KR20240058915A - 동종이계 인간 t 세포의 대체 생성 - Google Patents

동종이계 인간 t 세포의 대체 생성 Download PDF

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KR20240058915A
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펠리페 베도야
데이비드 바렛
비제이 고팔 레디 페다레디가리
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카이트 파마 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 CD3δ, CD3ε, CD3γ, B2M, CIITA, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP, 및 불변 쇄를 하향조절할 수 있는 핵산을 포함하고; 키메라 항원 수용체(CAR), 조작된 T 세포 수용체(TCR), 킬러 세포 면역글로불린-유사 수용체(KIR), 우성 음성 수용체 및/또는 전환 수용체를 암호화하는 외인성 핵산을 추가로 포함하는, 입양 T 세포 요법에 적합한 유전자 편집된 변형된 면역 세포를 제공한다. 또한, 변형된 면역 세포의 생성을 위한 조성물 및 방법, 및 입양 요법을 위해 변형된 면역 세포를 사용하고 질환 또는 상태를 치료하는 방법을 제공한다.

Description

동종이계 인간 T 세포의 대체 생성
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2021년 9월 10일에 출원된 미국 가출원 63/242,909의 우선권을 주장하며, 그 내용은 참고로 구체적으로 포함된다.
입양 면역요법(adoptive immunotherapy)은 생체 외에서 생성된 자기유래(autologous) 항원-특이적 T 세포를 환자에게 다시 전달하는 것을 포함하며, 암, 감염 및 자가-면역 질환 치료를 위한 유망한 전략인 것으로 나타났다. 입양 면역요법에 사용되는 T 세포는 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 재조합 T 세포 수용체(TCR)를 발현하고 생체 외에서 확장하여 암세포와 같은 병리학적 세포에 대해 1차 면역 세포를 전용하도록 조작된 1차 세포이다. CAR은 단일 융합 분자에서 하나 이상의 신호전달 도메인과 연관된 표적화(targeting) 모이어티로 이루어지는 합성 항체 유사 분자이며 T 세포에 항원 특이성을 전달하도록 설계되었다. CAR은 림프종 및 고형 종양을 포함한 다양한 악성종양의 종양 세포 표면에서 발현된 항원에 대해 T 세포를 전용하는 데 성공하였다. CAR을 발현하는 T 세포는 또한 특정 유형의 암 치료에 장기적인 효능을 나타낸다.
그러나, 현재 입양 면역요법은 자기유래 세포 이식을 기반으로 하고 있다. 자가 면역요법(autologous immunotherapy)에서 환자는 환자 자신의 림프구를 기반으로 맞춤형 치료를 받는데, 이 림프구는 환자로부터 단리되고, 유전적으로 변형되거나 체외에서 선택되고, 시험관 내에서 배양되어 환자에게 다시 주입되었다. 자가 입양 면역요법 치료법의 승인과 일반적인 성공에도 불구하고, 그러한 치료법의 확장성과 타당성은 중요한 과제를 제시한다. 자가 입양 면역요법 치료법은 여전히 상당히 복잡하여 전문 지식과 임상 관리, 값비싼 전용 시설이 필요하다. 또한 CAR 제조 과정 동안 질환이 빠르게 진행되거나 치료 전 환자의 면역 기능이 저하되어 입양 면역요법을 받을 수 없는 환자도 많다. 따라서, 암 면역요법의 광범위한 임상 적용은 자기유래 CART 세포의 개인별 제조로 인해 부과되는 상당한 경제적 제약으로 인해 제한된다. 따라서, 동종이계(allogeneic) 치료 세포가 사전-제조되고, 세부적으로 특성화되고, 광범위한 환자에게 즉시 투여될 수 있는 표준화된 입양 면역요법이 필요하다.
동종이계 면역요법은 이식편대숙주병(graft-versus-host disease)(GVHD) 및/또는 숙주대이식편병(Host-versus-Graft disease)(HvGD, 이식 거부)으로 임상적으로 나타나는 동종이계 T-세포 반응과 같은 많은 가능한 합병증이 있는, 여전히 위험한 과정이다. GvHD는 공여자 CAR 세포의 동종반응성(alloreactive) TCR에 의해 매개되는 주입된 동종이계 CAR-T 세포에 의한 수용자 조직의 공격으로 인해 발생한다. 특히, 주입된 T 세포의 내인성 T 세포 수용체 알파(TCRα; TRAC) 및 베타(TCRβ; TRBC) 쇄는 수용자의 주 및 부 조직적합성 항원을 인식하여 (GvHD)로 이어질 수 있다. 반대로, 주입된 동종이계 CART 세포는 수용자 T 림프구에 의해 거부되어 HvGD로 이어질 수 있다. 따라서, 본래의 동종이계 면역 반응을 조절하는 표준화된 해법이 확인되면 동종이계 CAR T 세포를 사용하여 입양 면역요법의 적용 가능성과 다양성이 향상될 것이다. GvHD의 특이적 억제는 동종이계 CART 세포의 안전하고 유효한 사용을 가능하게 할 것이다.
따라서, 숙주 면역 반응을 유발하지 않는 CAR-T 세포에 대한 개선된 방법이 여전히 필요하다. 구체적으로, 개선된 적합성을 갖는 동종이계 T 세포를 생성하기 위한 신규의 대체 조성물 및 방법이 필요하다.
본 발명은 이러한 요구를 해결하는 방법 및 조성물을 제공한다.
발명의 요약
한 양태에서, 본 개시내용은 (a) 각각 CD3δ, CD3ε, CD3γ, B2M, CIITA, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP 및 불변 쇄(Ii 쇄)로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 내인성 면역 단백질(endogenous immune protein)을 암호화(encoding)하는 하나 이상의 유전자좌(gene locus)의 삽입 및/또는 결실을 포함하는 변형된 면역 세포(modified immune cell)를 제공한다. 삽입 및/또는 결실은 하나 이상의 내인성 면역 유전자의 유전자 발현을 하향조절(downregulating)할 수 있다. 또한, 변형된 면역 세포는 (b) 키메라 항원 수용체(CAR), 조작된 T 세포 수용체(TCR), 킬러 세포 면역글로불린-유사 수용체(KIR), 항원-결합 폴리펩티드, 세포 표면 수용체 리간드, 또는 종양 항원을 암호화하는 외인성 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포는 우성 음성 수용체(dominant negative receptor), 전환 수용체(switch receptor), 케모카인, 케모카인 수용체, 사이토카인, 사이토카인 수용체, IL-7, IL-7R, IL-15, IL-15R, IL-21, IL-18, CCL21, CCL19 또는 이들의 임의의 조합을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 삽입 및/또는 결실은 (a) CD3δ, CD3ε 및/또는 CD3γ로부터 선택된 T 세포 수용체 서브유닛(subunit); (b) B2M, TAP1, TAP2, TAPBP 및/또는 NLRC5로부터 선택된 HLA 부류 I 분자; 및 (c) HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP 및/또는 불변 쇄(Ii 쇄)로부터 선택된 HLA 부류 II 분자의 유전자 발현을 하향조절할 수 있다.
일부 구현예에서, 삽입 및/또는 결실은 (a) CD3δ의 유전자 발현, 및 (b) B2M, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP, 불변 쇄(Ii 쇄) 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 HLA 분자의 유전자 발현을 하향조절할 수 있다.
일부 구현예에서, 삽입 및/또는 결실은 (a) CD3ε의 유전자 발현, 및 (b) B2M, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, CIITA, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP, 불변 쇄(Ii 쇄) 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 HLA 분자의 유전자 발현을 하향조절할 수 있다.
일부 구현예에서, 삽입 및/또는 결실은 (a) CD3γ의 유전자 발현, 및 (b) B2M, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, CIITA, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP, 불변 쇄(Ii 쇄) 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 HLA 분자의 유전자 발현을 하향조절할 수 있다.
일부 구현예에서, 삽입 및/또는 결실은 (a) CD3ε, B2M, 및 CIITA; (b) CD3ε, B2M, 및 RFX5; (c) CD3ε, B2M, 및 RFXAP; (d) CD3ε, B2M, 및 RFXANK; (e) CD3ε, B2M, 및 HLA-DM; (f) CD3ε, B2M, 및 Ii 쇄; (g) CD3ε, TAP1, 및 CIITA; (h) CD3ε, TAP1, 및 RFX5; (i) CD3ε, TAP1, 및 RFXAP; (j) CD3ε, TAP1, 및 RFXANK; (k) CD3ε, TAP1, 및 HLA-DM; (l) CD3ε, TAP1, 및 Ii 쇄; (m) CD3ε, TAP2, 및 CIITA; (n) CD3ε, TAP2, 및 RFX5; (o) CD3ε, TAP2, 및 RFXAP; (p) CD3ε, TAP2, 및 RFXANK; (q) CD3ε, TAP2, 및 HLA-DM; (r) CD3ε, TAP2, 및 Ii 쇄; (s) CD3ε, NLRC5, 및 CIITA; (t) CD3ε, NLRC5, 및 RFX5; (u) CD3ε, NLRC5, 및 RFXAP; (v) CD3ε, NLRC5, 및 RFXANK; (w) CD3ε, NLRC5, 및 HLA-DM; (x) CD3ε, NLRC5, 및 Ii 쇄; (y) CD3ε, TAPBP, 및 CIITA; (z) CD3ε, TAPBP, 및 RFX5; (aa) CD3ε, TAPBP, 및 RFXAP; (bb) CD3ε, TAPBP, 및 RFXANK; (cc) CD3ε, TAPBP, 및 HLA-DM; 또는 (dd) CD3ε, TAPBP, 및 Ii 쇄의 유전자 발현을 하향조절할 수 있다.
일부 구현예에서, 삽입 및/또는 결실은 (a) CD3δ, B2M, 및 CIITA; (b) CD3δ, B2M, 및 RFX5; (c) CD3δ, B2M, 및 RFXAP; (d) CD3δ, B2M, 및 RFXANK; (e) CD3δ, B2M, 및 HLA-DM; (f) CD3δ, B2M, 및 Ii 쇄; (g) CD3δ, TAP1, 및 CIITA; (h) CD3δ, TAP1, 및 RFX5; (i) CD3δ, TAP1, 및 RFXAP; (j) CD3δ, TAP1, 및 RFXANK; (k) CD3δ, TAP1, 및 HLA-DM; (l) CD3δ, TAP1, 및 Ii 쇄; (m) CD3δ, TAP2, 및 CIITA; (n) CD3δ, TAP2, 및 RFX5; (o) CD3δ, TAP2, 및 RFXAP; (p) CD3δ, TAP2, 및 RFXANK; (q) CD3δ, TAP2, 및 HLA-DM; (r) CD3δ, TAP2, 및 Ii 쇄; (s) CD3δ, NLRC5, 및 CIITA; (t) CD3δ, NLRC5, 및 RFX5; (u) CD3δ, NLRC5, 및 RFXAP; (v) CD3δ, NLRC5, 및 RFXANK; (w) CD3δ, NLRC5, 및 HLA-DM; (x) CD3δ, NLRC5, 및 Ii 쇄; (y) CD3δ, TAPBP, 및 CIITA; (z) CD3δ, TAPBP, 및 RFX5; (aa) CD3δ, TAPBP, 및 RFXAP; (bb) CD3δ, TAPBP, 및 RFXANK; (cc) CD3δ, TAPBP, 및 HLA-DM; 또는 (dd) CD3δ, TAPBP, 및 Ii 쇄의 유전자 발현을 하향조절할 수 있다.
일부 구현예에서, 삽입 및/또는 결실은 (a) CD3γ, B2M, 및 CIITA; (b) CD3γ, B2M, 및 RFX5; (c) CD3γ, B2M, 및 RFXAP; (d) CD3γ, B2M, 및 RFXANK; (e) CD3γ, B2M, 및 HLA-DM; (f) CD3γ, B2M, 및 Ii 쇄; (g) CD3γ, TAP1, 및 CIITA; (h) CD3γ, TAP1, 및 RFX5; (i) CD3γ, TAP1, 및 RFXAP; (j) CD3γ, TAP1, 및 RFXANK; (k) CD3γ, TAP1, 및 HLA-DM; (l) CD3γ, TAP1, 및 Ii 쇄; (m) CD3γ, TAP2, 및 CIITA; (n) CD3γ, TAP2, 및 RFX5; (o) CD3γ, TAP2, 및 RFXAP; (p) CD3γ, TAP2, 및 RFXANK; (q) CD3γ, TAP2, 및 HLA-DM; (r) CD3γ, TAP2, 및 Ii 쇄; (s) CD3γ, NLRC5, 및 CIITA; (t) CD3γ, NLRC5, 및 RFX5; (u) CD3γ, NLRC5, 및 RFXAP; (v) CD3γ, NLRC5, 및 RFXANK; (w) CD3γ, NLRC5, 및 HLA-DM; (x) CD3γ, NLRC5, 및 Ii 쇄; (y) CD3γ, TAPBP, 및 CIITA; (z) CD3γ, TAPBP, 및 RFX5; (aa) CD3γ, TAPBP, 및 RFXAP; (bb) CD3γ, TAPBP, 및 RFXANK; (cc) CD3γ, TAPBP, 및 HLA-DM; 또는 (dd) CD3γ, TAPBP, 및 Ii 쇄의 유전자 발현을 하향조절할 수 있다.
일부 구현예에서, 변형된 면역 세포는 T 세포, 자연 살해 세포(NK 세포), 자연 살해 T 세포, 림프 전구 세포(lymphoid progenitor cell), 조혈 줄기 세포, 줄기 세포, 대식세포, 수지상 세포(dendritic cell), 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포는 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포이다. 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포는 동종이계 T 세포 또는 자기유래 인간 T 세포이다.
일부 구현예에서, 삽입 및/또는 결실은 (a) CRISPR-관련(Cas)(CRISPR-Cas) 엔도뉴클레아제 시스템 및 안내 RNA; (b) TALEN 유전자 편집 시스템(gene editing system), 아연 집게 뉴클레아제(zinc finger nuclease; ZFN) 유전자 편집 시스템, 메가뉴클레아제 유전자 편집 시스템, 또는 메가-TALEN 유전자 편집 시스템; 및 (c) 안티센스 RNA, 안티고머(antigomer) RNA, RNAi, siRNA 또는 shRNA로부터 선택된 유전자 침묵 시스템(gene silencing system)으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 유전자 편집의 결과이다. 일부 구현예에서, CRISPR-Cas 시스템은 pAd5/F35-CRISPR 벡터(vector)를 포함한다. 일부 구현예에서 Cas 엔도뉴클레아제는 Cas3, Cas4, Cas8a, Cas8b, Cas9, Cas10, Cas10d, Cas12a, Cas12b, Cas12d, Cas12e, Cas12f, Cas12g, Cas12h, Cas12i, Cas13, Cas14, CasX, Cse1, Csy1, Csn2, Cpf1, C2c1, Csm2, Cmr5, Fok1, 에스 피오게네스(S. pyogenes) Cas9, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) Cas9, MAD7 뉴클레아제(V형 CRISPR 뉴클레아제) 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서 CRISPR-Cas 엔도뉴클레아제 시스템은 안내 RNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 안내 RNA는 CD3δ, CD3ε, CD3γ, B2M, CIITA, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP 및 불변 쇄(Ii 쇄)로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 면역 단백질을 각각 암호화하는 하나 이상의 유전자좌 내의 서열과 상보적인 안내 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 안내 RNA는 CD3δ, CD3ε 또는 CD3γ의 하나 이상의 엑손 내의 서열과 상보적이다. 일부 구현예에서, 안내 RNA는 CD3δ, CD3ε 또는 CD3γ의 엑손 1 내의 서열과 상보적이다.
일부 구현예에서, 안내 RNA의 상보적 서열은 CD3δ 유전자좌 내에 있고 안내 RNA는 서열번호 53에 의해 암호화된 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 안내 RNA의 상보적 서열은 CD3ε 유전자좌 내에 있고 안내 RNA는 서열번호 52에 의해 암호화된 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 안내 RNA의 상보적 서열은 CD3γ 유전자좌 내에 있고 안내 RNA는 서열번호 54에 의해 암호화된 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 안내 RNA의 상보적 서열은 B2M 유전자좌 내에 있고 안내 RNA는 서열번호 55에 의해 암호화된 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 안내 RNA의 상보적 서열은 CIITA 유전자좌 내에 있고 안내 RNA는 서열번호 61에 의해 암호화된 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 안내 RNA의 상보적 서열은 TAP1 유전자좌 내에 있고 안내 RNA는 서열번호 56에 의해 암호화된 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 안내 RNA의 상보적 서열은 TAP2 유전자좌 내에 있고 안내 RNA는 서열번호 57에 의해 암호화된 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 안내 RNA의 상보적 서열은 TAPBP 유전자좌 내에 있고 안내 RNA는 서열번호 58, 서열번호 59, 또는 이들의 조합에 의해 암호화된 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 안내 RNA의 상보적 서열은 NLRC5 유전자좌 내에 있고 안내 RNA는 서열번호 60에 의해 암호화된 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 안내 RNA의 상보적 서열은 HLA-DM 유전자좌 내에 있고 안내 RNA는 서열번호 62에 의해 암호화된 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 안내 RNA의 상보적 서열은 RFX5 유전자좌 내에 있고 안내 RNA는 서열번호 63, 서열번호 64 또는 이들의 조합에 의해 암호화된 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 안내 RNA의 상보적 서열은 RFXANK 유전자좌 내에 있고 안내 RNA는 서열번호 65에 의해 암호화된 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 안내 RNA의 상보적 서열은 RFXAP 유전자좌 내에 있고 안내 RNA는 서열번호 66에 의해 암호화된 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 안내 RNA의 상보적 서열은 Ii 쇄 유전자좌 내에 있고 안내 RNA는 서열번호 67, 서열번호 68, 또는 이들의 조합에 의해 암호화된 핵산 서열을 포함한다.
본 개시내용의 한 양태에서, 변형된 면역 세포는 상기 변형된 면역 세포가 대상체(subject)에게 투여될 때, 동일한 대상체에게 투여된 변형되지 않은 면역 세포에 의해 발휘되는 면역 반응과 비교하여, 상기 대상체에서 감소된 면역 반응을 발휘한다.
일부 구현예에서, 변형된 면역 세포는 상기 변형된 면역 세포가 대상체에게 투여될 때, TRAC, TRBC, B2M 및 CIITA의 유전자 발현을 하향조절할 수 있는 삽입 및/또는 결실을 포함하는 면역 세포에 의해 발휘되는 면역 반응과 비교하여, 상기 대상체에서 감소된 면역 반응을 발휘한다. 일부 구현예에서, 면역 반응은 이식편대숙주병(GvHD) 반응이다. 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포에 의해 감소된 GvHD 반응은 하나 이상의 유전자좌 내에 결실 및/또는 삽입이 없는 동등한 면역 세포, 또는 TRAC, TRBC, B2M 및 CIITA에 결실 및/또는 삽입을 포함하는 면역 세포에 비교된다. 일부 구현예에서, 감소된 GvHD 반응은 HLA-I 불일치 세포(mismatched cell) 또는 HLA-II 불일치 세포에 대해 유발된다.
일부 구현예에서, GvHD 반응은 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상 감소된다. 일부 구현예에서, GvHD 반응은 약 1배 이상, 약 2배 이상, 약 3배 이상, 약 4배 이상, 약 5배 이상, 약 6배 이상, 약 7배 이상, 약 8배 이상, 약 9배 이상, 약 10배 이상, 약 20배 이상, 약 30배 이상, 약 50배 이상, 약 100배 이상, 약 150배 이상, 또는 약 200배 이상 감소된다.
본 개시내용의 한 양태에서, 외인성 핵산은 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화한다. 일부 구현예에서, CAR은 항원 결합 도메인, 힌지 도메인(hinge domain), 막관통 도메인(transmembrane domain), 공동자극 신호전달 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 전장 항체(full length antibody) 또는 이의 항원-결합 단편, Fab, F(ab)2, 단일특이성(monospecific) Fab2, 이중특이성 Fab2, 삼중특이성 Fab2, 단쇄 가변 단편(scFv), 디아바디(diabody), 트리아바디, 미니바디, V-NAR 또는 VhH를 포함한다.
변형된 면역 세포의 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 인공 소수성 서열, I형 막관통 단백질의 막관통 도메인, T 세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD2, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, OX40(CD134), 4-1BB(CD137), ICOS(CD278), CD154, CD357(GITR), 톨-유사 수용체 1(TLR1), TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, 및 킬러 면역글로불린-유사 수용체(KIR)로부터 유래된 막관통 도메인으로부터 선택된다.
변형된 면역 세포의 일부 구현예에서, 공동자극 도메인은 TNFR 슈퍼패밀리의 단백질, CD28, 4-1BB(CD137), OX40(CD134), PD-1, CD7, LIGHT, CD83L, DAP10, DAP12, CD27, CD2, CD5, ICAM-1, LFA-1, Lck, TNFR-I, TNFR-II, Fas, CD30, CD40, ICOS(CD278), NKG2C, B7-H3(CD276), 및 킬러 면역글로불린-유사 수용체(KIR)로부터 유래된 세포내 도메인, 또는 이의 변이체로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 단백질의 공동자극 도메인 중 하나 이상을 포함한다.
변형된 면역 세포의 일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 인간 CD2의 세포질 신호전달 도메인, CD3 제타 쇄(CD3ζ), FcγRIII, FcsRI, Fc 수용체의 세포질 꼬리, 세포질 수용체를 보유하는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM), TCR 제타, FcR 감마, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d 또는 이의 변이체로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 세포내 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 인간 CD3 제타 쇄(CD3ζ)을 포함한다.
변형된 면역 세포의 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 혈액학적 악성종양과 연관되고/되거나 고형 종양과 연관된 종양 항원을 표적으로 한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 ROR1, 메소텔린, c-Met, PSMA, PSCA, 폴레이트 수용체 알파, 폴레이트 수용체 베타, EGFR, EGFRvIII, GPC2, GPC2, 뮤신 1(MUC1), Tn 항원((Tn Ag) 또는 (GalNAca-Ser/Thr)), TnMUC1, GDNF 패밀리 수용체 알파-4(GFRa4), 섬유아세포 활성화 단백질(FAP) 및 인터류킨-13 수용체 서브유닛 알파-2(IL-13Ra2 또는 CD213A2)로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 종양 항원을 표적으로 한다.
일부 구현예에서, CAR은 (a) PSMA 항원 결합 도메인, CD2 공동자극 도메인, 및 CD3 제타 세포내 신호전달 도메인; 또는 (b) 메소텔린 항원 결합 도메인, 4-1BB 공동자극 도메인 및 CD3 제타 신호전달 도메인; 또는 (c) TnMUC1 항원 결합 도메인, CD2 공동자극 도메인 및 CD3 제타 신호전달 도메인을 포함한다.
본 개시내용의 한 양태에서, 변형된 면역 세포는 전환(switch) 수용체를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 전환 수용체는 음성 신호와 연관된 신호전달 단백질의 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 양성 신호와 연관된 신호전달 단백질의 세포내 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 변형된 면역 세포는 우성 음성 수용체를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 우성 음성 수용체는 (a) 음성 신호와 연관된 야생형 단백질의 절두된 변이체(truncated variant); 또는 (b) 세포외 도메인, 막관통 도메인을 포함하고, 세포내 신호전달 도메인이 실질적으로 결여된 음성 신호와 연관된 야생형 단백질의 변이체; 또는 (c) 음성 신호와 연관된 신호전달 단백질의 세포외 도메인, 및 막관통 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 우성 음성 수용체는 PD1, VSIG3, VISG8, 또는 TGFβR 우성 음성 수용체이다.
일부 구현예에서, 음성 신호와 연관된 단백질은 CTLA4, PD-1, TGFβRII, BTLA, VSIG3, VSIG8 및 TIM-3으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 양성 신호와 연관된 단백질은 CD28, 4-1BB, IL12Rβ1, IL12Rβ2, CD2, ICOS 및 CD27로 이루어지는 그룹로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 전환 수용체는 PD-1-CD28, PD-1A132L-CD28, PD-1-CD27, PD-1A132L-CD27, PD-1-4-1BB, PD-1A132L-4-1BB, PD-1-ICOS, PD-1A132L-ICOS, PD-1-IL12Rβ1, PD-1A132L-IL12Rβ1, PD-1-IL12Rβ2, PD-1A132L-IL12Rβ2, VSIG3-CD28, VSIG8-CD28, VSIG3-CD27, VSIG8-CD27, VSIG3-4-1BB, VSIG8-4-1BB, VSIG3-ICOS, VSIG8-ICOS, VSIG3-IL12Rβ1, VSIG8-IL12Rβ1, VSIG3-IL12Rβ2, VSIG8-IL12Rβ2, TGFβRII-CD27, TGFβRII-CD28, TGFβRII-4-1BB, TGFβRII-ICOS, TGFβRII-IL12Rβ1 및 TGFβRII-IL12Rβ2로 이루어지는 그룹으로부터 선택된다.
변형된 면역 세포의 일부 구현예에서, 전환 수용체의 막관통 도메인은 CTLA4, PD-1, VSIG3, VSIG8, TGFβRII, BTLA, TIM-3, CD28, 4-1BB, IL12Rβ1, IL12Rβ2, CD2, ICOS 및 CD27로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 단백질의 막관통 도메인으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 전환 수용체의 막관통 도메인은 음성 신호와 연관된 단백질의 막관통 또는 음성 신호와 연관된 단백질의 막관통 도메인으로부터 선택된다.
한 양태에서, 본 개시내용은 CD3δ, CD3ε, CD3γ, B2M, C2TA, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP 및 불변 쇄(Ii 쇄)로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 기능적으로 손상된 폴리펩티드를 포함하는 단리된 변형된 T 세포를 제공한다. 일부 구현예에서, 기능적으로 손상된 폴리펩티드를 포함하는 변형된 T 세포는 (i) 변형되지 않은 T 세포와 비교하여 감소된 T 세포 수용체 발현; (ii) 손상된 폴리펩티드의 감소된 발현; (iii) T 세포 수용체 복합체 표면 발현의 완전한 부재(complete absence); 및/또는 (iv) 감소되거나 불충분한 T 세포 수용체 교차-결합(cross-linking) 중 적어도 하나를 나타낸다. 일부 구현예에서, 변형된 T 세포가 대상체에게 투여될 때, 동일한 대상체에게 투여된 변형되지 않은 T 세포에 의해 발휘된 면역 반응과 비교하여, 상기 T 세포는 상기 대상체에서 감소된 면역 반응을 발휘한다.
일부 구현예에서, T 세포는 2개 이상의 기능적으로 손상된 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 두 번째 손상된 폴리펩티드는 T 세포 수용체 α 쇄(TRAC) 및/또는 T 세포 수용체 β 쇄(TRBC)이다.
일부 구현예에서, 변형된 T 세포는 하기를 포함한다: (a) TRAC, CD3δ, CD3ε, CD3γ, B2M, C2TA, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP 또는 Ii 쇄로부터 선택된 3개 이상의 기능적으로 손상된 폴리펩티드; 또는 (b) CD3α, CD3δ, CD3ε, CD3γ, B2M, C2TA, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP 또는 Ii 쇄로부터 선택된 2개의 기능적으로 손상된 폴리펩티드; 또는 (c) CD3α, CD3δ, CD3ε, CD3γ, B2M, C2TA, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP 또는 Ii 쇄로부터 선택된 3개의 기능적으로 손상된 폴리펩티드; 또는 (d) CD3δ, CD3ε 및 CD3γ로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 기능적으로 손상된 폴리펩티드, 및 TRAC, TRBC, B2M, C2TA, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP 또는 Ii 쇄로부터 선택된 적어도 하나의 기능적으로 손상된 폴리펩티드; 또는 (e) CD3δ, CD3ε 및 CD3γ로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 기능적으로 손상된 폴리펩티드, 및 TRAC, TRBC, B2M, C2TA, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP 또는 Ii 쇄로부터 선택된 기능적으로 손상된 폴리펩티드.
일부 구현예에서, 변형된 T 세포는 하기를 포함한다: (a) 기능적으로 손상된 CD3δ 및 TRAC, TRBC, B2M, C2TA, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP, 또는 Ii 쇄로부터 선택된 적어도 하나의 기능적으로 손상된 폴리펩티드; (b) 기능적으로 손상된 CD3ε 및 TRAC, TRBC, B2M, C2TA, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP 또는 Ii 쇄로부터 선택된 적어도 하나의 기능적으로 손상된 폴리펩티드; 또는 (c) 기능적으로 손상된 CD3γ 및 TRAC, B2M, C2TA, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP 또는 Ii 쇄로부터 선택된 적어도 하나의 기능적으로 손상된 폴리펩티드.
일부 구현예에서, 변형된 T 세포는 TRAC, TRBC, B2M, C2TA, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP 또는 Ii 쇄로부터 선택된 2개 이상의 기능적으로 손상된 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 T 세포는 TRAC, TRBC, CD3δ, CD3ε, CD3γ, B2M, C2TA, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP, Ii 쇄 또는 이들의 임의의 조합의 감소된 발현을 갖는다. 일부 구현예에서, 변형된 T 세포는 CD3δ, CD3ε, CD3γ, TRAC, B2M, C2TA, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP, Ii 쇄 또는 이들의 임의의 조합을 발현하지 않는다.
일부 구현예에서, 변형된 T 세포는 TRAC, TRBC, B2M 및 C2TA로부터 선택된 기능적으로 손상된 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 T 세포는 TRAC, TRBC, B2M 또는 C2TA의 감소된 발현을 갖거나 TRAC, TRBC, B2M 또는 C2TA를 발현하지 않는다. 일부 구현예에서, CD3δ, CD3ε 및/또는 CD3γ의 변형은 손상된 TCR/CD3 복합체 기능을 초래한다. 일부 구현예에서, CD3δ, CD3ε 또는 CD3γ 중 적어도 하나는 CD3δ, CD3ε 또는 CD3γ의 하나 이상의 엑손, 선택적으로 CD3δ, CD3ε 또는 CD3γ의 엑손 1을 표적화함으로써 변형된다.
본 개시내용의 한 양태는 (a) CD3δ, CD3ε, CD3γ, B2M, CIITA, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP 및 불변 쇄(Ii 쇄)로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 내인성 면역 단백질을 암호화하는 하나 이상의 내인성 면역 유전자의 유전자 발현을 하향조절할 수 있는 하나 이상의 핵산을 면역 세포에 도입하고; (b) 키메라 항원 수용체(CAR), 조작된 T 세포 수용체(TCR), 킬러 세포 면역글로불린-유사 수용체(KIR), 항원-결합 폴리펩티드, 세포 표면 수용체 리간드, 또는 종양 항원을 암호화하는 외인성 핵산을 면역 세포에 도입하고; (c) 변형된 면역 세포를 확장하여 T 세포의 집단(population)을 생성시키는 것을 포함하는, 변형된 면역 세포를 생성하기 위한 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포를 생성하기 위한 방법은 우성 음성 수용체, 전환 수용체, 또는 이들의 조합을 암호화하는 외인성 핵산을 면역 세포에 도입하는 것을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 변형된 면역 세포 내로 도입된 하나 이상의 핵산은 (a) CD3δ, CD3ε 또는 CD3γ로부터 선택된 T 세포 수용체 서브유닛; 및/또는 (b) B2M, TAP1, TAP2, TAPBP 또는 NLRC5로부터 선택된 HLA 부류 I 분자; 및/또는 (c) HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP 또는 불변 쇄(Ii 쇄)로부터 선택된 HLA 부류 II 분자의 유전자 발현을 하향조절할 수 있다.
일부 구현예에서, 변형된 면역 세포 내로 도입된 하나 이상의 핵산은 CD3δ의 유전자 발현, 및 B2M, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP, 불변 쇄(Ii 쇄) 및 이들의 조합으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 HLA 분자의 유전자 발현을 하향조절할 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포 내로 도입된 하나 이상의 핵산은 CD3ε, 및 B2M, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, CIITA, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP, 불변 쇄(Ii 쇄) 및 이들의 조합으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 HLA 분자의 유전자 발현을 하향조절할 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포 내로 도입된 하나 이상의 핵산은 CD3γ, 및 B2M, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, CIITA, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP, 불변 쇄(Ii 쇄) 및 이들의 조합으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 HLA 분자의 유전자 발현을 하향조절할 수 있다.
일부 구현예에서, 변형된 면역 세포 내로 도입된 하나 이상의 핵산은 (a) CD3ε, B2M 및 CIITA; (b) CD3ε, B2M 및 RFX5; (c) CD3ε, B2M 및 RFXAP; (d) CD3ε, B2M 및 RFXANK; (e) CD3ε, B2M 및 HLA-DM; (f) CD3ε, B2M 및 Ii 쇄; (g) CD3ε, TAP1 및 CIITA; (h) CD3ε, TAP1 및 RFX5; (i) CD3ε, TAP1 및 RFXAP; (j) CD3ε, TAP1 및 RFXANK; (k) CD3ε, TAP1 및 HLA-DM; (l) CD3ε, TAP1 및 Ii 쇄; (m) CD3ε, TAP2 및 CIITA; (n) CD3ε, TAP2 및 RFX5; (o) CD3ε, TAP2 및 RFXAP; (p) CD3ε, TAP2 및 RFXANK; (q) CD3ε, TAP2 및 HLA-DM; (r) CD3ε, TAP2 및 Ii 쇄; (s) CD3ε, NLRC5 및 CIITA; (t) CD3ε, NLRC5 및 RFX5; (u) CD3ε, NLRC5 및 RFXAP; (v) CD3ε, NLRC5 및 RFXANK; (w) CD3ε, NLRC5 및 HLA-DM; (x) CD3ε, NLRC5 및 Ii 쇄; (y) CD3ε, TAPBP 및 CIITA; (z) CD3ε, TAPBP 및 RFX5; (aa) CD3ε, TAPBP 및 RFXAP; (bb) CD3ε, TAPBP 및 RFXANK; (cc) CD3ε, TAPBP 및 HLA-DM; 또는 (dd) CD3ε, TAPBP 및 Ii 쇄의 유전자 발현을 하향조절할 수 있다.
일부 구현예에서, 변형된 면역 세포 내로 도입된 하나 이상의 핵산은 (a) CD3δ, B2M 및 CIITA; (b) CD3δ, B2M 및 RFX5; (c) CD3δ, B2M 및 RFXAP; (d) CD3δ, B2M 및 RFXANK; (e) CD3δ, B2M 및 HLA-DM; (f) CD3δ, B2M 및 Ii 쇄; (g) CD3δ, TAP1 및 CIITA; (h) CD3δ, TAP1 및 RFX5; (i) CD3δ, TAP1 및 RFXAP; (j) CD3δ, TAP1 및 RFXANK; (k) CD3δ, TAP1 및 HLA-DM; (l) CD3δ, TAP1 및 Ii 쇄; (m) CD3δ, TAP2 및 CIITA; (n) CD3δ, TAP2 및 RFX5; (o) CD3δ, TAP2 및 RFXAP; (p) CD3δ, TAP2 및 RFXANK; (q) CD3δ, TAP2 및 HLA-DM; (r) CD3δ, TAP2 및 Ii 쇄; (s) CD3δ, NLRC5 및 CIITA; (t) CD3δ, NLRC5 및 RFX5; (u) CD3δ, NLRC5 및 RFXAP; (v) CD3δ, NLRC5 및 RFXANK; (w) CD3δ, NLRC5 및 HLA-DM; (x) CD3δ, NLRC5 및 Ii 쇄; (y) CD3δ, TAPBP 및 CIITA; (z) CD3δ, TAPBP 및 RFX5; (aa) CD3δ, TAPBP 및 RFXAP; (bb) CD3δ, TAPBP 및 RFXANK; (cc) CD3δ, TAPBP 및 HLA-DM; 또는 (dd) CD3δ, TAPBP 및 Ii 쇄의 유전자 발현을 하향조절할 수 있다.
일부 구현예에서, 변형된 면역 세포 내로 도입된 하나 이상의 핵산은 (a) CD3γ, B2M 및 CIITA; (b) CD3γ, B2M 및 RFX5; (c) CD3γ, B2M 및 RFXAP; (d) CD3γ, B2M 및 RFXANK; (e) CD3γ, B2M 및 HLA-DM; (f) CD3γ, B2M 및 Ii 쇄; (g) CD3γ, TAP1 및 CIITA; (h) CD3γ, TAP1 및 RFX5; (i) CD3γ, TAP1 및 RFXAP; (j) CD3γ, TAP1 및 RFXANK; (k) CD3γ, TAP1 및 HLA-DM; (l) CD3γ, TAP1 및 Ii 쇄; (m) CD3γ, TAP2 및 CIITA; (n) CD3γ, TAP2 및 RFX5; (o) CD3γ, TAP2 및 RFXAP; (p) CD3γ, TAP2 및 RFXANK; (q) CD3γ, TAP2 및 HLA-DM; (r) CD3γ, TAP2 및 Ii 쇄; (s) CD3γ, NLRC5 및 CIITA; (t) CD3γ, NLRC5 및 RFX5; (u) CD3γ, NLRC5 및 RFXAP; (v) CD3γ, NLRC5 및 RFXANK; (w) CD3γ, NLRC5 및 HLA-DM; (x) CD3γ, NLRC5 및 Ii 쇄; (y) CD3γ, TAPBP 및 CIITA; (z) CD3γ, TAPBP 및 RFX5; (aa) CD3γ, TAPBP 및 RFXAP; (bb) CD3γ, TAPBP 및 RFXANK; (cc) CD3γ, TAPBP 및 HLA-DM; 또는 (dd) CD3γ, TAPBP 및 Ii 쇄의 유전자 발현을 하향조절할 수 있다.
일부 구현예에서, 변형될 면역 세포는 T 세포, 자연 살해 세포(NK 세포), 자연 살해 T 세포, 림프 전구 세포, 조혈 줄기 세포, 줄기 세포, 대식세포 및 수지상 세포로 이루어지는 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 변형될 면역 세포는 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포이다. 일부 구현예에서, 변형될 면역 세포는 동종이계 T 세포 또는 자기유래 T 세포이다.
일부 구현예에서, 핵산은 바이러스 형질도입에 의해 면역 세포 내로 도입된다. 일부 구현예에서, 바이러스 형질도입은 면역 세포를 하나 이상의 핵산을 포함하는 바이러스 벡터와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터, 센다이 바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터 및 렌티바이러스 벡터로 이루어지는 그룹으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 내인성 면역 유전자의 발현을 하향조절할 수 있는 하나 이상의 핵산 각각은 하기로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 유전자 편집 시스템을 포함한다: (a) CRISPR-관련(Cas)(CRISPR-CAs) 엔도뉴클레아제 시스템 및 안내 RNA; (b) TALEN 유전자 편집 시스템, 아연 집게 뉴클레아제(ZFN) 유전자 편집 시스템, 메가뉴클레아제 유전자 편집 시스템, 또는 메가-TALEN 유전자 편집 시스템; 및 (c) 안티센스 RNA, 안티고머 RNA, RNAi, siRNA 또는 shRNA로부터 선택된 유전자 침묵 시스템.
일부 구현예에서 Cas 엔도뉴클레아제는 Cas3, Cas4, Cas8a, Cas8b, Cas9, Cas10, Cas10d, Cas12a, Cas12b, Cas12d, Cas12e, Cas12f, Cas12g, Cas12h, Cas12i, Cas13, Cas14, CasX, Cse1, Csy1, Csn2, Cpf1, C2c1, Csm2, Cmr5, Fok1, 에스 피오게네스 Cas9, 스타필로코커스 아우레우스 Cas9, MAD7 뉴클레아제(V형 CRISPR 뉴클레아제) 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR-Cas 시스템은 pAd5/F35-CRISPR 벡터를 포함한다.
일부 구현예에서, CRISPR-Cas 시스템의 안내 RNA는 CD3δ, CD3ε, CD3γ, B2M, CIITA, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP 및 불변 쇄(Ii 쇄)로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 면역 단백질을 각각 암호화하는 하나 이상의 유전자좌 내의 서열과 상보적인 안내 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 변형된 면역 세포 내로 도입된 안내 RNA는 CD3δ, CD3ε 또는 CD3γ의 하나 이상의 엑손 내의 서열과 상보적이다. 일부 구현예에서, 안내 RNA는 CD3δ, CD3ε 또는 CD3γ의 엑손 1 내의 서열과 상보적이다.
일부 구현예에서, 변형된 면역 세포 내로 도입된 안내 RNA는 CD3δ 유전자좌 내의 서열과 상보적이고 안내 RNA는 서열번호 53에 의해 암호화된 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포 내로 도입된 안내 RNA는 CD3ε 유전자좌 내의 서열과 상보적이고 안내 RNA는 서열번호 52에 의해 암호화된 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포 내로 도입된 안내 RNA는 CD3γ 유전자좌 내에 있고 안내 RNA는 서열번호 54에 의해 암호화된 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포 내로 도입된 안내 RNA는 B2M 유전자좌 내의 서열과 상보적이고 안내 RNA는 서열번호 55에 의해 암호화된 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포 내로 도입된 안내 RNA는 CIITA 유전자좌 내의 서열과 상보적이고 안내 RNA는 서열번호 61에 의해 암호화된 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포 내로 도입된 안내 RNA는 TAP1 유전자좌 내의 서열과 상보적이고 안내 RNA는 서열번호 56에 의해 암호화된 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포 내로 도입된 안내 RNA는 TAP2 유전자좌 내의 서열과 상보적이고 안내 RNA는 서열번호 57에 의해 암호화된 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포 내로 도입된 안내 RNA는 TAPBP 유전자좌 내의 서열과 상보적이고 안내 RNA는 서열번호 58, 서열번호 59, 또는 이들의 임의의 조합에 의해 암호화된 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포 내로 도입된 안내 RNA는 NLRC5 유전자좌 내의 서열과 상보적이고 안내 RNA는 서열번호 60에 의해 암호화된 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포 내로 도입된 안내 RNA는 HLA-DM 유전자좌 내의 서열과 상보적이고 안내 RNA는 서열번호 62에 의해 암호화된 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포 내로 도입된 안내 RNA는 RFX5 유전자좌 내의 서열과 상보적이고 안내 RNA는 서열번호 63, 서열번호 64 또는 이들의 조합에 의해 암호화된 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포 내로 도입된 안내 RNA는 RFXANK 유전자좌 내의 서열과 상보적이고 안내 RNA는 서열번호 65에 의해 암호화된 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포 내로 도입된 안내 RNA는 RFXAP 유전자좌 내의 서열과 상보적이고 안내 RNA는 서열번호 66에 의해 암호화된 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포 내로 도입된 안내 RNA는 Ii 쇄 유전자좌 내의 서열과 상보적이고 안내 RNA는 서열번호 67, 서열번호 68, 또는 이들의 조합에 의해 암호화된 핵산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 개시된 방법에 의해 생성된 변형된 면역 세포는 상기 변형된 면역 세포가 대상체에게 투여될 때, 동일한 대상체에게 투여된 변형되지 않은 면역 세포에 의해 발휘되는 면역 반응과 비교하여, 상기 대상체에서 감소된 면역 반응을 발휘한다.
일부 구현예에서, 개시된 방법에 의해 생성된 변형된 면역 세포는 상기 면역 세포가 대상체에게 투여될 때, TRAC, TRBC, B2M 및 CIITA의 유전자 발현을 하향조절할 수 있는 하나 이상의 핵산을 포함하는 면역 세포에 의해 발휘되는 면역 반응과 비교하여, 상기 대상체에서 감소된 면역 반응을 발휘한다. 일부 구현예에서, 개시된 방법에 의해 생성된 변형된 면역 세포에 의해 감소된 GvHD 반응은 하나 이상의 유전자좌 내에 결실 및/또는 삽입이 없는 동등한 면역 세포, 또는 TRAC, TRBC, B2M 및 CIITA에 결실 및/또는 삽입을 포함하는 면역 세포에 비교된다.
일부 구현예에서, 면역 반응은 이식편대숙주병(GvHD) 반응이다. 일부 구현예에서, 감소된 GvHD 반응은 HLA-I 불일치 세포 또는 HLA-II 불일치 세포에 대해 유발된다. 일부 구현예에서, 개시된 방법에 의해 생성된 변형된 면역 세포에 의해 유발된 GvHD 반응은 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상 감소된다. 일부 구현예에서, 개시된 방법에 의해 생성된 변형된 면역 세포에 의해 유발된 GvHD 반응은 약 1배 이상, 약 2배 이상, 약 3배 이상, 약 4배 이상, 약 5배 이상, 약 6배 이상, 약 7배 이상, 약 8배 이상, 약 9배 이상, 약 10배 이상, 약 20배 이상, 약 30배 이상, 약 50배 이상, 약 100배 이상, 약 150배 이상, 또는 약 200배 이상 감소된다.
일부 구현예에서, 면역 세포내로 도입된 외인성 핵산은 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화한다. 일부 구현예에서, CAR은 항원 결합 도메인, 힌지 도메인, 막관통 도메인, 공동자극 신호전달 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 혈액학적 악성종양과 연관되고/되거나 고형 종양과 연관된 종양 항원을 표적으로 한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 ROR1, 메소텔린, c-Met, PSMA, PSCA, 폴레이트 수용체 알파, 폴레이트 수용체 베타, EGFR, EGFRvIII, GPC2, GPC2, 뮤신 1(MUC1), Tn 항원((Tn Ag) 또는 (GalNAca-Ser/Thr)), TnMUC1, GDNF 패밀리 수용체 알파-4(GFRa4), 섬유아세포 활성화 단백질(FAP) 및 인터류킨-13 수용체 서브유닛 알파-2(IL-13Ra2 또는 CD213A2)로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 종양 항원을 표적으로 한다.
일부 구현예에서, 변형된 면역 세포내로 도입된 CAR은 (a) PSMA 항원 결합 도메인(예를 들어, 서열번호 73 또는 74), CD2 공동자극 도메인, 및 CD3 제타 세포내 신호전달 도메인; 또는 (b) 메소텔린 항원 결합 도메인(예를 들어, 서열번호 75), 4-1BB 공동자극 도메인 및 CD3 제타 신호전달 도메인; 또는 (c) TnMUC1 항원 결합 도메인, CD2 공동자극 도메인 및 CD3 제타 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, TnMUC1 CAR은 서열번호 70에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 메소텔린 CAR은 서열번호 71 또는 서열번호 72에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, TnMUC1 CAR은 서열번호 69에 제시된 핵산 서열에 의해 암호화된다.
본 개시내용의 한 양태에서, 변형된 면역 세포에 도입된 전환 수용체는 (a) CTLA4, PD-1, VSIG3, VSIG8, TGFβRII, BTLA, 및 TIM-3으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 음성 신호와 연관된 신호전달 단백질의 세포외 도메인, (b) 막관통 도메인, 및 (c) CD28, 4-1BB, IL12Rβ1, IL12Rβ2, CD2, ICOS 및 CD27로 이루어지는 그룹로부터 선택된 양성 신호와 연관된 신호전달 단백질의 세포내 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 전환 수용체는 PD-1-CD28, PD-1A132L-CD28, PD-1-CD27, PD-1A132L-CD27, PD-1-4-1BB, PD-1A132L-4-1BB, PD-1-ICOS, PD-1A132L-ICOS, PD-1-IL12Rβ1, PD-1A132L-IL12Rβ1, PD-1-IL12Rβ2, PD-1A132L-IL12Rβ2, VSIG3-CD28, VSIG8-CD28, VSIG3-CD27, VSIG8-CD27, VSIG3-4-1BB, VSIG8-4-1BB, VSIG3-ICOS, VSIG8-ICOS, VSIG3-IL12Rβ1, VSIG8-IL12Rβ1, VSIG3-IL12Rβ2, VSIG8-IL12Rβ2, TGFβRII-CD27, TGFβRII-CD28, TGFβRII-4-1BB, TGFβRII-ICOS, TGFβRII-IL12Rβ1 및 TGFβRII-IL12Rβ2로 이루어지는 그룹으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 변형된 면역 세포내로 도입된 우성 음성 수용체는 (a) 음성 신호와 연관된 야생형 단백질의 절두된 변이체; 또는 (b) 세포외 도메인, 막관통 도메인을 포함하고 세포내 신호전달 도메인이 실질적으로 결여된 음성 신호와 연관된 야생형 단백질의 변이체; 또는 (c) 음성 신호와 연관된 신호전달 단백질의 세포외 도메인, 및 막관통 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 우성 음성 수용체는 PD1, VSIG3, VISG8, 또는 TGFβR 우성 음성 수용체이다.
일부 구현예에서, 전환 수용체의 막관통 도메인은 CTLA4, PD-1, BTLA, TGFβRII, BTLA, TIM-3, CD28, 4-1BB, IL12Rβ1, IL12Rβ2, CD2, ICOS 및 CD27로 이루어지는 그룹로부터 선택된 단백질의 막관통 도메인으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 전환 수용체의 막관통 도메인은 음성 신호와 연관된 단백질의 막관통 또는 음성 신호와 연관된 단백질의 막관통 도메인으로부터 선택된다.
본 개시내용의 한 양태는 변형된 면역 세포의 확장을 제공한다. 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포를 확장시키는 것은 flt3-L, IL-1, IL-3, IL-2, IL-7, IL-15, IL-18, IL-21, TGF베타, IL-10 및 c-kit 리간드로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 인자와 함께 T 세포를 배양하는 것을 포함한다. 본 개시내용의 한 양태는 면역 세포의 다능성(pluripotency)을 유도하기 위해 면역 세포에 Klf4, Oct3/4 및 Sox2를 암호화하는 폴리펩티드 및/또는 핵산을 추가로 도입하는 것을 제공한다.
일부 구현예에서, 면역 세포는 혈액 샘플, 전혈 샘플, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 샘플, 또는 성분채집 샘플로부터 수득된다. 일부 구현예에서, 성분채집 샘플은 동결보존된 샘플이다. 일부 구현예에서, 성분채집 샘플은 신선한 샘플이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 인간 대상체로부터 수득된다.
이전 구현예 중 어느 하나의 방법에 의해 수득된 변형된 면역 세포의 집단을 제공한다. 일부 구현예에서, 조성물은 이전 구현예 중 어느 하나의 변형된 면역 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 이전 구현예 중 어느 하나에 개시된 방법에 의해 생성된 변형된 면역 세포의 집단 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함한다.
이전 구현예 중 어느 하나에 개시된 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 증대된 면역성과 연관된 질환 또는 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 상태는 암이다. 일부 구현예에서, 암은 유방암(breast cancer), 전립선암(prostate cancer), 난소암(ovarian cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 피부암(skin cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 결장직장암(colorectal cancer), 신장암(renal cancer), 간암(liver cancer), 뇌암(brain cancer), 림프종(lymphoma), 백혈병(leukemia), 폐암(lung cancer), 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 암은 고형 종양 또는 혈액학적 악성종양이다. 일부 구현예에서, 암을 치료하는 방법은 이전 구현예 중 어느 하나의 변형된 면역 세포, 이전 구현예 중 어느 하나의 변형된 T 세포의 집단, 또는 이전 구현예 중 어느 하나의 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
본 개시내용의 한 양태는 대상체에게 유효량의, 이전 구현예 중 어느 하나의 변형된 면역 세포, 이전 구현예 중 어느 하나의 변형된 면역 세포의 집단, 또는 이전 구현예 중 어느 하나의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 표적 세포 또는 조직에 대한 T 세포-매개된 면역 반응을 자극하기 위한 방법을 제공한다.
본 개시내용의 한 양태는 선택적으로 사용 설명서을 포함하는, 이전 구현예 중 어느 하나의 변형된 면역 세포, 이전 구현예 중 어느 하나의 변형된 T 세포의 집단, 또는 이전 구현예 중 어느 하나의 조성물을 포함하는 키트(kit)를 제공한다.
전술한 요약 및 하기의 도면 설명 및 상세한 설명은 모두 예시적이고 설명적이다. 이는 개시내용의 추가 세부사항을 제공하기 위한 것이지만 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 다른 목적, 이점 및 신규의 특징은 본 개시내용의 하기 상세한 설명으로부터 당업자에게 쉽게 명백해질 것이다.
도 1은 3개의 이량체 모듈 CD3δ/CD3ε, CD3γ/CD3ε 및 CD3ζ/CD3ζ에 커플링된 가변 TCR-알파 쇄(TCR-α, TRAC) 및 TCR-베타 쇄(TCR-β, TRBC)를 포함하는 인간 T-세포 수용체(TCR)-CD3 복합체의 도식적 표현을 도시한다. CD3δ/CD3ε 및 CD3γ/CD3ε 모듈이 본 개시내용의 주제이다.
