CN116987699A - 用于制备通用型car-t细胞的基因片段、其工具系统及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于制备通用型CAR‑T细胞的基因片段、其工具系统及应用。该基因片段的序列为SEQ ID No.1至SEQ ID No.11之一。将上述基因片段对应的crRNA与I‑B型CRISPR‑Cascade‑Cas3基因编辑系统相结合后即形成工具系统，能通过有效敲除TRAC基因从而获得通用型CAR‑T细胞。
Description
技术领域
本发明涉及用于制备通用型CAR-T细胞的基因片段、其工具系统及应用，属于生物技术、生物医药技术领域。
背景技术
CAR-T疗法已经有多款药物先后上市，不管是在疗效还是商业化上，都取得了巨大的成功。但是，使用基因工程构造CAR细胞的成本高昂。如此昂贵的售价显然会为很多患者家庭带来沉重的负担。此外，目前自体CAR-T细胞疗法为定制化生产(以患者自体血液中T细胞为材料)，从收集患者T细胞到CAR-T细胞到成功制备大概要经历2-3周，对于一些患者来说，这个时间可能会超过他们的最佳治疗时期。因此，研究者开始考虑同种异体CAR-T细胞，即通用型CAR-T(UCAR-T)。UCAR-T最大的优势就是可以提前制备，当患者有需要时可以及时使用，极大地降低了生产成本和时间成本。移植物抗宿主病(GvHD)是同种异体CAR-T细胞治疗中需要克服的主要障碍，尤其是当患者的CAR-T细胞是由人类白细胞抗原(HLA)不匹配的健康供体产生时，UCAR-T的移植会引起严重的血液学毒性。因此制备UCAR-T细胞的主要设计原则是从同种异体健康供体中生成肿瘤抗原特异性T细胞，然后通过基因编辑的方法破坏同种异体T细胞的TCR基因和/或HLA I类基因来有效消除移植物抗宿主病。通过靶向TCR内源性α或β亚基恒定区的基因组序列或破坏MHC基因复合物的HLA-A基因座，使得TCR或HLAI类抗原的表达被消除，由此产生的T细胞不能识别同种异体抗原，从而消除GvHD。构建TCR缺陷型和HLA I类缺陷型最常用的基因编辑方法有锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)和CRISPR-Cas9等。目前使用最普遍的是利用CRISPR-Cas9敲除TRAC及HLA，CRISPR-Cas9基因编辑通过切割DNA相关编码区域造成碱基的插入或缺失(InDel)来沉默基因表达，但该方法并不能实现DNA长片段的清除，对于完全的基因敲除效率很低，因而可能导致UCAR-T产品无法完全消除GvHD。
本发明的发明人课题组于2022年9月19日申请的发明专利《一种I-B型CRISPR-Cascade-Cas3基因编辑系统及应用》中，公开了I-B型CRISPR-Cascade-Cas3基因编辑系统，能够使单个CRISPR靶向位点形成不同程度的长片段缺失，从而弥补CRISPR-Cas9产生长片段缺失的能力相对有限的空白。目前经进一步研究得出了该I-B型CRISPR-Cascade-Cas3基因编辑系统用于制备通用型CAR-T细胞的应用成果，为细胞基因敲除提供更完善更彻底的解决方案，并以此来申报本发明专利。
发明内容
本发明的主要目的是：克服现有技术存在的问题，提供一种用于制备通用型CAR-T细胞的基因片段，将其对应的crRNA与I-B型CRISPR-Cascade-Cas3基因编辑系统相结合后，能够通过有效敲除TRAC基因从而获得通用型CAR-T细胞。同时还提供含有该基因片段的工具系统，以及相关应用。
本发明解决其技术问题的技术方案如下：
用于制备通用型CAR-T细胞的基因片段，其特征是，所述基因片段与crRNA相对应；所述基因片段的基本结构为5'-tgagcac-子片段-gtgtccaaaccattgatgccgtaaggcgt-3'；所述基因片段的序列为SEQ ID No.1至SEQ ID No.11之一。
优选地，所述基因片段的序列为SEQ ID No.2或SEQ ID No.7。
根据上述基因片段可合成出相应的crRNA，用于制备通用型CAR-T细胞。
本发明还提供：
与前文所述基因片段对应的crRNA。
上述crRNA与I-B型CRISPR-Cascade-Cas3基因编辑系统相结合后，能通过有效敲除TRAC基因从而获得通用型CAR-T细胞。
本发明还提供：
一种工具系统，其特征是，所述工具系统含有前文所述的crRNA；所述工具系统为I-B型CRISPR-Cascade-Cas3基因编辑系统。
优选地，所述I-B型CRISPR-Cascade-Cas3基因编辑系统由Cascade复合物以及Cas3蛋白组成；所述crRNA位于Cascade复合物中；所述Cascade复合物由Cmx8蛋白、Cas8蛋白、Cas5蛋白、Cas6蛋白、Cas11蛋白以及crRNA复合而成；所述Cmx8蛋白的氨基酸序列为SEQID NO.12；所述Cas8蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.13；所述Cas5蛋白的氨基酸序列为SEQID NO.14；所述Cas6蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.15；所述Cas11蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.16；所述Cas3蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.17。
