｍタンパク質、ＴＸＮＩＰタンパク質、ＣＩＩＴＡタンパク質、および／またはＴＧＦβタンパク質の発現が破壊される、組成物６４から８４までのいずれか１つによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物８６では、本開示は、ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＣＤ７３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１構築物が、Ｂ２Ｍ遺伝子の内部またはその近傍に挿入され、それにより、Ｂ２Ｍタンパク質の発現が破壊される、組成物６４から８５までのいずれか１つによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物８７では、本開示は、Ｂ２Ｍタンパク質、ＴＸＮＩＰタンパク質、ＣＩＩＴＡタンパク質、および／またはＴＧＦβタンパク質の発現の破壊が、Ｂ２Ｍタンパク質、ＴＸＮＩＰタンパク質、ＣＩＩＴＡタンパク質、および／またはＴＧＦβタンパク質の発現の低減または排除を含む、組成物２５から８６までのいずれか１つによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物８８では、本開示は、ＴＧＦβタンパク質が、ＴＧＦβ－２である、組成物２５から８７までのいずれか１つによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物８９では、本開示は、細胞が、幹細胞である、組成物２５から８８までのいずれか１つによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物９０では、本開示は、幹細胞が、胚性幹細胞、成体幹細胞、人工多能性幹細胞、または造血幹細胞である、組成物８９による組成物を提供する。
別の組成物、組成物９１では、本開示は、細胞が、分化した細胞または体細胞である、組成物２５から８８までのいずれか１つによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物９２では、本開示は、細胞が、系列が制限された前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）または完全に分化した体細胞である、組成物９１による組成物を提供する。
別の組成物、組成物９３では、本開示は、系列が制限された前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）が、胚体内胚葉細胞、未分化腸管細胞、後方前腸細胞、膵臓内胚葉前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）、膵臓内分泌前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）、膵内分泌細胞、または未成熟ベータ細胞であり、完全に分化した体細胞が、膵ベータ細胞である、組成物９２による組成物を提供する。
別の組成物、組成物９４では、本開示は、請求項１から９３までのいずれか一項に記載の複数の遺伝子改変された細胞を含む組成物を提供する。
別の組成物、組成物９５では、本開示は、細胞の少なくとも約５０％が、ＭＡＮＦ、ＨＬＡ－Ｅ、ＴＮＦＡＩＰ３、ＰＤ－Ｌ－１、ＣＤ３９および／またはＣＤ７３を発現する、組成物９４による組成物を提供する。
別の組成物、組成物９６では、本開示は、組成物９４または９５の複数の遺伝子改変された細胞に由来する系列が制限された前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）または完全に分化した体細胞の集団を含む組成物を提供する。
別の組成物、組成物９７では、本開示は、系列が制限された前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）が、胚体内胚葉細胞、未分化腸管細胞、後方前腸細胞、膵臓内胚葉前駆体、膵臓内分泌前駆体、または未成熟ベータ細胞であり、完全に分化した体細胞が、膵ベータ細胞である、組成物９６による組成物を提供する。
別の組成物、組成物９８では、本開示は、細胞の少なくとも約５０％が、ＭＡＮＦ、ＨＬＡ－Ｅ、ＴＮＦＡＩＰ３、ＰＤ－Ｌ－１、ＣＤ３９および／またはＣＤ７３を発現する、組成物９６または９７による組成物を提供する。
別の組成物、組成物９９では、本開示は、組成物９４もしくは９５の複数の細胞または組成物９６から９８までのいずれか１つの細胞の集団を含む組成物を提供する。
別の組成物、組成物１００では、本開示は、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、組成物９９による組成物を提供する。
別の組成物、組成物１０１では、本開示は、膵疾患または障害の処置における使用のための、組成物９９または１００による組成物を提供する。
別の組成物、組成物１０２では、本開示は、膵疾患または障害が、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病または膵切除である、組成物１０１による組成物を提供する。
別の組成物、組成物１０３では、本開示は、ヒトが、膵疾患または障害を含む、組成物１０１または１０２による組成物を提供する。
別の方法、方法１０４では、本開示は、それを必要とする対象を処置するための方法であって、（ａ）請求項９４または９５に記載の複数の遺伝子改変された細胞を、膵臓内胚葉細胞、膵内分泌細胞、未成熟ベータ細胞、および／または膵ベータ細胞への分化後に得るまたは得ておくステップ；ならびに（ｂ）膵臓内胚葉細胞、膵内分泌細胞、未成熟ベータ細胞、および／または膵ベータ細胞を対象に投与するステップを含む、方法を提供する。
別の方法、方法１０５では、本開示は、それを必要とする対象を処置するための方法であって、（ａ）請求項９６から９８までのいずれか一項に記載の系列が制限された前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）または完全に分化した体細胞の集団を得るまたは得ておくステップであって、系列が制限された前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）または完全に分化した体細胞が、膵臓内胚葉細胞、膵臓内分泌前駆細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ）、未成熟ベータ細胞、および／または膵ベータ細胞を含む、ステップ；ならびに（ｂ）膵臓内胚葉細胞、膵内分泌細胞、未成熟ベータ細胞、および／またはベータ細胞を対象に投与するステップを含む、方法を提供する。
別の方法、方法１０６では、本開示は、それを必要とする対象を処置するための方法であって、（ａ）請求項９４または９５に記載の複数の遺伝子改変された細胞を得るまたは得ておくステップであって、複数の遺伝子改変された細胞が、幹細胞を含む、ステップ；（ｂ）遺伝子改変された細胞を膵臓内胚葉細胞、膵臓内分泌前駆細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ）、未成熟ベータ細胞、および／または膵ベータ細胞に分化させるステップ；ならびに（ｃ）膵臓内胚葉細胞、膵臓内分泌前駆細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ）、未成熟ベータ細胞、および／または膵ベータ細胞を対象に投与するステップを含む、方法を提供する。
別の方法、方法１０７では、本開示は、投与するステップが、膵臓内胚葉細胞、膵内分泌細胞、未成熟ベータ細胞、または成熟ベータ細胞（ｍａｔｕｒｅ ｂｅｔａ ｃｅｌｌ）を含むデバイスを対象に埋め込むことを含む、方法１０４から１０６までのいずれか１つにおいて提供される方法を提供する。
別の方法、方法１０８では、本開示は、対象が、膵疾患または障害を有する、それを有する疑いがある、またはそのリスクがある、方法１０４から１０７までのいずれか１つにおいて提供される方法を提供する。
別の方法、方法１０９では、本開示は、膵疾患または障害が、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病または膵切除である、方法１０８において提供される方法を提供する。
別の方法、方法１１０では、本開示は、対象が、ヒトである、方法１０４から１０９までのいずれか１つにおいて提供される方法を提供する。
別の組成物、組成物１１１では、本開示は、（ａ）チオレドキシン相互作用タンパク質（ＴＸＮＩＰ）をコードする遺伝子の内部またはその近傍に挿入された中脳アストロサイト由来神経栄養因子（ＭＡＮＦ）をコードする第１のポリヌクレオチド、および（ｂ）ベータ２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）をコードする遺伝子の内部またはその近傍に挿入された腫瘍壊死因子アルファ誘導タンパク質３（ＴＮＦＡＩＰ３）をコードする第２のポリヌクレオチドを含む遺伝子改変された細胞を含む組成物であって、遺伝子改変された細胞が、ＭＡＮＦおよびＴＮＦＡＩＰ３を発現し、ＴＸＮＩＰおよびＢ２Ｍの発現の破壊を有する、組成物を提供する。
別の組成物、組成物１１２では、本開示は、Ｂ２ＭおよびＴＸＮＩＰの発現の破壊が、Ｂ２Ｍおよび／またはＴＸＮＩＰの発現の低減または排除を含む、組成物１１１による組成物を提供する。
別の組成物、組成物１１３では、本開示は、ＴＸＮＩＰ遺伝子の内部またはその近傍に挿入されたＨＬＡクラスＩ組織適合性抗原、アルファ鎖Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）をコードする第３のポリヌクレオチドをさらに含む、組成物１１１または１１２による組成物を提供する。
別の組成物、組成物１１４では、本開示は、ＨＬＡ－Ｅをコードする第３のポリヌクレオチドが、ＨＬＡ－Ｅ三量体をコードするポリヌクレオチドを含み、ＨＬＡ－Ｅ三量体が、シグナルペプチドを有さないＨＬＡ－Ｅと融合したＢ２Ｍ膜タンパク質、それと融合したＨＬＡ－Ｇ提示ペプチド、それと融合したＢ２Ｍシグナルペプチドを含む、組成物１１３による組成物を提供する。
別の組成物、組成物１１５では、本開示は、ＭＡＮＦをコードする第１のポリヌクレオチドおよびＨＬＡ－Ｅをコードする第３のポリヌクレオチドが、外因性プロモーターに作動可能に連結している、組成物１１３または１１４による組成物を提供する。
別の組成物、組成物１１６では、本開示は、ＭＡＮＦをコードする第１のポリヌクレオチドが、ＨＬＡ－Ｅをコードする第３のポリヌクレオチドと、Ｐ２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチドによって連結しており、したがって、第１のポリヌクレオチド、Ｐ２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチド、および第３のポリヌクレオチドにより、ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＨＬＡ－Ｅ構築物が形成される、組成物１１３から１１５までのいずれか１つによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物１１７では、本開示は、ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＨＬＡ－Ｅ構築物が、配列番号５５から本質的になるポリヌクレオチド配列を含む、組成物１１６による組成物を提供する。
別の組成物、組成物１１８では、本開示は、Ｂ２Ｍ遺伝子の内部またはその近傍に挿入されたプログラム死－リガンド１（ＰＤ－Ｌ－１）をコードする第４のポリヌクレオチドをさらに含む、組成物１１１から１１７までのいずれか１つによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物１１９では、本開示は、ＴＮＦＡＩＰ３をコードする第２のポリヌクレオチドおよびＰＤ－Ｌ－１をコードする第４のポリヌクレオチドが、外因性プロモーターに作動可能に連結している、組成物１１８による組成物を提供する。
別の組成物、組成物１２０では、本開示は、ＴＮＦＡＩＰ３をコードする第２のポリヌクレオチドが、ＰＤ－Ｌ－１をコードする第４のポリヌクレオチド配列と、Ｐ２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチドによって連結しており、したがって、第２のポリヌクレオチド、Ｐ２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチド、および第４のポリヌクレオチドにより、ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１構築物が形成される、組成物１１８または１１９による組成物を提供する。
別の組成物、組成物１２１では、本開示は、ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１構築物が、配列番号５４から本質的になるヌクレオチド配列を含む、組成物１２０による組成物を提供する。
別の組成物、組成物１２２では、本開示は、細胞が、幹細胞である、組成物１１１から１２１までのいずれか１つによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物１２３では、本開示は、幹細胞が、胚性幹細胞、成体幹細胞、人工多能性幹細胞、または造血幹細胞である、組成物１１２による組成物を提供する。
別の組成物、組成物１２４では、本開示は、細胞が、分化した細胞または体細胞である、組成物１１１から１２１までのいずれか１つによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物１２５では、本開示は、細胞が、系列が制限された前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）または完全に分化した体細胞である、組成物１２４による組成物を提供する。
別の組成物、組成物１２６では、本開示は、系列が制限された前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）が、胚体内胚葉細胞、未分化腸管細胞、後方前腸細胞、膵臓内胚葉前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）、膵臓内分泌前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）、膵内分泌細胞、または未成熟ベータ細胞であり、完全に分化した体細胞が、膵ベータ細胞である、組成物１２５による組成物を提供する。
別の組成物、組成物１２７では、本開示は、請求項１１１から１２６までのいずれか一項に記載の複数の遺伝子改変された細胞を含む組成物を提供する。
別の組成物、組成物１２８では、本開示は、細胞の少なくとも約５０％が、ＭＡＮＦ、ＨＬＡ－Ｅ、ＴＮＦＡＩＰ３、および／またはＰＤ－Ｌ－１を発現する、組成物１２７による組成物を提供する。
別の組成物、組成物１２９では、本開示は、組成物１２７または１２８の複数の遺伝子改変された細胞に由来する系列が制限された前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）または完全に分化した体細胞の集団を含む組成物を提供する。
別の組成物、組成物１３０では、本開示は、系列が制限された前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）が、胚体内胚葉細胞、未分化腸管細胞、後方前腸細胞、膵臓内胚葉前駆体、膵臓内分泌前駆体、または未成熟ベータ細胞であり、完全に分化した体細胞が、膵ベータ細胞である、組成物１２９による組成物を提供する。
別の組成物、組成物１３１では、本開示は、細胞の少なくとも約５０％が、ＭＡＮＦ、ＨＬＡ－Ｅ、ＴＮＦＡＩＰ３、および／またはＰＤ－Ｌ－１を発現する、組成物１２９または１３０による組成物を提供する。
別の組成物、組成物１３２では、本開示は、組成物１７もしくは１８の複数の細胞または組成物１３０もしくは１３１のいずれか１つの細胞の集団を含む組成物を提供する。
別の組成物、組成物１３３では、本開示は、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、組成物１３２による組成物を提供する。
別の組成物、組成物１３４では、本開示は、膵疾患または障害の処置における使用のための、組成物１３２または１３３による組成物を提供する。
別の組成物、組成物１３５では、本開示は、ヒトが、膵疾患または障害を含む、組成物１３４による組成物を提供する。
別の組成物、組成物１３６では、本開示は、膵疾患または障害が、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病または膵切除である、組成物１３４または１３５による組成物を提供する。
別の方法、方法１３７では、本開示は、それを必要とする対象を処置するための方法であって、（ａ）請求項１１１から１３９までのいずれか一項に記載の複数の遺伝子改変された細胞を、膵臓内胚葉細胞、膵内分泌細胞、未成熟ベータ細胞、および／または膵ベータ細胞への分化後に得るまたは得ておくステップ；ならびに（ｂ）膵臓内胚葉細胞、膵内分泌細胞、未成熟ベータ細胞、および／または膵ベータ細胞を対象に投与するステップを含む、方法を提供する。
別の方法、方法１３８では、本開示は、それを必要とする対象を処置するための方法であって、（ａ）請求項１２９に記載の系列が制限された前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）または完全に分化した体細胞の集団を得るまたは得ておくステップであって、系列が制限された前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）または完全に分化した体細胞が、膵臓内胚葉細胞、膵臓内分泌前駆細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ）、未成熟ベータ細胞、および／または膵ベータ細胞を含む、ステップ；ならびに（ｂ）膵臓内胚葉細胞、膵内分泌細胞、未成熟ベータ細胞、および／またはベータ細胞を対象に投与するステップを含む、方法を提供する。
別の方法、方法１３９では、本開示は、それを必要とする対象を処置するための方法であって、（ａ）請求項１２７または１２８に記載の複数の遺伝子改変された細胞を得るまたは得ておくステップであって、複数の遺伝子改変された細胞が、幹細胞を含む、ステップ；（ｂ）遺伝子改変された細胞を膵臓内胚葉細胞、膵臓内分泌前駆細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ）、未成熟ベータ細胞、および／または膵ベータ細胞に分化させるステップ；ならびに（ｃ）膵臓内胚葉細胞、膵臓内分泌前駆細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ）、未成熟ベータ細胞、および／または膵ベータ細胞を対象に投与するステップを含む、方法を提供する。
別の方法、方法１４０では、本開示は、投与するステップが、膵臓内胚葉細胞、膵内分泌細胞、未成熟ベータ細胞、または成熟ベータ細胞を含むデバイスを対象に埋め込むことを含む、方法１３７から１３９までのいずれか１つにおいて提供される方法を提供する。
別の方法、方法１４１では、本開示は、対象が、膵疾患または障害を有する、それを有する疑いがある、またはそのリスクがある、方法１３７から１４０までのいずれか１つにおいて提供される方法を提供する。
別の方法、方法１４２では、本開示は、膵疾患または障害が、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病または膵切除である、方法１４１において提供される方法を提供する。
別の方法、方法１４３では、本開示は、対象が、ヒトである、方法１３７から１４２までのいずれか１つにおいて提供される方法を提供する。
別の方法、方法１４４では、本開示は、ユニバーサルドナー細胞を生成するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、（ａ）第１のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼおよびベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子座における標的部位を標的とする第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；（ｂ）核酸を含む第１のベクターであって、核酸が、（ｉ）腫瘍壊死因子アルファ誘導タンパク質３（ＴＮＦＡＩＰ３）をコードするヌクレオチド配列およびプログラム死－リガンド１（ＰＤ－Ｌ－１）をコードするヌクレオチド配列；（ｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子座における標的部位の左側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列；および（ｉｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子座における標的部位の右側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列を含み、（ｉ）が、（ｉｉ）と（ｉｉｉ）に挟まれており、Ｂ２Ｍ遺伝子座を標的部位において切断し、ＴＮＦＡＩＰ３およびＰＤ－Ｌ－１をコードするヌクレオチド配列を含む核酸をＢ２Ｍ遺伝子座に挿入し、それにより、Ｂ２Ｍ遺伝子を破壊する、第１のベクター；ならびに（ｃ）第２のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼおよびチオレドキシン相互作用タンパク質（ＴＸＮＩＰ）遺伝子座における標的部位を標的とする第２のｇＲＮＡ；および（ｄ）核酸を含む第２のベクターであって、核酸が、（ｉ）中脳アストロサイト由来神経栄養因子（ＭＡＮＦ）をコードするヌクレオチド配列およびＨＬＡクラスＩ組織適合性抗原、アルファ鎖Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）をコードするヌクレオチド配列；（ｉｉ）ＴＸＮＩＰ遺伝子座における標的部位の左側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列；および（ｉｉｉ）ＴＸＮＩＰ遺伝子座における標的部位の右側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列を含み、（ｉ）が、（ｉｉ）と（ｉｉｉ）に挟まれており、ＴＸＮＩＰ遺伝子座を標的部位において切断し、ＭＡＮＦおよびＨＬＡ－Ｅをコードするヌクレオチド配列を含む核酸をＴＸＮＩＰ遺伝子座に挿入し、それにより、ＴＸＮＩＰ遺伝子を破壊する、第２のベクターを幹細胞に送達するステップを含み、ユニバーサルドナー細胞が、ＴＮＦＡＩＰ３、ＰＤ－Ｌ－１、ＭＡＮＦおよびＨＬＡ－Ｅを発現し、Ｂ２ＭおよびＴＸＮＩＰの発現の破壊を有する、方法を提供する。
別の方法、方法１４５では、本開示は、Ｂ２ＭおよびＴＸＮＩＰの発現の破壊が、Ｂ２Ｍおよび／またはＴＸＮＩＰの発現の低減または排除を含む、方法１４４において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法１４６では、本開示は、（ｂ）（ｉ）のヌクレオチド配列が、ＰＤ－Ｌ－１をコードするヌクレオチド配列と連結した、Ｐ２Ａをコードするヌクレオチド配列、それと連結した、ＴＮＦＡＩＰ３をコードするヌクレオチド配列を含む、方法１４４または１４５において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法１４７では、本開示は、（ｂ）（ｉ）のヌクレオチド配列が、配列番号５４を含む、方法１４４から１４６までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法１４８では、本開示は、（ｂ）（ｉ）のヌクレオチド配列が、外因性プロモーターに作動可能に連結している、方法１４４から１４７までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法１４９では、本開示は、外因性プロモーターが、ＣＭＶ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、ＣＡＧ、またはＵＢＣプロモーターである、方法１４８において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法１５０では、本開示は、（ｂ）（ｉｉ）のヌクレオチド配列が、配列番号１５を含むまたはそれから本質的になる、方法１４４から１４９までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法１５１では、本開示は、（ｂ）（ｉｉｉ）のヌクレオチド配列が、配列番号２２を含むまたはそれから本質的になる、方法１４４から１５０までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法１５２では、本開示は、第１のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと第１のｇＲＮＡが、約１：１～約１：１０の比で存在する、方法１４４から１５１までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法１５３では、本開示は、第１のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが、第１のＣａｓ９ヌクレアーゼである、方法１４４から１５２までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法１５４では、本開示は、第１のＣａｓ９ヌクレアーゼが、少なくとも１つの核局在化シグナルと連結している、方法１５３において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法１５５では、本開示は、ＨＬＡ－Ｅをコードするヌクレオチド配列が、ＨＬＡ－Ｅ三量体をコードする配列を含み、ＨＬＡ－Ｅ三量体が、シグナルペプチドを有さないＨＬＡ－Ｅと融合したＢ２Ｍ膜タンパク質、それと融合したＨＬＡ－Ｇ提示ペプチド、それと融合したＢ２Ｍシグナルペプチドを含む、方法１４４から１５４までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法１５６では、本開示は、（ｄ）（ｉ）のヌクレオチド配列が、ＨＬＡ－Ｅをコードするヌクレオチド配列と連結した、Ｐ２Ａをコードするヌクレオチド配列、それと連結した、ＭＡＮＦをコードするヌクレオチド配列を含む、方法１４４から１５５までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法１５７では、本開示は、（ｄ）（ｉ）のヌクレオチド配列が、配列番号５５を含む、方法１４４から１５６までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法１５８では、本開示は、（ｄ）（ｉ）のヌクレオチド配列が、外因性プロモーターに作動可能に連結している、方法１４４から１５７までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法１５９では、本開示は、外因性プロモーターが、ＣＭＶ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、ＣＡＧ、またはＵＢＣプロモーターである、方法１５８において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法１６０では、本開示は、（ｄ）（ｉｉ）のヌクレオチド配列が、配列番号４２から本質的になる、方法１４４から１５９までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法１６１では、本開示は、（ｄ）（ｉｉｉ）のヌクレオチド配列が、配列番号４４から本質的になる、方法１４４から１６０までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法１６２では、本開示は、第２のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと第２のｇＲＮＡが、約１：１～約１：１０の比で存在する、方法１４４から１６１までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法１６３では、本開示は、第２のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが、第２のＣａｓ９ヌクレアーゼである、方法１４４から１６２までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法１６４では、本開示は、第２のＣａｓ９ヌクレアーゼが、少なくとも１つの核局在化シグナルと連結している、方法１６３において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法１６５では、本開示は、幹細胞が、胚性幹細胞、成体幹細胞、人工多能性幹細胞、または造血幹細胞である、方法１４４から１６４までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法１６６では、本開示は、幹細胞が、ヒト幹細胞である、方法１４４から１６５までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法１６７では、本開示は、ユニバーサルドナー細胞が、核酸挿入および遺伝子破壊がなされていない同等の細胞と比較して、免疫回避および／または移植後生存の増大を有する、方法１４４から１６６までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法１６８では、本開示は、ユニバーサルドナー細胞を生成するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、（ａ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼならびに第１の標的遺伝子座における標的部位を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ならびに腫瘍壊死因子アルファ誘導タンパク質３（ＴＮＦＡＩＰ３）、中脳アストロサイト由来神経栄養因子（ＭＡＮＦ）、分化抗原群３９（ＣＤ３９）および／もしくは分化抗原群７３（ＣＤ７３）をコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸であって、第１の標的遺伝子座を標的部位において切断し、ＴＮＦＡＩＰ３、ＭＡＮＦ、ＣＤ３９および／またはＣＤ７３をコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸を標的遺伝子座に挿入し、それにより、標的遺伝子を破壊する、第１の核酸；ならびに／または（ｂ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼおよびベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子座における標的部位を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）であって、Ｂ２Ｍ遺伝子座を標的部位において切断し、それにより、Ｂ２Ｍ遺伝子を破壊する、ガイドＲＮＡ；ならびに／または（ｃ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼおよびチオレドキシン相互作用タンパク質（ＴＸＮＩＰ）遺伝子座における標的部位を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）であって、ＴＸＮＩＰ遺伝子座を標的部位において切断し、それにより、ＴＸＮＩＰ遺伝子を破壊する、ガイドＲＮＡ；ならびに／または（ｄ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼおよびクラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子座における標的部位を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）であって、ＣＩＩＴＡ遺伝子座を標的部位において切断し、それにより、ＣＩＩＴＡ遺伝子を破壊する、ガイドＲＮＡ；ならびに／または（ｅ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼおよびトランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）遺伝子座における標的部位を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）であって、ＴＧＦβ遺伝子座を標的部位において切断し、それにより、ＴＧＦβ遺伝子を破壊する、ガイドＲＮＡを幹細胞に送達するステップを含む、方法を提供する。
別の方法、方法１６９では、本開示は、（ａ）の標的遺伝子座が、ベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子座、チオレドキシン相互作用タンパク質（ＴＸＮＩＰ）遺伝子座、クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子座および／またはトランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）遺伝子座から選択され、ユニバーサルドナー細胞が、Ｂ２Ｍ、ＴＸＮＩＰ、ＣＩＩＴＡおよび／またはＴＧＦβの発現の破壊を有する、方法１６８において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法１７０では、本開示は、Ｂ２Ｍ、ＴＸＮＩＰ、ＣＩＩＴＡおよび／またはＴＧＦβの発現の破壊が、Ｂ２Ｍ、ＴＸＮＩＰ、ＣＩＩＴＡおよび／またはＴＧＦβの発現の低減または排除を含む、方法１６８または１６９において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法１７１では、本開示は、（ａ）の標的遺伝子座が、Ｂ２Ｍ遺伝子座であり、核酸が、（ｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子座における標的部位の左側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列；および（ｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子座における標的部位の右側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列をさらに含み、ＴＮＦＡＩＰ３、ＭＡＮＦ、ＣＤ３９および／またはＣＤ７３をコードするヌクレオチド配列が、（ｉ）と（ｉｉ）に挟まれており、ユニバーサルドナー細胞が、Ｂ２Ｍの発現の破壊を有する、方法１６９または１７０において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法１７２では、本開示は、（ｉ）のヌクレオチド配列が、配列番号１５を含むまたはそれから本質的になる、方法１７１において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法１７３では、本開示は、（ｉｉ）のヌクレオチド配列が、配列番号２２を含むまたはそれから本質的になる、方法１７１または１７２のいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法１７４では、本開示は、（ａ）の標的遺伝子座が、ＴＸＮＩＰ遺伝子座であり、核酸が、（ｉ）ＴＸＮＩＰ遺伝子座における標的部位の左側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列；および（ｉｉ）ＴＸＮＩＰ遺伝子座における標的部位の右側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列をさらに含み、ＴＮＦＡＩＰ３、ＭＡＮＦ、ＣＤ３９および／またはＣＤ７３をコードするヌクレオチド配列が、（ｉ）と（ｉｉ）に挟まれており、ユニバーサルドナー細胞が、ＴＸＮＩＰの発現の破壊を有する、方法１６９において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法１７５では、本開示は、（ｉ）のヌクレオチド配列が、配列番号４２を含むまたはそれから本質的になる、方法１７４において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法１７６では、本開示は、（ｉｉ）のヌクレオチド配列が、配列番号４４を含むまたはそれから本質的になる、方法１７４または１７５において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法１７７では、本開示は、（ａ）の標的遺伝子座が、ＣＩＩＴＡ遺伝子座であり、核酸が、（ｉ）ＣＩＩＴＡ遺伝子座における標的部位の左側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列；および（ｉｉ）ＣＩＩＴＡ遺伝子座における標的部位の右側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列をさらに含み、ＴＮＦＡＩＰ３、ＭＡＮＦ、ＣＤ３９および／またはＣＤ７３をコードするヌクレオチド配列が、（ｉ）と（ｉｉ）に挟まれており、ユニバーサルドナー細胞が、ＣＩＩＴＡの発現の破壊を有する、方法１６９において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法１７８では、本開示は、（ｉ）のヌクレオチド配列が、配列番号２６を含むまたはそれから本質的になる、方法１７７において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法１７９では、本開示は、（ｉｉ）のヌクレオチド配列が、配列番号２８を含むまたはそれから本質的になる、方法１７７または１７８において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法１８０では、本開示は、（ａ）の標的遺伝子座が、ＴＧＦβ遺伝子座であり、核酸が、（ｉ）ＴＧＦβ遺伝子座における標的部位の左側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列；および（ｉｉ）ＴＧＦβ遺伝子座における標的部位の右側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列をさらに含み、ＴＮＦＡＩＰ３、ＭＡＮＦ、ＣＤ３９および／またはＣＤ７３をコードするヌクレオチド配列が、（ｉ）と（ｉｉ）に挟まれており、ユニバーサルドナー細胞が、ＴＧＦβの発現の破壊を有する、方法１６９において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法１８１では、本開示は、（ｂ）の標的部位が、配列番号１～１３のいずれか１つから本質的になるヌクレオチド配列を含む、方法１６８から１８０までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法１８２では、本開示は、（ｃ）の標的部位が、配列番号３２～４１のいずれか１つから本質的になるヌクレオチド配列を含む、方法１６８から１８１までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法１８３では、本開示は、（ｄ）の標的部位が、配列番号２５および４８～５１のいずれか１つから本質的になるヌクレオチド配列を含む、方法１６８から１８２までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法１８４では、本開示は、（ｅ）の標的部位が、配列番号５７から本質的になるヌクレオチド配列を含む、方法１６８から１８３までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法１８５では、本開示は、（ｆ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼならびに標的遺伝子座における標的部位を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ならびに腫瘍壊死因子アルファ誘導タンパク質３（ＴＮＦＡＩＰ３）、中脳アストロサイト由来神経栄養因子（ＭＡＮＦ）、分化抗原群３９（ＣＤ３９）、分化抗原群７３（ＣＤ７３）、ＨＬＡクラスＩ組織適合性抗原、アルファ鎖Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）および／またはプログラム死－リガンド１（ＰＤ－Ｌ－１）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を幹細胞に送達するステップであって、標的遺伝子座を標的部位において切断し、ＴＮＦＡＩＰ３、ＭＡＮＦ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＨＬＡ－Ｅ、および／またはＰＤ－Ｌ－１をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を標的遺伝子座に挿入し、それにより、標的遺伝子を破壊する、ステップをさらに含む、方法１６８から１８４までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法１８６では、本開示は、（ｆ）の標的