도 2A-2C는 CRISPR/Cas 시스템을 사용하여 CD3δ(도 2A), CD3ε(도 2B) 및 CD3γ(도 2C) 유전자의 표적화된 붕괴 후 유세포 분석에 의해 측정된, 인간 T 세포에 대한 TCR-α 및 TCR-β 쇄 붕괴 효율을 예시하는 막대 그래프를 도시한다.
도 3은 도 1의 전략을 사용하여 생성된 동종이계 CART-세포의 확장을 예시하는 그래프를 도시하며, 10일에 걸친 집단 배가 수를 예시한다. 시험된 동종이계 CART 세포는 TRAC 녹아웃(TRAC KO), CD3δ 녹아웃(D1 KO), CD3γ 녹아웃(G4 KO) 및 CD3ε 녹아웃(E4 KO)을 포함하는 조작된 T 세포이다.
도 4A 및 4B는 TCR-α 쇄(T RAC) 녹아웃, CD3δ 녹아웃(D1 KO), CD3γ 녹아웃(G4 KO) 및 CD3ε 녹아웃(E4 KO)의 CRISPR 매개 하향조절을 비교하는 유세포 분석 결과를 도시한다. 도 4A는 TCR-α/β 쇄의 표면 발현에 의해 측정된 바와 같이, CD3ε 녹아웃(E4 KO)이 T 세포 수용체 녹아웃에 더 양호한 표적임을 나타낸다. 도 4B는 CD3ε 녹아웃(E4 KO)을 포함하는 동종이계 CART 세포가, 예를 들어 CD3γ 또는 CD3δ 녹아웃을 포함하는 CART 세포보다 더 높은 형질도입 효율을 갖고 기능적으로 더 양호하다는 것을 나타내며; PSMA CART 세포 구현예가 예시되어 있다.
도 5는 TCR-α 쇄(T RAC) 녹아웃, CD3δ 녹아웃(D1), CD3ε 녹아웃(E4) 및 CD3γ 녹아웃(G4)을 포함하는 동종이계 PSMA CART 세포의 종양 사멸 능력을 입증하는 그래프를 도시하고; PSMA E4 동종이계 CART 세포가 최고의 사멸 능력을 가지고 있음을 나타낸다. 표적 세포는 PC3 세포였다.
도 6A-6D는 T7 엔도뉴클레아제 불일치 검출 분석(T7E1)으로 예시된 CRISPR-Cas 활성을 도시한다. 도 6A는 3개의 상이한 gRNA를 사용하여 3개의 상이한 CRISPR-Cas C2TA(CIITA) 유전자 부위로부터 증폭된 T7E1-처리된 PCR 산물의 전형적인 겔 전기영동 이미지를 도시한다. 도 6B-6D는 CRISPR-Cas 편집 효율을 입증하는 T7E1 엔도뉴클레아제 분석의 Agilent Bioanalyzer 전기영동도에 의해 생성된 전기영동도를 도시한다.
도 7A-D는 C2TA(CIITA) CRISPR 편집 효율 결과를 예시하는 대조군 및 T7E1 처리 PCR의 Agilent Bioanalyzer 전기영동도 및 겔 전기영동을 도시한다. 특히, 도 7A는 샘플 C2TA-1-PCR에 대한 전체 결과를 도시하고, 도 7B는 샘플 C2TA-1-T7E1에 대한 전체 결과를 도시하고, 도 7C는 샘플 C2TA-2-PCR에 대한 전체 결과를 도시하고, 도 7D는 샘플 C2TA-2-T7E1에 대한 전체 결과를 도시한다.
도 8은 혼합 림프구 반응(MLR) 분석 결과를 예시하고; 대조용 T 세포(2차 공여자), 동종이계 PSMA CART 세포 단독 또는 공동 배양의 생존력(viability)을 입증하고; HLA 불일치의 존재에도 불구하고 공동 배양에서 2차(관련 없는) 공여자로부터의 T 세포가 동종이계 PSMA CART 세포에 반응하여 증식하지 않는다는 것을 예시하는 그래프를 도시한다. 동종이계 CART 세포는 PSMA CAR 및 CRISPR 편집 TRAC/B2M/C2TA gRNA를 포함한다.
I. 개요
T 세포 수용체(TCR) 복합체는 적어도 8개의 폴리펩티드 서브유닛(TCRαβ, CD3εγ, CD3εδ 및 CD3ζζ)으로 구성된 큰 다중-서브유닛 복합체이다. TCRαβ 이종이량체는 주조직적합성 복합체 부류 I 및 부류 II 분자에 결합된 항원을 인식하는 역할을 하는 리간드 결합 서브유닛이다. CD3ε, CD3γ, CD3δ 및 CD3ζ는 이량체로서 구성되어 TCRαβ 이종이량체에 의해 생성된 신호를 전달하는 3개의 이량체 모듈 CD3δ/CD3ε, CD3γ/CD3ε 및 CD3ζ/CD3ζ를 형성한다. 현재까지 GvHD 및/또는 HvHD 회피 전략은, TRAC 유전자좌의 표적화된 붕괴를 통한 TCRα 쇄의 하향조절을 포함하는 동종이계 T 세포의 생성이었다. 본 개시내용 이전에, GvHD 및 HvHD의 촉진에서 CD3ε, CD3γ, CD3δ 및 CD3ζ의 조절 역할은 조사되지 않았는데, 이는 CD3α/β의 붕괴가 동종이계 T 세포의 성공적인 생성에 결정적인 것으로 여겨졌기 때문이다. 본 개시내용은 CD3ε, CD3γ, CD3δ 및 CD3ζ 유전자좌의 표적화된 붕괴가, TRAC 유전자좌의 표적화된 붕괴를 포함하는 CAR T 세포만큼 효율적이고/이거나 더 양호한 동종이계 CAR T 세포를 생성시켰다는 놀라운 발견을 상세히 설명한다. 본 개시내용에서, CD3ε, CD3γ, CD3δ 유전자 중 적어도 하나의 붕괴가 바람직하다.
본 발명은 하나 이상의 내인성 T 세포 수용체 복합체 유전자 발현을 녹다운하고 키메라 항원 수용체(CAR), 조작된 T 세포 수용체(TCR), 킬러 세포 면역글로불린-유사 수용체(KIR), 항원-결합 폴리펩티드, 세포 표면 수용체 리간드, 종양 항원, 우성 음성 수용체, 전환 수용체, 케모카인, 케모카인 수용체, 사이토카인, 또는 사이토카인 수용체 중 하나를 발현함으로써 변형된 T 세포를 생성하기 위한 방법 및 조성물을 포함한다.
따라서, 본 개시내용은 T 세포 수용체 복합체의 유전적으로 편집된 CD3δ 유전자, CD3ε 유전자, CD3ζ 유전자 및/또는 CD3γ 유전자 중 적어도 하나를 키메라 항원 수용체(CAR), 및/또는 전환 수용체 및/또는 면역 증대 인자와 조합하여 포함하는 변형된 면역 세포가, 당업계에 공지된 표준 동종이계 T 세포와 비교할 때, 시험관 내에서 다양한 암 세포주에 대한 효능있는 세포질 활성뿐만 아니라 생체 내에서 유의미한 종양 근절을 입증하는 향상된 적합성을 지닌 개선된 동종이계 T 세포라는 관찰에 기반한다.
입양 면역요법은 암 환자에게 흥분되는 가능성을 제공한다. 그러나 현재 CAR-T 및 TCR 세포 제조와 관련하여 몇 가지 과제가 존재한다. 이러한 과제는 입양 면역요법의 잠재적인 성공에 영향을 미친다.
자가 입양 면역요법의 승인과 일반적인 성공에도 불구하고, 이러한 치료법의 확장성과 타당성은 중요한 과제를 제시한다. 특히, 입양 면역요법의 광범위한 임상 적용은 자기유래 CART 세포의 개인별 제조로 인해 부과되는 상당한 경제적 제약으로 인해 제한된다. 그러나 동종이계 치료 세포가 사전 제조되고, 세부적으로 특성화되고, 광범위한 환자에게 즉시 투여될 수 있는 표준화된 입양 면역요법은 여전히 동종이계 T 세포 반응과 같은, 많은 가능한 합병증이 있는 위험한 시술로 남아 있다. 동종이계 T 세포 반응은 이식편대숙주병(GVHD) 및/또는 숙주대이식편병(HvGD, 이식 거부)으로 임상적으로 나타난다. GvHD는 공여자 CAR 세포의 동종반응성 TCR에 의해 매개되는 주입된 동종이계 CAR-T 세포에 의한 수용자 조직의 공격으로 인해 발생한다. 특히, 주입된 T 세포의 내인성 T 세포 수용체 알파(TCRα; TRAC) 및 베타(TCRβ; TRBC) 쇄는 수용자의 주 및 부 조직적합성 항원을 인식하여 (GvHD)를 유발한다. 반대로, 주입된 동종이계 CART 세포는 수용자 T 림프구에 의해 거부되어 HvGD를 유발할 수 있다.
본 개시내용 이전에, 동종이계 T 세포 반응을 다루는 한 가지 접근법은 동종이계 공여자 T 세포에서 TCRα, TCRβ 및/또는 하나 이상의 주조직적합성(MHC) 부류 I(MHC I) 및/또는 MHC 부류 II 복합체의 발현을 없애기 위해 게놈 편집 기법을 사용하여 동종이계 T 세포를 조작하는 것이었다. TCRαβ 이종이량체는 전체 TCR 복합체의 조립 및 활성에 필요하기 때문에 TCR α 또는 β 쇄의 발현을 녹아웃시키면 공여자 CAR T 세포가 숙주 동종항원을 인식하지 못하게 되어 GVHD를 방지할 수 있다. 더욱이, 반대로 공여자 T 세포에서 MHC I를 편집하면 수용자의 T 세포가 이러한 동종이계 T 세포를 인식하지 못하게 되어 이식편 거부를 방지할 수 있다. 현재까지, TRAC 유전자좌의 표적화된 붕괴를 통한 α 쇄의 결실은 주로 β 쇄가 2개의 TRBC 유전자(TRBC1 및 TRBC2)에 의해 암호화되기 때문에 GVHD 회피 전략으로 활용되어 왔다. 따라서 TRBC 유전자를 녹아웃시키는 것은 잠재적으로 더 복잡하다.
독성을 최소화하면서 Cas9/sgRNA를 T 세포에 효율적으로 도입하기 위한 최적의 프로토콜은 아직 확립되지 않고 있다. 더욱이, 현행 기법은 CART 세포의 100%에서 TCR 녹아웃을 초래하지 않는다. 이는 CART 치료에 유용한 동종이계 세포의 성공적인 생성이 100% TCR 녹아웃으로부터 이익을 얻을 수 있기 때문에 중요하다.
이 문제를 해결하기 위해, 본 개시내용은 CD3ε 유전자, CD3γ 유전자 및/또는 CD3δ 유전자의 붕괴를 상세히 개시하며(도 1 참조), 이들은 하기 표 1에 상세히 설명된 대로 개별적으로는 물론이고 적어도 하나의 다른 유전자 녹아웃과 조합되었다. (CD3ζ 유전자도 또한 붕괴될 수 있다.) 본 개시내용은 또한 CD3ε, CD3γ 및/또는 CD3δ(및 선택적으로 CD3ζ 유전자) 중 적어도 하나가 붕괴되는 작제물(construct) 및 이의 용도를 포함한다. CD3ε, CD3γ 및/또는 CD3δ(및 선택적으로 CD3ζ 유전자) 중 적어도 하나의 붕괴는 또한 CD3α 및 CD3β 중 하나 이상의 붕괴(예를 들어, CD3ε 유전자 및 CD3γ 유전자의 녹아웃; CD3ε 유전자 및 CD3α 유전자의 녹아웃, CD3γ 유전자 및 CD3δ 유전자의 녹아웃 등)와 조합될 수 있다. 예를 들어, 대안의 T 세포 수용체 서브유닛(CD3δ, CD3γ 및 CD3ε) 및 항원 가공 및 제시 경로에서 추가의 중요한 유전자의 녹아웃(KO)을 포함하는 본 발명의 신규의 동종이계 CART 전략을 예시하는 실시예 2 및 표 1을 참조하시오.
[표 1]
놀랍게도 2개 또는 3개(또는 그 이상)의 붕괴가 T 세포 수용체 발현을 방해하고 최소한의 독성으로 TCR의 하향조절을 성공적으로 생성시켰다는 사실이 발견되었다.
또한, TRAC 음성 T 세포는 종양에서 더 오래 지속되는 것으로 나타났으며(Stadtmauer et. al., Science, 367(6481): eaba7365 (2020)), 따라서 CD3ε 유전자, CD3γ 유전자, CD3ζ 유전자 및/또는 CD3δ 유전자의 붕괴에 초점을 맞추면 입양 면역요법에 유효한 T 세포도 생성된다는 것은 놀라운 일이었다(상기에서 언급한 바와 같이, 본 개시내용은 또한 CD3α 및/또는 CD3β 유전자의 붕괴와 조합된 CD3ε, CD3γ, CD3ζ 및/또는 CD3δ 유전자 중 하나 이상의 붕괴를 포함한다).
본 개시내용은 동종이계 T 세포 반응과 연관된 TCR 신호전달을 대안적으로 조율하고 조정함으로써 T 세포의 기능적 특성을 조정하기 위한 신규의 대안적인 접근법을 제공한다. 특히, 본 개시내용은 CD3ε 유전자, CD3γ 유전자, CD3ζ 및/또는 CD3δ 유전자 중 적어도 하나의 단독적인 또는 하나 이상의 추가의 TCR 복합체 성분과의 조합의 하향조절이, CART 세포의 유익한 항종양 특성을 보존하여 안전하고 유효한 CART 세포를 생성시키면서 동종이계 T 세포 반응을 유의하게 감소시켰다는 것을 입증한다. 이러한 신규의 대안적인 접근 방식의 장점이 하기에 더 상세히 기재되어 있다.
II. 실험 결과
인간 T 세포에 대한 TCR-α 및 TCR-β 쇄 붕괴 효율의 백분율을 CRISPR/Cas 시스템을 사용하여 CD3δ(도 2A), CD3ε(도 2B) 및 CD3γ(도 2C) 유전자의 표적화된 붕괴 후 유세포 분석에 의해 측정하였다(또한 하기 실시예 3 참조). 도 2A는 4개의 상이한 안내 RNA, 즉 gRNA1, gRNA2, gRNA3 및 gRNA4를 사용한 CD3δ 붕괴 후 결과를 도시한다. CRISPR/Cas 시스템에서 gRNA1 및 gRNA3 안내 RNA를 사용한 CD3δ의 표적화된 붕괴는 TCR α/β의 100% KO 효율을 가져온 반면, CRISPR/Cas 시스템에서 gRNA2 및 gRNA4의 사용은 약 90% 초과의 TCR α/β의 KO 효율을 가져왔다. 따라서 CD3δ 붕괴의 경우 CRISPR/Cas 시스템에서 gRNA1 및 gRNA3의 사용이 바람직하다.
도 2B는 5개의 상이한 안내 RNA, 즉 gRNA1, gRNA2, gRNA3, gRNA4 및 gRNA5를 사용한 CD3ε의 표적화된 붕괴에 따른 결과를 도시한다: CRISPR/Cas 시스템에서 gRNA4 및 gRNA5 안내 RNA를 사용한 CD3ε의 붕괴는 TCR α/β의 100% KO 효율을 생성시킨 반면, gRNA1의 사용은 TCR α/β의 단지 약 50% KO 효율을 생성시켰고, 최종적으로 CRISPR/Cas 시스템에서 안내 gRNA2 및 gRNA3의 사용은 TCR α/β의 약 90% 초과의 KO 효율을 생성시켰다. 따라서 CD3ε 붕괴의 경우 CRISPR/Cas 시스템에서 gRNA4 및 gRNA5 안내 RNA를 사용하는 것이 바람직하다.
도 2C는 5개의 상이한 안내 RNA, 즉 gRNA1, gRNA2, gRNA3, gRNA4 및 gRNA5를 사용한 CD3γ의 표적화된 붕괴에 따른 결과를 도시한다: CRISPR/Cas 시스템에서 gRNA4 및 안내 RNA를 사용한 CD3ε의 붕괴는 TCR α/β의 100% KO 효율을 생성시킨 반면, gRNA5의 사용은 TCR α/β의 약 95% 초과의 KO 효율을 생성시켰고, 최종적으로 CRISPR/Cas 시스템에서 gRNA1, gRNA2 및 gRNA3 안내 RNA의 사용은 TCR α/β의 덜 유리한 KO 효율을 생성시켰다. 따라서 CD3γ 붕괴의 경우 CRISPR/Cas 시스템에서 gRNA4 안내 RNA를 사용하는 것이 바람직하다.
하기 실시예 4에 상세하게 제공된 또 다른 실험에서, 10일 기간에 걸쳐 동종이계 CART 세포의 다양한 작제물의 확장을 평가하였다. 변형된 면역 세포가 확장되지 않으면 성공적인 요법을 위해 충분한 수의 세포가 생성되지 않으므로 이 데이터가 중요하다. 시험된 다양한 작제물에는 (1) TRAC 녹아웃(도 3의 ALLO(TRAC KO))(예를 들어, 본 개시내용 이전에 사용된 녹아웃), (2) CD3δ 녹아웃(도 3의 ALLO(D1 KO)), (3) CD3γ 녹아웃(도 3의 ALLO(G4 KO)) 및 (4) CD3ε 녹아웃(도 3의 ALLO(E4 KO))을 포함하는 동종이계 CART 세포가 포함되었다. 세포 집단 배가의 백분율은 Y 축에 표시되고 일수는 X 축에 표시된다. 도 3에 상세히 설명된 결과는 모든 변형된 세포가 9일의 기간에 걸쳐 약 4배 이상의 배가를 생성시켰음을 보여주며, 따라서 이는 변형된 세포가 면역요법에 유용한 유용한 양의 물질을 생성시킨다는 것을 입증한다.
실시예 5는 TCR-α/β 쇄의 표면 발현을 평가하기 위해 다수의 상이한 녹아웃 작제물을 평가하였다. 특히, 도 4A 및 4B는 TCR-α 쇄(TRAC) 녹아웃(예를 들어, 본 개시내용 이전에 사용된 작제물), CD3δ 녹아웃(D1 KO), CD3γ 녹아웃(G4 KO) 및 CD3ε 녹아웃(E4 KO)의 CRISPR-매개 하향조절을 비교하는 유세포 분석 결과를 나타낸다. 도 4A는 TCR-α/β 쇄의 표면 발현에 의해 측정된 바와 같이, CD3ε 녹아웃(E4 KO)이 T 세포 수용체 녹아웃에 더 양호한 표적이었다는 것을 나타낸다. 도 4B는 CD3ε 녹아웃(E4 KO)을 포함하는 동종이계 CART 세포가 예를 들어 CD3γ 또는 CD3δ 녹아웃을 포함하는 CART 세포보다 더 높은 형질도입 효율을 갖고 기능적으로 더 양호하다는 것을 나타내며; PSMA CART 세포 구현예를 예시한다. 더욱이, 도 4B는 대부분의 CART 세포가 동종이계(CD3 및 TCR 음성)이었음을 나타내며, 이는 본 발명의 CART 세포가 투여된 환자에게 더 많은 수의 allo CART 세포가 주입될 것임을 의미한다.
하기 실시예 6에 상세히 설명된 추가 실험에서, 상이한 PSMA CART 세포 작제물의 종양 사멸 능력을 도 5에 도시된 바와 같이 평가하였다. 특히, 도 5는 TCR-α 쇄(T RAC) 녹아웃(예를 들어, 본 개시내용 이전에 사용된 작제물), CD3δ 녹아웃(D1), CD3ε 녹아웃(E4) 및 CD3γ 녹아웃(G4)을 포함하는 동종이계 PSMA CART 세포의 종양 사멸 능력을 입증하는 그래프를 도시한다. 결과는 PSMA E4 동종이계 CART 세포가 최고의 사멸 능력을 가지고 있음을 예시한다. 표적 세포는 인간 전립선암 세포주인 PC3 세포였다. E4는 뜻밖에도 D1 및 G4보다 더 효능있는 것으로 밝혀졌다. CD3ε 분자를 표적화함으로써 제조된 Allo CART 세포는 평가된 다른 allo CART 세포와 비교할 때 더 효능이 있었다(예를 들어, 종양 세포를 훨씬 더 빠르게 사멸시킨다). CD3ε 녹아웃(E4) CART 세포의 효능이 더 높다는 것은 이러한 CART 세포의 표적이 되는 종양 세포가 TCR-α 쇄(TRAC) 녹아웃 CART 세포, CD3δ 녹아웃(D1) CART 세포 및/또는 CD3γ 녹아웃(G4) CART 세포와 비교할 때 훨씬 더 빠르게 근절될 것임을 의미한다. 그리고 우리의 동종이계 전략이 환자에서 성공하려면 시간이 필수적이다.
실시예 7은 표적 유전자의 녹아웃에 영향을 미치는 CRISPR-Cas 방법의 유효성 평가를 기재한다. 특히, 도 6A-6D는 T7 엔도뉴클레아제 불일치 검출 분석(T7E1)으로 예시된 CRISPR-Cas 활성을 도시한다. 도 6A는 3개의 상이한 gRNA를 사용하여 3개의 상이한 CRISPR-Cas C2TA(CIITA) 유전자 부위로부터 증폭된 T7E1 처리된 PCR 산물의 전형적인 겔 전기영동 이미지를 도시한다. 도 6B-6D는 CRISPR-Cas 편집 효율을 입증하는 T7E1 엔도뉴클레아제 분석의 Agilent Bioanalyzer 전기영동도에 의해 생성된 전기영동도를 도시한다.
또한, 도 7A-D는 C2TA(CIITA) CRISPR 편집 효율 결과를 예시하는 대조군 및 T7E1 처리 PCR의 Agilent Bioanalyzer 전기영동도 및 겔 전기영동을 도시한다. 도 7A는 샘플 C2TA-1-PCR에 대한 전체 결과를 도시하고, 도 7B는 샘플 C2TA-1-T7E1에 대한 전체 결과를 도시하고, 도 7C는 샘플 C2TA-2-PCR에 대한 전체 결과를 도시하고, 도 7D는 샘플 C2TA-2-T7E1에 대한 전체 결과를 도시한다.
최종적으로, 혼합 림프구 분석(MLA)을 수행하였다. 도 8은 Allo 세포 단독, T 세포(2차 공여자; 상이한 공여자의 T 세포) 단독, 공동-배양된 Allo 세포, 및 공동-배양된 T 세포(2차 공여자)를 이용한 혼합 림프구 반응(MLR) 분석 결과를 예시하는 그래프이다. 특히, 수용자의 T 세포(상이한 공여자의 T 세포)를 동종이계 CART 세포와 14일 동안 공동-배양하고 T 세포의 증식을 분석하였다. 결과는 대조용 T 세포(2차 공여자), 동종이계 PSMA CART 세포 단독 또는 공동-배양의 생존력을 입증하며, "수용자의" T 세포는 동종이계 세포의 존재에 반응하지 않았다(증식 없음)는 것을 나타낸다. 그러므로, 도 8은 HLA 불일치의 존재에도 불구하고 공동-배양에서 2차(관련되지 않은) 공여자로부터의 T 세포가 동종이계 PSMA CART 세포에 반응하여 증식하지 않았음을 나타낸다. 동종이계 CART는 PSMA CART 및 CRISPR 편집된 TRAC/B2M/C2TA gRNA를 포함한다. 따라서, 본 발명의 동종이계 CART 세포는 수용자의 면역계(즉, T 세포)에 의해 검출되지 않으면서 종양 세포를 사멸시킬 수 있는 기회의 창을 가질 것이다.
III. 동종이계 T 세포
A. 내인성 면역 단백질의 하향조절
본 개시내용의 한 양태는 (1) 내인성 면역 단백질을 암호화하는 하나 이상의 유전자좌에서의 삽입 및/또는 결실; (2) 키메라 항원 수용체(CAR), 조작된 T 세포 수용체(TCR), 킬러 세포 면역글로불린 유사 수용체(KIR), 항원 결합 폴리펩티드, 세포 표면 수용체 리간드, 또는 종양 항원을 암호화하는 외인성 핵산을 포함하는 변형된 면역 세포를 제공한다. 따라서, 본 발명의 변형된 세포는 본원에 기재된 임의의 내인성 유전자의 발현을 붕괴하도록 유전적으로 편집된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조작된 TCR 또는 CAR 발현 시스템을 포함하는 변형된 세포는 본원에 기재된 내인성 유전자 중 하나 이상의 발현을 붕괴하도록 유전적으로 편집된다. 일부 구현예에서, CD3δ, CD3ε, CD3γ, B2M, CIITA, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP 및 불변 쇄(Ii 쇄) 중 하나 이상이 붕괴되는 경우, 동종이계 T 세포(즉, 보편적 면역 세포)가 생성된다. 본원에 사용된 용어 "보편적 면역 세포" 또는 "보편적 T 세포"는 임의의 환자에게 투여하기 위해 사전 변형/사전 제작된 동종이계 면역 세포 또는 T 세포를 지칭한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 변형된 면역 세포는 동종이계 T 세포 반응이 감소되거나 억제된 동종이계 T 세포 생성물이다. 일부 구현예에서, 내인성 면역 단백질의 하나 이상의 유전자좌의 하향조절은 GvHD 및/또는 HvHD를 감소 및/또는 제거한다.
일부 구현예에서, 변형된 면역 세포가 대상체에게 투여될 때, 동일한 대상체에게 투여된 변형되지 않은 면역 세포에 의해 발휘되는 면역 반응과 비교하여, 면역 세포는 대상체에서 감소된 면역 반응을 발휘한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 면역 세포는 변형된 면역 세포가 대상체에게 투여될 때 TRAC, TRBC, B2M 및 CIITA의 유전자 발현을 하향 조절할 수 있는 삽입 및/또는 결실을 포함하는 면역 세포에 의해 발휘되는 면역 반응과 비교하여, 대상체에서 감소된 면역 반응을 발휘한다. 일부 구현예에서, 면역 반응은 이식편대숙주병(GvHD) 또는 숙주대이식편병(HvHD; 이식 거부) 반응이다. 일부 구현예에서, 감소된 GvHD 반응은 HLA-I 불일치 세포 또는 HLA-II 불일치 세포에 대해 유발된다. 일부 구현예에서, GvHD 반응은 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상 감소한다. 그 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상 감소된다. 일부 구현예에서, GvHD 반응은 약 1배 이상, 약 2배 이상, 약 3배 이상, 약 4배 이상, 약 5배 이상, 약 6배 이상, 약 7배 이상, 약 8배 이상, 약 9배 이상, 약 10배 이상, 약 20배 이상, 약 30배 이상, 약 50배 이상 , 약 100배 이상, 약 150배 이상, 또는 약 200배 이상 감소된다. 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포에 의해 감소된 GvHD 반응은 하나 이상의 유전자좌 내에 결실 및/또는 삽입이 없는 동등한 면역 세포, 또는 TRAC, TCRβ, B2M 및 CIITA에 결실 및/또는 삽입을 포함하는 면역 세포에 비교된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 유전자좌에서의 삽입 및/또는 결실은 하나 이상의 내인성 면역 단백질 유전자좌의 유전자 발현을 하향조절할 수 있다. 일부 실시예에서, 내인성 면역 단백질은 TCR 복합체의 성분 중 하나이다. 일부 구현예에서, 내인성 면역 단백질은, 이종이량체로서 구성되고 리간드 결합에 의해 생성된 신호를 TCRαβ 이종이량체로 전달하는 3개의 이량체 모듈 CD3δ/CD3ε, CD3γ/CD3ε 및 CD3ζ/CD3ζ를 형성하는 CD3ε CD3γ, CD3δ 및 CD3ζ 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 리간드는 TCRαβ 이종이량체에 의해 인식되는 주조직적합성 복합체 부류 I 및 부류 II(MHC-I; MHC-II) 분자에 항원-결합된다.
일부 구현예에서, 내인성 면역 단백질은 MHC 부류 I(MHC-I) 및/또는 MHC 부류 II(MHC-II) 분자이다. 일부 구현예에서, 내인성 면역 단백질은 B2M(베타-2-마이크로글로불린), CIITA(부류 II 트랜스활성화인자), TAP1(항원 가공 1과 연관된 ABC 수송체; 수송체1, ATP 결합 카세트 하위패밀리 B 구성원), TAP2(항원 가공 2와 연관된 ABC 수송체; 수송체2, ATP 결합 카세트 하위패밀리 B 구성원), TAPBP(TAP 결합 단백질; 타파신; TAP 연관 단백질), NLRC5(NLR 패밀리 CARD 도메인 함유 5), HLA-DM, RFX5(조절 인자 X5), RFXANK(조절 인자 X 연관 안키린 함유 단백질), RFXAP(조절 인자 X 연관 단백질) 및 불변 쇄(Ii 쇄)이다.
TCR과 마찬가지로, MHC-I과 MHC-II는 T 림프구에 항원을 제시함으로써 적응 면역 반응의 활성화에 필수적인 역할을 하다. 인간은 3개의 주 MHC-I 유전자좌(HLA-A, HLA-B, HLA-C)를 가지며, 이는 바이러스, 암세포, 및 이식된 세포를 탐지하고 제거하는 데 필수적이다. 또한 면역 조절 기능을 갖는 3개의 비-고전적 MHC-I 분자(HLA-E, HLA-F 및 HLA-G)가 존재한다. 인간 MHC-II 분자는 또한 3개의 유전자좌(HLA-DP, HLA-DQ 및 HLA-DR)를 포함한다. MHC 부류 I 및 II 각각은 또한 여러 조절 단백질을 포함한다. MHC-I 조절 단백질에는 베타-2-마이크로글로불린(B2M), TAP1, TAP2, TAPBP와 같은 항원 가공 분자, 및 NLRC5와 같은 전사 조절인자가 포함된다. Tap1, Tap2 및 TAPBP는 부류 I HLA 복합체에 펩티드 항원을 로딩하는 데 필수적인 TAP 수송체 복합체의 일부이다. B2M, NLRC5, Tap1, Tap2 및 TAPBP 중 어느 하나의 발현의 하향조절은 감소된 MHC 부류 I 단백질 세포 표면 발현 및 손상된 면역 반응을 초래한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용에 의해 고려되는 내인성 면역 단백질은 B2M, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5 및 이들의 조합으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 MHC-I 유전자이다 .
MHC-II 조절 단백질에는 전사 조절인자 CIITA, RFX5, RFXANK, RFXAP; 및 MHC 부류 II 펩티드, 불변 쇄(Ii 쇄) 및 인간 백혈구 항원 DM(HLA-DM; HLA-DMA), HLA-DOA 및 HLA-DOB의 형성 및 수송에 관여하는 샤페론 단백질이 포함된다. RFX5, RFXANK, RFXAP는 모든 MHC 부류 II 유전자 프로모터에 특이적으로 결합하여 전사를 조절하는 삼량체 RFX DNA 결합 복합체의 서브유닛이다. 불변 쇄(Ii)는 ER에서 펩티드 로딩을 방지하고 ER로부터의 출구를 자극하며 항원 펩티드 로딩을 조절하는 MHC 부류 II 샤페론으로서 기능한다. TAPBP와 유사하게, HLA-DM(예를 들어, HLA-DMA)은 세포내 수송 동안 MHC-II 분자의 펩티드 로딩을 돕는다. HLA-DM은 항원의 '면역우세' 영역에 대한 T 세포 반응을 안내하여 MHC-II 단백질에 대한 약한 결합 펩티드의 디스플레이를 제거/방지한다. 일부 구현예에서, HLA-DM(예를 들어, HLA-DMA)은 자기-단백질의 가공에서 잠재적으로 자가반응성 T 세포의 제거를 촉진한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용에 의해 고려되는 내인성 면역 단백질은 CIITA, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP, 불변 쇄(Ii 쇄) 및 이들의 조합으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 MHC-II 유전자이다.
따라서, HvHD 또는 GvHD를 감소시키기 위한 HLA 장벽의 효율적인 제거는 하기 중 하나 이상을 하향조절함으로써 달성될 수 있다: (1) 다형성 MHC-I 유전자(HLA-A, -B, -C) 및/또는 MHC-II 유전자(HLA-DP, -DQ, -DR)의 표적화; (2) 모든 MHC-1 분자의 세포 표면으로의 수송을 조절하는 분자, 예를 들어 B2M, 또는 MHC-I 항원-가공 분자, 예를 들어 TAP1, TAP2 또는 TAPBP의 표적화; (3) MHC-II 분자 수송을 조절하는 분자, 예를 들어 불변 쇄(Ii; 또는 CD74)) 또는 HLA-DM의 표적화; 및/또는 (4) MHC-I(NLRC5) 또는 MHC-II 발현의 전사 조절인자(CIITA, RFX-5, RFXANK, RFX-AP)의 표적화.
일부 구현예에서, 유전자 발현이 삽입 및/또는 결실에 의해 하향조절되는 내인성 면역 단백질은 CD3δ, CD3ε, CD3γ, B2M, CIITA, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP, 불변 쇄(Ii 쇄 ; CD74), 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, CD3δ, CD3ε, CD3γ, B2M, CIITA, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP, 불변 쇄(Ii 쇄; CD74) 및 이들의 조합으로부터 선택된 내인성 면역 단백질의 유전자 발현이 하향조절된 변형된 면역 세포(즉, T 세포)는 동종이계 환경에서 감소된 면역원성을 갖는다. 일부 구현예에서, CD3δ, CD3ε, CD3γ, B2M, CIITA, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP, 불변 쇄(Ii 쇄; CD74), 또는 이들의 임의의 조합의 유전자 발현의 하향조절은, HvHD 및/또는 GvHD를 유발할 수 있는 T 세포 상의 동종항원(alloantigen)의 표면 제시를 제거하고/하거나 T 세포 수용체의 막 발현을 방지한다.
일부 구현예에서, 동종이계 T 세포 생성물을 생성하는 데 사용되는 변형된 면역 세포는 하나의 T 세포 수용체 서브유닛, 하나의 HLA 부류 I 분자; 및 하나의 HLA 부류 II 분자의 하향조절을 포함하는 삼중 녹아웃을 포함한다. 일부 구현예에서, T 세포 수용체 서브유닛은 CD3δ, CD3ε 또는 CD3γ로부터 선택되고; HLA 부류 I 분자는 B2M, TAP1, TAP2, TAPBP 또는 NLRC5로부터 선택되며; HLA 부류 II 분자는 HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP 또는 불변 쇄(Ii 쇄)로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 동종이계 T 세포 생성물은 3개 초과의 내인성 면역 단백질 녹아웃을 포함한다. 이러한 구현예에서, T 세포 수용체 서브유닛은 CD3δ, CD3ε 및/또는 CD3γ로부터 선택되고; HLA 부류 I 분자는 B2M, TAP1, TAP2, TAPBP 및/또는 NLRC5로부터 선택되며; HLA 부류 II 분자는 HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP 및/또는 불변 쇄(Ii 쇄)로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 동종이계 T 세포 생성물을 생성하기 위해 변형된 면역 세포는 적어도 2개의 T 세포 수용체 서브유닛, 적어도 2개의 HLA 부류 I 분자; 및 적어도 2개의 HLA 부류 II 분자의 하향조절을 포함하는 하나 이상의 내인성 면역 단백질 녹아웃을 포함한다. 일부 구현예에서, T 세포 수용체 서브유닛은 CD3δ, CD3ε 및 CD3γ 중 적어도 2개로부터 선택되고; HLA 부류 I 분자는 B2M, TAP1, TAP2, TAPBP 및 NLRC5 중 적어도 2개로부터 선택되며; HLA 부류 II 분자는 적어도 2개의 HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP 및 불변 쇄(Ii 쇄)로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 변형된 면역 세포는 CD3δ 유전자 발현 및 B2M, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP, 불변 쇄(Ii 쇄) 및 이들의 조합으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 HLA 분자의 유전자 발현을 하향조절하는 삽입 및/또는 검출을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포는 CD3ε 유전자 발현 및 B2M, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP, 불변 쇄(Ii 쇄) 및 이들의 조합으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 HLA 분자의 유전자 발현을 하향조절하는 삽입 및/또는 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포는 CD3γ 유전자 발현 및 B2M, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP, 불변 쇄(Ii 쇄) 및 이들의 조합으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 HLA 분자의 유전자 발현을 하향조절하는 삽입 및/또는 결실을 포함한다.
일부 구현예에서, CD3δ, CD3ε 및/또는 CD3γ의 유전자 발현이 하향조절되는 경우, T 세포 수용체 알파 및 베타의 표면 발현은 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100%까지 하향조절된다. 일부 구현예에서, CD3ε의 하향조절은 CD3γ 및/또는 CD3δ의 하향조절과 비교할 때 더 높은 T 세포 수용체 녹아웃 효율을 생성시킨다. 일부 구현예에서, CD3ε의 하향조절에 의해 유도된 T 세포 수용체 녹아웃 효율은 TRAC의 하향조절 이상이다.
일부 구현예에서, 동종이계 T 세포 생성물을 생성시키는 데 사용되는 변형된 면역 세포는 삼중 녹아웃을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 면역은 (1) CD3ε, B2M 및 CIITA; (2) CD3ε, B2M 및 RFX5; (3) CD3ε, B2M 및 RFXAP; (4) CD3ε, B2M 및 RFXANK; (5) CD3ε, B2M 및 HLA-DM; (6) CD3ε, B2M 및 Ii 쇄; (7) CD3ε, TAP1 및 CIITA; (8) CD3ε, TAP1 및 RFX5; (9) CD3ε, TAP1 및 RFXAP; (10) CD3ε, TAP1 및 RFXANK; (11) CD3ε, TAP1 및 HLA-DM; (12) CD3ε, TAP1 및 Ii 쇄; (13) CD3ε, TAP2 및 CIITA; (14) CD3ε, TAP2 및 RFX5; (15) CD3ε, TAP2 및 RFXAP; (16) CD3ε, TAP2 및 RFXANK; (17) CD3ε, TAP2 및 HLA-DM; (18) CD3ε, TAP2 및 Ii 쇄; (19) CD3ε, NLRC5 및 CIITA; (20) CD3ε, NLRC5 및 RFX5; (21) CD3ε, NLRC5 및 RFXAP; (22) CD3ε, NLRC5 및 RFXANK; (23) CD3ε, NLRC5 및 HLA-DM; (24) CD3ε, NLRC5 및 Ii 쇄; (25) CD3ε, TAPBP 및 CIITA ; (26) CD3ε, TAPBP 및 RFX5; (27) CD3ε, TAPBP 및 RFXAP; (28) CD3ε, TAPBP 및 RFXANK; (29) CD3ε, TAPBP 및 HLA-DM; 또는 (30) CD3ε, TAPBP 및 Ii 쇄의 감소되거나 제거된 유전자 발현을 포함한다.
일부 구현예에서, 변형된 면역은 (1) CD3δ, B2M 및 CIITA; (2) CD3δ, B2M 및 RFX5; (3) CD3δ, B2M 및 RFXAP; (4) CD3δ, B2M 및 RFXANK; (5) CD3δ, B2M 및 HLA-DM; (6) CD3δ, B2M 및 Ii 쇄; (7) CD3δ, TAP1 및 CIITA; (8) CD3δ, TAP1 및 RFX5; (9) CD3δ, TAP1 및 RFXAP; (10) CD3δ, TAP1 및 RFXANK; (11) CD3δ, TAP1 및 HLA-DM; (12) CD3δ, TAP1 및 Ii 쇄; (13) CD3δ, TAP2 및 CIITA; (14) CD3δ, TAP2 및 RFX5; (15) CD3δ, TAP2 및 RFXAP; (16) CD3δ, TAP2 및 RFXANK; (17) CD3δ, TAP2 및 HLA-DM; (18) CD3δ, TAP2 및 Ii 쇄; (19) CD3δ, NLRC5 및 CIITA; (20) CD3δ, NLRC5 및 RFX5; (21) CD3δ, NLRC5 및 RFXAP; (22) CD3δ, NLRC5 및 RFXANK; (23) CD3δ, NLRC5 및 HLA-DM; (24) CD3δ, NLRC5 및 Ii 쇄; (25) CD3δ, TAPBP 및 CIITA; (26) CD3δ, TAPBP 및 RFX5; (27) CD3δ, TAPBP 및 RFXAP; (28) CD3δ, TAPBP 및 RFXANK; (29) CD3δ, TAPBP 및 HLA-DM; 또는 (30) CD3δ, TAPBP 및 Ii 쇄의 감소되거나 제거된 유전자 발현을 포함한다.
일부 구현예에서, 변형된 면역은 (1) CD3γ, B2M 및 CIITA; (2) CD3γ, B2M 및 RFX5; (3) CD3γ, B2M 및 RFXAP; (4) CD3γ, B2M 및 RFXANK; (5) CD3γ, B2M 및 HLA-DM; (6) CD3γ, B2M 및 Ii 쇄; (7) CD3γ, TAP1 및 CIITA; (8) CD3γ, TAP1 및 RFX5; (9) CD3γ, TAP1 및 RFXAP; (10) CD3γ, TAP1 및 RFXANK; (11) CD3γ, TAP1 및 HLA-DM; (12) CD3γ, TAP1 및 Ii 쇄; (13) CD3γ, TAP2 및 CIITA; (14) CD3γ, TAP2 및 RFX5; (15) CD3γ, TAP2 및 RFXAP; (16) CD3γ, TAP2 및 RFXANK; (17) CD3γ, TAP2 및 HLA-DM; (18) CD3γ, TAP2 및 Ii 쇄; (19) CD3γ, NLRC5 및 CIITA; (20) CD3γ, NLRC5 및 RFX5; (21) CD3γ, NLRC5 및 RFXAP; (22) CD3γ, NLRC5 및 RFXANK; (23) CD3γ, NLRC5 및 HLA-DM; (24) CD3γ, NLRC5 및 Ii 쇄; (25) CD3γ, TAPBP 및 CIITA; (26) CD3γ, TAPBP 및 RFX5; (27) CD3γ, TAPBP 및 RFXAP; (28) CD3γ, TAPBP 및 RFXANK; (29) CD3γ, TAPBP 및 HLA-DM; 또는 (30) CD3γ, TAPBP 및 Ii 쇄의 감소되거나 제거된 유전자 발현을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 변형된 면역 세포는 T 세포, 자연 살해 세포(NK 세포), 자연 살해 T 세포(NKT), 림프 전구 세포, 조혈 줄기 세포, 줄기 세포, 대식세포 또는 수지상 세포이다. 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포는 변형된 비자극 면역 세포 또는 이의 전구 세포이다. 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포는 변형된 비자극 T 세포, 변형된 비자극 NK 세포, 또는 변형된 비자극 NKT 세포이다. 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포는 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포이다. 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포는 동종이계 T 세포 또는 자기유래 인간 T 세포이다. 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포는 인간 세포 또는 포유동물 세포이다.
B. 변형된 면역 세포
본 개시내용의 한 양태는 CD3δ, CD3ε, CD3γ, B2M, C2TA, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP 및 불변 쇄(Ii 쇄)로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 기능적으로 손상된 폴리펩티드를 포함하는 단리된 변형된 T 세포를 제공한다. 본원에 사용된 용어 "기능적으로 손상된 폴리펩티드"는 폴리펩티드가 돌연변이되어(예를 들어 결실, 삽입을 포함하거나 절두된 변이체임), TCR 복합체의 다른 성분에 쉽게 결합할 수 없거나 TRC 복합체에 통합되지 않음을 의미한다. 일부 구현예에서, 기능적으로 손상된 폴리펩티드는 기능적으로 손상된 TCR을 생성시키거나 세포 표면에서 기능적 TCR의 발현을 억제한다. 일부 구현예에서, 손상된 폴리펩티드는 TCR 복합체의 활성을 실질적으로 억제하는 우성 음성 폴리펩티드일 수 있다. 언급된 기능적으로 손상된 폴리펩티드를 포함하는 변형된 T 세포는 기능적 TCR을 생성하지 않거나 세포 표면에서 기능적 TCR을 거의 발현하지 않는 TCR-결핍 T 세포이다. 일부 구현예에서, 손상된 폴리펩티드는 TCR 신호전달 복합체의 성분이다. 일부 구현예에서, 손상된 폴리펩티드는 기능성 TCR의 형성을 조절한다. 일부 구현예에서, 손상된 폴리펩티드는 기능성 단백질의 기능 또는 발현에 영향을 미치는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 돌연변이는 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합이다. 일부 구현예에서, 손상된 폴리펩티드는 결함이 있는 유전자 산물의 발현, 또는 원하는 유전자 또는 유전자 산물의 발현 부재로 인해 발생한다.
TCR의 적절한 기능화는 TCR 복합체를 구성하는 단백질의 적절한 화학양론적 비를 필요로 한다. 도 1에 도시된 바와 같이, TCR 복합체는 가변 TCR-알파 쇄(TCR-α, TRAC) 및 TCR-베타 쇄(TCR-β, TRBC)를 포함하며, 이들은 3개의 이량체 모듈 CD3δ/CD3ε, CD3γ/CD3ε 및 CD3ζ/CD3ζ에 커플링된다. 상기 3개의 이량체 모듈은 TCR 신호전달의 필수적인 부분이다. 각 CD3 수용체는 TCR-α/β 이종이량체와 MHC-펩티드 리간드와의 결합 시 TCR 수용체 활성화를 전파하고 증폭시키는 신호전달 모티프를 포함한다. TCRαβ에의 리간드 결합 시, CD3 서브유닛은 형태 변화를 겪으며, CD3 세포질 꼬리 내의 신호전달 모티프(예를 들어, ITAM)는 세포내 단백질 티로신 키나제에 의해 인산화되게 된다. 후속적으로, 세포내 신호전달 및 어댑터 분자를 함유하는 SH2 도메인은 원형질막으로 모집되고, 여기서 이들은 CD3 신호전달 모티프와 직접 상호작용하여 TCR 활성화 신호를 증폭시킨다. 따라서 TCRαβ 이종이량체가 항원 결합을 담당하는 반면, CD3 서브유닛은 신호전달 요소로서 작용한다. 따라서 필수적인 CD3 수용체 중 하나가 없거나 손상되면 TCR 복합체가 기능적으로 불안정해지거나 적어도 TCR의 신호전달 기능이 약화된다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, TCR 복합체 및/또는 기능의 표면 발현을 위해서는 6개 단백질 모두의 좌표 발현이 필요하다.
TCR 복합체의 각 성분은 세포 표면의 TCR 복합체 조립에 필요하다. TCR 복합체의 한 성분이 손실되면 세포 표면에서 TCR 발현이 손실될 수 있다. 일부 구현예에서, 한 성분의 손실은 TCR 복합체의 표면 발현을 없앨 수 없을 수도 있다. 이러한 구현예에서, 일부 또는 심지어 모든 TCR 발현이 남아있을 수 있지만, TCR 수용체가 면역 반응을 유도하는지 여부를 결정하는 것은 TCR 수용체 기능이다. 본 발명은 세포 표면에서 완전한 TCR 복합체의 부재보다는 기능적 결핍을 고려한다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, TCR 발현이 낮을수록 TCR 복합체를 통한 T 세포 활성화를 유도하기에 충분한 TCR 교차-결합이 발생할 가능성이 낮아진다.
일부 구현예에서, 단리된 변형된 T 세포는 2개 이상의 기능적으로 손상된 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 구현예에서, 하나의 손상된 폴리펩티드는 T 세포 수용체 α 쇄(TRAC)일 수 있다. TCR 복합체는 세포 내부에 유지되며 TRAC가 없으면 원형질막으로 이동하지 않는다. 더욱이, TRAC가 결여된 TCR 수용체는 불안정하고 빠르게 분해될 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 T 세포는 TRAC, TRBC, CD3δ, CD3ε, CD3γ, B2M, C2TA, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP, 또는 불변 (Ii) 쇄로부터 선택된 3개 이상의 기능적으로 손상된 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 T 세포는 CD3α, CD3δ, CD3ε, CD3γ, B2M, C2TA, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP 또는 Ii 쇄로부터 선택된 2개의 기능적으로 손상된 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 T 세포는 CD3α, CD3δ, CD3ε, CD3γ, B2M, C2TA, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP 또는 Ii 쇄로부터 선택된 3개의 기능적으로 손상된 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 T 세포는 CD3δ, CD3ε 및 CD3γ로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 기능적으로 손상된 폴리펩티드, 및 TRAC, TRBC, B2M, C2TA, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP 또는 Ii 쇄로부터 선택된 적어도 하나의 기능적으로 손상된 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 T 세포는 CD3δ, CD3ε 및 CD3γ로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 기능적으로 손상된 폴리펩티드, 및 TRAC, TRBC, B2M, C2TA, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP 또는 Ii 쇄로부터 선택된 적어도 하나의 기능적으로 손상된 폴리펩티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 변형된 T 세포는 (a) 기능적으로 손상된 CD3δ, CD3ε 및/또는 CD3γ 중 적어도 하나 및 (b) TRAC, TRBC, B2M, C2TA, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP 또는 Ii 쇄로부터 선택된 적어도 하나의 기능적으로 손상된 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 T 세포는 TRAC, TRBC, B2M, C2TA, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP 또는 Ii 쇄로부터 선택된 2개 이상의 기능적으로 손상된 폴리펩티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 기능적으로 손상된 폴리펩티드는 단백질 발현을 감소시킨다. 이러한 구현예에서, 변형된 T 세포는 TRAC, TRBC, CD3δ, CD3ε, CD3γ, B2M, C2TA, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP, Ii 쇄, 또는 이들의 임의의 조합의 감소된 발현을 갖는다. 일부 구현예에서, 기능적으로 손상된 폴리펩티드는 암호화된 유전자 발현이 없다. 이러한 구현예에서, 변형된 T 세포는 CD3δ, CD3ε, CD3γ, TRAC, TRBC, B2M, C2TA, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP, Ii 쇄 또는 이들의 임의의 조합을 발현하지 않는다.
일부 구현예에서, CD3δ, CD3ε, CD3γ, TRAC, TRBC, B2M, C2TA, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP, Ii 쇄로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 폴리펩티드의 감소된 발현을 갖고 갖거나 발현이 결여된 변형된 T 세포는 TRAC, TRBC, B2M 및 C2TA로부터 선택된 기능적으로 손상된 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 이러한 구현예에서, 변형된 T 세포는 TRAC, TRBC, B2M 또는 C2TA의 감소된 발현을 갖고/갖거나 TRAC, TRBC, B2M 또는 C2TA를 발현하지 않는다.
일부 구현예에서, CD3δ, CD3ε 및/또는 CD3γ의 변형은 손상된 TCR/CD3 수용체 복합체 기능으로 이어진다. 일부 구현예에서, 본 발명에 의해 고려되는 기능적으로 손상된 폴리펩티드는 유전자 편집 기술을 사용하여 생성된다. 일부 구현예에서, 유전자 편집은 CRISPR-관련(Cas)(CRISPR-Cas) 엔도뉴클레아제 시스템, TALEN 유전자 편집 시스템, 아연 집게 뉴클레아제(ZFN) 유전자 편집 시스템, 메가뉴클레아제 유전자 편집 시스템 또는 메가-TALEN 유전자 편집 시스템, 안티센스 RNA, 안티고머 RNA, RNAi, siRNA 및 shRNA로 이루어지는 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, CD3δ, CD3ε 또는 CD3γ는 CD3δ, CD3ε 또는 CD3γ의 하나 이상의 엑손, 선택적으로 CD3δ, CD3ε 또는 CD3γ의 엑손 1을 표적화함으로써 변형된다.
T 세포가 기능적 TCR을 발현하는지 여부는 당업계에 공지되어 있거나 본원에 기재된 공지된 분석 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR αβ 및 CD3의 발현은 유세포 분석 및 정량적 실시간 PCR(QRT-PCR)에 의해 평가될 수 있다. TCR-α, TCR-β, CD3ε, CD3δ, CD3γ 및 CD3-ζ mRNA의 발현은 문헌[Sentman et al., J. Immunol. 173:6760-6766 (2004)]에 사용된 방법과 유사한 방법을 사용하여 ABI7300 실시간 PCR 장비 및 유전자 특이적 TAQMAN® 프라이머를 사용한 QRT-PCR에 의해 분석될 수 있다. 세포 표면 발현의 변화는 TCR-α, TCR-β, CD3ε, CD8, CD4, CD5 및 CD45에 특이적인 항체를 사용하여 결정될 수 있다. 유세포 분석을 사용하여 TCR/CD3 발현을 시험하기 위해 TCR 복합체의 특정 서브유닛에 대한 형광 색소로 표지된 항체가 사용된다. 일부 구현예에서, 살아있는 세포를 예를 들어 CD3ε, CD3δ, CD3γ, TCRα, TCRβ, TCRγ 또는 TCRδ에 대한 항체와 조합하여 CD5, CD8 및 CD4에 대한 항체로 염색한다. CD3 또는 TCR 유전자의 발현이 사용되는 경우, 변형되지 않은 T 세포 또는 대조용 벡터를 발현하는 T 세포와 비교할 때 변형된 T 세포에서 TCR 단백질 및 CD3 단백질 둘 다의 발현이 심하게 감소해야 한다. 아이소타입 대조용 항체를 배경 형광 대조용으로 사용한다.