上述工具系统能对人原代T细胞进行基因编辑，敲除TRAC基因，获得通用型CAR-T细胞。
本发明还提供：
前文所述基因片段、或前文所述crRNA、或前文所述工具系统用于制备敲除TRAC基因的药物的应用、或者用于制备通用型CAR-T细胞的应用。
含有前文所述工具系统的细胞系或细胞株。
本发明还提供：
一种制备通用型CAR-T细胞的方法，其特征是，所述方法包括：采用前文所述的工具系统对T细胞进行TRAC基因敲除，得到通用型CAR-T细胞。
一种通过利用前文所述的基因片段、或前文所述的crRNA、或前文所述的工具系统、或前文所述的方法制备获得的通用型CAR-T细胞。
含有前文所述的通用型CAR-T细胞的细胞制剂。
本发明利用I-B型CRISPR-Cascade-Cas3基因编辑系统，针对性设计出crRNA，通过有效敲除TRAC基因从而获得通用型CAR-T细胞。与传统的利用CRISPR-Cas9编辑相比，本发明利用I-B型CRISPR-Cascade-Cas3基因编辑系统能造成长片段缺失的特点，能更加彻底地敲除TRAC基因，从而在细胞产品的通用性和特异性上更有优势，尤其适用于对于敲除程度要求高的应用场景，如通用型T细胞产品。
附图说明
图1为本发明实施例1的优选测试实验结果图。
图2为本发明实施例1的TRAC基因敲除位点示意图。
图3为本发明实施例1的流式细胞术检测编辑效率示意图。其中，百分比表示TCR-T细胞比例。
图4为本发明实施例1的编辑效率统计结果图(mean±SEM,n＝5)。
图5为本发明实施例1的基因组缺失范围示意图。
具体实施方式
本发明利用I-B型CRISPR-Cascade-Cas3基因编辑系统，通过反复深入地系统性试验研究，获得了通过有效敲除TRAC基因从而获得通用型CAR-T细胞的技术手段，具体为将靶向T细胞TRAC基因的系列基因片段所对应的crRNA与I-B型CRISPR-Cascade-Cas3基因编辑系统相结合，以实现上述效果。
具体而言，系列基因片段的基本结构为5'-tgagcac-子片段-gtgtccaaaccattgatgccgtaaggcgt-3'。各基因片段的具体序列如下所示(各子片段以大写字母表示)：
SEQ ID No.1：
tgagcacGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAAgtgtccaaaccattgatgccgtaaggcgt
SEQ ID No.2：
tgagcacTCTAGCACAGTTTTGTCTGTGATATACACATCAGAgtgtccaaaccattgatgccgtaaggcgt
SEQ ID No.3：
tgagcacAAGAGAAGGTGGCAGGAGAGGGCACGTGGCCCAGCgtgtccaaaccattgatgccgtaaggcgt
SEQ ID No.4：
tgagcacAGAAAGGAGAAGAGCAGCAGGCATGAGTTGAATGAgtgtccaaaccattgatgccgtaaggcgt
SEQ ID No.5：
tgagcacCACCATTGCACTCCAGCCTGGGCAACAAGAGCAAAgtgtccaaaccattgatgccgtaaggcgt
SEQ ID No.6：
tgagcacGTTCTACCTTTGAAACCTGAATGGTGTTGGTTACCgtgtccaaaccattgatgccgtaaggcgt
SEQ ID No.7：
tgagcacATGGATCTTCAGTGGGTTCTCTTGGGCTCTAGGTCgtgtccaaaccattgatgccgtaaggcgt
SEQ ID No.8：
tgagcacTCCTCTCTCCCCAGTACGGCTCTCTTAGCTCAGTAgtgtccaaaccattgatgccgtaaggcgt
SEQ ID No.9：
tgagcacGGAGGATCGCTTGAGCCCTGGAATGTTGAGGCTACgtgtccaaaccattgatgccgtaaggcgt
SEQ ID No.10：
tgagcacGCTCTGTTTGGGGCTATGTGGTAGAGTTCTAGGAGgtgtccaaaccattgatgccgtaaggcgt
SEQ ID No.11：
tgagcacCTGTGTATCTGGGCGTGTTGTATGTCCTGCTGCCGgtgtccaaaccattgatgccgtaaggcgt
其中，优选SEQ ID No.2或SEQ ID No.7。