遺伝子座が、ベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子座、チオレドキシン相互作用タンパク質（ＴＸＮＩＰ）遺伝子座、クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子座および／またはトランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）遺伝子座から選択される、方法１８５において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法１８７では、本開示は、（ｆ）の標的遺伝子座が、Ｂ２Ｍ遺伝子座であり、（ｆ）の核酸が、（ｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子座における標的部位の左側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列；および（ｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子座における標的部位の右側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列をさらに含み、ＴＮＦＡＩＰ３、ＭＡＮＦ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＨＬＡ－Ｅ、および／またはＰＤ－Ｌ－１をコードするヌクレオチド配列が、（ｉ）と（ｉｉ）に挟まれている、方法１８６において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法１８８では、本開示は、（ｉ）のヌクレオチド配列が、配列番号１５を含むまたはそれから本質的になる、方法１８７において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法１８９では、本開示は、（ｉｉ）のヌクレオチド配列が、配列番号２２を含むまたはそれから本質的になる、方法１８７または１８８のいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法１９０では、本開示は、（ｆ）の標的遺伝子座が、ＴＸＮＩＰ遺伝子座であり、（ｆ）の核酸が、（ｉ）ＴＸＮＩＰ遺伝子座における標的部位の左側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列；および（ｉｉ）ＴＸＮＩＰ遺伝子座における標的部位の右側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列をさらに含み、ＴＮＦＡＩＰ３、ＭＡＮＦ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＨＬＡ－Ｅ、および／またはＰＤ－Ｌ－１をコードするヌクレオチド配列が、（ｉ）と（ｉｉ）に挟まれている、方法１８６において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法１９１では、本開示は、（ｉ）のヌクレオチド配列が、配列番号４２を含むまたはそれから本質的になる、方法１９０において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法１９２では、本開示は、（ｉｉ）のヌクレオチド配列が、配列番号４４を含むまたはそれから本質的になる、方法１９０または１９１において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法１９３では、本開示は、（ｆ）の標的遺伝子座が、ＣＩＩＴＡ遺伝子座であり、（ｆ）の核酸が、（ｉ）ＣＩＩＴＡ遺伝子座における標的部位の左側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列；および（ｉｉ）ＣＩＩＴＡ遺伝子座における標的部位の右側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列をさらに含み、ＴＮＦＡＩＰ３、ＭＡＮＦ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＨＬＡ－Ｅ、および／またはＰＤ－Ｌ－１をコードするヌクレオチド配列が、（ｉ）と（ｉｉ）に挟まれている、方法１８６において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法１９４では、本開示は、（ｉ）のヌクレオチド配列が、配列番号２６を含むまたはそれから本質的になる、方法１９３において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法１９５では、本開示は、（ｉｉ）のヌクレオチド配列が、配列番号２８を含むまたはそれから本質的になる、方法１９３または１９５において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法１９６では、本開示は、（ｆ）の標的遺伝子座が、ＴＧＦβ遺伝子座であり、（ｆ）の核酸が、（ｉ）ＴＧＦβ遺伝子座における標的部位の左側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列；および（ｉｉ）ＴＧＦβ遺伝子座における標的部位の右側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列をさらに含み、ＴＮＦＡＩＰ３、ＭＡＮＦ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＨＬＡ－Ｅ、および／またはＰＤ－Ｌ－１をコードするヌクレオチド配列が、（ｉ）と（ｉｉ）に挟まれている、方法１８６において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法１９７では、本開示は、（ｆ）の標的遺伝子座が、（ａ）の標的遺伝子座と同じである、方法１８５から１９６までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法１９８では、本開示は、（ｆ）の標的遺伝子座が、（ａ）の標的遺伝子座とは異なる、方法１８５から１９７までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法１９９では、本開示は、（ｇ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼならびに標的遺伝子座における標的部位を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ならびに腫瘍壊死因子アルファ誘導タンパク質３（ＴＮＦＡＩＰ３）、中脳アストロサイト由来神経栄養因子（ＭＡＮＦ）、分化抗原群３９（ＣＤ３９）、分化抗原群７３（ＣＤ７３）、ＨＬＡ－Ｅおよび／またはＰＤ－Ｌ－１をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を幹細胞に送達するステップであって、標的遺伝子座を標的部位において切断し、ＴＮＦＡＩＰ３、ＭＡＮＦ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＨＬＡ－Ｅ、および／またはＰＤ－Ｌ－１をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を標的遺伝子座に挿入し、それにより、標的遺伝子を破壊する、ステップをさらに含む、方法１６８から１９８までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２００では、本開示は、（ｇ）の標的遺伝子座が、ベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子座、チオレドキシン相互作用タンパク質（ＴＸＮＩＰ）遺伝子座、クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子座および／またはトランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）遺伝子座から選択される、方法１９９において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２０１では、本開示は、（ｇ）の標的遺伝子座が、Ｂ２Ｍ遺伝子座であり、（ｇ）の核酸が、（ｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子座における標的部位の左側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列；および（ｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子座における標的部位の右側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列をさらに含み、ＴＮＦＡＩＰ３、ＭＡＮＦ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＨＬＡ－Ｅ、および／またはＰＤ－Ｌ－１をコードするヌクレオチド配列が、（ｉ）と（ｉｉ）に挟まれている、方法２００において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２０２では、本開示は、（ｉ）のヌクレオチド配列が、配列番号１５を含むまたはそれから本質的になる、方法２０１において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２０３では、本開示は、（ｉｉ）のヌクレオチド配列が、配列番号２２を含むまたはそれから本質的になる、方法２０１または２０２において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２０４では、本開示は、（ｇ）の標的遺伝子座が、ＴＸＮＩＰ遺伝子座であり、（ｇ）の核酸が、（ｉ）ＴＸＮＩＰ遺伝子座における標的部位の左側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列；および（ｉｉ）ＴＸＮＩＰ遺伝子座における標的部位の右側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列をさらに含み、ＴＮＦＡＩＰ３、ＭＡＮＦ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＨＬＡ－Ｅ、および／またはＰＤ－Ｌ－１をコードするヌクレオチド配列が、（ｉ）と（ｉｉ）に挟まれている、方法２００において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２０５では、本開示は、（ｉ）のヌクレオチド配列が、配列番号４２を含むまたはそれから本質的になる、方法２０４において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２０６では、本開示は、（ｉｉ）のヌクレオチド配列が、配列番号４４を含むまたはそれから本質的になる、方法２０４または２０５において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２０７では、本開示は、（ｇ）の標的遺伝子座が、ＣＩＩＴＡ遺伝子座であり、（ｇ）の核酸が、（ｉ）ＣＩＩＴＡ遺伝子座における標的部位の左側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列；および（ｉｉ）ＣＩＩＴＡ遺伝子座における標的部位の右側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列をさらに含み、ＴＮＦＡＩＰ３、ＭＡＮＦ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＨＬＡ－Ｅ、および／またはＰＤ－Ｌ－１をコードするヌクレオチド配列が、（ｉ）と（ｉｉ）に挟まれている、方法２００において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２０８では、本開示は、（ｉ）のヌクレオチド配列が、配列番号２６を含むまたはそれから本質的になる、方法２０７において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２０９では、本開示は、（ｉｉ）のヌクレオチド配列が、配列番号２８を含むまたはそれから本質的になる、方法２０７または２０８において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２１０では、本開示は、（ｇ）の標的遺伝子座が、ＴＧＦβ遺伝子座であり、（ｇ）の核酸が、（ｉ）ＴＧＦβ遺伝子座における標的部位の左側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列；および（ｉｉ）ＴＧＦβ遺伝子座における標的部位の右側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列をさらに含み、ＴＮＦＡＩＰ３、ＭＡＮＦ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＨＬＡ－Ｅ、および／またはＰＤ－Ｌ－１をコードするヌクレオチド配列が、（ｉ）と（ｉｉ）に挟まれている、方法２００において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２１１では、本開示は、（ｇ）の標的遺伝子座が、（ａ）および／または（ｆ）の標的遺伝子座と同じである、方法１９９から２１０までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２１２では、本開示は、（ｇ）の標的遺伝子座が、（ａ）および／または（ｆ）の標的遺伝子座とは異なる、方法１９９から２１１までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２１３では、本開示は、（ｈ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼならびに標的遺伝子座における標的部位を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ならびに腫瘍壊死因子アルファ誘導タンパク質３（ＴＮＦＡＩＰ３）、中脳アストロサイト由来神経栄養因子（ＭＡＮＦ）、分化抗原群３９（ＣＤ３９）、分化抗原群７３（ＣＤ７３）、ＨＬＡ－Ｅおよび／またはＰＤ－Ｌ－１をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を幹細胞に送達するステップであって、標的遺伝子座を標的部位において切断し、ＴＮＦＡＩＰ３、ＭＡＮＦ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＨＬＡ－Ｅ、および／またはＰＤ－Ｌ－１をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を標的遺伝子座に挿入し、それにより、標的遺伝子を破壊する、ステップをさらに含む、方法１６８から２１２までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２１４では、本開示は、（ｈ）の標的遺伝子座が、ベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子座、チオレドキシン相互作用タンパク質（ＴＸＮＩＰ）遺伝子座、クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子座および／またはトランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）遺伝子座から選択される、方法２１３において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２１５では、本開示は、（ｈ）の標的遺伝子座が、Ｂ２Ｍ遺伝子座であり、（ｈ）の核酸が、（ｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子座における標的部位の左側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列；および（ｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子座における標的部位の右側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列をさらに含み、ＴＮＦＡＩＰ３、ＭＡＮＦ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＨＬＡ－Ｅ、および／またはＰＤ－Ｌ－１をコードするヌクレオチド配列が、（ｉ）と（ｉｉ）に挟まれている、方法２１４において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２１６では、本開示は、（ｉ）のヌクレオチド配列が、配列番号１５を含むまたはそれから本質的になる、方法２１５において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２１７では、本開示は、（ｉｉ）のヌクレオチド配列が、配列番号２２を含むまたはそれから本質的になる、方法２１５または２１６において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２１８では、本開示は、（ｈ）の標的遺伝子座が、ＴＸＮＩＰ遺伝子座であり、（ｈ）の核酸が、（ｉ）ＴＸＮＩＰ遺伝子座における標的部位の左側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列；および（ｉｉ）ＴＸＮＩＰ遺伝子座における標的部位の右側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列をさらに含み、ＴＮＦＡＩＰ３、ＭＡＮＦ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＨＬＡ－Ｅ、および／またはＰＤ－Ｌ－１をコードするヌクレオチド配列が、（ｉ）と（ｉｉ）に挟まれている、方法２１４において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２１９では、本開示は、（ｉ）のヌクレオチド配列が、配列番号４２を含むまたはそれから本質的になる、方法２１８において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２２０では、本開示は、（ｉｉ）のヌクレオチド配列が、配列番号４４を含むまたはそれから本質的になる、方法２１８または２１９において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２２１では、本開示は、（ｈ）の標的遺伝子座が、ＣＩＩＴＡ遺伝子座であり、（ｈ）の核酸が、（ｉ）ＣＩＩＴＡ遺伝子座における標的部位の左側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列；および（ｉｉ）ＣＩＩＴＡ遺伝子座における標的部位の右側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列をさらに含み、ＴＮＦＡＩＰ３、ＭＡＮＦ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＨＬＡ－Ｅ、および／またはＰＤ－Ｌ－１をコードするヌクレオチド配列が、（ｉ）と（ｉｉ）に挟まれている、方法２１４において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２２２では、本開示は、（ｉ）のヌクレオチド配列が、配列番号２６を含むまたはそれから本質的になる、方法２２１において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２２３では、本開示は、（ｉｉ）のヌクレオチド配列が、配列番号２８を含むまたはそれから本質的になる、方法２２１または２２２において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２２４では、本開示は、（ｈ）の標的遺伝子座が、ＴＧＦβ遺伝子座であり、（ｈ）の核酸が、（ｉ）ＴＧＦβ遺伝子座における標的部位の左側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列；および（ｉｉ）ＴＧＦβ遺伝子座における標的部位の右側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列をさらに含み、ＴＮＦＡＩＰ３、ＭＡＮＦ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＨＬＡ－Ｅ、および／またはＰＤ－Ｌ－１をコードするヌクレオチド配列が、（ｉ）と（ｉｉ）に挟まれている、方法２１４において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２２５では、本開示は、（ｈ）の標的遺伝子座が、（ａ）、（ｆ）および／または（ｇ）の標的遺伝子座と同じである、方法２１３から２２４までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２２６では、本開示は、（ｈ）の標的遺伝子座が、（ａ）、（ｆ）および／または（ｇ）の標的遺伝子座とは異なる、方法２１３から２２５までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２２７では、本開示は、（ａ）の核酸、（ｆ）の核酸、（ｇ）の核酸および／または（ｈ）の核酸が、ＭＡＮＦをコードするヌクレオチド配列を含み、ユニバーサルドナー細胞が、ＭＡＮＦを発現する、方法１６８から２２６までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２２８では、本開示は、ＭＡＮＦをコードするヌクレオチド配列が、配列番号１７から本質的になる、方法２２７において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２２９では、本開示は、（ａ）の核酸、（ｆ）の核酸、（ｇ）の核酸および／または（ｈ）の核酸が、ＴＮＦＡＩＰ３をコードするヌクレオチド配列を含み、ユニバーサルドナー細胞が、ＴＮＦＡＩＰ３を発現する、方法１６８から２２８までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２３０では、本開示は、ＴＮＦＡＩＰ３をコードするヌクレオチド配列が、配列番号１９から本質的になる、方法２２９において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２３１では、本開示は、（ａ）の核酸、（ｆ）の核酸、（ｇ）の核酸および／または（ｈ）の核酸が、ＣＤ３９をコードするヌクレオチド配列を含み、ユニバーサルドナー細胞が、ＣＤ３９を発現する、方法１６８から２３０までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２３２では、本開示は、ＣＤ３９をコードするヌクレオチド配列が、配列番号２７から本質的になる、方法２３１において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２３３では、本開示は、（ａ）の核酸、（ｆ）の核酸、（ｇ）の核酸および／または（ｈ）の核酸が、ＣＤ７３をコードするヌクレオチド配列を含み、ユニバーサルドナー細胞が、ＣＤ７３を発現する、方法１６８から２３２までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２３４では、本開示は、ＣＤ７３をコードするヌクレオチド配列が、配列番号４６から本質的になる、方法２３３において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２３５では、本開示は、（ａ）の核酸が、ＨＬＡクラスＩ組織適合性抗原、アルファ鎖Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）をコードするヌクレオチド配列をさらに含み、ユニバーサルドナー細胞が、ＨＬＡ－Ｅをさらに発現する、方法１６８から２３４までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２３６では、本開示は、（ｆ）の核酸、（ｇ）の核酸および／または（ｈ）の核酸が、ＨＬＡクラスＩ組織適合性抗原、アルファ鎖Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）をコードするヌクレオチド配列を含み、ユニバーサルドナー細胞が、ＨＬＡ－Ｅを発現する、方法１６８から２３５までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２３７では、本開示は、ＨＬＡ－Ｅをコードするヌクレオチド配列が、ＨＬＡ－Ｅ三量体をコードする配列を含み、ＨＬＡ－Ｅ三量体が、シグナルペプチドを有さないＨＬＡ－Ｅと融合したＢ２Ｍ膜タンパク質、それと融合したＨＬＡ－Ｇ提示ペプチド、それと融合したＢ２Ｍシグナルペプチドを含む、方法１６８から２３６までにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２３８では、本開示は、ＨＬＡ－Ｅをコードするヌクレオチド配列が、配列番号４３から本質的になる、方法２３５から２３７までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２３９では、本開示は、（ａ）の核酸、（ｆ）の核酸、（ｇ）の核酸および／または（ｈ）の核酸が、ＭＡＮＦをコードするヌクレオチド配列およびＨＬＡ－Ｅをコードするヌクレオチド配列を含み、ユニバーサルドナー細胞が、ＭＡＮＦおよびＨＬＡ－Ｅを発現する、方法２３５から２３８までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２４０では、本開示は、（ａ）の核酸、（ｆ）の核酸、（ｇ）の核酸および／または（ｈ）の核酸が、ＨＬＡ－Ｅをコードするヌクレオチド配列と連結した、Ｐ２Ａペプチドをコードするヌクレオチド配列、それと連結した、ＭＡＮＦをコードするヌクレオチド配列を含む、方法２３９において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２４１では、本開示は、（ａ）の核酸、（ｆ）の核酸、（ｇ）の核酸および／または（ｈ）の核酸が、配列番号５５からなるヌクレオチド配列を含む、方法２４０において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２４２では、本開示は、（ａ）の核酸が、プログラム死－リガンド１（ＰＤ－Ｌ－１）をコードするヌクレオチド配列をさらに含み、ユニバーサルドナー細胞が、ＰＤ－Ｌ－１をさらに発現する、方法１６８から２４１までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２４３では、本開示は、（ｆ）の核酸、（ｇ）の核酸および／または（ｈ）の核酸が、ＰＤ－Ｌ－１をコードするヌクレオチド配列を含み、ユニバーサルドナー細胞が、ＰＤ－Ｌ－１を発現する、方法１６８から２４２までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２４４では、本開示は、ＰＤ－Ｌ－１をコードするヌクレオチド配列が、配列番号２０から本質的になる、方法２４２または２４３において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２４５では、本開示は、（ａ）の核酸、（ｆ）の核酸、（ｇ）の核酸、および／または（ｈ）の核酸が、ＴＮＦＡＩＰ３をコードするヌクレオチド配列およびＰＤ－Ｌ－１をコードするヌクレオチド配列を含み、ユニバーサルドナー細胞が、ＴＮＦＡＩＰ３およびＰＤ－Ｌ－１を発現する、方法２４２から２４４までにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２４６では、本開示は、（ａ）の核酸、（ｆ）の核酸、（ｇ）の核酸、および／または（ｈ）の核酸が、ＰＤ－Ｌ－１をコードするヌクレオチド配列と連結したＰ２Ａペプチドをコードするヌクレオチド配列、それと連結したＴＮＦＡＩＰ３をコードするヌクレオチド配列を含む、方法２４２から２４５までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２４７では、本開示は、（ａ）の核酸、（ｆ）の核酸、（ｇ）の核酸、および／または（ｈ）の核酸が、配列番号５４から本質的になるヌクレオチド配列を含む、方法２４６において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２４８では、本開示は、（ａ）の核酸、（ｆ）の核酸、（ｇ）の核酸、および／または（ｈ）の核酸が、ＣＤ３９のヌクレオチド配列およびＰＤ－Ｌ－１をコードするヌクレオチド配列を含み、ユニバーサルドナー細胞が、ＣＤ３９およびＰＤ－Ｌ－１を発現する、方法２４２から２４７までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２４９では、本開示は、（ａ）の核酸、（ｆ）の核酸、（ｇ）の核酸、および／または（ｈ）の核酸が、ＰＤ－Ｌ－１をコードするヌクレオチド配列と連結したＰ２Ａペプチドをコードするヌクレオチド配列、それと連結したＣＤ３９のヌクレオチド配列を含む、方法２４８において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２５０では、本開示は、（ａ）の核酸、（ｆ）の核酸、（ｇ）の核酸、および／または（ｈ）の核酸が、配列番号５３から本質的になるヌクレオチド配列を含む、方法２４９において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２５１では、本開示は、（ａ）の核酸、（ｆ）の核酸、（ｇ）の核酸、および／または（ｈ）の核酸が、ＭＡＮＦをコードするヌクレオチド配列、ＴＮＦＡＩＰ３をコードするヌクレオチド配列、およびＰＤ－Ｌ－１をコードするヌクレオチド配列を含み、ユニバーサルドナー細胞が、ＭＡＮＦ、ＴＮＦＡＩＰ３およびＰＤ－Ｌ－１を発現する、方法１８５から２５０までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２５２では、本開示は、（ａ）の核酸、（ｆ）の核酸、（ｇ）の核酸、および／または（ｈ）の核酸が、Ｐ２Ａペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列によってＴＮＦＡＩＰ３をコードするヌクレオチド配列と連結したＭＡＮＦをコードするヌクレオチド配列、およびＰ２Ａペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列によってＰＤ－Ｌ－１をコードするヌクレオチド配列と連結したＴＮＦＡＩＰ３をコードするヌクレオチド配列を含む、方法２５１において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２５３では、本開示は、（ａ）の核酸、（ｆ）の核酸、（ｇ）の核酸、および／または（ｈ）の核酸が、配列番号５２から本質的になるヌクレオチド配列を含む、方法２５２において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２５４では、本開示は、（ａ）の核酸、（ｆ）の核酸、（ｇ）の核酸、および／または（ｈ）の核酸が、ＣＤ３９をコードするヌクレオチド配列、ＣＤ７３をコードするヌクレオチド配列およびＰＤ－Ｌ－１をコードするヌクレオチド配列を含み、ユニバーサルドナー細胞が、ＣＤ３９、ＣＤ７３およびＰＤ－Ｌ－１を発現する、方法１８５から２５３までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２５５では、本開示は、ＣＤ３９をコードするヌクレオチド配列が、ＣＤ７３をコードするヌクレオチド配列と、Ｐ２Ａペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列によって連結しており、ＣＤ７３をコードするヌクレオチド配列が、ＰＤ－Ｌ－１をコードするヌクレオチド配列と、Ｐ２Ａペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列によって連結している、方法２５４において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２５６では、本開示は、（ａ）の核酸、（ｆ）の核酸、（ｇ）の核酸、および／または（ｈ）の核酸が、配列番号５６から本質的になるヌクレオチド配列を含む、方法２５５において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２５７では、本開示は、（ａ）の核酸、（ｆ）の核酸、（ｇ）の核酸、および／または（ｈ）の核酸が、ＣＤ３９をコードするヌクレオチド配列およびＣＤ７３をコードするヌクレオチド配列を含み、ユニバーサルドナー細胞が、ＣＤ３９およびＣＤ７３を発現する、方法１６８から２５６までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２５８では、本開示は、ＣＤ３９をコードするヌクレオチド配列が、ＣＤ７３をコードするヌクレオチド配列と、Ｐ２Ａペプチドをコードするヌクレオチド配列によって連結している、方法２５７において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２５９では、本開示は、（ａ）の核酸、（ｆ）の核酸、（ｇ）の核酸、および／または（ｈ）の核酸が、配列番号５８から本質的になるヌクレオチド配列を含む、方法２５８において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２６０では、本開示は、（ａ）、（ｆ）、（ｇ）、および／または（ｈ）の核酸のいずれかのヌクレオチド配列が、外因性プロモーターに作動可能に連結している、方法１６８から２５９までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２６１では、本開示は、外因性プロモーターが、ＣＭＶ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、ＣＡＧ、またはＵＢＣプロモーターである、方法２６０において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２６２では、本開示は、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）および／または（ｈ）のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼとｇＲＮＡが、約１：１～約１：１０の比で存在する、方法１６８から２６１までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２６３では、本開示は、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、および／または（ｈ）のそれぞれのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼとｇＲＮＡが、約１：１～約１：１０の比で存在する、方法１６８から２６２までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２６４では、本開示は、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、および／または（ｈ）のそれぞれのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、方法１６８から２６３までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２６５では、本開示は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼが、少なくとも１つの核局在化シグナルと連結している、方法２６４において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２６６では、本開示は、幹細胞が、胚性幹細胞、成体幹細胞、人工多能性幹細胞、または造血幹細胞である、方法１６８から２６４までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２６７では、本開示は、幹細胞が、ヒト幹細胞である、方法１６８から２６６までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２６８では、本開示は、ユニバーサルドナー細胞が、核酸挿入および／または遺伝子破壊がなされていない同等の細胞と比較して、免疫回避および／または移植後生存の増大を有する、方法１から２６７までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２６９では、本開示は、ユニバーサルドナー細胞を生成するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、（ａ）第１のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼおよびベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子座における標的部位を標的とする第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；（ｂ）核酸を含む第１のベクターであって、核酸が、（ｉ）腫瘍壊死因子アルファ誘導タンパク質３（ＴＮＦＡＩＰ３）をコードするヌクレオチド配列およびプログラム死－リガンド１（ＰＤ－Ｌ－１）をコードするヌクレオチド配列；（ｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子座における標的部位の左側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列；ならびに（ｉｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子座における標的部位の右側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列を含み、（ｉ）が、（ｉｉ）と（ｉｉｉ）に挟まれている、第１のベクター、を幹細胞に送達するステップであって、Ｂ２Ｍ遺伝子座を標的部位において切断し、ＴＮＦＡＩＰ３およびＰＤ－Ｌ－１をコードするヌクレオチド配列を含む核酸をＢ２Ｍ遺伝子座に挿入し、それにより、Ｂ２Ｍ遺伝子を破壊する、ステップを含み、ユニバーサルドナー細胞が、ＴＮＦＡＩＰ３およびＰＤ－Ｌ－１を発現し、核酸挿入および遺伝子破壊がなされていない同等の細胞と比較して、免疫回避および／または移植後生存の増大を有する、方法を提供する。