변형된 T 세포에서 기능적으로 손상된 폴리펩티드의 발현이 TCR 기능 및/또는 변형된 T 세포 기능을 변경하기에 충분한지 여부를 결정하기 위해, 변형된 T 세포를 하기에 대해 시험한다: (1) 시험관내 세포 생존; (2) 미토마이신 C-처리된 동종이계 PBMC 존재 하에서의 증식; 및/또는 (3) 동종이계 PBMC, 항-CD3 mAb, 또는 항-TCR mAb에 대한 반응으로 사이토카인 생성.
TCR 복합체의 기능적 결함을 시험하기 위해, T 세포 확장을 유도하는 주요 효과기 사이토카인의 생성 부족을 결정할 수 있다. 예를 들어, 변형된 T 세포에 대한 항-CD3 자극의 효과를 사용하여 인터류킨-2(IL-2) 및/또는 인터페론(IFN)-감마 생성을 결정할 수 있다.
일부 구현예에서, 기능적으로 손상된 폴리펩티드를 포함하는 변형된 T 세포는 변형되지 않은 T 세포에 비해 감소된 T 세포 수용체 발현을 나타낸다. 일부 구현예에서, 기능적으로 손상된 폴리펩티드를 포함하는 변형된 T 세포는 손상된 폴리펩티드의 감소된 발현을 나타낸다. 일부 구현예에서, 기능적으로 손상된 폴리펩티드를 포함하는 변형된 T 세포는 T 세포 수용체 복합체 표면 발현의 완전한 부재를 나타낸다. 일부 구현예에서, 기능적으로 손상된 폴리펩티드를 포함하는 변형된 T 세포는 감소된 또는 불충분한 T 세포 수용체 교차-결합을 나타낸다. 일부 구현예에서, 변형된 T 세포는 TCR 서브유닛의 일부 또는 전부를 발현하며 세포 표면에 있을 수 있다. 표면에 기능성 TCR이 없으면 변형된 T 세포는 완전히 활성화되지 못한다. 따라서, 본 발명에 의해 고려되는 변형된 T 세포는 숙주에 도입될 때 바람직하지 않은 반응을 일으킬 수 없다. 결과적으로, 변형된 T 세포는 숙주 MHC 분자로부터 신호를 전달할 수 없기 때문에 변형된 T 세포는 GvHD 또는 HvHD를 유발하지 못한다.
일부 구현예에서, 변형된 T 세포는 동일한 대상체에게 투여된 변형되지 않은 T 세포에 의해 발휘되는 면역 반응과 비교하여, 변형된 T 세포가 대상체에게 투여될 때 대상체에서 감소된 면역 반응을 발휘한다. 본 발명의 변형된 T 세포는 T 세포 요법의 모든 적용에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 T 세포는 T 세포 요법이 바람직한 임의의 방법 또는 조성물에 사용된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 변형된 T 세포는 암, GVHD, 이식 거부, 감염, 하나 이상의 자가면역 장애, 방사선병 또는 기타 질환 또는 상태를 감소 또는 개선하거나 예방 또는 치료하는 데 사용될 수 있다.
IV. 유전자 편집 시스템
A. CRISPR
일부 구현예에서, 본 개시내용의 변형된 면역 세포는 유전자 편집된 변형된 면역 세포이다. 일부 구현예에서, 각각 본 개시내용의 내인성 면역 단백질을 암호화하는 하나 이상의 유전자좌에서의 삽입 및/또는 결실은 유전자 편집의 결과이다. 특정 구현예에서, CD3δ, CD3ε, CD3γ, TRAC, B2M, CIITA, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP, 또는 Ii 쇄를 암호화하는 유전자는 유전자 편집 시스템에 의해 변형된다. 일부 경우에, 유전자 편집 시스템은 클러스터링된 규칙적으로 산재된 짧은 회문식 핵산(CRISPR)-Cas 시스템과 같은 RNA-안내 뉴클레아제를 포함한다. CRISPR 시스템(본원에서는 또한 CRISPR-Cas 시스템, Cas 시스템 또는 CRISPR/Cas 시스템이라고도 함)은 Cas 엔도뉴클레아제 및 표적 유전자에 특이적인 안내 핵산 서열을 포함하며, 이는 세포 내로 도입된 후 복합체를 형성하여, Cas 엔도뉴클레아제가 표적 유전자에 파손(예를 들어, 이중 가닥 파손)을 도입할 수 있게 한다. 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포는 CRISPR/Cas9를 사용하여 편집되어 하나 이상의 내인성 면역 단백질을 붕괴시킨다.
일부 구현예에서, CRISPR-Cas 시스템은 내인성 CD3δ, CD3ε, CD3γ, TRAC, B2M, CIITA, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP 또는 Ii 쇄 중 하나 이상을 붕괴시켜, CD3δ, CD3ε, CD3γ, TRAC, B2M, CIITA, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP 또는 Ii 쇄의 유전자 발현을 하향조절하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 내인성 면역 단백질의 유전자 발현을 하향조절할 수 있는 삽입 및/또는 결실은 CD3δ, CD3ε, CD3γ, TRAC, B2M, CIITA, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP 또는 Ii 쇄로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 내인성 단백질의 발현을 하향조절한다. 일부 구현예에서, 유전자 발현을 하향조절할 수 있는 각각의 삽입 및/또는 결실은 CRISPR 관련 시스템을 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR 관련 시스템은 CRISPR 관련 Cas 엔도뉴클레아제 및 안내 RNA이다.
일부 구현예에서 Cas 엔도뉴클레아제는 Cas9 엔도뉴클레아제를 포함한다. 일부의 경우에, Cas9 엔도뉴클레아제는 예를 들어 에스 피오게네스(예를 들어, SpCas9), 에스 써모필레스(S. thermophiles), 스타필로코커스 아우레우스(예를 들어, SaCas9) 또는 네이세리아 메닌지티데스(Neisseria meningitides)의 Cas9 분자로부터 유래되거나 이에 기초한다. 일부 경우에, Cas9 엔도뉴클레아제는 예를 들어 아시도보락스 아베나에(Acidovorax avenae), 악티노바실루스 플레우로뉴모니아에(Actinobacillus pleuropneumoniae), 악티노바실루스 숙시노제네스(Actinobacillus succinogenes), 악티노바실루스 수이스(Actinobacillus suis), 악티노마이세스 스페시즈(Actinomyces sp.), 사이클리필루스 데니트리피칸스(cycliphilus denitrificans), 아미노모나스 파우시보란스(Aminomonas paucivorans), 바실루스 세레우스(Bacillus cereus), 바실루스 스미시이(Bacillus smithii), 바실루스 투링기엔시스(Bacillus thuringiensis), 박테로이데스 스페시즈(Bacteroides sp.), 블라스토피렐룰라 마리나(Blastopirellula marina), 브라디리즈 오비움 스페시즈(Bradyrhiz obium sp.), 브레비바실러스 라템스포루스(Brevibacillus latemsporus), 캄필로박터 콜리(Campylobacter coli), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 캄필로박터 라드(Campylobacter lad), 칸디다투스 푸니세이스피릴룸(Candidatus Puniceispirillum), 클로스트리디우 셀룰로리티쿰(Clostridiu cellulolyticum), 클로스트리디움 페르프린젠스(Clostridium perfringens), 코리네박테리움 아콜렌스(Corynebacterium accolens), 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria), 코리네박테리움 마트루코티이(Corynebacterium matruchotii), 디노로세오박터 슬리이바에(Dinoroseobacter sliibae), 유박테리움 렉탈레(Eubacterium rectale), 유박테리움 돌리쿰(Eubacterium dolichum), 감마 프로테오박테리움(gamma proteobacterium), 글루코나세토바클레르 디아조트로피쿠스(Gluconacetobacler diazotrophicus), 하에모필루스 파라인플루엔자에(Haemophilus parainfluenzae), 하에모필루스 스푸토룸(Haemophilus sputorum), 헬리코박터 카나덴시스(Helicobacter canadensis), 헬리코박터 신나에디(Helicobacter cinaedi), 헬리코박터 무스텔라에(Helicobacter mustelae), 일리오바클레르 폴리트로푸스(Ilyobacler polytropus), 킹겔라 킹가에(Kingella kingae), 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus), 리스테리아 이바노비이(Listeria ivanovii), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 리스테리아세아에 박테리움(Listeriaceae bacterium), 메틸로시스티스 스페시즈(Methylocystis sp.), 메틸로시누스 트리코스포리움(Methylosinus trichosporium), 모빌룬쿠스 뮬리에리스(Mobiluncus mulieris), 네이세리아 바실리포르미스(Neisseria bacilliformis), 네이세리아 시네레아(Neisseria cinerea), 네이세리아 플라베센스(Neisseria flavescens), 네이세리아 락타미카(Neisseria lactamica), 네이세리아 스페시즈, 네이세리아 와즈월티이(Neisseria wadsworthii), 니트로소모나스 스페시즈(Nitrosomonas sp.), 파르비바쿨룸 라바멘티보란스(Parvibaculum lavamentivorans), 파스테우렐라 뮬토시다(Pasteurella multocida), 파스콜락토박테리움 숙시나투텐스(Phascolarctobacterium succinatutens), 랄스토니아 시지기이(Ralstonia syzygii), 로도슈도모나스 팔루스트리스(Rhodopseudomonas palustris), 로도불룸 스페시즈(Rhodovulum sp.), 시몬시엘라 무엘레리(Simonsiella muelleri), 스핑고모나스 스페시즈(Sphingomonas sp.), 스포로락토바실러스 비네아에(Sporolactobacillus vineae), 스타필로코커스 루그두넨시스(Staphylococcus lugdunensis), 스트렙토코커스 스페시즈(Streptococcus sp.), 수브돌리그라눌룸 스페시즈(Subdoligranulum sp.), 티슬렐라 모빌리스(Tislrella mobilis), 트레포네마 스페시즈(Treponema sp.), 또는 베르미네프로박터 에이세니아에(Verminephrobacter eiseniae)의 Cas9 분자로부터 유래하거나 이에 기초한다.
일부 구현예에서, Cas9 엔도뉴클레아제는 에스 피오게네스(예를 들어, 균주 SF370, MGAS 10270, MGAS 10750, MGAS2096, MGAS315, MGAS5005, MGAS6180, MGAS9429, NZ131 및 SSI-1), 에스 써모필루스(예를 들어, 균주 LMD-9), 에스 슈도포르시누스(S. pseudoporcinus)(예를 들어, 균주 SPIN 20026), 에스 뮤탄스(S. mutans)(예를 들어, 균주 UA 159, NN2025), 에스 마카카에(S. macacae)(예를 들어, 균주 NCTC1 1558), 에스 갈로리티쿠스(S. gallolylicus)(예를 들어, 균주 UCN34, ATCC BAA-2069), 에스 에퀴네스(S. equines)(예를 들어, 균주 ATCC 9812, MGCS 124), 에스 디스달락티아에(S. dysdalactiae)(예를 들어, 균주 GGS 124), 에스 보비스(S. bovis)(예를 들어, 균주 ATCC 700338), 에스 씨엠기노수스(S. cmginosus)(예를 들어, 균주 F0211), 에스 아갈락티아(S. agalactia)(예를 들어, 균주 NEM316, A909), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)(예를 들어, 균주 F6854), 리스테리아 인노쿠아(Listeria innocua)(L. innocua, 예를 들어, 균주 Clip 11262), 엔테로코커스 이탈리쿠스(Enterococcus italicus)(예를 들어, 균주 DSM 15952), 또는 엔테로코커스 파에시움(Enterococcus faecium)(예를 들어, 균주 1,23,408)의 Cas9 분자로부터 유래한다.
일부 예에서, 엔도뉴클레아제는 Cas3, Cas4, Cas8a, Cas8b, Cas9, Cas10, Cas10d, Cas12a, Cas12b, Cas12d, Cas12e, Cas12f, Cas12g, Cas12h, Cas12i, Cas13, Cas14, CasX, Cse1, Csy1, Csn2, Cpf1, C2c1, Csm2, Cmr5, Fok1, 에스 피오게네스 Cas9, 스타필로코커스 아우레우스 Cas9, MAD7 뉴클레아제(V형 CRISPR 뉴클레아제), 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
B. 안내 RNA
일부 구현예에서, 안내 핵산은 Cas-RNA 복합체를 표적 서열로 지시하는 안내 RNA(gRNA) 분자이다. 일부 예에서, 지시는 gRNA의 일부를 DNA에 하이브리드화함으로써(예를 들어, gRNA 표적화 도메인을 통해), 및 gRNA 분자의 일부를 RNA-안내 뉴클레아제 또는 다른 효과기 분자(예를 들어, 적어도 gRNA tracr을 통해)에 결합시킴으로써 달성된다. 일부 구현예에서, gRNA 분자는 본원에서 "단일 안내 RNA"("sgRNA")로 지칭되는 단일 연속 폴리뉴클레오티드 분자로 이루어진다. 다른 구현예에서, gRNA 분자는 본원에서 "이중 안내 RNA"("dgRNA")로서 지칭되는, 일반적으로 하이브리드화를 통해 그 자체로 회합할 수 있는, 다수의, 일반적으로 2개의 폴리뉴클레오티드 분자로 이루어진다.
일부 경우에, gRNA 분자는 crRNA 및 tracr을 포함하며, 이들은 임의로 단일 폴리뉴클레오티드 상에 또는 별도의 폴리뉴클레오티드 상에 있을 수 있다. 일부 경우에, crRNA는 표적화 도메인, 및 tracr과 상호작용하여 깃대 영역을 형성하는 영역을 포함한다. tracr은 뉴클레아제 또는 다른 효과기 분자에 결합하는 gRNA 분자의 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, tracr은 Cas 엔도뉴클레아제(예를 들어, Cas9) 에 특이적으로 결합하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, tracr은 깃대의 일부를 형성하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 도메인은 표적 DNA 내의 프로토스페이서(protospacer) 서열을 인식하는, 예를 들어 이에 상보적인 gRNA 분자의 부분이다.
프로토스페이서-인접 모티프(PAM)는 프로토스페이서의 3' 말단에 인접하게 위치하며 Cas 엔도뉴클레아제에 의해 인식되는 2-6 염기쌍의 DNA 서열이다. 일부 경우에, 각각의 Cas 엔도뉴클레아제가 특정 PAM 서열을 인식한다. 예시적인 PAM 서열에는 에스 피오게네스 Cas9 엔도뉴클레아제에 의해 인식되는 NGG 서열; 또는 에스 써모필루스 Cas9 엔도뉴클레아제에 의해 인식되는 NGGNG 또는 NNAGAAW 서열(여기서 N은 임의의 뉴클레오티드이다)이 포함된다. 당업자는 Cas 엔도뉴클레아제가 인식할 PAM 서열과 함께 사용되는 특정 Cas 엔도뉴클레아제를 기반으로 gRNA 분자를 설계하는 방법을 이해할 것이다.
일부 구현예에서, 안내 RNA는 CD3δ, CD3ε, CD3γ, B2M, CIITA, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP 및 불변 쇄(Ii 쇄)로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 내인성 면역 단백질 유전자좌의 표적 서열과 충분히 상보적인 안내 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 안내 RNA는 CD3δ, CD3ε, CD3γ, B2M, CIITA, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP 및 불변 쇄(Ii 쇄)로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 면역 단백질을 각각 암호화하는 하나 이상의 유전자좌 내의 서열과 상보적인 안내 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 안내 RNA는 CD3δ, CD3ε 또는 CD3γ의 하나 이상의 엑손 내의 서열과 상보적이다. 일부 구현예에서, 안내 RNA는 CD3δ, CD3ε 또는 CD3γ의 엑손 1 내의 서열과 상보적이다. 일부 구현예에서, CD3δ, CD3ε, CD3γ, B2M, CIITA, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP, 또는 불변 쇄(Ii 쇄)의 gRNA 핵산 서열은 표 4에 개시된 핵산 서열을 갖는다.
일부 구현예에서, 안내 RNA는 CD3δ 유전자좌 내의 서열과 상보적인 안내 서열을 포함하고, 안내 RNA는 서열번호 53에 제시된 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 안내 RNA는 CD3ε 유전자좌 내의 서열과 상보적인 안내 서열을 포함하고, 안내 RNA는 서열번호 52에 제시된 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 안내 RNA는 CD3γ 유전자좌 내의 서열과 상보적인 안내 서열을 포함하고 안내 RNA는 서열번호 54에 제시된 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 안내 RNA는 B2M 유전자좌 내의 서열과 상보적인 안내 서열을 포함하고 안내 RNA는 서열번호 55에 제시된 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 안내 RNA는 CIITA(C2TA) 유전자좌 내의 서열과 상보적인 안내 서열을 포함하고 안내 RNA는 서열번호 61에 제시된 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 안내 RNA는 TAP1 유전자좌 내의 서열과 상보적인 안내 서열을 포함하고 안내 RNA는 서열번호 56에 제시된 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 안내 RNA는 TAP2 유전자좌 내의 서열과 상보적인 안내 서열을 포함하고 안내 RNA는 서열번호 57에 제시된 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 안내 RNA는 TAPBP 유전자좌 내의 서열과 상보적인 안내 서열을 포함하고 안내 RNA는 서열번호 58, 서열번호 59, 또는 이들의 임의의 조합에 제시된 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 안내 RNA는 NLRC5 유전자좌 내의 서열과 상보적인 안내 서열을 포함하고 안내 RNA는 서열번호 60에 제시된 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 안내 RNA는 HLA-DM 유전자좌 내의 서열과 상보적인 안내 서열을 포함하고 안내 RNA는 서열번호 62에 제시된 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 안내 RNA는 RFX5 유전자좌 내의 서열과 상보적인 안내 서열을 포함하고 안내 RNA는 서열번호 63, 서열번호 64, 또는 이들의 조합에 제시된 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 안내 RNA는 RFXANK 유전자좌 내의 서열과 상보적인 안내 서열을 포함하고 안내 RNA는 서열번호 65에 제시된 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 안내 RNA는 RFXAP 유전자좌 내의 서열과 상보적인 안내 서열을 포함하고 안내 RNA는 서열번호 66에 제시된 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 안내 RNA는 li Ii 쇄 유전자좌 내의 서열과 상보적인 안내 서열을 포함하고 안내 RNA는 서열번호 67, 서열번호 68, 또는 이들의 임의의 조합에 제시된 핵산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 또는 4개 이상의 안내 핵산(예를 들어, 안내 RNA 분자)은 Cas 엔도뉴클레아제를 사용하여 면역 세포에 형질감염된다. 일부 경우에, 약 1개, 2개 또는 3개의 안내 핵산(예를 들어, 안내 RNA 분자)이 Cas 엔도뉴클레아제를 사용하여 면역 세포에 형질감염된다. 일부 경우에, 약 3개의 안내 핵산(예를 들어, 안내 RNA 분자)이 Cas 엔도뉴클레아제를 사용하여 면역 세포에 형질감염된다. 일부 경우에 약 2개의 안내 핵산(예를 들어, 안내 RNA 분자)이 Cas 엔도뉴클레아제를 사용하여 면역 세포에 형질감염된다. 일부 경우에, 약 1개의 안내 핵산(예를 들어, 안내 RNA 분자)이 Cas 엔도뉴클레아제를 사용하여 면역 세포에 형질감염된다.
일부 구현예에서, 벡터는 CRISPR 시스템의 발현을 구동한다. 당해 분야에는 본 발명에 유용한 적합한 벡터가 풍부하다. 사용되는 벡터는 복제 및 선택적으로 진핵 세포 내 통합에 적합하다. 일반적인 벡터에는 원하는 핵산 서열의 발현 조절에 유용한 전사 및 번역 종결자, 개시 서열 및 프로모터가 포함되어 있다. 본 발명의 벡터는 또한 핵산 표준 유전자 전달 프로토콜에 사용될 수 있다. 유전자 전달 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 또한, 벡터는 바이러스 벡터의 형태로 세포에 제공될 수 있다. 바이러스 벡터 기술은 당업계에 주지되어 있으며, 예를 들어 문헌[Sambrook et al., 4th Edition, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 2012] 및 다른 바이러스학 및 분자 생물학 매뉴얼에 기재되어 있다. 벡터로서 유용한 바이러스에는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스 바이러스, 신드비스 바이러스, 감마-레트로바이러스 및 렌티바이러스가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 적합한 벡터는 적어도 하나의 유기체에서 기능성인 복제 기원, 프로모터 서열, 편리한 제한 엔도뉴클레아제 부위 및 하나 이상의 선택성 마커를 함유한다. 일부 구현예에서 CRISPR/Cas 시스템은 발현 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서 CRISPR/Cas 시스템은 pAd5/F35-CRISPR 벡터를 포함한다.
C. TALEN
일부 구현예에서, 유전자 편집 시스템은 TALEN 유전자 편집 시스템이다. TALEN은 TAL 효과기 DNA 결합 도메인을 DNA 절단 도메인에 융합시킴으로써 인공적으로 생성된다. 전사 활성제-유사 효과(TALE)는 표적 DNA에 결합하도록 조작될 수 있다. 조작된 TALE를 DNA 절단 도메인과 조합함으로써 임의의 표적 DNA 서열에 특이적인 제한 효소를 생성시킬 수 있다.
TALE는 잔토모나스(Xanthomonas) 세균에 의해 분비되는 단백질이다. DNA 결합 도메인은 12번째와 13번째 아미노산을 제외하고, 반복되는, 고도로 보존된 33-34개의 아미노산 서열을 함유한다. 이들 두 위치는 매우 가변적이어서 특정 뉴클레오티드 인식과 강한 상관관계를 보여주므로, 표적 DNA 서열에 결합하도록 조작될 수 있다.
TALEN을 생성시키기 위해, TALE 단백질을, 예를 들어 야생형 또는 돌연변이된 Fok1 엔도뉴클레아제를 포함하는 뉴클레아제(N)에 융합시킨다. Fok1 도메인은 이량체로서 기능하며, 이는 적절한 배향과 간격을 갖는 표적 게놈 중의 부위에 대한 독특한 DNA 결합 도메인을 갖는 2개의 작제물을 필요로 한다. 특이성 및 표적외 효과는 TALE DNA 결합 도메인과 Fok1 절단 도메인 사이의 아미노산 잔기 수와 2개의 개별 TALEN 결합 부위 사이의 염기 수를 변화시킴으로써 조절될 수 있다.
D. 아연 집게 뉴클레아제
일부 구현예에서, 유전자 편집 시스템은 아연 집게 뉴클레아제(ZFN) 유전자 편집 시스템이다. 아연 집게 뉴클레아제는 표적 핵산 서열의 하나 이상의 핵산 부위를 변형시키는데 사용될 수 있는 인공 뉴클레아제이다. TALEN 편집 시스템과 유사하게, ZFN은 DNA 결합 도메인에 융합된 Fok1 뉴클레아제 도메인(또는 이의 유도체)을 포함한다. ZFN의 경우, DNA 결합 도메인은 하나 이상의 아연 집게를 포함한다. 아연 집게는 하나 이상의 아연 이온에 의해 안정화된 작은 단백질 구조 모티프이다. 아연 집게는 예를 들어 Cys2His2를 포함할 수 있고 대략 3 bp 서열을 인식할 수 있다. 특이성이 알려진 다양한 아연 집게를 조합하여 약 6, 9, 12, 15 또는 18 bp 서열을 인식하는 다중 집게 폴리펩티드를 생성시킬 수 있다.
ZFN은 비-회문형 DNA 부위를 인식한다. 표적 부위를 절단하기 위해 한 쌍의 ZFN이 이량체화되어 표적 부위의 반대 가닥에 조립된다. 파지 디스플레이, 효모 1-하이브리드 시스템, 세균 1-하이브리드 및 2-하이브리드 시스템, 및 포유동물 세포를 비롯한 특정 서열을 인식하는 아연 집게(및 이들의 조합)를 생성시키는 데 다양한 선택 및 모듈식 조립 기법을 사용할 수 있다.
E. 메가뉴클레아제
일부 구현예에서, 유전자 편집 시스템은 메가뉴클레아제 유전자 편집 시스템이다. 메가뉴클레아제는 15-40개의 염기쌍 절단 부위를 인식하는 인공 뉴클레아제이다. 일부의 경우에, 메가뉴클레아제는 뉴클레아제 활성 및/또는 DNA 인식에 영향을 미치는 구조적 모티프에 기초하여 패밀리로 분류된다. LAGLIDADG 패밀리의 구성원은 보존된 LAGLIDADG 모티프의 1개 또는 2개의 사본을 갖는 것을 특징으로 한다. 일부의 경우에, LAGLIDADG 모티프의 단일 사본을 갖는 LAGLIDADG 메가뉴클레아제는 동종이량체를 형성하는 반면, LAGLIDADG 모티프의 2개의 사본을 갖는 구성원은 단량체로서 발견된다. GIY-YIG 패밀리 구성원은 길이가 70-100개 잔기인 GP-YIG 모듈을 가지며 4개의 불변 잔기를 갖는 4개 또는 5개의 보존된 서열 모티프를 포함하고, 이 중 2개는 활성에 필요하다. His-Cys 박스 메가뉴클레아제는 수백 개의 아미노산 잔기를 포함하는 영역에 걸쳐 고도로 보존된 일련의 히스티딘과 시스테인을 특징으로 한다. NHN 패밀리 구성원은 아스파라긴 잔기로 둘러싸인 두 쌍의 보존된 히스티딘을 포함하는 모티프에 의해 정의된다. 변경된 DNA-결합 특이성(예를 들어, 미리 결정된 핵산 서열에의 결합에 대한)을 갖는 메가뉴클레아제를 조작하기 위한 전략은 당해 분야에 공지되어 있다.
일부 예에서, 메가뉴클레아제는 메가뉴클레아제의 N-말단에 융합된 TALE 도메인을 포함하는 메가TAL로 지칭되는 하이브리드 뉴클레아제이다. 일부 경우에, 메가뉴클레아제는 LAGLIDADG 패밀리의 일원이다.
일부 구현예에서, 유전자 편집 시스템은 유전자 침묵 시스템이다. 예시적인 유전자 침묵 시스템은 RNAi-, siRNA-, 또는 shRNA-매개 유전자 침묵 시스템을 포함한다.
V. 외인성 핵산
본 발명은 내인성 면역 단백질 및 외인성 핵산의 유전자 발현을 하향조절할 수 있는 내인성 면역 단백질을 암호화하는 하나 이상의 유전자좌에 삽입 및/또는 결실을 포함하는 변형된 면역 세포 또는 이의 전구 세포를 제공한다. 일부 구현예에서, 외인성 핵산은 키메라 항원 수용체(CAR), 조작된 T 세포 수용체(TCR), 킬러 세포 면역글로불린 유사 수용체(KIR), 항원 결합 폴리펩티드, 세포 표면 수용체 리간드 또는 종양 항원을 암호화한다. 일부 구현예에서, 외인성 폴리펩티드를 발현하는 변형된 면역 세포가 본원에 개시된다. 일부 경우에, 외인성 핵산은 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화한다. 일부 경우에, 외인성 핵산은 항원 결합 폴리펩티드를 암호화한다. 일부 경우에, 외인성 핵산은 킬러 세포 면역글로불린 유사 수용체(KIR)를 암호화한다. 추가적인 경우에, 외인성 핵산은 세포 표면 수용체 리간드 또는 종양 항원을 암호화한다.
A. 키메라 항원 수용체
본 발명은 또한 본원에 기재된 바와 같은, 유전자 발현이 하향조절된 변형된 T 세포 및 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 CAR 또는 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는 변형된 T 세포를 포함하며, 여기서 CAR은 항원 결합 도메인, 힌지 도메인, 막관통 도메인, 공동자극 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 본원에 기재된 임의의 항원 결합 도메인, 임의의 힌지, 임의의 막관통 도메인, 임의의 공동자극 도메인 및 임의의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 CAR을 포함하는 임의의 변형된 세포가 구상되며, 이는 본원의 개시내용에 비추어 당해 분야의 숙련가에 의해 용이하게 이해되고 제조될 수 있다.
항원 결합 도메인은 면역 세포에서의 발현을 위해 CAR의 또 다른 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 막관통 도메인 또는 세포내 도메인에 작동적으로 연결될 수 있다. 한 구현예에서, 항원 결합 도메인을 암호화하는 제1 핵산 서열은 막관통 도메인을 암호화하는 제2 핵산에 작동적으로 연결되고, 추가로 세포내 도메인을 암호화하는 제3 핵산 서열에 작동적으로 연결된다.
본원에 기재된 항원 결합 도메인은 본원에 기재된 임의의 막관통 도메인, 본원에 기재된 임의의 세포내 도메인 또는 세포질 도메인, 또는 본 발명의 CAR에 포함될 수 있는 본원에 기재된 임의의 다른 도메인과 조합될 수 있다. 본 발명의 대상 CAR은 또한 본원에 기재된 바와 같은 스페이서 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인은 각각 링커에 의해 분리된다.
1. 항원 결합 도메인
CAR의 항원 결합 도메인은 단백질, 탄수화물 및 당지질을 포함한 특정 표적 항원에 결합하기 위한 CAR의 세포외 영역이다. 일부 구현예에서, CAR은 표적 세포(예를 들어 암 세포) 상의 표적 항원(예를 들어 종양 관련 항원)에 대한 친화성을 포함한다. 표적 항원은 표적 세포와 관련된 임의의 유형의 단백질 또는 이의 에피토프를 포함할 수 있다. 예를 들어, CAR은 표적 세포의 특정 상태를 나타내는 표적 세포 상의 표적 항원에 대한 친화성을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, 표적 세포 상의 특정 표적 항원에 대한 친화성을 갖는 본 개시내용의 CAR은 표적-특이적 결합 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 특이적 결합 도메인은 뮤린 표적 특이적 결합 도메인이고, 예를 들어 표적 특이적 결합 도메인은 뮤린 기원의 것이다. 일부 구현예에서, 표적 특이적 결합 도메인은 인간 표적 특이적 결합 도메인이고, 예를 들어 표적 특이적 결합 도메인은 인간 기원의 것이다.
항원 결합 도메인은 항원에 결합하는 임의의 도메인을 포함할 수 있고, 단클론 항체, 다클론 항체, 합성 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 비-인간 항체, 및 이의 임의의 단편을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 따라서, 한 구현예에서, 항원 결합 도메인 부분은 포유동물 항체 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 전장 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 항원 결합 단편(Fab), 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, 단일특이성 Fab2, 이중특이성 Fab2, 삼중특이성 Fab2, 단쇄 가변 단편(scFv), dAb, 탠덤 scFv, VhH, V-NAR, 카멜리드, 디아바디, 미니바디, 트리아바디 또는 테트라바디를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 CAR은 하나 이상의 표적 세포 상의 하나 이상의 표적 항원에 대한 친화성을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, CAR은 단일 표적 세포 상의 하나 이상의 표적 항원에 대한 친화성을 가질 수 있다. 이러한 구현예에서, CAR은 이중특이성 CAR 또는 다중특이성 CAR이다. 일부 구현예에서, CAR은 하나 이상의 표적 항원에 대한 친화성을 부여하는 하나 이상의 표적 특이적 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 동일한 표적 항원에 대해 친화성을 부여하는 하나 이상의 표적 특이적 결합 도메인을 포함한다. 예를 들어, 동일한 표적 항원에 대한 친화성을 갖는 하나 이상의 표적 특이적 결합 도메인을 포함하는 CAR은 표적 항원의 별개의 에피토프에 결합할 수 있다. 다수의 표적-특이적 결합 도메인이 CAR에 존재하는 경우, 결합 도메인은 탠덤으로 배열될 수 있고 링커 펩티드에 의해 분리될 수 있다. 예를 들어, 2개의 표적-특이적 결합 도메인을 포함하는 CAR에서, 결합 도메인은 폴리펩티드 링커, Fc 힌지 영역 또는 막 힌지 영역을 통해 단일 폴리펩티드 쇄에서 서로 공유적으로 연결된다.
본원에 사용된 용어 "단쇄 가변 단편" 또는 "scFv"는 공유적으로 연결되어 VH::VL 이종이량체를 형성하는 면역글로불린(예를 들어, 마우스 또는 인간)의 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변 영역의 융합 단백질이다. 중쇄(VH)와 경쇄(VL)는 직접 연결되거나 또는 VH의 N 말단을 VL의 C 말단과, 또는 VH의 C 말단을 VL의 N 말단과 연결하는 펩티드 암호화 링커 또는 스페이서에 의해 연결된다. 용어 "링커" 및 "스페이서"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인(예를 들어, Tn-MUC1 결합 도메인, PSMA 결합 도메인, 또는 메소텔린 결합 도메인)은 N-말단에서 C-말단으로, VH-링커-VL의 배열을 갖는 scFv를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인(예를 들어, Tn-MUC1 결합 도메인, PSMA 결합 도메인, 또는 메소텔린 결합 도메인)은 N-말단에서 C-말단으로, VL-링커-VH 배열을 갖는 scFv를 포함한다. 당업자는 본 발명에 사용하기 위한 적절한 배열을 선택할 수 있을 것이다.
링커에는 전형적으로 가요성을 위한 글리신과 용해성을 위한 세린 또는 트레오닌이 풍부하다. 링커는 세포외 항원 결합 도메인의 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변영역을 연결할 수 있다. 링커의 비제한적인 예는 문헌[Shen et al., Anal. Chem. 80(6):1910-1917 (2008)] 및 WO 2014/087010에 개시되어 있다. 다양한 링커 서열, 예를 들어 비제한적으로 글리신 세린(GS) 링커, 예를 들어 (GS)n, (GSGGS)n(서열번호 47), (GGGS)n(서열번호 48), 및 (GGGGS)n(서열번호 49)(여기서 n은 적어도 1의 정수를 나타낸다)이 당해 분야에 공지되어 있다. 예시적인 링커 서열은 비제한적으로 GGSG(서열번호 29), GGSGG(서열번호 30), GSGSG(서열번호 31), GSGGG(서열번호 32), GGGSG(서열번호 33), GSSSG(서열번호 34), GGGGS(서열번호 49), 또는 GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 50) 등을 포함한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 당업자는 본 발명에 사용하기 위한 적절한 링커 서열을 선택할 수 있을 것이다. 한 구현예에서, 본 발명의 항원 결합 도메인(예를 들어, Tn-MUC1 결합 도메인, PSMA 결합 도메인 또는 메소텔린 결합 도메인)은 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하며, 여기서 VH 및 VL은 아미노산 서열 GGGSGGGGSGGGGS(서열번호 50)를 갖는 링커 서열에 의해 분리된다. 일부 구현예에서, 링커 핵산 서열은 뉴클레오티드 서열 GGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGTGGGGTCGGGGTGGCGGCGGATCT(서열번호 51)를 포함한다.
불변 영역의 제거 및 링커의 도입에도 불구하고 scFv 단백질은 원래 면역글로불린의 특이성을 유지한다. 단쇄 Fv 폴리펩티드 항체는 문헌[Huston, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988)]에 기재된 바와 같이 VH- 및 VL-암호화 서열을 포함하는 핵산으로부터 발현될 수 있다. 억제 활성을 갖는 길항성 scFv가 기재되었다. 예를 들어 문헌[Zhao et al., Hybridoma (Larchmt), 27(6):455-51 (2008)]을 참조하시오. 자극 활성을 갖는 효능성 scFv가 기재되었다. 예를 들어 문헌[Peter et al., J. Biol. Chem., 25278(38):36740-7 (2003)]을 참조하시오.
본원에 사용된 바와 같이, "Fab"는 항원에 결합하지만 1가이고 Fc 부분을 갖지 않는 항체 구조의 단편을 지칭하며, 예를 들어 파파인 효소에 의해 절단된 항체는 2개의 Fab 단편과 Fc 단편을 생성시킨다(예를 들어 중(H) 쇄 불변 영역; 항원에 결합하지 않는 Fc 영역).
일부 경우에, 항원 결합 도메인은 CAR이 궁극적으로 사용될 동일한 종으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 인간에 사용하기 위해, CAR의 항원 결합 도메인은 본원의 다른 곳에 기재된 인간 항체 또는 이의 단편을 포함할 수 있다.
따라서, 예를 들어 본원에 기재된 방법에 의해 획득된 면역 세포는 하기의 암 관련 항원(종양 항원) 중 하나를 표적화하는 CAR을 발현하도록 조작될 수 있다: CD19; CD20; CD22(Siglec 2); CD37; CD 123; CD22; CD30; CD 171; CS-1(CD2 하위집합 1, CRACC, SLAMF7, CD319 및 19A24라고도 함); C형 렉틴-유사 분자-1(CLL-1 또는 CLECL1); CD33; CD133; 표피 성장 인자 수용체(EGFR); 표피 성장 인자 수용체 변이체 III(EGFRvIII); 인간 표피 성장 인자 수용체(HER1); 강글리오시드 G2(GD2); 강글리오시드 GD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer); TNF 수용체 패밀리 구성원 B 세포 성숙화(BCMA); Tn 항원((Tn Ag) 또는 (GalNAca-Ser/Thr)); 전립선 특이 막항원(PSMA); 수용체 티로신 키나제-유사 고아 수용체 1(ROR1); Fms-유사 티로신 키나제 3(FLT3); 종양 관련 당단백질 72(TAG72); CD38; CD44v6; 암배아항원(CEA); 상피 세포 부착 분자(EPCAM); B7H3(CD276); KIT(CD117); 인터류킨-13 수용체 서브유닛 알파-2(IL-13Ra2 또는 CD213A2); 메소텔린; 인터류킨 11 수용체 알파(IL-11Ra); 전립선 줄기 세포 항원(PSCA); 프로테아제 세린 21(테스티신 또는 PRSS21); 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2); 루이스(Y) 항원; CD24; 혈소판 유래 성장 인자 수용체 베타(PDGFR-베타); 단계-특이적 배아 항원-4(SSEA-4); 폴레이트 수용체 알파; 수용체 티로신-단백질 키나제 ERBB2(Her2/neu); 뮤신 1, 세포 표면 관련(MUC 1); GalNAca1-O-Ser/Thr(Tn) MUC 1(TnMUC1); 신경 세포 부착 분자(NCAM); 프로스타제; 전립선산 포스파타제(PAP); 신장 인자 2 돌연변이(ELF2M); 에프린 B2; 섬유아세포 활성화 단백질 알파(FAP); 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체(IGF-I 수용체), 카보닉 안하이드라제 IX(CAIX); 프로테아솜(Prosome, Macropain) 서브유닛, 베타 유형, 9(LMP2); 당단백질 100(gp100); 중단점 클러스터 영역(BCR) 및 Abelson 쥐 백혈병 바이러스성 종양유전자 상동체 1(Abl)로 이루어지는 종양유전자 융합 단백질(bcr-abl); 티로시나제; 에프린 A형 수용체 2(EphA2); 푸코실 GM1; 시알릴 루이스 부착 분자(sLe); 강글리오시드 GM3(aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(II)Cer); 트랜스글루타미나제 5(TGS5); 고분자량 흑색종 관련 항원(HMWMAA); o-아세틸-GD2 강글리오시드(OAcGD2); 폴레이트 수용체 베타; 종양 내피 마커 1(TEM1/CD248); 종양 내피 마커 7 관련(TEM7R); 클라우딘 6(CLDN6); 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR); G 단백질-커플링된 수용체 부류 C 그룹 5, 구성원 D(GPRC5D); 염색체 X 개방 판독 프레임 61(CXORF61); CD97; CD179a; 역형성 림프종 키나제(ALK); 폴리시알산; 태반특이적 1(PLAC1); globoH 글리코세라미드(GloboH)의 헥사사카라이드 부분; 유선 분화 항원(NY-BR-1); 유로플라킨 2(UPK2); 티로신-단백질 키나제 Met(c-Met); A형 간염 바이러스 세포 수용체 1(HAVCR1); 아드레날린 수용체 베타 3(ADRB3); 파넥신 3(PANX3); G 단백질-커플링된 수용체 20(GPR20); 림프구 항원 6 복합체, 유전자좌 K 9(LY6K); 후각 수용체 51E2(OR51E2); TCR 감마 대체 판독 프레임 단백질(TARP); 윌름스 종양 단백질(WT1); 암/고환 항원 1(NY-ESO-1); 암/고환 항원 2(LAGE-1a); 흑색종 관련 항원 1(MAGE-A1); 염색체 12p에 위치한 ETS 전위 변이 유전자 6(ETV6-AML); 정자 단백질 17(SPA17); X 항원 패밀리, 구성원 1A(XAGE1); 안지오포이에틴-결합 세포 표면 수용체 2(Tie 2); 흑색종 암 고환 항원-1(MAD-CT-1); 흑색종 암 고환 항원-2(MAD-CT-2); Fos 관련 항원 1; 종양 단백질 p53(p53); p53 돌연변이; 프로스테인; 생존; 텔로머라제; 전립선 암종 종양 항원-1(PCTA-1 또는 갈렉틴 8), T 세포 1에 의해 인식되는 흑색종 항원(MelanA 또는 MARTI); 래트 육종(Ras) 돌연변이; 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT); 육종 전위 중단점; 흑색종 세포자멸사 억제제(ML-IAP); ERG(막관통 프로테아제, 세린 2(TMPRSS2) ETS 융합 유전자); N-아세틸 글루코스아미닐-트랜스퍼라제 V(NA17); 쌍을 이루는 상자 단백질 Pax-3(PAX3); 안드로겐 수용체; 사이클린 B1; v-myc 조류 골수세포종증 바이러스성 종양유전자 신경모세포종 유래 상동체(MYCN); Ras 상동체 구성원 C(RhoC); 티로시나제 관련 단백질 2(TRP-2); 시토크롬 P450 1B 1(CYP1B 1); CCCTC-결합 인자(아연 집게 단백질)-유사(BORIS 또는 각인 부위 조절자의 형제), T 세포 3에 의해 인식되는 편평 세포 암종 항원(SART3); 쌍을 이루는 상자 단백질 Pax-5(PAX5); 프로아크로신 결합 단백질 sp32(OY-TES1); 림프구 특이적 단백질 티로신 키나제(LCK); 키나제 앵커 단백질 4(AKAP-4); 윤활막 육종, X 중단점 2(SSX2); 최종 당화산물 수용체(RAGE-1); 신장 유비쿼터스 1(RU1); 신장 유비쿼터스 2(RU2); 레구메인; 인유두종 바이러스 E6(HPV E6); 인유두종 바이러스 E7(HPV E7); 장 카르복실 에스테라제; 열 충격 단백질 70-2 돌연변이(mut hsp70-2); CD79a; CD79b; CD72; 백혈구 관련 면역글로불린-유사 수용체 1(LAIR1); IgA 수용체의 Fc 단편(FCAR 또는 CD89); 백혈구 면역글로불린-유사 수용체 하위패밀리 A 구성원 2(LILRA2); CD300 분자-유사 패밀리 구성원 f(CD300LF); C형 렉틴 도메인 패밀리 12 구성원 A(CLEC12A); 골수 간질 세포 항원 2(BST2); EGF-유사 모듈-함유 뮤신-유사 호르몬 수용체-유사 2(EMR2); 림프구 항원 75(LY75); 글리피칸-2(GPC2); 글리피칸-3(GPC3); NKG2D; KRAS; GDNF 패밀리 수용체 알파-4(GFRa4); IL13Ra2; Fc 수용체-유사 5(FCRL5); 및 면역글로불린 람다-유사 폴리펩티드 1(IGLL1).
일부 구현예에서, 면역 세포는 CD19, CD20, CD22, BCMA, CD37, 메소텔린, PSMA, PSCA, Tn-MUC1, EGFR, EGFRvIII, c-Met, HER1, HER2, CD33, CD133, GD2, GPC2, GPC3, NKG2D, KRAS 또는 WT1을 표적화하는 CAR을 발현하도록 조작된다.
2. 막관통 도메인
막관통 도메인과 관련하여, CAR은 CAR의 항원 결합 도메인을 세포내 도메인에 연결하는 막관통 도메인을 포함하도록 설계될 수 있다. 대상 CAR의 막관통 도메인은 세포(예를 들어, 면역 세포 또는 이의 전구체)의 원형질막에 걸쳐 있을 수 있는 영역이다. 막관통 도메인은 세포막, 예를 들어 진핵 세포막으로 삽입하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 CAR의 항원-결합 도메인과 세포내 도메인 사이에 놓인다.
한 구현예에서, 막관통 도메인은 CAR 내의 하나 이상의 도메인과 자연적으로 연관되어 있다. 일부 경우에, 막관통 도메인은 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호작용을 최소화하기 위해, 동일하거나 상이한 표면 막 단백질의 막관통 도메인에 대한 이러한 도메인의 결합을 피하기 위해 아미노산 치환에 의해 선택되거나 변형될 수 있다.
일부 구현예에서, 막관통 도메인은 천연 또는 합성 공급원으로부터 유래될 수 있다. 공급원이 천연인 경우, 도메인은 임의의 막 결합 또는 막관통 단백질, 예를 들어 I형 막관통 단백질로부터 유래될 수 있다. 공급원이 합성인 경우, 막관통 도메인은 세포막으로의 CAR 삽입을 촉진하는 임의의 인공 서열, 예를 들어 인공 소수성 서열일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명에서 특별히 사용되는 막관통 도메인은 (T 세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD28, CD2, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD7, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134(OX-40), CD137(4-1BB), CD154(CD40L), CD278(ICOS), CD357(GITR), 톨-유사 수용체 1(TLR1), TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, 및 킬러 면역글로불린-유사 수용체(KIR))로부터 유래된 막관통 도메인을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 적어도 T 세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD28, CD2, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD7, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134(OX-40), CD137(4-1BB), CD154(CD40L), CD278(ICOS), CD357(GITR), 톨-유사 수용체 1(TLR1), TLR2, TLR3, TLR4, TLR5 , TLR6, TLR7, TLR8, TLR9 및 킬러 면역글로불린-유사 수용체(KIR)로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 단백질의 막관통 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 합성일 수 있다. 일부 구현예에서, 합성 막관통 도메인은 주로 소수성 잔기, 예를 들어 류신 및 발린을 포함한다. 특정한 예시적인 구현예에서, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 트리플릿은 합성 막관통 도메인의 각 단부에서 발견될 것이다.
본원에 기재된 막관통 도메인은 본원에 기재된 임의의 항원 결합 도메인, 본원에 기재된 임의의 공동자극 신호전달 도메인, 본원에 기재된 임의의 세포내 신호전달 도메인, 또는 대상 CAR에 포함될 수 있는 본원에 기재된 임의의 다른 도메인과 조합될 수 있다.
한 구현예에서, 막관통 도메인은 CD8α 막관통 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 서열번호 23에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CD8α 막관통 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 막 관통 도메인은 서열번호 24에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 막관통 도메인은 CD28 막관통 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 서열번호 27에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CD28 막관통 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CD28 막관통 도메인은 서열번호 28에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
의도된 기능을 유지하면서 막관통 및/또는 힌지 도메인의 허용 가능한 변형은 당업자에게 알려져 있을 것이다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 서열번호 23 및/또는 27에 제시된 아미노산 서열 중 어느 하나에 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서 막관통 도메인은 서열번호 24 및/또는 28에 제시된 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나에 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 서열 일치성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열에 의해 암호화된다. 막관통 도메인은 임의의 힌지 도메인과 조합될 수 있고/있거나 본원에 기재된 하나 이상의 막관통 도메인을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, CAR은 임의의 항원 결합 도메인, T 세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄의 t 막관통 도메인, CD28, CD2, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD7, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134(OX-40), CD137(4-1BB), CD154(CD40L), CD278(ICOS), CD357 (GITR), 톨-유사 수용체 1(TLR1), TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9 및 킬러 면역글로불린 유사 수용체(KIR)의 막관통 도메인으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 막관통 도메인; 임의의 공동 자극 신호전달 도메인 및 본원에 기재된 임의의 세포내 도메인 또는 세포질 도메인, 또는 CAR에 포함될 수 있는 본원에 기재된 임의의 다른 도메인, 및 선택적으로 힌지 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, CAR은 CAR의 세포외 도메인과 막관통 도메인 사이에, 또는 CAR의 세포내 도메인과 막관통 도메인 사이에 스페이서 도메인을 추가로 포함한다. 본원에 사용된 용어 "스페이서 도메인"은 일반적으로 막관통 도메인을 폴리펩티드 쇄의 세포외 도메인 또는 세포내 도메인에 연결하는 기능을 하는 임의의 올리고- 또는 폴리펩티드를 의미한다. 스페이서 도메인은 최대 약 300개의 아미노산, 예를 들어 약 10개 내지 약 100개 아미노산, 또는 약 25개 내지 약 50개 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 스페이서 도메인은 예를 들어 약 2개 내지 약 10개 아미노산 길이의 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커일 수 있다. 예를 들어, 글리신-세린 더블릿은 대상 CAR의 막관통 도메인과 세포내 신호전달 도메인 사이에 특히 적합한 링커를 제공한다.
따라서, 본 개시내용의 CAR은 본원에 기재된 막관통 도메인, 힌지 도메인, 또는 스페이서 도메인 중 임의의 것을 포함할 수 있다.
3. 힌지 도메인
일부 구현예에서, 본 발명의 대상 CAR은 힌지 영역을 포함한다. CAR의 힌지 영역은 항원 결합 도메인과 막관통 도메인 사이에 위치하는 친수성 영역이다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 CAR에 대한 적절한 단백질 폴딩을 촉진한다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 CAR에 대한 선택적 성분이다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 항체의 Fc 단편, 항체의 힌지 영역, 항체의 CH2 영역, 항체의 CH3 영역, 인공 힌지 서열 또는 이들의 조합으로부터 선택된 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 CD8a 힌지, 3개의 글리신(Gly) 정도로 작을 수 있는 폴리펩티드로 만들어진 인공 힌지로부터 선택되지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 힌지 영역은 수용체로부터 유래된 힌지 영역 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 힌지 영역은 CD8-유래 힌지 영역이다. 한 구현예에서, 힌지 도메인은 인간 CD8 또는 이의 변이체로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 대상 CAR은 CD8α 힌지 도메인 및 CD8α 막관통 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CD8α 힌지 도메인은 서열번호 25에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CD8α 힌지 도메인은 서열번호 26에 제된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서 힌지 도메인은 서열번호 25에 제시된 아미노산 서열 중 어느 하나에 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서 힌지 도메인은 서열번호 26에 제시된 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나에 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 서열 일치성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열에 의해 암호화된다.
일부 구현예에서, 힌지 도메인은 항원 결합 도메인을 세포내 도메인에 연결된 막관통 도메인에 연결한다. 예시적인 구현예에서, 힌지 영역은 항원 결합 도메인이 표적 세포 상의 표적 항원을 인식하고 이에 결합하도록 지지할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Hudecek et al., Cancer Immunol. Res., 3(2): 125-135 (2015)]을 참조하시오. 일부 구현예에서, 힌지 영역은 가요성 도메인이므로, 항원 결합 도메인이 종양 세포와 같은 세포 상의 표적 항원의 특정 구조 및 밀도를 최적으로 인식할 수 있는 구조를 가질 수 있게 한다. 힌지 영역의 가요성으로 인해 힌지 영역이 다양한 형태를 채택할 수 있다.
일부 구현예에서, 힌지 도메인은 약 4개 내지 약 50개, 약 4개 내지 약 10개, 약 10개 내지 약 15개, 약 15개 내지 약 20개, 약 20개 내지 약 25개, 약 25개 내지 약 30개, 약 30개 내지 약 40개, 또는 약 40개 내지 약 50개 아미노산으로부터 선택된 길이를 갖는다.
적합한 힌지 영역은 용이하게 선택될 수 있고, 임의의 다수의 적합한 길이, 예를 들어 약 1개 아미노산(예를 들어, 글리신(Gly)) 내지 약 20개의 아미노산, 약 2개 내지 약 15개, 약 3개 내지 약 12개 아미노산, 예를 들어 약 4개 내지 약 10개, 약 5개 내지 약 9개, 약 6개 내지 약 8개, 또는 약 7개 내지 약 8개 아미노산의 길이를 가질 수 있으며, 약 1개, 약 2개, 약 3개, 약 4개, 약 5개, 약 6개 또는 약 7개의 아미노산일 수 있다.