本发明用于制备通用型CAR-T细胞的工具系统由Cascade复合物以及Cas3蛋白组成；Cascade复合物由Cmx8蛋白、Cas8蛋白、Cas5蛋白、Cas6蛋白、Cas11蛋白以及crRNA复合而成；Cmx8蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.12；Cas8蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.13；Cas5蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.14；Cas6蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.15；Cas11蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.16；Cas3蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.17；与crRNA对应的基因片段为SEQ ID No.1至SEQ ID No.11之一，且优选SEQ ID No.2或SEQ ID No.7。
下面参照附图并结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例子。
实施例1
本实施例通过敲除TRAC位点实现T细胞产品的通用性，以获得通用型CAR-T细胞。操作流程包括：培养T细胞，制备crRNA和mRNA并电转到T细胞，最后通过流式细胞术和长距离PCR来检测敲除效果。
一、具体实验内容
(1)T细胞培养
使用EasySepTM Human T Cell提取试剂盒从外周血单个核细胞(Peripheralblood mononuclear cells，PBMC)中分离CD3+T细胞。得到的CD3+T细胞接种至含有200U/mL人源IL-2的CTSTM AIM-VTM培养基中，用抗人CD3/CD28磁珠(磁珠与细胞浓度比为1:1)刺激2天。
(2)cas mRNAs体外转录
以携带cas3、cmx8、cas8、cas5、cas6、cas11基因的无内毒素线性质粒作为模板，按照mMessage mMachine T7 Ultra试剂盒的操作说明来进行体外转录，其中用N1-甲基假尿苷三磷酸(m1Ψ-5’-triphosphate)替代尿苷三磷酸(Uridine triphosphate)，并且补加120nt的poly(A)tail。反应产物经过纤维素法柱层析分离纯化后保存于-20℃。
(3)mRNA电转
CD3+T细胞在加入磁珠刺激48h后，可用于电转，去除磁珠，90g离心10min，弃上清，细胞沉淀加入P3缓冲液重悬(每100万个细胞加入20μL缓冲液)。使用Lonza 4D电穿孔系统对每孔T细胞进行电穿孔，脉冲代码为EH115，cas mRNAs以及crRNA加入量如下表所示。电穿孔后，每孔立即加入80μL预热培养基，置于37℃细胞培养箱中静置10min，之后将细胞移至24孔细胞培养板。每隔2-3天，补加新鲜的培养基以及人源IL-2(终浓度为100U/mL)。
(4)流式细胞术分析
电穿孔后约5天，离心收集细胞。用25μL含有2％ FBS的PBS缓冲液重悬细胞沉淀，加入TCR特异性抗体IP26对细胞进行染色，在4℃避光孵育20分钟。之后将细胞用FACS缓冲液洗涤2次。使用BD AccuriTM C6 Plus流式细胞仪进行分析，收集到的数据用FlowJov10.7.1进行分析。
(5)PacBio测序分析
按照Puregene Cell试剂盒的操作说明，提取上一步中收集的细胞的基因组DNA。在编辑位点上下游设计引物，序列如下：
Fwd：ttccacctcaaaacattggttccgtc，
Rev：ccctctgacctctgccctaactgg，
利用上述引物，以提取的基因组DNA为模板，按照KOD FX Neo试剂盒的说明进行长片段PCR扩增，PCR产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳进行分离。在紫外灯下观察电泳后的凝胶，进行切胶回收，并通过PacBio测序进行分析。
二、TRAC基因敲除结果分析
为了探究I-B型CRISPR-Cascade-Cas3基因编辑系统在哺乳动物基因组中进行基因编辑的能力以及特征，本实施例针对TRAC基因座设计了11条protospacer并且分别合成了71nt的成熟crRNA，各crRNA对应的基因片段序列如下表所示。
对上述11条crRNA进行优选测试实验，具体为：每条crRNA与cas mRNAs一起通过电穿孔递送至CD3+T细胞，培养72h，通过抗体染色流式细胞术检测敲除效率。检测结果如图1所示。
根据上述结果，结合图2所示的TRAC基因敲除位点，选择SEQ ID No.2的crRNA作为G1，并选择SEQ ID No.7的crRNA作为G2，分别与cas mRNAs一起通过电穿孔递送至CD3+T细胞中。通过TCR特异性抗体IP26对T细胞进行染色(其中TRAC基因被破坏的细胞将不会表达TCR，无法对其进行染色)，然后通过流式细胞术来检测敲除效率。
通过流式分析发现，如图3、图4所示，通过递送mRNA以及不同的crRNA(G1、G2)，在CD3+T细胞体内分别可以达到约35.56％以及36.62％的敲除效率，最高可以分别达到40.5％和41.2％，且靶向上游或者下游的crRNA在编辑效率上并没有显著的差异；而递送非靶标的crRNA在CD3+T细胞内达到的效率仅为0.48％，可以忽略不计。