別の方法、方法２７０では、本開示は、Ｂ２Ｍ遺伝子を破壊することが、Ｂ２Ｍの発現を低減または排除することを含む、方法２６９において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２７１では、本開示は、（ｂ）（ｉ）のヌクレオチド配列が、ＰＤ－Ｌ－１をコードするヌクレオチド配列と連結したＰ２Ａペプチドをコードするヌクレオチド配列、それと連結したＴＮＦＡＩＰ３をコードするヌクレオチド配列を含む、方法２６９または２７０において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２７２では、本開示は、（ｂ）（ｉ）のヌクレオチド配列が、配列番号５４を含む、方法２６９から２７１までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２７３では、本開示は、（ｂ）（ｉ）のヌクレオチド配列が、外因性プロモーターに作動可能に連結している、方法２６９から２７２までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２７４では、本開示は、外因性プロモーターが、ＣＭＶ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、ＣＡＧ、またはＵＢＣプロモーターである、方法２７３において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２７５では、本開示は、（ｂ）（ｉｉ）のヌクレオチド配列が、配列番号１５を含むまたはそれから本質的になる、方法２６９から２７４までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２７６では、本開示は、（ｂ）（ｉｉｉ）のヌクレオチド配列が、配列番号２２を含むまたはそれから本質的になる、方法２６９から２７５までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２７７では、本開示は、第１のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと第１のｇＲＮＡが、約１：１～約１：１０の比で存在する、方法２６９から２７６までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２７８では、本開示は、第１のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが、第１のＣａｓ９ヌクレアーゼである、方法２６９から２７７までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２７９では、本開示は、第１のＣａｓ９ヌクレアーゼが、少なくとも１つの核局在化シグナルと連結している、方法２７８において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２８０では、本開示は、（ｃ）第２のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼおよびチオレドキシン相互作用タンパク質（ＴＸＮＩＰ）遺伝子座における標的部位を標的とする第２のｇＲＮＡ；ならびに（ｄ）核酸を含む第２のベクターであって、核酸が、（ｉ）中脳アストロサイト由来神経栄養因子（ＭＡＮＦ）をコードするヌクレオチド配列およびＨＬＡクラスＩ組織適合性抗原、アルファ鎖Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）をコードするヌクレオチド配列；（ｉｉ）ＴＸＮＩＰ遺伝子座における標的部位の左側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列；ならびに（ｉｉｉ）ＴＸＮＩＰ遺伝子座における標的部位の右側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列を含み、（ｉ）が、（ｉｉ）と（ｉｉｉ）に挟まれている、第２のベクターを幹細胞に送達するステップであって、ＴＸＮＩＰ遺伝子座を標的部位において切断し、ＭＡＮＦおよびＨＬＡ－Ｅをコードするヌクレオチド配列を含む核酸をＴＸＮＩＰ遺伝子座に挿入し、それにより、ＴＸＮＩＰ遺伝子を破壊する、ステップをさらに含み、ユニバーサルドナー細胞が、ＭＡＮＦおよびＨＬＡ－Ｅをさらに発現する、方法２６９から２７９までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２８１では、本開示は、ＴＸＮＩＰ遺伝子を破壊することが、ＴＸＮＩＰの発現を低減または排除することを含む、方法２８０において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２８２では、本開示は、ＨＬＡ－Ｅをコードするヌクレオチド配列が、ＨＬＡ－Ｅ三量体をコードする配列を含み、ＨＬＡ－Ｅ三量体が、シグナルペプチドを有さないＨＬＡ－Ｅと融合したＢ２Ｍ膜タンパク質、それと融合したＨＬＡ－Ｇ提示ペプチド、それと融合したＢ２Ｍシグナルペプチドを含む、方法２８０または２８１において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２８３では、本開示は、（ｄ）（ｉ）のヌクレオチド配列が、ＨＬＡ－Ｅをコードするヌクレオチド配列と連結した、Ｐ２Ａペプチドをコードするヌクレオチド配列、それと連結した、ＭＡＮＦをコードするヌクレオチド配列を含む、方法２８０から２８２までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２８４では、本開示は、（ｄ）（ｉ）のヌクレオチド配列が、配列番号５５を含む、方法２８０から２８３までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２８５では、本開示は、（ｄ）（ｉ）のヌクレオチド配列が、外因性プロモーターに作動可能に連結している、方法２８０から２８４までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２８６では、本開示は、外因性プロモーターが、ＣＭＶ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、ＣＡＧ、またはＵＢＣプロモーターである、方法２８５において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２８７では、本開示は、（ｄ）（ｉｉ）のヌクレオチド配列が、配列番号４２から本質的になる、方法２８０から２８６までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２８８では、本開示は、（ｄ）（ｉｉｉ）のヌクレオチド配列が、配列番号４４から本質的になる、方法２８０から２８７までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２８９では、本開示は、第２のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと第２のｇＲＮＡが、約１：１～約１：１０の比で存在する、方法２８０から２８８までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２９０では、本開示は、第２のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが、第２のＣａｓ９ヌクレアーゼである、方法２８０から２８９までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２９１では、本開示は、第２のＣａｓ９ヌクレアーゼが、少なくとも１つの核局在化シグナルと連結している、方法２９０において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２９２では、本開示は、幹細胞が、胚性幹細胞、成体幹細胞、人工多能性幹細胞、または造血幹細胞である、方法２６９から２９１までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法２９３では、本開示は、幹細胞が、ヒト幹細胞である、方法２６９から２９２までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の組成物、組成物２９４では、本開示は、ベータ２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、チオレドキシン相互作用タンパク質（ＴＸＮＩＰ）、またはクラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）をコードする遺伝子の内部またはその近傍に挿入された中脳アストロサイト由来神経栄養因子（ＭＡＮＦ）をコードするヌクレオチド配列、腫瘍壊死因子アルファ誘導タンパク質３（ＴＮＦＡＩＰ３）をコードするヌクレオチド配列、分化抗原群７３（ＣＤ７３）をコードするヌクレオチド配列、および／または分化抗原群３９（ＣＤ３９）をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子改変された細胞を含む組成物であって、遺伝子改変された細胞が、ＭＡＮＦ、ＴＮＦＡＩＰ３、ＣＤ７３、および／またはＣＤ３９を発現し、Ｂ２Ｍ、ＴＸＮＩＰ、および／またはＣＩＩＴＡの発現の破壊を有する、組成物を提供する。
別の組成物、組成物２９５では、本開示は、Ｂ２Ｍ、ＴＸＮＩＰ、および／またはＣＩＩＴＡの発現の破壊が、Ｂ２Ｍ、ＴＸＮＩＰ、および／またはＣＩＩＴＡの発現の低減または排除を含む、組成物２９４による組成物を提供する。
別の組成物、組成物２９６では、本開示は、Ｂ２Ｍ、ＴＸＮＩＰ、またはＣＩＩＴＡ遺伝子の内部またはその近傍に挿入されたプログラム死－リガンド１（ＰＤ－Ｌ－１）をコードするヌクレオチド配列および／またはＨＬＡクラスＩ組織適合性抗原、アルファ鎖Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、組成物２９４または２９５による組成物を提供する。
別の組成物、組成物２９７では、本開示は、ＨＬＡ－Ｅをコードするヌクレオチド配列が、ＨＬＡ－Ｅ三量体をコードする配列を含み、ＨＬＡ－Ｅ三量体が、シグナルペプチドを有さないＨＬＡ－Ｅと融合したＢ２Ｍ膜タンパク質、それと融合したＨＬＡ－Ｇ提示ペプチド、それと融合したＢ２Ｍシグナルペプチドを含む、組成物２９６による組成物を提供する。
別の組成物、組成物２９８では、本開示は、遺伝子改変された細胞が、ＴＸＮＩＰ遺伝子の内部またはその近傍に挿入されたＭＡＮＦをコードするヌクレオチド配列およびＨＬＡ－Ｅをコードするヌクレオチド配列を含む、組成物２９６または２９７による組成物を提供する。
別の組成物、組成物２９９では、本開示は、ＭＡＮＦをコードするヌクレオチド配列およびＨＬＡ－Ｅをコードするヌクレオチド配列が、外因性プロモーターに作動可能に連結している、組成物２９８による組成物を提供する。
別の組成物、組成物３００では、本開示は、ＭＡＮＦをコードするヌクレオチド配列が、ＨＬＡ－Ｅをコードするヌクレオチド配列と、リボソームスキップをコードするヌクレオチド配列によって連結している、組成物２９８または２９９による組成物を提供する。
別の組成物、組成物３０１では、本開示は、リボソームスキップが、２Ａ配列ファミリーメンバーである、組成物３００による組成物を提供する。
別の組成物、組成物３０２では、本開示は、遺伝子改変された細胞が、Ｂ２Ｍ遺伝子の内部またはその近傍に挿入されたＴＮＦＡＩＰ３をコードするヌクレオチド配列およびＰＤ－Ｌ－１をコードするヌクレオチド配列を含む、組成物２９４から３０１までのいずれか１つによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物３０３では、本開示は、ＴＮＦＡＩＰ３をコードするヌクレオチド配列およびＰＤ－Ｌ－１をコードするヌクレオチド配列が、外因性プロモーターに作動可能に連結している、組成物３０２による組成物を提供する。
別の組成物、組成物３０４では、本開示は、ＴＮＦＡＩＰ３をコードするヌクレオチド配列が、ＰＤ－Ｌ－１をコードするヌクレオチド配列と、リボソームスキップをコードするヌクレオチド配列によって連結している、組成物３０２または３０３による組成物を提供する。
別の組成物、組成物３０５では、本開示は、リボソームスキップが、２Ａ配列ファミリーメンバーである、組成物３０４による組成物を提供する。
別の組成物、組成物３０６では、本開示は、遺伝子改変された細胞が、Ｂ２Ｍ遺伝子の内部またはその近傍に挿入されたＴＮＦＡＩＰ３をコードするヌクレオチド配列、ＭＡＮＦをコードするヌクレオチド配列、およびＰＤ－Ｌ－１をコードするヌクレオチド配列を含む、組成物２９６または２９７による組成物を提供する。
別の組成物、組成物３０７では、本開示は、ＴＮＦＡＩＰ３をコードするヌクレオチド配列、ＭＡＮＦをコードするヌクレオチド配列、およびＰＤ－Ｌ－１をコードするヌクレオチド配列が、外因性プロモーターに作動可能に連結している、組成物３０６による組成物を提供する。
別の組成物、組成物３０８では、本開示は、ＴＮＦＡＩＰ３をコードするヌクレオチド配列が、ＭＡＮＦをコードするヌクレオチド配列と、リボソームスキップをコードするヌクレオチド配列によって連結しており、ＭＡＮＦをコードするヌクレオチド配列が、ＰＤ－Ｌ－１をコードするヌクレオチド配列と、リボソームスキップをコードするヌクレオチド配列によって連結している、組成物３０６または３０７による組成物を提供する。
別の組成物、組成物３０９では、本開示は、リボソームスキップが、２Ａ配列ファミリーメンバーである、組成物３０８による組成物を提供する。
別の組成物、組成物３１０では、本開示は、遺伝子改変された細胞が、ＣＩＩＴＡ遺伝子の内部またはその近傍に挿入されたＣＤ３９をコードするヌクレオチド配列を含む、組成物２９４から３０９までのいずれか１つによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物３１１では、本開示は、ＣＤ３９をコードするヌクレオチド配列が、外因性プロモーターに作動可能に連結している、組成物３１０による組成物を提供する。
別の組成物、組成物３１２では、本開示は、遺伝子改変された細胞が、Ｂ２Ｍ遺伝子の内部またはその近傍に挿入されたＣＤ３９をコードするヌクレオチド配列およびＰＤ－Ｌ－１をコードするヌクレオチド配列を含む、組成物２９６または２９７による組成物を提供する。
別の組成物、組成物３１３では、本開示は、ＣＤ３９をコードするヌクレオチド配列およびＰＤ－Ｌ－１をコードするヌクレオチド配列が、外因性プロモーターに作動可能に連結している、組成物３１２による組成物を提供する。
別の組成物、組成物３１４では、本開示は、ＣＤ３９をコードするヌクレオチド配列が、ＰＤ－Ｌ－１をコードするヌクレオチド配列と、リボソームスキップをコードするヌクレオチド配列によって連結している、組成物３１２または３１３による組成物を提供する。
別の組成物、組成物３１５では、本開示は、リボソームスキップが、２Ａ配列ファミリーメンバーである、組成物３１４による組成物を提供する。
別の組成物、組成物３１６では、本開示は、Ｂ２Ｍ遺伝子の内部もしくはその近傍に挿入されたＰＤ－Ｌ－１をコードするヌクレオチド配列、ＴＸＮＩＰ遺伝子の内部もしくはその近傍に挿入されたＨＬＡ－Ｅをコードするヌクレオチド配列、および／またはＣＩＩＴＡ遺伝子もしくはＢ２Ｍ遺伝子の内部もしくはその近傍に挿入されたＣＤ３９をコードするヌクレオチド配列を含む組成物であって、遺伝子改変された細胞が、ＰＤ－Ｌ－１、ＨＬＡ－Ｅ、および／またはＣＤ３９を発現し、Ｂ２Ｍ、ＴＸＮＩＰ、および／またはＣＩＩＴＡの発現の破壊を有する、組成物を提供する。
別の組成物、組成物３１７では、本開示は、Ｂ２Ｍ、ＴＸＮＩＰ、および／またはＣＩＩＴＡの発現の破壊が、Ｂ２Ｍ、ＴＸＮＩＰ、および／またはＣＩＩＴＡの発現の低減または排除を含む、組成物３１６による組成物を提供する。
別の組成物、組成物３１８では、本開示は、細胞が、幹細胞である、組成物２９４から３１７までのいずれか１つによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物３１９では、本開示は、幹細胞が、胚性幹細胞、成体幹細胞、人工多能性幹細胞、または造血幹細胞である、組成物３１８による組成物を提供する。
別の組成物、組成物３２０では、本開示は、細胞が、分化した細胞または体細胞である、組成物２９４から３１９までのいずれか１つによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物３２１では、本開示は、細胞が、系列が制限された前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）または完全に分化した体細胞に分化する、組成物３２０による組成物を提供する。
別の組成物、組成物３２２では、本開示は、系列が制限された前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）が、胚体内胚葉細胞、未分化腸管細胞、後方前腸細胞、膵臓内胚葉前駆体、膵臓内分泌前駆体、または膵内分泌細胞であり、完全に分化した体細胞が、未成熟ベータ細胞または成熟ベータ細胞である、組成物３２１による組成物を提供する。
別の組成物、組成物３２３では、本開示は、請求項２９４から３２２までのいずれか一項に記載の複数の遺伝子改変された細胞を含む組成物を提供する。
別の組成物、組成物３２４では、本開示は、細胞の少なくとも約５０％が、ＭＡＮＦ、ＨＬＡ－Ｅ、ＴＮＦＡＩＰ３、ＰＤ－Ｌ－１、および／またはＣＤ３９を発現する、組成物３２３による組成物を提供する。
別の組成物、組成物３２５では、本開示は、組成物３２３または３２４の複数の遺伝子改変された細胞に由来する系列が制限された前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）または完全に分化した体細胞の集団を含む組成物を提供する。
別の組成物、組成物３２６では、本開示は、系列が制限された前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）が、胚体内胚葉細胞、未分化腸管細胞、後方前腸細胞、膵臓内胚葉前駆体、膵臓内分泌前駆体、または膵内分泌細胞であり、完全に分化した体細胞が、未成熟ベータ細胞または成熟ベータ細胞である、組成物３２５による組成物を提供する。
別の組成物、組成物３２７では、本開示は、細胞の少なくとも約５０％が、ＭＡＮＦ、ＨＬＡ－Ｅ、ＴＮＦＡＩＰ３、ＰＤ－Ｌ－１、および／またはＣＤ３９を発現する、組成物３２５または３２６による組成物を提供する。
別の組成物、組成物３２８では、本開示は、組成物３２３もしくは３２４の複数の細胞または組成物３２５から３２７までのいずれか１つの細胞の集団を含む組成物を提供する。
別の組成物、組成物３２９では、本開示は、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、組成物３２８による組成物を提供する。
別の組成物、組成物３３０では、本開示は、それを必要とする対象の処置における使用のための、組成物３２８または３２９による組成物を提供する。
別の組成物、組成物３３１では、本開示は、対象が、疾患または障害を有する、それを有する疑いがある、またはそのリスクがある、組成物３３０による組成物を提供する。
別の組成物、組成物３３２では、本開示は、疾患または障害が、Ｉ型糖尿病などの遺伝性疾患である、組成物３３０または３３１による組成物を提供する。
別の組成物、組成物３３３では、本開示は、疾患または障害が、ＩＩ型糖尿病または膵切除である、組成物３３２による組成物を提供する。
別の組成物、組成物３３４では、本開示は、対象が、ヒトである、組成物３２８から３３３までのいずれか１つによる組成物を提供する。
別の方法、方法３３５では、本開示は、それを必要とする対象における膵疾患または障害を処置するための方法であって、（ａ）請求項２９４から３２２までのいずれか一項に記載の複数の遺伝子改変された細胞を、膵臓内胚葉細胞、膵内分泌細胞、未成熟ベータ細胞、または成熟ベータ細胞への分化後に得るまたは得ておくステップ；ならびに（ｂ）膵臓内胚葉細胞、膵内分泌細胞、未成熟ベータ細胞、または成熟ベータ細胞を対象に投与するステップを含む、方法を提供する。
別の方法、方法３３６では、本開示は、投与するステップが、膵臓内胚葉細胞、膵内分泌細胞、未成熟ベータ細胞、または成熟ベータ細胞を含むデバイスを対象に埋め込むことを含む、方法３３５において提供される方法を提供する。
別の方法、方法３３７では、本開示は、膵疾患または障害が、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、または膵切除である、方法３３５または３３６において提供される方法を提供する。
別の方法、方法３３８では、本開示は、対象が、ヒトである、方法３３５から３３７までのいずれか１つにおいて提供される方法を提供する。
別の方法、方法３３９では、本開示は、ユニバーサルドナー細胞を生成するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、（ａ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと、ベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子座における標的部位を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体；（ｂ）核酸を含むベクターであって、核酸が、（ｉ）腫瘍壊死因子アルファ誘導タンパク質３（ＴＮＦＡＩＰ３）をコードするヌクレオチド配列およびプログラム死－リガンド１（ＰＤ－Ｌ－１）をコードするヌクレオチド配列；（ｉｉ）配列番号１５から本質的になり、Ｂ２Ｍ遺伝子座における標的部位の左側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列；ならびに（ｉｉｉ）配列番号２２から本質的になり、Ｂ２Ｍ遺伝子座における標的部位の右側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列を含み、（ｉ）が、（ｉｉ）と（ｉｉｉ）に挟まれている、ベクターを幹細胞に送達するステップであって、Ｂ２Ｍ遺伝子座を標的部位において切断し、ＴＮＦＡＩＰ３およびＰＤ－Ｌ－１をコードするヌクレオチド配列を含む核酸をＢ２Ｍ遺伝子座に挿入し、それにより、Ｂ２Ｍ遺伝子を破壊する、ステップを含み、ユニバーサルドナー細胞が、核酸挿入および遺伝子破壊がなされていない同等の細胞と比較して、免疫回避および／または移植後生存の増大を有する、方法を提供する。
別の方法、方法３４０では、本開示は、（ｂ）（ｉ）のヌクレオチド配列が、ＰＤ－Ｌ－１をコードするヌクレオチド配列と連結したリボソームスキップをコードするヌクレオチド配列、それと連結したＴＮＦＡＩＰ３をコードするヌクレオチド配列を含む、方法３３９において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法３４１では、本開示は、ユニバーサルドナー細胞を生成するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、（ａ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと、チオレドキシン相互作用タンパク質（ＴＸＮＩＰ）遺伝子座における標的部位を標的とするｇＲＮＡとを含むＲＮＰ複合体；ならびに（ｂ）核酸を含むベクターであって、核酸が、（ｉ）中脳アストロサイト由来神経栄養因子（ＭＡＮＦ）をコードするヌクレオチド配列およびＨＬＡクラスＩ組織適合性抗原、アルファ鎖Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）をコードするヌクレオチド配列；（ｉｉ）配列番号４２から本質的になり、ＴＸＮＩＰ遺伝子座における標的部位の左側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列；ならびに（ｉｉｉ）配列番号４４から本質的になり、ＴＸＮＩＰ遺伝子座における標的部位の右側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列を含み、（ｉ）が、（ｉｉ）と（ｉｉｉ）に挟まれている、ベクターを幹細胞に送達するステップであって、ＴＸＮＩＰ遺伝子座を標的部位において切断し、ＭＡＮＦおよびＨＬＡ－Ｅをコードするヌクレオチド配列を含む核酸をＴＸＮＩＰ遺伝子座に挿入し、それにより、ＴＸＮＩＰ遺伝子を破壊する、ステップ；ならびにユニバーサルドナー細胞を生成するステップであって、ユニバーサルドナー細胞が、核酸挿入および遺伝子破壊がなされていない同等の細胞と比較して、免疫回避および／または移植後生存の増大を有する、ステップを含む、方法を提供する。
別の方法、方法３４２では、本開示は、ＨＬＡ－Ｅをコードするヌクレオチド配列が、ＨＬＡ－Ｅ三量体をコードする配列を含み、ＨＬＡ－Ｅ三量体が、シグナルペプチドを有さないＨＬＡ－Ｅと融合したＢ２Ｍ膜タンパク質、それと融合したＨＬＡ－Ｇ提示ペプチド、それと融合したＢ２Ｍシグナルペプチドを含む、方法３４１において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法３４３では、本開示は、（ｂ）（ｉ）のヌクレオチド配列が、ＨＬＡ－Ｅをコードするヌクレオチド配列と連結したリボソームスキップをコードするヌクレオチド配列、それと連結したＭＡＮＦをコードするヌクレオチド配列を含む、方法３４１または３４２において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法３４４では、本開示は、（ｂ）（ｉ）のリボソームスキップが、２Ａ配列ファミリーメンバーである、方法３４０または３４３において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法３４５では、本開示は、ユニバーサルドナー細胞を生成するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、（ａ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと、クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子座における標的部位を標的とするｇＲＮＡとを含むＲＮＰ複合体；ならびに（ｂ）核酸を含むベクターであって、核酸が、（ｉ）分化抗原群３９（ＣＤ３９）をコードするヌクレオチド配列；（ｉｉ）配列番号２６から本質的になり、ＣＩＩＴＡ遺伝子座における標的部位の左側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列；および（ｉｉｉ）配列番号２８から本質的になり、ＣＩＩＴＡ遺伝子座における標的部位の右側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列を含み、（ｉ）が、（ｉｉ）と（ｉｉｉ）に挟まれている、ベクターを幹細胞に送達するステップであって、ＣＩＩＴＡ遺伝子座を標的部位において切断し、ＣＤ３９をコードするヌクレオチド配列を含む核酸をＣＩＩＴＡ遺伝子座に挿入し、それにより、ＣＩＩＴＡ遺伝子を破壊する、ステップ；ならびにユニバーサルドナー細胞を生成するステップであって、ユニバーサルドナー細胞が、核酸挿入および遺伝子破壊がなされていない同等の細胞と比較して、免疫回避および／または移植後生存の増大を有する、ステップを含む、方法を提供する。
別の方法、方法３４６では、本開示は、（ｂ）（ｉ）のヌクレオチド配列が、外因性プロモーターに作動可能に連結している、方法３３９から３４５までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法３４７では、本開示は、外因性プロモーターが、ＣＭＶ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、ＣＡＧ、またはＵＢＣプロモーターである、方法３４６において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法３４８では、本開示は、ユニバーサルドナー細胞を生成するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、（ａ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと、ベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子座における標的部位を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを含む第１のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体；（ｂ）核酸を含む第１のベクターであって、核酸が、（ｉ）腫瘍壊死因子アルファ誘導タンパク質３（ＴＮＦＡＩＰ３）をコードするヌクレオチド配列およびプログラム死－リガンド１（ＰＤ－Ｌ－１）をコードするヌクレオチド配列；（ｉｉ）配列番号１５から本質的になり、Ｂ２Ｍ遺伝子座における標的部位の左側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列；ならびに（ｉｉｉ）配列番号２２から本質的になり、Ｂ２Ｍ遺伝子座における標的部位の右側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列を含み、（ｉ）が、（ｉｉ）と（ｉｉｉ）に挟まれており、Ｂ２Ｍ遺伝子座を標的部位において切断し、ＴＮＦＡＩＰ３およびＰＤ－Ｌ－１をコードするヌクレオチド配列を含む核酸をＢ２Ｍ遺伝子座に挿入し、それにより、Ｂ２Ｍ遺伝子を破壊する、第１のベクター；（ｃ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと、チオレドキシン相互作用タンパク質（ＴＸＮＩＰ）遺伝子座における標的部位を標的とするｇＲＮＡとを含む第２のＲＮＰ複合体；および（ｄ）核酸を含む第２のベクターであって、核酸が、（ｉ）中脳アストロサイト由来神経栄養因子（ＭＡＮＦ）をコードするヌクレオチド配列およびＨＬＡクラスＩ組織適合性抗原、アルファ鎖Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）をコードするヌクレオチド配列；（ｉｉ）配列番号４２から本質的になり、ＴＸＮＩＰ遺伝子座における標的部位の左側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列；ならびに（ｉｉｉ）配列番号４４から本質的になり、ＴＸＮＩＰ遺伝子座における標的部位の右側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列を含み、（ｉ）が、（ｉｉ）と（ｉｉｉ）に挟まれており、ＴＸＮＩＰ遺伝子座を標的部位において切断し、ＭＡＮＦおよびＨＬＡ－Ｅをコードするヌクレオチド配列を含む核酸をＴＸＮＩＰ遺伝子座に挿入し、それにより、ＴＸＮＩＰ遺伝子を破壊する、第２のベクターを幹細胞に送達するステップ；ならびにユニバーサルドナー細胞を生成するステップであって、ユニバーサルドナー細胞が、核酸挿入および遺伝子破壊がなされていない同等の細胞と比較して、免疫回避および／または移植後生存の増大を有する、ステップを含む、方法を提供する。
別の方法、方法３４９では、本開示は、（ｅ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと、クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子座における標的部位を標的とするｇＲＮＡとを含む第３のＲＮＰ複合体；および（ｆ）核酸を含む第３のベクターであって、核酸が、（ｉ）分化抗原群３９（ＣＤ３９）をコードするヌクレオチド配列；（ｉｉ）配列番号２６から本質的になり、ＣＩＩＴＡ遺伝子座における標的部位の左側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列；および（ｉｉｉ）配列番号２８から本質的になり、ＣＩＩＴＡ遺伝子座における標的部位の右側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列を含み、（ｉ）が、（ｉｉ）と（ｉｉｉ）に挟まれている、第３のベクターを幹細胞に送達するステップであって、ＣＩＩＴＡ遺伝子座を標的部位において切断し、ＣＤ３９をコードするヌクレオチド配列を含む核酸をＣＩＩＴＡ遺伝子座に挿入し、それにより、ＣＩＩＴＡ遺伝子を破壊する、ステップをさらに含む、方法３４８において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法３５０では、本開示は、ＨＬＡ－Ｅをコードするヌクレオチド配列が、ＨＬＡ－Ｅ三量体をコードする配列を含み、ＨＬＡ－Ｅ三量体が、シグナルペプチドを有さないＨＬＡ－Ｅと融合したＢ２Ｍ膜タンパク質、それと融合したＨＬＡ－Ｇ提示ペプチド、それと融合したＢ２Ｍシグナルペプチドを含む、方法２９４から３４９までにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法３５１では、本開示は、（ｂ）（ｉ）のヌクレオチド配列が、ＰＤ－Ｌ－１をコードする配列と連結したリボソームスキップをコードする配列、それと連結したＴＮＦＡＩＰ３をコードする配列を含み、（ｄ）（ｉ）のヌクレオチド配列が、ＨＬＡ－Ｅをコードする配列と連結したリボソームスキップをコードする配列、それと連結したＭＡＮＦをコードする配列を含む、方法２９４から３５０までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法３５２では、本開示は、（ｂ）（ｉ）および（ｄ）（ｉ）のそれぞれのリボソームスキップが、２Ａ配列ファミリーメンバーである、方法３５１において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法３５３では、本開示は、（ｂ）（ｉ）、（ｄ）（ｉ）、および（ｆ）（ｉ）のそれぞれのヌクレオチド配列が、外因性プロモーターに作動可能に連結している、方法２９４から３５２までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法３５４では、本開示は、外因性プロモーターが、ＣＭＶ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、ＣＡＧ、またはＵＢＣプロモーターである、方法３５３において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法３５５では、本開示は、ユニバーサルドナー細胞を生成するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、（ａ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと、ベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子座における標的部位を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを含む第１のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体；（ｂ）核酸を含む第１のベクターであって、核酸が、（ｉ）腫瘍壊死因子アルファ誘導タンパク質３（ＴＮＦＡＩＰ３）をコードするヌクレオチド配列、ＭＡＮＦをコードするヌクレオチド配列、およびプログラム死－リガンド１（ＰＤ－Ｌ－１）をコードするヌクレオチド配列；（ｉｉ）配列番号１５から本質的になり、Ｂ２Ｍ遺伝子座における標的部位の左側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列；ならびに（ｉｉｉ）配列番号２２から本質的になり、Ｂ２Ｍ遺伝子座における標的部位の右側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列を含み、（ｉ）が、（ｉｉ）と（ｉｉｉ）に挟まれている、第１のベクターを幹細胞に送達するステップであって、Ｂ２Ｍ遺伝子座を標的部位において切断し、ＴＮＦＡＩＰ３、ＭＡＮＦ、およびＰＤ－Ｌ－１をコードするヌクレオチド配列を含む核酸をＢ２Ｍ遺伝子座に挿入し、それにより、Ｂ２Ｍ遺伝子を破壊する、ステップ；ならびにユニバーサルドナー細胞を生成するステップであって、ユニバーサルドナー細胞が、核酸挿入および遺伝子破壊がなされていない同等の細胞と比較して、免疫回避および／または移植後生存の増大を有する、ステップを含む、方法を提供する。
別の方法、方法３５６では、本開示は、（ｃ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと、クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子座における標的部位を標的とするｇＲＮＡとを含む第２のＲＮＰ複合体；および（ｄ）核酸を含む第２のベクターであって、核酸が、（ｉ）分化抗原群３９（ＣＤ３９）をコードするヌクレオチド配列；（ｉｉ）配列番号２６から本質的になり、ＣＩＩＴＡ遺伝子座における標的部位の左側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列；および（ｉｉｉ）配列番号２８から本質的になり、ＣＩＩＴＡ遺伝子座における標的部位の右側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列を含み、（ｉ）が、（ｉｉ）と（ｉｉｉ）に挟まれている、第２のベクターを幹細胞に送達するステップであって、ＣＩＩＴＡ遺伝子座を標的部位において切断し、ＣＤ３９をコードするヌクレオチド配列を含む核酸をＣＩＩＴＡ遺伝子座に挿入し、それにより、ＣＩＩＴＡ遺伝子を破壊する、ステップをさらに含む、方法３５５において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法３５７では、本開示は、（ｂ）（ｉ）のヌクレオチド配列が、リボソームスキップをコードするヌクレオチド配列によってＭＡＮＦをコードするヌクレオチド配列と連結したＴＮＦＡＩＰ３をコードするヌクレオチド配列、およびリボソームスキップをコードするヌクレオチド配列によってＰＤ－Ｌ－１をコードするヌクレオチド配列と連結したＭＡＮＦをコードするヌクレオチド配列を含む、方法３５５または３５６において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法３５８では、本開示は、リボソームスキップが、２Ａ配列ファミリーメンバーである、方法３５７において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法３５９では、本開示は、（ｂ）（ｉ）のヌクレオチド配列が、外因性プロモーターに作動可能に連結している、方法３５７から３５８までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法３６０では、本開示は、（ｄ）（ｉ）のヌクレオチド配列が、外因性プロモーターに作動可能に連結している、方法３５６から３５９までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法３６１では、本開示は、外因性プロモーターが、ＣＭＶ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、ＣＡＧ、またはＵＢＣプロモーターである、方法３５９または３６０において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法３６２では、本開示は、各ＲＮＰ複合体が、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼのｇＲＮＡに対する約１：１～約１：１０のモル比を含む、方法３３９から３６１までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法３６３では、本開示は、各ＲＮＰ複合体のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、方法３３９から３６２までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法３６４では、本開示は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼが、少なくとも１つの核局在化シグナルと連結している、方法３６３において提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法３６５では、本開示は、幹細胞が、胚性幹細胞、成体幹細胞、人工多能性幹細胞、または造血幹細胞である、方法３３９から３６２までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法３６６では、本開示は、幹細胞が、ヒト幹細胞である、方法３３９から３６５までのいずれか１つにおいて提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の組成物、組成物３６７では、本開示は、方法３３９から３６６までのいずれか１つによって生成された複数のユニバーサルドナー細胞を含む組成物を提供する。
別の組成物、組成物３６８では、本開示は、細胞の少なくとも約５０％が、ＭＡＮＦ、ＨＬＡ－Ｅ、ＴＮＦＡＩＰ３、ＰＤ－Ｌ－１、および／またはＣＤ３９を発現する、組成物３６７による組成物を提供する。
別の組成物、組成物３６９では、本開示は、組成物３６７または３６８の複数のユニバーサルドナー細胞に由来する系列が制限された前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）または完全に分化した体細胞の集団を含む組成物を提供する。
別の組成物、組成物３７０では、本開示は、系列が制限された前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）が、胚体内胚葉細胞、未分化腸管細胞、後方前腸細胞、膵臓内胚葉前駆体、膵臓内分泌前駆体、膵内分泌細胞、未成熟ベータ細胞、または成熟ベータ細胞（ｍａｔｕｒｉｎｇ ｂｅｔａ ｃｅｌｌ）であり、完全に分化した体細胞が、膵ベータ細胞である、組成物３６９による組成物を提供する。
別の組成物、組成物３７１では、本開示は、細胞の少なくとも約５０％が、ＭＡＮＦ、ＨＬＡ－Ｅ、ＴＮＦＡＩＰ３、ＰＤ－Ｌ－１、および／またはＣＤ３９を発現する、組成物３６９から３７０までによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物３７２では、本開示は、組成物３６７もしくは３６８のいずれか１つの複数の細胞または組成物３６９から３７１までのいずれか１つの細胞の集団を含む組成物を提供する。
別の組成物、組成物３７３では、本開示は、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、組成物３７２による組成物を提供する。
別の組成物、組成物３７４では、本開示は、それを必要とする対象の処置における使用のための、組成物３７２から３７３までによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物３７５では、本開示は、対象が、疾患または障害を有する、それを有する疑いがある、またはそのリスクがある、組成物３７４による組成物を提供する。
別の組成物、組成物３７６では、本開示は、疾患または障害が、Ｉ型糖尿病などの遺伝性疾患である、組成物３７５による組成物を提供する。
別の組成物、組成物３７７では、本開示は、疾患または障害が、ＩＩ型糖尿病または膵切除である、組成物３７５による組成物を提供する。
別の組成物、組成物３７８では、本開示は、対象が、ヒトである、組成物３７４から３７７までによる組成物を提供する。
別の方法、方法３７９では、本開示は、それを必要とする対象における膵疾患または障害を処置するための方法であって、（ｃ）請求項３６７または３６８に記載の複数のユニバーサルドナー細胞を、膵臓内胚葉細胞、膵内分泌細胞、未成熟ベータ細胞、または成熟ベータ細胞への分化後に得るまたは得ておくステップ；および（ｄ）膵臓内胚葉細胞、膵内分泌細胞、未成熟ベータ細胞、または成熟ベータ細胞を対象に投与するステップを含む、方法を提供する。