일부 구현예에서, 아미노산은 글리신(Gly)이다. 글리신 및 글리신-세린 중합체가 사용될 수 있으며; Gly와 Ser은 모두 비교적 구조화되어 있지 않으므로 성분 간의 중립 테더 역할을 할 수 있다. 글리신 중합체가 사용될 수 있으며; 글리신은 심지어 알라닌보다 상당히 더 파이-사이 공간에 접근하고 더 긴 측쇄를 갖는 잔기보다 훨씬 덜 제한된다(예를 들어, 문헌[Scheraga, Rev. Computational. Chem. (1992) 2: 73-142] 참조). 일부 구현예에서, 힌지 영역은 글리신 중합체 (G)n, 글리신-세린 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 힌지 영역은 (GS)n, (GSGGS)n(서열번호 47) 및 (GGGS)n(서열번호 48)(여기서 n은 적어도 1의 정수이다)으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 글리신-세린 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 GGSG(서열번호 29), GGSGG(서열번호 30), GSGSG(서열번호 31), GSGGG(서열번호 32), GGGSG(서열번호 33), GSSSG(서열번호 34)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 힌지 영역은 글리신-알라닌 중합체, 알라닌-세린 중합체, 또는 당업계에 공지된 다른 가요성 링커를 포함한다.
일부 구현예에서, 힌지 영역은 면역글로불린 중쇄 힌지 영역이다. 면역글로불린 힌지 영역 아미노산 서열은 당업계에 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 면역글로불린 힌지 도메인은 DKTHT(서열번호 35); CPPC(서열번호 36); CPEPKSCDTPPPCPR(서열번호 37)(예를 들어, 문헌[Glaser et al., J. Biol. Chem. (2005) 280:41494-41503] 참조); ELKTPLGDTTHT(서열번호 38); KSCDKTHTCP(서열번호 39); KCCVDCP(서열번호 40); KYGPPCP(서열번호 41); EPKSCDKTHTCPPCP(서열번호 42)(인간 IgG1 힌지); ERKCCVECPPCP(서열번호 43)(인간 IgG2 힌지); ELKTPLGDTTHTCPRCP(서열번호 44)(인간 IgG3 힌지); SPNMVPHAHHAQ(서열번호 45)(인간 IgG4 힌지) 등으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 힌지 영역은 면역글로불린 중쇄 힌지 영역이다. 일부 구현예에서, 힌지는 IgG(예를 들어, 인간 IgG4)의 CH1 및 CH3 도메인으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 힌지 도메인의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 힌지 영역은 야생형(자연 발생) 힌지 영역과 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환 및/또는 삽입 및/또는 결실을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 인간 IgG1 힌지의 229번 위치에 있는 히스티딘(His229)은 티로신(Tyr)으로 치환된다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 아미노산 서열 EPKSCDKTYTCPPCP(서열번호 46)을 포함한다.
4. 공동자극 도메인
본 발명의 CAR은 또한 세포내 도메인을 포함한다. CAR의 세포내 도메인 또는 달리 세포질 도메인은 CAR이 발현되는 세포의 활성화를 담당하다. 따라서 용어 "세포내 도메인"은 활성화 신호를 전달하기에 충분한 세포내 도메인의 임의의 부분을 포함하는 것을 의미한다. 한 구현예에서, 세포내 도메인은 효과기 기능을 담당하는 도메인을 포함한다. "효과기 기능"이라는 용어는 세포의 특화된 기능을 지칭한다. 예를 들어, T 세포의 효과기 기능은 세포용해 활성 또는 사이토카인 분비를 포함한 보조 활성일 수 있다. 한 구현예에서, CAR의 세포내 도메인은 신호 활성화 및/또는 전달을 담당하는 도메인을 포함한다. 세포내 도메인은 단백질-단백질 상호작용, 생화학적 변화 또는 세포의 대사, 형태, 유전자 발현을 변경하는 다른 반응, 또는 키메라 세포내 신호전달 분자의 활성화에 대한 다른 세포 반응을 통해 신호 활성화를 전달할 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 세포내 도메인의 예에는 T 세포 수용체(TCR)의 세포질 부분, 및 임의의 공동 자극 분자, 또는 항원 수용체 관여 후 T 세포의 신호 전달을 개시하기 위해 TCR과 협력하여 작용하는 임의의 분자뿐만 아니라 이들 요소의 임의의 유도체나 변이체, 및 동일한 기능적 능력을 갖는 합성 서열이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 세포내 도메인은 공동자극 신호전달 도메인 및 세포내 신호전달을 포함한다. 특정 구현예에서, 세포내 도메인은 공동자극 신호전달 도메인을 포함한다. 한 구현예에서, CAR의 세포내 도메인은 TNFR 슈퍼패밀리의 단백질로부터의 신호전달 도메인의 일부, CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40(CD134), PD-1, CD7, LIGHT, CD83L, DAP10, DAP12, CD27, CD2, CD5, ICAM-1, LFA-1, Lck, TNFR-I, TNFR-II, Fas, CD30, CD40, ICOS(CD278), NKG2C, B7-H3(CD276), 및 킬러 면역글로불린-유사 수용체(KIR, 이의 임의의 유도체 또는 변이체, 동일한 기능적 능력을 갖는 이의 임의의 합성 서열, 및 이들의 임의의 조합)로부터 유래된 세포내 도메인으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 공동자극 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 공동자극 도메인은 TNFR 슈퍼패밀리의 단백질, CD28, 4-1BB(CD137), OX40(CD134), PD-1, CD7, LIGHT, CD83L, DAP10, DAP12, CD27, CD2, CD5, ICAM-1, LFA-1, Lck, TNFR-I, TNFR-II, Fas, CD30, CD40, ICOS(CD278), NKG2C, B7-H3(CD276), 및 킬러 면역글로불린 유사 수용체(KIR)로부터 유래된 세포내 도메인, 또는 이들의 변이체로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 단백질의 공동자극 도메인 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 공동자극 도메인은 CD28, 4-1BB(CD137), OX40(CD134), CD27, CD2, 또는 이들의 조합의 단백질로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 단백질의 공동자극 도메인 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 공동자극 신호전달 도메인은 4-1BB 공동자극 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 공동자극 신호전달 도메인은 CD2 공동자극 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 공동자극 신호전달 도메인은 CD28 공동자극 도메인을 포함한다.
한 구현예에서, CAR의 공동자극 도메인은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 4-1BB 공동자극 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 4-1BB 공동자극 도메인은 서열번호 2 또는 3에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, CAR의 공동자극 도메인은 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CD28 공동자극 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CD28 공동자극 도메인 서열번호 5에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, CAR의 공동자극 도메인은 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CD28(YMFM) 공동자극 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CD28(YMFM) 공동자극 도메인은 서열번호 7에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열에 의해 암호화된다. 한 구현예에서, CAR의 세포내 도메인은 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 ICOS 공동자극 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, ICOS 공동자극 도메인은 서열번호 9 또는 서열번호 10에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, CAR의 세포내 도메인은 서열번호 11에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 ICOS(YMNM) 공동자극 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, ICOS(YMNM) 공동자극 도메인은 서열번호 12에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, 대상 CAR의 세포내 도메인은 서열번호 13에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CD2 공동자극 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CD2 공동자극 도메인은 서열번호 14에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열에 의해 암호화된다. 한 구현예에서, CAR의 세포내 도메인은 서열번호 15에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CD27 공동자극 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CD27 공동자극 도메인은 서열번호 16에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열에 의해 암호화된다. 한 구현예에서, CAR의 세포내 도메인은 서열번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 OX40 공동자극 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, OX40 공동자극 도메인은 서열번호 18에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열에 의해 암호화된다.
5. 세포내 도메인
특정 구현예에서, 세포내 도메인은 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 세포내 도메인의 예에는 TCR, CD3 제타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD86, 공통 FcR 감마, FcR 베타(Fc 엡실론 Rib), CD79a, CD79b, Fc 감마 R11a, DAP10, DAP12, T 세포 수용체(TCR), CD2, CD8, CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX9, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, KIR 패밀리 단백질, 림프구 기능 관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83, CD5, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM과 특이적으로 결합하는 리간드(LIGHTR), SLAMF7, NKp80(KLRF1), CD127, CD160, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD1Id, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD lib, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(촉각), CEACAM1, CRTAM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CD100(SEMA4D), CD69, SLAMF6(NTB-A, Lyl08), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD 162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, 톨-유사 수용체 1(TLR1), TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, syk 패밀리 티로신 키나제(Syk, ZAP 70 등), src 패밀리 티로신 키나제(Lck, Fyn, Lyn 등), 기타 본원에 기재된 공동자극 분자, 이들의 임의의 유도체, 변이체 또는 단편, 동일한 기능적 능력을 갖는 공동자극 분자의 임의의 합성 서열, 및 이의 임의의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는 하나 이상의 분자 또는 수용체로부터의 단편 또는 도메인이 포함된다.
일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 인간 CD2, CD3 제타 쇄(CD3ζ), FcγRIII, FcsRI, Fc 수용체의 세포질 꼬리, 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM) 함유 세포질 수용체, TCR 제타, FcR 감마, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d, 및 이들의 변이체로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 세포내 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3 제타 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
세포내 도메인의 추가 예에는 CD3, B7 패밀리 공동자극 및 종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 슈퍼패밀리 수용체를 포함한 1세대, 2세대 및 3세대 T 세포 신호전달 단백질을 포함하지만 이에 제한되지 않는 여러 유형의 다양한 기타 면역 신호전달 수용체의 세포내 신호전달 도메인이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 추가로, 세포내 신호전달 도메인에는 NKp30(B7-H6) 및 DAP12, NKG2D, NKp44, NKp46, DAP10 및 CD3z의 신호전달 도메인과 같은 NK 및 NKT 세포에 의해 사용되는 신호전달 도메인이 포함될 수 있다.
본 발명의 CAR에 사용하기에 적합한 세포내 신호전달 도메인은 CAR의 활성화(즉, 항원 및 이량체화제에 의해 활성화됨)에 반응하여 신호를 전달하는 임의의 원하는 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 뚜렷하고 검출가능한 신호는 예를 들어 세포에 의한 하나 이상의 사이토카인의 생성 증가; 표적 유전자의 전사 변화; 단백질 활성 변화; 세포 거동의 변화(예를 들어, 세포사); 세포 증식; 세포분화; 세포 생존; 및/또는 세포 신호전달 반응의 조절을 포함한다. 예를 들어 일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 DAP10/CD28 유형 신호전달 쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 막 결합된 CAR에 공유적으로 부착되지 않고 대신 세포질에 확산된다.
본 발명의 CAR에 사용하기에 적합한 세포내 신호전달 도메인은 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM) 함유 세포내 신호전달 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 하기 기재된 바와 같이 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 또는 적어도 6개의 ITAM 모티프를 포함한다. 일부 구현예에서, ITAM 모티프는 세포내 신호전달 도메인에서 2회 반복되며, 여기서 ITAM 모티프의 첫 번째 및 두 번째 경우는 6 내지 8개의 아미노산만큼 서로 분리되어 있다. 한 구현예에서, 대상 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 3개의 ITAM 모티프를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM), 예를 들어 Fc 감마 RI, Fc 감마 RIIA, Fc 감마 RIIC, Fc 감마 RIIIA, FcRL5를 포함하지만 이에 제한되지 않는 인간 면역글로불린 수용체의 신호전달 도메인을 포함한다.
적합한 세포내 신호전달 도메인은 ITAM 모티프를 함유하는 폴리펩티드로부터 유래된 ITAM 모티프-함유 부분일 수 있다. 예를 들어, 적합한 세포내 신호전달 도메인은 임의의 ITAM 모티프 함유 단백질로부터의 ITAM 모티프 함유 도메인일 수 있다. 따라서, 적합한 세포내 신호전달 도메인은 그것이 유래된 전체 단백질의 전체 서열을 함유할 필요가 없다. 적합한 ITAM 모티프 함유 폴리펩티드의 예에는 DAP12, FCER1G(Fc 엡실론 수용체 I 감마 쇄), CD3D(CD3 델타), CD3E(CD3 엡실론), CD3G(CD3 감마), CD3Z(CD3 제타) 및 CD79A(항원 수용체 복합체 관련 단백질 알파 쇄)가 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
한 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 DAP12(TYROBP; TYRO 단백질 티로신 키나제 결합 단백질; KARAP; PLOSL; DNAX-활성화 단백질 12; KAR-관련 단백질; TYRO 단백질 티로신 키나제-결합 단백질; 킬러 활성화 수용체 관련 단백질, 킬러 활성화 수용체-관련 단백질 등으로도 공지됨)로부터 유래된다 한 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 FCER1G(FCRG; Fc 엡실론 수용체 I 감마 쇄; Fc 수용체 감마 쇄; fc-엡실론 RI-감마; fcR 감마; fceR1 감마; 고친화성 면역글로불린 엡실론 수용체 서브유닛 감마; 면역글로불린 E 수용체, 고친화성, 감마 쇄 등으로도 공지됨)로부터 유래된다. 한 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 T 세포 표면 당단백질 CD3 델타 쇄(CD3D; CD3-DELTA; T3D; CD3 항원, 델타 서브유닛; CD3 델타; CD3d 항원, 델타 폴리펩티드(TiT3 복합체); OKT3, 델타 쇄, T 세포 수용체 T3 델타 쇄, T 세포 표면 당단백질 CD3 델타 쇄 등으로도 공지됨)로부터 유래된다. 한 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 T 세포 표면 당단백질 CD3 입실론 쇄(CD3e, T 세포 표면 항원 T3/Leu-4 입실론 쇄, T 세포 표면 당단백질 CD3 입실론 쇄, AI504783, CD3, CD3epsilon, T3e 등으로도 공지됨)로부터 유래된다. 한 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 T 세포 표면 당단백질 CD3 감마 쇄(CD3G, T 세포 수용체 T3 감마 쇄, CD3-GAMMA, T3G, 감마 폴리펩티드(TiT3 복합체) 등으로도 공지됨)로부터 유래된다. 한 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 T 세포 표면 당단백질 CD3 제타 쇄(CD3Z, T 세포 수용체 T3 제타 쇄, CD247, CD3-제타, CD3H, CD3Q, T3Z, TCRZ 등으로도 공지됨)로부터 유래된다. 한 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD79A(B 세포 항원 수용체 복합체 관련 단백질 알파 쇄; CD79a 항원(면역글로불린 관련 알파); MB-1 막 당단백질; Ig-알파; 막 결합된 면역글로불린 관련 단백질, 표면 IgM 관련 단백질 등으로도 공지됨)로부터 유래된다. 한 구현예에서, 본 개시내용의 CAR에 사용하기에 적합한 세포내 신호전달 도메인은 DAP10/CD28 유형 신호전달 쇄를 포함한다. 한 구현예에서, 본 개시내용의 대상 CAR에 사용하기에 적합한 세포내 신호전달 도메인은 ZAP70 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 TCR 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b 또는 CD66d의 세포질 신호전달 도메인을 포함한다. 한 구현예에서, CAR의 세포내 신호전달 도메인은 인간 CD3 제타의 세포질 신호전달 도메인을 포함한다.
대개는 전체 세포내 신호전달 도메인이 사용될 수 있지만, 많은 경우 전체 쇄를 사용할 필요는 없다. 세포내 신호전달 도메인의 절두된 부분이 사용되는 경우, 이러한 절두된 부분은 효과기 기능 신호를 전달하는 한 온전한 쇄 대신 사용될 수 있다. 세포내 신호전달 도메인은 효과기 기능 신호를 전달하기에 충분한 세포내 신호전달 도메인의 임의의 절두된 부분을 포함한다.
본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인은 CAR에 포함될 수 있는 임의의 본원에 기재된 공동자극 신호전달 도메인, 임의의 본원에 기재된 항원 결합 도메인, 임의의 본원에 기재된 막관통 도메인, 또는 임의의 본원에 기재된 다른 도메인과 조합될 수 있다. 일부 구현예에서, CAR의 세포내 도메인은 이중 신호전달 도메인을 포함한다. 이중 신호전달 도메인은 임의의 본원에 기재된 분자로부터의 단편 또는 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포내 도메인은 4-1BB 공동자극 도메인 및 CD3 제타 신호전달 도메인; CD28 공동자극 도메인 및 CD3 제타 신호전달 도메인; CD2 공동자극 도메인 및 CD3 제타 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR의 세포내 도메인은 공동자극 분자의 임의의 부분, 예를 들어 CD3, CD27, CD28, ICOS, 4-1BB, PD-1, T 세포 수용체(TCR), 이들의 유도체 또는 변이체, 동일한 기능적 능력을 갖는 이들의 합성 서열, 및 이들의 임의의 조합으로부터의 적어도 하나의 신호전달 도메인을 포함한다.
추가로, 대상 CAR에 사용하기에 적합한 변이체 세포내 신호전달 도메인은 당해 분야에 공지되어 있다. YMFM 모티프는 ICOS에서 발견되며, PI3K의 p85 및 p50알파 서브유닛을 모두 모집하여 AKT 신호 전달을 향상시키는 SH2 결합 모티프이다. 한 구현예에서, CD28 세포내 도메인 변이체는 YMFM 모티프를 포함하도록 생성될 수 있다.
한 구현예에서, 대상 CAR의 세포내 도메인은 서열번호 19 또는 서열번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CD3 제타 세포내 신호전달 도메인을 포함하며, 이는 각각 서열번호 20 또는 서열번호 22에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있다.
특이적 활성을 유지하면서 세포내 도메인의 허용 가능한 변형은 당업자에게 알려져 있을 것이다. 일부 구현예에서, 세포내 도메인은 서열번호 19 또는 21에 제시된 아미노산 서열 중 어느 하나에 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서 세포내 도메인은 서열번호 20 또는 22에 제시된 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나에 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 서열 일치성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열에 의해 암호화된다.
한 구현예에서, 대상 CAR의 세포내 도메인은 ICOS 공동자극 도메인 및 CD3 제타 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 한 구현예에서, 대상 CAR의 세포내 도메인은 CD28 공동자극 도메인 및 CD3 제타 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 한 구현예에서, 대상 CAR의 세포내 도메인은 CD28 YMFM 변이체 공동자극 도메인 및 CD3 제타 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 한 구현예에서, 대상 CAR의 세포내 도메인은 CD27 공동자극 도메인 및 CD3 제타 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 한 구현예에서, 대상 CAR의 세포내 도메인은 OX40 공동자극 도메인 및 CD3 제타 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 한 예시적 구현예에서, 대상 CAR의 세포내 도메인은 4-1BB 공동자극 도메인 및 CD3 제타 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 한 예시적 구현예에서, 대상 CAR의 세포내 도메인은 CD2 공동자극 도메인 및 CD3 제타 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
표 2는 본원에 기재된 CAR 도메인의 예시적인 서열을 예시한다.
[표 2]
B. 추가적인 항원-결합 폴리펩티드
일부 구현예에서, 변형된 T 세포는 항원 결합 폴리펩티드, 세포 표면 수용체 리간드, 또는 종양 항원에 결합하는 폴리펩티드를 발현한다. 일부 경우에, 항원 결합 도메인은 세포 표면 단백질 또는 종양 세포에서 발현된 수용체를 인식하는 항체를 포함한다. 일부 경우에, 항원 결합 도메인은 종양 항원을 인식하는 항체를 포함한다. 일부 경우에, 항원 결합 도메인은 전장 항체 또는 이의 항원 결합 단편, Fab, F(ab)2, 단일특이성 Fab2, 이중특이성 Fab2, 삼중특이성 Fab2, 단쇄 가변 단편(scFv), 디아바디, 트리아바디, 미니바디, V-NAR 또는 VhH를 포함한다.
C. 세포 표면 수용체 리간드
일부 구현예에서, 변형된 T 세포는 세포 표면 수용체 리간드를 발현한다. 일부 경우에, 리간드는 종양 세포에 발현된 세포 표면 수용체에 결합하다. 일부 경우에, 리간드는 세포 표면 수용체에 결합하는 야생형 단백질 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 경우에, 리간드는 세포 표면 수용체에 결합하는 전장 단백질 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 일부 경우에, 기능적 단편은 단백질의 전장 버전과 비교하여 약 90%, 약 80%, 약 70%, 약 60%, 약 50% 또는 약 40%의 길이를 포함하지만 세포 표면 수용체에 대한 결합은 유지한다. 일부 경우에, 리간드는 세포 표면 수용체에 결합하는 드노보(de novo) 조작된 단백질이다. 예시적인 리간드는 표피 성장 인자(EGF), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF) 또는 Wnt3A를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
D. 종양 항원
일부 구현예에서, 변형된 T 세포는 종양 항원에 결합하는 폴리펩티드를 발현한다. 일부 경우에 종양 항원은 혈액학적 악성종양과 연관된다. 예시적인 종양 항원에는 CD19, CD20, CD22, CD33/IL3Ra, ROR1, 메소텔린, c-Met, PSMA, PSCA, 폴레이트 수용체 알파, 폴레이트 수용체 베타, EGFRvIII, GPC2, Tn-MUC1, GDNF 패밀리 수용체 알파-4(GFRa4), 섬유아세포 활성화 단백질(FAP) 및 IL13Ra2가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 일부 경우에, 종양 항원은 CD19, CD20, CD22, BCMA, CD37, 메소텔린, PSMA, PSCA, Tn-MUC1, EGFR, EGFRvIII, c-Met, HER1, HER2, CD33, CD133, GD2, GPC2, GPC3, NKG2D, KRAS 또는 WT1을 포함한다. 일부 경우에, 폴리펩티드는 종양 항원의 리간드, 예를 들어 종양 항원에 결합하는 전장 단백질, 이의 기능적 단편, 또는 종양 항원에 결합하는 드노보 조작된 리간드이다. 일부 경우에, 폴리펩티드는 종양 항원에 결합하는 항체이다.
E. 전환 수용체 및 우성 음성 수용체
한 양태에서, 본 개시내용은 또한 우성 음성 수용체, 전환 수용체, 또는 이들의 조합을 암호화하는 외인성 핵산을 추가로 포함하는 본원에 기재된 바와 같이 하향조절된 유전자 발현을 갖는 변형된 면역 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같이 유전자 발현이 하향조절된 변형된 면역 세포는 키메라 항원 수용체(CAR) 및/또는 우성 음성 수용체를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같이 유전자 발현이 하향조절된 변형된 면역 세포는 CAR 및 전환 수용체를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같이 유전자 발현이 하향조절된 변형된 면역 세포는 조작된 TCR 및 전환 수용체를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같이 유전자 발현이 하향조절된 변형된 면역 세포는 조작된 TCR 및 우성 음성 수용체를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같이 유전자 발현이 하향조절된 변형된 면역 세포는 KIR 및 전환 수용체를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같이 유전자 발현이 하향조절된 변형된 면역 세포는 KIR 및 우성 음성 수용체를 추가로 포함한다.
1. 전환 수용체
본 발명은 CAR 및 전환 수용체를 포함하는 유전자 발현이 하향조절된 변형된 면역 세포 또는 이의 전구체를 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 종양 세포는 면역 인식 및 제거로부터 종양을 보호하는 역할을 하는 면역억제 미세 환경을 생성한다. 이러한 면역억제 미세환경은 CAR-T 또는 TCR-T 세포 요법과 같은 면역억제 요법의 유효성을 제한할 수 있다. 예를 들어, 분비된 사이토카인 형질전환 성장인자 베타(TGF β)는 세포독성 T 세포의 기능을 직접적으로 억제하고 추가적으로 조절 T 세포 형성을 유도하여 면역 반응을 더욱 억제한다. 전립선암과 관련하여 TGFβ로 인한 T 세포 면역억제는 이전에 문헌[Donkor et al(2011)] 및 문헌[Shalapour et al(2015)]에 의해 입증되었다. 면역 세포에 대한 TGF의 면역억제 효과를 감소시키는 것을 변형시켜, 예를 들어 인터류킨-12 수용체(IL12R; TGFβR-IL12R)의 세포내 신호전달 도메인에 융합된 TGFβR의 세포외 리간드-결합 도메인을 포함하는 조작된 TGFβR을 발현하도록 변형시킬 수 있다. 따라서, 전환 수용체를 포함하는 변형된 면역 세포는 변형된 면역 세포의 미세환경에서 음성 신호 전달 분자와 결합할 수 있고, 변형된 면역 세포상의 억제 분자의 음성 신호 전달 신호를 변형된 면역 세포를 자극하는 양성 신호로 전환시킬 수 있다. 본 발명의 전환 수용체는 양성 신호와 연관된 세포내 도메인을 포함함으로써, 음성 신호 전달 분자의 효과를 감소시키거나 또는 음성 신호를 양성 신호로 전환시키도록 설계될 수 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 내인성 면역 단백질을 암호화하는 하나 이상의 유전자좌에 삽입 및/또는 결실을 포함하는 변형된 면역 세포는 전환 수용체를 발현하도록 추가로 유전적으로 변형되었다. 본원에 사용된 용어 "전환 수용체"는 본 발명의 변형된 면역 세포에 대한 음성 신호 전달 분자의 효과를 감소시키도록 설계된 분자를 지칭한다. 전환 수용체는 음성 신호(세포 또는 T 세포 활성화를 억압하거나 억제하는 신호 전달)와 연관된 제1 폴리펩티드로부터 유래된 제1 도메인; 및 양성 신호(세포 또는 T 세포를 자극하는 신호 전달 신호)와 연관된 제2 폴리펩티드로부터 유래된 제2 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 음성 신호와 연관된 단백질은 CTLA4, PD-1, TGFβRII, BTLA, VSIG3, VSIG8 및 TIM-3으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 양성 신호와 연관된 단백질은 CD28, 4-1BB, IL12Rβ1, IL12Rβ2, CD2, ICOS 및 CD27로 이루어지는 그룹으로부터 선택된다.
한 구현예에서, 제1 도메인은 음성 신호와 연관된 제1 폴리펩티드의 세포외 도메인의 적어도 일부를 포함하고, 제2 도메인은 양성 신호와 연관된 제2 폴리펩티드의 세포내 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 이와 같이, 전환 수용체는 양성 신호와 연관된 세포내 도메인에 융합된 음성 신호와 연관된 세포외 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 전환 수용체는 음성 신호와 연관된 신호전달 단백질의 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 양성 신호와 연관된 신호전달 단백질의 세포내 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 전환 수용체의 막관통 도메인은 음성 신호와 연관된 단백질의 막관통 또는 음성 신호와 연관된 단백질의 막관통 도메인으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 전환 수용체의 막관통 도메인은 CTLA4, PD-1, VSIG3, VSIG8, TGFβRII, BTLA, TIM-3, CD28, 4-1BB, IL12Rβ1, IL12Rβ2, CD2, ICOS 및 CD27로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 단백질의 막관통 도메인으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 전환 수용체는 PD-1-CD28, PD-1A132L-CD28, PD-1-CD27, PD-1A132L-CD27, PD-1-4-1BB, PD-1A132L-4-1BB, PD-1-ICOS, PD-1A132L-ICOS, PD-1-IL12Rβ1, PD-1A132L-IL12Rβ1, PD-1-IL12Rβ2, PD-1A132L-IL12Rβ2, VSIG3-CD28, VSIG8-CD28, VSIG3-CD27, VSIG8-CD27, VSIG3-4-1BB, VSIG8-4-1BB, VSIG3-ICOS, VSIG8-ICOS, VSIG3-IL12Rβ1, VSIG8-IL12Rβ1, VSIG3-IL12Rβ2, VSIG8-IL12Rβ2, TGFβRII-CD27, TGFβRII-CD28, TGFβRII-4-1BB, TGFβRII-ICOS, TGFβRII-IL12Rβ1 및 TGFβRII-IL12Rβ2로 이루어지는 그룹으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 전환 수용체는 PD-1-CD28이고 서열번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 전환 수용체는 PD-1A132L-CD28이고 서열번호 82에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 전환 수용체는 PD-1-4-1BB이고 서열번호 84에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 전환 수용체는 PD-1A132L-4-1BB이고 서열번호 86에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 전환 수용체는 TGFβRII-IL12Rβ1이고 서열번호 88에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 전환 수용체는 TGFβRII-IL12Rβ2이고 서열번호 90에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 전환 수용체는 서열번호 79, 81, 83, 85, 87, 89 또는 91에 제시된 핵산 서열로 암호화된다.
의도된 생물학적 활성(예를 들어, 세포에서 발현 시 음성 신호를 양성 신호로 전환시킴)을 유지하면서 전환 수용체의 허용 가능한 변형은 당업자에게 알려져 있을 것이다. 따라서, 일부 구현예에서 본 발명의 전환 수용체는 서열번호 79, 81, 83, 85, 87, 89 또는 91에 제시된 핵산 서열에 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 서열 일치성을 갖는 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 전환 수용체는 서열번호 78, 80, 82, 84, 86, 88, 또는 90에 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 변형된 면역 세포는 CD3, B2M, 및 CIITA, CAR, 및 PD-1-CD28, PD-1A132L-CD28, PD-1-CD27, PD-1A132L-CD27, PD-1-4-1BB, PD-1A132L-4-1BB, PD-1-ICOS, PD-1A132L-ICOS, PD-1-IL12Rβ1, PD-1A132L-IL12Rβ1, PD-1-IL12Rβ2, PD-1A132L-IL12Rβ2, VSIG3-CD28, VSIG8-CD28, VSIG3-CD27, VSIG8-CD27, VSIG3-4-1BB, VSIG8-4-1BB, VSIG3-ICOS, VSIG8-ICOS, VSIG3-IL12Rβ1, VSIG8-IL12Rβ1, VSIG3-IL12Rβ2, VSIG8-IL12Rβ2, TGFβRII-CD27, TGFβRII-CD28, TGFβRII-4-1BB, TGFβRII-ICOS, TGFβRII-IL12Rβ1 및 TGFβRII-IL12Rβ2로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 전환 수용체를 하향조절할 수 있는 삽입 및/또는 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포는 각각 CD3δ, CD3ε, CD3γ, B2M, CIITA, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP, 불변 쇄(Ii 쇄)으로 이루어지는 그룹 및 이들의 조합으로부터 선택된 내인성 면역 단백질, CAR, 및 PD-1-CD28, PD-1A132L-CD28, PD-1-CD27, PD-1A132L-CD27, PD-1-4-1BB, PD-1A132L-4-1BB, PD-1-ICOS, PD-1A132L-ICOS, PD-1-IL12Rβ1, PD-1A132L-IL12Rβ1, PD-1-IL12Rβ2, PD-1A132L-IL12Rβ2, VSIG3-CD28, VSIG8-CD28, VSIG3-CD27, VSIG8-CD27, VSIG3-4-1BB, VSIG8-4-1BB, VSIG3-ICOS, VSIG8-ICOS, VSIG3-IL12Rβ1, VSIG8-IL12Rβ1, VSIG3-IL12Rβ2, VSIG8-IL12Rβ2, TGFβRII-CD27, TGFβRII-CD28, TGFβRII-4-1BB, TGFβRII-ICOS, TGFβRII-IL12Rβ1 및 TGFβRII-IL12Rβ2로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 전환 수용체를 암호화하는 하나 이상의 유전자좌에 삽입 및/또는 결실을 포함한다.
2. 우성 음성 수용체
본 발명은 CAR 및 우성 음성 수용체를 포함하는 유전자 발현이 하향조절된 변형된 면역 세포 또는 이의 전구체를 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 따라서, 일부 구현예에서, 내인성 면역 단백질을 암호화하는 하나 이상의 유전자좌에 삽입 및/또는 결실을 포함하는 변형된 면역 세포는 우성 음성 수용체를 발현하도록 추가로 유전적으로 변형되었다. 본원에 사용된 용어 "우성 음성 수용체"는 음성 신호 전달 분자의 효과(예를 들어, 본 발명의 변형된 면역 세포에 대한 음성 신호 전달 분자의 효과)를 감소시키도록 설계된 분자를 지칭한다. 우성 음성 수용체는 음성 신호와 관련된 야생형 단백질의 절두된 변이체이다. 일부 구현예에서, 음성 신호와 연관된 단백질, 음성 신호와 연관된 단백질은 CTLA4, PD-1, BTLA, TGFβRII, VSIG3, VSIG8 및 TIM-3으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 우성 음성 수용체는 음성 신호와 연관된 세포외 도메인 덕분에 음성 신호 전달 분자(예를 들어, CTLA4, PD-1, BTLA, TGFβRII, VSIG3, VSIG8 및 TIM-3)에 결합할 수 있고, 음성 신호 전달 분자의 효과를 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 우성 음성 수용체를 포함하는 변형된 면역 세포는 변형된 면역 세포의 미세환경에서 음성 신호 전달 분자에 결합할 수 있지만, 이러한 결합은 변형된 T 세포의 활성을 변형시키기 위해 세포 내부에서 이 신호를 전달하지 않을 것이다. 오히려, 결합은 음성 신호 전달 분자를 격리하고 내인성 수용체/리간드에 대한 결합을 방지함으로써 음성 신호 전달 분자가 변형된 면역 세포에 미칠 수 있는 효과를 감소시킨다. 이와 같이, 특정 분자의 면역억제 효과를 감소시키기 위해서 면역 세포를 우성 음성 수용체인 우성 음성 수용체를 발현하도록 변형시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 우성 음성 수용체는 음성 신호와 연관된 야생형 단백질의 절두된 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 우성 음성 수용체는 세포외 도메인, 막관통 도메인을 포함하고 세포내 신호전달 도메인이 실질적으로 결여된 음성 신호와 연관된 야생형 단백질의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 우성 음성 수용체는 음성 신호와 연관된 신호전달 단백질의 세포외 도메인, 및 막관통 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 우성 음성 수용체는 PD-1, CTLA4, BTLA, TGFβRII, VSIG3, VSIG8 또는 TIM-3 우성 음성 수용체이다. 일부 구현예에서, 우성 음성 수용체는 PD-1 또는 TGFβRII이다. 일부 구현예에서, TGFβRII는 서열번호 76에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, TGFβRII는 서열번호 77에 제시된 핵산 서열에 의해 암호화된다.
의도된 생물학적 활성(예를 들어, 세포에서 발현 시 음성 신호를 차단하고/하거나 음성 신호를 갖는 분자를 격리시킴)을 유지하면서 우성 음성 수용체의 허용 가능한 변형은 당업자에게 알려져 있을 것이다. 따라서, 일부 구현예에서 본 발명의 우성 음성 수용체는 서열번호 77에 제시된 핵산 서열에 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 서열 일치성을 갖는 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 우성 음성 수용체는 서열번호 76에 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
F. 개선된 적합성을 위한 면역 향상 인자로서의 케모카인 및 사이토카인
본 발명은 CAR을 포함하고 우성 음성 수용체, 전환 수용체, 케모카인, 케모카인 수용체, 사이토카인, 사이토카인 수용체, 인터류킨-7( IL-7), 인터류킨-7 수용체(IL-7R), 인터류킨-15(IL-15), 인터류킨-15 수용체(IL-15R), 인터류킨-21(IL-21), 인터류킨-18(IL-18), CCL21, CCL19 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는 하향조절된 면역 유전자 발현을 갖는 변형된 면역 세포를 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 케모카인, 케모카인 수용체, 사이토카인, 사이토카인 수용체, IL-7, IL-7R, IL-15, IL-15R, IL-21, IL-18, C-C 모티프 케모카인 리간드 21(CCL21) 또는 C-C 모티프 케모카인 리간드 19(CCL19)는 청구된 변형된 면역 세포의 적합성을 향상시키는 면역 기능-향상 인자이다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 케모카인, 케모카인 수용체, 사이토카인, 사이토카인 수용체, IL-7, IL-7R, IL-15, IL-15R, IL-21, IL-18, CCL21 또는 CCL19의 변형된 면역세포에의 첨가는 변형된 면역세포의 면역유도 효과 및 항종양 활성을 향상시킨다.
이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 인터류킨 및 케모카인은 고형 종양에서 T 세포 프라이밍 및/또는 T 세포 침윤의 증가를 촉진할 수 있다. 예를 들어, T 세포 침윤이 낮은 미세부수체 안정성 대장암(CRC)에서, IL-15는 T 세포 프라이밍을 촉진한다. 일부 구현예에서, CAR과 케모카인/인터류킨 수용체 복합체의 조합은 T 세포 프라이밍을 촉진한다. 또한, IL-15는 NK 세포 침윤을 유도할 수 있다. 일부 구현예에서, IL-15/IL-15RA 복합체에 대한 반응은 NK 세포 침윤을 초래할 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 변형된 면역 세포는 IL-15/IL-15Ra 복합체를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, IL-15/IL-15Ra 복합체는 NIZ985(Novartis), ATL-803(Altor) 또는 CYP0150(Cytune)으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, IL-15/IL-15RA 복합체는 NIZ985이다. 일부 구현예에서, IL-15는 자연 살해 세포를 자극하여 췌장암 세포를 제거(예를 들어, 사멸)한다. 일부 구현예에서, IL-15/IL15Ra를 추가로 포함하는 본원에 기재된 변형된 면역 세포에 대한 치료 반응은 결장직장암의 동물 모델에서 자연 살해 세포 침윤과 연관된다. 일부 구현예에서, IL-15/IL-15Ra 복합체는 가용성 형태의 인간 IL-15Ra와 복합체화된 인간 IL-15를 포함한다. 복합체는 가용성 형태의 IL-15Ra에 공유적으로 또는 비공유적으로 결합된 IL-15를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 인간 IL-15는 가용성 형태의 IL-15Ra에 비공유 결합된다.
고형 종양에 대한 CAR T 세포 요법의 비효율성은 부분적으로 고형 종양에서 면역 세포 및 CAR T 세포의 제한된 모집 및 축적으로 인해 발생한다. 이 문제를 해결하기 위한 한 가지 접근법은 T-대역 섬유아세포 망상세포(FRC)의 기능을 모방하는 CAR T 세포를 조작하는 것이다. 림프절은 병원체와 면역원을 검출하는 역할을 한다. T-대역은 3가지 유형의 세포를 포함한다: (1) 수지상 세포, 단핵구, 대식세포 및 과립구와 같은 선천 면역 세포; (2) CD4 및 CD8 림프구와 같은 적응 면역 세포, 및 (3) 간질 세포(FRC). 이들 세포는 CD4 T 세포의 활성화, 분화 및 성숙을 촉진함으로써 병원체에 대해 유효한 면역 반응을 일으키기 위해 협력한다. FRC는 수지상 세포와 T 세포가 림프절을 통해 이동하고 B 세포를 유인하는 네트워크를 형성하기 때문에 특히 중요하다. 특히 FRC는 하기를 위한 네트워크를 제공한다: (i) 2개의 케모카인(CCL21 및 CCL19)을 방출함으로써 미경험 T 세포, B 세포 및 수지상 세포를 림프절로 모집한다; (ii) 특히 미경험 T 세포에 대한 생존 인자인 IL-7을 분비함으로써 T 세포가 생존한다; (iii) CD4 T 세포를 배중심(GC; 림프절의 상이한 부분)으로 수송한다. 따라서, 외인성 CCL21 또는 CCL19 및 IL-7로 무장된 CAR은 T 세포, B 세포 및 수지상 세포의 고형 종양에 대한 모집을 향상시킬 것이다. 일부 구현예에서, 변형된 T 세포는 면역 기능-향상 인자를 암호화하는 핵산을 포함하며, 여기서 면역 기능-향상 인자를 암호화하는 핵산은 인터류킨-7을 암호화하는 핵산 및 CCL19 또는 CCL21을 암호화하는 핵산이다.
일부 구현예에서, 면역 기능-향상 인자(즉, 케모카인, 케모카인 수용체, 사이토카인, 사이토카인 수용체, IL-7, IL-7R, IL-15, IL-15R, IL-21, IL-18, CCL21 또는 CCL19)의 핵산이 CAR에 융합된다. 일부 구현예에서, 케모카인, 케모카인 수용체, 사이토카인, 사이토카인 수용체, IL-7, IL-7R, IL-15, IL-15R, IL-21, IL-18, CCL21 또는 CCL19가 P2A, T2A, E2A 또는 F2A와 같은 자기-절단 펩티드를 통해 CAR에 융합된다.
VI. 변형된 T 세포를 생성하기 위한 방법
본 발명의 한 양태는 변형된 면역 세포(예를 들어 동종이계 T 세포, NK 세포 또는 NKT 세포)의 생성 방법을 제공한다. 본 발명의 변형된 면역 세포는 일반적으로 (1) 내인성 면역 단백질을 암호화하는 하나 이상의 내인성 면역 유전자의 유전자 발현을 하향조절할 수 있는 하나 이상의 핵산을 면역 세포에 도입하고; (2) 조작된 수용체를 암호화하는 외인성 핵산을 면역 세포에 도입하고; (3) 변형된 면역 세포를 확장하여 변형된 면역 T 세포를 생성시킴으로써 유전적으로 조작된다. 이러한 변형된 면역 세포는 치료용 조성물에 포함될 수 있으며 이를 필요로 하는 환자에게 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 변형된 면역 세포를 생성하기 위한 방법은 하나 이상의 내인성 면역 유전자의 유전자 발현을 하향조절할 수 있는 하나 이상의 핵산을 면역 세포에 도입하는 것을 포함한다. 하나 이상의 면역 유전자는 CD3δ, CD3ε, CD3γ, B2M, CIITA, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP 및 불변 쇄(Ii 쇄)로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 내인성 면역 단백질을 암호화한다. 또한, 면역 세포내에 키메라 항원 수용체(CAR), 조작된 T 세포 수용체(TCR), 킬러 세포 면역글로불린-유사 수용체(KIR), 항원-결합 폴리펩티드, 세포 표면 수용체 리간드 또는 종양 항원을 암호화하는 외인성 핵산을 도입하는 것은 또한 면역 세포에 도입된다. 일부 구현예에서, 방법은 우성 음성 수용체, 전환 수용체, 또는 이들의 조합을 암호화하는 외인성 핵산을 면역 세포에 도입하는 것을 추가로 포함한다.
A. 세포 내로 핵산을 도입하는 방법
핵산을 세포에 도입하는 방법은 물리적, 생물학적, 화학적 방법을 포함한다. RNA와 같은 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입하기 위한 물리적 방법에는 칼슘 포스페이트 침전, 리포펙션, 입자 충격, 미세주입, 일렉트로포레이션 등이 포함된다. RNA는 일렉트로포레이션(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems, Cologne, Germany)), (ECM 830(BTX)(Harvard Instruments, Boston, MA) 또는 Gene Pulser II(BioRad, Denver, CO), 멀티포레이터(Multiporator)(Eppendorf, Hamburg Germany)를 포함하는 상업적으로 이용 가능한 방법을 사용하여 표적 세포에 도입될 수 있다. RNA는 또한 리포펙션을 사용한 양이온성 리포솜 매개 형질감염 사용, 중합체 캡슐화 사용, 펩티드 매개 형질감염 사용 또는 "유전자총"과 같은 생물학적 입자 전달 시스템 사용으로 세포 내로 도입될 수 있다.
1. 생물학적 방법
관심 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포(예를 들어, 면역 세포)에 도입하기 위한 생물학적 방법에는 DNA 및 RNA 벡터의 사용이 포함된다. 바이러스 벡터, 및 특히 레트로바이러스 벡터는 유전자를 포유동물(예를 들어, 인간 세포)에 삽입하기 위해 가장 널리 사용되는 방법이 되었다. 다른 바이러스 벡터는 렌티바이러스, 폭스바이러스, 단순 포진 바이러스 I, 아데노바이러스 및 아데노 관련 바이러스 등으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 미국특허 5,350,674 및 5,585,362를 참조하시오.
일부 구현예에서, 본 발명의 대상 CAR, 대상 조작된 TCR, 대상 KIR, 대상 항원-결합 폴리펩티드, 대상 세포 표면 수용체 리간드, 대상 종양 항원, 대상 전환 수용체, 및/또는 대상 우성 음성 수용체를 암호화하는 핵산을 발현 벡터에 의해 세포 내로 도입한다. 대상 CAR, 대상 조작된 TCR, 대상 KIR, 대상 항원-결합 폴리펩티드, 대상 세포 표면 수용체 리간드, 대상 종양 항원, 대상 전환 수용체, 및/또는 대상 우성 음성 수용체를 암호화하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 본원에 제공한다. 적합한 발현 벡터에는 렌티바이러스 벡터, 감마 레트로바이러스 벡터, 거품형성 바이러스 벡터, 아데노 연관 바이러스(AAV) 벡터, 아데노바이러스 벡터, 조작된 하이브리드 바이러스, 네이키드 DNA, 예를 들어 비제한적으로 Sleeping Beauty, Piggyback과 같은 트랜스포손 매개 벡터, 및 Phi3l과 같은 인테그라제가 포함된다. 일부 다른 적합한 발현 벡터에는 단순 포진 바이러스(HSV) 및 레트로바이러스 발현 벡터가 포함된다.
아데노바이러스 발현 벡터는, 게놈 DNA로의 통합 능력은 낮지만 숙주 세포의 형질감염 효율은 높은 아데노바이러스를 기반으로 한다. 아데노바이러스 발현 벡터는 (a) 발현 벡터의 패키징을 지원하고 (b) 궁극적으로 대상 CAR, 대상 조작된 TCR, 대상 KIR, 대상 항원-결합 폴리펩티드, 대상 세포 표면 수용체 리간드, 대상 종양 항원, 대상 전환 수용체, 및/또는 대상 우성 음성 수용체를 숙주 세포에서 발현하기에 충분한 아데노바이러스 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 아데노바이러스 게놈은 외래 DNA 서열인 36 kb 선형 이중 가닥 DNA이다. 예를 들어, 대상 CAR, 대상 조작된 TCR, 대상 KIR, 대상 항원-결합 폴리펩티드, 대상 세포 표면 수용체 리간드, 대상 종양 항원, 대상 전환 수용체, 및/또는 대상 우성 음성 수용체를 암호화하는 핵산을 본 발명의 발현 벡터를 제조하기 위해서 삽입하여 큰 조각의 아데노바이러스 DNA를 대체할 수 있다.
또 다른 발현 벡터는 아데노바이러스 커플링된 시스템을 활용하는 아데노 관련 바이러스를 기반으로 하다. 이 AAV 발현 벡터는 숙주 게놈으로의 통합 빈도가 높다. 이는 비-분열 세포를 감염시킬 수 있으며, 따라서 이는 상기 벡터를 예를 들어 조직 배양물에서 또는 생체내에서 포유동물 세포로 유전자를 전달하는 데 유용하게 한다. AAV 벡터는 감염성에 대해 광범위한 숙주 범위를 가지고 있다. AAV 벡터의 생성 및 사용에 관한 세부사항은 미국특허 5,139,941 및 4,797,368에 기재되어 있다.
레트로바이러스 발현 벡터는 숙주 게놈에 통합되어 다량의 외부 유전 물질을 전달하고 광범위한 종과 세포 유형을 감염시키고 특수 세포주에 패키징될 수 있다. 레트로바이러스 벡터를, 핵산(예를 들어, 대상 CAR, 대상 조작된 TCR, 대상 KIR, 대상 항원-결합 폴리펩티드, 대상 세포 표면 수용체 리간드, 대상 종양 항원, 대상 전환 수용체, 및/또는 대상 우성 음성 수용체를 암호화하는 핵산)을 특정 위치에서 바이러스 게놈내에 삽입함으로써 구성하여 복제 결함성인 바이러스를 생성시킨다. 레트로바이러스 벡터는 광범위한 세포 유형을 감염시킬 수 있지만, 대상 CAR, 대상 조작된 TCR, 대상 KIR, 대상 항원-결합 폴리펩티드, 대상 세포 표면 수용체 리간드, 대상 종양 항원, 대상 전환 수용체, 및/또는 대상 우성 음성 수용체의 통합 및 안정한 발현은 숙주 세포의 분열을 필요로 한다.
렌티 바이러스 벡터는 통상적인 레트로바이러스 유전자 gag, pol 및 env 외에도, 조절 또는 구조적 기능을 가진 다른 유전자를 포함하는 복잡한 레트로바이러스인 렌티바이러스로부터 유래된다. 예를 들어, 미국특허 6,013,516 및 5,994,136을 참조하시오. 렌티바이러스의 일부 예에는 인간 면역결핍 바이러스(HTV-1, HTV-2) 및 유인원 면역결핍 바이러스(SIV)가 포함된다. 렌티바이러스 벡터는 HIV 독성 유전자를 다중적으로 약화시킴으로써 생성되었다, 예를 들어 유전자 env, vif, vpr, vpu 및 nef를 결실시켜 벡터를 생물학적으로 안전하게 한다. 렌티바이러스 벡터는 비-분열 세포를 감염시킬 수 있으며 대상 CAR, 대상 조작된 TCR, 대상 KIR, 대상 항원-결합 폴리펩티드, 대상 세포 표면 수용체 리간드, 대상 종양 항원, 대상 전환 수용체, 및/또는 대상 우성 음성 수용체를 암호화하는 핵산의 생체내 및 생체외 유전자 전달 및 발현 모두에 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국특허 5,994,136을 참조하시오.
본 개시내용의 핵산을 포함하는 발현 벡터는 당업자에게 공지된 임의의 수단에 의해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 경우에 따라, 발현 벡터는 형질감염을 위한 바이러스 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 발현 벡터는 융합, 일렉트로포에이션, 바이오리스틱스, 형질감염, 리포펙션 등에 의해 도입될 수 있다. 숙주 세포(예를 들어, 면역 세포)는 발현 벡터의 도입 전에 배양물에서 성장 및 확장될 수 있고, 이어서 벡터의 도입 및 통합을 위한 적절한 처리가 이어질 수 있다. 그 후, 숙주 세포(예를 들어, 면역 세포)가 확장되고 벡터에 존재하는 마커에 의해 스크리닝될 수 있다. 일부 구현예에서, 대상 CAR, 대상 조작된 TCR, 대상 KIR, 대상 항원-결합 폴리펩티드, 대상 세포 표면 수용체 리간드, 대상 종양 항원, 대상 전환 수용체, 및/또는 대상 우성 음성 수용체를 암호화하는 핵산은 바이러스 형질도입에 의해 면역 세포에 도입된다. 일부 구현예에서, 바이러스 형질도입은 면역 세포를 하나 이상의 핵산을 포함하는 바이러스 벡터와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터, 센다이 바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터 및 렌티바이러스 벡터로 이루어지는 그룹으로부터 선택된다. 사용될 수 있는 다양한 마커는 당업계에 공지되어 있으며, hprt, 네오마이신 내성, 티미딘 키나제, 히그로마이신 내성 등을 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"은 호환가능하게 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 면역 세포 또는 이의 전구체이다. 일부 구현예에서, 유전적으로 조작된 세포는 유전적으로 조작된 T-림프구(T 세포), 미경험 T 세포(TN), 기억 T 세포(예를 들어, 중심 기억 T 세포(TCM), 효과기 기억 세포(TEM)), 자연 살해 세포(NK 세포) 및 치료적으로 관련된 자손을 생성할 수 있는 대식세포이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 T 세포, NK 세포, 또는 NKT 세포이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 T 세포, 자연 살해 세포(NK 세포), 자연 살해 T 세포, 림프 전구 세포, 조혈 줄기 세포, 줄기 세포, 대식 세포, 및 수지상 세포로 이루어지는 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 동종이계 T 세포 또는 자기유래 T 세포이다. 일부 구현예에서, 동종이계 T 세포 또는 자기유래 T 세포는 인간이다.
본 발명의 변형된 면역 세포(예를 들어, 유전자, CAR, KIR, TCR 우성 음성 수용체 및/또는 전환 수용체를 하향조절할 수 있는 핵산을 포함함)는 숙주 세포(예를 들어 면역 세포)를 본 개시내용의 핵산을 포함하는 발현 벡터로 안정적으로 형질감염시킴으로써 생성될 수 있다. 본 개시내용의 변형된 세포를 생성하기 위한 추가 방법에는 화학적 형질전환 방법(예를 들어, 칼슘 포스페이트, 덴드리머, 리포솜 및/또는 양이온성 중합체를 사용함), 비-화학적 형질전환 방법(예를 들어, 일렉트로포레이션, 광학적 형질전환, 유전자 전기전달 및/또는 유체역학적 전달) 및/또는 입자-기반 방법(예를 들어, 유전자 총 및/또는 자기감염을 사용하는 손상감염)이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 본 개시내용의 유전자, CAR, KIR, TCR 우성 음성 수용체 및/또는 전환 수용체를 하향조절할 수 있는 핵산을 발현하는 형질감염된 세포(즉, 면역 세포)는 생체외에서 확장될 수 있다.