为进一步分析基因缺失的情况，本实施例通过流式分选收集TCR表达显著降低的细胞(靶向G1)，提取基因组进行长片段PCR，对PCR产物进行PacBio测序。将测序结果与原始序列进行比对，得到了总计73条缺失片段，其中有32个样本的缺失长度超过了1kb(如图5所示)；进一步分析发现缺失的起点并不位于假定的R-loop位点，而是位于PAM上游320nt到348nt的一个窗口中(其中有一个例外，其缺失起点位于PAM上游85nt)；并且造成的缺失都是从PAM近端到PAM远端，证明本实施例形成的工具系统中，Cas3表现出3'-5'单向的切割活性，而缺失的终点最远可以达到PAM远端约4.5kb，利用本实施例形成的工具系统可以在CD3+T细胞内对基因组造成单向的大片段敲除。
三、总结与讨论
通用型CAR-T细胞治疗中最大的挑战在于宿主细胞对通用型CAR-T细胞的免疫排斥以及通用型CAR-T细胞攻击宿主组织器官。αβT细胞占T细胞总数95％以上，αβT细胞的T细胞受体(TCR)由α链(TRAC基因编码)、β1链(TRBC1基因编码)和β2链(TRBC2基因编码)构成，同种异基因CAR-T细胞表面TCR可以识别宿主细胞抗原，引发移植物抗宿主病(GVHD)。此外，同种异基因CAR-T细胞表面的MHC，又称为人类白细胞抗原(HLA)，诱发宿主TCR识别，引起免疫排斥。HLA可分为HLA Ⅰ类分子和HLA Ⅱ类分子，其中，HLA Ⅰ类分子由具有高度多态性的α链和由B2M基因编码的β链(即β2微球蛋白)构成。
本实施例中，首先通过mRNA递送的方式，在CD3+T细胞内进行靶向敲除TRAC基因的编辑实验；在靶基因的上下游分别设计了敲除位点，递送cas mRNA以及crRNA，通过流式细胞术检测编辑效率；然后通过长片段PCR以及PacBio测序，确定DNA缺失的范围。通过上述实验最终确定，本实施例形成的工具系统在T细胞内最高可以达到40％的敲除效率；同时经过测序分析，可以发现利用该工具可以在T细胞内造成长达4.5kb的DNA缺失，这也证明了该工具系统在真核细胞中进行基因编辑的能力。
本发明首次利用I-B型CRISPR-Cascade-Cas3基因编辑系统在T细胞内进行基因编辑，这对于后续开发I-B型CRISPR-Cascade-Cas3基因编辑系统的临床应用奠定了基础。
除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。
Claims (10)
1.用于制备通用型CAR-T细胞的基因片段，其特征是，所述基因片段与crRNA相对应；所述基因片段的基本结构为5'-tgagcac-子片段-gtgtccaaaccattg atgccgtaaggcgt-3'；所述基因片段的序列为SEQ ID No.1至SEQ ID No.11之一。
2.根据权利要求1所述的基因片段，其特征是，所述基因片段的序列为SEQ ID No.2或SEQ ID No.7。
3.与权利要求1或2所述的基因片段对应的crRNA。
4.一种工具系统，其特征是，所述工具系统含有权利要求3所述的crRNA；所述工具系统为I-B型CRISPR-Cascade-Cas3基因编辑系统。
5.根据权利要求4所述的工具系统，其特征是，所述I-B型CRISPR-Cascade-Cas3基因编辑系统由Cascade复合物以及Cas3蛋白组成；所述crRNA位于Cascade复合物中；所述Cascade复合物由Cmx8蛋白、Cas8蛋白、Cas5蛋白、Cas6蛋白、Cas11蛋白以及crRNA复合而成；所述Cmx8蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.12；所述Cas8蛋白的氨基酸序列为SEQ IDNO.13；所述Cas5蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.14；所述Cas6蛋白的氨基酸序列为SEQ IDNO.15；所述Cas11蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.16；所述Cas3蛋白的氨基酸序列为SEQID NO.17。
6.权利要求1或2所述基因片段、或者权利要求3所述crRNA、或者权利要求4或5所述工具系统用于敲除TRAC基因的应用、或者用于制备通用型CAR-T细胞的应用。
7.含有权利要求4或5所述工具系统的细胞系或细胞株。
8.一种制备通用型CAR-T细胞的方法，其特征是，所述方法包括：采用权利要求4或5所述的工具系统对T细胞进行TRAC基因敲除，得到通用型CAR-T细胞。
9.一种通过利用权利要求1或2所述的基因片段、或权利要求3所述的crRNA、或权利要求4或5所述的工具系统、或权利要求8所述的方法制备获得的通用型CAR-T细胞。
10.含有权利要求9所述通用型CAR-T细胞的细胞制剂。
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