別の方法、方法３８０では、本開示は、投与するステップが、膵臓内胚葉細胞、膵内分泌細胞、未成熟ベータ細胞、または成熟ベータ細胞を含むデバイスを対象に埋め込むことを含む、方法３７９において提供される方法を提供する。
別の方法、方法３８１では、本開示は、膵疾患または障害が、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、または膵切除である、方法３７９から３８０までにおいて提供される方法を提供する。
別の方法、方法３８２では、本開示は、対象が、ヒトである、方法３７９から３８１までのいずれか１つにおいて提供される方法を提供する。
別の組成物、組成物３８３では、本開示は、遺伝子改変された細胞が、Ｂ２Ｍ遺伝子の内部またはその近傍に挿入されたＣＤ３９をコードするヌクレオチド配列およびＰＤ－Ｌ－１をコードするヌクレオチド配列を含む、組成物２９４から２９６までのいずれか１つにおいて提供される組成物を提供する。
別の組成物、組成物３８４では、本開示は、ＣＤ３９をコードするヌクレオチド配列が、ＰＤ－Ｌ－１をコードするヌクレオチド配列と、２Ａ配列ファミリーメンバーをコードするヌクレオチド配列によって連結している、組成物３８３による組成物を提供する。
別の組成物、組成物３８５では、本開示は、ＣＤ３９をコードするヌクレオチド配列およびＰＤ－Ｌ－１をコードするヌクレオチド配列が、外因性プロモーターに作動可能に連結している、組成物３８３または３８４による組成物を提供する。
別の組成物、組成物３８６では、本開示は、遺伝子改変された細胞が、Ｂ２Ｍ遺伝子の内部またはその近傍に挿入されたＣＤ３９をコードするヌクレオチド配列、ＣＤ７３をコードするヌクレオチド配列、およびＰＤ－Ｌ－１をコードするヌクレオチド配列を含む、組成物２９４から２９６までのいずれか１つにおいて提供される組成物を提供する。
別の組成物、組成物３８７では、本開示は、ＣＤ３９をコードするヌクレオチド配列が、ＣＤ７３をコードするヌクレオチド配列と、２Ａ配列ファミリーメンバーをコードするヌクレオチド配列によって連結しており、ＣＤ７３をコードするヌクレオチド配列が、ＰＤ－Ｌ－１をコードするヌクレオチド配列と、２Ａ配列ファミリーメンバーをコードするヌクレオチド配列によって連結している、組成物３８６による組成物を提供する。
別の組成物、組成物３８８では、本開示は、ＣＤ３９をコードするヌクレオチド配列、ＣＤ７３をコードするヌクレオチド配列、およびＰＤ－Ｌ－１をコードするヌクレオチド配列が、外因性プロモーターに作動可能に連結している、組成物３８６または３８７による組成物を提供する。
別の組成物、組成物３８９では、本開示は、（ａ）チオレドキシン相互作用タンパク質（ＴＸＮＩＰ）をコードする遺伝子の内部またはその近傍に挿入された中脳アストロサイト由来神経栄養因子（ＭＡＮＦ）をコードする第１のポリヌクレオチド配列およびＨＬＡクラスＩ組織適合性抗原、アルファ鎖Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）をコードする第２のポリヌクレオチド、ならびに（ｂ）ベータ２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）をコードする遺伝子の内部またはその近傍に挿入された腫瘍壊死因子アルファ誘導タンパク質３（ＴＮＦＡＩＰ３）をコードする第３のポリヌクレオチド配列およびプログラム死－リガンド１（ＰＤ－Ｌ－１）をコードする第４のポリヌクレオチドを含む遺伝子改変された細胞を含む組成物であって、遺伝子改変された細胞が、ＭＡＮＦ、ＨＬＡ－Ｅ、ＴＮＦＡＩＰ３、およびＰＤ－Ｌ－１を発現し、ＴＸＮＩＰおよびＢ２Ｍの発現の破壊を有する、組成物を提供する。
別の方法、方法３９０では、本開示は、ユニバーサルドナー細胞を調製するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、（ａ）第１のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼおよびベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子座における標的部位を標的とする第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；（ｂ）核酸を含む第１のベクターであって、核酸が、（ｉ）腫瘍壊死因子アルファ誘導タンパク質３（ＴＮＦＡＩＰ３）をコードするヌクレオチド配列およびプログラム死－リガンド１（ＰＤ－Ｌ－１）をコードするヌクレオチド配列；（ｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子座における標的部位の左側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列；ならびに（ｉｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子座における標的部位の右側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列を含み、（ｉ）が、（ｉｉ）と（ｉｉｉ）に挟まれている、第１のベクターを幹細胞に送達するステップであって、Ｂ２Ｍ遺伝子座を標的部位において切断し、ＴＮＦＡＩＰ３およびＰＤ－Ｌ－１をコードするヌクレオチド配列を含む核酸をＢ２Ｍ遺伝子座に挿入し、それにより、Ｂ２Ｍ遺伝子を破壊する、ステップを含み、ユニバーサルドナー細胞が、ＴＮＦＡＩＰ３およびＰＤ－Ｌ－１を発現し、核酸挿入および遺伝子破壊がなされていない同等の細胞と比較して、免疫回避および／または移植後生存の増大を有する、方法を提供する。
別の方法、方法３９１では、本開示は、Ｂ２Ｍ遺伝子を破壊することが、Ｂ２Ｍの発現を低減または排除することを含む、方法３９０によるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法３９２では、本開示は、（ｂ）（ｉ）のヌクレオチド配列が、ＰＤ－Ｌ－１をコードするヌクレオチド配列と連結した、Ｐ２Ａをコードするヌクレオチド配列、それと連結した、ＴＮＦＡＩＰ３をコードするヌクレオチド配列を含む、方法３９０または３９１によるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法３９３では、本開示は、（ｂ）（ｉ）のヌクレオチド配列が、配列番号５４を含む、方法３９０から３９２までのいずれか１つによるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法３９４では、本開示は、（ｂ）（ｉ）のヌクレオチド配列が、外因性プロモーターに作動可能に連結している、方法３９０から３９３までのいずれか１つによるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法３９５では、本開示は、外因性プロモーターが、ＣＭＶ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、ＣＡＧ、またはＵＢＣプロモーターである、方法３９０から３９４までのいずれか１つによるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法３９６では、本開示は、（ｂ）（ｉｉ）のヌクレオチド配列が、配列番号１５を含むまたはそれから本質的になる、方法３９０から３９５までのいずれか１つによるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法３９７では、本開示は、（ｂ）（ｉｉｉ）のヌクレオチド配列が、配列番号２２を含むまたはそれから本質的になる、方法３９０から３９６までのいずれか１つによるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法３９８では、本開示は、第１のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと第１のｇＲＮＡが、約１：１～約１：１０の比で存在する、方法３９０から３９７までのいずれか１つによるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法３９９では、本開示は、第１のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが、第１のＣａｓ９ヌクレアーゼである、方法３９０から３９８までのいずれか１つによるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法４００では、本開示は、第１のＣａｓ９ヌクレアーゼが、少なくとも１つの核局在化シグナルと連結している、方法３９９によるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法４０１では、本開示は、（ｃ）第２のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼおよびチオレドキシン相互作用タンパク質（ＴＸＮＩＰ）遺伝子座における標的部位を標的とする第２のｇＲＮＡ；ならびに（ｄ）核酸を含む第２のベクターであって、核酸が、（ｉ）中脳アストロサイト由来神経栄養因子（ＭＡＮＦ）をコードするヌクレオチド配列およびＨＬＡクラスＩ組織適合性抗原、アルファ鎖Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）をコードするヌクレオチド配列；（ｉｉ）ＴＸＮＩＰ遺伝子座における標的部位の左側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列；および（ｉｉｉ）ＴＸＮＩＰ遺伝子座における標的部位の右側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列を含み、（ｉ）が、（ｉｉ）と（ｉｉｉ）に挟まれている、第２のベクターを幹細胞に送達するステップであって、ＴＸＮＩＰ遺伝子座を標的部位において切断し、ＭＡＮＦおよびＨＬＡ－Ｅをコードするヌクレオチド配列を含む核酸をＴＸＮＩＰ遺伝子座に挿入し、それにより、ＴＸＮＩＰ遺伝子を破壊し、ユニバーサルドナー細胞が、ＭＡＮＦおよびＨＬＡ－Ｅをさらに発現する、ステップをさらに含む、方法３９０から４００までのいずれか１つによるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法４０２では、本開示は、ＴＸＮＩＰ遺伝子を破壊することが、ＴＸＮＩＰの発現を低減または排除することを含む、方法４０１によるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法４０３では、本開示は、ＨＬＡ－Ｅをコードするヌクレオチド配列が、ＨＬＡ－Ｅ三量体をコードする配列を含み、ＨＬＡ－Ｅ三量体が、シグナルペプチドを有さないＨＬＡ－Ｅと融合したＢ２Ｍ膜タンパク質、それと融合したＨＬＡ－Ｇ提示ペプチド、それと融合したＢ２Ｍシグナルペプチドを含む、方法４０１または４０２によるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法４０４では、本開示は、（ｄ）（ｉ）のヌクレオチド配列が、ＨＬＡ－Ｅをコードするヌクレオチド配列と連結した、Ｐ２Ａをコードするヌクレオチド配列、それと連結した、ＭＡＮＦをコードするヌクレオチド配列を含む、方法４０１から４０３までのいずれか１つによるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法４０５では、本開示は、（ｄ）（ｉ）のヌクレオチド配列が、配列番号５５を含む、方法４０１から４０４までのいずれか１つによるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法４０６では、本開示は、（ｄ）（ｉ）のヌクレオチド配列が、外因性プロモーターに作動可能に連結している、方法４０１から４０５までのいずれか１つによるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法４０７では、本開示は、外因性プロモーターが、ＣＭＶ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、ＣＡＧ、またはＵＢＣプロモーターである、方法４０６によるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法４０８では、本開示は、（ｄ）（ｉｉ）のヌクレオチド配列が、配列番号４２から本質的になる、方法４０１から４０７までのいずれか１つによるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法４０９では、本開示は、（ｄ）（ｉｉｉ）のヌクレオチド配列が、配列番号４４から本質的になる、方法４０１から４０８までのいずれか１つによるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法４１０では、本開示は、第２のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと第２のｇＲＮＡが、約１：１～約１：１０の比で存在する、方法４０１から４０９までのいずれか１つによるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法４１１では、本開示は、第２のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが、第２のＣａｓ９ヌクレアーゼである、方法４０１から４１０までのいずれか１つによるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法４１２では、本開示は、第２のＣａｓ９ヌクレアーゼが、少なくとも１つの核局在化シグナルと連結している、方法４１１によるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法４１３では、本開示は、（ｅ）第３のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼおよびクラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子座における標的部位を標的とする第３のｇＲＮＡ；ならびに（ｆ）核酸を含む第２のベクターであって、核酸が、（ｉ）ＣＤ３９をコードするヌクレオチド配列；（ｉｉ）ＣＩＩＴＡ遺伝子座における標的部位の左側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列；および（ｉｉｉ）ＣＩＩＴＡ遺伝子座における標的部位の右側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列を含み、（ｉ）が、（ｉｉ）と（ｉｉｉ）に挟まれている、第２のベクターを幹細胞に送達するステップであって、ＴＸＮＩＰ遺伝子座を標的部位において切断し、ＣＤ３９をコードするヌクレオチド配列を含む核酸をＣＩＩＴＡ遺伝子座に挿入し、それにより、ＣＩＩＴＡ遺伝子を破壊する、ステップをさらに含み、ユニバーサルドナー細胞が、ＣＤ３９をさらに発現する、方法４０１から４１２までのいずれか１つによるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法４１４では、本開示は、（ｅ）（ｉ）のヌクレオチド配列が、配列番号２７を含む、方法４１３によるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法４１５では、本開示は、（ｆ）（ｉ）のヌクレオチド配列が、外因性プロモーターに作動可能に連結している、方法４１３または４１４によるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法４１６では、本開示は、外因性プロモーターが、ＣＭＶ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、ＣＡＧ、またはＵＢＣプロモーターである、方法４１５によるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法４１７では、本開示は、（ｆ）（ｉｉ）のヌクレオチド配列が、配列番号２６から本質的になる、方法４１３から４１６までのいずれか１つによるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法４１８では、本開示は、（ｆ）（ｉｉｉ）のヌクレオチド配列が、配列番号２８から本質的になる、方法４１３から４１７までのいずれか１つによるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法４１９では、本開示は、第３のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと第３のｇＲＮＡが、約１：１～約１：１０の比で存在する、方法４１３から４１８までのいずれか１つによるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法４２０では、本開示は、第３のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが、第３のＣａｓ９ヌクレアーゼである、方法４１３から４１９までのいずれか１つによるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法４２１では、本開示は、第３のＣａｓ９ヌクレアーゼが、少なくとも１つの核局在化シグナルと連結している、方法４２０によるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法４２２では、本開示は、（ｇ）第４のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼおよびＴＧＧβ遺伝子座における標的部位を標的とする第４のｇＲＮＡを幹細胞に送達し、それにより、ＴＧＦβ遺伝子を破壊するステップをさらに含む、方法３９０から４２１までのいずれか１つによるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法４２３では、本開示は、第４のｇＲＮＡが、配列番号５７から本質的になるヌクレオチド配列を標的とする、方法４２２によるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法４２４では、本開示は、幹細胞が、胚性幹細胞、成体幹細胞、人工多能性幹細胞、または造血幹細胞である、方法３９０から４２３までのいずれか１つによるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法４２５では、本開示は、幹細胞が、ヒト幹細胞である、方法３９０から４２４までのいずれか１つによるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の組成物、組成物４２６では、本開示は、（ａ）破壊されたＢ２Ｍ遺伝子、および破壊されたＢ２Ｍ遺伝子への中脳アストロサイト由来神経栄養因子（ＭＡＮＦ）をコードする第１のポリヌクレオチドの第１の挿入；（ｂ）破壊されたＴＸＮＩＰ遺伝子、および破壊されたＴＸＮＩＰ遺伝子への腫瘍壊死因子アルファ誘導タンパク質３（ＴＮＦＡＩＰ３）をコードする第２のポリヌクレオチドの第２の挿入；（ｃ）破壊されたＣＩＩＴＡ遺伝子、およびＣＤ３９をコードする第３のポリヌクレオチドの第３の挿入を含む遺伝子改変された細胞を含む組成物であって、細胞が、ＭＡＮＦ、ＴＮＦＡＩＰ３およびＣＤ３９を発現し、Ｂ２Ｍ、ＴＸＮＩＰおよびＣＩＩＴＡの発現の破壊を有する、組成物を提供する。
別の組成物、組成物４２７では、本開示は、第３のポリヌクレオチドが、配列番号２７から本質的になるヌクレオチド配列を含む、組成物４２６による組成物をさらに提供する。
別の組成物、組成物４２８では、本開示は、Ｂ２Ｍ、ＴＸＮＩＰおよび／またはＣＩＩＴＡの発現の破壊が、Ｂ２Ｍタンパク質、ＴＸＮＩＰタンパク質および／またはＣＩＩＴＡタンパク質の発現の低減または排除を含む、組成物４２６から４２７までのいずれか１つによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物４２９では、本開示は、遺伝子改変された細胞が、（ｄ）破壊されたＴＧＦβ遺伝子をさらに含み、細胞が、ＴＧＦβタンパク質の発現の破壊を有する、組成物４２６から４２８までのいずれか１つによる組成物をさらに提供する。
別の組成物、組成物４３０では、本開示は、ＴＧＦβタンパク質の発現の破壊が、ＴＧＦβタンパク質の発現の低減または排除を含む、組成物４２９による組成物を提供する。
別の組成物、組成物４３１では、本開示は、ユニバーサルドナー細胞が、ポリヌクレオチド挿入および遺伝子破壊がなされていない同等の細胞と比較して、免疫回避および／または移植後生存の増大を有する、組成物４２６から４３０までのいずれか１つによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物４３２では、本開示は、細胞が、幹細胞である、組成物４２６から４３１までのいずれか１つによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物４３３では、本開示は、幹細胞が、胚性幹細胞、成体幹細胞、人工多能性幹細胞、または造血幹細胞である、組成物４３２による組成物を提供する。
別の組成物、組成物４３４では、本開示は、細胞が、分化した細胞または体細胞である、組成物４２６から４３１までのいずれか１つによる組成物を提供する。
別の組成物、組成物４３５では、本開示は、細胞が、系列が制限された前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）または完全に分化した体細胞に分化する、組成物４３４による組成物を提供する。
別の組成物、組成物４３６では、本開示は、系列が制限された前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）が、胚体内胚葉細胞、未分化腸管細胞、後方前腸細胞、膵臓内胚葉前駆体、膵臓内分泌前駆体、または未成熟ベータ細胞であり、完全に分化した体細胞が、ベータ細胞である、組成物４３５による組成物を提供する。
別の組成物、組成物４３７では、本開示は、組成物１から４３６までのいずれか１つによる複数の遺伝子改変された細胞を含む組成物を提供する。
別の組成物、組成物４３８では、本開示は、組成物４３７の複数の遺伝子改変された細胞に由来する系列が制限された前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）または完全に分化した体細胞の集団を含む組成物を提供する。
別の組成物、組成物４３９では、本開示は、集団が、胚体内胚葉細胞、未分化腸管細胞、後方前腸細胞、膵臓内胚葉細胞、膵臓内分泌前駆細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ）、未成熟ベータ細胞、および／または膵ベータ細胞を含む、組成物４３８による組成物を提供する。
別の組成物、組成物４４０では、本開示は、組成物４３７の複数の細胞または組成物４３８もしくは４３９の細胞の集団、および少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含む組成物を提供する。
別の方法、方法４４１では、本開示は、それを必要とする対象における膵疾患または障害を処置するための方法であって、（ａ）請求項４３８の系列が制限された前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）または完全に分化した体細胞の集団を得るまたは得ておくステップであって、系列が制限された前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）または完全に分化した体細胞が、膵臓内胚葉細胞、膵臓内分泌前駆細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ）、未成熟ベータ細胞、および／または膵ベータ細胞を含む、ステップ；ならびに（ｂ）膵臓内胚葉細胞、膵内分泌細胞、未成熟ベータ細胞、および／またはベータ細胞を対象に投与するステップを含む、方法を提供する。
別の方法、方法４４２では、本開示は、それを必要とする対象における膵疾患または障害を処置するための方法であって、（ａ）請求項４３６の複数の遺伝子改変された細胞を得るまたは得ておくステップであって、複数の遺伝子改変された細胞が、幹細胞を含む、ステップ；（ｂ）遺伝子改変された細胞を膵臓内胚葉細胞、膵臓内分泌前駆細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ）、未成熟ベータ細胞、および／または膵ベータ細胞に分化させるステップ；ならびに（ｃ）膵臓内胚葉細胞、膵臓内分泌前駆細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ）、未成熟ベータ細胞、および／または膵ベータ細胞を対象に投与するステップを含む、方法を提供する。
別の方法、方法４４３では、本開示は、膵疾患または障害が、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病または膵切除である、方法４４１または４４２において提供される方法を提供する。
別の方法、方法４４４では、本開示は、ユニバーサルドナー細胞を調製するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、（ａ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼおよびチオレドキシン相互作用タンパク質（ＴＸＮＩＰ）遺伝子座における標的部位を標的とするｇＲＮＡ；ならびに（ｂ）核酸を含むベクターであって、核酸が、（ｉ）中脳アストロサイト由来神経栄養因子（ＭＡＮＦ）をコードするヌクレオチド配列およびＨＬＡクラスＩ組織適合性抗原、アルファ鎖Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）をコードするヌクレオチド配列；（ｉｉ）ＴＸＮＩＰ遺伝子座における標的部位の左側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列；ならびに（ｉｉｉ）ＴＸＮＩＰ遺伝子座における標的部位の右側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列を含み、（ｉ）が、（ｉｉ）と（ｉｉｉ）に挟まれている、ベクターを幹細胞に送達するステップであって、ＴＸＮＩＰ遺伝子座を標的部位において切断し、ＭＡＮＦおよびＨＬＡ－Ｅをコードするヌクレオチド配列を含む核酸をＴＸＮＩＰ遺伝子座に挿入し、それにより、ＴＸＮＩＰ遺伝子を破壊する、ステップを含み、ユニバーサルドナー細胞が、ＭＡＮＦおよびＨＬＡ－Ｅを発現する、方法を提供する。
別の方法、方法４４５では、本開示は、ＴＸＮＩＰ遺伝子を破壊することが、ＴＸＮＩＰの発現を低減または排除することを含む、方法４４４によるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法４４６では、本開示は、ＨＬＡ－Ｅをコードするヌクレオチド配列が、ＨＬＡ－Ｅ三量体をコードする配列を含み、ＨＬＡ－Ｅ三量体が、シグナルペプチドを有さないＨＬＡ－Ｅと融合したＢ２Ｍ膜タンパク質、それと融合したＨＬＡ－Ｇ提示ペプチド、それと融合したＢ２Ｍシグナルペプチドを含む、方法４４４または４４５によるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法４４７では、本開示は、（ｂ）（ｉ）のヌクレオチド配列が、ＨＬＡ－Ｅをコードするヌクレオチド配列と連結した、Ｐ２Ａをコードするヌクレオチド配列、それと連結した、ＭＡＮＦをコードするヌクレオチド配列を含む、方法４４４から４４６までのいずれか１つによるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法４４８では、本開示は、（ｂ）（ｉ）のヌクレオチド配列が、配列番号５５を含む、方法４４４から４４７までのいずれか１つによるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法４４９では、本開示は、（ｂ）（ｉ）のヌクレオチド配列が、外因性プロモーターに作動可能に連結している、方法４４４から４４８までのいずれか１つによるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法４５０では、本開示は、外因性プロモーターが、ＣＭＶ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、ＣＡＧ、またはＵＢＣプロモーターである、方法４４９によるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法４５１では、本開示は、（ｂ）（ｉｉ）のヌクレオチド配列が、配列番号４２から本質的になる、方法４４４から４５０までのいずれか１つによるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法４５２では、本開示は、（ｂ）（ｉｉｉ）のヌクレオチド配列が、配列番号４４から本質的になる、方法４４４から４５１までのいずれか１つによるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法４５３では、本開示は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼとｇＲＮＡが、約１：１～約１：１０の比で存在する、方法４４４から４５２までのいずれか１つによるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法４５４では、本開示は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、方法４４４から４５３までのいずれか１つによるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
別の方法、方法４５５では、本開示は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼが、少なくとも１つの核局在化シグナルと連結している、方法４５４によるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
下記の実施例に、本開示による特定のユニバーサルドナー細胞の生成および特徴付けを記載する。
（実施例１）
細胞の維持および拡大
ｈＥＳＣ／ｈｉＰＳＣの維持。ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）およびヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）を、ＳｔｅｍＦｌｅｘ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａ３３４９４０１）中、ＢＩＯＬＡＭＩＮＩＮ ５２１ ＣＴＧ（ＢｉｏＬａｍｉｎａ Ｃａｔ＃ ＣＴ５２１）またはラミニン５１１をコーティングした組織培養プレートで維持した。細胞に毎日ＳｔｅｍＦｌｅｘ培地を供給した。細胞を単一細胞としてプレーティングするために、細胞を、１％ＲｅｖｉｔａＣｅｌｌ（商標）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（１００×）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｃａｔ＃Ａ２６４４５０１）と共にＳｔｅｍＦｌｅｘ中、ＢＩＯＬＡＭＩＮＩＮまたはラミニン５１１をコーティングしたプレートにプレーティングした。継代のために、１％ＲＥＶＩＴＡＣＥＬＬ（商標）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（１００×）を添加した。
ｈＰＳＣの単一細胞クローニング。単一細胞クローニングのために、ｈＰＳＣ（ｈＥＳＣまたはｈｉＰＳＣ）にＳｔｅｍＦｌｅｘ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａ３３４９４０１）を１％ＲｅｖｉｔａＣｅｌｌ（商標）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（１００×）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｃａｔ＃Ａ２６４４５０１）と共に供給した。ＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）を用いた解離後、細胞を、予めコーティングしたプレートにウェル当たり１つの単一細胞になるようにソーティングした。９６ウェルプレートを、ＤＰＢＳ、カルシウム、マグネシウム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１４０４０１３３）中、ＢＩＯＬＡＭＩＮＩＮ ５２１ ＣＴＧ（ＢｉｏＬａｍｉｎａ Ｃａｔ＃ＣＴ５２１）の１：１０または１：２０希釈物を用いて３７℃で２時間、予めコーティングした。ＷＯＬＦ ＦＡＣＳ－ｓｏｒｔｅｒ（Ｎａｎｏｃｅｌｌｅｃｔ）を使用して単一細胞をウェル中にソーティングした。プレートに、ＲｅｖｉｔａＣｅｌｌ（商標）および４μＬ／ｍＬのＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｌａｍｉｎｉｎ ｉＭａｔｒｉｘ－５１１ Ｅ８（ＡＭＳＢＩＯ、ＡＭＳ．８９２ ０１１）と共に１００～２００μＬのＳｔｅｍＦｌｅｘ Ｃｏｍｐｌｅｔｅを予め充填した。細胞を播種した３日後に、細胞に新鮮なＳｔｅｍＦｌｅｘを供給し、２日に１回の培地１００～２００μＬの供給を継続した。１０日間成長させた後、１２～１４日目まで毎日細胞にＳｔｅｍＦｌｅｘを供給した。この時点で、プレートについてＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）を用いて解離を行い、収集された細胞懸濁液を１：２に分割し、半分を維持のために新しい９６ウェルプレートに入れ、半分をＤＮＡ抽出溶液ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（商標） ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｌｕｃｉｇｅｎ）に入れた。ＤＮＡ抽出後、ＰＣＲを実施して、標的化されたＤＮＡ遺伝子座における所望の遺伝子編集の存在または非存在を評定した。サンガーシーケンシングを使用して、所望の編集を検証した。
単一細胞由来ｈＰＳＣクローンの拡大。ｈＥＳＣに関しては、首尾よく標的化されたクローンを、ＳｔｅｍＦｌｅｘおよびＢＩＯＬＡＭＩＮＩＮ ５２１またはＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｌａｍｉｎｉｎ ｉＭａｔｒｉｘ－５１１ Ｅ８を使用し、９６ウェルプレートから２４ウェルプレートに継代した。２４ウェルプレートでの拡大後、細胞を６ウェルプレートに継代し、ＳｔｅｍＦｌｅｘでのプレーティングの翌日にＫＳＲ Ａ１０Ｈ１０培地への移行を開始した。プレーティング後１日目に、細胞にＫＳＲ Ａ１０Ｈ１０とＳｔｅｍＦｌｅｘの５０：５０ミックスを供給した。翌日、細胞に１００％ＫＳＲ Ａ１０Ｈ１０を供給した。１００％ＫＳＲ Ａ１０Ｈ１０中で２日後、細胞を、ＫＳＲ Ａ１０Ｈ１０中１０％ＸＦを使用して継代することができた。細胞が１００％ＫＳＲ Ａ１０Ｈ１０中で２日間経過していなかった場合、付着および生存を可能にするために、細胞にＢＩＯＬＡＭＩＮＩＮ ５２１またはＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｌａｍｉｎｉｎ ｉＭａｔｒｉｘ－５１１ Ｅ８を受けさせ、その後、ＫＳＲ Ａ１０Ｈ１０中でさらに成長させ、ラミニンを伴う培養物に完全に移行させた。ＫＳＲ Ａ１０Ｈ１０に完全に移行させた後、ｈＥＳＣクローンをSchulz et al. (2012) PLoS ONE 7 (5): e37004に記載されている通り継代した。
ｈｉＰＳＣに関しては、細胞を、クローニング全体を通してＳｔｅｍＦｌｅｘ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ中で維持し、継代段階では、ＲｅｖｉｔａＣｅｌｌ（商標）を伴うＢＩＯＬＡＭＩＮＩＮをコーティングしたプレートでの通常の維持プロセスで維持した。
（実施例２）
ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１のノックイン（ＫＩ）によりＢ２Ｍがノックアウト（ＫＯ）されたヒト多能性幹細胞の生成
本実施例には、本開示による生存（ＭＡＮＦ）および免疫回避（ＴＮＦＡＩＰ３、Ａ２０としても公知）を改善するための追加的な編集を用いた特定のユニバーサルドナー細胞の生成および特徴付けを記載する。ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１をコードする導入遺伝子がＢ２Ｍ遺伝子座に挿入され、それにより、Ｂ２Ｍ遺伝子がノックアウトされた細胞を生成した。
Ｂ２Ｍを標的とするｇＲＮＡを、Ｂ２Ｍコード配列のエクソン１を標的とするように設計した。これらのｇＲＮＡは、ｇＲＮＡ設計ソフトウェアを使用した配列相同性予測に基づいて、オフターゲットスコアが低いことが予測された。ｇＲＮＡの標的配列を表２に示す。ｇＲＮＡは、標的ＤＮＡ配列に対応するＲＮＡ配列を含む。
Figure 2024503291000003
ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１をコードする導入遺伝子をＢ２Ｍ遺伝子座に挿入するためのプラスミド設計を、相同組換え修復（ＨＤＲ）が起こって導入遺伝子が挿入された後にＢ２Ｍの開始コドンが除去され、それにより、部分的なＢ２Ｍ発現のあらゆる可能性がなくなるように、行った。上首尾のＨＤＲにより、ＭＡＮＦ、ＴＮＦＡＩＰ３、およびＰＤ－Ｌ－１（ＣＤ２７４）という３種の遺伝子のゲノムへの挿入がもたらされた。３種の別々のタンパク質の単一の転写物からの発現を可能にするために、３種のコード配列をＰ２Ａペプチドコード配列によって連結した。ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１のコード配列は、配列番号５２のヌクレオチド配列を含む。図１は、Ｂ２Ｍ－ＣＡＧＧＳ－ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ドナープラスミドの概略図を示し、表３は、そのドナープラスミド内のエレメントおよび位置を同定する。ドナープラスミドは、ＣＡＧＧＳプロモーター（すなわち、ＣＭＶエンハンサー、ニワトリβ－アクチンプロモーター、およびキメライントロンを含む）により駆動される、Ｂ２Ｍ遺伝子座のエクソン１周辺と同一の配列を有する８００塩基対の相同アームに挟まれたＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１のｃＤＮＡを含有していた。プラスミドの完全な配列は、配列番号２４のヌクレオチド配列を含む。
Figure 2024503291000004
ヒトＥＳＣに、Ｎｅｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ（Ｎｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｃａｔ＃ＭＰＫ５０００）を使用し、ｈＥＳＣ１００万個当たり４μｇのプラスミドＤＮＡを、Ｃａｓ９タンパク質とＢ２Ｍ－２ ｇＲＮＡ（配列番号２）のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）混合物と一緒に電気穿孔した。ＲＮＰ複合体を形成するために、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９を１つの容器中でＲ－緩衝剤（Ｎｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ １００μＬ Ｋｉｔ ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｃａｔ＃ＭＰＫ１００９６）と組み合わせて総体積を２５～５０μＬにし、室温で１５分間インキュベートした。細胞を、ＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）を使用して解離させ、次いで、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ、ｃａｔ＃１１３２００３３）中に再懸濁させ、ＮＣ－２００（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ）を使用して計数し、遠心分離した。合計１×１０６個の細胞を、プラスミド、ＲＮＰ複合体、およびＲ－緩衝剤と共に再懸濁させた。次いで、この混合物を電気穿孔した。電気穿孔後、細胞を、ピペット操作により取り出し、ＲｅｖｉｔａＣｅｌｌ（商標）を伴うＳｔｅｍＦｌｅｘ培地を充填したエッペンドルフ管または６ウェルプレートのウェルに入れた。次いで、この細胞懸濁液を予めコーティングした組織培養皿にプレーティングした。細胞を正常酸素インキュベーター（３７℃、８％ＣＯ２）中で培養した。
電気穿孔の７～１０日後、細胞に対して、抗マウスＩｇＧ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＣＥＬＬｅｃｔｉｏｎ（商標）Ｐａｎ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ Ｋｉｔ、１１５３１Ｄ）を使用した磁気支援セルソーティング（ＭＡＣＳ）により、ＰＤ－Ｌ－１発現細胞の富化を行った。これらの富化された細胞（Ｌ１Ｖ００８細胞株）は、高度にＰＤ－Ｌ－１陽性のバルクＫＩ集団を表していた。次いで、富化された細胞を、ＰＤ－Ｌ－１表面発現についてＷＯＬＦ ＦＡＣＳ－ｓｏｒｔｅｒ（Ｎａｎｏｃｅｌｌｅｃｔ）を使用して、ＳｔｅｍＦｌｅｘおよびＲｅｖｉｔａＣｅｌｌ（商標）を伴う、ＢＩＯＬＡＭＩＮＩＮ ５２１ ＣＴＧでコーティングされた９６ウェルプレート中にＦＡＣＳソーティングした。ＰＤ－Ｌ－１表面発現を検出するために、抗ＰＤ－Ｌ－１蛍光抗体を使用した（表４参照）。ＦＡＣＳによるソーティングに関して、編集されていない細胞が陰性対照としての機能を果たした。ＰＤ－Ｌ－１陽性細胞をソーティングおよび単一細胞クローニングのために選択した。