2. 물리적 방법
발현 벡터를 숙주 세포에 도입하기 위한 물리적 방법에는 칼슘 포스페이트 침전, 리포펙션, 입자 충격, 미세주입, 일렉트로포레이션 등이 포함된다. 벡터 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 세포를 생성시키는 방법은 당해 분야에 주지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001)]을 참조하시오.
3. 화학적 방법
발현 벡터를 숙주 세포에 도입하기 위한 화학적 방법에는 거대분자 복합체, 나노캡슐, 미소구체, 비드와 같은 콜로이드 분산 시스템, 및 수중 유적형 유화액, 미셀, 혼합 미셀 및 리포솜을 비롯한 지질 기반 시스템이 포함된다. 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입하기 위한 화학적 수단에는 거대분자 복합체, 나노캡슐, 미소구체, 비드와 같은 콜로이드 분산 시스템, 및 수중 유적형 유화액, 미셀, 혼합 미셀 및 리포솜을 비롯한 지질 기반 시스템이 포함된다. 시험관내 및 생체내 전달 비히클로서 사용하기 위한 예시적인 콜로이드 시스템은 리포솜(예를 들어, 인공 막 소포)이다.
외인성 핵산을 숙주 세포에 도입하거나 달리 세포를 본 발명의 억제제에 노출시키는 데 사용되는 방법에 관계없이, 숙주 세포내 핵산의 존재를 확인하기 위해 다양한 분석이 수행될 수 있다. 이러한 분석에는 예를 들어, 서던 및 노던 블롯팅, RT-PCR 및 PCR과 같은 당업자에게 주지된 분자 생물학적 분석; 특정 펩티드의 존재 또는 부재를 검출하는 것과 같은 생화학적 분석(예를 들어, 면역학적 수단(ELISA 및 웨스턴 블롯)) 또는 본 발명의 범위에 속하는 작용제를 식별하기 위해 본원에 기재된 분석에 의한 것이 포함된다.
더욱이, 핵산은 확장된 숙주 세포(예를 들어, 면역 세포)를 형질도입하고, 확장된 숙주 세포(예를 들어, 면역 세포)를 형질감염시키고, 확장된 숙주 세포(예를 들어, 면역 세포)를 일렉트로포레이션하는 것과 같은 임의의 수단에 의해 도입될 수 있다. 하나의 핵산은 하나의 방법으로 도입될 수 있고 또 다른 핵산은 상이한 방법으로 숙주 세포(예를 들어, 면역 세포)에 도입될 수 있다.
4. RNA
한 구현예에서, 숙주 세포(예를 들어 면역 세포)에 도입되는 핵산은 RNA이다. 다른 구현예에서, RNA는 시험관내에서 전사된 RNA 또는 합성 RNA를 포함하는 mRNA이다. RNA는 폴리머라제 쇄 반응(PCR)-생성된 주형을 사용하여 시험관내 전사에 의해 생성된다. 임의의 공급원으로부터의 관심 DNA는 적절한 프라이머와 RNA 폴리머라제를 사용하여 PCR을 통해 시험관내 mRNA 합성을 위한 주형으로 직접 전환될 수 있다. DNA 공급원은 게놈 DNA, 플라스미드 DNA, 파지 DNA, cDNA, 합성 DNA 서열 또는 기타 적절한 DNA 공급원일 수 있다.
PCR은 세포내로 도입되는 mRNA의 시험관내 전사를 위한 주형을 생성하는 데 사용될 수 있다. PCR을 수행하는 방법은 당해 분야에 주지되어 있다. PCR에 사용하기 위한 프라이머는 PCR에 대한 주형으로서 사용되는 DNA 영역에 실질적으로 상보적인 영역을 갖도록 설계된다. 본원에 사용된 바와 같이, "실질적으로 상보적인"은 프라이머 서열의 염기의 대부분 또는 전부가 상보적이거나 하나 이상의 염기가 비상보적이거나 불일치하는 뉴클레오티드의 서열을 지칭한다. 실질적으로 상보적인 서열은 PCR에 사용되는 어닐링 조건 하에서 의도된 DNA 표적과 어닐링되거나 하이브리드화될 수 있다. 프라이머는 DNA 주형의 임의의 부분에 실질적으로 상보적이도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 5' 및 3' UTR을 포함하여 세포에서 통상적으로 전사되는 유전자 부분(개방 판독 프레임)을 증폭하도록 설계될 수 있다. 프라이머는 특정 관심 도메인을 암호화하는 유전자의 일부를 증폭하도록 설계될 수도 있다. 한 구현예에서, 프라이머는 5' 및 3' UTR의 전부 또는 일부를 포함하는 인간 cDNA의 암호화 영역을 증폭하도록 설계된다. PCR에 유용한 프라이머는 당해 분야에 주지된 합성 방법에 의해 생성된다. "순방향 프라이머"는 증폭될 DNA 서열의 상류에 있는 DNA 주형의 뉴클레오티드에 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드 영역을 포함하는 프라이머이다. "상류"는 암호화 가닥에 대해 증폭될 DNA 서열에 대한 5 위치를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. "역방향 프라이머"는 증폭될 DNA 서열의 하류에 있는 이중 가닥 DNA 주형에 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드 영역을 포함하는 프라이머이다. "하류"는 암호화 가닥에 대해 증폭될 DNA 서열에 대해 3' 위치를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다.
RNA의 안정성 및/또는 번역 효율을 촉진하는 능력을 갖는 화학 구조가 또한 사용될 수 있다. RNA는 바람직하게는 5' 및 3' UTR을 갖는다. 한 구현예에서, 5' UTR의 길이는 0 내지 3000개 뉴클레오티드이다. 암호화 영역에 추가될 5' 및 3' UTR 서열의 길이는, 비제한적으로 UTR의 상이한 영역에 어닐링하는 PCR용 프라이머 설계를 포함한 다양한 방법으로 변경될 수 있다. 이러한 접근법을 사용하여, 당업자는 전사된 RNA의 형질감염 후 최적의 번역 효율을 달성하는 데 필요한 5' 및 3' UTR 길이를 변형시킬 수 있다.
5' 및 3' UTR은 관심 유전자에 대한 자연 발생 내인성 5' 및 3' UTR일 수 있다. 대안적으로, 관심 유전자에 내생적이지 않은 UTR 서열을, UTR 서열을 순방향 및 역방향 프라이머에 통합하거나 또는 주형의 다른 변형에 의해 추가할 수 있다. 관심 유전자에 내인성이 아닌 UTR 서열의 사용은 RNA의 안정성 및/또는 번역 효율을 변형시키는 데 유용할 수 있다. 예를 들어, 3' UTR 서열의 AU-풍부 요소는 mRNA의 안정성을 감소시킬 수 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 3' UTR은 당업계에 주지된 UTR의 특성에 기반하여 전사된 RNA의 안정성을 증가시키도록 선택되거나 설계될 수 있다.
한 구현예에서, 5' UTR은 내인성 유전자의 Kozak 서열을 함유할 수 있다. 또는 상술한 대로 관심 유전자에 내인성이 아닌 5' UTR이 PCR에 의해 추가되는 경우, 5' UTR 서열을 추가하여 공통 Kozak 서열을 재설계할 수 있다. Kozak 서열은 일부 RNA 전사물의 번역 효율을 높일 수 있지만 모든 RNA가 효율적인 번역을 가능하게 하는 데 필요한 것은 아닌 것으로 보인다. 많은 mRNA에 대한 Kozak 서열의 요건은 당해 분야에 알려져 있다. 다른 구현예에서, 5' UTR은 RNA 게놈이 세포에서 안정한 RNA 바이러스로부터 유래될 수 있다. 다른 구현예에서, mRNA의 엑소뉴클레아제 분해를 방해하기 위해 다양한 뉴클레오티드 유사체가 3' 또는 5' UTR에 사용될 수 있다.
유전자 클로닝 필요없이 DNA 주형에서 RNA를 합성하려면 전사 프로모터가 전사될 서열의 DNA 주형 상류에 부착되어야 하다. RNA 폴리머라제의 프로모터로서 기능하는 서열이 순방향 프라이머의 5' 단부에 추가되면, RNA 폴리머라제 프로모터는 전사될 개방 판독 프레임의 상류 PCR 산물에 통합된다. 한 구현예에서, 프로모터는 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같은 T7 폴리머라제 프로모터이다. 다른 유용한 프로모터에는 T3 및 SP6 RNA 폴리머라제 프로모터가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. T7, T3 및 SP6 프로모터에 대한 공통 뉴클레오티드 서열은 당업계에 공지되어 있다.
한 구현예에서, mRNA는 리보솜 결합, 번역 개시 및 세포내 mRNA 안정성을 결정하는 5' 단부의 캡 및 3' 폴리(A) 꼬리를 모두 갖는다. 예를 들어 플라스미드 DNA와 같은 원형 DNA 주형에서 RNA 폴리머라제는 진핵 세포에서 발현하기에 적합하지 않은 긴 연쇄 생성물을 생성한다. 3' UTR의 단부에서 선형화된 플라스미드 DNA의 전사는 전사 후 폴리아데닐화되더라도 진핵생물 형질감염에 유효하지 않은 정상적인 크기의 mRNA를 생성시킨다. 선형 DNA 주형에서, 파지 T7 RNA 폴리머라제는 전사물의 3' 단부를 주형의 마지막 염기 이상으로 연장할 수 있다(Schenborn and Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985); Nacheva and Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem, 270: 1485-65 (2003).
폴리A/T 신장부를 DNA 주형에 통합시키는 일반적인 방법은 분자 클로닝이다. 그러나 플라스미드 DNA에 통합된 폴리A/T 서열은 플라스미드 불안정성을 유발할 수 있으며, 이는 세균 세포에서 획득된 플라스미드 DNA 주형이 종종 결실 및 기타 일탈로 심하게 오염되는 이유이다. 이로 인해 클로닝 절차가 힘들고 시간이 많이 걸릴 뿐만 아니라 신뢰성이 떨어지는 경우도 많다. 이것이 바로 클로닝 없이 폴리A/T 3' 신장부를 사용하여 DNA 주형을 구성할 수 있는 방법이 매우 바람직한 이유이다. 전사 DNA 주형의 폴리A/T 분절은 폴리T 꼬리, 예를 들어 100T 꼬리(크기는 50-5000T일 수 있다)를 함유하는 역방향 프라이머를 사용하여 PCR 중에 생성되거나, 또는 비제한적으로 DNA 결찰 또는 시험관내 재조합을 포함한 임의의 다른 방법에 의해 PCR 후에 생성될 수 있다. 폴리(A) 꼬리는 또한 RNA에 안정성을 제공하고 분해를 줄인다. 일반적으로 폴리(A) 꼬리의 길이는 전사된 RNA의 안정성과 양의 상관관계가 있다. 한 구현예에서, 폴리(A) 꼬리는 100 내지 5000개 아데노신이다.
RNA의 폴리(A) 꼬리는 이 콜라이 폴리A 폴리머라제(E-PAP)와 같은 폴리(A) 폴리머라제를 사용하여 시험관내 전사 후 추가로 연장될 수 있다. 한 구현예에서, 폴리(A) 꼬리의 길이를 100개 뉴클레오티드에서 300 내지 400개 뉴클레오티드로 증가시키면 RNA의 번역 효율이 약 2배 증가하게 된다. 추가적으로, 3' 단부에 다른 화학기가 부착되면 mRNA 안정성이 증가할 수 있다. 이러한 부착에는 변형된/인공 뉴클레오티드, 앱타머 및 기타 화합물이 포함될 수 있다. 예를 들어, ATP 유사체는 폴리(A) 폴리머라제를 사용하여 폴리(A) 꼬리에 통합될 수 있다. ATP 유사체는 RNA의 안정성을 더욱 증가시킬 수 있다. 5' 캡은 또한 RNA 분자에 안정성을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 RNA는 5' 캡을 포함한다. 5' 캡은 당업계에 공지되어 있고 본원에 기재된 기법을 사용하여 제공된다. Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci. 29:436-444 (2001); Stepinski, et al, RNA 7: 1468-95 (2001); Elango, et al, Biochim. Biophys. Res. Commun. 330:958-966 (2005).
본원에 개시된 방법에 의해 생성된 RNA는 또한 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 서열을 함유할 수도 있다. IRES 서열은 mRNA에 대한 캡 독립적 리보솜 결합을 개시하고 번역의 개시를 촉진하는 임의의 바이러스, 염색체 또는 인공적으로 설계된 서열일 수 있다. 당, 펩티드, 지질, 단백질, 항산화제, 및 계면활성제와 같이 세포 투과성과 생존력을 촉진하는 인자를 함유할 수 있는, 세포 일렉트로포레이션에 적합한 임의의 용질이 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, RNA는 시험관내 전사된 RNA와 같이 세포 내로 일렉트로포레이션된다.
개시된 방법은 표적 암세포를 사멸시키는 유전적으로 변형된 숙주 세포의 능력 평가를 포함하여, 암, 줄기 세포, 급성 및 만성 감염, 자가면역 질환 분야의 기초 연구 및 치료에서 숙주 세포 활성의 조절에 적용될 수 있다.
이 방법은 또한 예를 들어 프로모터 또는 투입 RNA의 양을 변경하여 넓은 범위에 걸쳐 발현 수준을 조절하는 능력을 제공하여 발현 수준을 개별적으로 조절할 수 있게 한다. 더욱이, PCR 기반의 mRNA 생산 기법은 다양한 구조와 도메인 조합을 갖는 mRNA의 설계를 크게 촉진한다. 본 발명의 RNA 형질감염 방법의 한 가지 이점은 RNA 형질감염이 본질적으로 일시적이며 벡터가 없다는 점이다. RNA 트랜스유전자는 임의의 추가 바이러스 서열이 필요 없는 최소 발현 카세트로서 림프구로 전달되어, 그 안에서 간단한 시험관내 세포 활성화 후 발현될 수 있다. 이러한 조건 하에서, 트랜스유전자는 숙주 세포 게놈으로 통합될 가능성이 거의 없다. RNA의 형질감염 효율 및 전체 림프구 집단을 균일하게 변형하는 능력 때문에 세포 클로닝은 필요하지 않다.
따라서, 본 발명은 본원에 기재되어 있거나 당업자에게 주지된 임의의 유전자 편집 기법을 사용하여 본원에 기재된 하나 이상의 내인성 면역 유전자의 유전자 발현을 하향조절할 수 있는 하나 이상의 핵산을 면역 세포에 도입하는 것을 포함하는, 변형된 면역 세포 또는 이의 전구 세포를 생성하기 위한 방법을 제공한다. TCR α 쇄, TCR β 쇄, CD3δ, CD3ε, CD3γ, HLA-1 분자(예를 들어, 베타-2 마이크로글로불린, TAP1, TAP2, TAPBP 또는 NLRC5) 또는 HLA-II 분자(예를 들어, CIITA, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP 또는 불변 쇄)와 같이, 세포에 대한 면역 반응의 생성에 관여하는 내인성 유전자 발현의 하향조절은 변형된 T 세포의 면역 매개 거부 반응을 감소시킨다. 예를 들어, 내인성 TCR 수용체 성분인 MHC-I 또는 MHC-II, 베타-2 마이크로글로불린, CIITA 유전자 발현의 하향조절은 숙주 면역계에 의한 거부를 일으킬 수 있는 T 세포 상에서의 동종항원 표면 제시를 제거한다. 일부 구현예에서, 내인성 유전자 발현을 하향조절할 수 있는 핵산은 일렉트로포레이션, 형질감염, 렌티- 또는 다른 바이러스 형질도입 등에 의해 T 세포 내로 도입된다. 일부 구현예에서, 본 발명은 내인성 유전자 발현을 하향조절할 수 있는 일렉트로포레이션된 핵산을 포함하는 변형된 T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 바이러스 형질도입에 의해 면역 세포 내로 도입된다. 일부 구현예에서, 바이러스 형질도입은 면역 세포를 하나 이상의 핵산을 포함하는 바이러스 벡터와 접촉시키는 것을 포함한다. 한 구현예에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터, 센다이 바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터 및 렌티바이러스 벡터로 이루어지는 그룹으로부터 선택된다.
B. 면역 세포의 유전자 편집 방법
한 양태에서, 본 개시내용은 CD3δ, CD3ε, CD3γ, B2M, CIITA, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP 및 불변 쇄(Ii 쇄)로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 내인성 면역 단백질을 암호화하는 하나 이상의 내인성 면역 유전자의 유전자 발현을 하향조절할 수 있는 하나 이상의 핵산을 면역 세포에 도입하는 것을 포함하는, 면역 세포를 유전적으로 편집하는 방법을 제공한다. 한 구현예에서, 변형된 면역 세포를 유전적으로 편집하는 방법은 CD3δ, CD3ε 또는 CD3γ로부터 선택된 T 세포 수용체 서브유닛의 유전자 발현을 하향조절할 수 있는 핵산을 면역 세포에 도입하는 것을 포함한다. 한 구현예에서, 변형된 면역 세포를 유전적으로 편집하는 방법은 B2M, TAP1, TAP2, TAPBP 또는 NLRC5로부터 선택된 HLA 부류 I 분자의 유전자 발현을 하향조절할 수 있는 핵산을 면역 세포에 도입하는 것을 포함한다. 한 구현예에서, 변형된 면역 세포를 유전적으로 편집하는 방법은 HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP 또는 불변 쇄(Ii 쇄)로부터 선택된 HLA 부류 II 분자의 유전자 발현을 하향조절할 수 있는 핵산을 면역 세포에 도입하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 면역 세포를 유전적으로 편집하는 방법은 CD3δ의 유전자 발현 및 B2M, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP, 불변 쇄(Ii 쇄) 및 이들의 조합으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 HLA 분자의 유전자 발현을 하향조절할 수 있는 핵산을 면역 세포에 도입하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 세포를 유전적으로 편집하는 방법은 CD3ε의 유전자 발현 및 B2M, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP, 불변 쇄(Ii 쇄) 및 이들의 조합으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 HLA 분자의 유전자 발현을 하향조절할 수 있는 핵산을 면역 세포에 도입하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 세포를 유전적으로 편집하는 방법은 CD3γ의 유전자 발현 및 B2M, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP, 불변 쇄(Ii 쇄) 및 이들의 조합으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 HLA 분자의 유전자 발현을 하향조절할 수 있는 핵산을 면역 세포에 도입하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 세포를 유전적으로 편집하는 방법은 CD3γ의 유전자 발현, 및 CD3ε, B2M 및 CIITA의 유전자 발현을 하향조절할 수 있는 핵산을 면역 세포에 도입하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 면역 세포를 유전적으로 편집하는 방법은 (1) CD3ε, B2M 및 RFX5; (2) CD3ε, B2M 및 RFXAP; (3) CD3ε, B2M 및 RFXANK; (4) CD3ε, B2M 및 HLA-DM; (5) CD3ε, B2M 및 Ii 쇄; (6) CD3ε, TAP1 및 CIITA; (7) CD3ε, TAP1 및 RFX5; (8) CD3ε, TAP1 및 RFXAP; (9) CD3ε, TAP1 및 RFXANK; (10) CD3ε, TAP1 및 HLA-DM; (11) CD3ε, TAP1 및 Ii 쇄; (12) CD3ε, TAP2 및 CIITA; (13) CD3ε, TAP2 및 RFX5; (14) CD3ε, TAP2 및 RFXAP; (15) CD3ε, TAP2 및 RFXANK; (16) CD3ε, TAP2 및 HLA-DM; (17) CD3ε, TAP2 및 Ii 쇄; (18) CD3ε, NLRC5 및 CIITA; (19) CD3ε, NLRC5 및 RFX5; (20) CD3ε, NLRC5 및 RFXAP; (21) CD3ε, NLRC5 및 RFXANK; (22) CD3ε, NLRC5 및 HLA-DM; (23) CD3ε, NLRC5 및 Ii 쇄; (24) CD3ε, TAPBP 및 CIITA; (25) CD3ε, TAPBP 및 RFX5; (26) CD3ε, TAPBP 및 RFXAP; (27) CD3ε, TAPBP 및 RFXANK; (28) CD3ε, TAPBP 및 HLA-DM; 또는 (29) CD3ε, TAPBP 및 Ii 쇄의 유전자 발현을 하향조절할 수 있는 핵산을 면역 세포에 도입하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 면역 세포를 유전적으로 편집하는 방법은 (1) CD3δ, B2M 및 RFX5; (2) CD3δ, B2M 및 RFXAP; (3) CD3δ, B2M 및 RFXANK; (4) CD3δ, B2M 및 HLA-DM; (5) CD3δ, B2M 및 Ii 쇄; (6) CD3δ, TAP1 및 CIITA; (7) CD3δ, TAP1 및 RFX5; (8) CD3δ, TAP1 및 RFXAP; (9) CD3δ, TAP1 및 RFXANK; (10) CD3δ, TAP1 및 HLA-DM; (11) CD3δ, TAP1 및 Ii 쇄; (12) CD3δ, TAP2 및 CIITA; (13) CD3δ, TAP2 및 RFX5; (14) CD3δ, TAP2 및 RFXAP; (15) CD3δ, TAP2 및 RFXANK; (16) CD3δ, TAP2 및 HLA-DM; (17) CD3δ, TAP2 및 Ii 쇄; (18) CD3δ, NLRC5 및 CIITA; (19) CD3δ, NLRC5 및 RFX5; (20) CD3δ, NLRC5 및 RFXAP; (21) CD3δ, NLRC5 및 RFXANK; (22) CD3δ, NLRC5 및 HLA-DM; (23) CD3δ, NLRC5 및 Ii 쇄; (24) CD3δ, TAPBP 및 CIITA; (25) CD3δ, TAPBP 및 RFX5; (26) CD3δ, TAPBP 및 RFXAP; (27) CD3δ, TAPBP 및 RFXANK; (28) CD3δ, TAPBP 및 HLA-DM; 또는 (29) CD3δ, TAPBP 및 Ii 쇄의 유전자 발현을 하향조절할 수 있는 핵산을 면역 세포에 도입하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 면역 세포를 유전적으로 편집하는 방법은 (1) CD3γ, B2M 및 RFX5; (2) CD3γ, B2M 및 RFXAP; (3) CD3γ, B2M 및 RFXANK; (4) CD3γ, B2M 및 HLA-DM; (5) CD3γ, B2M 및 Ii 쇄; (6) CD3γ, TAP1 및 CIITA; (7) CD3γ, TAP1 및 RFX5; (8) CD3γ, TAP1 및 RFXAP; (9) CD3γ, TAP1 및 RFXANK; (10) CD3γ, TAP1 및 HLA-DM; (11) CD3γ, TAP1 및 Ii 쇄; (12) CD3γ, TAP2 및 CIITA; (13) CD3γ, TAP2 및 RFX5; (14) CD3γ, TAP2 및 RFXAP; (15) CD3γ, TAP2 및 RFXANK; (16) CD3γ, TAP2 및 HLA-DM; (17) CD3γ, TAP2 및 Ii 쇄; (18) CD3γ, NLRC5 및 CIITA; (19) CD3γ, NLRC5 및 RFX5; (20) CD3γ, NLRC5 및 RFXAP; (21) CD3γ, NLRC5 및 RFXANK; (22) CD3γ, NLRC5 및 HLA-DM; (23) CD3γ, NLRC5 및 Ii 쇄; (24) CD3γ, TAPBP 및 CIITA; (25) CD3γ, TAPBP 및 RFX5; (26) CD3γ, TAPBP 및 RFXAP; (27) CD3γ, TAPBP 및 RFXANK; (28) CD3γ, TAPBP 및 HLA-DM 또는 (29) CD3γ, TAPBP 및 Ii 쇄의 유전자 발현을 하향조절할 수 있는 핵산을 면역 세포에 도입하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 면역 세포를 유전적으로 편집하는 방법은 안티센스 RNA, 안티고머 RNA, siRNA, shRNA 및 CRISPR 시스템으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 유전자 편집 시스템을 포함하는 유전자 발현을 하향조절할 수 있는 핵산을 면역 세포에 도입하는 것을 포함한다. 내인성 면역 유전자 발현은 예를 들어 안티센스 RNA, 안티고머 RNA, siRNA, shRNA, CRISPR 시스템 등에 의해 하향조절, 녹다운, 감소 및/또는 억제될 수 있다. 한 구현예에서, 면역 세포의 유전자 편집 방법은 CRISPR-연관(Cas)(CRISPR-Cas) 엔도뉴클레아제 시스템 및 안내 RNA를 포함하는 유전자 발현을 하향조절할 수 있는 핵산을 면역 세포에 도입하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 발현을 하향조절할 수 있는 핵산은 Cas3, Cas4, Cas8a, Cas8b, Cas9, Cas10, Cas10d, Cas12a, Cas12b, Cas12d, Cas12e, Cas12f, Cas12g, Cas12h, Cas12i, Cas13, Cas14, CasX, Cse1, Csy1, Csn2, Cpf1, C2c1, Csm2, Cmr5, Fok1, 에스 피오게네스 Cas9(spCas9), 스타필로코커스 아우레우스 Cas9(saCas9), MAD7 뉴클레아제(V형 CRISPR 뉴클레아제) 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 Cas 엔도뉴클레아제를 포함한다. 세포를 유전적으로 편집하는 방법은 당업계에 주지되어 있으며 본원에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 면역 세포를 유전적으로 편집하는 방법은 CRISPR/Cas를 면역 세포에 도입하여 변형된 세포(예를 들어, 변형된 T 세포)에서 하나 이상의 내인성 면역 유전자를 붕괴시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR/Cas9는 CD3δ, CD3ε, CD3γ, B2M, CIITA, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP 및 불변 쇄(Ii 쇄)로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 내인성 면역 단백질 중 하나 이상을 붕괴시키는 데 사용된다. 특정한 예시적 구현예에서, CRISPR/Cas9는 내인성 CD3δ, CD3ε, CD3γ, B2M, CIITA, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP 및 불변 쇄(Ii 쇄) 중 하나 이상을 붕괴시켜, CD3δ, CD3ε, CD3γ, B2M, CIITA, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP 및 불변 쇄(Ii 쇄)의 하향조절을 발생시키는 데 사용된다. 내인성 TRAC, TRBC, B2M, CIITA 및/또는 PD1 중 하나 이상을 붕괴시키는데 사용하기에 적합한 gRNA는 도 26 및 27에 제시되어 있다. 일부 구현예에서, 면역 세포를 유전적으로 편집하는 방법은 CRISPR/Cas 및 안내 RNA를 면역 세포에 도입하여 변형된 세포(예를 들어, 변형된 T 세포)에서 하나 이상의 내인성 면역 유전자를 붕괴시키는 것을 포함한다. 한 구현예에서, 면역 세포를 유전적으로 편집하는 방법은 CRISPR/Cas 및 안내 RNA를 면역 세포에 도입하는 것을 포함하며, 안내 RNA는 CD3δ, CD3ε, CD3γ, B2M, CIITA, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP 및 불변 쇄(Ii 쇄)로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자좌 내의 서열과 상보적인 안내 서열을 포함한다. 내인성 CD3δ, CD3ε, CD3γ, B2M, CIITA, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP 및 불변 쇄(Ii 쇄) 중 하나 이상을 붕괴시키는 데 사용하기에 적합한 안내 RNA(gRNA)는 표 4에 제시되어 있다.
한 구현예에서, 면역 세포의 유전자 편집 방법은 TALEN 유전자 편집 시스템을 포함하는 유전자 발현을 하향조절할 수 있는 핵산을 면역 세포 내로 도입하는 것을 포함한다. 한 구현예에서, 면역 세포의 유전자 편집 방법은 아연 집게 뉴클레아제(ZFN) 유전자 편집 시스템을 포함하는 유전자 발현을 하향조절할 수 있는 핵산을 면역 세포에 도입하는 것을 포함한다. 한 구현예에서, 면역 세포의 유전자 편집 방법은 메가뉴클레아제 유전자 편집 시스템을 포함하는 유전자 발현을 하향조절할 수 있는 핵산을 면역 세포에 도입하는 것을 포함한다. 한 구현예에서, 면역 세포의 유전자 편집 방법은 메가-TALEN 유전자 편집 시스템을 포함하는 유전자 발현을 하향조절할 수 있는 핵산을 면역 세포 내로 도입하는 것을 포함한다. 한 구현예에서, 변형된 면역 세포의 유전자 편집 방법은 안티센스 RNA, 안티고머 RNA, RNAi, siRNA 또는 shRNA로부터 선택된 유전자 침묵 시스템을 포함하는 유전자 발현을 하향조절할 수 있는 핵산을 면역 세포에 도입하는 것을 포함한다.
C. 변형된 면역 세포의 확장
더욱 또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 변형된 T 세포를 생성하는 방법은 변형된 T 세포의 집단을 생성하기 위해 변형된 면역 세포를 확장시키는 것을 추가로 포함한다. CAR, TCR, 우성 음성 수용체 및/또는 전환 수용체를 발현하기 위한 면역 세포의 변형 전 또는 후에, 변형된 세포를 당업계에 공지된 방법을 사용하여 활성화하고 그 수를 확장시킬 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 면역 세포를 CD3/TCR 복합체 관련 신호를 자극하는 작용제 및 변형된 면역 세포 표면의 공동자극 분자를 자극하는 리간드가 부착된 표면과의 접촉에 의해 확장시킬 수 있다. 특히, 변형된 면역 세포 집단을 항-CD3 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 표면에 고정화된 항-CD2 항체와의 접촉에 의해, 또는 칼슘 이온운반체와 함께 단백질 키나제 C 활성제(예를 들어, 브리오스타틴)와의 접촉에 의해 자극할 수 있다. 변형된 면역 세포 표면의 보조 분자를 공동 자극하기 위해 보조 분자에 결합하는 리간드가 사용된다. 예를 들어, 변형된 면역 세포를 면역 세포의 증식을 자극하기에 적합한 조건 하에서 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 접촉시킬 수 있다. 항-CD28 항체의 예에는 9.3, B-T3, XR-CD28(Diaclone, Besancon, France)이 포함되며, 이들은 당업계에 공지된 다른 방법 및 시약과 마찬가지로 본 발명에 사용될 수 있다.
본원에 개시된 방법에 의해 변형된 면역 세포를 확장시키는 것은 약 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배, 200배, 300배, 400배, 500배, 600배, 700배, 800배, 900배, 1000배, 2000배, 3000배, 4000배, 5000배, 6000배, 7000배, 8000배, 9000배, 10,000배, 100,000배, 1,000,000배, 10,000,000배 또는 그 이상, 및 그 사이의 모든 정수 또는 부분 정수만큼 배가될 수 있다. 한 구현예에서, 변형된 면역 세포는 약 20배 내지 약 50배 범위로 확장된다.
배양 후, 변형된 면역 세포를, 세포가 다른 배양 기구로 통과하기 전에 일정 기간 동안 또는 최적의 계대배양을 위해 세포가 컨플루언시(confluency) 또는 높은 세포 밀도에 도달할 때까지 배양 기구의 세포 배지에서 배양할 수 있다. 배양 기구는 시험관 내에서 세포를 배양하기 위해 통상적으로 사용되는 임의의 배양 기구일 수 있다. 바람직하게는, 세포를 다른 배양 기구로 통과시키기 전에 컨플루언시 수준이 70% 이상이다. 더욱 바람직하게 컨플루언시 수준은 90% 이상이다. 일정 기간은 시험관내 세포 배양에 적합한 임의의 시간일 수 있다. 면역 세포 배지는 면역 세포 배양 중에 언제든지 교체될 수 있다. 바람직하게, 면역 세포 배지는 약 2 내지 3일마다 교체된다. 이어서 면역 세포를 배양 기구로부터 수확하고, 변형된 면역 세포를 즉시 사용하거나 나중에 사용하기 위해 동결보존(cryopreserving)할 수 있다. 한 구현예에서, 본 발명은 확장된 변형 면역 세포를 동결보존하는 것을 포함한다. 동결보존된 면역 세포는 면역 세포에 핵산을 도입하기 전에 해동된다.
다른 구현예에서, 방법은 면역 세포를 단리하고 면역 세포를 확장시키는 것을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 확장 전에 면역 세포를 동결보존하는 것을 추가로 포함한다. 또 다른 구현예에서, 동결보존된 면역 세포는 키메라 막 단백질을 암호화하는 RNA를 이용한 일렉트로포레이션을 위해 해동된다.
또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 변형된 T 세포를 생성하는 방법은 변형된 면역 세포를 생체외에서 확장시키는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포의 생체외 배양 및 확장은 세포 성장 인자의 첨가를 포함한다. 그러나, flt3-L, IL-1, IL-3 및 c-kit 리간드와 같은 다른 인자도 추가할 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 T 세포를 확장시키는 것은 변형된 T 세포를 flt3-L, IL-1, IL-3, IL-2, IL-7, IL-15, IL-18, IL-21, TGF베타, IL-10 및 c-kit 리간드로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 인자와 함께 배양하는 것을 포함한다. 본원에 기재된 바와 같은 배양 단계(본원에 기재된 바와 같은 작용제와의 접촉 또는 일렉트로포레이션 후)는 매우 짧을 수 있으며, 예를 들어 24시간 미만, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23시간일 수 있다. 배양 단계는 더 길 수 있으며, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14일 이상일 수 있다.
다양한 용어를 사용하여 배양 중인 세포를 기재한다. 세포 배양은 일반적으로, 살아있는 유기체로부터 채취하여 조절된 조건에서 성장된 세포를 지칭한다. 1차 세포 배양은 유기체로부터 직접 채취한 세포, 조직 또는 장기의 배양으로, 첫 번째 계대배양 이전에 이루어진다. 세포는 세포 성장 및/또는 분열을 촉진하는 조건 하에서 성장 배지에 배치될 때 배양물에서 확장되어, 더 큰 세포 집단을 생성시킨다. 세포가 배양물에서 확장될 때, 세포 증식 속도는 전형적으로 세포 수가 2배가 되는 데 필요한 시간의 양, 즉 배가 시간으로서 공지된 양에 의해 측정된다.
면역 세포 배양에 적합한 조건에는 혈청(예를 들어, 소 태아 또는 인간 혈청), 인터류킨-2(IL-2), 인슐린, IFN-감마, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGF-베타 및 TNF-a 또는 당업자에게 공지된 세포 성장을 위한 임의의 다른 첨가제를 포함하여, 증식 및 생존에 필요한 인자를 함유할 수 있는 적절한 배지(예를 들어, 최소 필수 배지 또는 RPMI 배지 1640, 또는 X-vivo 15, (Lonza))가 포함된다. 세포 성장을 위한 다른 첨가제로는 계면활성제, 플라스마네이트, N-아세틸-시스테인 및 2-머캅토에탄올과 같은 환원제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
배지에는 무혈청이거나 또는 적절한 양의 혈청(또는 혈장) 또는 정의된 호르몬 세트 및/또는 면역 세포의 성장 및 확장에 충분한 양의 사이토카인(들)이 보충된, 아미노산, 나트륨 피루베이트, 비타민이 첨가된 RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 15 및 X-Vivo 20, Optimizer가 포함될 수 있다. 항생제, 예를 들어 페니실린 및 스트렙토마이신은 단지 실험 배양에만 포함되며, 대상체에게 주입될 세포 배양물에는 포함되지 않는다. 표적 세포는 성장을 지원하는 데 필요한 조건, 예를 들어 적절한 온도(예를 들어, 37℃) 및 분위기(예를 들어, 공기 + 5% CO2) 하에서 유지된다.
면역 세포를 배양하는 데 사용되는 배지에는 면역 세포를 공동 자극할 수 있는 물질이 포함될 수 있다. 예를 들어, CD3을 자극할 수 있는 작용제는 CD3에 대한 항체이고, CD28을 자극할 수 있는 작용제는 CD28에 대한 항체이다. 이는 본원에 개시된 데이터에 의해 입증된 바와 같이, 본원에 개시된 방법에 의해 단리된 세포가 대략 약 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배, 200배, 300배, 400배, 500배, 600배, 700배, 800배, 900배, 1000배, 2000배, 3000배, 4000배, 5000배, 6000배, 7000배, 8000배, 9000배, 10,000배, 100,000배, 1,000,000배, 10,000,000배 또는 그 이상 확장될 수 있기 때문이다. 한 구현예에서, 면역 세포는 일렉트로포레이션된 집단을 배양함으로써 약 20배 내지 약 50배 또는 그 이상의 범위로 확장된다. 한 구현예에서, 인간 T 조절 세포는 항-CD3 항체 코팅된 KT64.86 인공 항원 제시 세포(aAPC)를 통해 확장된다. 면역 세포를 확장하고 활성화하는 방법은 미국특허 7,754,482, 8,722,400 및 9,555,105에서 찾을 수 있으며, 그 내용은 전체가 본원에 포함된다.
D. 면역 세포의 공급원
확장 전에, 생체외 조작을 위해 대상체로부터 면역 세포의 공급원을 획득한다. 생체외 조작을 위한 표적 세포의 공급원은 또한 예를 들어 자기유래 또는 이종 공여자 혈액, 제대혈 또는 골수를 포함할 수 있다. 예를 들어, 면역 세포의 공급원은 본 발명의 변형된 면역 세포로 치료할 대상체, 예를 들어 대상체의 혈액, 대상체의 제대혈 또는 대상체의 골수로부터 유래할 수 있다. 대상체의 비제한적인 예에는 인간, 개, 고양이, 마우스, 래트 및 이들의 트랜스제닉 종이 포함된다. 바람직하게, 대상체는 인간이다.
면역 세포는 혈액, 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 비장 조직, 탯줄, 림프 또는 림프 기관을 포함한 다양한 공급원으로부터 수득될 수 있다. 면역 세포는 선천성 또는 적응성 면역 세포, 예를 들어 림프구를 포함한 골수성 또는 림프성 세포, 전형적으로 T 세포 및/또는 NK 세포와 같은 면역계의 세포이다. 다른 예시적인 세포에는 유도 만능 줄기 세포(iPSC)를 비롯한 만능성 및 다능성 줄기 세포와 같은 줄기 세포가 포함된다. 일부 양태에서, 세포는 인간 세포이다. 치료할 대상체와 관련하여, 세포는 동종이계 및/또는 자기유래일 수 있다. 세포는 전형적으로 대상체로부터 직접 단리되고/되거나 대상체로부터 단리되어 동결된 세포와 같은 1차 세포이다.
특정 구현예에서, 면역 세포는 T 세포, 예를 들어 CD8+ T 세포(예를 들어 CD8+ 미경험 T 세포, 중심 기억 T 세포 또는 효과기 기억 T 세포), CD4+ T 세포, 자연 살해 T 세포(NKT 세포), 조절 T 세포(Treg), 줄기 세포 기억 T 세포, 림프 전구 세포, 조혈 줄기 세포, 자연 살해 세포(NK 세포) 또는 수지상 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 단핵구 또는 과립구, 예를 들어 골수 세포, 대식세포, 호중구, 수지상 세포, 비만 세포, 호산구 및/또는 호염기구이다. 한 구현예에서, 표적 세포는 유도 만능 줄기(iPS) 세포 또는 iPS 세포로부터 유래된 세포, 예를 들어 하나 이상의 표적 유전자의 발현을 변경(예를 들어 돌연변이 유도)하거나 조작하기 위해 조작되고, 예를 들어 T 세포, 예를 들어 CD8+ T 세포(예를 들어, CD8+ 미경험 T 세포, 중심 기억 T 세포 또는 효과기 기억 T 세포), CD4+ T 세포, 줄기 세포 기억 T 세포, 림프 전구 세포 또는 조혈 줄기 세포로 분화된, 대상체로부터 생성된 iPS 세포이다.
일부 구현예에서, 세포는 T 세포 또는 다른 세포 유형의 하나 이상의 하위 집합, 예를 들어 전체 T 세포 집단, CD4+ 세포, CD8+ 세포 및 이의 하위 집단, 예를 들어 기능, 활성화 상태, 성숙도, 분화 잠재성, 확장, 재순환, 국소화 및/또는 지속 능력, 항원-특이성, 항원 수용체 유형, 특정 기관 또는 구획에서의 존재, 마커 또는 사이토카인 분비 프로파일 및/또는 분화도에 의해 정의된 것을 포함한다.
T 세포 및/또는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 하위 유형 및 하위집단 중에는 미경험 T(TN) 세포, 효과기 T 세포(TEFF), 기억 T 세포 및 이의 하위유형, 예를 들어 줄기 세포 기억 T(TSCM), 중심 기억 T(TCM), 효과기 기억 T(TEM) 또는 최종 분화 효과기 기억 T 세포, 종양-침윤 림프구(TIL), 미성숙 T 세포, 성숙 T 세포, 헬퍼 T 세포, 세포독성 T 세포, 점막-관련 불변 T(MAIT) 세포, 자연 발생 및 적응성 조절 T(Treg) 세포, 헬퍼 T 세포, 예를 들어, TH1 세포, TH2 세포, TH3 세포, TH17 세포, TH9 세포, TH22 세포, 여포성 헬퍼 T 세포, 알파/베타 T 세포, 및 델타/감마 T 세포가 있다. 특정 구현예에서, 당업계에서 이용가능한 임의의 수의 T 세포주가 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 방법은 대상체로부터 면역 세포를 단리하고, 이를 제조하고, 가공하고, 배양하고/하거나 조작하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 조작된 세포의 제조는 하나 이상의 배양 및/또는 제조 단계를 포함한다. 기재된 바와 같은 조작을 위한 세포는 생물학적 샘플, 예를 들어 대상체로부터 수득되거나 유래된 것과 같은 샘플로부터 단리될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포가 단리된 대상체는 질환 또는 상태를 갖고 있거나 세포 요법이 필요하거나 세포 요법이 투여될 대상체이다. 일부 구현예에서 대상체는 세포가 단리되고, 가공되고/되거나 조작되는 입양 세포 요법과 같은 특별한 치료적 개입이 필요한 인간이다. 따라서, 일부 구현예에서 세포는 1차 세포, 예를 들어 1차 인간 세포이다. 샘플에는 대상체로부터 직접 채취한 조직, 체액 및 기타 샘플뿐만 아니라 분리, 원심분리, 유전공학(예를 들어, 바이러스 벡터를 이용한 형질도입), 세척 및/또는 배양과 같은 하나 이상의 가공 단계에서 생성된 샘플이 포함된다. 생물학적 샘플은 생물학적 공급원으로부터 직접 수득된 샘플이거나 가공된 샘플일 수 있다. 생물학적 샘플에는 혈액, 혈장, 혈청, 뇌척수액, 윤활액, 소변 및 땀과 같은 체액, 조직 및 기관 샘플(이로부터 유래된 가공된 샘플 포함)이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
특정 양태에서, 면역 세포가 유래되거나 단리되는 샘플은 혈액 또는 혈액 유래 샘플이거나 성분채집 또는 백혈구 성분채집 생성물이거나 이로부터 유래된다. 예시적인 샘플에는 전혈, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 백혈구, 골수, 흉선, 조직 생검, 종양, 백혈병, 림프종, 림프절, 장 관련 림프 조직, 점막 관련 림프 조직, 비장, 기타 림프 조직, 간, 폐, 위, 장, 결장, 신장, 췌장, 유방, 뼈, 전립선, 자궁 경부, 고환, 난소, 편도선, 또는 기타 기관 및/또는 이로부터 유래된 세포가 포함된다. 샘플에는 세포 요법, 예를 들어 입양 세포 요법과 관련하여 자기유래 및 동종이계 공급원의 샘플이 포함된다.
일부 구현예에서, 세포는 세포주, 예를 들어 T 세포주로부터 유래된다. 일부 구현예에서 세포는 이종 공급원, 예를 들어 마우스, 래트, 비-인간 영장류 및 돼지로부터 수득된다. 일부 구현예에서, 세포의 단리는 하나 이상의 제조 및/또는 비-친화성 기반 세포 분리 단계를 포함한다. 일부 예에서, 예를 들어 원치 않는 성분을 제거하고, 원하는 성분을 농축시키고, 특정 시약에 민감한 세포를 용해 또는 제거하기 위해 세포를 세척하고, 원심분리하고/하거나 하나 이상의 시약의 존재 하에서 배양한다. 일부 예에서, 세포는 밀도, 부착 특성, 크기, 민감도 및/또는 특정 성분에 대한 내성과 같은 하나 이상의 특성을 기준으로 분리된다.
일부 예에서, 대상체의 순환 혈액으로부터 세포를, 예를 들어 성분채집술 또는 백혈구 성분채집술에 의해 수득한다. 특정 양태에서 샘플은 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 기타 유핵 백혈구, 적혈구 및/또는 혈소판을 포함하는 림프구를 포함하고, 특정 양태에서는 적혈구 및 혈소판 이외의 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 예를 들어 혈장 분획을 제거하고 세포를 후속 가공 단계를 위해 적절한 완충액 또는 배지에 넣기 위해 대상체로부터 수집된 혈액 세포를 세척한다. 일부 구현예에서, 세포를 포스페이트 완충된 식염수(PBS)로 세척한다. 일부 경우에, 제조사의 설명서에 따라 접선유동여과(TFF)를 통해 세척 단계를 수행한다. 특정 구현예에서, 세포를 세척 후 다양한 생체적합성 완충액에 재현탁한다. 특정 구현예에서, 혈액 세포 샘플의 성분을 제거하고 세포를 배양 배지에 직접 재현탁한다. 일부 구현예에서, 방법은 밀도 기반 세포 분리 방법, 예를 들어 적혈구를 용해시키고 Percoll 또는 Ficoll 구배를 통한 원심분리에 의해 말초혈로부터 백혈구를 제조하는 방법을 포함한다.
한 구현예에서, 면역 세포는 성분채집술 또는 백혈구 성분채집술에 의해 개인의 순환 혈액으로부터 수득된다. 성분채집 생성물은 일반적으로 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 기타 유핵 백혈구, 적혈구 및 혈소판을 포함한 림프구를 함유한다. 성분채집술에 의해 수집된 세포를 후속 가공 단계를 위해 세척하여 혈장 분획을 제거하고 적절한 완충액 또는 배지, 예를 들어 칼슘이 없고 마그네슘이 없거나 또는 모든 2가 양이온은 아니지만 다수가 없을 수도 있는 포스페이트 완충된 식염수(PBS) 또는 세척액에 세포를 넣을 수 있다. 당업자라면 쉽게 알 수 있는 바와 같이, 세척 단계를, 예를 들어 반자동 "병류(flow-through)" 원심분리기(예를 들어, Cobe 2991 cell processor, the Baxter CytoMate, 또는 the Haemonetics Cell Saver 5)를 사용하여 제조사의 설명서에 따라 수행할 수 있다. 세척 후, 세포를 다양한 생체적합성 완충액, 예를 들어 Ca2+ 무함유, Mg2+ 무함유 PBS, PlasmaLyte A, 또는 완충액이 있거나 없는 다른 식염수 용액에 재현탁할 수 있다. 일부 구현예에서, 성분채집 샘플의 바람직하지 않은 성분을 제거하고 세포를 배양 배지에 직접 재현탁할 수 있다.
일부 구현예에서, 단리 방법은 하나 이상의 특정 분자, 예를 들어 표면 마커, 예를 들어 표면 단백질, 세포내 마커 또는 핵산의 세포 내 발현 또는 존재에 기반한 상이한 세포 유형의 분리를 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 마커에 기반한 임의의 공지된 분리 방법이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 분리는 친화성 기반 또는 면역친화성 기반 분리이다. 예를 들어, 특정 양태에서의 단리에는 예를 들어 마커에 특이적으로 결합하는 항체 또는 결합 상대와의 배양에 이어서, 세척 단계 및 상기 항체 또는 결합 상대에 결합하지 않은 세포로부터 상기 항체 또는 결합 상대에 결합한 세포의 분리에 의한, 세포의 발현 또는 하나 이상의 마커, 전형적으로 세포 표면 마커의 발현 수준을 기반으로 하는 세포 및 세포 집단의 분리가 포함된다. 이러한 분리 단계는, 시약에 결합된 세포가 추가 사용을 위해 유지되는 양성 선택, 및/또는 항체 또는 결합 상대에 결합되지 않은 세포가 유지되는 음성 선택에 기반할 수 있다. 일부 예에서는 추가 사용을 위해 두 분획이 모두 유지된다. 특정 양태에서, 음성 선택은, 이종 집단에서 세포 유형을 특이적으로 식별하는 항체를 이용할 수 없는 경우에 특히 유용할 수 있으며, 이와 같은 분리는 원하는 집단 이외의 세포에 의해 발현되는 마커에 기반하여 가장 잘 수행된다. 분리는 특정 세포 집단 또는 특정 마커를 발현하는 세포가 100% 농축되거나 제거될 필요는 없다. 예를 들어, 마커를 발현하는 것과 같은 특정 유형의 세포에 대한 양성 선택 또는 농축은 그러한 세포의 수 또는 백분율을 증가시키는 것을 의미하지만, 마커를 발현하지 않는 세포가 완전히 없을 필요는 없다. 마찬가지로, 마커를 발현하는 것과 같은 특정 유형의 세포의 음성 선택, 제거 또는 고갈은 그러한 세포의 수 또는 백분율을 감소시키는 것을 지칭하지만 그러한 세포가 모두 완전히 제거될 필요는 없다. 특정한 예시적 구현예에서, 다수의 분리 단계가 수행되며, 여기서 한 단계로부터 양성 또는 음성으로 선택된 분획은 후속 양성 또는 음성 선택과 같은 또 다른 분리 단계를 거치게 된다. 특정한 예시적 구현예에서, 단일 분리 단계는, 예를 들어 음성 선택을 위해 표적화된 마커에 각각 특이적인 다수의 항체 또는 결합 상대와 세포를 배양함으로써 동시에 다중 마커를 발현하는 세포를 고갈시킬 수 있다. 마찬가지로, 다양한 세포 유형에서 발현되는 다수의 항체 또는 결합 상대와 함께 세포를 배양함으로써 다수의 세포 유형을 동시에 양으로 선택할 수 있다.
일부 구현예에서, T 세포 집단 중 하나 이상은 하나 이상의 특정 마커, 예를 들어 표면 마커에 대해 양성(markeri-)이거나 높은 수준(마커high)을 발현하는 세포, 또는 하나 이상의 마커에 대해 음성(마커-)이거나 상대적으로 낮은 수준(마커low)을 발현하는 세포가 풍부하거나 고갈된다. 예를 들어, 특정 양태에서, T 세포의 특정 하위집단, 예를 들어 하나 이상의 표면 마커에 양성이거나 이를 높은 수준으로 발현하는 세포, 예를 들어 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및/또는 CD45RO+ T 세포를 양성 또는 음성 선택 기법에 의해 단리한다. 일부 경우에, 이러한 마커는 특정 T 세포 집단(예를 들어, 비-기억 세포)에서는 없거나 상대적으로 낮은 수준으로 발현되지만, 다른 특정 T 세포 집단(예를 들어, 기억 세포)에서는 상대적으로 더 높은 수준으로 존재하거나 발현되는 것들이다. 한 구현예에서, 세포(예를 들어 CD8+ 세포 또는 T 세포, 예를 들어 CD3+ 세포)는 양성이거나 높은 표면 수준의 CD45RO, CCR7, CD28, CD27, CD44, CD127 및/또는 CD62L을 발현하는 세포가 농축되고(즉 양성으로 선택되고)/되거나 CD45RA에 대해 양성이거나 이를 높은 표면 수준으로 발현하는 세포가 고갈된다(예를 들어, 음성으로 선택된다). 일부 구현예에서, 세포는 CD122, CD95, CD25, CD27 및/또는 IL7-Ra(CD127)에 양성이거나 이를 높은 표면 수준으로 발현하는 세포가 농축되거나 고갈된다. 특정한 예시적인 구현예에서, CD8+ T 세포는 CD45RO(또는 CD45RA에 대해 음성) 및 CD62L에 대해 양성인 세포가 농축된다. 예를 들어, CD3+, CD28+ T 세포는 CD3/CD28 접합된 자기 비드(예를 들어, DYNABEADS® M -450 CD3/CD28 T 세포 확장기)를 사용하여 양으로 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, T 세포는 비-T 세포, 예를 들어 B 세포, 단핵구, 또는 CD14와 같은 기타 백혈구 상에서 발현되는 마커의 음성 선택에 의해 PBMC 샘플로부터 분리된다. 특정 양태에서, CD4+ 또는 CD8+ 선택 단계는 CD4+ 헬퍼 및 CD8+ 세포독성 T 세포를 분리하는 데 사용된다. 이러한 CD4+ 및 CD8+ 집단은 하나 이상의 미경험, 기억 및/또는 효과기 T 세포 하위 집단에서 발현되거나 또는 비교적 더 높은 정도로 발현되는 마커에 대한 양성 또는 음성 선택에 의해 하위집단들로 추가로 분류될 수 있다. 일부 구현예에서, CD8+ 세포는 예를 들어 각각의 하위집단과 연관된 표면 항원에 기초한 양성 또는 음성 선택에 의해 미경험, 중심 기억, 효과기 기억 및/또는 중심 기억 줄기 세포가 추가로 농축되거나 고갈된다. 일부 구현예에서, 중심 기억 T(TCM) 세포에 대한 농축은 투여 후 장기 생존, 확장 및/또는 생착을 개선하는 것과 같이 효능을 증가시키기 위해 수행되며, 이는 특정 양태에서 이러한 하위집단에서 특히 확고하다.