Figure 2024503291000005
プレーティングした単一細胞を、正常酸素インキュベーター（３７℃、８％ＣＯ２）中で、培地を２日に１回交換しながら、コロニーが単一細胞として再播種するために十分な大きさになるまで成長させた。コンフルエントになったら、試料を維持およびゲノムＤＮＡ抽出のために分割した。ＭＡＮＦ－ＴＮＦＡＩＰ３－ＰＤ－Ｌ－１ ＫＩ挿入について、Ｂ２Ｍ遺伝子座への挿入部位のプラスミド相同アームの外側から増幅させ、ＫＩにより組み込まれたＤＮＡのみを増幅させることを可能にするプライマーを使用してＰＣＲによって、正確に標的化されたクローンを同定した。クローンのＢ２Ｍ ＫＯの状態をＰＣＲおよびサンガーシーケンシングによって確認した。正確にＫＩおよびＫＯされたクローンを、漸増組織培養フォーマットで、細胞３，０００万個の集団サイズに達するまで拡大させた。
（実施例３）
ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１のＫＩによりＢ２ＭがＫＯされ、ＣＤ３９のＫＩによりＣＩＩＴＡがＫＯされたヒト多能性幹細胞の生成
ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１をコードする導入遺伝子がＢ２Ｍ遺伝子座に挿入され、ＣＤ３９をコードする導入遺伝子がＣＩＩＴＡ遺伝子座に挿入され、それにより、Ｂ２Ｍ遺伝子およびＣＩＩＴＡ遺伝子がノックアウトされた細胞を生成する。
ヒト多能性幹細胞に、基本的に上の実施例２に記載の通り、Ｂ２Ｍ－ＣＡＧＧＳ－ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ドナープラスミド（配列番号２４、表３）およびＣａｓ９とＢ２Ｍ－２ ｇＲＮＡ（配列番号２）とを含むＲＮＰを電気穿孔する。電気穿孔の７～１０日後、細胞に対して、Ｍｉｌｔｅｎｙｉの試薬またはＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒの試薬を使用したＭＡＣＳにより、ＰＤ－Ｌ－１発現（陽性）細胞の富化を行う。富化されたＰＤ－Ｌ－１陽性集団を拡大させた後、細胞に、基本的に上の実施例２に記載の通り、以下の表５に詳述されているＣＩＩＴＡ－ＣＡＧＧＳ－ＣＤ３９ドナープラスミド、および、Ｃａｓ９と、ＣＩＩＴＡのエクソン３を対象とするｇＲＮＡ、例えば、ＣＩＩＴＡ Ｅｘ３＿Ｔ６ ｇＲＮＡ（標的配列は、５’－ＧＧＴＣＣＡＴＣＴＧＧＴＣＡＴＡＧＡＡＧ－３’、配列番号２５である；ＰＡＭはＴＧＧである）とを含むＲＮＰを電気穿孔する。
図２は、ＣＩＩＴＡ－ＣＡＧＧＳ－ＣＤ３９ドナープラスミドの概略図を示し、表５は、そのドナープラスミド内のエレメントおよび位置を同定する。ＣＩＩＴＡ－ＣＡＧＧＳ－ＣＤ３９ドナープラスミドは、ＣＩＩＴＡ遺伝子座のエクソン３周辺と同一の配列を有する８００塩基対の相同アームに挟まれたＣＤ３９のｃＤＮＡの発現を駆動するためのＣＡＧＧＳプロモーター（ＣＭＶエンハンサー、ニワトリβ－アクチンプロモーター、およびキメライントロンを含む）を含む。プラスミドの完全な配列は、配列番号２９のヌクレオチド配列を含む。
Figure 2024503291000006
電気穿孔の７～１０日後、細胞に対して、Ｍｉｌｔｅｎｙｉの試薬（Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ Ｃａｔ＃１３０－０４８－４０１、ＬＳ Ｃｏｌｕｍｎｓ Ｃａｔ＃１３０－０４２－４０１、およびＭｉｄｉＭＡＣＳ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ Ｃａｔ＃１３０－０４２－３０２）またはＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒの試薬（ＤｙｎａＭａｇ（商標）－１５ Ｍａｇｎｅｔ Ｃａｔ＃１２３０１Ｄ、ＣＥＬＬｅｃｔｉｏｎ（商標）Ｐａｎ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ Ｋｉｔ Ｃａｔ＃１１５３１Ｄ、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）Ｐａｎ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ Ｃａｔ＃１１０４２）を使用したＭＡＣＳにより、ＰＤ－Ｌ－１および／またはＣＤ３９発現細胞の富化を行う。ＰＤ－Ｌ－１および／またはＣＤ３９の富化後、富化された細胞を、ＷＯＬＦ ＦＡＣＳ－ｓｏｒｔｅｒ（Ｎａｎｏｃｅｌｌｅｃｔ）を使用してＰＤ－Ｌ－１および／またはＣＤ３９発現について、ＳｔｅｍＦｌｅｘおよびＲｅｖｉｔａＣｅｌｌ（商標）を伴う、ＢＩＯＬＡＭＩＮＩＮ ５２１ ＣＴＧでコーティングされた９６ウェルプレート中に、ＰＤ－Ｌ－１およびＣＤ３９二重陽性細胞についてのゲーティングセットを用いてＦＡＣＳソーティングする。ＦＡＣＳによるソーティングに関して、編集されていない細胞が陰性対照としての機能を果たした。陽性細胞をソーティングおよび単一細胞クローニングのために選択する。
プレーティングした単一細胞を、正常酸素インキュベーター（３７℃、８％ＣＯ２）中で、培地を２日に１回交換しながら、コロニーが単一細胞として再播種するために十分な大きさになるまで成長させる。コンフルエントになったら、試料を維持およびゲノムＤＮＡ抽出のために分割する。ＰＤ－Ｌ－１ ＫＩ挿入およびＣＤ３９ ＫＩ挿入について、各挿入部位のプラスミド相同アームの外側からの領域を増幅させ、ＫＩにより組み込まれたＤＮＡのみを増幅させることを可能にするプライマーを使用してＰＣＲによって、正確に標的化されたクローンを同定する。クローンのＢ２ＭおよびＣＩＩＴＡ ＫＯの状態をＰＣＲおよびサンガーシーケンシングによって確認する。
（実施例４）
ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１のＫＩによりＢ２ＭがＫＯされたヒト多能性幹細胞の生成
ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１をコードする導入遺伝子がＢ２Ｍ遺伝子座に挿入され、それにより、Ｂ２Ｍ遺伝子がノックアウトされた細胞を生成した。
ヒト多能性幹細胞に、基本的に上の実施例２に記載の通り、以下の表６に詳述されているＢ２Ｍ－ＣＡＧＧＳ－ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ドナープラスミド、およびＣａｓ９とＢ２Ｍ－２ ｇＲＮＡ（配列番号２）とを含むＲＮＰを電気穿孔した。
図３は、Ｂ２Ｍ－ＣＡＧＧＳ－ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ドナープラスミドの概略図を示し、表６は、そのドナープラスミ内のエレメントおよび位置を同定する。Ｂ２Ｍ－ＣＡＧＧＳ－ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ドナープラスミドは、Ｂ２Ｍ遺伝子座のエクソン１周辺と同一の配列を有する８００塩基対の相同アームに挟まれたＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１（配列番号５３）のｃＤＮＡの発現を駆動するためのＣＡＧＧＳプロモーター（ＣＭＶエンハンサー、ニワトリβ－アクチンプロモーター、およびキメライントロンを含む）を含む。Ｂ２Ｍ－ＣＡＧＧＳ－ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ドナープラスミドの完全な配列は、配列番号３０のヌクレオチド配列を含む。
Figure 2024503291000007
電気穿孔の７～１０日後、細胞に対して、抗マウスＩｇＧ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＣＥＬＬｅｃｔｉｏｎ（商標）Ｐａｎ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ Ｋｉｔ、１１５３１Ｄを使用した磁気支援セルソーティング（ＭＡＣＳ）により、ＰＤ－Ｌ－１発現細胞の富化を行った。これらの富化された細胞は、高度にＰＤ－Ｌ－１陽性のバルクＫＩ集団を表していた。次いで、富化された細胞を、ＰＤ－Ｌ－１表面発現についてＷＯＬＦ ＦＡＣＳ－ｓｏｒｔｅｒ（Ｎａｎｏｃｅｌｌｅｃｔ）を使用して、ＳｔｅｍＦｌｅｘおよびＲｅｖｉｔａＣｅｌｌ（商標）を伴う、ＢＩＯＬＡＭＩＮＩＮ ５２１ ＣＴＧでコーティングされた９６ウェルプレート中にＦＡＣＳソーティングした。ＰＤ－Ｌ－１表面発現を検出するために、抗ＰＤ－Ｌ－１蛍光抗体を使用した（表４参照）。ＦＡＣＳによるソーティングに関して、編集されていない細胞が陰性対照としての機能を果たした。ＰＤ－Ｌ－１陽性細胞をソーティングおよび単一細胞クローニングのために選択した。
プレーティングした単一細胞を、正常酸素インキュベーター（３７℃、８％ＣＯ２）中で、培地を２日に１回交換しながら、コロニーが単一細胞として再播種するために十分な大きさになるまで成長させた。コンフルエントになったら、試料を維持およびゲノムＤＮＡ抽出のために分割した。ＣＤ３９－ＰＤ－Ｌ－１ ＫＩ挿入について、Ｂ２Ｍ遺伝子座への挿入部位のプラスミド相同アームの外側から増幅させ、ＫＩにより組み込まれたＤＮＡのみを増幅させることを可能にするプライマーを使用してＰＣＲによって、正確に標的化されたクローンを同定した。クローンのＢ２Ｍ ＫＯの状態をＰＣＲおよびサンガーシーケンシングによって確認した。正確にＫＩおよびＫＯされたクローン（Ｌ１Ｖ０１７細胞株）を、漸増組織培養フォーマットで、細胞３，０００万個の集団サイズに達するまで拡大させた。
（実施例５）
ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１のＫＩによりＢ２ＭがＫＯされ、ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１のＫＩによりＢ２ＭがＫＯされたヒト多能性幹細胞の生成
ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１をコードする導入遺伝子がＢ２Ｍ遺伝子座の第１の標的部位に挿入され、ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１をコードする導入遺伝子がＢ２Ｍ遺伝子座の別の位置にある第２の標的部位に挿入され、それにより、Ｂ２Ｍ遺伝子がノックアウトされた細胞を生成する。
ヒト多能性幹細胞に、基本的に上の実施例２に記載の通り、Ｂ２Ｍ－ＣＡＧＧＳ－ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ドナープラスミド（配列番号２４、表３）およびＣａｓ９とＢ２Ｍ－２ ｇＲＮＡ（配列番号３）とを含むＲＮＰを電気穿孔する。ＰＤ－Ｌ－１の富化および拡大後、細胞に、Ｂ２Ｍ－ＣＡＧＧＳ－ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ドナープラスミド（配列番号３０。表６）、およびＣａｓ９と配列番号１または３～１３から選択される第２のＢ２Ｍ ｇＲＮＡ（上の表２参照）とを含むＲＮＰを電気穿孔する。細胞に対して上記の通り富化、拡大、選択、および特徴付けを行う。
（実施例６）
ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１のＫＩによりＢ２ＭがＫＯされ、ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＨＬＡ－ＥのＫＩによりＴＸＮＩＰがＫＯされたヒト多能性幹細胞（「Ｘ１」細胞）の生成
ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１をコードする導入遺伝子がＢ２Ｍ遺伝子座に挿入され、ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＨＬＡ－Ｅをコードする導入遺伝子がＴＸＮＩＰに挿入され、それにより、Ｂ２Ｍ遺伝子およびＴＸＮＩＰ遺伝子がノックアウトされた細胞を生成した。
ヒト多能性幹細胞に、基本的に上の実施例２に記載の通り、Ｂ２Ｍ－ＣＡＧＧＳ－ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ドナープラスミド（以下参照）およびＣａｓ９とＢ２Ｍ－２ ｇＲＮＡ（配列番号２）とを含むＲＮＰを電気穿孔した。図４は、Ｂ２Ｍ－ＣＡＧＧＳ－ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ドナープラスミド（Ｘ１－１カセットとも称される）の概略図を示し、表７は、そのドナープラスミド内のエレメントおよび位置を同定する。Ｂ２Ｍ－ＣＡＧＧＳ－ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ドナープラスミドは、Ｂ２Ｍ遺伝子座のエクソン１周辺と同一の配列を有する８００塩基対の相同アームに挟まれたＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１（配列番号５４）のｃＤＮＡの発現を駆動するためのＣＡＧＧＳプロモーター（ＣＭＶエンハンサー、ニワトリβ－アクチンプロモーター、およびキメライントロンを含む）を含む。Ｂ２Ｍ－ＣＡＧＧＳ－ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ドナープラスミドの完全な配列は、配列番号３１のヌクレオチド配列を含む。
Figure 2024503291000008
電気穿孔の７～１０日後、細胞に対して、基本的に実施例２に記載の通り、ＭＡＣＳにより、ＰＤ－Ｌ－１発現細胞の富化を行った。ＰＤ－Ｌ－１の富化後、富化された細胞に、以下に詳述されているＴＸＮＩＰ－ＣＡＧＧＳ－ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＨＬＡ－Ｅドナープラスミド、およびＣａｓ９とＴＸＮＩＰ遺伝子のエクソン１を標的とするｇＲＮＡ（すなわち、ＴＸＮＩＰ＿エクソン１＿Ｔ５ ｇＲＮＡ、配列番号３７）とを含むＲＮＰを電気穿孔した。表８は、ＴＸＮＩＰ遺伝子のエクソン１またはエクソン２を標的とする追加的なｇＲＮＡの標的配列を提示する。これらのｇＲＮＡは、ｇＲＮＡ設計ソフトウェアを使用した配列相同性予測に基づいて、オフターゲットスコアが低いことが予測された。
Figure 2024503291000009
図５は、ＴＸＮＩＰ－ＣＡＧＧＳ－ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＨＬＡ－Ｅドナープラスミド（Ｘ１－２カセットとも称される）の概略図を示し、表９は、そのドナープラスミド内のエレメントおよび位置を同定する。ＴＸＮＩＰ－ＣＡＧＧＳ－ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＨＬＡ－Ｅドナープラスミドは、ＴＸＮＩＰ遺伝子座のエクソン１周辺と同一の配列を有する８００塩基対の相同アームに挟まれたＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＨＬＡ－Ｅ（配列番号５５）のｃＤＮＡの発現を駆動するためのＣＡＧＧＳプロモーター（ＣＭＶエンハンサー、ニワトリβ－アクチンプロモーター、およびキメライントロンを含む）を含む。ＨＬＡ－Ｅ配列（配列番号４３）はＨＬＡ－Ｅ三量体をコードし、このＨＬＡ－Ｅ三量体は、シグナルペプチドを有さないＨＬＡ－Ｅタンパク質と融合したＧＳリンカー、それと融合したＢ２Ｍ膜タンパク質、それと融合したＧＳリンカー、それと融合したＨＬＡ－Ｇ提示ペプチド、それと融合したＢ２Ｍシグナルペプチドを含む。この三量体設計は以前公開されている（Gornalusse et al. (2017) Nat. Biotechnol. 35 (8): 765-772）。ＴＸＮＩＰ－ＣＡＧＧＳ－ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＨＬＡ－Ｅドナープラスミドの完全な配列は、配列番号４５のヌクレオチド配列を含む。
Figure 2024503291000010
電気穿孔の７～１０日後、細胞に対して、Ｍｉｌｔｅｎｙｉの試薬またはＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒの試薬を使用したＭＡＣＳにより、ＨＬＡ－Ｅ発現細胞の富化を行った。次いで、これらの富化された細胞を、ＷＯＬＦ ＦＡＣＳ－ｓｏｒｔｅｒ（Ｎａｎｏｃｅｌｌｅｃｔ）を使用して、ＳｔｅｍＦｌｅｘおよびＲｅｖｉｔａＣｅｌｌ（商標）を伴う、ＢＩＯＬＡＭＩＮＩＮ ５２１ ＣＴＧでコーティングされた９６ウェルプレート中に、ＰＤ－Ｌ－１およびＨＬＡ－Ｅ二重陽性細胞についてのゲーティングセットを用いてＦＡＣＳソーティングした。ＰＤ－Ｌ－１表面発現およびＨＬＡ－Ｅ表面発現を検出するために、抗ＰＤ－Ｌ－１および抗ＨＬＡ－Ｅ蛍光抗体を使用した（表４参照）。ＦＡＣＳによるソーティングに関して、編集されていない細胞が陰性対照としての機能を果たした。ＰＤ－Ｌ－１およびＨＬＡ－Ｅ二重陽性細胞（Ｌ１Ｖ０２８細胞株）をソーティングおよび単一細胞クローニングのために選択した。
プレーティングした単一細胞を、正常酸素インキュベーター（３７℃、８％ＣＯ２）中で、培地を２日に１回交換しながら、コロニーが単一細胞として再播種するために十分な大きさになるまで成長させた。コンフルエントになったら、試料を維持およびゲノムＤＮＡ抽出のために分割した。ＰＤ－Ｌ－１ ＫＩ挿入およびＨＬＡ－Ｅ ＫＩ挿入について、各挿入部位におけるプラスミド相同アームの外側から増幅させ、それにより、ＫＩにより組み込まれたＤＮＡのみを増幅させることを可能にするプライマーを使用してＰＣＲによって、正確に標的化されたクローンを同定した。クローンのＢ２ＭおよびＴＸＮＩＰ ＫＯの状態をＰＣＲおよびサンガーシーケンシングによって確認した。正確にＫＩおよびＫＯされたクローンを、漸増組織培養フォーマットで、細胞３，０００万個の集団サイズに達するまで拡大させた。これらの細胞を以降Ｘ１細胞と称する。
（実施例７）
ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１のＫＩによりＢ２ＭがＫＯされ、ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＨＬＡ－ＥのＫＩによりＴＸＮＩＰがＫＯされ、ＣＤ３９のＫＩによりＣＩＩＴＡがＫＯされたヒト多能性幹細胞の生成
ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１をコードする導入遺伝子がＢ２Ｍ遺伝子座に挿入され、ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＨＬＡ－Ｅをコードする導入遺伝子がＴＸＮＩＰ遺伝子座に挿入され、ＣＤ３９をコードする導入遺伝子がＣＩＩＴＡ遺伝子座に挿入され、それにより、Ｂ２Ｍ遺伝子、ＴＸＮＩＰ遺伝子、およびＣＩＩＴＡ遺伝子がノックアウトされた細胞を生成した。
ヒト多能性幹細胞に、基本的に上の実施例２に記載の通り、Ｂ２Ｍ－ＣＡＧＧＳ－ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ドナープラスミド（配列番号３１、表７）およびＣａｓ９とＢ２Ｍ－２ ｇＲＮＡ（配列番号２）とを含むＲＮＰを電気穿孔した。電気穿孔の７～１０日後、細胞に対して、基本的に実施例２に記載の通り、ＭＡＣＳにより、ＰＤ－Ｌ－１発現（陽性）細胞の富化を行った。富化されたＰＤ－Ｌ－１陽性集団を拡大させた後、細胞に、基本的に上の実施例２に記載の通り、ＴＸＮＩＰ－ＣＡＧＧＳ－ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＨＬＡ－Ｅドナープラスミド（配列番号４５、表９）およびＣａｓ９とＴＸＮＩＰ＿エクソン１＿Ｔ５ ｇＲＮＡ（配列番号３７）とを含むＲＮＰを電気穿孔した。ＨＬＡ－Ｅ陽性細胞の富化ならびにＰＤ－Ｌ－１およびＨＬＡ－Ｅ細胞の拡大後、二重陽性細胞を、ＣＤ３９のＣＩＩＴＡ遺伝子座へのさらなる挿入のために使用した。
ＣＩＩＴＡ－ＣＡＧＧＳ－ＣＤ３９ドナープラスミド（配列番号２９、表５）を、ＣＩＩＴＡを標的とするｇＲＮＡ（ＣＩＩＴＡ Ｅｘ３＿Ｔ６ ｇＲＮＡ（配列番号２５））とＣａｓ９タンパク質で構成されるリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体と一緒に導入した。具体的には、実施例７に記載のＸ１のクローンに、ＣＩＩＴＡ－ＣＡＧＧＳ－ＣＤ３９ドナープラスミドを、ＣＩＩＴＡを標的とするｇＲＮＡ（ＣＩＩＴＡ Ｅｘ３＿Ｔ６ ｇＲＮＡ（配列番号２５））とＣａｓ９タンパク質とで構成されるＲＮＰと一緒にトランスフェクトした。ｈＥＳＣ細胞２００万個当たり４μｇのプラスミドＤＮＡをＲＮＰと一緒に電気穿孔によって送達した。ｈＥＳＣ細胞に対して、Ｎｅｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒを使用し、Ｃａｓ９タンパク質（Ｂｉｏｍａｙ）とガイドＲＮＡ（Ｂｉｏｓｐｒｉｎｇ）の、モル比が５：１（ｇＲＮＡ：Ｃａｓ９）であり、絶対値が細胞２００万個当たり１２５ｐｍｏｌのＣａｓ９と６２５ｐｍｏｌのｇＲＮＡであるＲＮＰ混合物を用いて電気穿孔を行った。ＲＮＰ複合体を形成するために、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９を１つの容器中でＲ－緩衝剤（Ｎｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）と組み合わせて総体積を２５～５０μＬにし、室温（ＲＴ）で１５分間インキュベートした。細胞を、ＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）を使用して解離させ、次いで、ＳｔｅｍＦｌｅｘ培地中に再懸濁させ、ＮＣ－２００（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ）を使用して計数し、遠心分離した。合計２×１０６個の細胞をＲＮＰ複合体と共に再懸濁させ、Ｒ－緩衝剤を添加して総体積を約１１５μＬにした。次いで、この混合物に対して、１０００Ｖで３０ｍｓのパルスを３回用いて電気穿孔した。電気穿孔を２回実施した。電気穿孔後、細胞をピペット操作により取り出し、ＲｅｖｉｔａＣｅｌｌおよびラミニン５１１を伴うＳｔｅｍＦｌｅｘ培地を充填した６ウェルプレートのウェル中に入れた。プレートを、ＢＩＯＬＡＭＩＮＩＮ ５２１ ＣＴＧを１：１０希釈で用いて予めコーティングした。細胞を正常酸素インキュベーター（３７℃、８％ＣＯ２）中で培養した。
電気穿孔の２日後、細胞に対して、ＣＤ３９に対する抗体を使用し、蛍光支援セルソーティング（ＦＡＣＳ）により、トランスフェクトされたＣＤ３９発現細胞の富化を行った。次いで、これらの富化された細胞を、電気穿孔後７～１０日間拡大させ、再度ソーティングして、ＣＤ３９ノックインについて富化させた。Ｘ１のクローンから生成されたこれらの富化された細胞は、ＣＤ３９陽性細胞のバルクトランスフェクト集団（「Ｌ３Ｖ００３Ｂ」、「Ｘ４」とも称される）を表す。また、ＣＤ３９陽性細胞およびＴＧＦ－β２陰性細胞のバルクトランスフェクト集団（「Ｌ３Ｖ００４Ｂ」、「Ｘ４＋ＴＧＦ－β２ ＫＯ」とも称される）を生成するために、ＴＧＦ－β２遺伝子を標的とするガイドを使用して、ＣＤ３９ ＫＩを有するＸ１のクローンを編集した。これらの集団をＣＤ３９発現についてフローサイトメトリーによって評定したが、全体的なパーセンテージは予測されたものよりも低く、したがって、バルク細胞に対してＣＤ３９発現細胞の３回目の富化を行い、フローサイトメトリーにより＞９０％のＣＤ３９発現が示された（図６）。
（実施例８）
ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１のＫＩによりＢ２ＭがＫＯされ、ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＨＬＡ－ＥのＫＩによりＴＸＮＩＰがＫＯされ、ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１のＫＩによりＢ２ＭがＫＯされたヒト多能性幹細胞の生成
ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１をコードする導入遺伝子がＢ２Ｍ遺伝子座の第１の標的部位に挿入され、ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＨＬＡ－Ｅをコードする導入遺伝子がＴＸＮＩＰ遺伝子座に挿入され、ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１をコードする導入遺伝子がＢ２Ｍ遺伝子座の別の位置にある第２の標的部位に挿入され、それにより、Ｂ２Ｍ遺伝子およびＴＸＮＩＰ遺伝子がノックアウトされた細胞を生成する。
ヒト多能性幹細胞に、基本的に上の実施例２に記載の通り、Ｂ２Ｍ－ＣＡＧＧＳ－ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ドナープラスミド（配列番号３１、表７）およびＣａｓ９とＢ２Ｍ－２ ｇＲＮＡ（配列番号２）とを含むＲＮＰを電気穿孔する。電気穿孔の７～１０日後、細胞に対して、Ｍｉｌｔｅｎｙｉの試薬またはＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒの試薬を使用したＭＡＣＳにより、ＰＤ－Ｌ－１発現（陽性）細胞の富化を行う。富化されたＰＤ－Ｌ－１陽性集団を拡大させた後、細胞に、基本的に上の実施例２に記載の通り、ＴＸＮＩＰ－ＣＡＧＧＳ－ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＨＬＡ－Ｅドナープラスミド（配列番号４５、表９）およびＣａｓ９とＴＸＮＩＰ＿エクソン１＿Ｔ５ ｇＲＮＡ（配列番号３７）とを含むＲＮＰを電気穿孔する。ＨＬＡ－Ｅ陽性細胞の富化ならびにＰＤ－Ｌ－１およびＨＬＡ－Ｅ細胞の拡大後、二重陽性細胞に、Ｂ２Ｍ－ＣＡＧＧＳ－ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ドナープラスミド（配列番号３０、表６）およびＣａｓ９と配列番号１または３～１３から選択されるＢ２Ｍ ｇＲＮＡとを含むＲＮＰを電気穿孔する。細胞に対して、ＣＤ３９陽性細胞の富化、拡大、ならびにＰＤ－Ｌ－１、ＨＬＡ－Ｅ、およびＣＤ３９三重陽性細胞についての選択を行い、その三重陽性細胞を上記の通り特徴付ける。
一部の実施形態では、Ｂ２Ｍ－ＣＡＧＧＳ－ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ドナープラスミドにおいて、ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１のｃＤＮＡは、第２のＢ２Ｍ標的部位の両側のゲノム配列と配列同一性を有する８００塩基対の相同アームに挟まれている。
（実施例９）
編集されたクローンのＧバンド核型分析
編集されたＥＳ細胞（実施例２および６参照）１００万個を、培養培地（１０ｎｇ／ｍＬのアクチビンおよび１０ｎｇ／ｍＬのヘレグリンを伴うＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％ゼノフリーＫＳＲ）を伴うＴ－２５培養フラスコ中に継代した。一晩培養した後、３つのＴ２５培養フラスコを核型分析；第１染色体、第１２染色体、第１７染色体、第２０染色体についてのＦＩＳＨ分析；および標準の８×６０Ｋアレイを用いたアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（ａＣＧＨ）分析のためにＣｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）に送付した。選択されたＭＡＮＦ－ＴＮＦＡＩＰ３（Ａ２０）－ＰＤ－Ｌ－１のＫＩによりＢ２ＭがＫＯされたクローン（Ｌ１Ｖ００８細胞株；実施例２）およびＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＨＬＡ－ＥのＫＩによりＴＸＮＩＰがＫＯされた／ＴＮＦＡＩＰ３（Ａ２０）－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１のＫＩによりＢ２ＭがＫＯされたクローン（Ｌ１Ｖ０２８細胞株；実施例６）についてのＧバンディングの結果を表１０に示す。
Figure 2024503291000011
Figure 2024503291000012
（実施例１０）
編集されたヒト胚性幹細胞の膵臓内胚葉細胞（ＰＥＣ）への分化
編集されたヒト胚性幹細胞（ＥＳ）の維持。種々の継代数（Ｐ３８～４２）の編集されたヒト多能性幹細胞を、４日毎の継代については細胞３３，０００個／ｃｍ２、または３日毎の継代については細胞５０，０００個／ｃｍ２でｈＥＳＭ培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％ＫＳＲ＋１０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡおよび１０ｎｇ／ｍＬのヘレグリン）および最後の１０％ヒトＡＢ型血清に播種することによって維持した。
編集されたヒト胚性幹細胞のＰＥＣへの分化のための凝集。編集された細胞を、ＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）を用いて単一細胞に解離させ、次いで、遠心分離し、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中２％ＳｔｅｍＰｒｏ（Ｃａｔ＃Ａ１０００７０１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）に１ｍｌ当たり細胞１００万個で再懸濁させ、全部で３億５千万～４億個の細胞を８５０ｃｍ２のローラーボトル（Ｃａｔ＃４３１１９８、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）１本に播種し、８ＲＰＭ±０．５ＲＰＭの回転スピードで１８～２０時間置いた後、分化させた。編集されたヒト多能性幹細胞由来の凝集体を、ローラーボトル中、Schulz et al. (2012) PLoS ONE 7(5): e37004に記載されている通り膵臓系列に分化させた。編集されたヒト多能性幹細胞由来の凝集体をRezania et al. (2014) Nat. Biotechnol. 32 (11): 1121-1133およびＵＳ２０２００２０８１１６に記載されている通り膵臓系列に分化させた。
図７は、ＰＥＣ段階および第６段階（Ｓ６）のＴＸＮＩＰ ＫＯ／ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＨＬＡ－Ｅ ＫＩ＆Ｂ２Ｍ ＫＯ／ＴＮＦＡＩＰ３（Ａ２０）－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ ＫＩクローン（「Ｘ１」またはＬ１Ｖ０２８細胞株）と野生型細胞から分化させたものの間でモルホロジーが同様であることを示す。
（実施例１１）
ＰＥＣ段階および第６段階における遺伝子発現
遺伝子発現分析のための標的化ＲＮＡｓｅｑを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑおよび１１１種の遺伝子を標的とするオリゴのカスタムパネルを使用して実施した。パネルは、膵臓分化の間の発生段階のマーカーである遺伝子を主に含有した。ＰＥＣ段階および第６段階の最後に、１０μＬ ＡＰＶ（凝集したペレットの体積）を収集し、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙまたはＲＮｅａｓｙ９６スピンカラムプロトコールを使用し、オンカラムＤＮａｓｅ処理を含め、抽出した。数量化および品質管理を、Ｑｕｂｉｔと組み合わせたＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎを使用するか、またはＱｉａｇｅｎ ＱＩＡｘｃｅｌを使用することによって実施した。ＲＮＡ５０～２００ｎｇを、ｃＤＮＡ合成、カスタムオリゴプールのハイブリダイゼーション、洗浄、伸長、結合したオリゴのライゲーション、ライブラリーのＰＣＲ増幅、およびライブラリーのクリーンアップからなるＩｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑライブラリー調製プロトコールに従って処理した後、得られたｄｓＤＮＡライブラリーの数量化および品質管理をＱｕｂｉｔと組み合わせたＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎを使用するか、またはＱｉａｇｅｎ ＱＩＡｘｃｅｌを使用することによって行った。続いて、ライブラリーを４ｎＭの濃度に希釈し、プールし、その後、変性させ、ＰｈｉＸ対照をスパイクし、１０～１２ｐＭにさらに希釈した後、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑシーケンサーにローディングした。シーケンシングの実行後、最初のデータ分析をＢａｓｅＳｐａｃｅによって自動的に実施し、カスタムプローブのそれぞれについての生のリードカウントを生成した。次いで、各遺伝子について、これらのリードカウントを、その遺伝子に対応する全てのプローブについて合計し、１リードカウントを足した（下流でのゼロ除算を防ぐため）。遺伝子ＳＦ３Ｂ２に対する正規化を実施し、リードを、一般的に第０段階に対する倍率変化として可視化した。データを主成分分析のために処理する場合、ＤＥｓｅｑ法を使用して正規化を実施した。
選択された遺伝子発現を図８に示す。ＰＥＣ段階および第６段階（Ｓ６）の「Ｘ１」クローン、すなわち、ＴＸＮＩＰ ＫＯ／ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＨＬＡ－Ｅ ＫＩ＆Ｂ２Ｍ ＫＯ／ＴＮＦＡＩＰ３（Ａ２０）－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ ＫＩ（Ｘ１）からのＣＨＧＡ、ＦＯＸＡ２、ＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１およびＩＮＳの発現パターンは、野生型細胞から分化させた細胞のものと同様であった。
（実施例１２）
ＰＥＣ段階および第６段階におけるＣＨＧＡ、ＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１に関するフローサイトメトリー
ＰＥＣ段階および第６段階の凝集体をＰＢＳで洗浄し、次いで、３７℃でＡＣＣＵＭＡＸ（商標）（カタログ＃Ａ７０８９、Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）を使用して酵素により解離させて単一細胞懸濁液にした。ＭＡＣＳ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｃａｔ＃１３０－０９１－２２１、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｎｏｒｔｈ Ｒｈｉｎｅ－Ｗｅｓｔｐｈａｌｉａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加し、懸濁液を、４０μｍのフィルターを通過させ、ペレット化した。細胞内マーカー染色のために、細胞を４％（ｗｔ／ｖ）パラホルムアルデヒド中で３０分間固定し、ＦＡＣＳ Ｂｕｆｆｅｒ（ＰＢＳ、０．１％（ｗｔ／ｖ）ＢＳＡ、０．１％（ｗｔ／ｖ）ＮａＮ３）で洗浄し、次いで、細胞を、Ｐｅｒｍ Ｂｕｆｆｅｒ（ＰＢＳ、０．２％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００（Ｃａｔ＃Ａ１６０４６、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ、ＭＡ）、５％（ｖ／ｖ）正常ロバ血清、０．１％（ｗｔ／ｖ）ＮａＮ３）を用いて氷上で３０分間透過処理し、次いで、洗浄緩衝剤（ＰＢＳ、１％（ｗｔ／ｖ）ＢＳＡ、０．１％（ｗｔ／ｖ）ＮａＮ３）で洗浄した。細胞を、Ｂｌｏｃｋ Ｂｕｆｆｅｒ（ＰＢＳ、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００、５％（ｖ／ｖ）正常ロバ血清、０．１％（ｗｔ／ｖ）ＮａＮ３）で希釈した一次抗体（表１１）と共に４℃で一晩インキュベートした。細胞をＩＣ緩衝剤で洗浄し、次いで、適当な二次抗体と共に４℃で６０分間インキュベートした。細胞をＩＣ緩衝剤で、次いで、ＦＡＣＳ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄した。フローサイトメトリーデータをＮｏｖｏＣｙｔｅ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｒｕｓｓｅｌｓ）を用いて取得した。データを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）を使用して分析した。インタクトな細胞を、前方（小角）および側方（直角、９０°）光散乱に基づいて同定した。バックグラウンドを、抗体対照および未分化細胞を使用して推定した。図には亜集団の１つについての代表的なフローサイトメトリープロットが示されている。図に報告されている数字は、インタクトな細胞のゲーティングによる総細胞に対するパーセンテージを表す。
Figure 2024503291000013
図９は、野生型細胞または実施例６において生成した２種のＬ１Ｖ０２８クローン（すなわち、ＴＸＮＩＰ ＫＯ／ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＨＬＡ－Ｅ ＫＩ＆Ｂ２Ｍ ＫＯ／ＴＮＦＡＩＰ３（Ａ２０）－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ ＫＩ）から分化させたＰＥＣ細胞におけるＣＨＧＡ、ＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１に関するフローサイトメトリーを示す。図１０Ａおよび１０Ｂは、野生型細胞（図１０Ａ）またはＸ１細胞（すなわち、ＴＸＮＩＰ ＫＯ／ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＨＬＡ－Ｅ ＫＩ＆Ｂ２Ｍ ＫＯ／ＴＮＦＡＩＰ３（Ａ２０）－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ ＫＩ）（図１０Ｂ）から分化させた第６段階（Ｓ６）の細胞におけるＣＨＧＡ、ＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１に関するフローサイトメトリーを示す。
（実施例１３）
Ｂ２Ｍ ＫＯ／ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ ＫＩ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ有効性研究
膵臓内胚葉細胞を上の実施例２に記載のＢ２Ｍ ＫＯ／ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＴＮＦＡＩＰ３（Ａ２０）－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ ＫＩ（Ｌ１Ｖ００８）細胞株から生成し、改変されていないクローン細胞株を、非切断性（ｎｏｎ－ｃｕｔｔｉｎｇ）ガイドＲＮＡ（ＮＣＧ）を用いたトランスフェクションによって得た。
示されているクローン株に由来する膵臓内胚葉凝集体を有孔デバイス（ＰＤ）にローディングして、試験物または対照物を作製した。ＰＤにより、皮下移植した際の直接血管化が可能になり、封入された膵臓前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）がｉｎ ｖｉｖｏにおいてグルコース応答性インスリン産生細胞を含めた機能的な膵内分泌細胞に成熟した。
表１２に要約する通り、Ｌ１Ｖ００８および対照細胞を、それぞれの皮下に、それぞれおよそ７×１０６個の細胞を含有した２種の物品を埋め込んだ胸腺欠損ヌードラットの４つの群において試験した。
Figure 2024503291000014
１２週目に開始して、生存している動物の全てを、グルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）試験による有効性評価に供した。絶食させていない動物から、３ｇ／ｋｇのグルコースの腹腔内投与の前後に血液試料を得た。ヒトＣペプチドの血清中濃度を標準の酵素結合免疫吸着アッセイによって決定した。Ｃペプチドの読み取りを対照群（ＧＲＰ４）についてはグルコースの腹腔内投与の６０分後に行い、一方、実験群についての読み取りは投与の９０分後に行った。
図１１は、４つの群についての１２週間、１６週間、２０週間および２４週間目のＣペプチドレベルを示す。結果から、実験群間で実質的な差異がなかったことが示された。これらの結果から、導入された遺伝子改変とクローン株の生成に必要であった操作のいずれも、問題の細胞株がｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて膵臓内胚葉細胞に分化し、その後ｉｎ ｖｉｖｏにおいて機能的なベータ細胞を生成する能力に影響を及ぼさなかったことが示された。
（実施例１４）
Ｂ２Ｍ ＫＯ／ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ ＫＩ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ有効性研究
実施例４において調製されたＢ２Ｍ ＫＯ／ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ ＫＩ（Ｌ１Ｖ０１７）細胞株または対照細胞に由来する膵臓内胚葉凝集体を、上の実施例１３に記載の通り、ＧＳＩＳ試験のために、有孔デバイスにローディングし、動物に埋め込んだ。表１３に試験設計を示す。
Figure 2024503291000015
図１２に示されている通り、遺伝子改変およびこの細胞株の生成に必要であった操作は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて膵臓内胚葉細胞に分化し、その後、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて機能的なベータ細胞を生成する細胞の能力に影響を及ぼさなかった。
（実施例１５）
ＴＸＮＩＰ ＫＯ／ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＨＬＡ－Ｅ ＫＩ＆Ｂ２Ｍ ＫＯ／ＴＮＦＡＩＰ３（Ａ２０）－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ ＫＩ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ有効性研究
対照細胞（ＮＣＧ）または実施例６において生成したＬ１Ｖ０２８クローン（すなわち、ＴＸＮＩＰ ＫＯ／ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＨＬＡ－Ｅ ＫＩ＆Ｂ２Ｍ ＫＯ／ＴＮＦＡＩＰ３（Ａ２０）－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ ＫＩ；「Ｘ１」）から分化させたＰＥＣ段階の細胞および第６段階の細胞をｉｎ ｖｉｖｏ有効性について試験した。試験または対照カプセルをＮＳＧマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔｏｃｋ Ｎｏ：００５５５７）の左腎に移植した。表１４に試験設計を示す。
Figure 2024503291000016
ＧＳＩＳ試験を１２週間、１６週間、２０週間および２４週間目に実施した。図１３は、ＰＥＣ－対照群、ＰＥＣ－Ｘ１群、Ｓ６－対照群、およびＳ６－Ｘ１群の個々の動物についての１２週間および１６週間目のＣペプチドレベルを示す。図１４は、ＰＥＣ－対照群およびＰＥＣ－Ｘ１群についての１２週から２４週までの平均Ｃペプチドレベルの時間経過を示す。これらの結果から、Ｘ１細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて膵臓内胚葉細胞に分化し、その後、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて機能的なベータ細胞を生成することができることが示される。
ＧＳＩＳ試験後、２６週間目に、動物を安楽死させ、外植された試験物を中性緩衝ホルマリン中に固定し、スライドに加工し、インスリンおよびグルカゴンについてＨ＆Ｅを用いた、免疫組織化学的検査によって染色した。
「Ｘ１」細胞株（すなわち、Ｌ１Ｖ０２８）由来のいくつかの播種実行クローンもｉｎ ｖｉｖｏにおいて試験した。全ゲノム配列シーケンシングに基づいてクローンを選択した。それらは、Ｈｅｔ／Ｈｏｍオンサイト遺伝子型を有し、意図されたものではないプラスミド挿入を示さず、いかなる機能的に変更された癌遺伝子を有し得るバリアントも示さなかった。クローン６Ｄ０９は推定されるオフターゲットの挿入を有さなかったが、一方、クローン６Ｈ０７および５Ｃ１０は、少なくとも１つの推定されるオフターゲットの挿入を有する。１２週間および１６週間目にＧＳＩＳ試験を実施した。図１５は、１２週間、１６週間、および２０週間目の各動物についてのＣペプチドレベルおよび群平均レベルを示す。クローン６Ｄ０９、６Ｈ０７、および５Ｃ１０は良好なｉｎ ｖｉｖｏ効率を示した。
（実施例１６）
ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＣＤ７３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１のＫＩによりＢ２Ｍがノックアウト（ＫＯ）されたヒト多能性幹細胞の生成
ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＣＤ７３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１をコードする導入遺伝子がＢ２Ｍ遺伝子座に挿入され、それにより、Ｂ２Ｍ遺伝子がノックアウトされた細胞を生成した。
ヒト多能性幹細胞に、基本的に上の実施例２に記載の通り、以下の表１５に詳述されているＢ２Ｍ－ＣＡＧＧＳ－ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＣＤ７３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ドナープラスミド、およびＣａｓ９とＢ２Ｍ－２ ｇＲＮＡ（配列番号２）とを含むＲＮＰを電気穿孔した。
図１６は、Ｂ２Ｍ－ＣＡＧＧＳ－ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＣＤ７３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１プラスミドの概略図を示し、表１５は、そのプラスミド内のエレメントおよび位置を同定する。Ｂ２Ｍ－ＣＡＧＧＳ－ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＣＤ７３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ドナープラスミドは、Ｂ２Ｍ遺伝子座のエクソン１周辺と同一の配列を有する８００塩基対の相同アームに挟まれたＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＣＤ７３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１（配列番号５６）のｃＤＮＡの発現を駆動するためのＣＡＧＧＳプロモーターを含む。Ｂ２Ｍ－ＣＡＧＧＳ－ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＣＤ７３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ドナープラスミドの完全な配列は、配列番号４７のヌクレオチド配列を含む。
Figure 2024503291000017
電気穿孔の７～１０日後、細胞に対して、抗マウスＩｇＧ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＣＥＬＬｅｃｔｉｏｎ（商標）Ｐａｎ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ Ｋｉｔ、１１５３１Ｄを使用した磁気支援セルソーティング（ＭＡＣＳ）により、ＰＤ－Ｌ－１発現細胞の富化を行った。これらの富化された細胞は、高度にＰＤ－Ｌ－１陽性のバルクＫＩ集団を表していた。次いで、富化された細胞を、ＰＤ－Ｌ－１表面発現についてＷＯＬＦ ＦＡＣＳ－ｓｏｒｔｅｒ（Ｎａｎｏｃｅｌｌｅｃｔ）を使用して、ＳｔｅｍＦｌｅｘおよびＲｅｖｉｔａＣｅｌｌ（商標）を伴う、ＢＩＯＬＡＭＩＮＩＮ ５２１ ＣＴＧでコーティングされた９６ウェルプレート中にＦＡＣＳソーティングした。ＰＤ－Ｌ－１表面発現を検出するために、抗ＰＤ－Ｌ－１蛍光抗体を使用した（表４参照）。ＦＡＣＳによるソーティングに関して、編集されていない細胞が陰性対照としての機能を果たした。ＰＤ－Ｌ－１陽性細胞をソーティングおよび単一細胞クローニングのために選択した。
プレーティングした単一細胞を、正常酸素インキュベーター（３７℃、８％ＣＯ２）中で、培地を２日に１回交換しながら、コロニーが単一細胞として再播種するために十分な大きさになるまで成長させた。コンフルエントになったら、試料を維持およびゲノムＤＮＡ抽出のために分割した。ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＣＤ７３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ ＫＩ挿入について、Ｂ２Ｍ遺伝子座への挿入部位のプラスミド相同アームの外側から増幅させ、ＫＩにより組み込まれたＤＮＡのみを増幅させることを可能にするプライマーを使用してＰＣＲによって、正確に標的化されたクローンを同定した。クローンのＢ２Ｍ ＫＯの状態をＰＣＲおよびサンガーシーケンシングによって確認した。正確にＫＩおよびＫＯされたクローン（Ｌ１Ｖ０１８Ｂ細胞株）を、漸増組織培養フォーマットで、細胞３，０００万個の集団サイズに達するまで拡大させた。
（実施例１７）
ＴＮＦＡＩＰ３（Ａ２０）－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１のＫＩによりＢ２ＭがＫＯされたヒト多能性幹細胞の生成
ヒト多能性幹細胞に、基本的に上の実施例２に記載の通り、Ｂ２Ｍ－ＣＡＧＧＳ－ＴＮＦＡＩＰ３（Ａ２０）－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ドナープラスミド（配列番号３１、表７）およびＣａｓ９とＢ２Ｍ－２ ｇＲＮＡ（配列番号２）とを含むＲＮＰを電気穿孔して、Ｌ１Ｖ０１９Ｂ細胞株を生成した。図４は、Ｂ２Ｍ－ＣＡＧＧＳ－ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ドナープラスミド（Ｘ１－１カセットとも称される）の概略図を示す。
電気穿孔の７～１０日後、細胞に対して、抗マウスＩｇＧ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＣＥＬＬｅｃｔｉｏｎ（商標）Ｐａｎ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ Ｋｉｔ、１１５３１Ｄを使用した磁気支援セルソーティング（ＭＡＣＳ）により、ＰＤ－Ｌ－１発現細胞の富化を行った。これらの富化された細胞は、高度にＰＤ－Ｌ－１陽性のバルクＫＩ集団を表していた。次いで、富化された細胞を、ＰＤ－Ｌ－１表面発現についてＷＯＬＦ ＦＡＣＳ－ｓｏｒｔｅｒ（Ｎａｎｏｃｅｌｌｅｃｔ）を使用して、ＳｔｅｍＦｌｅｘおよびＲｅｖｉｔａＣｅｌｌ（商標）を伴う、ＢＩＯＬＡＭＩＮＩＮ ５２１ ＣＴＧでコーティングされた９６ウェルプレート中にＦＡＣＳソーティングした。ＰＤ－Ｌ－１表面発現を検出するために、抗ＰＤ－Ｌ－１蛍光抗体を使用した（表４参照）。ＦＡＣＳによるソーティングに関して、編集されていない細胞が陰性対照としての機能を果たした。ＰＤ－Ｌ－１陽性細胞をソーティングおよび単一細胞クローニングのために選択した。
プレーティングした単一細胞を、正常酸素インキュベーター（３７℃、８％ＣＯ２）中で、培地を２日に１回交換しながら、コロニーが単一細胞として再播種するために十分な大きさになるまで成長させた。コンフルエントになったら、試料を維持およびゲノムＤＮＡ抽出のために分割した。Ａ２０－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ ＫＩ挿入について、Ｂ２Ｍ遺伝子座への挿入部位のプラスミド相同アームの外側から増幅させ、ＫＩにより組み込まれたＤＮＡのみを増幅させることを可能にするプライマーを使用してＰＣＲによって、正確に標的化されたクローンを同定した。クローンのＢ２Ｍ ＫＯの状態をＰＣＲおよびサンガーシーケンシングによって確認した。正確にＫＩおよびＫＯされたクローン（Ｌ１Ｖ０１９Ｂ細胞株）を、漸増組織培養フォーマットで、細胞３，０００万個の集団サイズに達するまで拡大させた。
（実施例１８）
追加的な編集された細胞株の分化および特徴付け
上の実施例４において調製されたＬ１Ｖ０１７Ｂ細胞株（すなわち、ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ ＫＩおよびＢ２Ｍ ＫＯ）、上の実施例１６において調製されたＬ１Ｖ０１８Ｂ細胞株（すなわち、ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＣＤ７３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ ＫＩおよびＢ２Ｍ ＫＯ）、および上の実施例１７において調製されたＬ１Ｖ０１９Ｂ細胞株（すなわち、ＴＮＦＡＩＰ３（Ａ２０）－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ ＫＩおよびＢ２Ｍ ＫＯ）に由来の細胞を基本的に上の実施例１０に記載の通り分化させた。
基本的に上の実施例１１および１２に記載の分化プロセスの間の様々な時点で遺伝子発現を調査した。図１７は、ＤＥ（胚体内胚葉）細胞の存在を確認するための、１８日目におけるＳＯＸ１７発現およびＦＯＸＡ２発現に関するフローサイトメトリーを示す。分化した膵臓内胚葉細胞（ＰＥＣ）の存在を、フローサイトメトリーにより、ＣＨＧＡ陰性およびＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１陽性優勢集団の存在によってさらに確認した（図１８参照）。１６日目からの種々のマーカー（例えば、ＣＨＧＡ、ＦＯＸＡ２、ＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１、ＳＯＸ１７、ＡＦＰ、ＡＬＢ、ＣＤＸ２、ＨＡＮＤ１、ＨＡＮＤ２、ＮＡＮＯＧ）の膵島細胞までの発現の時間経過が図１９に示されている。
（実施例１９）
ＰＤ－Ｌ－１のＫＩによりＢ２ＭがＫＯされ、ＨＬＡ－ＥのＫＩによりＴＸＮＩＰがＫＯされ、ＣＤ３９ ＫＩによりＣＩＩＴＡがＫＯされたヒト多能性幹細胞の生成
ＰＤ－Ｌ－１をコードするポリヌクレオチドがＢ２Ｍ遺伝子座に挿入され、ＨＬＡ－ＥをコードするポリヌクレオチドがＴＸＮＩＰ遺伝子座に挿入され、ＣＤ３９をコードするポリヌクレオチドがＣＩＩＴＡ遺伝子座に挿入され、それにより、Ｂ２Ｍ遺伝子、ＴＸＮＩＰ遺伝子、およびＣＩＩＴＡ遺伝子がノックアウトされた細胞を生成する。
ヒト多能性幹細胞に、基本的に上の実施例２に記載の通り、ＰＤ－Ｌ－１配列（配列番号２０）がＢ２Ｍ遺伝子座の標的部位の左側および右側にそれぞれ位置するゲノム配列に対して配列相同性を有する８００ｂｐの相同アーム（配列番号１５および２２）に挟まれているＢ２Ｍ－ＣＡＧＧＳ－ＰＤ－Ｌ－１ドナープラスミド、およびＣａｓ９とＢ２Ｍ－２ ｇＲＮＡ（配列番号２）とを含むＲＮＰを電気穿孔する。電気穿孔の７～１０日後、細胞に対して、基本的に実施例２に記載の通り、ＭＡＣＳによるＰＤ－Ｌ－１発現（陽性）細胞の富化を行う。富化されたＰＤ－Ｌ－１陽性集団を拡大させた後、細胞に、基本的に上の実施例２に記載の通り、ＨＬＡ－Ｅ配列（配列番号４３）がＴＸＮＩＰ遺伝子座の標的部位の左側および右側にそれぞれ位置するゲノム配列に対して配列相同性を有する８００ｂｐのアーム（配列番号４２および４４）に挟まれているＴＸＮＩＰ－ＣＡＧＧＳ－ＨＬＡ－Ｅドナープラスミド、およびＣａｓ９とＴＸＮＩＰ＿エクソン１＿Ｔ５ ｇＲＮＡ（配列番号３７）とを含むＲＮＰを電気穿孔する。ＨＬＡ－Ｅ陽性細胞の富化ならびにＰＤ－Ｌ－１およびＨＬＡ－Ｅ細胞の拡大後、二重陽性細胞に、ＣＩＩＴＡ－ＣＡＧＧＳ－ＣＤ３９ドナープラスミド（表５）およびＣａｓ９とＣＩＩＴＡ Ｅｘ３＿Ｔ６ ｇＲＮＡ（配列番号２５）とを含むＲＮＰを電気穿孔する。細胞に対して、ＣＤ３９発現細胞の富化、拡大、ならびにＰＤ－Ｌ－１、ＨＬＡ－Ｅ、およびＣＤ３９三重陽性細胞についての選択を行い、その三重陽性細胞を上記の通り特徴付ける。
（実施例２０）
ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１のＫＩによりＢ２ＭがＫＯされ、ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＨＬＡ－ＥのＫＩによりＴＸＮＩＰがＫＯされ、ＣＤ３９－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１のＫＩによりＢ２ＭがＫＯされたヒト多能性幹細胞の生成
ＰＤ－Ｌ－１をコードするポリヌクレオチドがＢ２Ｍ遺伝子座の第１の標的部位に挿入され、ＨＬＡ－ＥをコードするポリヌクレオチドがＴＸＮＩＰ遺伝子座に挿入され、ＣＤ３９をコードするポリヌクレオチドがＢ２Ｍ遺伝子座の別の位置にある第２の標的部位に挿入され、それにより、Ｂ２Ｍ遺伝子およびＴＸＮＩＰ遺伝子がノックアウトされた細胞を生成する。
ＰＤ－Ｌ－１およびＨＬＡ－Ｅを発現する二重陽性細胞を基本的に上の実施例１６に記載の通り生成する。二重陽性細胞に、ＣＤ３９配列（配列番号２７）が第２のＢ２Ｍ標的部位周辺のゲノム配列に対して配列同一性を有する８００ｂｐの相同アームに挟まれているＢ２Ｍ－ＣＡＧＧＳ－ＣＤ３９ドナープラスミド、およびＣａｓ９と配列番号１または３～１３から選択されるＢ２Ｍ ｇＲＮＡとを含むＲＮＰを電気穿孔する。細胞に対して、ＣＤ３９陽性細胞の富化、拡大、ならびにＰＤ－Ｌ－１、ＨＬＡ－Ｅ、およびＣＤ３９三重陽性細胞についての選択を行い、その三重陽性細胞を上記の通り特徴付ける。
（実施例２１）
編集されたヒト胚性幹細胞の膵臓内胚葉細胞（ＰＥＣ）への分化
編集されたヒト胚性幹細胞（ＥＳ）の維持。種々の継代数（Ｐ３８～４２）の、ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１のＫＩによるＢ２ＭのＫＯ、ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＨＬＡ－ＥのＫＩによるＴＸＮＩＰのＫＯ、ＣＤ３９ ＫＩによるＣＩＩＴＡのＫＯを含む編集されたヒト多能性幹細胞（「Ｘ４」；実施例７参照）を、４日毎の継代については細胞約３３，０００個／ｃｍ２、または３日毎の継代については細胞約５０，０００個／ｃｍ２でｈＥＳＭ培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％ＫＳＲ＋１０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡおよび１０ｎｇ／ｍＬのヘレグリン）および最後の１０％ヒトＡＢ型血清に播種することによって維持した。
編集されたヒト胚性幹細胞のＰＥＣへの分化のための凝集。編集された細胞を、ＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）を用いて単一細胞に解離させ、次いで、遠心分離し、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中２％ＳｔｅｍＰｒｏ（Ｃａｔ＃Ａ１０００７０１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）に１ｍｌ当たり細胞１００万個で再懸濁させ、全部で３億５千万～４億個の細胞を８５０ｃｍ２のローラーボトル（Ｃａｔ＃４３１１９８、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）１本に播種し、８ＲＰＭ±０．５ＲＰＭの回転スピードで１８～２０時間置いた後、分化させた。編集されたヒト多能性幹細胞由来の凝集体を、ローラーボトル中、Schulz et al. (2012) PLoS ONE 7(5): e37004に記載されており、またＸ１細胞について示されている通り膵臓系列に分化させた。編集されたヒト多能性幹細胞由来の凝集体をRezania et al. (2014) Nat. Biotechnol. 32 (11): 1121-1133およびＵＳ２０２００２０８１１６に記載されている通り膵臓系列に分化させた。
ＰＥＣ段階および第６段階（Ｓ６）の「Ｘ４」クローン、すなわち、ＴＸＮＩＰ ＫＯ／ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＨＬＡ－Ｅ ＫＩ、Ｂ２Ｍ ＫＯ／ＴＮＦＡＩＰ３（Ａ２０）－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ ＫＩ、およびＣＩＩＴＡ ＫＯ／ＣＤ３９ ＫＩからのＣＨＧＡ、ＦＯＸＡ２、ＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１およびＩＮＳの発現パターンを決定して、分化を確認した。
（実施例２２）
ＴＸＮＩＰ ＫＯ／ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＨＬＡ－Ｅ ＫＩ＆Ｂ２Ｍ ＫＯ／ＴＮＦＡＩＰ３（Ａ２０）－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ ＫＩ、ＣＩＩＴＡ ＫＯ／ＣＤ３９ ＫＩ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ有効性研究
対照細胞（ＮＣＧ）またはＸ４（すなわち、ＴＸＮＩＰ ＫＯ／ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＨＬＡ－Ｅ ＫＩ＆Ｂ２Ｍ ＫＯ／ＴＮＦＡＩＰ３（Ａ２０）－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ ＫＩ、ＣＩＩＴＡ ＫＯ／ＣＤ３９ ＫＩ）から分化させたＰＥＣ段階の細胞および第６段階の細胞をｉｎ ｖｉｖｏ有効性についても試験する。試験または対照カプセルをＮＳＧマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔｏｃｋ Ｎｏ：００５５５７）の左腎に移植する。
Ｘ１細胞について実施例１５に記載の通り、ＧＳＩＳ試験を１２週間、１６週間、２０週間および２４週間目に実施する。ＧＳＩＳ試験後、２６週間目に、動物を安楽死させ、外植された試験物を中性緩衝ホルマリン中に固定し、スライドに加工し、インスリンおよびグルカゴンについてＨ＆Ｅを用いた、免疫組織化学的検査によって染色した。
（実施例２３）
ＴＧＦ－β２ ＫＯ有するＸ１ヒト多能性幹細胞の生成。
ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１をコードする導入遺伝子がＢ２Ｍ遺伝子座に挿入され、ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＨＬＡ－Ｅをコードする導入遺伝子がＴＸＮＩＰ遺伝子座に挿入され、ＣＤ３９をコードする導入遺伝子がＣＩＩＴＡ遺伝子座に挿入され、ＴＧＦ－β２遺伝子がノックアウトされ、それにより、細胞がＢ２Ｍ、ＴＸＮＩＰ、ＣＩＩＴＡおよびＴＧＦ－β２遺伝子のノックアウトを有する、細胞を生成した。
ヒト多能性幹細胞に、基本的に上の実施例２に記載の通り、Ｂ２Ｍ－ＣＡＧＧＳ－ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ドナープラスミド（配列番号３１、表７）およびＣａｓ９とＢ２Ｍ－２ ｇＲＮＡ（配列番号２）とを含むＲＮＰを電気穿孔した。電気穿孔の７～１０日後、細胞に対して、基本的に実施例２に記載の通り、ＭＡＣＳにより、ＰＤ－Ｌ－１発現（陽性）細胞の富化を行った。富化されたＰＤ－Ｌ－１陽性集団を拡大させた後、細胞に、基本的に上の実施例２に記載の通り、ＴＸＮＩＰ－ＣＡＧＧＳ－ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＨＬＡ－Ｅドナープラスミド（配列番号４５、表９）およびＣａｓ９とＴＸＮＩＰ＿エクソン１＿Ｔ５ ｇＲＮＡ（配列番号３７）とを含むＲＮＰを電気穿孔した。ＨＬＡ－Ｅ陽性細胞の富化ならびにＰＤ－Ｌ－１およびＨＬＡ－Ｅ細胞の拡大後、二重陽性細胞に、ＣＩＩＴＡ－ＣＡＧＧＳ－ＣＤ３９ドナープラスミド（配列番号２９、表５）およびＣａｓ９とＣＩＩＴＡ Ｅｘ３＿Ｔ６ ｇＲＮＡ（配列番号２５）とを含むＲＮＰを電気穿孔した。細胞に対して、ＣＤ３９発現細胞の富化、拡大、ならびにＰＤ－Ｌ－１、ＨＬＡ－Ｅ、およびＣＤ３９三重陽性細胞についての選択を行い、その三重陽性細胞を上記の通り特徴付けた。
Ｂ２Ｍ遺伝子、ＴＸＮＩＰ遺伝子、およびＣＩＩＴＡ遺伝子もノックアウトされた、確認された三重陽性細胞に、Ｃａｓ９とＴＧＦ－β２ ｇＲＮＡとを含むＲＮＰを電気穿孔して、ＴＧＦ－β２ノックアウトを生成した。ＴＧＦ－β２ ｇＲＮＡ１（５’－ＧＴＴＣＡＴＧＣＧＣＡＡＧＡＧＧＡＴＣＧ－３’（配列番号５７）、ＰＡＭはＡＧＧである）を使用して、Ｘ１クローンおよびＸ４バルク細胞株におけるＴＧＦ－β２タンパク質を、ＴＧＦ－β２遺伝子エクソン１にフレームシフト変異を引き起こすことによってノックアウトした。これらの富化されたｈＥＳＣ細胞に、Ｎｅｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒを使用し、Ｃａｓ９タンパク質（Ｂｉｏｍａｙ）とガイドＲＮＡ（ＩＤＴ）の、モル比が５：１（ｇＲＮＡ：Ｃａｓ９）であり、絶対値が細胞１００万個当たり１２５ｐｍｏｌのＣａｓ９および６２５ｐｍｏｌのｇＲＮＡであるＲＮＰ混合物を用いて電気穿孔を行った。ＲＮＰ複合体を形成するために、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９を１つの容器中でＲ－緩衝剤（Ｎｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）と組み合わせて総体積を２５～５０μＬにし、室温（ＲＴ）で１５分間インキュベートした。次いで、この混合物を、Ｒ－緩衝剤を使用し、細胞と組み合わせて総体積を約１１５μＬにした。次いで、この混合物に対して、１５００Ｖで２０ｍｓのパルスを１回用いて電気穿孔した。電気穿孔後、細胞をピペット操作により取り出し、ＲＥＶＩＴＡＣＥＬＬ（商標）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（１００×）およびラミニン５１１を伴うＳＴＥＭＦＬＥＸ（商標）培地を充填した６ウェルプレート中に入れた。細胞を正常酸素インキュベーター（３７℃、８％ＣＯ２）中で培養した。ＴＧＦ－β２ ｇＲＮＡを用いて標的化されたＬ３Ｖ００３Ｂ（「Ｘ４」）集団をＬ３Ｖ００４Ｂ（「Ｘ４＋ＴＧＦ－β２ ＫＯ」）と名付け、一方、ＴＧＦ－β２ ｇＲＮＡを用いて標的化されたＸ１クローン集団をＬ３Ｖ００２Ｂ（「Ｘ１＋ＴＧＦ－β２ ＫＯ」）と名付けた。高効率のＴＧＦ－β２ ＫＯを確実にするために、このプロセスをＬ３Ｖ００４Ｂ集団についてはもう１回およびＬ３Ｖ００２Ｂについては２回繰り返した。
プレーティングした単一細胞を、正常酸素インキュベーター（３７℃、８％ＣＯ２）中、培地を２日に１回交換しながら、コロニーが単一細胞として再播種するために十分な大きさになるまで成長させた。コンフルエントになったら、試料を維持およびゲノムＤＮＡ抽出のために分割した。正確に標的化されたクローンをＰＣＲおよびサンガーシーケンシングによって確認した。
標的ＴＧＦ－β２配列に対するＰＣＲを実施し、得られた増幅したＤＮＡをカット効率についてＴＩＤＥ分析によって評定した。関連性のある領域に対するＰＣＲをＰｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ＃１２５３２０１７６およびＣａｔ＃１１４９５０１７）を使用して実施した。ＰＣＲプライマーの配列を表１６に示す。図２０Ａおよび２０Ｂは、２種のバルクの編集された株Ｌ３Ｖ００２（「ＴＧＦＢ２－ＫＯ－Ｆ１」）およびＬ３Ｖ００４（「ＴＧＦＢ２－ＫＯ－ＣＤ３９－Ｆ１」）についてのＴＧＦ－β２ ＫＯ編集効率を示す。どちらの集団も８０％を超えるＫＯを有し、所望の閾値を超え、最も顕著な編集は＋１および－７インデルであった。
Figure 2024503291000018
（実施例２４）
編集されたヒト胚性幹細胞の膵臓内胚葉細胞（ＰＥＣ）への分化
編集されたヒト胚性幹細胞（ＥＳ）の維持。種々の継代数（Ｐ３８～４２）の、ＴＮＦＡＩＰ３－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１のＫＩによるＢ２ＭのＫＯ、ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＨＬＡ－ＥのＫＩによるＴＸＮＩＰのＫＯ、ＣＤ３９ ＫＩによるＣＩＩＴＡのＫＯ、およびＴＧＦ－β２のＫＯ（「Ｘ４＋ＴＧＦ－β２ ＫＯ」）を含む編集されたヒト多能性幹細胞を、４日毎の継代については細胞約３３，０００個／ｃｍ２、または３日毎の継代については細胞約５０，０００個／ｃｍ２でｈＥＳＭ培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％ＫＳＲ＋１０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡおよび１０ｎｇ／ｍＬのヘレグリン）および最後の１０％ヒトＡＢ型血清に播種することによって維持した。
編集されたヒト胚性幹細胞のＰＥＣへの分化のための凝集。編集された細胞を、ＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）を用いて単一細胞に解離させ、次いで、遠心分離し、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中２％ＳｔｅｍＰｒｏ（Ｃａｔ＃Ａ１０００７０１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）に１ｍｌ当たり細胞１００万個で再懸濁させ、全部で３億５千万～４億個の細胞を８５０ｃｍ２のローラーボトル（Ｃａｔ＃４３１１９８、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）１本に播種し、８ＲＰＭ±０．５ＲＰＭの回転スピードで１８～２０時間置いた後、分化させた。編集されたヒト多能性幹細胞由来の凝集体を、ローラーボトル中、Schulz et al. (2012) PLoS ONE 7(5): e37004に記載されており、またＸ１細胞について示されている通り膵臓系列に分化させた。編集されたヒト多能性幹細胞由来の凝集体をRezania et al. (2014) Nat. Biotechnol. 32 (11): 1121-1133およびＵＳ２０２００２０８１１６に記載されている通り膵臓系列に分化させた。
ＰＥＣ段階および第６段階（Ｓ６）の「Ｘ４＋ＴＧＦ－β２ ＫＯ」クローン、すなわち、ＴＸＮＩＰ ＫＯ／ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＨＬＡ－Ｅ ＫＩ＆Ｂ２Ｍ ＫＯ／ＴＮＦＡＩＰ３（Ａ２０）－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ ＫＩ（Ｘ１）ＣＩＩＴＡ ＫＯ／ＣＤ３９ ＫＩおよびＴＧＦ－β２ ＫＯからのＣＨＧＡ、ＦＯＸＡ２、ＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１およびＩＮＳの発現パターンを決定して、分化を確認した。
（実施例２５）
Ｂ２Ｍ ＫＯおよびＸ１ ＰＥＣ細胞を用いた免疫回避アッセイ
Ｂ２Ｍ ＫＯおよびＴＸＮＩＰ ＫＯ／ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＨＬＡ－Ｅ ＫＩ＆Ｂ２Ｍ ＫＯ／ＴＮＦＡＩＰ３（Ａ２０）－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ ＫＩ（「Ｘ１」）細胞の、培地中、ＴＧＦ－βシグナル伝達を伴う場合、およびＴＧＦ－βシグナル伝達の非存在下での免疫応答を回避する能力を、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）増殖アッセイを使用した免疫回避アッセイを使用して試験した。アッセイは、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）ＣＦＳＥ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔを提供する製造者の指示に従って行った。簡単に述べると、編集されたＰＥＣ細胞または非切断性対照ＰＥＣ細胞、ＩＬ－２およびヒト血清を含み、ＴＧＦ－β 遮断抗体を伴うまたは伴わないＸ－ＶＩＶＯ－１５培地に、蛍光標識されたＰＢＭＣを添加した。ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２およびＴＧＦ－β３に対する抗体を使用して、タンパク質を培地中のシグナル伝達から遮断し、ＴＧＦβ媒介性免疫回避を阻害した。ｄｙｅ－ｄｉｌｕｔｉｏｎ ＣＦＳＥ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｋｉｔを使用し、５日間の期間にわたってＰＢＭＣ細胞増殖をモニタリングした。ＴＧＦ－β遮断薬を用いなかった場合、または用いた場合のＰＢＭＣ活性化データが図２１に提示されている。結果から、ＴＧＦ－βが遮断されない場合、いずれの試料についてもＴ細胞活性化が誘導されなかったので、全てのＰＥＣが「免疫回避」することが示される。ＴＧＦ－βが遮断された場合、より大きなＴ細胞活性化が認められた。ＮＣＧ（正常なＢ２Ｍを有する非切断性対照）ではＰＢＭＣ単独対照を超えるＴ細胞活性化応答が駆動されたが、Ｂ２Ｍ ＫＯおよびＸ１（同じくＢ２Ｍ ＫＯを有する）ＰＥＣではどちらもベースラインを下回り、これにより、Ｘ１ ＰＥＣおよびＢ２Ｍ ＫＯ ＰＥＣは免疫回避的であったが、一方、ＮＣＧ ＰＥＣは同種他家由来ＰＢＭＣに対して穏やかな免疫原性を有したことが示唆される。
（実施例２６）
編集し分化させたＰＥＣ細胞のＴＧＦ－β２分泌についての特徴付け。
編集し分化させた細胞におけるＴＧＦ－β１およびＴＧＦ－β２分泌レベルプロファイルを、７２時間馴化培地中、抗ＴＧＦ－β１抗体および抗ＴＧＦ－β２抗体を使用したＥＬＩＳＡに基づくアッセイを使用して試験した。使用した抗体を下記の表に提示する。
Figure 2024503291000019
ＴＧＦ－β２およびＴＧＦ－β１分泌プロファイルを、ＴＧＦ－β２ ＫＯ細胞ならびにＨＬＡ－Ｅ ＫＩ、ＴＸＮＩＰ ＫＯ、ＰＤ－Ｌ－１ ＫＩ、およびＢ２Ｍ ＫＯを有する編集された細胞（「Ｖ１Ｂ」）において決定した。結果から、Ｖ１Ｂ細胞およびＴＧＦ－β２ ＫＯ細胞のどちらも、馴化培地中のＴＧＦ－β２については検出不可能なレベルを示したことが示される（図２２Ａ参照）。しかし、興味深いことに、ＴＧＦ－β２ ＫＯ細胞からの馴化培地ではより高いレベルのＴＧＦ－β１分泌が示された（図２２Ｂ参照）。
（実施例２７）
ＴＧＦ－β２ ＫＯ細胞によって分泌される化学誘引物質の特徴付け
線維芽細胞遊走およびその結果生じる線維症は、生着した細胞によって分泌される化学誘引物質によって方向づけられる。ＥＬＩＳＡに基づく手法を使用して、ＴＧＦ－β２ ＫＯ細胞による化学誘引物質の分泌がＶ１Ｂ細胞（ＨＬＡ－Ｅ ＫＩ、ＴＸＮＩＰ ＫＯ、ＰＤ－Ｌ－１ ＫＩ、Ｂ２Ｍ ＫＯ）およびＸ１（実施例２６において表に提示されている抗体）と比較して減少しているかどうかを確認した。試験した化学誘引物質にはＴＧＦ－β２（図２３Ａ参照）、増殖分化因子（ＧＤＦ－９、図２３Ｂ参照）、および血小板由来増殖因子－ＡＡ（ＰＤＧＦ－ＡＡ、図２３Ｃ参照）が含まれた。
結果から、Ｖ１Ｂ細胞およびＴＧＦ－β２ ＫＯ細胞のどちらでも、ＴＧＦ－β２およびＧＤＦ－９の分泌の著しい減少が示されたことが示唆される。しかし、ＰＤＧＦ－ＡＡの分泌の減少はＴＧＦ－β２ ＫＯ細胞のみで示された。
（実施例２８）
ｉｎ－ｖｉｔｒｏ線維芽細胞遊走アッセイ。
ｉｎ－ｖｉｔｒｏ線維芽細胞遊走アッセイを、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ／ＳｉｇｍａからのＱＣＭ走化性細胞遊走アッセイキット（ｃａｔ＃ＥＣＭ５０９）を使用し、製造者の指示の通り行った。簡単に述べると、ＭＲＣ－５細胞（ヒト肺線維芽細胞）またはＨＴ１０８０細胞（ヒト線維肉腫）を含む細胞懸濁液をアッセイセルの上部チャンバーに入れた。この上部チャンバーは、野生型、Ｖ１Ｂ、ＴＧＦ－β２ ＫＯ、Ｘ１、Ｘ４、および／またはＸ４＋ＴＧＦ－β２ ＫＯ ＰＥＣ細胞由来の７２時間馴化培地を含む外側のチャンバーと孔径８μｍのポリカーボネート膜によって分離されている。細胞を２～２４時間ポリカーボネート膜を通して遊走させた。遊走した細胞は膜の底部に付着した。遊走した細胞を膜から解離させ、溶解させた。ＣｙＱｕａｎｔ ＧＲ Ｄｙｅを使用して細胞を数量化した。図２４Ａ～２４Ｂは、ヒト肺線維芽細胞（ＭＲＣ－５）細胞と、ＷＴ、Ｖ１Ｂ、およびＸ１細胞由来の馴化培地（図２４Ａ）、ならびにＷＴおよびＴＧＦ－β２ ＫＯ細胞由来の馴化培地（図２４Ｂ）を使用して実施した線維芽細胞遊走アッセイ結果を示す。図２５Ａ～２５Ｃは、ヒト線維肉腫（ＨＴ１０８０）細胞と、ＷＴ、Ｖ１Ｂ、およびＸ１細胞由来の馴化培地（図２５Ａ）、ＷＴおよびＴＧＦ－β２ ＫＯ細胞由来の馴化培地（図２５Ｂ）、ならびにＷＴ、Ｘ４、およびＸ４＋ＴＧＦ－β２ ＫＯ細胞由来の馴化培地（図２５Ｃ）を使用して実施した線維芽細胞遊走アッセイ結果を示す。示されているデータから分かる通り、どちらのＴＧＦ－β２ ＫＯ編集されたＰＥＣ馴化培地によっても、野生型と比較して線維芽細胞の遊走の減少が支持された。
（実施例２９）
ＴＸＮＩＰ ＫＯ／ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＨＬＡ－Ｅ ＫＩ＆Ｂ２Ｍ ＫＯ／ＴＮＦＡＩＰ３（Ａ２０）－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ ＫＩ、ＣＩＩＴＡ ＫＯ／ＣＤ３９ ＫＩおよびＴＧＦ－β２ ＫＯ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ有効性研究
対照細胞（ＮＣＧ）または実施例２４において生成したＸ４＋ＴＧＦ－β２ ＫＯ細胞株（すなわち、ＴＸＮＩＰ ＫＯ／ＭＡＮＦ－Ｐ２Ａ－ＨＬＡ－Ｅ ＫＩ、Ｂ２Ｍ ＫＯ／ＴＮＦＡＩＰ３（Ａ２０）－Ｐ２Ａ－ＰＤ－Ｌ－１ ＫＩ、ＣＩＩＴＡ ＫＯ／ＣＤ３９ ＫＩ、およびＴＧＦ－β２ ＫＯ）から分化させたＰＥＣ段階の細胞および第６段階の細胞をｉｎ ｖｉｖｏ有効性について試験する。試験または対照カプセルをＮＳＧマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔｏｃｋ Ｎｏ：００５５５７）の左腎に移植する。
実施例１４にＸ１細胞について記載の通りＧＳＩＳ試験を１２週間、１６週間、２０週間および２４週間目に実施する。ＧＳＩＳ試験後、２６週間目に、動物を安楽死させ、外植された試験物を中性緩衝ホルマリン中に固定し、スライドに加工し、インスリンおよびグルカゴンについてＨ＆Ｅを用いた、免疫組織化学的検査によって染色する。

Claims (101)

  1. ユニバーサルドナー細胞を生成するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、
    （ａ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼならびに第１の標的遺伝子座における標的部位を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ならびに腫瘍壊死因子アルファ誘導タンパク質３（ＴＮＦＡＩＰ３）、中脳アストロサイト由来神経栄養因子（ＭＡＮＦ）、分化抗原群３９（ＣＤ３９）および／もしくは分化抗原群７３（ＣＤ７３）をコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸であって、前記第１の標的遺伝子座を前記標的部位において切断し、前記第１の核酸を前記標的遺伝子座に挿入し、それにより、前記標的遺伝子を破壊する、第１の核酸；ならびに／または
    （ｂ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼおよびベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子座における標的部位を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）であって、前記Ｂ２Ｍ遺伝子座を前記標的部位において切断し、それにより、前記Ｂ２Ｍ遺伝子を破壊する、ガイドＲＮＡ；ならびに／または
    （ｃ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼおよびチオレドキシン相互作用タンパク質（ＴＸＮＩＰ）遺伝子座における標的部位を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）であって、前記ＴＸＮＩＰ遺伝子座を前記標的部位において切断し、それにより、前記ＴＸＮＩＰ遺伝子を破壊する、ガイドＲＮＡ；ならびに／または
    （ｄ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼおよびクラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子座における標的部位を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）であって、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子座を前記標的部位において切断し、それにより、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子を破壊する、ガイドＲＮＡ；ならびに／または
    （ｅ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼおよびトランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）遺伝子座における標的部位を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）であって、前記ＴＧＦβ遺伝子座を前記標的部位において切断し、それにより、前記ＴＧＦβ遺伝子を破壊する、ガイドＲＮＡ