일부 구현예에서, TCM-농축된 CD8+ T 세포와 CD4+ T 세포를 조합하면 효능이 더욱 향상된다. 일부 구현예에서, 기억 T 세포는 CD8+ 말초혈액 림프구의 CD62L+ 및 CD62L- 하위집합 둘 다에 존재한다. PBMC는 예를 들어 항-CD8 및 항-CD62L 항체를 사용하여, CD62L-CD8+ 및/또는 CD62L+CD8+ 분획을 농축시키거나 고갈시킬 수 있다. 일부 구현예에서, CD4+ T 세포 집단 및/또는 CD8+ T 집단은 중심 기억(TCM) 세포가 농축된다. 일부 구현예에서, 중심 기억 T(TCM) 세포의 농축은 CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CDS 및/또는 CD127의 양성 또는 높은 표면 발현에 기반하고; 특정 양태에서 이는 CD45RA 및/또는 그랜자임 B를 발현하거나 고도로 발현하는 세포에 대한 음성 선택에 기반한다. 특정 양태에서, TCM 세포가 농축된 CD8+ 집단의 단리는 CD4, CD14, CD45RA를 발현하는 세포의 고갈 및 CD62L을 발현하는 세포에 대한 양성 선택 또는 농축에 의해 수행된다. 한 양태에서, 중심 기억 T(TCM) 세포의 농축은, CD14 및 CD45RA의 발현을 기반으로 한 음성 선택 및 CD62L에 기반한 양성 선택이 가해진 CD4 발현을 기반으로 선택된 세포의 음성 분획으로 시작하여 수행된다. 특정 양태에서 이러한 선택은 동시에 수행되며 다른 양태에서는 어느 순서로든 순차적으로 수행된다. 일부 경우에, CD8+ 세포 집단 또는 하위 집단을 제조하는 데 사용된 것과 동일한 CD4 발현 기반 선택 단계가 또한 CD4+ 세포 집단 또는 하위-집단을 생성하는 데에도 사용되어, CD4 기반 분리로부터의 양성 및 음성 분획이 모두 유지되고, 선택적으로 하나 이상의 추가의 양성 또는 음성 선택 단계 후에, 방법의 후속 단계에 사용된다.
CD4+ T 헬퍼 세포를, 세포 표면 항원이 있는 세포 집단을 식별하여 미경험, 중심 기억, 및 효과기 세포로 분류한다. CD4+ 림프구를 표준 방법으로 수득할 수 있다. 일부 구현예에서, 미경험 CD4+ T 림프구는 CD45RO-, CD45RA+, CD62L+, CD4+ T 세포이다. 일부 구현예에서, 중심 기억 CD4+ 세포는 CD62L+ 및 CD45RO+이다. 일부 구현예에서, 효과기 CD4+ 세포는 CD62L- 및 CD45RO이다. 한 예에서, 음성 선택을 통해 CD4+ 세포를 농축시키기 위해 단클론 항체 칵테일은 전형적으로 CD14, CD20, CD11b , CD16, HLA-DR 및 CDS에 대한 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 결합 상대를, 양성 및/또는 음성 선택을 위한 세포의 분리를 허용하기 위해 자기 비드 또는 상자성 비드와 같은 고체 지지체 또는 매트릭스에 결합시킨다.
일부 구현예에서, 세포를 유전 공학 이전에 또는 이와 관련하여 배양 및/또는 재배한다. 배양 단계에는 배양, 재배, 자극, 활성화 및/또는 번식이 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물 또는 세포를 자극 조건 또는 자극제의 존재 하에서 배양한다. 이러한 조건에는 집단 내 세포의 증식, 확장, 활성화 및/또는 생존을 유도하고, 항원 노출을 모방하고/하거나 재조합 항원 수용체의 도입과 같은 유전 공학을 위해 세포를 프라이밍하도록 고안된 조건이 포함된다. 조건은 특정 배지, 온도, 산소 함량, 이산화탄소 함량, 시간, 작용제, 예를 들어 영양소, 아미노산, 항생제, 이온, 및/또는 자극 인자, 예를 들어, 사이토카인, 케모카인, 항원, 결합 상대, 융합 단백질, 재조합 가용성 수용체, 및 세포를 활성화하도록 설계된 기타 작용제 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 자극 조건 또는 작용제는 TCR 복합체의 세포내 신호전달 도메인을 활성화할 수 있는 하나 이상의 작용제, 예를 들어 리간드를 포함한다. 특정 양태에서, 작용제는 T 세포에서 TCR/CD3 세포내 신호전달 캐스케이드를 켜거나 개시시킨다. 이러한 작용제에는 예를 들어 비드와 같은 고체 지지체 및/또는 하나 이상의 사이토카인에 결합된 TCR 성분 및/또는 공동자극 수용체, 예를 들어 항-CD3, 항-CD28에 특이적인 항체와 같은 항체가 포함될 수 있다. 선택적으로, 확장 방법은 항-CD3 및/또는 항CD28 항체를 배양 배지에 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다(예를 들어, 적어도 약 0.5 ng/㎖의 농도로). 일부 실시예에서, 자극제는 IL-2 및/또는 IL-15, 예를 들어 적어도 약 10 단위/㎖의 IL-2 농도를 포함한다.
다른 구현예에서, T 세포를 예를 들어 PERCOLL™ 구배를 통한 원심분리에 의해 적혈구를 용해시키고 단핵구를 고갈시킴으로써 말초 혈액으로부터 단리한다. 대안적으로, T 세포를 탯줄로부터 단리할 수 있다. 어쨌든, T 세포의 특정 하위 집단을 양성 또는 음성 선택 기법을 통해 추가로 단리할 수 있다.
이렇게 단리된 제대혈 단핵 세포에는, 비제한적으로 CD34, CDS, CD14, CD19 및 CD56을 포함한 특정 항원을 발현하는 세포가 고갈될 수 있다. 이들 세포의 고갈은 단리된 항체, 복수와 같은 항체를 포함하는 생물학적 샘플, 물리적 지지체에 결합된 항체, 및 세포 결합된 항체를 사용하여 달성될 수 있다.
음성 선택에 의한 T 세포 집단의 농축은 음성 선택 세포에 고유한 표면 마커에 대한 항체의 조합을 사용하여 달성될 수 있다. 예시적인 방법은 음성으로 선택된 세포에 존재하는 세포 표면 마커에 대한 단클론 항체의 칵테일을 사용하는 음성 자기 면역부착 또는 유세포 분석을 통한 세포 분류 및/또는 선택이다. 예를 들어, 음성 선택을 통해 CD4 + 세포를 농축시키기 위해, 단클론 항체 칵테일은 전형적으로 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR 및 CDS에 대한 항체를 포함한다.
양성 또는 음성 선택에 의해 원하는 세포 집단을 단리하기 위해, 세포 및 표면(예를 들어, 비드와 같은 입자)의 농도를 변화시킬 수 있다. 특정 구현예에서, 세포와 비드의 최대 접촉을 보장하기 위해 비드와 세포가 함께 혼합되는 부피를 상당히 감소시키는 것(즉, 세포의 농도를 증가시키는 것)이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 한 구현예에서, 20억 세포/㎖의 농도가 사용된다. 한 구현예에서, 10억 세포/㎖의 농도가 사용된다. 추가 구현예에서, 1억 초과 세포/㎖가 사용된다. 추가 구현예에서, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 5천만 세포/㎖의 세포 농도가 사용된다. 또 다른 구현예에서, 75, 80, 85, 90, 95 또는 1억 세포/㎖의 세포 농도가 사용된다. 추가 구현예에서, 1억 2천 5백만 또는 1억 5천만 세포/㎖의 농도가 사용될 수 있다. 고농도를 사용하면 세포 수율, 세포 활성화 및 세포 확장이 증가할 수 있다.
T 세포를 또한 세척 단계 후에 동결시킬 수 있으며, 이는 단핵구-제거 단계가 필요하지 않다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 동결 및 후속 해동 단계는 세포 집단에서 과립구 및 어느 정도 단핵구를 제거함으로써 보다 균일한 생성물을 제공한다. 혈장과 혈소판을 제거하는 세척 단계 후에, 세포를 동결 용액에 현탁시킬 수 있다. 다수의 동결액 및 매개변수가 당업계에 공지되어 있고 이러한 맥락에서 유용할 것이지만, 비제한적인 예로 한 가지 방법은 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민을 함유하는 PBS, 또는 기타 적합한 세포 동결 배지의 사용을 포함한다. 이어서 세포를 분당 1℃의 속도로 -80℃까지 동결시키고 액체 질소 저장 탱크의 증기상에 보관한다. -20℃ 또는 액체 질소에서 즉시 조절되지 않는 동결뿐만 아니라 다른 조절식 동결 방법도 사용할 수 있다.
한 구현예에서, T 세포 집단은 말초 혈액 단핵 세포, 제대혈 세포, 정제된 T 세포 집단 및 T 세포주와 같은 세포 내에 포함된다. 다른 구현예에서, 말초 혈액 단핵 세포는 T 세포 집단을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 정제된 T 세포는 T 세포 집단을 포함한다.
일부 구현예에서, 면역 세포는 혈액 샘플, 전혈 샘플, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 샘플, 또는 성분채집 샘플로부터 수득된다. 일부 예에서, 대상체의 순환 혈액으로부터의 세포를 예를 들어 성분채집술 또는 백혈구 성분채집술에 의해 수득한다. 한 구현예에서, 면역 세포를 성분채집술 또는 백혈구 성분채집술에 의해 개인의 순환 혈액으로부터 수득한다. 성분채집 생성물에는 전형적으로 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 기타 유핵 백혈구, 적혈구 및 혈소판을 포함한 림프구가 포함되어 있다. 일부 구현예에서, 성분채집 샘플은 동결보존된 샘플이다. 일부 구현예에서, 성분채집 샘플은 신선한 샘플이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 인간 대상체로부터 수득된다.
VII. 조성물
한 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 변형된 면역 세포, 또는 본원에 기재된 임의의 방법으로부터 수득된 변형된 면역 세포의 집단을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 본원에 기재된 변형된 비자극 T 세포 또는 변형된 자극 T 세포를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 약학 조성물을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 약학 조성물을 포함할 수 있고, 하나 이상의 약제학적으로 또는 생리학적으로 허용되는 담체, 희석제, 보조제 또는 부형제를 추가로 포함한다. 이러한 조성물은 중성 완충 식염수, 포스페이트 완충 식염수 등과 같은 완충제; 글루코스, 만노스, 슈크로스 또는 덱스트란, 만니톨과 같은 탄수화물; 단백질; 폴리펩티드 또는 아미노산, 예를 들어 글리신, 항산화제; EDTA 또는 글루타치온과 같은 킬레이트제; 항원보강제(예를 들어, 수산화알루미늄); 및 보존제를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 바람직하게는 비경구 투여(예를 들어, 정맥내 투여)를 위해 제형화된다. 일부 구현예에서, 치료 유효량의 변형된 T 세포를 포함하는 약학 조성물을, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여할 수 있다.
VIII. 치료 방법
한 양태에서, 본 개시내용은 본 발명의 변형된 면역 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 입양 세포 전달 요법을 위한 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본원은 대상체에게 본원에 기재된 변형된 T 세포 집단, 예를 들어 본원에 기재된 변형된 비자극 T 세포 집단 또는 변형된 자극 T 세포 집단을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환 또는 상태를 치료하는 방법을 개시한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 변형된 면역 세포를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환 또는 상태를 치료하는 방법을 포함한다. 일부 구현예에서, 대상체의 질환 또는 상태를 치료하는 방법은, CD3δ, CD3ε, CD3γ, B2M, CIITA, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP 및 불변쇄(Ii 쇄)로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 내인성 면역단백질, 및 키메라 항원 수용체(CAR), 조작된 T 세포 수용체(TCR), 킬러 세포 면역글로불린 유사 수용체(KIR), 항원 결합 폴리펩티드, 세포 표면 수용체 리간드 또는 종양 항원을 암호화하는 외인성 핵산을 각각 암호화하는 하나 이상의 유전자좌에서의 삽입 및/또는 결실을 포함하는 변형된 면역 세포(예를 들어, T 세포)를, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 삽입 및/또는 결실은 하나 이상의 내인성 면역 유전자의 유전자 발현을 하향조절할 수 있다.
일부 구현예에서, 변형된 면역 세포는 우성 음성 수용체, 전환 수용체, 케모카인, 케모카인 수용체, 사이토카인, 사이토카인 수용체, IL-7, IL-7R, IL-15, IL-15R, IL-21, IL-18, CCL21, CCL19 또는 이들의 조합을 추가로 포함한다. 일부 경우에, 질환은 암, 선택적으로 고형 종양 또는 혈액학적 악성종양이다. 일부 경우에, 변형된 비자극 T 세포 또는 변형된 자극 T 세포는 각각 암에 의해 발현되는 항원에 특이적인 항원 결합 도메인을 발현한다. 일부 구현예에서, 방법은 본원의 다른 곳에 설명된 유전자 발현을 하향조절할 수 있는 핵산, TCR, KIR, CAR, 우성 음성 수용체, 및/또는 전환 수용체를 포함하는 변형된 면역 세포(예를 들어, T 세포)를, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포는 보편적인 TCR 재지시된 T 세포(예를 들어 동종이계 T 세포)이다.
일부 구현예에서, 암은 고형 종양이다. 예시적인 고형 종양에는 방광암(bladder cancer), 골암(bone cancer), 뇌암(brain cancer)(예를 들어, 신경교종(glioma), 교모세포종(glioblastoma), 신경모세포종(neuroblastoma)), 유방암(breast cancer), 결장직장암(colorectal cancer), 식도암(esophageal cancer), 눈암(eye cancer), 두경부암(head and neck cancer), 신장암(kidney cancer), 폐암(lung cancer), 흑색종(melanoma), 중피종(mesothelioma), 난소암(ovarian cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 전립선암(prostate cancer) 또는 위암(stomach cancer)이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 일부 경우에, 고형 종양은 뇌암(예를 들어, 신경교종, 교모세포종, 신경모세포종), 유방암, 폐암, 흑색종, 중피종, 난소암, 췌장암 또는 전립선암이다. 일부 경우에, 고형 종양은 전이성 암이다. 일부 경우에, 고형 종양은 재발성 또는 불응성 고형 종양이다.
일부 구현예에서, 암은 혈액학적 악성종양이다. 일부 구현예에서, 혈액학적 악성종양은 B 세포 악성종양 또는 T 세포 악성종양이다. 일부 구현예에서, 혈액학적 악성종양은 림프종(lymphoma), 백혈병(leukemia) 또는 골수종(myeloma)이다. 일부 구현예에서, 혈액학적 악성종양은 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma), 또는 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma)이다. 예시적인 혈액학적 악성종양은 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia)(CLL), 소 림프구성 백혈병(small lymphocytic lymphoma)(SLL), 여포성 림프종(follicular lymphoma)(FL), 미만성 거대 B-세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma)(DLBCL), 외투세포 림프종(mantle cell lymphoma)(MCL), 발덴스트롬 마크로글로불린혈증(Waldenstrom's macroglobulinemia), 다발성 골수종(multiple myeloma), 결절외 변연부 B 세포 림프종(extranodal marginal zone B cell lymphoma), 결절 변연부 B 세포 림프종(nodal marginal zone B cell lymphoma), 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma), 비-버킷 고 등급 B 세포 림프종(non-Burkitt high grade B cell lymphoma), 원발성 종격동 B 세포 림프종(primary mediastinal B-cell lymphoma)(PMBL), 면역모세포 대세포 림프종(immunoblastic large cell lymphoma), 전구체 B 림프모구성 림프종(precursor B-lymphoblastic lymphoma), B 세포 전림프구성 백혈병(B cell prolymphocytic leukemia), 림프형질구성 림프종(lymphoplasmacytic lymphoma), 비장 변연부 림프종(splenic marginal zone lymphoma), 형질세포 골수종(plasma cell myeloma), 형질세포종(plasmacytoma), 종격동(흉선) 거대 B 세포 림프종(mediastinal (thymic) large B cell lymphoma), 혈관내 거대 B 세포 림프종(intravascular large B cell lymphoma), 원발성 삼출성 림프종(primary effusion lymphoma), 또는 림프종성 육아종증(lymphomatoid granulomatosis)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 예에서, 혈액학적 악성종양은 전이성 혈액학적 악성종양이다. 일부 경우에, 혈액학적 악성종양은 재발성 또는 불응성 혈액학적 악성종양이다.
일부 구현예에서, 질환을 치료하는 방법은 대상체에게 추가 치료제 또는 추가 요법을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 추가 치료제는 화학요법제, 면역요법제, 표적 요법, 방사선 요법 또는 이들의 조합을 포함한다. 예시적인 추가 치료제에는 알트레타민, 부설판, 카르보플라틴, 카르무스틴, 클로람부실, 시스플라틴, 사이클로포스파미드, 다카르바진, 로무스틴, 멜팔란, 옥살라플라틴, 테모졸로미드 또는 티오테파와 같은 알킬화제; 5-플루오로우라실(5-FU), 6-머캅토퓨린(6-MP), 카페시타빈, 시타라빈, 플록수리딘, 플루다라빈, 젬시타빈, 하이드록시우레아, 메토트렉세이트 또는 페메트렉시드와 같은 대사길항물질; 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신 또는 이다루비신과 같은 안트라사이클린; 토포테칸 또는 이리노테칸(CPT-11)과 같은 토포이소머라제 I 억제제; 에토포사이드(VP-16), 테니포사이드 또는 미톡산트론과 같은 토포이소머라제 II 억제제; 도세탁셀, 에스트라무스틴, 익사베필론, 파클리탁셀, 빈블라스틴, 빈크리스틴 또는 비노렐빈과 같은 유사분열 억제제; 또는 프레드니손, 메틸프레드니솔론 또는 덱사메타손과 같은 코르티코스테로이드가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 일부 경우에, 추가 치료제는 1차 요법을 포함한다. 본원에 사용된 "1차 요법"은 암에 걸린 대상체에 대한 1차 치료를 포함한다. 일부 경우에, 암은 원발성 암이다. 다른 경우에, 암은 전이성 또는 재발성 암이다. 일부 경우에, 1차 요법은 화학요법을 포함한다. 다른 경우에, 1차 요법은 방사선 요법을 포함한다. 숙련가는 다양한 1차 요법이 다양한 유형의 암에 적용될 수 있다는 것을 쉽게 이해할 것이다. 일부 경우에, 추가 치료제는 면역 체크포인트 억제제를 포함한다. 일부 경우에서, 면역 체크포인트 억제제는 PD-1, PD-L1, PD-1, PD-L1, CTLA4, PD-L2, LAG3, B7-H3, KIR, CD137, PS, TFM3, CD52, CD30, CD20, CD33, CD27, OX40, GITR, ICOS, BTLA(CD272), CD160, 2B4, LAIR1, TIGHT, LIGHT, DR3, CD226, CD2 또는 SLAM에 대한 항체 또는 그의 단편(예를 들어, 단클론 항체, 인간, 인간화 또는 키메라 항체), RNAi 분자, 또는 소분자와 같은 억제제를 포함한다. 예시적인 체크포인트 억제제에는 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 트레멜리무맙 또는 이필리무맙이 포함된다. 일부 구현예에서, 추가 요법은 방사선 요법을 포함한다.
일부 구현예에서, 추가 요법은 수술을 포함한다.
IX. 키트 및 제조 물품
일부 구현예에서, 본원에 기재된 키트 또는 제조 물품은 변형된 T 세포(예를 들어, 변형된 비자극 T 세포 또는 변형된 자극 T 세포)의 하나 이상의 집단을 포함한다. 일부 예에서, 본원에 기재된 키트 또는 제조 물품은 바이알, 튜브 등과 같은 하나 이상의 용기를 수용하도록 구획화된 캐리어, 패키지 또는 용기를 추가로 포함하며, 각각의 용기(들)는 본원에 기재된 방법에 사용되는 별도의 요소 중 하나를 포함한다. 적합한 용기에는 예를 들어 병, 바이알, 주사기 및 시험관이 포함된다. 한 구현예에서, 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 형성된다.
본원에 제공된 제조 물품은 포장재를 함유한다. 의약품 포장재의 예에는 블리스터 팩, 병, 튜브, 주머니, 용기, 병, 및 선택된 제형과 의도된 투여 및 치료 방식에 적합한 임의의 포장재가 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
키트는 전형적으로 내용물 및/또는 사용 설명서가 나열된 표지, 및 사용 설명서가 포함된 패키지 삽입물이 포함된다. 전형적으로 일련의 설명서가 또한 포함될 것이다.
IX. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시 내용이 속하는 기술 분야의 숙련가가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 등가인 방법 및 물질이 본 개시내용의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 본원에 기재되어 있다.
또한, 본원에 사용된 용어는 단지 특정 구현예를 설명하기 위한 것이며, 제한하려는 의도가 아니라는 점을 이해해야 한다.
본 개시내용의 실시는 달리 명시되지 않는 한, 당해 분야의 기술 내에 있는 조직 배양, 면역학, 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학 및 재조합 DNA의 통상적인 기법을 사용할 것이다. 예를 들어, 하기 문헌을 참조하시오: Green and Sambrook eds. (2012) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th edition; the series Ausubel et al. eds. (2015) Current Protocols in Molecular Biology; the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); MacPherson et al. (2015) PCR 1 : A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press); MacPherson et al. (1995) PCR 2: A Practical Approach; McPherson et al. (2006) PCR: The Basics (Garland Science); Harlow and Lane eds. (1999) Antibodies, A Laboratory Manual; Greenfield ed. (2014) Antibodies, A Laboratory Manual; Freshney (2010) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 6th edition; Gait ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; Hames and Higgins eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Anderson (1999) Nucleic Acid Hybridization; Herdewijn ed. (2005) Oligonucleotide Synthesis: Methods and Applications; Hames and Higgins eds. (1984) Transcription and Translation; Buzdin and Lukyanov ed. (2007) Nucleic Acids Hybridization: Modern Applications; Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press (1986)); Grandi ed. (2007) In Vitro Transcription and Translation Protocols, 2nd edition; Guisan ed. (2006) Immobilization of Enzymes and Cells; Perbal (1988) A Practical Guide to Molecular Cloning, 2nd edition; Miller and Calos eds, (1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory); Makrides ed. (2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells; Mayer and Walker eds. (1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); Lundblad and Macdonald eds. (2010) Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, 4th edition; 및 Herzenberg et al. eds (1996) Weir's Handbook of Experimental Immunology, 5th edition.
본원에 사용된 단수형 "a", "an" 및 "the"는 문맥에서 달리 명시하지 않는 한 복수형을 포함한다. 예를 들어, "세포"라는 용어는 다수의 세포 및 이들의 혼합물을 포함하며, 하나의 세포 또는 하나 이상의 세포를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "약"은 값이 상기 값을 결정하기 위해 사용되는 장치 또는 방법에 대한 오차의 표준 편차를 포함한다는 것을 나타내는 데 사용된다. 온도, 시간, 양, 농도(범위 포함) 앞에 사용된 "약"이라는 용어는 (+) 또는 (-)(±) 20%, 15%, 10 % , 5%, 3%, 2% 또는 1%까지 달라질 수 있는 근사치를 가리킨다. 명시된 값으로부터 바람직하게는 ±5%, 더 바람직하게는 ±1%, 더욱 더 바람직하게는 ±0.1%이며, 이러한 변화는 개시된 방법을 수행하는 데 적합하다.
본원에 사용된 용어 "활성화"는 검출 가능한 세포 증식을 유도할 만큼 충분히 자극된 T 세포의 상태를 지칭한다. 활성화는 유도된 사이토카인 생성 및 검출 가능한 효과기 기능과도 연관될 수 있다. "활성화된 T 세포"라는 용어는 무엇보다도 세포 분열을 겪고 있는 T 세포를 지칭한다.
"동종이계"는 물질이 도입된 개체와 동일한 종의 다른 동물로부터 유래된 모든 물질을 지칭한다. 하나 이상의 유전자좌의 유전자가 동일하지 않을 때 둘 이상의 개체를 서로 동종이계라고 한다. 일부 양태에서, 동일한 종의 개체로부터 얻은 동종이계 물질은 항원적으로 상호작용할 만큼 유전적으로 충분히 다를 수 있다.
본원에 사용된 용어 "동종이계 T 세포 표적" 또는 "동종이계 T 세포"는 숙주 대 이식편 반응을 매개하거나 이에 기여하거나, 또는 이식편 대 숙주 반응을 매개하거나 이에 기여하거나, 또는 면역억제의 표적인 단백질; 및 상기 분자 및 이와 연관된 조절 요소(예를 들어, 프로모터)를 암호화하는 유전자를 지칭한다. 동종이계 T 세포 표적이라는 용어는 표적 서열 또는 gRNA 분자와 관련하여 사용될 때 동종이계 T 세포 표적 단백질을 암호화하는 유전자(및 이와 연관된 조절 요소)를 지칭하는 것으로 이해될 것이다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 하나 이상의 동종이계 T 세포 표적의 억제 또는 제거(예를 들어, 본원에 개시된 방법 및 조성물에 의함)는 동종이계 세포의 효능, 생존, 기능 및/또는 생존력을 향상시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 동종이계 세포의 효능, 생존, 기능 및/또는 생존력은 바람직하지 않은 면역원성(예를 들어 숙주 대 이식편 반응 또는 이식편 대 숙주 반응)을 감소시키거나 제거함으로써 개선된다. 일부 구현예에서, 이식편 대 숙주 반응 또는 숙주 대 이식편 반응을 매개하거나 이에 기여하는 단백질은 T 세포 수용체 복합체의 하나 이상의 성분이다. 일부 구현예에서, T 세포 수용체 복합체의 성분은 TCR 알파(TRAC; TCRα)의 불변 도메인인 T 세포 수용체 알파이다. 일부 구현예에서, T 세포 수용체의 성분은 T 세포 수용체 베타 쇄(TRBC; TCR-β), 예를 들어 TCR 베타의 불변 도메인 1(TRBC1) 또는 불변 도메인 2(TRBC2)이다. 일부 구현예에서, T 세포 수용체의 성분은 T 세포 수용체 델타 쇄(CD3δ), T 세포 수용체 엡실론 쇄(CD3ε), T 세포 수용체 제타 쇄(CD3ζ; CD247) 및/또는 T 세포 수용체 감마 쇄(CD3γ)이다. 일부 구현예에서, 동종이계 T 세포 표적에 의해 암호화된 단백질이 TCR 신호전달 복합체의 성분인 경우, 동종이계 T 세포 표적을 암호화하는 유전자는 예를 들어 TRAC, TRBC1, TRBC2, CD3δ, CD3ε, CD3γ, 또는 CD3ζ(CD247) 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "항체"는 항원과 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자를 지칭한다. 항체는 천연 공급원 또는 재조합 공급원으로부터 유래된 온전한 면역글로불린일 수 있으며 온전한 면역글로불린의 면역반응성 부분일 수 있다. 항체는 전형적으로 면역글로불린 분자의 사량체이다. 본 발명의 항체는 단쇄 항체(scFv) 및 인간화 항체뿐만 아니라, 예를 들어 다클론 항체, 단클론 항체, Fv, Fab 및 F(ab)2를 포함하는 다양한 형태로 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 관심 항원(예를 들어, 종양 관련 항원)에 대해 유의미한 공지된 특이적 면역반응 활성을 갖는 이러한 조립체(예를 들어, 온전한 항체 분자, 면역부착소 또는 그의 변이체)를 지칭한다. 항체와 면역글로불린은 쇄 간 공유 결합이 있거나 없는 경쇄와 중쇄를 포함한다. 척추동물계의 기본적인 면역글로불린 구조는 비교적 잘 이해되어 있다.
"항체 단편"이라는 용어는 온전한 항체의 일부를 지칭하며 온전한 항체의 항원 결정 가변 영역을 지칭한다. 항체 단편의 예에는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편, 선형 항체, scFv 항체 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체가 포함되나 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "항체 중쇄"는 자연 발생 형태로 모든 항체 분자에 존재하는 2가지 유형의 폴리펩티드 쇄 중 더 큰 것을 지칭한다.
본원에 사용된 "항체 경쇄"는 자연 발생 형태로 모든 항체 분자에 존재하는 2가지 유형의 폴리펩티드 쇄 중 더 작은 것을 지칭한다. α 및 β 경쇄는 2가지 주요 항체 경쇄 아이소타입을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "합성 항체"는 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성된 항체, 예를 들어 본원에 기재된 박테리오파지에 의해 발현된 항체를 의미한다. 이 용어는 또한 항체를 암호화하는 DNA 분자의 합성에 의해 생성되고 DNA 분자가 항체 단백질 또는 항체를 특정하는 아미노산 서열을 발현하는 항체를 의미하는 것으로 해석되어야 하며, 여기서 DNA 또는 아미노산 서열은, 당해 분야에서 입수할 수 있고 주지되어 있는 합성 DNA 또는 아미노산 서열 기술을 사용하여 획득되었다.
(예를 들어, 키메라 항원 수용체)의 항원 결합 도메인은 항체 변이체를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "항체 변이체"는 자연적으로 발생하지 않도록 변경된 항체의 합성 및 조작된 형태, 예를 들어 적어도 2개의 중쇄 부분을 포함하지만 2개의 완전한 중쇄는 포함하지 않는 항체(예를 들어, 도메인 결실된 항체 또는 미니바디); 2개 이상의 상이한 항원 또는 단일 항원상의 상이한 에피토프에 결합하도록 변경된 다중특이성 형태의 항체(예를 들어, 이중특이성, 삼중특이성 등); scFv 분자에 결합된 중쇄 분자 등을 포함한다. 또한, "항체 변이체"라는 용어는 동일한 항원의 3개, 4개 또는 그 이상의 사본에 결합하는 항체의 다가 형태(예를 들어, 3가, 4가 등)를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "항원" 또는 "Ag"는 면역 반응을 유발하는 분자로서 정의된다. 이 면역 반응은 항체 생성이나 특정 면역학적 능력이 있는 세포의 활성화, 또는 이들 둘 다를 포함할 수 있다. 당업자는 사실상 모든 단백질 또는 펩티드를 포함하는 임의의 거대분자가 항원으로 작용할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 더욱이, 항원은 재조합 DNA 또는 게놈 DNA로부터 유래될 수 있다. 당업자는 면역 반응을 유도하는 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 또는 부분 뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의의 DNA가, 본원에 사용되는 용어로서 "항원"을 암호화한다는 것을 이해할 것이다. 또한, 당업자는 항원이 유전자의 전장 뉴클레오티드 서열에 의해서만 암호화될 필요가 없다는 것을 이해할 것이다. 본 발명이 하나 이상의 유전자의 부분 뉴클레오티드 서열의 사용을 포함하지만 이에 제한되지 않으며 이러한 뉴클레오티드 서열은 원하는 면역 반응을 유도하기 위해 다양한 조합으로 배열된다는 것은 쉽게 명백하다. 더욱이, 당업자는 항원이 "유전자"에 의해 암호화될 필요가 전혀 없다는 것을 이해할 것이다. 항원이 합성되어 생성될 수 있거나 또는 생물학적 샘플로부터 유래될 수 있다는 것은 쉽게 명백하다. 이러한 생물학적 샘플에는 조직 샘플, 종양 샘플, 세포 또는 생물학적 체액이 포함될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "항-종양 효과"는 종양 부피 감소, 종양 세포 수 감소, 전이 수 감소, 기대 수명 연장 또는 암성 상태와 관련된 다양한 생리학적 증상의 개선에 의해 나타날 수 있는 생물학적 효과를 지칭한다. 일부 구현예에서, "항-종양 효과"는 또한 우선, 종양 발생을 예방하는 본 발명의 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 세포 및 항체의 능력에 의해 나타날 수도 있다.
본원에 사용된 용어 "자가-항원"은 본 발명에 따라, 면역계에 의해 외부인 것으로 인식되는 임의의 자기-항원을 의미한다. 일부 구현예에서, 자가-항원은 세포 표면 수용체를 포함하는 세포 단백질, 인단백질, 세포 표면 단백질, 세포 지질, 핵산, 당단백질을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "자가면역 질환"은 자가면역 반응으로 인해 발생하는 장애로서 정의된다. 자가면역 질환은 자기-항원에 대한 부적절하고 과도한 반응의 결과이다. 자가면역 질환의 예에는 특히 애디슨병(Addision's disease), 원형탈모증(alopecia areata), 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 자가면역 간염(autoimmune hepatitis), 자가면역 이하선염(autoimmune parotitis), 암, 크론병(Crohn's disease), 당뇨병(diabetes)(1형), 수포성 이영양성 표피박리증(dystrophic epidermolysis bullosa), 부고환염(epididymitis), 사구체신염(glomerulonephritis), 그레이브스병(Graves' disease), 길랑-바레 증후군(Guillain-Barr syndrome), 하시모토병(Hashimoto's disease), 용혈성 빈혈(hemolytic anemia), 전신 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 중증 근무력증(myasthenia gravis), 심상성 천포창(pemphigus vulgaris), 건선(psoriasis), 류마티스열(rheumatic fever), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 유육종증(sarcoidosis), 피부경화증(scleroderma), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 척추관절병증(pondyloarthropathies), 갑상선염(thyroiditis), 혈관염(vasculitis), 백반증(vitiligo), 점액수종(myxedema), 악성빈혈(pernicious anemia), 궤양성 대장염(ulcerative colitis)이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "자기유래"는 물질이 나중에 재도입될 수 있는 동일한 개인으로부터 유래된 임의의 물질을 지칭하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "암"은 이상 세포의 급속하고 통제되지 않는 성장을 특징으로 하는 질환을 지칭한다. 암세포는 국소적으로 또는 혈류와 림프계를 통해 신체의 다른 부위로 퍼질 수 있다. 다양한 암의 예로는 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 췌장암, 대장암, 신장암, 간암, 뇌암, 림프종, 백혈병, 폐암, 전이성 거세-저항성 전립선암(metastatic castrate-resistant prostate cancer), 흑색종(melanoma), 윤활막육종(synovial sarcoma), 진행성 TnMuc1 양성 고형 종양, 신경모세포종(neuroblastoma), 신경내분비 종양(neuroendocrine tumor) 등이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 암은 갑상선 수질암종(medullary thyroid carcinoma)이다. 특정 구현예에서, 암은 전립선암이다. 특정 구현예에서, 암은 중피종(mesothelioma) 또는 메소텔린 발현 암(mesothelin expressing cancer)이다. 일부 구현예에서, 암은 전이성 거세-저항성 전립선암이다. 용어 "암" 및 "종양"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 두 용어 모두 고형 및 액상 종양, 미만성 또는 순환성 종양을 포함한다. 일부 구현예에서, 암 또는 종양은 전악성종양뿐만 아니라, 악성 암 및 종양을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "암 관련 항원" 또는 "종양 항원"은 암세포의 표면에서 전체적으로 또는 단편(예를 들어, MHC/펩티드)으로서 발현되는 분자(전형적으로 단백질, 탄수화물 또는 지질)이며, 이는 암세포에 대한 약리학적 작용제의 우선적 표적화에 유용하다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 정상 세포 및 암 세포 모두에 의해 발현되는 마커(예를 들어, B 세포 상의 CD19와 같은 계통 마커)이다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 정상 세포와 비교하여 암세포에서 과발현되는, 예를 들어, 정상 세포와 비교하여 1배 과발현, 2배 과발현, 3배 또는 그 이상 과발현되는 세포 표면 분자이다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 암세포에서 부적절하게 합성되는 세포 표면 분자, 예를 들어 정상 세포에서 발현되는 분자와 비교하여 결실, 첨가 또는 돌연변이를 함유하는 분자이다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 전적으로 암세포의 세포 표면에서만, 전체적으로 또는 단편(예를 들어, MHC/펩티드)으로서 발현될 것이며, 정상 세포의 표면에서는 합성되거나 발현되지 않을 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 CAR에는 MHC 제시 펩티드에 결합하는 항원 결합 도메인(예를 들어, 항체 또는 항체 단편)을 포함하는 CAR이 포함된다. 일반적으로 내인성 단백질에서 유래된 펩티드는 주조직적합성 복합체(MHC) 부류 I 분자의 포켓을 채우고 CD8+ T 림프구의 T 세포 수용체(TCR)에 의해 인식된다. MHC 부류 I 복합체는 모든 유핵 세포에서 구성적으로 발현된다. 암에서 바이러스 특이적 및/또는 종양 특이적 펩티드/MHC 복합체는 면역요법을 위한 독특한 종류의 세포 표면 표적을 나타낸다. 인간 백혈구 항원(HLA)-A1 또는 HLA-A2와 관련하여 바이러스 또는 종양 항원에서 유래된 펩티드를 표적으로 하는 TCR 유사 항체가 기재되었다. 예를 들어, TCR 유사 항체는 인간 scFv 파지 디스플레이 라이브러리와 같은 라이브러리를 스크리닝하여 식별될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "암-지지 항원" 또는 "종양-지지 항원"은 그 자체로는 암이 아니지만 암세포의 성장이나 생존을 촉진하여 암세포를 지원하는(예를 들어, 면역 세포에 대해 내성인), 세포 표면에서 발현되는 분자(전형적으로 단백질, 탄수화물 또는 지질)를 상호교환적으로 지칭한다. 이러한 유형의 예시적인 세포에는 간질 세포 및 골수 유래 억제 세포(MDSC)가 포함된다. 종양-지지 항원 자체는, 항원이 암 세포를 지지하는 세포에 존재하는 한, 종양 세포를 지지하는 역할을 할 필요가 없다.
본원에 사용된 용어 "Cas", "Cas 분자" 또는 "Cas 분자"는 DNA 절단을 담당하는 세균성 II형 CRISPR/Cas 시스템으로부터의 효소를 지칭한다. Cas에는 야생형 단백질뿐만 아니라 이의 기능성 및 비-기능성 돌연변이체가 포함된다.
본원에 사용된 용어 "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR"은 면역 효과기 세포 또는 이의 전구체 세포에서 발현되고 항원에 특이적으로 결합하도록 조작된 인공 T 세포 수용체를 지칭한다. CAR은 입양 세포 전달과 함께 입양 세포 요법에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 입양 세포 전달(또는 요법)은 환자로부터 T 세포를 제거하고, 특정 항원에 특이적인 수용체를 발현하도록 T 세포를 변형시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 선택된 표적, 예를 들어 ROR1, 메소텔린, c-Met, PSMA, PSCA, 폴레이트 수용체 알파, 폴레이트 수용체 베타, EGFR, EGFRvIII, GPC2, GPC2, 뮤신 1(MUC1), Tn 항원((Tn Ag) 또는 (GalNAca-Ser/Thr)), TnMUC1, GDNF 패밀리 수용체 알파-4(GFRa4), 섬유아세포 활성화 단백질(FAP) 또는 인터류킨-13 수용체 서브유닛 알파-2(IL-13Ra2 또는 CD213A2)에 특이성을 갖는다. 일부 구현예에서, CAR은 또한 세포내 활성화 도메인, 막관통 도메인 및 종양 관련 항원 결합 영역을 포함하는 세포외 도메인을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, CAR은 CD3-제타 막관통 및 세포내 도메인에 융합된 단쇄 가변 단편(scFv) 유래 단클론 항체의 융합을 포함한다. CAR 설계의 특이성은 수용체의 리간드(예를 들어, 펩티드)로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, CAR은 종양 관련 항원에 특이적인 CAR을 발현하는 T 세포의 특이성을 전용함으로써 암을 표적화할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "절단"은 핵산 분자의 주쇄와 같은 공유 결합의 파괴를 지칭한다. 절단은 포스포디에스테르 결합의 효소적 또는 화학적 가수분해를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 방법에 의해 개시될 수 있다. 단일 가닥 절단과 이중 가닥 절단이 모두 가능하다. 이중 가닥 절단은 2가지 별개의 단일 가닥 절단 사건의 결과로서 발생할 수 있다. DNA 절단으로 인해 무딘 단부 또는 엇갈린 단부가 생성될 수 있다. 특정 구현예에서, 융합 폴리펩티드는 절단된 이중 가닥 DNA를 표적화하는데 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 핵산과 관련하여 사용된 용어 "상보적"은 A와 T 또는 U, 및 G와 C의 염기 쌍을 지칭한다. 상보적이라는 용어는 완전히 상보적인, 즉 전체 참조 서열에 걸쳐 A 대 T 또는 U 쌍 및 G 대 C 쌍을 형성하는 핵산 분자뿐만 아니라 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 상보적인 분자를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "보존적 서열 변형"은 아미노산 서열을 함유하는 항체의 결합 특징에 유의미한 영향을 미치거나 변경시키는 것이 아닌 아미노산 변형을 의미하는 것으로 의도된다. 이러한 보존적 변형에는 아미노산 치환, 부가 및 결실이 포함된다. 부위 지정 돌연변이 유발 및 PCR 매개 돌연변이 유발과 같은 당업계에 공지된 표준 기법에 의해 변형을 본 발명의 항체에 도입시킬 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리가 당해 분야에 정의되어 있다. 이러한 패밀리에는 염기성 측쇄(예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 전하를 띠지 않은 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타 분지형 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)가 있는 아미노산이 포함된다. 따라서, 항체의 CDR 영역 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 패밀리의 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있고 변경된 항체는 본원에 기재된 기능적 분석을 사용하여 항원에 결합하는 능력에 대해 시험될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "공동자극 리간드"는 T 세포 상의 동족 공동자극 분자에 특이적으로 결합하고, 이에 따라 예를 들어 펩티드가 로딩된 MHC 분자와 TCR/CD3 복합체와의 결합에 의해 제공되는 1차 신호에 추가하여, 비제한적으로 증식, 활성화, 분화 등을 포함한 T 세포 반응을 매개하는 신호를 제공하는 항원 제시 세포(예를 들어, aAPC, 수지상 세포, B 세포 등) 상의 분자를 포함한다. 공동자극 리간드는 CD2, CD7, B7-1(CD80), B7-2(CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, 유도성 공동자극 리간드(ICOS-L), 세포간 부착 분자(ICAM), CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, HVEM, 림프톡신 베타 수용체, 3/TR6, ILT3, ILT4, HVEM, 톨 리간드 수용체에 결합하는 효능제 또는 항체, 및 B7-H3와 특이적으로 결합하는 리간드를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 공동자극 리간드는 또한 특히 T 세포 상에 존재하는 공동자극 분자, 예를 들어 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능 관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드를 포함한다.
본원에 사용된 "공동자극 분자"는 공동자극 리간드와 특이적으로 결합하여 T 세포에 의한 공동자극 반응, 예를 들어 비제한적으로 증식을 매개하는 T 세포 상의 동족 결합 상대를 지칭한다. 공동자극 분자는 효율적인 면역 반응에 기여하는 항원 수용체 또는 그 리간드 이외의 세포 표면 분자이다. 공동자극 분자에는 MHC 부류 I 분자, BTLA, 톨 리간드 수용체, CD28, 4-1BB(CD137), OX40(CD134), PD-1, CD7, LIGHT, CD83L, DAP10, DAP12, CD27, CD2, CD5, ICAM-1, LFA-1, Lck, TNFR-I, TNFR-II, Fas, CD30, CD40, ICOS(CD278), NKG2C, B7-H3(CD276), 킬러 면역글로불린-유사 수용체(KIR)로부터 유래된 세포내 도메인이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 공동자극 분자는 OX40, CD27, CD2, CD28, ICOS(CD278) 및 4-1BB(CD137)를 포함한다. 이러한 보조자극 분자의 추가 예에는 CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM(LIGHTR), SLAMF7, NKp80(KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE RANKL, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(촉각), CEACAM1, CRTAM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CD100(SEMA4D), CD69, SLAMF6(NTB-A, Lyl08), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP -76, PAG/Cbp, CD19a, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드가 포함된다.
본원에 사용된 용어 "공동자극 신호"는 TCR/CD3 결찰과 같은 1차 신호와 조합하여 T 세포 증식 및/또는 주요 분자의 상향조절 또는 하향조절을 유도하는 신호를 지칭한다. 공동자극 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 분자의 세포내 부분일 수 있다. 공동자극 분자를 하기와 같은 단백질 패밀리로 나타낼 수 있다: TNF 수용체 단백질, 면역글로불린 유사 단백질, 사이토카인 수용체, 인테그린, 신호 전달 림프구 활성화 분자(SLAM 단백질) 및 활성화 NK 세포 수용체. 이러한 분자의 예에는 CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, GITR, CD30, CD40, ICOS, BAFFR, HVEM, ICAM-1, 림프구 기능 관련 항원-1(LFA-1), CD2, CDS, CD7, CD287, LIGHT, NKG2C, NKG2D, SLAMF7, NKp80, NKp30, NKp44, NKp46, CD160, B7-H3, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 등이 포함된다.
본원에 사용된 용어 "CRISPR"은 규칙적으로 간격을 두고 클러스터링된 짧은 회문식 반복 시스템을 지칭한다. 용어 "CRISPR 시스템", "CRISPR/Cas", "CRISPR/Cas 시스템" 또는 "CRISPR"은 염기 서열의 짧은 반복을 포함하는 DNA 유전자좌를 지칭한다. 각 반복 후에는 앞서 바이러스에 노출되어 획득된 스페이서 DNA의 짧은 분절이 이어진다. 세균 및 고세균은 짧은 RNA를 사용하여 외부 핵산 분해를 지시하는 CRISPR-CRISPR 관련(Cas) 시스템이라는 적응형 면역 방어를 진화시켰다. 세균에서 CRISPR 시스템은 RNA 안내 DNA 절단을 통해 외부 DNA 침입에 대해 획득된 면역을 제공한다. II형 CRISPR/Cas 시스템에서, "스페이서"라고 불리는 외부 DNA의 짧은 분절이 CRISPR 게놈 유전자좌 내에 통합되어 전사되고 짧은 CRISPR RNA(crRNA)로 가공된다. 이러한 crRNA는 트랜스-활성화 crRNA(tracrRNA)에 어닐링하고 Cas 단백질에 의한 병원성 DNA의 서열 특이적 절단 및 침묵을 지시한다. 최근 연구에 따르면 Cas9 단백질에 의한 표적 인식에는 crRNA 내의 "시드" 서열과 crRNA 결합 영역 상류의 보존된 디뉴클레오티드 함유 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열이 필요하다는 것이 밝혀졌다.
일부 구현예에서, 용어 "CRISPR 시스템", "CRISPR/Cas", "CRISPR/Cas 시스템" 또는 "CRISPR"은 함께 RNA-안내 뉴클레아제 또는 기타 효과기 분자에 의한 표적 서열의 핵산 변형을 지시하고 실행하는 데 필요하고 충분한 RNA-안내 뉴클레아제 또는 다른 효과기 분자 및 gRNA 분자를 포함하는 분자 세트를 지칭한다. 일부 구현예에서, CRISPR 시스템은 gRNA 및 Cas 단백질, 예를 들어 Cas3, Cas4, Cas8a, Cas8b, Cas9, Cas10, Cas10d, Cas12a, Cas12b, Cas12d, Cas12e, Cas12f, Cas12g, Cas12h, Cas12i, Cas13, Cas14, CasX, Cse1, Csy1, Csn2, Cpf1, C2c1, Csm2, Cmr5, Fok1, 에스 피오게네스 Cas9(spCas9) 또는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9(saCas9) 단백질을 포함한다. Cas 또는 변형된 Cas 분자를 포함하는 이러한 시스템은 본원에서 "Cas 시스템" 또는 "CRISPR/Cas 시스템"으로 지칭된다. 일부 구현예에서, gRNA 분자와 Cas 분자는 복합체를 형성하여 리보핵 단백질(RNP) 복합체를 형성할 수 있다.
Cas9가 관심 서열을 절단하도록 지시하기 위해, 이하 "안내 RNA" 또는 "gRNA"로 지칭되는 crRNA-tracrRNA 융합 전사물을 인간 U6 폴리머라제 III 프로모터로부터 설계할 수 있다. CRISPR/CAS 매개 게놈 편집 및 조절은 기초 과학, 세포 공학 및 치료법에 대한 혁신적인 잠재력을 강조하였다.
본원에 사용된 용어 "crRNA"는 gRNA 분자와 관련하여 사용되며, 표적화 도메인 및 tracr과 상호작용하여 깃대 영역을 형성하는 영역을 포함하는 gRNA 분자의 일부이다.
본원에 사용된 용어 "CRISPRi"는 예를 들어 전사 수준에서 유전자 발현의 서열 특이적 유전자 억압 또는 억제를 위한 CRISPR 시스템을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "~로부터 유래된"은 제1 분자와 제2 분자 사이의 관계를 지칭한다. 이는 제1 분자와 제2 분자 간의 구조적 유사성을 정의하며, 제2 분자에서 유래된 제1 분자에 대한 가공 또는 공급원 제한을 의미하거나 포함하지 않는다. 예를 들어, CD3제타 분자로부터 유래된 세포내 신호전달 도메인의 경우, 세포내 신호전달 도메인은 필요한 기능, 즉 적절한 조건 하에서 신호를 생성하는 능력을 갖도록 충분한 CD3제타 구조를 유지한다. 이는 세포내 신호전달 도메인을 생성하는 특정 과정에 대한 제한을 내포하거나 포함하지 않는다. 이는 세포내 신호전달 도메인을 제공하기 위해 CD3제타 서열로 시작하여 원치 않는 서열을 삭제하거나 돌연변이를 부과하여 세포내 신호전달 도메인에 도달해야 함을 의미하지 않는다.
본원에 사용된 용어 "질환"은 동물이 항상성을 유지할 수 없는 동물의 건강 상태를 의미하며, 질환이 개선되지 않으면 동물의 건강은 계속 악화된다. 대조적으로, 동물의 "장애"라는 용어는 동물이 항상성을 유지할 수 있지만 동물의 건강 상태가 장애가 없을 때보다 덜 유리한 건강 상태를 지칭한다. 치료하지 않고 방치하면 장애가 반드시 동물의 건강 상태를 추가로 감소시키는 것은 아니다.
본원에 사용된 "종양 항원의 발현과 관련된 질환"에는 종양 항원의 발현과 관련된 질환 또는 종양 항원을 발현하는 세포와 관련된 상태, 예를 들어 비제한적으로, 암 또는 악성 종양과 같은 증식성 질환 또는 골수이형성증(myelodysplasia), 골수이형성 증후군(myelodysplastic syndrome) 또는 전백혈병(preleukemia)과 같은 전암성 질환; 또는 종양 항원을 발현하는 세포와 연관된 비암 관련 적응증이 포함된다. 일부 구현예에서, 종양 항원의 발현과 연관된 암은 혈액암이다. 일부 구현예에서, 종양 항원의 발현과 연관된 암은 고형암이다. 종양 항원의 발현과 관련된 추가 질환에는 종양 항원의 발현과 관련된 비정형 및/또는 비고전적 암, 악성 종양, 전암성 상태 또는 증식성 질환이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 종양 항원의 발현과 관련된 비암 관련 징후에는 자가면역 질환(예를 들어, 루푸스(lupus)), 염증성 장애(알레르기 및 천식(asthma)) 및 이식이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 종양 항원 발현 세포는 종양 항원을 암호화하는 mRNA를 발현하거나 언제든지 발현한다. 일부 구현예에서, 종양 항원 발현 세포는 종양 항원 단백질(예를 들어, 야생형 또는 돌연변이체)을 생성하며, 종양 항원 단백질은 정상 수준 또는 감소된 수준으로 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 종양 항원 발현 세포는 한 지점에서 검출 가능한 수준의 종양 항원 단백질을 생성하였고, 이후에는 검출 가능한 종양 항원 단백질을 실질적으로 생성하지 않았다.
본원에 사용된 용어 "하향조절"은 하나 이상의 유전자의 유전자 발현의 감소 또는 제거를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "암호화"는 정의된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, rRNA, tRNA 및 mRNA) 또는 정의된 아미노산 서열 및 그로부터 발생하는 생물학적 특성을 갖는 생물학적 과정에서 다른 중합체 및 거대분자의 합성을 위한 주형 역할을 하는, 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 유전자, cDNA 또는 mRNA)의 특정 뉴클레오티드 서열의 고유 특성을 지칭한다. 따라서 유전자, cDNA 또는 RNA는 해당 유전자에 상응하는 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 기타 생물학적 시스템에서 단백질을 생성하는 경우 단백질을 암호화한다. 뉴클레오티드 서열이 mRNA 서열과 동일하고 일반적으로 서열 목록에 제공되는 2개의 암호화 가닥과, 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 주형으로 사용되는 비-암호화 가닥 모두를 단백질 또는 해당 유전자 또는 cDNA의 기타 생성물을 암호화하는 것으로서 지칭할 수 있다. 달리 명시되지 않는 한, "아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열"은, 서로의 축퇴 버전이며 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 단백질 또는 RNA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이라는 어구는 또한 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 일부 버전에서 인트론(들)을 함유할 수 있는 정도로 인트론을 포함할 수 있다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 "유효량" 또는 "치료 유효량"은 원하는 생리학적, 치료적 또는 예방적 결과를 필요로 하는 대상체에서 이를 달성하는 데 유효한, 본원에 기재된 화합물, 제형, 물질, 약제 또는 조성물의 양을 지칭한다. 이러한 결과에는, 포유동물에게 투여 시 본 발명의 조성물이 없을 때 검출된 면역 반응과 비교하여 검출 가능한 수준의 면역 반응을 유발하는 양이 포함될 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 면역 반응은 당업계에서 인정된 다양한 방법에 의해 쉽게 평가될 수 있다. 당업자는 본원에서 투여되는 조성물의 양이 치료되는 질환 또는 상태, 치료되는 포유동물의 연령 및 건강 및 신체 상태, 질환의 중증도, 투여되는 특정 화합물 등과 같은 수많은 요인에 기초하여 쉽게 결정될 수 있음을 이해할 것이다. 유효량은 치료할 대상체의 건강 및 신체 상태, 치료할 대상체의 분류학적 그룹, 조성물의 제형, 대상체의 의학적 상태의 평가 및 기타 관련 인자에 따라 대상체마다 다를 수 있다.
본원에 사용된 용어 "내인성"은 유기체, 세포, 조직 또는 시스템으로부터 유래하거나 이들 내부에서 생성되는 임의의 물질을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "확장하다"는 면역 세포(예를 들어 T 세포) 수의 증가에서와 같이 수의 증가를 지칭한다. 일부 구현예에서, 생체외에서 확장되는 면역 세포(예를 들어 T 세포)는 배양물에 원래 존재하는 수에 비해 수가 증가한다. 또 다른 구현예에서, 생체외에서 확장되는 면역 세포(예를 들어 T 세포)는 배양물 내 다른 세포 유형에 비해 수가 증가한다.
본원에 사용된 용어 "발현"은 프로모터에 의해 구동되는 특정 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 번역을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "외인성"은 유기체, 세포, 조직 또는 시스템으로부터 도입되거나 외부에서 생성된 임의의 물질을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "발현 벡터"는 발현시키고자 하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 발현 조절 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는 발현을 위한 충분한 시스-작용 요소를 포함하며; 발현을 위한 다른 요소는 숙주 세포에 의해 또는 시험관내 발현 시스템에서 공급될 수 있다. 발현 벡터에는 재조합 폴리뉴클레오티드를 통합하는 코스미드, 플라스미드(예를 들어, 네이키드 또는 리포솜에 함유된) 및 바이러스(예를 들어, 센다이 바이러스, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노 관련 바이러스)와 같은 당업계에 공지된 모든 것이 포함된다.
본원에 사용된 용어 "생체외"는 살아있는 유기체(예를 들어, 인간)로부터 제거되고 유기체 외부(예를 들어, 배양 접시, 시험관 또는 생물반응기에서)에서 증식된 세포를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "깃대"는 gRNA 분자와 관련하여 사용되며, crRNA 및 tracr이 서로 결합하거나 하이브리드화하는 gRNA의 일부를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "안내 RNA", "안내 RNA 분자", "gRNA 분자" 또는 "gRNA"는 상호교환적으로 사용되며, 표적 서열에의 RNA-안내 뉴클레아제 또는 다른 효과기 분자(전형적으로 gRNA 분자와의 복합체 중의)의 특이적 지시를 촉진하는 핵산 분자 세트를 지칭한다. 일부 구현예에서, 상기 지시는 DNA에 대한 gRNA의 일부의 하이브리드화를 통해(예를 들어, gRNA 표적화 도메인을 통해), 및 RNA-안내 뉴클레아제 또는 다른 효과기 분자에 대한 gRNA 분자의 일부의 결합에 의해(예를 들어, 적어도 gRNA tracr을 통해) 수행된다. 일부 구현예에서, gRNA 분자는 본원에서 "단일 안내 RNA" 또는 "sgRNA" 등으로 지칭되는 단일 연속 폴리뉴클레오티드 분자로 이루어진다. 일부 구현예에서, gRNA 분자는 복수, 일반적으로 2개의 폴리뉴클레오티드 분자로 이루어지며, 이는 대개 하이브리드화를 통해 자체적으로 회합할 수 있으며, 본원에서는 "이중 안내 RNA" 또는 "dgRNA" 등으로 지칭된다. gRNA 분자는 하기에 더 상세히 기재되어 있지만, 일반적으로 표적화 도메인과 tracr을 포함한다. 일부 구현예에서 표적화 도메인 및 tracr은 단일 폴리뉴클레오티드 상에 배치된다. 다른 구현예에서, 표적화 도메인 및 tracr은 별도의 폴리뉴클레오티드 상에 배치된다.
본원에 사용된 용어 "상동성"은 2개의 중합체 분자 사이(예를 들어, 2개의 DNA 분자 또는 2개의 RNA 분자와 같은 2개의 핵산 분자 사이) 또는 2개의 폴리펩티드 분자 사이의 서브유닛 서열 일치성을 지칭한다. 두 분자 모두의 서브유닛 위치가 동일한 단량체 서브유닛에 의해 점유되면, 이들은 해당 위치에서 상동성이다. 예를 들어, 두 DNA 분자 각각의 위치가 아데닌에 의해 점유되면, 두 DNA 분자는 상동성이다. 두 서열 간의 상동성은 일치하는 위치 또는 상동성 위치 수의 직접적인 함수이다. 예를 들어, 두 서열의 위치 중 절반(예를 들어, 길이가 10개의 서브유닛인 중합체의 5개 위치)이 상동성인 경우, 두 서열은 50% 상동성이고; 위치의 90%(예를 들어, 10개 중 9개)가 일치하거나 상동성인 경우, 두 서열은 90% 상동성이다.
본원에 사용된 용어 "인간화 항체"는 인간 형태의 비-인간(예를 들어, 쥐) 항체를 지칭하며, 비-인간 면역글로불린에서 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 이의 단편(예를 들어, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원-결합 하위서열)이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수용자의 상보적 결정 영역(CDR)의 잔기가 원하는 특이성, 친화력 및 능력을 갖는 마우스, 래트 또는 토끼와 같은 비인간 종(공여자 항체)의 CDR 잔기로 대체된 인간 면역글로불린(수용자 항체)이다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역(FR) 잔기가 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 더욱이, 인간화 항체는 수용자 항체나 유입된 CDR 또는 프레임워크 서열에서는 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 더욱 개선시키고 최적화하기 위해 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 CDR 영역의 전부 또는 실질적으로 전부가 비-인간 면역글로불린의 것에 상응하고 FR 영역의 전부 또는 실질적으로 전부가 인간 면역글로불린 서열의 것인 적어도 하나, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 전부 포함할 것이다. 인간화 항체는 또한 최적으로 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 부분을 포함할 것이다. 추가의 상세한 내용에 대해서 하기 문헌을 참조하시오: Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature 332: 323-329 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992).
본원에 사용된 용어 "완전 인간"은 전체 분자가 인간 기원의 것이거나 인간 형태의 항체와 동일한 아미노산 서열로 이루어지는 항체와 같은 면역글로불린을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "일치성"은 2개의 중합체 분자 사이, 특히 2개의 아미노산 분자 사이, 예를 들어 2개의 폴리펩티드 분자 사이의 서브유닛 서열 일치성을 지칭한다. 2개의 아미노산 서열이 동일한 위치에 동일한 잔기를 갖는 경우 이들은 해당 위치에서 동일하다. 예를 들어, 두 폴리펩티드 분자 각각에서 하나의 위치가 아르기닌에 의해 점유되면 두 폴리펩티드는 동일하다. 2개의 아미노산 서열이 한 정렬에서 동일한 위치에 동일한 잔기를 갖는 일치성 또는 정도는 종종 백분율로서 표시된다. 두 아미노산 서열 간의 일치성은 일치하거나 동일한 위치 수의 직접적인 함수이다. 예를 들어, 두 서열의 위치 중 절반(예를 들어 길이가 10개 아미노산인 중합체의 5개 위치)이 동일한 경우, 두 서열은 50% 일치하고; 위치의 90%(예를 들어, 10개 중 9개)가 일치하거나 동일한 경우, 두 아미노산 서열은 90% 일치한다.
본원에 사용된 용어 "면역글로불린" 또는 "Ig"는 항체로서 기능하는 단백질 부류를 정의한다. B 세포에 의해 발현되는 항체는 때때로 BCR(B 세포 수용체) 또는 항원 수용체로서 지칭된다. 이 단백질 부류에 포함된 다섯 가지 구성원은 IgA, IgG, IgM, IgD 및 IgE이다. IgA는 타액, 눈물, 모유, 위장 분비물, 호흡기 및 비뇨 생식기 점액 분비물과 같은 신체 분비물에 존재하는 1차 항체이다. IgG는 가장 흔한 순환 항체이다. IgM은 대부분의 대상체에서 1차 면역 반응에서 생성되는 주요 면역글로불린이다. 이는 응집, 보체 고정 및 기타 항체 반응에서 가장 효율적인 면역글로불린이며 세균 및 바이러스에 대한 방어에 중요하다. IgD는 공지된 항체 기능이 없는 면역글로불린이지만 항원 수용체 역할을 할 수 있다. IgE는 알레르기 항원에 노출되면 비만세포와 호염기구에서 매개물질의 방출을 유발하여 즉각적인 과민성을 매개하는 면역글로불린이다.
본원에 사용된 용어 "면역 반응"은 림프구가 항원 분자를 이물질로 식별하고 항체 형성을 유도하고/하거나 림프구를 활성화하여 항원을 제거할 때 발생하는 항원에 대한 세포 반응으로서 정의된다.
본원에 사용된 용어 "면역 효과기 세포"는 면역 반응, 예를 들어 면역 효과기 반응의 촉진에 관여하는 세포를 지칭한다. 면역 효과기 세포의 예에는 T 세포(예를 들어, 알파/에타 T 세포 및 감마/델타 T 세포), B 세포, 자연 살해(NK) 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포, 비만 세포 및 골수-유래 식세포가 포함된다.
본원에 사용된 용어 "면역 효과기 기능 또는 면역 효과기 반응"은 표적 세포의 면역 공격을 증대시키거나 촉진하는 기능 또는 반응을 지칭한다. 일부 구현예에서, 면역 효과기 기능 또는 반응은 표적 세포의 사멸 또는 성장 또는 증식의 억제를 촉진하는 T 또는 NK 세포의 특성을 의미한다. T 세포의 경우, 1차 자극 및 공동자극이 면역 효과기 기능 또는 반응의 예이다.
본원에 사용된 용어 "억제 분자"는 활성화될 때 세포 생존, 활성화, 증식 및/또는 기능의 억제를 유발하거나 이에 기여하는 분자; 및 상기 분자 및 이와 연관된 조절 요소(예를 들어, 프로모터)를 암호화하는 유전자를 지칭한다. 일부 구현예에서, 억제 분자는 면역 효과기 세포(예를 들어, T 세포)에서 발현되는 분자이다. 억제 분자의 비제한적 예는 PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, LAG3, CEACAM(예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), VISTA, TGFβIIR, VSIG3, VSIG 8, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3(CD276), B7-H4(VTCN1), HVEM(TNFRSF14 또는 CD107), KIR, A2aR, MHC 부류 I, MHC 부류 II, GAL9, 아데노신 및 TGF 베타이다. 억제 분자라는 용어는 표적 서열 또는 gRNA 분자와 관련하여 사용될 때 억제 분자 단백질을 암호화하는 유전자(및 이와 연관된 조절 요소)를 지칭하는 것으로 이해될 것이다. 일부 구현예에서, 억제 분자를 암호화하는 유전자는 BTLA, PD-1, TIM-3, VSIG3, VSIG8, CTLA4 또는 TGFβIIR이다. 일부 구현예에서, 억제 분자를 암호화하는 유전자는 VSIG3이다. 일부 구현예에서, 억제 분자를 암호화하는 유전자는 PD-1이다. 일부 구현예에서, 억제 분자를 암호화하는 유전자는 TGFβIIR이다.
본원에 사용된 용어 "유도 만능 줄기 세포" 또는 "iPS 세포"는 면역 세포(즉, T 세포)와 같은 성체 세포로부터 생성된 만능 줄기 세포를 지칭한다. 성체 세포에서 Klf4, Oct3/4 및 Sox2와 같은 리프로그래밍 인자의 발현은 세포를 다중 세포 유형으로 증식 및 분화할 수 있는 다능성 세포로 전환시킨다.
본원에 사용된 용어 "설명서 자료"는 본 발명의 조성물 및 방법의 유용성을 전달하는 데 사용될 수 있는 간행물, 기록, 도표 또는 기타 표현 매체가 포함된다. 본 발명 키트의 설명서 자료는 예를 들어 본 발명의 핵산, 펩티드 및/또는 조성물을 함유하는 용기에 부착되거나 본 발명의 핵산, 펩티드 및/또는 조성물을 함유하는 용기와 함께 배송될 수 있다. 대안적으로, 설명서 자료는 수령인이 상기 설명서 자료와 화합물을 협력하여 사용할 수 있도록 용기와 별도로 배송될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "단리된"은 자연 상태에서 변경되거나 제거된 것을 지칭한다. 예를 들어, 살아있는 동물에 자연적으로 존재하는 핵산 또는 펩티드는 "단리"된 것이 아니고, 자연 상태의 공존 물질로부터 부분적으로 또는 완전히 분리된 동일한 핵산 또는 펩티드가 "단리"된 것이다. 단리된 핵산 또는 단백질은 실질적으로 정제된 형태로 존재할 수 있거나, 예를 들어 숙주 세포와 같은 비-고유 환경에 존재할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "녹아웃"은 하나 이상의 유전자의 유전자 발현의 절제를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "렌티바이러스"는 레트로비리다에(Retroviridae) 과의 속을 지칭한다. 렌티바이러스는 비-분열 세포를 감염시킬 수 있다는 점에서 레트로바이러스 중에서 독특하다. 이는 상당한 양의 유전 정보를 숙주 세포의 DNA에 전달할 수 있으므로, 유전자 전달 벡터의 가장 효율적인 방법 중 하나이다. HIV, SIV, FIV는 모두 렌티바이러스의 예이다. 렌티바이러스에서 유래된 벡터는 생체 내에서 상당한 수준의 유전자 전달을 달성하는 수단을 제공한다.
본원에 사용된 용어 scFv와 관련하여 사용된 "가요성 폴리펩티드 링커" 또는 "링커"는 중쇄 및 가변 경쇄 영역을 함께 연결하기 위해 단독으로 또는 조합하여 사용되는 글리신 및/또는 세린 잔기와 같은 아미노산으로 이루어지는 펩티드 링커를 지칭한다. 한 구현예에서, 가요성 폴리펩티드 링커는 Gly/Ser 링커이고 아미노산 서열 (Gly-Gly-Gly-Ser)n을 포함하며, 여기서 n은 1 이상의 양의 정수이다. 예를 들어, n=1 , n=2, n=3. n=4, n=5 및 n=6, n=7, n=8, n=9 및 n=10(서열번호 6592). 한 구현예에서, 가요성 폴리펩티드 링커는 (Gly4 Ser)4 또는 (Gly4 Ser)3을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 다른 구현예에서, 링커는 (Gly2Ser), (GlySer) 또는 (Gly3Ser)의 다중 반복을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "변형된"은 본 발명의 분자 또는 세포의 상태 또는 구조가 변화된 것을 의미한다. 분자는 화학적, 구조적 및 기능적을 포함하여, 다양한 방식으로 변형될 수 있다. 세포는 핵산의 도입을 통해 변형될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "조절하는"은 치료 또는 화합물이 없는 대상체의 반응 수준과 비교하여, 및/또는 다른 점은 동일하지만 치료를 받지 않은 대상체의 반응 수준과 비교하여, 대상체의 반응 수준의 검출가능한 증가 또는 감소를 매개하는 것을 의미한다. 이 용어는 고유의 신호 또는 반응을 동요시키고/시키거나 영향을 주어 대상체, 바람직하게는 인간에서 유익한 치료 반응을 매개하는 것을 포함한다.
본 발명의 맥락에서, 통상적으로 발생하는 핵산 염기에 대해 하기의 약어가 사용된다. "A"는 아데노신, "C"는 시토신, "G"는 구아노신, "T"는 티미딘, "U"는 유리딘을 지칭한다.
달리 명시되지 않는 한, "아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열"은, 서로의 축퇴 버전이며 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 단백질 또는 RNA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이라는 어구는 또한 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 일부 버전에서 인트론(들)을 함유할 수 있는 정도까지 인트론을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "작동적으로 연결된"은 조절 서열과 이종 핵산 서열 사이의 기능적 연결을 의미하며, 그 결과 이종 핵산 서열이 발현된다. 예를 들어, 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적 관계에 위치할 때 제1 핵산 서열은 제2 핵산 서열과 작동적으로 연결된다. 예를 들어, 프로모터가 암호화 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미치는 경우 프로모터는 암호화 서열에 작동적으로 연결된다. 일반적으로, 작동 가능하게 연결된 DNA 서열은 연속적이며, 필요한 경우 2개 단백질의 암호화 영역을 연결하기 위해 동일한 판독 프레임 중에 있다.
본원에 사용된 용어 "과발현된" 종양 항원 또는 종양 항원의 "과발현"은 특정 조직이나 기관의 정상 세포에서의 발현 수준과 비교된, 환자의 해당 조직 또는 기관 내의 고형 종양과 같은 질환 영역의 세포에서의 종양 항원의 비정상적인 발현 수준을 나타내려고자 한다. 종양 항원의 과발현을 특징으로 하는 고형 종양 또는 혈액학적 악성종양을 갖는 환자는 당업계에 공지된 표준 분석에 의해 결정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 면역원성 조성물의 "비경구" 투여라는 용어는 예를 들어 피하(sc), 정맥내(iv), 근육내(im), 또는 흉골내 주사 또는 주입 기법을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 쇄로서 정의된다. 또한, 핵산은 뉴클레오티드의 중합체이다. 따라서, 본원에 사용된 핵산 및 폴리뉴클레오티드는 상호교환 가능하다. 당업자는 핵산이, 단량체성 "뉴클레오티드"로 가수분해될 수 있는 폴리뉴클레오티드라는 일반적인 지식을 가지고 있다. 단량체성 뉴클레오티드는 뉴클레오시드로 가수분해될 수 있다. 본원에 사용된 폴리뉴클레오티드는 비제한적으로, 재조합 수단, 즉 재조합 라이브러리 또는 세포 게놈으로부터의 핵산 서열의 클로닝을 포함하여, 당업계에서 이용 가능한 임의의 수단에 의해, 통상적인 클로닝 기술과 PCR™ 등을 사용하여, 합성 수단에 의해 획득되는 모든 핵산 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질"은 상호교환적으로 사용되며, 펩티드 결합에 의해 공유 결합된 아미노산 잔기를 포함하는 화합물을 지칭한다. 단백질 또는 펩티드는 적어도 2개의 아미노산을 포함해야 하며, 단백질 또는 펩티드의 서열을 포함할 수 있는 아미노산의 최대 수에는 제한이 없다. 폴리펩티드에는 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩티드 또는 단백질이 포함된다. 본원에 사용된 용어는 예를 들어 당업계에서 일반적으로 펩티드, 올리고펩티드 및 올리고머로서 지칭되는 단쇄 및 일반적으로 당업계에서 단백질로서 지칭되는 장쇄를 모두 지칭하며, 다수의 유형이 존재한다. "폴리펩티드"에는 특히, 예를 들어 생물학적 활성 단편, 실질적으로 상동성인 폴리펩티드, 올리고펩티드, 동종이량체, 이종이량체, 폴리펩티드의 변이체, 변형된 폴리펩티드, 유도체, 유사체, 융합 단백질 등이 포함된다. 폴리펩티드에는 천연 펩티드, 재조합 펩티드, 합성 펩티드 또는 이들의 조합이 포함된다.
본원에 사용된 용어 "프로모터"는 폴리뉴클레오티드 서열의 특정 전사를 개시하는 데 필요한 세포의 합성 기구 또는 도입된 합성 기구에 의해 인식되는 DNA 서열로서 정의된다.
본원에 사용된 용어 "프로모터/조절 서열"은 프로모터/조절 서열에 작동적으로 연결된 유전자 산물의 발현에 필요한 핵산 서열을 의미한다. 일부 경우에 이 서열은 핵심 프로모터 서열일 수 있고, 다른 경우에 이 서열은 또한 유전자 산물의 발현에 필요한 인핸서 서열 및 기타 조절 요소를 포함할 수 있다. 프로모터/조절 서열은 예를 들어 조직 특이적 방식으로 유전자 산물을 발현하는 서열일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "구성적 프로모터"는, 유전자 생성물을 암호화하거나 지정하는 폴리뉴클레오티드와 작동적으로 연결될 때 세포의 대부분 또는 모든 생리학적 조건 하에서 세포에서 유전자 생성물이 생성되도록 하는 뉴클레오티드 서열이다.
본원에 사용된 용어 "유도성 프로모터"는 유전자 산물을 암호화하거나 지정하는 폴리뉴클레오티드와 작동적으로 연결될 때, 실질적으로 프로모터에 상응하는 유도인자가 세포 중에 존재할 때만 상기 유전자 산물이 세포에서 생성되도록 하는 뉴클레오티드 서열이다.
본원에 사용된 용어 "조직-특이적 프로모터"는 유전자를 암호화하거나 유전자에 의해 특정되는 폴리뉴클레오티드와 작동적으로 연결될 때, 실질적으로 세포가 프로모터에 상응하는 조직 유형의 세포인 경우에만 유전자 산물이 세포에서 생성되도록 하는 뉴클레오티드 서열이다.
본원에 사용된 용어 "센다이 바이러스"는 파라믹소비리다에(Paramyxoviridae) 과의 속을 지칭한다. 센다이 바이러스는 숙주 게놈에 통합되거나 숙주 세포의 유전 정보를 변경하는 것이 아닌 음성의 단일 가닥 RNA 바이러스이다. 센다이 바이러스는 숙주 범위가 매우 넓으며 인간에 대해 병원성이 아니다. 재조합 바이러스 벡터로서 사용되는 경우, 센다이 바이러스는 일시적이지만 강한 유전자 발현이 가능하다.
본원에 사용된 용어 "신호 전달 경로"는 세포의 한 부분에서 세포의 다른 부분으로 신호를 전달하는 역할을 하는 다양한 신호 전달 분자 사이의 생화학적 관계를 지칭한다. "세포 표면 수용체"라는 문구는 신호를 수신하고 세포의 원형질막을 통해 신호를 전달할 수 있는 분자 및 분자 복합체를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "단쇄 항체"는 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 단편이 조작된 범위의 아미노산을 통해 Fv 영역에 연결되는 재조합 DNA 기법에 의해 형성된 항체를 지칭한다. 단쇄 항체를 생성하는 다양한 방법, 예를 들어 하기에 기재된 것들이 공지되어 있다: 미국특허 4,694,778; Bird, Science 242:423-442 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879- 5883 (1988); Ward et al., Nature 334:54454 (1989); Skerra et al., Science 242:1038-1041 (1988).
본원에 사용된 용어 "특이성"은 주어진 표적 항원(예를 들어, 인간 표적 항원)에 특이적으로 결합하는(예를 들어, 면역반응하는) 능력을 지칭한다. 키메라 항원 수용체는 단일특이적일 수 있고 표적에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 결합 부위를 함유할 수 있거나, 또는 키메라 항원 수용체는 다중특이적일 수 있으며 동일하거나 상이한 표적에 특이적으로 결합하는 2개 이상의 결합 부위를 함유할 수 있다. 특정 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 동일한 표적의 2개의 상이한(예를 들어, 비-중첩) 부분에 특이적이다. 특정 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 하나 초과의 표적에 특이적이다.
항체와 관련하여 본원에 사용된 용어 "특이적으로 결합하다"는 특정 항원을 인식하지만 샘플 내 다른 분자를 실질적으로 인식하거나 이에 결합하지 않는 항체 또는 이의 결합 단편(예를 들어, scFv)을 의미한다. 예를 들어, 한 종의 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 하나 이상의 종의 항원에도 결합할 수 있다. 그러나 이러한 종간 반응성 자체가 특정 항체의 분류를 변경시키지는 않는다. 또 다른 예에서, 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 항원의 다양한 대립형질 형태에도 결합할 수 있다. 그러나 이러한 교차 반응성 자체가 특정 항체의 분류를 변경시키지는 않는다. 일부 경우에, "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하는"이라는 용어는 항체, 단백질, 키메라 항원 수용체 또는 펩티드와 제2 화학종과의 상호작용과 관련하여 사용될 수 있으며, 이는 상기 상호작용이 화학종에 대한 특정 구조(예를 들어, 항원 결정인자 또는 에피토프)의 존재에 따라 달라진다는 것을 의미한다; 예를 들어 키메라 항원 수용체는 일반적으로 단백질보다는 특정 단백질 구조를 인식하고 이에 결합한다. 항체가 에피토프 "A"에 특이적인 경우, 표지된 "A" 및 항체를 함유하는 반응에서 에피토프 A(또는 표지되지 않은 유리 A)를 함유하는 분자의 존재는 항체에 결합된 표지된 A의 양을 감소시킬 것이다.
본원에 사용된 용어 "자극"은 자극 분자(예를 들어, TCR/CD3 복합체)와 그의 동족 리간드와의 결합에 의해 유도되어 신호 전달 사건, 예를 들어 비제한적으로 TCR/CD3 복합체를 통한 신호 전달을 매개하는 1차 반응을 의미한다. 자극은 TGF-베타의 하향 조절 및/또는 세포골격 구조의 재구성, 클론 확장 및 별개의 하위 집합으로의 분화와 같은 특정 분자의 발현 변경을 매개할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "자극 분자"는 항원 제시 세포에 존재하는 동족 자극 리간드와 특이적으로 결합하는 T 세포 상의 분자를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "자극 리간드"는 항원 제시 세포(예를 들어, aAPC, 수지상 세포, B-세포 등) 상에 존재할 때 T 세포상의 동족 결합 상대(본원에서 "자극 분자"로서 지칭됨)와 특이적으로 결합하여, T 세포에 의한 1차 반응, 예를 들어 비제한적으로 면역 반응의 활성화, 개시, 증식 등을 매개할 수 있는 리간드를 의미한다. 자극 리간드는 당업계에 주지되어 있으며, 특히 펩티드, 항-CD3 항체, 초효능제 항-CD28 항체 및 초효능제 항-CD2 항체가 로딩된 MHC 부류 I 분자를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "대상체" 및 "환자"는 상호교환적으로 사용된다. 본원에 사용된 바와 같이, 대상체는 비-영장류(예를 들어, 소, 돼지, 말, 고양이, 개, 래트 등) 또는 영장류(예를 들어, 원숭이 및 인간)와 같은 포유동물일 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 사용된 용어 "대상체"는 포유동물과 같은 척추동물을 지칭한다. 포유동물에는 인간, 인간이 아닌 영장류, 야생 동물, 길거리 동물, 농장 동물, 스포츠 동물 및 반려동물이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 면역 반응이 유도될 수 있는 모든 살아있는 유기체가 대상체 또는 환자일 수 있다. 특정한 예시적인 구현예에서, 대상체는 인간이다.
본원에 사용된 용어 "실질적으로 정제된" 세포는 본질적으로 다른 세포 유형이 없는 세포이다. 실질적으로 정제된 세포는 또한 자연 발생 상태에서 일반적으로 연관되어 있는 다른 세포 유형으로부터 분리된 세포를 지칭한다. 일부 경우에, 실질적으로 정제된 세포 집단은 동종 세포 집단을 지칭한다. 다른 경우에 이 용어는 단순히 자연 상태에서 자연적으로 결합되어 있는 세포에서 분리된 세포를 지칭한다. 일부 구현예에서, 세포는 시험관 내에서 배양된다. 다른 구현예에서, 세포는 시험관 내에서 배양되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "표적 부위" 또는 "표적 서열"은 결합이 일어나기에 충분한 조건 하에서 결합 분자가 특이적으로 결합할 수 있는 핵산의 일부를 정의하는 게놈 핵산 서열을 지칭한다.
gRNA와 관련하여 본원에 사용된 용어 "표적화 도메인"은 표적 서열, 예를 들어, 세포의 핵산 내(예를 들어, 유전자 내) 표적 서열을 인식하거나 이에 상보적인 gRNA 분자의 일부를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "표적 서열"은 gRNA 표적화 도메인에 상보적인, 예를 들어 완전히 상보적인 핵산 서열을 지칭한다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 게놈 DNA 상에 배치된다. 일부 구현예에서 표적 서열은 뉴클레아제 또는 다른 효과기 활성을 갖는 단백질에 의해 인식되는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열, 예를 들어 Cas9에 의해 인식되는 PAM 서열(DNA의 동일한 가닥 또는 상보적 가닥 상에)에 인접해 있다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 동종이계 T 세포 표적의 표적 서열이다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 억제 분자의 표적 서열이다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 억제 분자의 하류 효과기의 표적 서열이다.
본원에 사용된 용어 "T 세포 수용체" 또는 "TCR"은 항원 제시에 반응하여 T 세포의 활성화에 참여하는 막 단백질의 복합체를 지칭한다. TCR은 주조직적합성 복합체 분자에 결합된 항원을 인식하는 역할을 한다. TCR은 3개의 이량체 모듈 CD3δ/CD3ε, CD3γ/CD3ε 및 CD3ζ/CD3ζ에 커플링된 알파(a) 및 베타(β) 쇄의 이종이량체로 구성된다. 일부 세포에서 TCR은, 감마 및 델타(γ/δ) 쇄(CD3γ/CD3ε)로 이루어진다. 일부 구현예에서, TCR은 구조적으로 유사하지만 별개의 해부학적 위치와 기능을 갖는 알파/베타 및 감마/델타 형태로 존재할 수 있다. 각 쇄는 가변 도메인과 불변 도메인이라는 2개의 세포외 도메인으로 구성된다. 일부 구현예에서, TCR은 예를 들어 헬퍼 T 세포, 세포독성 T 세포, 기억 T 세포, 조절 T 세포, 자연 살해 T 세포 및 감마 델타 T 세포를 포함하여 TCR을 포함하는 임의의 세포에서 변형될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "치료학적"은 치료 및/또는 예방을 의미한다. 치료학적 효과는 질환 상태의 억제, 완화 또는 근절을 통해 획득된다.
본원에 사용된 용어 "요법"은 질환 또는 이와 관련된 증상의 예방, 관리, 치료 및/또는 개선에 사용될 수 있는 임의의 프로토콜, 방법 및/또는 작용제(예를 들어, CAR-T)를 지칭한다. 일부 구현예에서, 용어 "치료법" 및 "요법"은 의료인과 같은 당업자에게 알려진 질환 또는 이와 관련된 증상의 예방, 관리, 치료 및/또는 치료에 유용한 생물학적 요법(예를 들어, 입양 세포 요법), 지지 요법(예를 들어, 림프구고갈 요법), 및/또는 기타 요법을 지칭한다.
gRNA 분자와 관련하여 본원에 사용된 용어 "tracr"은 뉴클레아제 또는 다른 효과기 분자에 결합하는 gRNA의 일부를 지칭한다. 일부 구현예에서, tracr은 Cas9에 특이적으로 결합하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, tracr은 깃대의 일부를 형성하는 핵산 서열을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된"은 외인성 핵산이 숙주 세포 내로 전달되거나 도입되는 과정을 지칭한다. "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된" 세포는 외인성 핵산으로 형질감염, 형질전환 또는 형질도입된 세포이다. 세포는 1차 대상체 세포 및 그 자손을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "치료하다", "치료" 및 "치료하는"은 하나 이상의 요법(예를 들어, 비제한적으로 고형 종양의 치료에 대한 CAR-T 요법)의 투여로부터 발생하는, 질환 또는 이와 관련된 증상의 진행, 중증도, 빈도 및/또는 기간의 감소 또는 개선을 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "치료하는"은 또한 치료되는 대상체의 질환 경과를 변경시키는 것을 지칭할 수 있다. 치료의 치료학적 효과에는 질환의 발생 또는 재발 예방, 증상(들)의 완화, 질환의 직간접적인 병리학적 결과의 감소, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 호전 또는 경감, 및 완화 또는 예후 개선이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "전사 조절 하에" 또는 "작동적으로 연결된"은 프로모터가 RNA 폴리머라제에 의한 전사 개시 및 폴리뉴클레오티드의 발현을 조절하기 위해 폴리뉴클레오티드와 관련하여 올바른 위치 및 배향에 있음을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "벡터"는, 단리된 핵산을 포함하고 단리된 핵산을 세포 내부로 전달하는 데 사용될 수 있는 물질의 조성물이다. 선형 폴리뉴클레오티드, 이온성 또는 양친매성 화합물과 연관된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드 및 바이러스를 포함하지만 이에 제한되지 않는 수많은 벡터가 당업계에 공지되어 있다. 따라서 "벡터"라는 용어에는 자율적으로 복제되는 플라스미드 또는 바이러스가 포함된다. 이 용어는 또한 핵산의 세포 내로의 전달을 촉진하는 비-플라스미드 및 비-바이러스 화합물, 예를 들어 폴리리신 화합물, 리포솜 등을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 바이러스 벡터의 예는 센다이 바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "이종발생성(Xenogeneic)"은 다른 종의 동물로부터 유래된 이식편을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "완전 배지" 및 "완전 배지"는 면역 세포 성장(예를 들어, T 세포 성장)에 최적화된 세포 배양 배지를 지칭한다. 일부 경우에, 완전 배지는 단백질, 무기염, 미량원소, 비타민, 아미노산, 지질, 탄수화물, 사이토카인 및/또는 성장 인자를 포함하며, 여기서 각 성분의 비는 세포 성장에 최적화되었다. 예시적인 단백질에는 알부민, 트랜스페린, 피브로넥틴 및 인슐린이 포함된다. 예시적인 탄수화물에는 글루코스가 포함된다. 예시적인 무기염에는 나트륨, 칼륨 및 칼슘 이온이 포함된다. 예시적인 미량원소에는 아연, 구리, 셀레늄 및 트리카르복실산이 포함된다. 예시적인 아미노산에는 L-글루타민(예를 들어, 알라닐-1-글루타민 또는 글리실-1-글루타민)과 같은 필수 아미노산; 또는 글리신, L-알라닌, L-아스파라긴, L-아스파르트산, L-글루탐산, L-프롤린 및/또는 L-세린과 같은 불필수 아미노산(NEAA)이 포함된다. 일부 구현예에서, 완전 배지는 또한 나트륨 비카보네이트(NaHCO3), HEPES(4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진 에탄설폰산), 페놀 레드, 항생제 및/또는 β-머캅토에탄올 중 하나 이상을 포함한다. 일부 경우에, 완전 배지는 무혈청 배지인 경우도 있다. 일부 경우에, 완전 배지는 무-이종(xeno-free) 배지이다.
본원에 사용된 용어 "화학적으로 정의된 배지"는 모든 성분의 조성 및 농도가 알려져 있는 세포 배양 배지를 지칭한다. 이는 완전 배지가 조성 및/또는 농도를 알 수 없는 성분(예를 들어, 동물 유래 성분)을 포함할 수 있다는 점에서 완전 배지와 다르다.
일부 경우에, "무-이종" 배지에는 어떠한 동물 유래(비-인간) 성분도 포함되어 있지 않다. 일부 경우에, 무-이종 배지는 인간 혈청, 성장 인자 및 인슐린과 같은 인간 유래 성분을 하나 이상 함유한다.
일부 구현예에서, "무-혈청" 배지는 혈청 또는 혈장을 함유하지 않지만, 혈청 또는 혈장으로부터 유래된 성분을 함유할 수 있다. 일부 경우에, "무-혈청" 배지는 소 혈청 알부민(BSA)과 같은 동물 유래 성분을 함유한다.
일부 구현예에서, "최소" 배지는 표적 세포의 성장을 위한 최소한의 필수성분을 포함한다. 일부 경우에 최소 배지는 무기염, 탄소원 및 물을 함유한다. 일부 경우에, 보충제, 사이토카인, 및/또는 알부민(예를 들어, HSA)과 같은 단백질이 최소 배지에 추가된다. 본원에 사용된 바와 같이, 보충제는 미량원소, 비타민, 아미노산, 지질, 탄수화물, 사이토카인, 성장 인자 또는 이들의 조합을 포함한다.
범위: 본 개시내용 전체에 걸쳐, 본 발명의 다양한 양태가 범위 형식으로 제시될 수 있다. 범위 형식의 기재는 단지 편의와 간결성을 위한 것이며 본 발명의 범위에 대한 융통성 없는 제한으로 해석되어서는 안 된다는 점을 이해해야 한다. 따라서, 범위에 대한 기재는 가능한 모든 하위 범위뿐만 아니라 그 범위 내의 개별 수치도 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 1 내지 6의 범위에 대한 기재는 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6과 같은 구체적으로 개시된 하위 범위뿐만 아니라 해당 범위 내의 개별 숫자, 예를 들어 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3 및 6을 갖는 것으로 간주되어야 한다. 이는 범위의 폭에 관계없이 적용된다.
실시예
이들 실시예는 단지 예시의 목적으로만 제공되며 본원에 제공된 청구범위를 제한하지 않는다.
실시예 1
본 실시예는 본 개시내용의 신규의 동종이계 CART 세포를 제조하는 데 사용되는 물질 및 방법을 제공한다.
1차 인간 T 세포 확장 및 세포 동결보존. T 세포를 배지에서 1x106 세포/㎖로 배양하고 배양 시작 시 Dynabeads®(ThermoFisher)를 사용하여 활성화하였다. NC200™ 자동 세포 계수기(Chemometec)를 사용하여 격일로 세포 수를 카운트하였다. 또한, 세포 생존력 및 세포 크기를 격일로 측정하였다. 세포에 신선한 T 세포 배지를 공급하고 5x105 세포/㎖로 재현탁시켰다. 9-11일 차에, 세포를 수확하고 5% DMSO를 함유하는 동결 배지에서 동결보존하였다.
다색성 유세포 분석. 세포를 세척하고 FACS 완충액(5% 송아지 태아 혈청을 함유하는 포스페이트 완충 식염수)에 재현탁시켰다. 특정 형광단에 접합된 항체의 마스터 믹스를 세포에 첨가하였다. 세포를 세척하고 FACS 완충액에 재현탁시킨 후 MACSQuant® 세포계수기(Miltenyi)를 사용하여 분석하였다. 사용된 항체 패널은 생존력 평가를 위한 항-CD3-VioBlue, 항-TCRab-APC, 항-B2M-PE-Vio770, 항-HLA-DR-VioGreen, 항-HLAI-ABC-FITC, 항-CAR-PE 및 7AAD를 포함하였다. FlowJo® 소프트웨어(BD Biosciences)를 데이터 분석에 사용하였다.
1차 인간 T 세포의 유전자 편집. 각 표적에 대한 각각의 안내 RNA와 접합된 뉴클레아제 형태의 리보핵단백질(RNP)을 인간 T 세포에 형질감염시켰다. 세포를 5% 인간 혈청, IL-7, IL-15 및 글루타민을 함유하는 특수 T 세포 배지에서 5-8일 동안 배양하였다. 배양이 끝나면 각 하나의 유전자 표적에 대한 유전자 편집 효율 수준을 동시에 결정하기 위해 다색성 유세포 분석을 수행하였다.
실시간 종양 세포독성 분석. CAR T 세포 세포독성 능력을 xCelligence™ 실시간 세포 분석 장비(Agilent)를 사용하여 평가하였다. 간략하게, CAR T 세포를 종양 표적 세포와 함께 미세적정 플레이트에서 수일 동안 다양한 효과기 대 표적 비(예를 들어, 1:10, 1:5, 1:2.5, 1:1)로 공동 배양하였다. 종양 세포사를 각 조건에 대해 측정된 세포 임피던스의 변화에 따라 지속적으로 결정하였다. 데이터를 RTCA® 소프트웨어(Agilent)를 사용하여 수집하였다.
T7E1 엔도뉴클레아제 분석에 의한 유전자 편집 효율. 분자 수준에서 유전자 편집 효율을 결정하기 위해 우리는 각 특정 유전자 표적에 맞춘 T7E1 엔도뉴클레아제 분석을 사용하였다. 전체 게놈 DNA를 T 세포로부터 단리하여 영하 80℃에 보관하거나 분석에 직접 사용하였다. 각 표적에 대한 절단 부위에 걸쳐 있는 프라이머를 사용한 PCR 반응을 수행하였다. PCR 산물을 겔 전기영동으로 분석하여 앰플리콘 크기 및 양을 검증하였다. 이어서 T7E1 뉴클레아제를 사용하여 PCR 앰플리콘을 절단하고 2100 고성능 자동 전기영동 BioAnalyzer® 장비(Agilent)를 사용하여 분석하였다. 2100 Expert® 소프트웨어가 유전자 편집 효율을 결정하는 데 사용되었다.
혼합 백혈구 반응. 관련 없는 공여자("2차 공여자"로 표지됨)로부터의 T 세포와 동종이계 CAR T 세포와의 공동 배양을 다양한 비로 설정하고 16일 동안 추적하였다. 세포사를, 각 특정 세포 유형(즉, 동종이계 CART 세포 대 "2차 공여자의" T 세포)을 구별하고 추적하기 위해 특정 마커를 사용하는 유세포 분석에 의해 결정하였다. 유세포 분석 전에 123count™ eBeads를 추가하여 세포의 절대 수를 결정하고, 7AAD 염료를 사용하여 세포 생존력을 평가하였다.
실시예 2
본 실시예의 목적은 삼중 녹아웃 전략을 상세히 설명하는 것이었다.
하기 표 3은 본 개시내용의 삼중 녹아웃 전략(3-유전자 녹아웃 조합)을 포함하는 신규의 동종이계 CART 세포 플랫폼을 예시한다. 독특한 접근법은 TCR 모듈( CD3δ, CD3ε 및 CD3γ)의 하나 이상의 유전자, HLA-I의 하나 이상의 유전자 및 HLA-II의 하나 이상의 유전자를 표적화함을 수반한다.
[표 3]
CRISPR 조합
다수의 유전자를 녹아웃시키는 전략은 개선된 동종이계 T 세포 생성물을 생성시킬 것으로 예상된다.
실시예 3
본 실시예의 목적은 적어도 하나의 녹아웃 유전자를 갖는, 본원에 기재된 바와 같은 다양한 작제물을 제조하는 것이었다.
표 1은 대안적인 T 세포 수용체 서브유닛(CD3δ, CD3γ 및 CD3ε)의 녹아웃(KO) 및 항원 가공 및 제시 경로에서 추가의 중요한 유전자를 수반하는 본 개시내용의 신규의 동종이계 CART 전략을 예시한다. 특히, 15개의 유전자 표적을 선택하고 각각 CRISPR-연관(Cas)(CRISPR-Cas) 엔도뉴클레아제 시스템을 사용하여 다중 안내 RNA(gRNA)로 시험하였다. 15개 유전자를 표적화하는 데 사용된 예시적인 gRNA는 표 4에 개시되어 있다.
[표 4]
예시적인 gRNA
실시예 4
본 실시예의 목적은 CD3δ(도 2A), CD3ε(도 2B) 및 CD3γ(도 2C)의 표적화된 붕괴에 초점을 맞춘 다양한 작제물을 사용하여 TCR α/β의 녹아웃 효율을 평가하는 것이었다.
인간 T 세포에 대한 TCR-α 및 TCR-β 쇄 붕괴 효율의 백분율을 CRISPR/Cas 시스템을 사용하여 CD3δ(도 2A), CD3ε(도 2B) 및 CD3γ(도 2C) 유전자의 표적화된 붕괴 후 유세포 분석에 의해 측정하였다. 도 2A는 4개의 상이한 안내 RNA, 즉 gRNA1, gRNA2, gRNA3 및 gRNA4를 사용하여 CD3δ 붕괴 후 결과를 도시한다. CRISPR/Cas 시스템에서 gRNA1 및 gRNA3 안내 RNA를 사용하여 CD3δ를 붕괴시킨 결과 TCR α/β의 100% KO 효율이 발생한 반면, CRISPR/Cas 시스템에서 gRNA2 및 gRNA4를 사용하면 TCRα/β의 약 90% 초과의 KO 효율이 발생하였다. 따라서 CD3δ 붕괴의 경우 CRISPR/Cas 시스템에서는 gRNA1 및 gRNA3의 사용이 바람직하다.
도 2B는 gRNA1, gRNA2, gRNA3, gRNA4 및 gRNA5의 5개의 상이한 안내 RNA를 사용하여 CD3ε의 표적화된 붕괴에 따른 결과를 도시한다. CRISPR/Cas 시스템에서 gRNA4 및 gRNA5 안내 RNA를 사용하여 CD3ε를 붕괴시킨 결과 TCR α/β의 100% KO 효율이 발생한 반면, gRNA1을 사용하면 TCR α/β의 KO 효율이 약 50%에 불과하였고, 최종적으로 CRISPR/Cas 시스템에서 안내 gRNA2 및 gRNA3을 사용하면 TCR α/β의 약 90% 초과의 KO 효율이 발생하였다. 따라서 CD3ε 붕괴의 경우 CRISPR/Cas 시스템에서는 gRNA4 및 gRNA5 안내 RNA를 사용하는 것이 바람직하다.
도 2C는 5개의 상이한 안내 RNA인 gRNA1, gRNA2, gRNA3, gRNA4 및 gRNA5를 사용하여 CD3γ의 표적화된 붕괴에 따른 결과를 도시한다. CRISPR/Cas 시스템에서 gRNA4 및 안내 RNA를 사용한 CD3ε의 붕괴는 TCR α/β의 100% KO 효율을 초래한 반면, gRNA5를 사용하면 TCR α/β의 약 95% 초과의 KO 효율이 발생하였고, 최종적으로 CRISPR/Cas 시스템에서 gRNA1, gRNA2 및 gRNA3 안내 RNA를 사용하면 TCR α/β의 덜 유리한 KO 효율이 발생하였다. 따라서 CD3γ 붕괴의 경우 CRISPR/Cas 시스템에서는 gRNA4 안내 RNA를 사용하는 것이 바람직하다.
실시예 5
본 실시예의 목적은 10일의 기간에 걸쳐 동종이계 CART 세포의 다양한 작제물의 확장을 평가하는 것이었다.
시험된 다양한 작제물에는 (1) TRAC 녹아웃(도 3의 ALLO(TRAC KO))(예를 들어, 본 개시내용 이전에 사용된 녹아웃), (2) CD3δ 녹아웃(도 3의 ALLO(D1 KO)), (3) CD3γ 녹아웃(도 3의 ALLO(G4 KO)), 및 (4) CD3ε 녹아웃(도 3의 ALLO(E4 KO))을 포함하는 동종이계 CART 세포가 포함되었다. 세포 집단 배가의 백분율은 Y 축에 표시되고 일수는 X 축에 표시된다. 결과는 도 3에 상세히 설명되어 있다.
도 3은 도 1의 전략을 사용하여 생성된 동종이계 CART-세포의 확장을 예시하고 10일의 기간에 걸친 집단 배가 수를 예시하는 그래프를 도시한다. 시험된 동종이계 CART 세포는 TRAC 녹아웃(TRAC KO), CD3δ 녹아웃(D1 KO), CD3γ 녹아웃(G4 KO) 및 CD3ε 녹아웃(E4 KO)을 포함하는 조작된 T 세포이다.
실시예 6
본 실시예는 TCR-α/β 쇄의 표면 발현을 비교하기 위해 여러 상이한 녹아웃 작제물을 평가하였다.
도 4A 및 4B는 TCR-α 쇄(TRAC) 녹아웃(예를 들어, 본 개시내용 이전에 사용된 작제물), CD3δ 녹아웃(D1 KO), CD3γ 녹아웃(G4 KO) 및 CD3ε 녹아웃(E4 KO)의 CRISPR 매개 하향조절을 비교하는 유세포 분석 결과를 도시한다. 도 4A는 TCR-α/β 쇄의 표면 발현에 의해 측정된 바와 같이, CD3ε 녹아웃(E4 KO)이 T 세포 수용체 녹아웃에 더 양호한 표적임을 나타낸다. 도 4B는 CD3ε 녹아웃(E4 KO)을 포함하는 동종이계 CART 세포가, 예를 들어 CD3γ 또는 CD3δ 녹아웃을 포함하는 CART 세포보다 더 높은 형질도입 효율을 갖고 기능적으로 더 양호하다는 것을 나타내며; PSMA CART 세포 구현예가 예시되어 있다.
실시예 7
본 실시예의 목적은 다양한 PSMA CART 세포 작제물의 종양 사멸 능력을 평가하는 것이었다.
도 5는 TCR-α 쇄(TRAC) 녹아웃(예를 들어, 본 개시내용 이전에 사용된 작제물), CD3δ 녹아웃(D1), CD3ε 녹아웃(E4) 및 CD3γ 녹아웃(G4)을 포함하는 동종이계 PSMA CART 세포의 종양 사멸 능력을 입증하는 그래프를 도시한다. PSMA E4 동종이계 CART 세포가 최고의 사멸 능력을 가지고 있음을 나타낸다. 표적 세포는 PC3 세포였으며, 이는 인간 전립선암 세포주이다.
이러한 결과는 하나의 CD3 서브유닛의 표적화된 붕괴가 다른 CD3 서브유닛의 표적화된 붕괴와 비교할 때 더 효능있는 동종이계 CART 세포를 생성할 것으로 예상되지 않았기 때문에 놀랍고 예상치 못한 것이었다. 도 5는 CD3ε를 표적으로 하는 allo CART 세포(예를 들어, CD3ε 녹아웃(E4))가 allo TCR-α 쇄(TRAC) 녹아웃 CART 세포, allo CD3δ 녹아웃(D1) CART 세포, 또는 allo CD3γ 녹아웃(G4) CART 세포와 비교하여 더 효능있다는(즉 종양 세포를 더 빠르게 사멸시킨다는) 뜻밖의 발견을 입증한다.
실시예 8
본 실시예의 목적은 표적 유전자의 녹아웃에 영향을 미치는 CRISPR-Cas 방법의 효과를 평가하는 것이었다. 특히,
도 6A-6D는 T7 엔도뉴클레아제 불일치 검출 분석(T7E1)으로 예시된 CRISPR-Cas 활성을 도시한다. 도 6A는 3개의 상이한 gRNA를 사용하여 3개의 상이한 CRISPR-Cas C2TA(CIITA) 유전자 부위로부터 증폭된 T7E1-처리된 PCR 산물의 전형적인 겔 전기영동 이미지를 도시한다. 도 6B-6D는 CRISPR-Cas 편집 효율을 입증하는 T7E1 엔도뉴클레아제 분석의 Agilent Bioanalyzer 전기영동도에 의해 생성된 전기영동도를 도시한다.
또한, 도 7A-D는 C2TA(CIITA) CRISPR 편집 효율 결과를 예시하는 대조군 및 T7E1 처리 PCR의 Agilent Bioanalyzer 전기영동도 및 겔 전기영동을 도시한다.
실시예 9
본 실시예의 목적은 다양한 세포 유형의 생존력을 결정하는 것이었다.
혼합 림프구 분석(MLA)이 수행되었다. 도 8은 Allo 세포 단독, T 세포(2차 공여자) 단독, 공동 배양에서 Allo 세포, 및 공동 배양에서 T 세포(2차 공여자)에 대한 혼합 림프구 반응(MLR) 분석 결과를 예시하는 그래프를 도시한다. 특히, 수용자의 T 세포(다른 공여자의 T 세포)를 동종이계 CART 세포와 14일 동안 공동 배양하고 T 세포의 증식을 분석하였다.