    を幹細胞に送達するステップを含む、方法。
  2. （ａ）の標的遺伝子座が、（ｂ）のＢ２Ｍ遺伝子座またはベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子座、（ｃ）のＴＸＮＩＰ遺伝子座またはチオレドキシン相互作用タンパク質（ＴＸＮＩＰ）遺伝子座、（ｄ）のＣＩＩＴＡ遺伝子座またはクラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子座、および（ｅ）のＴＧＦβ遺伝子座またはトランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）遺伝子座から選択され、前記ユニバーサルドナー細胞が、Ｂ２Ｍ、ＴＸＮＩＰ、ＣＩＩＴＡおよび／またはＴＧＦβの発現の破壊を有する、請求項１に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  3. Ｂ２Ｍ、ＴＸＮＩＰ、ＣＩＩＴＡおよび／またはＴＧＦβの発現の破壊が、Ｂ２Ｍ、ＴＸＮＩＰ、ＣＩＩＴＡおよび／またはＴＧＦβの発現の低減または排除を含む、請求項１または２に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  4. （ａ）の標的遺伝子座が、前記Ｂ２Ｍ遺伝子座であり、前記核酸が、（ｉ）前記Ｂ２Ｍ遺伝子座における標的部位の左側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列；および（ｉｉ）前記Ｂ２Ｍ遺伝子座における標的部位の右側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列をさらに含み、ＴＮＦＡＩＰ３、ＭＡＮＦ、ＣＤ３９および／もしくはＣＤ７３をコードする前記ヌクレオチド配列が、（ｉ）と（ｉｉ）に挟まれている；ならびに／または（ａ）の標的遺伝子座が、（ｂ）のＢ２Ｍ遺伝子座であり、前記第１の核酸が、（ｉｉｉ）（ｂ）のＢ２Ｍ遺伝子座における標的部位の左側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列；および（ｉｖ）（ｂ）のＢ２Ｍ遺伝子座における標的部位の右側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列をさらに含み、ＴＮＦＡＩＰ３、ＭＡＮＦ、ＣＤ３９および／もしくはＣＤ７３をコードする前記ヌクレオチド配列が、（ｉｉｉ）と（ｉｖ）に挟まれている；かつ、前記ユニバーサルドナー細胞が、Ｂ２Ｍの発現の破壊を有する、請求項１から３までのいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  5. （ｉ）または（ｉｉｉ）のヌクレオチド配列が、配列番号１５を含むまたはそれから本質的になる、請求項４に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  6. （ｉｉ）または（ｉｖ）のヌクレオチド配列が、配列番号２２を含むまたはそれから本質的になる、請求項４または５に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  7. （ａ）の標的遺伝子座が、前記ＴＸＮＩＰ遺伝子座であり、前記核酸が、（ｉ）前記ＴＸＮＩＰ遺伝子座における標的部位の左側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列；および（ｉｉ）前記ＴＸＮＩＰ遺伝子座における標的部位の右側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列をさらに含み、ＴＮＦＡＩＰ３、ＭＡＮＦ、ＣＤ３９および／もしくはＣＤ７３をコードする前記ヌクレオチド配列が、（ｉ）と（ｉｉ）に挟まれている；ならびに／または（ａ）の標的遺伝子座が、（ｃ）のＴＸＮＩＰ遺伝子座であり、前記第１の核酸が、（ｉｉｉ）（ｃ）のＴＸＮＩＰ遺伝子座における標的部位の左側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列；および（ｉｖ）（ｃ）のＴＸＮＩＰ遺伝子座における標的部位の右側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列をさらに含み、ＴＮＦＡＩＰ３、ＭＡＮＦ、ＣＤ３９および／もしくはＣＤ７３をコードする前記ヌクレオチド配列が、（ｉｉｉ）と（ｉｖ）に挟まれている、かつ、前記ユニバーサルドナー細胞が、ＴＸＮＩＰの発現の破壊を有する、請求項１から３までのいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  8. （ｉ）または（ｉｉｉ）のヌクレオチド配列が、配列番号４２を含むまたはそれから本質的になる、請求項７に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  9. （ｉｉ）または（ｉｖ）のヌクレオチド配列が、配列番号４４を含むまたはそれから本質的になる、請求項７または８に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  10. （ａ）の標的遺伝子座が、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子座であり、前記核酸が、（ｉ）前記ＣＩＩＴＡ遺伝子座における標的部位の左側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列；および（ｉｉ）前記ＣＩＩＴＡ遺伝子座における標的部位の右側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列をさらに含み、ＴＮＦＡＩＰ３、ＭＡＮＦ、ＣＤ３９および／もしくはＣＤ７３をコードする前記ヌクレオチド配列が、（ｉ）と（ｉｉ）に挟まれている；ならびに／または（ａ）の標的遺伝子座が、（ｄ）のＣＩＩＴＡ遺伝子座であり、前記核酸が、（ｉｉｉ）（ｄ）のＣＩＩＴＡ遺伝子座における標的部位の左側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列；および（ｉｖ）（ｄ）のＣＩＩＴＡ遺伝子座における標的部位の右側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列をさらに含み、ＴＮＦＡＩＰ３、ＭＡＮＦ、ＣＤ３９および／もしくはＣＤ７３をコードする前記ヌクレオチド配列が、（ｉｉｉ）と（ｉｖ）に挟まれている；かつ、前記ユニバーサルドナー細胞が、ＣＩＩＴＡの発現の破壊を有する、請求項１から３までのいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  11. （ｉ）または（ｉｉｉ）のヌクレオチド配列が、配列番号２６を含むまたはそれから本質的になる、請求項１０に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  12. （ｉｉ）または（ｉｖ）のヌクレオチド配列が、配列番号２８を含むまたはそれから本質的になる、請求項１０または１１に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  13. （ａ）の標的遺伝子座が、前記ＴＧＦβ遺伝子座であり、前記核酸が、（ｉ）前記ＴＧＦβ遺伝子座における標的部位の左側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列；および（ｉｉ）前記ＴＧＦβ遺伝子座における標的部位の右側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列をさらに含み、ＴＮＦＡＩＰ３、ＭＡＮＦ、ＣＤ３９および／もしくはＣＤ７３をコードする前記ヌクレオチド配列が、（ｉ）と（ｉｉ）に挟まれている；ならびに／または（ａ）の標的遺伝子座が、（ｅ）のＴＧＦβ遺伝子座であり、前記核酸が、（ｉｉｉ）（ｅ）のＴＧＦβ遺伝子座における標的部位の左側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列；および（ｉｖ）（ｅ）のＴＧＦβ遺伝子座における標的部位の右側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列をさらに含み、ＴＮＦＡＩＰ３、ＭＡＮＦ、ＣＤ３９および／もしくはＣＤ７３をコードする前記ヌクレオチド配列が、（ｉｉｉ）と（ｉｖ）に挟まれている；かつ、前記ユニバーサルドナー細胞が、ＴＧＦβの発現の破壊を有する、請求項１から３までのいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  14. （ｂ）の標的部位が、配列番号１～１３のいずれか１つから本質的になるヌクレオチド配列を含む、請求項１から１３までのいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  15. （ｃ）の標的部位が、配列番号３２～４１のいずれか１つから本質的になるヌクレオチド配列を含む、請求項１から１４までのいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  16. （ｄ）の標的部位が、配列番号２５および４８～５１のいずれか１つから本質的になるヌクレオチド配列を含む、請求項１から１５までのいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  17. （ｅ）の標的部位が、配列番号５７から本質的になるヌクレオチド配列を含む、請求項１から１６までのいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  18. （ｆ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼならびに標的遺伝子座における標的部位を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ならびに腫瘍壊死因子アルファ誘導タンパク質３（ＴＮＦＡＩＰ３）、中脳アストロサイト由来神経栄養因子（ＭＡＮＦ）、分化抗原群３９（ＣＤ３９）、分化抗原群７３（ＣＤ７３）、ＨＬＡクラスＩ組織適合性抗原、アルファ鎖Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）および／またはプログラム死－リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を前記幹細胞に送達するステップであって、前記標的遺伝子座を前記標的部位において切断し、ＴＮＦＡＩＰ３、ＭＡＮＦ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＨＬＡ－Ｅ、および／またはＰＤ－Ｌ１をコードする前記ヌクレオチド配列を含む前記核酸を前記標的遺伝子座に挿入し、それにより、前記標的遺伝子を破壊する、ステップ
    をさらに含む、請求項１から１７までのいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  19. （ｆ）の標的遺伝子座が、ベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子座もしくは（ｂ）のＢ２Ｍ遺伝子座、チオレドキシン相互作用タンパク質（ＴＸＮＩＰ）遺伝子座もしくは（ｃ）のＴＸＮＩＰ遺伝子座、クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子座もしくは（ｄ）のＣＩＩＴＡ遺伝子座および／またはトランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）遺伝子座もしくは（ｅ）のＴＧＦβ遺伝子座から選択され、前記ユニバーサルドナー細胞が、Ｂ２Ｍ、ＴＸＮＩＰ、ＣＩＩＴＡおよび／またはＴＧＦβの発現の破壊を有する、請求項１８に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  20. （ｆ）の標的遺伝子座が、前記Ｂ２Ｍ遺伝子座であり、（ｆ）の核酸が、（ｉ）前記Ｂ２Ｍ遺伝子座における標的部位の左側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列；および（ｉｉ）前記Ｂ２Ｍ遺伝子座における標的部位の右側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列をさらに含み、ＴＮＦＡＩＰ３、ＭＡＮＦ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＨＬＡ－Ｅ、および／もしくはＰＤ－Ｌ１をコードする前記ヌクレオチド配列が、（ｉ）と（ｉｉ）に挟まれている；ならびに／または（ｆ）の標的遺伝子座が、（ｂ）のＢ２Ｍ遺伝子座であり、前記核酸が、（ｉｉｉ）（ｂ）のＢ２Ｍ遺伝子座における標的部位の左側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列；および（ｉｖ）（ｂ）のＢ２Ｍ遺伝子座における標的部位の右側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列をさらに含み、ＴＮＦＡＩＰ３、ＭＡＮＦ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＨＬＡ－Ｅ、および／もしくはＰＤ－Ｌ１をコードする前記ヌクレオチド配列が、（ｉｉｉ）と（ｉｖ）に挟まれている；かつ、前記ユニバーサルドナー細胞が、Ｂ２Ｍの発現の破壊を有する、請求項１８または１９に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  21. （ｉ）または（ｉｉｉ）のヌクレオチド配列が、配列番号１５を含むまたはそれから本質的になる、請求項２０に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  22. （ｉｉ）または（ｉｖ）のヌクレオチド配列が、配列番号２２を含むまたはそれから本質的になる、請求項２０または２１に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  23. （ｆ）の標的遺伝子座が、前記ＴＸＮＩＰ遺伝子座であり、（ｆ）の核酸が、（ｉ）前記ＴＸＮＩＰ遺伝子座における標的部位の左側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列；および（ｉｉ）前記ＴＸＮＩＰ遺伝子座における標的部位の右側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列をさらに含み、ＴＮＦＡＩＰ３、ＭＡＮＦ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＨＬＡ－Ｅ、および／もしくはＰＤ－Ｌ１をコードする前記ヌクレオチド配列が、（ｉ）と（ｉｉ）に挟まれている、ならびに／または（ｆ）の標的遺伝子座が、（ｃ）のＴＸＮＩＰ遺伝子座であり、前記核酸が、（ｉｉｉ）（ｃ）のＴＸＮＩＰ遺伝子座における標的部位の左側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列；および（ｉｖ）（ｃ）のＴＸＮＩＰ遺伝子座における標的部位の右側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列をさらに含み、ＴＮＦＡＩＰ３、ＭＡＮＦ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＨＬＡ－Ｅ、および／もしくはＰＤ－Ｌ１をコードする前記ヌクレオチド配列が、（ｉｉｉ）と（ｉｖ）に挟まれている；かつ、前記ユニバーサルドナー細胞が、ＴＸＮＩＰの発現の破壊を有する、請求項１９に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  24. （ｉ）または（ｉｉｉ）のヌクレオチド配列が、配列番号４２を含むまたはそれから本質的になる、請求項２３に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  25. （ｉｉ）または（ｉｖ）のヌクレオチド配列が、配列番号４４を含むまたはそれから本質的になる、請求項２３または２４に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  26. （ｆ）の標的遺伝子座が、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子座であり、（ｆ）の核酸が、（ｉ）前記ＣＩＩＴＡ遺伝子座における標的部位の左側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列；および（ｉｉ）前記ＣＩＩＴＡ遺伝子座における標的部位の右側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列をさらに含み、ＴＮＦＡＩＰ３、ＭＡＮＦ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＨＬＡ－Ｅ、および／もしくはＰＤ－Ｌ１をコードする前記ヌクレオチド配列が、（ｉ）と（ｉｉ）に挟まれている、ならびに／または（ｆ）の標的遺伝子座が、（ｄ）のＣＩＩＴＡ遺伝子座であり、前記核酸が、（ｉｉｉ）（ｄ）のＣＩＩＴＡ遺伝子座における標的部位の左側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列；および（ｉｖ）（ｄ）のＣＩＩＴＡ遺伝子座における標的部位の右側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列をさらに含み、ＴＮＦＡＩＰ３、ＭＡＮＦ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＨＬＡ－Ｅ、および／もしくはＰＤ－Ｌ１をコードする前記ヌクレオチド配列が、（ｉｉｉ）と（ｉｖ）に挟まれている；かつ、前記ユニバーサルドナー細胞が、ＣＩＩＴＡの発現の破壊を有する、請求項１８または１９に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  27. （ｉ）または（ｉｉｉ）のヌクレオチド配列が、配列番号２６を含むまたはそれから本質的になる、請求項２６に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  28. （ｉｉ）または（ｉｖ）のヌクレオチド配列が、配列番号２８を含むまたはそれから本質的になる、請求項２６または２７に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  29. （ｆ）の標的遺伝子座が、前記ＴＧＦβ遺伝子座であり、（ｆ）の核酸が、（ｉ）前記ＴＧＦβ遺伝子座における標的部位の左側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列；および（ｉｉ）前記ＴＧＦβ遺伝子座における標的部位の右側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列をさらに含み、ＴＮＦＡＩＰ３、ＭＡＮＦ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＨＬＡ－Ｅ、および／もしくはＰＤ－Ｌ１をコードする前記ヌクレオチド配列が、（ｉ）と（ｉｉ）に挟まれている、ならびに／または（ｆ）の標的遺伝子座が、（ｅ）のＴＧＦβ遺伝子座であり、前記核酸が、（ｉｉｉ）（ｅ）のＴＧＦβ遺伝子座における標的部位の左側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列；および（ｉｖ）（ｅ）のＴＧＦβ遺伝子座における標的部位の右側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列をさらに含み、ＴＮＦＡＩＰ３、ＭＡＮＦ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＨＬＡ－Ｅ、および／もしくはＰＤ－Ｌ１をコードする前記ヌクレオチド配列が、（ｉｉｉ）と（ｉｖ）に挟まれている；かつ、前記ユニバーサルドナー細胞が、ＴＧＦβの発現の破壊を有する、請求項１９に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  30. （ｆ）の標的遺伝子座が、（ａ）の標的遺伝子座と同じである、請求項１８から２９までのいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  31. （ｆ）の標的遺伝子座が、（ａ）の標的遺伝子座とは異なる、請求項１８から２９までのいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  32. （ｇ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼならびに標的遺伝子座における標的部位を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ならびに腫瘍壊死因子アルファ誘導タンパク質３（ＴＮＦＡＩＰ３）、中脳アストロサイト由来神経栄養因子（ＭＡＮＦ）、分化抗原群３９（ＣＤ３９）、分化抗原群７３（ＣＤ７３）、ＨＬＡ－Ｅおよび／またはＰＤ－Ｌ１をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を前記幹細胞に送達するステップであって、前記標的遺伝子座を前記標的部位において切断し、ＴＮＦＡＩＰ３、ＭＡＮＦ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＨＬＡ－Ｅ、および／またはＰＤ－Ｌ１をコードするヌクレオチド配列を含む前記核酸を前記標的遺伝子座に挿入し、それにより、前記標的遺伝子を破壊する、ステップ
    をさらに含む、請求項１８から３１までのいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  33. （ｇ）の標的遺伝子座が、ベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子座もしくは（ｂ）のＢ２Ｍ遺伝子座、チオレドキシン相互作用タンパク質（ＴＸＮＩＰ）遺伝子座もしくは（ｃ）のＴＸＮＩＰ遺伝子座、クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子座もしくは（ｄ）のＣＩＩＴＡ遺伝子座および／またはトランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）遺伝子座もしくは（ｅ）のＴＧＦβ遺伝子座から選択され、前記ユニバーサルドナー細胞が、Ｂ２Ｍ、ＴＸＮＩＰ、ＣＩＩＴＡおよび／またはＴＧＦβの発現の破壊を有する、請求項１８に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  34. （ｇ）の標的遺伝子座が、前記Ｂ２Ｍ遺伝子座であり、（ｇ）の核酸が、（ｉ）前記Ｂ２Ｍ遺伝子座における標的部位の左側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列；および（ｉｉ）前記Ｂ２Ｍ遺伝子座における標的部位の右側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列をさらに含み、ＴＮＦＡＩＰ３、ＭＡＮＦ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＨＬＡ－Ｅ、および／もしくはＰＤ－Ｌ１をコードする前記ヌクレオチド配列が、（ｉ）と（ｉｉ）に挟まれている、ならびに／または（ｇ）の標的遺伝子座が、（ｂ）のＢ２Ｍ遺伝子座であり、前記核酸が、（ｉｉｉ）（ｂ）のＢ２Ｍ遺伝子座における標的部位の左側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列；および（ｉｖ）（ｂ）のＢ２Ｍ遺伝子座における標的部位の右側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列をさらに含み、ＴＮＦＡＩＰ３、ＭＡＮＦ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＨＬＡ－Ｅ、および／もしくはＰＤ－Ｌ１をコードする前記ヌクレオチド配列が、（ｉｉｉ）と（ｉｖ）に挟まれている；かつ、前記ユニバーサルドナー細胞が、Ｂ２Ｍの発現の破壊を有する、請求項３２または３３に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  35. （ｉ）または（ｉｉｉ）のヌクレオチド配列が、配列番号１５を含むまたはそれから本質的になる、請求項３４に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  36. （ｉｉ）または（ｉｖ）のヌクレオチド配列が、配列番号２２を含むまたはそれから本質的になる、請求項３４または３５のいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  37. （ｇ）の標的遺伝子座が、前記ＴＸＮＩＰ遺伝子座であり、（ｇ）の核酸が、（ｉ）前記ＴＸＮＩＰ遺伝子座における標的部位の左側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列；および（ｉｉ）前記ＴＸＮＩＰ遺伝子座における標的部位の右側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列をさらに含み、ＴＮＦＡＩＰ３、ＭＡＮＦ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＨＬＡ－Ｅ、および／もしくはＰＤ－Ｌ１をコードする前記ヌクレオチド配列が、（ｉ）と（ｉｉ）に挟まれている、ならびに／または（ｇ）の標的遺伝子座が、（ｃ）のＴＸＮＩＰ遺伝子座であり、前記核酸が、（ｉｉｉ）（ｃ）のＴＸＮＩＰ遺伝子座における標的部位の左側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列；および（ｉｖ）（ｃ）のＴＸＮＩＰ遺伝子座における標的部位の右側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列をさらに含み、ＴＮＦＡＩＰ３、ＭＡＮＦ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＨＬＡ－Ｅ、および／もしくはＰＤ－Ｌ１をコードする前記ヌクレオチド配列が、（ｉｉｉ）と（ｉｖ）に挟まれている；かつ、前記ユニバーサルドナー細胞が、ＴＸＮＩＰの発現の破壊を有する、請求項３２または３３に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  38. （ｉ）または（ｉｉｉ）のヌクレオチド配列が、配列番号４２を含むまたはそれから本質的になる、請求項３７に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  39. （ｉｉ）または（ｉｖ）のヌクレオチド配列が、配列番号４４を含むまたはそれから本質的になる、請求項３７または３８に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  40. （ｇ）の標的遺伝子座が、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子座であり、（ｇ）の核酸が、（ｉ）前記ＣＩＩＴＡ遺伝子座における標的部位の左側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列；および（ｉｉ）前記ＣＩＩＴＡ遺伝子座における標的部位の右側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列をさらに含み、ＴＮＦＡＩＰ３、ＭＡＮＦ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＨＬＡ－Ｅ、および／もしくはＰＤ－Ｌ１をコードする前記ヌクレオチド配列が、（ｉ）と（ｉｉ）に挟まれている、ならびに／または（ｇ）の標的遺伝子座が、（ｄ）のＣＩＩＴＡ遺伝子座であり、前記核酸が、（ｉｉｉ）（ｄ）のＣＩＩＴＡ遺伝子座における標的部位の左側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列；および（ｉｖ）前記ＣＩＩＴＡ遺伝子座における標的部位の右側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列をさらに含み、ＴＮＦＡＩＰ３、ＭＡＮＦ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＨＬＡ－Ｅ、および／もしくはＰＤ－Ｌ１をコードする前記ヌクレオチド配列が、（ｉｉｉ）と（ｉｖ）に挟まれている；かつ、前記ユニバーサルドナー細胞が、ＣＩＩＴＡの発現の破壊を有する、請求項３２または３３に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  41. （ｉ）または（ｉｉｉ）のヌクレオチド配列が、配列番号２６を含むまたはそれから本質的になる、請求項４０に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  42. （ｉｉ）または（ｉｖ）のヌクレオチド配列が、配列番号２８を含むまたはそれから本質的になる、請求項４０または４１に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  43. （ｇ）の標的遺伝子座が、前記ＴＧＦβ遺伝子座であり、（ｇ）の核酸が、（ｉ）前記ＴＧＦβ遺伝子座における標的部位の左側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列；および（ｉｉ）前記ＴＧＦβ遺伝子座における標的部位の右側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列をさらに含み、ＴＮＦＡＩＰ３、ＭＡＮＦ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＨＬＡ－Ｅ、および／もしくはＰＤ－Ｌ１をコードする前記ヌクレオチド配列が、（ｉ）と（ｉｉ）に挟まれている、ならびに／または（ｇ）の標的遺伝子座が、（ｅ）のＴＧＦβ遺伝子座であり、前記核酸が、（ｉｉｉ）（ｅ）のＴＧＦβ遺伝子座における標的部位の左側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列；および（ｉｖ）（ｅ）のＴＧＦβ遺伝子座における標的部位の右側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列をさらに含み、ＴＮＦＡＩＰ３、ＭＡＮＦ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＨＬＡ－Ｅ、および／もしくはＰＤ－Ｌ１をコードする前記ヌクレオチド配列が、（ｉｉｉ）と（ｉｖ）に挟まれている；かつ、前記ユニバーサルドナー細胞が、ＴＧＦβの発現の破壊を有する、請求項３２または３３に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  44. （ｇ）の標的遺伝子座が、（ａ）および／または（ｆ）の標的遺伝子座と同じである、請求項３２から４３までのいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  45. （ｇ）の標的遺伝子座が、（ａ）および／または（ｆ）の標的遺伝子座とは異なる、請求項３２から４３までのいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  46. （ｈ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼならびに標的遺伝子座における標的部位を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ならびに腫瘍壊死因子アルファ誘導タンパク質３（ＴＮＦＡＩＰ３）、中脳アストロサイト由来神経栄養因子（ＭＡＮＦ）、分化抗原群３９（ＣＤ３９）、分化抗原群７３（ＣＤ７３）、ＨＬＡ－Ｅおよび／またはＰＤ－Ｌ１をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を前記幹細胞に送達するステップであって、前記標的遺伝子座を前記標的部位において切断し、ＴＮＦＡＩＰ３、ＭＡＮＦ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＨＬＡ－Ｅ、および／またはＰＤ－Ｌ１をコードするヌクレオチド配列を含む前記核酸を前記標的遺伝子座に挿入し、それにより、前記標的遺伝子を破壊する、ステップ
    をさらに含む、請求項３２から４５までのいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  47. （ｈ）の標的遺伝子座がベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子座もしくは（ｂ）のＢ２Ｍ遺伝子座、チオレドキシン相互作用タンパク質（ＴＸＮＩＰ）遺伝子座もしくは（ｃ）のＴＸＮＩＰ遺伝子座、クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子座もしくは（ｄ）のＣＩＩＴＡ遺伝子座および／またはトランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）遺伝子座もしくは（ｅ）のＴＧＦβ遺伝子座から選択され、前記ユニバーサルドナー細胞が、Ｂ２Ｍ、ＴＸＮＩＰ、ＣＩＩＴＡおよび／またはＴＧＦβの発現の破壊を有する、請求項１８に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  48. （ｈ）の標的遺伝子座が、前記Ｂ２Ｍ遺伝子座であり、（ｈ）の核酸が、（ｉ）前記Ｂ２Ｍ遺伝子座における標的部位の左側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列；および（ｉｉ）前記Ｂ２Ｍ遺伝子座における標的部位の右側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列をさらに含み、ＴＮＦＡＩＰ３、ＭＡＮＦ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＨＬＡ－Ｅ、および／もしくはＰＤ－Ｌ１をコードする前記ヌクレオチド配列が、（ｉ）と（ｉｉ）に挟まれている；ならびに／または（ｈ）の標的遺伝子座が、（ｂ）のＢ２Ｍ遺伝子座であり、前記核酸が、（ｉｉｉ）（ｂ）のＢ２Ｍ遺伝子座における標的部位の左側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列；および（ｉｖ）（ｂ）のＢ２Ｍ遺伝子座における標的部位の右側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列をさらに含み、ＴＮＦＡＩＰ３、ＭＡＮＦ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＨＬＡ－Ｅ、および／もしくはＰＤ－Ｌ１をコードする前記ヌクレオチド配列が、（ｉｉｉ）と（ｉｖ）に挟まれている；かつ、前記ユニバーサルドナー細胞が、Ｂ２Ｍの発現の破壊を有する、請求項４６または４７に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  49. （ｉ）または（ｉｉｉ）のヌクレオチド配列が、配列番号１５を含むまたはそれから本質的になる、請求項４８に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  50. （ｉｉ）または（ｉｖ）のヌクレオチド配列が、配列番号２２を含むまたはそれから本質的になる、請求項４８または４９のいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  51. （ｈ）の標的遺伝子座が、前記ＴＸＮＩＰ遺伝子座であり、（ｈ）の核酸が、（ｉ）前記ＴＸＮＩＰ遺伝子座における標的部位の左側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列；および（ｉｉ）前記ＴＸＮＩＰ遺伝子座における標的部位の右側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列をさらに含み、ＴＮＦＡＩＰ３、ＭＡＮＦ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＨＬＡ－Ｅ、および／もしくはＰＤ－Ｌ１をコードする前記ヌクレオチド配列が、（ｉ）と（ｉｉ）に挟まれている；ならびに／または（ｈ）の標的遺伝子座が、（ｃ）のＴＸＮＩＰ遺伝子座であり、前記核酸が、（ｉｉｉ）（ｃ）のＴＸＮＩＰ遺伝子座における標的部位の左側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列および（ｉｖ）（ｃ）のＴＸＮＩＰ遺伝子座における標的部位の右側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列をさらに含み、ＴＮＦＡＩＰ３、ＭＡＮＦ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＨＬＡ－Ｅ、および／もしくはＰＤ－Ｌ１をコードする前記ヌクレオチド配列が、（ｉｉｉ）と（ｉｖ）に挟まれている；かつ、前記ユニバーサルドナー細胞が、ＴＸＮＩＰの発現の破壊を有する、請求項４６または４７に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  52. （ｉ）のヌクレオチド配列が、配列番号４２を含むまたはそれから本質的になる、請求項５１に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  53. （ｉｉ）のヌクレオチド配列が、配列番号４４を含むまたはそれから本質的になる、請求項５１または５２に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  54. （ｈ）の標的遺伝子座が、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子座であり、（ｈ）の核酸が、（ｉ）前記ＣＩＩＴＡ遺伝子座における標的部位の左側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列；および（ｉｉ）前記ＣＩＩＴＡ遺伝子座における標的部位の右側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列をさらに含み、ＴＮＦＡＩＰ３、ＭＡＮＦ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＨＬＡ－Ｅ、および／もしくはＰＤ－Ｌ１をコードする前記ヌクレオチド配列が、（ｉ）と（ｉｉ）に挟まれている；ならびに／または（ｈ）の標的遺伝子座が、（ｄ）のＣＩＩＴＡ遺伝子座であり、前記核酸が、（ｉｉｉ）（ｄ）のＣＩＩＴＡ遺伝子座における標的部位の左側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列；および（ｉｖ）（ｄ）のＣＩＩＴＡ遺伝子座における標的部位の右側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列をさらに含み、ＴＮＦＡＩＰ３、ＭＡＮＦ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＨＬＡ－Ｅ、および／もしくはＰＤ－Ｌ１をコードする前記ヌクレオチド配列が、（ｉｉｉ）と（ｉｖ）に挟まれている；かつ、前記ユニバーサルドナー細胞が、ＣＩＩＴＡの発現の破壊を有する、請求項４６または４７に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  55. （ｉ）のヌクレオチド配列が、配列番号２６を含むまたはそれから本質的になる、請求項５４に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  56. （ｉｉ）のヌクレオチド配列が、配列番号２８を含むまたはそれから本質的になる、請求項５４または５５に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  57. （ｈ）の標的遺伝子座が、前記ＴＧＦβ遺伝子座であり、（ｈ）の核酸が、（ｉ）前記ＴＧＦβ遺伝子座における標的部位の左側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列；および（ｉｉ）前記ＴＧＦβ遺伝子座における標的部位の右側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列をさらに含み、ＴＮＦＡＩＰ３、ＭＡＮＦ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＨＬＡ－Ｅ、および／もしくはＰＤ－Ｌ１をコードする前記ヌクレオチド配列が、（ｉ）と（ｉｉ）に挟まれている；ならびに／または（ｈ）の標的遺伝子座が、（ｅ）のＴＧＦβ遺伝子座であり、前記核酸が、（ｉｉｉ）（ｅ）のＴＧＦβ遺伝子座における標的部位の左側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列；および（ｉｖ）（ｅ）のＴＧＦβ遺伝子座における標的部位の右側に位置するゲノム領域に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列をさらに含み、ＴＮＦＡＩＰ３、ＭＡＮＦ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＨＬＡ－Ｅ、および／もしくはＰＤ－Ｌ１をコードする前記ヌクレオチド配列が、（ｉｉｉ）と（ｉｖ）に挟まれている；かつ、前記ユニバーサルドナー細胞が、ＴＧＦβの発現の破壊を有する、請求項４６または４７に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  58. （ｈ）の標的遺伝子座が、（ａ）、（ｆ）および／または（ｇ）の標的遺伝子座と同じである、請求項４６から５７までのいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  59. （ｈ）の標的遺伝子座が、（ａ）、（ｆ）および／または（ｇ）の標的遺伝子座とは異なる、請求項４６から５７までのいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  60. （ａ）の核酸、（ｆ）の核酸、（ｇ）の核酸および／または（ｈ）の核酸が、ＭＡＮＦをコードする前記ヌクレオチド配列を含み、前記ユニバーサルドナー細胞が、ＭＡＮＦを発現する、請求項１から５９までのいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  61. ＭＡＮＦをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号１７から本質的になる、請求項６０に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  62. （ａ）の核酸、（ｆ）の核酸、（ｇ）の核酸および／または（ｈ）の核酸が、ＴＮＦＡＩＰ３をコードする前記ヌクレオチド配列を含み、前記ユニバーサルドナー細胞が、ＴＮＦＡＩＰ３を発現する、請求項１から６１までのいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  63. ＴＮＦＡＩＰ３をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号１９から本質的になる、請求項６２に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  64. （ａ）の核酸、（ｆ）の核酸、（ｇ）の核酸および／または（ｈ）の核酸が、ＣＤ３９をコードする前記ヌクレオチド配列を含み、前記ユニバーサルドナー細胞が、ＣＤ３９を発現する、請求項１から６３までのいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  65. ＣＤ３９をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号２７から本質的になる、請求項６４に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  66. （ａ）の核酸、（ｆ）の核酸、（ｇ）の核酸および／または（ｈ）の核酸が、ＣＤ７３をコードする前記ヌクレオチド配列を含み、前記ユニバーサルドナー細胞が、ＣＤ７３を発現する、請求項１から６５までのいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  67. ＣＤ７３をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号４６から本質的になる、請求項６６に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  68. （ａ）の核酸が、ＨＬＡクラスＩ組織適合性抗原、アルファ鎖Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）をコードするヌクレオチド配列をさらに含み、前記ユニバーサルドナー細胞が、ＨＬＡ－Ｅをさらに発現する、請求項１から６７までのいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  69. （ｆ）の核酸、（ｇ）の核酸および／または（ｈ）の核酸が、ＨＬＡクラスＩ組織適合性抗原、アルファ鎖Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）をコードする前記ヌクレオチド配列を含み、前記ユニバーサルドナー細胞が、ＨＬＡ－Ｅを発現する、請求項１８から６８までのいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  70. ＨＬＡ－Ｅをコードする前記ヌクレオチド配列が、ＨＬＡ－Ｅ三量体をコードする配列を含み、前記ＨＬＡ－Ｅ三量体が、シグナルペプチドを有さないＨＬＡ－Ｅと融合したＢ２Ｍ膜タンパク質、それと融合したＨＬＡ－Ｇ提示ペプチド、それと融合したＢ２Ｍシグナルペプチドを含む、請求項６８または６９に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  71. ＨＬＡ－Ｅをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号４３から本質的になる、請求項６８から７０までのいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  72. （ａ）の核酸、（ｆ）の核酸、（ｇ）の核酸および／または（ｈ）の核酸が、ＭＡＮＦをコードするヌクレオチド配列およびＨＬＡ－Ｅをコードするヌクレオチド配列を含み、前記ユニバーサルドナー細胞が、ＭＡＮＦおよびＨＬＡ－Ｅを発現する、請求項６８から７１までのいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  73. （ａ）の核酸、（ｆ）の核酸、（ｇ）の核酸および／または（ｈ）の核酸が、ＨＬＡ－Ｅをコードする前記ヌクレオチド配列と連結した、Ｐ２Ａペプチドをコードするヌクレオチド配列、それと連結した、ＭＡＮＦをコードする前記ヌクレオチド配列を含む、請求項７２に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  74. （ａ）の核酸、（ｆ）の核酸、（ｇ）の核酸および／または（ｈ）の核酸が、配列番号５５からなるヌクレオチド配列を含む、請求項７３に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  75. （ａ）の核酸が、プログラム死－リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）をコードするヌクレオチド配列をさらに含み、前記ユニバーサルドナー細胞が、ＰＤ－Ｌ１をさらに発現する、請求項１から７４までのいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  76. （ｆ）の核酸、（ｇ）の核酸および／または（ｈ）の核酸が、ＰＤ－Ｌ１をコードする前記ヌクレオチド配列を含み、前記ユニバーサルドナー細胞が、ＰＤ－Ｌ１を発現する、請求項１８から７５までのいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  77. ＰＤ－Ｌ１をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号２０から本質的になる、請求項７５または７６に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  78. （ａ）の核酸、（ｆ）の核酸、（ｇ）の核酸、および／または（ｈ）の核酸が、ＴＮＦＡＩＰ３をコードするヌクレオチド配列およびＰＤ－Ｌ１をコードするヌクレオチド配列を含み、前記ユニバーサルドナー細胞が、ＴＮＦＡＩＰ３およびＰＤ－Ｌ１を発現する、請求項７５から７７までに記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  79. （ａ）の核酸、（ｆ）の核酸、（ｇ）の核酸、および／または（ｈ）の核酸が、ＰＤ－Ｌ１をコードする前記ヌクレオチド配列と連結した、Ｐ２Ａペプチドをコードするヌクレオチド配列、それと連結した、ＴＮＦＡＩＰ３をコードする前記ヌクレオチド配列を含む、請求項７８に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  80. （ａ）の核酸、（ｆ）の核酸、（ｇ）の核酸、および／または（ｈ）の核酸が、配列番号５４から本質的になるヌクレオチド配列を含む、請求項７９に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  81. （ａ）の核酸、（ｆ）の核酸、（ｇ）の核酸、および／または（ｈ）の核酸が、ＣＤ３９のヌクレオチド配列およびＰＤ－Ｌ１をコードするヌクレオチド配列を含み、前記ユニバーサルドナー細胞が、ＣＤ３９およびＰＤ－Ｌ１を発現する、請求項７５から８０までのいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  82. （ａ）の核酸、（ｆ）の核酸、（ｇ）の核酸、および／または（ｈ）の核酸が、ＰＤ－Ｌ１をコードする前記ヌクレオチド配列と連結した、Ｐ２Ａペプチドをコードするヌクレオチド配列、それと連結した、前記ＣＤ３９のヌクレオチド配列、を含む、請求項８１に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  83. （ａ）の核酸、（ｆ）の核酸、（ｇ）の核酸、および／または（ｈ）の核酸が、配列番号５３から本質的になるヌクレオチド配列を含む、請求項８２に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  84. （ａ）の核酸、（ｆ）の核酸、（ｇ）の核酸、および／または（ｈ）の核酸が、ＭＡＮＦをコードする前記ヌクレオチド配列、ＴＮＦＡＩＰ３をコードする前記ヌクレオチド配列、およびＰＤ－Ｌ１をコードする前記ヌクレオチド配列を含み、前記ユニバーサルドナー細胞が、ＭＡＮＦ、ＴＮＦＡＩＰ３およびＰＤ－Ｌ１を発現する、請求項７５から８３までのいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  85. （ａ）の核酸、（ｆ）の核酸、（ｇ）の核酸、および／または（ｈ）の核酸が、Ｐ２Ａペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列によってＴＮＦＡＩＰ３をコードする前記ヌクレオチド配列と連結したＭＡＮＦをコードする前記ヌクレオチド配列、およびＰ２Ａペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列によってＰＤ－Ｌ１をコードする前記ヌクレオチド配列と連結したＴＮＦＡＩＰ３をコードする前記ヌクレオチド配列を含む、請求項８４に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  86. （ａ）の核酸、（ｆ）の核酸、（ｇ）の核酸、および／または（ｈ）の核酸が、配列番号５２から本質的になるヌクレオチド配列を含む、請求項８５に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  87. （ａ）の核酸、（ｆ）の核酸、（ｇ）の核酸、および／または（ｈ）の核酸が、ＣＤ３９をコードする前記ヌクレオチド配列、ＣＤ７３をコードする前記ヌクレオチド配列、およびＰＤ－Ｌ１をコードする前記ヌクレオチド配列を含み、前記ユニバーサルドナー細胞が、ＣＤ３９、ＣＤ７３およびＰＤ－Ｌ１を発現する、請求項７５から８６までのいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  88. ＣＤ３９をコードする前記ヌクレオチド配列が、ＣＤ７３をコードする前記ヌクレオチド配列と、Ｐ２Ａペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列によって連結しており、ＣＤ７３をコードする前記ヌクレオチド配列が、ＰＤ－Ｌ１をコードする前記ヌクレオチド配列と、Ｐ２Ａペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列によって連結している、請求項８７に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  89. （ａ）の核酸、（ｆ）の核酸、（ｇ）の核酸、および／または（ｈ）の核酸が、配列番号５６から本質的になるヌクレオチド配列を含む、請求項８８に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  90. （ａ）の核酸、（ｆ）の核酸、（ｇ）の核酸、および／または（ｈ）の核酸が、ＣＤ３９をコードする前記ヌクレオチド配列およびＣＤ７３をコードする前記ヌクレオチド配列を含み、前記ユニバーサルドナー細胞が、ＣＤ３９およびＣＤ７３を発現する、請求項１から８９までのいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  91. ＣＤ３９をコードする前記ヌクレオチド配列が、ＣＤ７３をコードする前記ヌクレオチド配列と、Ｐ２Ａペプチドをコードするヌクレオチド配列によって連結している、請求項９０に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  92. （ａ）の核酸、（ｆ）の核酸、（ｇ）の核酸、および／または（ｈ）の核酸が、配列番号５８から本質的になるヌクレオチド配列を含む、請求項９１に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  93. （ａ）、（ｆ）、（ｇ）、および／または（ｈ）の核酸のいずれかのヌクレオチド配列が、外因性プロモーターに作動可能に連結している、請求項１から９２までのいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  94. 前記外因性プロモーターが、ＣＭＶ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、ＣＡＧ、またはＵＢＣプロモーターである、請求項９３に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  95. （ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）および／または（ｈ）のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼとｇＲＮＡが、約１：１～約１：１０の比で存在する、請求項１から９４までのいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  96. （ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、および／または（ｈ）のそれぞれのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼとｇＲＮＡが、約１：１～約１：１０の比で存在する、請求項１から９５までのいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  97. （ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、および／または（ｈ）のそれぞれのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、請求項１から９６までのいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  98. 前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼが、少なくとも１つの核局在化シグナルと連結している、請求項９７に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  99. 前記幹細胞が、胚性幹細胞、成体幹細胞、人工多能性幹細胞、または造血幹細胞である、請求項１から９８までのいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  100. 前記幹細胞が、ヒト幹細胞である、請求項１から９９までのいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  101. 前記ユニバーサルドナー細胞が、核酸挿入および／または遺伝子破壊がなされていない同等の細胞と比較して、免疫回避および／または移植後生存の増大を有する、請求項１から１００までのいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10724052B2 (en) * 2018-09-07 2020-07-28 Crispr Therapeutics Ag Universal donor cells

Family Cites Families (86)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1724052A (en) 1928-06-13 1929-08-13 Luther S Swearengin Fire-door construction
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5283058A (en) 1990-08-30 1994-02-01 The General Hospital Corporation Methods for inhibiting rejection of transplanted tissue
US7101543B2 (en) 2000-03-31 2006-09-05 Novarx Genetically modified cells expressing a TGFβ inhibitor, the cells being lung cancer cells
CA2406743A1 (en) 2000-04-28 2001-11-08 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Recombinant aav vectors with aav5 capsids and aav5 vectors pseudotyped in heterologous capsids
US20060222633A1 (en) 2000-05-11 2006-10-05 Yale University Prevention, decrease, and/or treatment of immunoreactivity by depleting and/or inactivating antigen presenting cells in the host
CA2456981C (en) 2001-08-06 2012-02-28 Bresagen, Inc. Alternative compositions and methods for the culture of stem cells
US7985585B2 (en) 2004-07-09 2011-07-26 Viacyte, Inc. Preprimitive streak and mesendoderm cells
US7541185B2 (en) 2003-12-23 2009-06-02 Cythera, Inc. Methods for identifying factors for differentiating definitive endoderm
US20050266554A1 (en) 2004-04-27 2005-12-01 D Amour Kevin A PDX1 expressing endoderm
CA2549605C (en) 2003-12-23 2013-05-07 Cythera, Inc. Definitive endoderm
US8586357B2 (en) 2003-12-23 2013-11-19 Viacyte, Inc. Markers of definitive endoderm
CA2576872C (en) 2004-08-13 2013-11-12 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Compositions and methods for self-renewal and differentiation in human embryonic stem cells
CA2595407A1 (en) 2005-01-20 2006-07-27 University Of Rochester Thioredoxin interacting protein (txnip) as regulator of vascular function
CA2627645C (en) 2005-10-27 2015-07-07 Cythera, Inc. Pdx1-expressing dorsal and ventral foregut endoderm
CA2643478C (en) 2006-02-23 2019-06-18 Novocell, Inc. Compositions and methods useful for culturing differentiable cells
US7695965B2 (en) 2006-03-02 2010-04-13 Cythera, Inc. Methods of producing pancreatic hormones
CA3147112A1 (en) 2006-03-02 2007-09-13 Viacyte, Inc. Endocrine precursor cells, pancreatic hormone-expressing cells and methods of production
WO2007139929A2 (en) 2006-05-25 2007-12-06 The Burnham Institute For Medical Research Methods for culture and production of single cell populations of human embryonic stem cells
KR101617243B1 (ko) 2007-07-31 2016-05-02 라이프스캔, 인코포레이티드 인간 배아 줄기 세포의 분화
US7695963B2 (en) 2007-09-24 2010-04-13 Cythera, Inc. Methods for increasing definitive endoderm production
US8623650B2 (en) 2007-10-19 2014-01-07 Viacyte, Inc. Methods and compositions for feeder-free pluripotent stem cell media containing human serum
MX2010005805A (es) 2007-11-27 2010-06-09 Lifescan Inc Diferenciacion de celulas madre embrionarias humanas.
US8338170B2 (en) 2008-04-21 2012-12-25 Viacyte, Inc. Methods for purifying endoderm and pancreatic endoderm cells derived from human embryonic stem cells
US7939322B2 (en) 2008-04-24 2011-05-10 Centocor Ortho Biotech Inc. Cells expressing pluripotency markers and expressing markers characteristic of the definitive endoderm
US20120058105A1 (en) 2008-06-27 2012-03-08 Martin Kean Chong Ng Method of treatment of vascular complications
PL2346988T3 (pl) 2008-10-31 2017-10-31 Janssen Biotech Inc Różnicowanie ludzkich zarodkowych komórek macierzystych do linii endokrynnej trzustki
US9012218B2 (en) 2008-10-31 2015-04-21 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
US8008075B2 (en) 2008-11-04 2011-08-30 Viacyte, Inc. Stem cell aggregate suspension compositions and methods of differentiation thereof
US8895300B2 (en) 2008-11-04 2014-11-25 Viacyte, Inc. Scalable primate pluripotent stem cell aggregate suspension culture and differentiation thereof
EP4176888A1 (en) 2008-11-14 2023-05-10 ViaCyte, Inc. Encapsulation of pancreatic cells derived from human pluripotent stem cells
EP2421957B1 (en) 2009-04-22 2020-11-18 Viacyte, Inc. Cell compositions derived from dedifferentiated reprogrammed cells
US9109245B2 (en) 2009-04-22 2015-08-18 Viacyte, Inc. Cell compositions derived from dedifferentiated reprogrammed cells
US8685726B2 (en) 2009-04-27 2014-04-01 Viacyte, Inc. Small molecules supporting pluripotent cell growth and methods thereof
EP2456859A4 (en) 2009-07-20 2015-03-18 Janssen Biotech Inc DIFFERENTIATION OF HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS
EP2456858B1 (en) 2009-07-20 2018-08-29 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
EP2516626B1 (en) 2009-12-23 2017-05-10 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
CN102741395B (zh) 2009-12-23 2016-03-16 詹森生物科技公司 人胚胎干细胞的分化
AU2011296382B2 (en) 2010-08-31 2016-04-14 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
EP2611907B1 (en) 2010-08-31 2016-05-04 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of pluripotent stem cells
AU2010365057B2 (en) 2010-12-08 2016-12-22 Viacyte, Inc. Agents and methods for inhibiting human pluripotent stem cell growth
CA3205636A1 (en) 2011-04-20 2012-10-26 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Beta-2 microglobulin-deficient cells
EP2791160B1 (en) 2011-12-16 2022-03-02 ModernaTX, Inc. Modified mrna compositions
SG10201608914WA (en) 2011-12-22 2016-12-29 Janssen Biotech Inc Differentiation of human embryonic stem cells into single hormonal insulin positive cells
EP2657340B1 (en) 2012-04-25 2016-11-16 Deutsches Krebsforschungszentrum Inhibitors of thioredoxin-interacting protein (TXNIP) for therapy
WO2013169769A1 (en) 2012-05-07 2013-11-14 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells into pancreatic endoderm
DE202013012242U1 (de) 2012-05-25 2016-02-02 Emmanuelle Charpentier Zusammensetzungen für die durch RNA gesteuerte Modifikation einer Ziel-DNA und für die durch RNA gesteuerte Modulation der Transkription
US10066210B2 (en) 2012-06-08 2018-09-04 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells into pancreatic endocrine cells
BR112014031424A2 (pt) 2012-06-14 2017-06-27 Janssen Biotech Inc tratamento de células pluripotentes
MX2015007549A (es) 2012-12-12 2017-01-20 Broad Inst Inc Modificaciones de sistemas, métodos y composiciones guía optimizadas para la manipulación de secuencias.
BR112015015714A2 (pt) 2012-12-31 2017-07-11 Janssen Biotech Inc suspensão e aglomeração de células pluripotentes humanas para diferenciação em célu-las endócrinas pancreáticas
SG10201709338RA (en) 2012-12-31 2017-12-28 Janssen Biotech Inc Culturing of human embryonic stem cells at the air-liquid interface for differentiation into pancreatic endocrine cells
US10370644B2 (en) 2012-12-31 2019-08-06 Janssen Biotech, Inc. Method for making human pluripotent suspension cultures and cells derived therefrom
KR101942769B1 (ko) 2012-12-31 2019-01-28 얀센 바이오테크 인코포레이티드 Hb9 조절제를 사용하는 인간 배아 줄기세포의 췌장 내분비 세포로의 분화
US9101597B2 (en) 2013-03-14 2015-08-11 The Administration Of The Tulane Educational Fund Immunoprotective primary mesenchymal stem cells and methods
US8859286B2 (en) 2013-03-14 2014-10-14 Viacyte, Inc. In vitro differentiation of pluripotent stem cells to pancreatic endoderm cells (PEC) and endocrine cells
KR102205234B1 (ko) 2013-06-11 2021-01-20 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 SC-β 세포 및 조성물 그리고 그 생성 방법
KR20140144964A (ko) 2013-06-12 2014-12-22 한국생명공학연구원 티오레독신-결합 단백질을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물 및 이의 용도
RU2716421C2 (ru) 2013-06-17 2020-03-11 Те Брод Инститьют Инк. Доставка, применение и применения в терапии систем crispr-cas и композиций для целенаправленного воздействия на нарушения и заболевания с использованием вирусных компонентов
JP2016534731A (ja) 2013-11-01 2016-11-10 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 膵内分泌細胞への分化のためのヒト多能性幹細胞の懸濁及び集団化
WO2015149005A1 (en) * 2014-03-28 2015-10-01 Buck Institute For Research On Aging Methods and compositions for modulating the immune system
CN117821369A (zh) 2014-05-16 2024-04-05 詹森生物科技公司 小分子增强胰腺内分泌细胞中的mafa表达的用途
CA2970935A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 Janssen Biotech, Inc. Suspension culturing of pluripotent stem cells
US10968426B2 (en) * 2015-05-08 2021-04-06 President And Fellows Of Harvard College Universal donor stem cells and related methods
CA2993431A1 (en) 2015-07-31 2017-02-09 Regents Of The University Of Minnesota Nuclease based knockouts of immunological checkpoint genes in immune cells
CN108368520B (zh) 2015-11-04 2023-01-17 菲特治疗公司 多能细胞的基因组工程改造
MA45502A (fr) 2016-06-21 2019-04-24 Janssen Biotech Inc Génération de cellules bêta fonctionnelles dérivées de cellules souches pluripotentes humaines ayant une respiration mitochondriale glucose-dépendante et une réponse en sécrétion d'insuline en deux phases
CN110312799A (zh) 2016-08-17 2019-10-08 博德研究所 新型crispr酶和系统
US9982267B2 (en) 2016-10-12 2018-05-29 Feldan Bio Inc. Rationally-designed synthetic peptide shuttle agents for delivering polypeptide cargos from an extracellular space to the cytosol and/or nucleus of a target eukaryotic cell, uses thereof, methods and kits relating to same
JP7088564B2 (ja) 2016-11-10 2022-06-21 ヴィアサイト，インコーポレイテッド 細胞送達装置におけるｐｄｘ１膵臓内胚葉細胞及びその方法
EA201991692A1 (ru) 2017-01-13 2019-12-30 Дзе Риджентс Оф Дзе Юниверсити Оф Калифорния Иммуносконструированные плюрипотентные клетки
EP3596117A4 (en) 2017-03-17 2021-01-13 The Johns Hopkins University TARGETED EPIGENETIC THERAPY AGAINST THE DISTAL EXPRESSION REGULATORY ELEMENT OF TGFB2
CA3064297A1 (en) 2017-06-12 2018-12-20 Sinai Health System Allograft tolerance without the need for systemic immune suppression
US10391156B2 (en) 2017-07-12 2019-08-27 Viacyte, Inc. University donor cells and related methods
EP3684919A1 (en) 2017-10-19 2020-07-29 Cellectis Targeted gene integration of nk inhibitors genes for improved immune cells therapy
EP3712268A4 (en) 2017-11-16 2022-03-23 Mogam Institute for Biomedical Research TRANSFORMED HUMAN CELL AND ITS USE
EP3720946A4 (en) 2017-12-08 2021-08-18 Fate Therapeutics, Inc. IMMUNOTHERAPIES USING IMPROVED CSPI-DERIVED EFFECTIVE CELLS
US20190223416A1 (en) 2018-01-23 2019-07-25 Cotyledon, LLC Canine genome editing
US10724052B2 (en) 2018-09-07 2020-07-28 Crispr Therapeutics Ag Universal donor cells
CA3120576A1 (en) 2018-11-26 2020-06-04 Massachusetts Institute Of Technology Compositions and methods for immune tolerance
CA3123102A1 (en) 2018-12-13 2020-06-18 Sinai Health System Immunomodulatory cells and uses thereof
US20220160751A1 (en) 2019-04-02 2022-05-26 Yale University Methods of treatment of diseases and disorders associated with increased tet level, increased h19 level, increased level of tgf signaling, or any combination thereof
WO2020228039A1 (en) * 2019-05-16 2020-11-19 Egenesis, Inc. Cells, tissues, organs, and/or animals having one or more modified genes for enhanced xenograft survival and/or tolerance
CN110373389A (zh) * 2019-06-10 2019-10-25 云南农业大学 一种适合胰岛细胞及皮肤等组织异种移植供体猪的构建方法
WO2021044379A1 (en) 2019-09-05 2021-03-11 Crispr Therapeutics Ag Universal donor cells
US11116797B2 (en) 2019-09-05 2021-09-14 Crispr Therapeutics Ag Universal donor cells

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