결과는 대조용 T 세포(2차 공여자), 단독 또는 공동 배양물 중의 동종이계 PSMA CART 세포의 생존력을 입증하고, "수용자의" T 세포는 동종이계 세포의 존재에 반응하지 않았다(증식 없음)는 것을 나타낸다. 그러므로, 도 8은 HLA 불일치의 존재에도 불구하고 공동 배양에서 2차(관련되지 않은) 공여자로부터의 T 세포가 동종이계 PSMA CART 세포에 반응하여 증식하지 않았음을 나타낸다. 동종이계 CART는 PSMA CART 및 CRISPR 편집된 TRAC/B2M/C2TA gRNA를 포함한다. 따라서, 본 발명의 동종이계 CART 세포는 수용자의 면역계(즉, T 세포)에 의해 검출되지 않으면서 종양 세포를 사멸시킬 기회의 창을 가질 것이다.
* * * *
특정 구현예가 예시되고 기재되었지만, 이는 하기의 청구범위에 정의된 더 넓은 양태의 기술로부터 이탈됨 없이 당업자에 따라 변경 및 수정이 이루어질 수 있다는 것을 이해해야 한다.
본원에 예시적으로 기재된 구현예는 본원에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소(들), 제한 또는 한계 없이 적절하게 실시될 수 있다. 따라서, 예를 들어, "포함하는", "내포하는", "함유하는" 등의 용어는 제한 없이 광범위하게 해석되어야 한다. 또한, "~로 필수적으로 이루어지는"이라는 문구는 구체적으로 언급된 요소와 청구된 기술의 기본적이고 새로운 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 추가 요소를 포함하는 것으로 이해된다. "~로 이루어지는"이라는 문구는 명시되지 않은 임의의 요소를 제외한다.
또한, 본 개시내용의 특징 또는 양태가 Markush 그룹의 관점에서 기술되는 경우, 당업자는 본 개시내용이 또한 이에 의해 Markush 그룹의 임의의 개별 구성원 또는 구성원의 하위 그룹의 관점에서 기술된다는 것을 인식할 것이다.
당업자가 이해하는 바와 같이, 모든 목적을 위해, 특히 서면 기재를 제공하는 양태에서, 본원에 개시된 모든 범위는 또한 종말점을 포함하여 모든 가능한 하위 범위 및 그 하위 범위의 조합을 포함한다. 나열된 임의의 범위는 동일한 범위가 적어도 동일한 절반, 3분의 1, 4분의 1, 5분의 1, 10분의 1 등으로 분할됨을 충분히 기재하고 이것이 가능한 것으로서 쉽게 인식될 수 있다. 비제한적인 예로서, 본원에 기재된 각 범위는 하위 1/3, 중간 1/3 및 상위 1/3 등으로 쉽게 분할될 수 있다. 또한 당업자라면 이해할 수 있듯이 "최대", "적어도", "초과", "미만" 등의 모든 언어는 언급된 숫자를 포함하고 상기에서 논의한 대로 하위 범위로 후속적으로 분할될 수 있는 범위를 지칭한다. 마지막으로, 당업자가 이해하는 바와 같이, 범위는 각각의 개별 구성원을 포함한다.
본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 등록된 특허 및 기타 공개적으로 이용 가능한 문서는 각각의 개별 간행물, 특허 출원, 등록된 특허 또는 기타 문서가 참고로 포함되도록 구체적이고 개별적으로 표시된 것처럼 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 참고로 포함된 텍스트에 포함된 정의는 본 개시내용의 정의와 모순되는 경우 제외된다.
다른 구현예는 하기 청구범위에서 제시된다.

Claims (33)

  1. (a) 각각 CD3δ, CD3ε, CD3γ, B2M, CIITA, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP 및 불변 쇄(Ii 쇄)로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 내인성 면역 단백질(endogenous immune protein)을 암호화(encoding)하는 하나 이상의 유전자좌(gene locus)의 삽입 및/또는 결실로서, 하나 이상의 내인성 면역 유전자의 유전자 발현을 하향조절(downregulating)할 수 있는 삽입 및/또는 결실; 및
    (b) 키메라 항원 수용체(CAR), 조작된 T 세포 수용체(TCR), 킬러 세포 면역글로불린-유사 수용체(KIR), 항원-결합 폴리펩티드, 세포 표면 수용체 리간드, 또는 종양 항원을 암호화하는 외인성 핵산
    을 포함하고; 선택적으로
    (c) 우성 음성 수용체(dominant negative receptor), 전환 수용체(switch receptor), 케모카인, 케모카인 수용체, 사이토카인, 사이토카인 수용체, IL-7, IL-7R, IL-15, IL-15R, IL-21, IL-18, CCL21, CCL19 또는 이들의 임의의 조합
    을 추가로 포함하는, 변형된 면역 세포(modified immune cell).
  2. 제1항에 있어서,
    삽입 및/또는 결실이
    (a) CD3δ, CD3ε 및/또는 CD3γ로부터 선택된 T 세포 수용체 서브유닛(subunit);
    (b) B2M, TAP1, TAP2, TAPBP 및/또는 NLRC5로부터 선택된 HLA 부류 I 분자; 및
    (c) HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP 및/또는 불변 쇄(Ii 쇄)로부터 선택된 HLA 부류 II 분자
    의 유전자 발현을 하향조절할 수 있는, 변형된 면역 세포.
  3. 제2항에 있어서,
    (a) 삽입 및/또는 결실이
    (i) CD3δ의 유전자 발현, 및
    (ii) B2M, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP, 불변 쇄(Ii 쇄) 및 이들의 조합으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 HLA 분자의 유전자 발현
    을 하향조절할 수 있거나; 또는
    (b) 삽입 및/또는 결실이
    (i) CD3ε의 유전자 발현, 및
    (ii) B2M, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, CIITA, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP, 불변 쇄(Ii 쇄) 또는 이들의 조합으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 HLA 분자의 유전자 발현
    을 하향조절할 수 있거나; 또는
    (c) 삽입 및/또는 결실이
    (i) CD3γ의 유전자 발현, 및
    (ii) B2M, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, CIITA, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP, 불변 쇄(Ii 쇄) 또는 이들의 조합으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 HLA 분자의 유전자 발현
    을 하향조절할 수 있는,
    변형된 면역 세포.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    삽입 및/또는 결실이
    (I) 하기 중 어느 하나:
    (a) CD3ε, B2M, 및 CIITA;
    (b) CD3ε, B2M, 및 RFX5;
    (c) CD3ε, B2M, 및 RFXAP;
    (d) CD3ε, B2M, 및 RFXANK;
    (e) CD3ε, B2M, 및 HLA-DM;
    (f) CD3ε, B2M, 및 Ii 쇄;
    (g) CD3ε, TAP1, 및 CIITA;
    (h) CD3ε, TAP1, 및 RFX5;
    (i) CD3ε, TAP1, 및 RFXAP;
    (j) CD3ε, TAP1, 및 RFXANK;
    (k) CD3ε, TAP1, 및 HLA-DM;
    (l) CD3ε, TAP1, 및 Ii 쇄;
    (m) CD3ε, TAP2, 및 CIITA;
    (n) CD3ε, TAP2, 및 RFX5;
    (o) CD3ε, TAP2, 및 RFXAP;
    (p) CD3ε, TAP2, 및 RFXANK;
    (q) CD3ε, TAP2, 및 HLA-DM;
    (r) CD3ε, TAP2, 및 Ii 쇄;
    (s) CD3ε, NLRC5, 및 CIITA;
    (t) CD3ε, NLRC5, 및 RFX5;
    (u) CD3ε, NLRC5, 및 RFXAP;
    (v) CD3ε, NLRC5, 및 RFXANK;
    (w) CD3ε, NLRC5, 및 HLA-DM;
    (x) CD3ε, NLRC5, 및 Ii 쇄;
    (y) CD3ε, TAPBP, 및 CIITA;
    (z) CD3ε, TAPBP, 및 RFX5;
    (aa) CD3ε, TAPBP, 및 RFXAP;
    (bb) CD3ε, TAPBP, 및 RFXANK;
    (cc) CD3ε, TAPBP, 및 HLA-DM; 또는
    (dd) CD3ε, TAPBP, 및 Ii 쇄; 또는
    (II) 하기 중 어느 하나:
    (a) CD3δ, B2M, 및 CIITA;
    (b) CD3δ, B2M, 및 RFX5;
    (c) CD3δ, B2M, 및 RFXAP;
    (d) CD3δ, B2M, 및 RFXANK;
    (e) CD3δ, B2M, 및 HLA-DM;
    (f) CD3δ, B2M, 및 Ii 쇄;
    (g) CD3δ, TAP1, 및 CIITA;
    (h) CD3δ, TAP1, 및 RFX5;
    (i) CD3δ, TAP1, 및 RFXAP;
    (j) CD3δ, TAP1, 및 RFXANK;
    (k) CD3δ, TAP1, 및 HLA-DM;
    (l) CD3δ, TAP1, 및 Ii 쇄;
    (m) CD3δ, TAP2, 및 CIITA;
    (n) CD3δ, TAP2, 및 RFX5;
    (o) CD3δ, TAP2, 및 RFXAP;
    (p) CD3δ, TAP2, 및 RFXANK;
    (q) CD3δ, TAP2, 및 HLA-DM;
    (r) CD3δ, TAP2, 및 Ii 쇄;
    (s) CD3δ, NLRC5, 및 CIITA;
    (t) CD3δ, NLRC5, 및 RFX5;
    (u) CD3δ, NLRC5, 및 RFXAP;
    (v) CD3δ, NLRC5, 및 RFXANK;
    (w) CD3δ, NLRC5, 및 HLA-DM;
    (x) CD3δ, NLRC5, 및 Ii 쇄;
    (y) CD3δ, TAPBP, 및 CIITA;
    (z) CD3δ, TAPBP, 및 RFX5;
    (aa) CD3δ, TAPBP, 및 RFXAP;
    (bb) CD3δ, TAPBP, 및 RFXANK;
    (cc) CD3δ, TAPBP, 및 HLA-DM; 또는
    (dd) CD3δ, TAPBP, 및 Ii 쇄; 또는
    (III) 하기 중 어느 하나:
    (a) CD3γ, B2M, 및 CIITA;
    (b) CD3γ, B2M, 및 RFX5;
    (c) CD3γ, B2M, 및 RFXAP;
    (d) CD3γ, B2M, 및 RFXANK;
    (e) CD3γ, B2M, 및 HLA-DM;
    (f) CD3γ, B2M, 및 Ii 쇄;
    (g) CD3γ, TAP1, 및 CIITA;
    (h) CD3γ, TAP1, 및 RFX5;
    (i) CD3γ, TAP1, 및 RFXAP;
    (j) CD3γ, TAP1, 및 RFXANK;
    (k) CD3γ, TAP1, 및 HLA-DM;
    (l) CD3γ, TAP1, 및 Ii 쇄;
    (m) CD3γ, TAP2, 및 CIITA;
    (n) CD3γ, TAP2, 및 RFX5;
    (o) CD3γ, TAP2, 및 RFXAP;
    (p) CD3γ, TAP2, 및 RFXANK;
    (q) CD3γ, TAP2, 및 HLA-DM;
    (r) CD3γ, TAP2, 및 Ii 쇄;
    (s) CD3γ, NLRC5, 및 CIITA;
    (t) CD3γ, NLRC5, 및 RFX5;
    (u) CD3γ, NLRC5, 및 RFXAP;
    (v) CD3γ, NLRC5, 및 RFXANK;
    (w) CD3γ, NLRC5, 및 HLA-DM;
    (x) CD3γ, NLRC5, 및 Ii 쇄;
    (y) CD3γ, TAPBP, 및 CIITA;
    (z) CD3γ, TAPBP, 및 RFX5;
    (aa) CD3γ, TAPBP, 및 RFXAP;
    (bb) CD3γ, TAPBP, 및 RFXANK;
    (cc) CD3γ, TAPBP, 및 HLA-DM; 또는
    (dd) CD3γ, TAPBP, 및 Ii 쇄
    의 유전자 발현을 하향조절할 수 있는, 변형된 면역 세포.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) T 세포, 자연 살해 세포(NK 세포), 자연 살해 T 세포, 림프 전구 세포(lymphoid progenitor cell), 조혈 줄기 세포, 줄기 세포, 대식세포, 및 수지상 세포(dendritic cell)로 이루어지는 그룹으로부터 선택되고; 및/또는
    (b) CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포이고; 및/또는
    (c) 동종이계(allogeneic) T 세포 또는 자기유래(autologous) 인간 T 세포인,
    변형된 면역 세포.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    삽입 및/또는 결실이
    (a) CRISPR-관련(Cas)(CRISPR-CAs) 엔도뉴클레아제 시스템 및 안내 RNA;
    (b) TALEN 유전자 편집 시스템(gene editing system), 아연 집게 뉴클레아제(zinc finger nuclease; ZFN) 유전자 편집 시스템, 메가뉴클레아제 유전자 편집 시스템, 또는 메가-TALEN 유전자 편집 시스템; 및
    (c) 안티센스 RNA, 안티고머(antigomer) RNA, RNAi, siRNA 또는 shRNA로부터 선택된 유전자 침묵 시스템(gene silencing system)
    으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 유전자 편집의 결과인, 변형된 면역 세포.
  7. 제6항에 있어서,
    (a) Cas 엔도뉴클레아제가 Cas3, Cas4, Cas8a, Cas8b, Cas9, Cas10, Cas10d, Cas12a, Cas12b, Cas12d, Cas12e, Cas12f, Cas12g, Cas12h, Cas12i, Cas13, Cas14, CasX, Cse1, Csy1, Csn2, Cpf1, C2c1, Csm2, Cmr5, Fok1, 에스 피오게네스(S. pyogenes) Cas9, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) Cas9, MAD7, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하거나; 또는
    (b) CRISPR-Cas 시스템이 pAd5/F35-CRISPR 벡터(vector)를 포함하거나; 또는
    (c) 안내 RNA가 CD3δ, CD3ε, CD3γ, B2M, CIITA, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP 및 불변 쇄(Ii 쇄)로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 면역 단백질을 각각 암호화하는 하나 이상의 유전자좌 내의 서열과 상보적인 안내 서열을 포함하는,
    변형된 면역 세포.
  8. 제7항에 있어서,
    (a) 안내 RNA가 (1) CD3δ, CD3ε 또는 CD3γ의 하나 이상의 엑손, 또는 (2) CD3δ, CD3ε 또는 CD3γ의 엑손 1 내의 서열과 상보적이거나; 또는
    (b) 서열이 CD3δ 유전자좌 내에 있고 안내 RNA가 서열번호 53에 의해 암호화된 핵산 서열을 포함하거나; 또는
    (c) 서열이 CD3ε 유전자좌 내에 있고 안내 RNA가 서열번호 52에 의해 암호화된 핵산 서열을 포함하거나; 또는
    (d) 서열이 CD3γ 유전자좌 내에 있고 안내 RNA가 서열번호 54에 의해 암호화된 핵산 서열을 포함하거나; 또는
    (e) 서열이 B2M 유전자좌 내에 있고 안내 RNA가 서열번호 55에 의해 암호화된 핵산 서열을 포함하거나; 또는
    (f) 서열이 CIITA 유전자좌 내에 있고 안내 RNA가 서열번호 61에 의해 암호화된 핵산 서열을 포함하거나; 또는
    (g) 서열이 TAP1 유전자좌 내에 있고 안내 RNA가 서열번호 56에 의해 암호화된 핵산 서열을 포함하거나; 또는
    (h) 서열이 TAP2 유전자좌 내에 있고 안내 RNA가 서열번호 57에 의해 암호화된 핵산 서열을 포함하거나; 또는
    (i) 서열이 TAPBP 유전자좌 내에 있고 안내 RNA가 서열번호 58, 서열번호 59, 또는 이들의 조합에 의해 암호화된 핵산 서열을 포함하거나; 또는
    (j) 서열이 NLRC5 유전자좌 내에 있고 안내 RNA가 서열번호 60에 의해 암호화된 핵산 서열을 포함하거나; 또는
    (k) 서열이 HLA-DM 유전자좌 내에 있고 안내 RNA가 서열번호 62에 의해 암호화된 핵산 서열을 포함하거나; 또는
    (l) 서열이 RFX5 유전자좌 내에 있고 안내 RNA가 서열번호 63, 서열번호 64 또는 이들의 조합에 의해 암호화된 핵산 서열을 포함하거나; 또는
    (m) 서열이 RFXANK 유전자좌 내에 있고 안내 RNA는 서열번호 65에 의해 암호화된 핵산 서열을 포함하거나; 또는
    (n) 서열이 RFXAP 유전자좌 내에 있고 안내 RNA가 서열번호 66에 의해 암호화된 핵산 서열을 포함하거나; 또는
    (o) 서열이 Ii 쇄 유전자좌 내에 있고 안내 RNA가 서열번호 67, 서열번호 68, 또는 이들의 조합에 의해 암호화된 핵산 서열을 포함하는,
    변형된 면역 세포.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 변형된 면역 세포가 대상체(subject)에게 투여될 때, 동일한 대상체에게 투여된 변형되지 않은 면역 세포에 의해 발휘되는 면역 반응과 비교하여, 상기 면역 세포가 상기 대상체에서 감소된 면역 반응을 발휘하고;
    (b) 변형된 면역 세포가 대상체에게 투여될 때, TRAC, B2M 및 CIITA의 유전자 발현을 하향조절할 수 있는 삽입 및/또는 결실을 포함하는 면역 세포에 의해 발휘되는 면역 반응과 비교하여, 상기 면역 세포가 상기 대상체에서 감소된 면역 반응을 발휘하고, 선택적으로 상기 면역 반응이 이식편대숙주병(graft-versus-host disease)(GvHD) 반응이고, 추가로 선택적으로 상기 감소된 GvHD 반응이 HLA-I 불일치 세포(mismatched cell) 또는 HLA-II 불일치 세포에 대해 유발되는,
    변형된 면역 세포.
  10. 제9항에 있어서,
    (a) GvHD 반응이 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상 감소되거나; 또는
    (b) GvHD 반응이 약 1배 이상, 약 2배 이상, 약 3배 이상, 약 4배 이상, 약 5배 이상, 약 6배 이상, 약 7배 이상, 약 8배 이상, 약 9배 이상, 약 10배 이상, 약 20배 이상, 약 30배 이상, 약 50배 이상, 약 100배 이상, 약 150배 이상, 또는 약 200배 이상 감소되고/되거나;
    (c) 변형된 면역 세포에 의해 감소된 GvHD 반응이 하나 이상의 유전자좌 내에 결실 및/또는 삽입이 없는 동등한 면역 세포, 또는 TRAC, B2M 및 CIITA에 결실 및/또는 삽입을 포함하는 면역 세포에 비교되는,
    변형된 면역 세포.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    외인성 핵산이 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하고, 상기 CAR이 항원 결합 도메인, 힌지 도메인(hinge domain), 막관통 도메인(transmembrane domain), 공동자극 신호전달 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 변형된 세포.
  12. 제11항에 있어서,
    (a) 항원 결합 도메인이 전장 항체(full length antibody) 또는 이의 항원-결합 단편, Fab, F(ab)2, 단일특이성(monospecific) Fab2, 이중특이성 Fab2, 삼중특이성 Fab2, 단쇄 가변 단편(scFv), 디아바디(diabody), 트리아바디, 미니바디, V-NAR 또는 VhH를 포함하고; 및/또는
    (b) 막관통 도메인이 인공 소수성 서열, I형 막관통 단백질의 막관통 도메인, T 세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD2, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, OX40(CD134), 4-1BB(CD137), ICOS(CD278), CD154, CD357(GITR), 톨-유사 수용체 1(TLR1), TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, 및 킬러 면역글로불린-유사 수용체(KIR)로부터 유래된 막관통 도메인으로부터 선택되고; 및/또는
    (c) 공동자극 도메인이 TNFR 슈퍼패밀리의 단백질, CD28, 4-1BB(CD137), OX40(CD134), PD-1, CD7, LIGHT, CD83L, DAP10, DAP12, CD27, CD2, CD5, ICAM-1, LFA-1, Lck, TNFR-I, TNFR-II, Fas, CD30, CD40, ICOS(CD278), NKG2C, B7-H3(CD276), 및 킬러 면역글로불린-유사 수용체(KIR)로부터 유래된 세포내 도메인, 또는 이의 변이체로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 단백질의 공동자극 도메인 중 하나 이상을 포함하고; 및/또는
    (d) 세포내 신호전달 도메인이 인간 CD2의 세포질 신호전달 도메인, CD3 제타 쇄(CD3ζ), FcγRIII, FcsRI, Fc 수용체의 세포질 꼬리, 세포질 수용체를 보유하는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM), TCR 제타, FcR 감마, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d 또는 이의 변이체로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 세포내 도메인을 포함하고; 및/또는
    (e) 항원 결합 도메인이
    (i) 혈액학적 악성종양과 연관되고;
    (ii) 고형 종양과 연관되고; 및/또는
    (iii) ROR1, 메소텔린, c-Met, PSMA, PSCA, 폴레이트 수용체 알파, 폴레이트 수용체 베타, EGFR, EGFRvIII, GPC2, GPC2, 뮤신 1(MUC1), Tn 항원((Tn Ag) 또는 (GalNAca-Ser/Thr)), TnMUC1, GDNF 패밀리 수용체 알파-4(GFRa4), 섬유아세포 활성화 단백질(FAP) 및 인터류킨-13 수용체 서브유닛 알파-2(IL-13Ra2 또는 CD213A2)로 이루어지는 그룹으로부터 선택된
    종양 항원을 표적화하고; 및/또는
    (f) 세포내 신호전달 도메인이 인간 CD3 제타 쇄(CD3ζ)를 포함하고; 및/또는
    (g) CAR이
    (i) PSMA 항원 결합 도메인, CD2 공동자극 도메인, 및 CD3 제타 세포내 신호전달 도메인;
    (ii) 메소텔린 항원 결합 도메인, 4-1BB 공동자극 도메인 및 CD3 제타 신호전달 도메인; 또는
    (iii) TnMUC1 항원 결합 도메인, CD2 공동자극 도메인 및 CD3 제타 신호전달 도메인
    을 포함하는,
    변형된 면역 세포.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 전환(switch) 수용체가 음성 신호와 연관된 신호전달 단백질의 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 양성 신호와 연관된 신호전달 단백질의 세포내 도메인을 포함하고; 및/또는
    (b) 우성 음성 수용체가
    (i) 음성 신호와 연관된 야생형 단백질의 절두된 변이체;
    (ii) 세포외 도메인, 막관통 도메인을 포함하고, 세포내 신호전달 도메인이 실질적으로 결여된 음성 신호와 연관된 야생형 단백질의 변이체; 또는
    (iii) 음성 신호와 연관된 신호전달 단백질의 세포외 도메인, 및 막관통 도메인
    을 포함하는,
    변형된 면역 세포.
  14. 제13항에 있어서,
    (a) 음성 신호와 연관된 단백질이 CTLA4, PD-1, TGFβRII, BTLA, VSIG3, VSIG8 및 TIM-3으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되고; 및/또는
    (b) 양성 신호와 연관된 단백질이 CD28, 4-1BB, IL12Rβ1, IL12Rβ2, CD2, ICOS 및 CD27로 이루어지는 그룹로부터 선택되고; 및/또는
    (c) 전환 수용체가 PD-1-CD28, PD-1A132L-CD28, PD-1-CD27, PD-1A132L-CD27, PD-1-4-1BB, PD-1A132L-4-1BB, PD-1-ICOS, PD-1A132L-ICOS, PD-1-IL12Rβ1, PD-1A132L-IL12Rβ1, PD-1-IL12Rβ2, PD-1A132L-IL12Rβ2, VSIG3-CD28, VSIG8-CD28, VSIG3-CD27, VSIG8-CD27, VSIG3-4-1BB, VSIG8-4-1BB, VSIG3-ICOS, VSIG8-ICOS, VSIG3-IL12Rβ1, VSIG8-IL12Rβ1, VSIG3-IL12Rβ2, VSIG8-IL12Rβ2, TGFβRII-CD27, TGFβRII-CD28, TGFβRII-4-1BB, TGFβRII-ICOS, TGFβRII-IL12Rβ1 및 TGFβRII-IL12Rβ2로 이루어지는 그룹으로부터 선택되고; 및/또는
    (d) 우성 음성 수용체가 PD1, VSIG3, VSIG8, 또는 TGFβR 우성 음성 수용체이고; 및/또는
    (e) 막관통 도메인이
    (i) CTLA4, PD-1, VSIG3, VSIG8, TGFβRII, BTLA, TIM-3, CD28, 4-1BB, IL12Rβ1, IL12Rβ2, CD2, ICOS 및 CD27로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 단백질의 막관통 도메인으로부터 선택되거나; 또는
    (ii) 음성 신호와 연관된 단백질의 막관통 또는 음성 신호와 연관된 단백질의 막관통 도메인으로부터 선택되는,
    변형된 면역 세포.
  15. CD3δ, CD3ε, CD3γ, B2M, C2TA, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP 및 불변 쇄(Ii 쇄)로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 기능적으로 손상된 폴리펩티드를 포함하는 단리된 변형된 T 세포로서, 여기서
    상기 기능적으로 손상된 폴리펩티드를 포함하는 변형된 T 세포가
    (i) 변형되지 않은 T 세포와 비교하여 감소된 T 세포 수용체 발현;
    (ii) 손상된 폴리펩티드의 감소된 발현;
    (iii) T 세포 수용체 복합체 표면 발현의 완전한 부재(complete absence); 및
    (iv) 감소되거나 불충분한 T 세포 수용체 교차-결합(cross-linking)
    중 적어도 하나를 나타내는, 단리된 변형된 T 세포.
  16. 제15항에 있어서,
    (a) 변형된 T 세포가 대상체에게 투여될 때, 동일한 대상체에게 투여된 변형되지 않은 T 세포에 의해 발휘된 면역 반응과 비교하여, 상기 변형된 T 세포가 상기 대상체에서 감소된 면역 반응을 발휘하고; 및/또는
    (b) 변형된 T 세포가 2개 이상의 기능적으로 손상된 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 두 번째 손상된 폴리펩티드가 T 세포 수용체 α 쇄(TRAC)이고; 및/또는
    (c) 변형된 T 세포가 하기를 포함하고:
    (i) TRAC, CD3δ, CD3ε, CD3γ, B2M, C2TA, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP 또는 Ii 쇄로부터 선택된 3개 이상의 기능적으로 손상된 폴리펩티드;
    (ii) CD3α, CD3δ, CD3ε, CD3γ, B2M, C2TA, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP 또는 Ii 쇄로부터 선택된 2개의 기능적으로 손상된 폴리펩티드;
    (iii) CD3α, CD3δ, CD3ε, CD3γ, B2M, C2TA, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP 또는 Ii 쇄로부터 선택된 3개의 기능적으로 손상된 폴리펩티드;
    (iv) CD3δ, CD3ε 및 CD3γ로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 기능적으로 손상된 폴리펩티드, 및 TRAC, B2M, C2TA, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP 또는 Ii 쇄로부터 선택된 적어도 하나의 기능적으로 손상된 폴리펩티드; 또는
    (v) CD3δ, CD3ε 및 CD3γ로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 기능적으로 손상된 폴리펩티드, 및 TRAC, B2M, C2TA, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP 또는 Ii 쇄로부터 선택된 기능적으로 손상된 폴리펩티드; 및/또는
    (d) 변형된 T 세포가 하기를 포함하고:
    (i) 기능적으로 손상된 CD3δ 및 TRAC, B2M, C2TA, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP, 또는 Ii 쇄로부터 선택된 적어도 하나의 기능적으로 손상된 폴리펩티드;
    (ii) 기능적으로 손상된 CD3ε 및 TRAC, B2M, C2TA, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP 또는 Ii 쇄로부터 선택된 적어도 하나의 기능적으로 손상된 폴리펩티드; 또는
    (iii) 기능적으로 손상된 CD3γ 및 TRAC, B2M, C2TA, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP 또는 Ii 쇄로부터 선택된 적어도 하나의 기능적으로 손상된 폴리펩티드; 및/또는
    (e) 변형된 T 세포가 TRAC, B2M, C2TA, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP 또는 Ii 쇄로부터 선택된 2개 이상의 기능적으로 손상된 폴리펩티드를 포함하고; 및/또는
    (f) 변형된 T 세포가:
    (i) TRAC, CD3δ, CD3ε, CD3γ, B2M, C2TA, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP, Ii 쇄 또는 이들의 임의의 조합의 감소된 발현을 갖거나, 또는
    (ii) CD3δ, CD3ε, CD3γ, TRAC, B2M, C2TA, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP, Ii 쇄 또는 이들의 임의의 조합을 발현하지 않고; 및/또는
    (g) 변형된 T 세포가 TRAC, B2M 및 C2TA로부터 선택된 기능적으로 손상된 폴리펩티드를 추가로 포함하고; 및/또는
    (h) 변형된 T 세포가 TRAC, B2M 또는 C2TA의 감소된 발현을 갖거나 TRAC, B2M 또는 C2TA를 발현하지 않고; 및/또는
    (i) CD3δ, CD3ε 및/또는 CD3γ의 변형이 손상된 TCR/CD3 복합체 기능을 초래하고; 및/또는
    (j) CD3δ, CD3ε 또는 CD3γ가 CD3δ, CD3ε 또는 CD3γ의 하나 이상의 엑손, 선택적으로 CD3δ, CD3ε 또는 CD3γ의 엑손 1을 표적화(targeting)함으로써 변형되는,
    단리된 변형된 T 세포.
  17. (a) CD3δ, CD3ε, CD3γ, B2M, CIITA, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP 및 불변 쇄(Ii 쇄)로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 내인성 면역 단백질을 암호화하는 하나 이상의 내인성 면역 유전자의 유전자 발현을 하향조절할 수 있는 하나 이상의 핵산을 면역 세포에 도입하고;
    (b) 키메라 항원 수용체(CAR), 조작된 T 세포 수용체(TCR), 킬러 세포 면역글로불린-유사 수용체(KIR), 항원-결합 폴리펩티드, 세포 표면 수용체 리간드, 또는 종양 항원을 암호화하는 외인성 핵산을 면역 세포에 도입하고;
    (c) 변형된 면역 세포를 확장하여 T 세포의 집단(population)을 생성시키고; 선택적으로
    (d) 우성 음성 수용체, 전환 수용체, 또는 이들의 조합을 암호화하는 외인성 핵산을 면역 세포에 도입하는 것을 추가로 포함하는
    변형된 면역 세포를 생성하기 위한 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    (a) 하나 이상의 핵산이
    (i) CD3δ, CD3ε 또는 CD3γ로부터 선택된 T 세포 수용체 서브유닛;
    (ii) B2M, TAP1, TAP2, TAPBP 또는 NLRC5로부터 선택된 HLA 부류 I 분자; 및
    (iii) HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP 또는 불변 쇄(Ii 쇄)로부터 선택된 HLA 부류 II 분자
    의 유전자 발현을 하향조절할 수 있고; 및/또는
    (b) 하나 이상의 핵산이 CD3δ의 유전자 발현, 및 B2M, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP, 불변 쇄(Ii 쇄) 및 이들의 조합으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 HLA 분자의 유전자 발현을 하향조절할 수 있고; 및/또는
    (c) 하나 이상의 핵산이 CD3ε, 및 B2M, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, CIITA, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP, 불변 쇄(Ii 쇄) 및 이들의 조합으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 HLA 분자의 유전자 발현을 하향조절할 수 있고; 및/또는
    (d) 하나 이상의 핵산이 CD3γ, 및 B2M, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, CIITA, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP, 불변 쇄(Ii 쇄) 및 이들의 조합으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 HLA 분자의 유전자 발현을 하향조절할 수 있는,
    방법.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서,
    하나 이상의 핵산이
    (I) 하기 중 어느 하나:
    (a) CD3ε, B2M, 및 CIITA;
    (b) CD3ε, B2M, 및 RFX5;
    (c) CD3ε, B2M, 및 RFXAP;
    (d) CD3ε, B2M, 및 RFXANK;
    (e) CD3ε, B2M, 및 HLA-DM;
    (f) CD3ε, B2M, 및 Ii 쇄;
    (g) CD3ε, TAP1, 및 CIITA;
    (h) CD3ε, TAP1, 및 RFX5;
    (i) CD3ε, TAP1, 및 RFXAP;
    (j) CD3ε, TAP1, 및 RFXANK;
    (k) CD3ε, TAP1, 및 HLA-DM;
    (l) CD3ε, TAP1, 및 Ii 쇄;
    (m) CD3ε, TAP2, 및 CIITA;
    (n) CD3ε, TAP2, 및 RFX5;
    (o) CD3ε, TAP2, 및 RFXAP;
    (p) CD3ε, TAP2, 및 RFXANK;
    (q) CD3ε, TAP2, 및 HLA-DM;
    (r) CD3ε, TAP2, 및 Ii 쇄;
    (s) CD3ε, NLRC5, 및 CIITA;
    (t) CD3ε, NLRC5, 및 RFX5;
    (u) CD3ε, NLRC5, 및 RFXAP;
    (v) CD3ε, NLRC5, 및 RFXANK;
    (w) CD3ε, NLRC5, 및 HLA-DM;
    (x) CD3ε, NLRC5, 및 Ii 쇄;
    (y) CD3ε, TAPBP, 및 CIITA;
    (z) CD3ε, TAPBP, 및 RFX5;
    (aa) CD3ε, TAPBP, 및 RFXAP;
    (bb) CD3ε, TAPBP, 및 RFXANK;
    (cc) CD3ε, TAPBP, 및 HLA-DM; 또는
    (dd) CD3ε, TAPBP, 및 Ii 쇄; 또는
    (II) 하기 중 어느 하나:
    (a) CD3δ, B2M, 및 CIITA;
    (b) CD3δ, B2M, 및 RFX5;
    (c) CD3δ, B2M, 및 RFXAP;
    (d) CD3δ, B2M, 및 RFXANK;
    (e) CD3δ, B2M, 및 HLA-DM;
    (f) CD3δ, B2M, 및 Ii 쇄;
    (g) CD3δ, TAP1, 및 CIITA;
    (h) CD3δ, TAP1, 및 RFX5;
    (i) CD3δ, TAP1, 및 RFXAP;
    (j) CD3δ, TAP1, 및 RFXANK;
    (k) CD3δ, TAP1, 및 HLA-DM;
    (l) CD3δ, TAP1, 및 Ii 쇄;
    (m) CD3δ, TAP2, 및 CIITA;
    (n) CD3δ, TAP2, 및 RFX5;
    (o) CD3δ, TAP2, 및 RFXAP;
    (p) CD3δ, TAP2, 및 RFXANK;
    (q) CD3δ, TAP2, 및 HLA-DM;
    (r) CD3δ, TAP2, 및 Ii 쇄;
    (s) CD3δ, NLRC5, 및 CIITA;
    (t) CD3δ, NLRC5, 및 RFX5;
    (u) CD3δ, NLRC5, 및 RFXAP;
    (v) CD3δ, NLRC5, 및 RFXANK;
    (w) CD3δ, NLRC5, 및 HLA-DM;
    (x) CD3δ, NLRC5, 및 Ii 쇄;
    (y) CD3δ, TAPBP, 및 CIITA;
    (z) CD3δ, TAPBP, 및 RFX5;
    (aa) CD3δ, TAPBP, 및 RFXAP;
    (bb) CD3δ, TAPBP, 및 RFXANK;
    (cc) CD3δ, TAPBP, 및 HLA-DM; 또는
    (dd) CD3δ, TAPBP, 및 Ii 쇄; 또는
    (III) 하기 중 어느 하나:
    (a) CD3γ, B2M, 및 CIITA;
    (b) CD3γ, B2M, 및 RFX5;
    (c) CD3γ, B2M, 및 RFXAP;
    (d) CD3γ, B2M, 및 RFXANK;
    (e) CD3γ, B2M, 및 HLA-DM;
    (f) CD3γ, B2M, 및 Ii 쇄;
    (g) CD3γ, TAP1, 및 CIITA;
    (h) CD3γ, TAP1, 및 RFX5;
    (i) CD3γ, TAP1, 및 RFXAP;
    (j) CD3γ, TAP1, 및 RFXANK;
    (k) CD3γ, TAP1, 및 HLA-DM;
    (l) CD3γ, TAP1, 및 Ii 쇄;
    (m) CD3γ, TAP2, 및 CIITA;
    (n) CD3γ, TAP2, 및 RFX5;
    (o) CD3γ, TAP2, 및 RFXAP;
    (p) CD3γ, TAP2, 및 RFXANK;
    (q) CD3γ, TAP2, 및 HLA-DM;
    (r) CD3γ, TAP2, 및 Ii 쇄;
    (s) CD3γ, NLRC5, 및 CIITA;
    (t) CD3γ, NLRC5, 및 RFX5;
    (u) CD3γ, NLRC5, 및 RFXAP;
    (v) CD3γ, NLRC5, 및 RFXANK;
    (w) CD3γ, NLRC5, 및 HLA-DM;
    (x) CD3γ, NLRC5, 및 Ii 쇄;
    (y) CD3γ, TAPBP, 및 CIITA;
    (z) CD3γ, TAPBP, 및 RFX5;
    (aa) CD3γ, TAPBP, 및 RFXAP;
    (bb) CD3γ, TAPBP, 및 RFXANK;
    (cc) CD3γ, TAPBP, 및 HLA-DM; 또는
    (dd) CD3γ, TAPBP, 및 Ii 쇄
    의 유전자 발현을 하향조절할 수 있는, 방법.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 면역 세포가 T 세포, 자연 살해 세포(NK 세포), 자연 살해 T 세포, 림프 전구 세포, 조혈 줄기 세포, 줄기 세포, 대식세포, 및 수지상 세포로 이루어지는 그룹으로부터 선택되고; 및/또는
    (b) 면역 세포가 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포이고; 및/또는
    (c) 면역 세포가 동종이계 T 세포 또는 자기유래 T 세포인,
    방법.
  21. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 핵산이 바이러스 형질도입에 의해 면역 세포 내로 도입되고, 여기서 상기 바이러스 형질도입이 면역 세포를 하나 이상의 핵산을 포함하는 바이러스 벡터와 접촉시키는 것을 포함하며; 및/또는
    (b) 핵산이 바이러스 형질도입에 의해 면역 세포내로 도입되고, 여기서 상기 바이러스 형질도입이 면역 세포를 하나 이상의 핵산을 포함하는 바이러스 벡터와 접촉시키는 것을 포함하며, 추가로 상기 바이러스 벡터가 레트로바이러스 벡터, 센다이 바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터 및 렌티바이러스 벡터로 이루어지는 그룹으로부터 선택되고; 및/또는
    (c) 발현을 하향조절할 수 있는 하나 이상의 핵산 각각이
    (i) CRISPR-관련(Cas)(CRISPR-CAs) 엔도뉴클레아제 시스템 및 안내 RNA;
    (ii) TALEN 유전자 편집 시스템, 아연 집게 뉴클레아제(ZFN) 유전자 편집 시스템, 메가뉴클레아제 유전자 편집 시스템, 또는 메가-TALEN 유전자 편집 시스템; 및
    (iii) 안티센스 RNA, 안티고머 RNA, RNAi, siRNA 또는 shRNA로부터 선택된 유전자 침묵 시스템
    으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 유전자 편집 시스템을 포함하는, 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    (a) Cas 엔도뉴클레아제가 Cas3, Cas4, Cas8a, Cas8b, Cas9, Cas10, Cas10d, Cas12a, Cas12b, Cas12d, Cas12e, Cas12f, Cas12g, Cas12h, Cas12i, Cas13, Cas14, CasX, Cse1, Csy1, Csn2, Cpf1, C2c1, Csm2, Cmr5, Fok1, 에스 피오게네스 Cas9, 스타필로코커스 아우레우스 Cas9, MAD7, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하고; 및/또는
    (b) CRISPR-Cas 시스템이 pAd5/F35-CRISPR 벡터를 포함하고; 및/또는
    (c) 안내 RNA가 CD3δ, CD3ε, CD3γ, B2M, CIITA, TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, HLA-DM, RFX5, RFXANK, RFXAP 및 불변 쇄(Ii 쇄)로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 면역 단백질을 각각 암호화하는 하나 이상의 유전자좌 내의 서열과 상보적인 안내 서열을 포함하고; 및/또는
    (d) 안내 RNA가 (1) CD3δ, CD3ε 또는 CD3γ의 하나 이상의 엑손, 또는 (2) CD3δ, CD3ε 또는 CD3γ의 엑손 1 내의 서열과 상보적이고; 및/또는
    (e) 서열이 CD3δ 유전자좌 내에 있고 안내 RNA가 서열번호 53에 의해 암호화된 핵산 서열을 포함하거나;
    (f) 서열이 CD3ε 유전자좌 내에 있고 안내 RNA가 서열번호 52에 의해 암호화된 핵산 서열을 포함하거나;
    (g) 서열이 CD3γ 유전자좌 내에 있고 안내 RNA가 서열번호 54에 의해 암호화된 핵산 서열을 포함하거나;
    (h) 서열이 B2M 유전자좌 내에 있고 안내 RNA가 서열번호 55에 의해 암호화된 핵산 서열을 포함하거나;
    (i) 서열이 CIITA 유전자좌 내에 있고 안내 RNA가 서열번호 61에 의해 암호화된 핵산 서열을 포함하거나;
    (j) 서열이 TAP1 유전자좌 내에 있고 안내 RNA가 서열번호 56에 의해 암호화된 핵산 서열을 포함하거나;
    (k) 서열이 TAP2 유전자좌 내에 있고 안내 RNA가 서열번호 57에 의해 암호화된 핵산 서열을 포함하거나;
    (l) 서열이 TAPBP 유전자좌 내에 있고 안내 RNA가 서열번호 58, 서열번호 59, 또는 이들의 조합에 의해 암호화된 핵산 서열을 포함하거나;
    (m) 서열이 NLRC5 유전자좌 내에 있고 안내 RNA가 서열번호 60에 의해 암호화된 핵산 서열을 포함하거나;
    (n) 서열이 HLA-DM 유전자좌 내에 있고 안내 RNA가 서열번호 62에 의해 암호화된 핵산 서열을 포함하거나;
    (o) 서열이 RFX5 유전자좌 내에 있고 안내 RNA가 서열번호 63, 서열번호 64 또는 이들의 조합에 의해 암호화된 핵산 서열을 포함하거나;
    (p) 서열이 RFXANK 유전자좌 내에 있고 안내 RNA는 서열번호 65에 의해 암호화된 핵산 서열을 포함하거나;
    (q) 서열이 RFXAP 유전자좌 내에 있고 안내 RNA가 서열번호 66에 의해 암호화된 핵산 서열을 포함하거나; 또는
    (r) 서열이 Ii 쇄 유전자좌 내에 있고 안내 RNA가 서열번호 67, 서열번호 68, 또는 이들의 조합에 의해 암호화된 핵산 서열을 포함하는,
    방법.
  23. 제17항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 면역 세포가 대상체에게 투여될 때, 동일한 대상체에게 투여된 변형되지 않은 면역 세포에 의해 발휘되는 면역 반응과 비교하여, 상기 면역 세포가 상기 대상체에서 감소된 면역 반응을 발휘하고; 및/또는
    (b) 면역 세포가 대상체에게 투여될 때, TRAC, B2M 및 CIITA의 유전자 발현을 하향조절할 수 있는 하나 이상의 핵산을 포함하는 면역 세포에 의해 발휘되는 면역 반응과 비교하여, 상기 면역 세포가 상기 대상체에서 감소된 면역 반응을 발휘하고; 및/또는
    (c) 면역 세포가 대상체에게 투여될 때, 상기 면역 세포가 상기 대상체에서 감소된 면역 반응을 발휘하고, 여기서 상기 면역 반응이 이식편대숙주병(GvHD) 반응이고; 및/또는
    (d) 면역 세포가 대상체에게 투여될 때, 상기 면역 세포가 상기 대상체에서 감소된 면역 반응을 발휘하고, 여기서 상기 면역 반응이 이식편대숙주병(GvHD) 반응이고, 추가로 선택적으로 상기 감소된 GvHD 반응이 HLA-I 불일치 세포 또는 HLA-II 불일치 세포에 대해 유발되고; 및/또는
    (e) 면역 세포가 대상체에게 투여될 때, 상기 면역 세포가 상기 대상체에서 감소된 면역 반응을 발휘하고, 여기서 상기 면역 반응이 이식편대숙주병(GvHD) 반응이고, 상기 GvHD 반응이
    (i) 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상 감소되거나; 또는
    (ii) 약 1배 이상, 약 2배 이상, 약 3배 이상, 약 4배 이상, 약 5배 이상, 약 6배 이상, 약 7배 이상, 약 8배 이상, 약 9배 이상, 약 10배 이상, 약 20배 이상, 약 30배 이상, 약 50배 이상, 약 100배 이상, 약 150배 이상, 또는 약 200배 이상 감소되고; 및/또는
    (f) 면역 세포가 대상체에게 투여될 때, 상기 면역 세포가 상기 대상체에서 감소된 면역 반응을 발휘하고, 여기서 상기 면역 반응이 이식편대숙주병(GvHD) 반응이고, 추가로 상기 변형된 면역 세포에 의해 감소된 GvHD 반응이 하나 이상의 유전자좌 내에 결실 및/또는 삽입이 없는 동등한 면역 세포, 또는 TRAC, B2M 및 CIITA에 결실 및/또는 삽입을 포함하는 면역 세포에 비교되는,
    방법.
  24. 제17항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 외인성 핵산이 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하고, 여기서 상기 CAR이 항원 결합 도메인, 힌지 도메인, 막관통 도메인, 공동자극 신호전달 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하고; 및/또는
    (b) 외인성 핵산이 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하고, 여기서 상기 CAR이 항원 결합 도메인, 힌지 도메인, 막관통 도메인, 공동자극 신호전달 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하고, 추가로 상기 항원 결합 도메인이
    (i) 혈액학적 악성종양과 연관되고;
    (ii) 고형 종양과 연관되고; 및/또는
    (iii) ROR1, 메소텔린, c-Met, PSMA, PSCA, 폴레이트 수용체 알파, 폴레이트 수용체 베타, EGFR, EGFRvIII, GPC2, GPC2, 뮤신 1(MUC1), Tn 항원((Tn Ag) 또는 (GalNAca-Ser/Thr)), TnMUC1, GDNF 패밀리 수용체 알파-4(GFRa4), 섬유아세포 활성화 단백질(FAP) 및 인터류킨-13 수용체 서브유닛 알파-2(IL-13Ra2 또는 CD213A2)로 이루어지는 그룹으로부터 선택된
    종양 항원을 표적화하고; 및/또는
    (c) 외인성 핵산이 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하고, 여기서 상기 CAR이 항원 결합 도메인, 힌지 도메인, 막관통 도메인, 공동자극 신호전달 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하고, 추가로 상기 CAR이
    (i) PSMA 항원 결합 도메인, CD2 공동자극 도메인, 및 CD3 제타 세포내 신호전달 도메인;
    (ii) 메소텔린 항원 결합 도메인, 4-1BB 공동자극 도메인 및 CD3 제타 신호전달 도메인; 또는
    (iii) TnMUC1 항원 결합 도메인, CD2 공동자극 도메인 및 CD3 제타 신호전달 도메인
    을 포함하고; 및/또는
    (d) 전환 수용체가
    (i) CTLA4, PD-1, VSIG3, VSIG8, TGFβRII, BTLA, 및 TIM-3으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 음성 신호와 연관된 신호전달 단백질의 세포외 도메인,
    (ii) 막관통 도메인, 및
    (iii) CD28, 4-1BB, IL12Rβ1, IL12Rβ2, CD2, ICOS 및 CD27로 이루어지는 그룹로부터 선택된 양성 신호와 연관된 신호전달 단백질의 세포내 도메인
    을 포함하고; 및/또는
    (e) 우성 음성 수용체가
    (i) 음성 신호와 연관된 야생형 단백질의 절두된 변이체(truncated variant),
    (ii) 세포외 도메인, 막관통 도메인을 포함하고 세포내 신호전달 도메인이 실질적으로 결여된 음성 신호와 연관된 야생형 단백질의 변이체; 또는
    (iii) 음성 신호와 연관된 신호전달 단백질의 세포외 도메인, 및 막관통 도메인
    을 포함하고; 및/또는
    (f) 전환 수용체가 PD-1-CD28, PD-1A132L-CD28, PD-1-CD27, PD-1A132L-CD27, PD-1-4-1BB, PD-1A132L-4-1BB, PD-1-ICOS, PD-1A132L-ICOS, PD-1-IL12Rβ1, PD-1A132L-IL12Rβ1, PD-1-IL12Rβ2, PD-1A132L-IL12Rβ2, VSIG3-CD28, VSIG8-CD28, VSIG3-CD27, VSIG8-CD27, VSIG3-4-1BB, VSIG8-4-1BB, VSIG3-ICOS, VSIG8-ICOS, VSIG3-IL12Rβ1, VSIG8-IL12Rβ1, VSIG3-IL12Rβ2, VSIG8-IL12Rβ2, TGFβRII-CD27, TGFβRII-CD28, TGFβRII-4-1BB, TGFβRII-ICOS, TGFβRII-IL12Rβ1 및 TGFβRII-IL12Rβ2로 이루어지는 그룹으로부터 선택되고; 및/또는
    (g) 우성 음성 수용체가 PD1, VSIG3, VSIG8, 또는 TGFβR 우성 음성 수용체이고; 및/또는
    (h) 막관통 도메인이
    (i) CTLA4, PD-1, BTLA, TGFβRII, BTLA, TIM-3, CD28, 4-1BB, IL12Rβ1, IL12Rβ2, CD2, ICOS 및 CD27로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 단백질의 막관통 도메인으로부터 선택되거나; 또는
    (ii) 음성 신호와 연관된 단백질의 막관통 또는 음성 신호와 연관된 단백질의 막관통 도메인으로부터 선택되는,
    방법.
  25. 제17항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 변형된 면역 세포를 확장시키는 것이 flt3-L, IL-1, IL-3, IL-2, IL-7, IL-15, IL-18, IL-21, TGF베타, IL-10 및 c-kit 리간드로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 인자와 함께 T 세포를 배양하는 것을 포함하고; 및/또는
    (b) 면역 세포의 다능성(pluripotency)을 유도하기 위해 면역 세포에 Klf4, Oct3/4 및 Sox2를 암호화하는 폴리펩티드 및/또는 핵산을 도입하는 것을 추가로 포함하고; 및/또는
    (c) 여기서 면역 세포가 혈액 샘플, 전혈 샘플, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 샘플, 또는 성분채집(apheresis) 샘플로부터 수득되고; 및/또는
    (d) 여기서 면역 세포가 성분채집 샘플로부터 수득되고 추가로 상기 성분채집 샘플이 동결보존된 샘플이고; 및/또는
    (e) 여기서 면역 세포가 성분채집 샘플로부터 수득되고 추가로 상기 성분채집 샘플이 신선한 샘플이고; 및/또는
    (f) 여기서 면역 세포가 인간 대상체로부터 수득되는,
    방법.
  26. 제17항 내지 제25항 중 어느 한 항의 방법으로부터 수득된 변형된 면역 세포의 집단.
  27. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 변형된 면역 세포 또는 변형된 T 세포, 또는 제26항의 변형된 면역 세포의 집단 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 조성물.
  28. 증대된 면역성과 연관된 질환 또는 상태를 치료하는 방법으로서, 상기 치료가 필요한 대상체에게 유효량의 제27항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 상기 질환 또는 상태를 치료하는 방법.
  29. 제28항에 있어서,
    (a) 상태가 암이고; 및/또는
    (b) 상태가 암이고, 추가로 상기 암이 유방암(breast cancer), 전립선암(prostate cancer), 난소암(ovarian cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 피부암(skin cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 결장직장암(colorectal cancer), 신장암(renal cancer), 간암(liver cancer), 뇌암(brain cancer), 림프종(lymphoma), 백혈병(leukemia), 폐암(lung cancer), 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되고; 및/또는
    (c) 상태가 암이고 상기 암이 고형 종양 또는 혈액학적 악성종양인,
    방법.
  30. 암을 치료하는 방법으로서, 대상체에게 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 변형된 면역 세포 또는 변형된 T 세포, 제26항의 변형된 면역 세포의 집단, 또는 제27항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  31. 제30항에 있어서,
    암이 고형 종양, 또는 혈액학적 악성종양인, 방법.
  32. 대상체에서 표적 세포 또는 조직에 대한 T 세포-매개된 면역 반응을 자극하기 위한 방법으로서, 대상체에게 유효량의, 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 변형된 면역 세포 또는 변형된 T 세포, 제26항의 변형된 면역 세포의 집단, 또는 제27항의 조성물을 포함하는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  33. 선택적으로 사용 설명서를 포함하는, 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 변형된 면역 세포, 제26항의 변형된 T 세포의 집단, 또는 제27항의 조성물을 포함하는 키트(kit).

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