TW201922777A - 一種sgRNA構建體、提高胎兒血紅蛋白表達的方法及其應用與用途 - Google Patents

Abstract

本發明關於高效安全基因編輯造血幹細胞BCL11A的增強子位點的方法，包括透過基因編輯技術破壞BCL11A基因組CTTCCT區域。本發明基因編輯後的造血幹細胞具有正常細胞功能，且能顯著提高胎兒血紅蛋白的表達, 以抵消地中海貧血患者缺失的正常血紅蛋白。因此，可將基因編輯後的造血幹細胞用於β-地中海貧血和鐮刀紅細胞貧血的臨床治療。

Description

一種sgRNA構建體、提高胎兒血紅蛋白表達的方法及其應用與用途

[交叉引用]本申請要求享有2017年10月27日提交的中國專利申請2017110277086的優先權，該中國專利申請的公開內容以其整體透過引用併入本申請。

本發明關於用於治療地中海貧血和鐮刀型紅細胞貧血等貧血疾病的細胞治療方案，其包含利用基因編輯技術，高效安全地基因修飾人的造血幹細胞的BCL11A的增強子位點，尤其是透過基因編輯技術破壞造血幹細胞中2號染色體上CTTCCT連續6個鹼基的BCL11A基因組區域，上調γ球蛋白和胎兒血紅蛋白的表達，實現治療疾病的目的。

地中海貧血又稱為球蛋白生成障礙貧血或者海洋性貧血，是一組由於基因缺陷等遺傳因素導致的溶血性貧血類疾病。遺傳性基因缺陷致使血紅蛋白中一種或幾種球蛋白肽鏈合成缺失或者不足，從而導致貧血或者溶血的病理狀態。合成血紅蛋白的球蛋白鏈減少或缺失會導致血紅蛋白結構異常，這種含有異常血紅蛋白的紅細胞變形性降低，壽命減短，在骨髓中可能出現原位溶血，進入到外周血液迴圈後被脾臟等臟器提前破壞，致使貧血、體內鐵沉積甚至發育異常。由於不同球蛋白鏈基因突變的多樣性和複雜性，使缺失的球蛋白類型、數量及臨床症狀變異性非常大。

地中海貧血根據所缺失的球蛋白鏈種類及缺乏程度予以命名和分類。按照不同類型球蛋白肽鏈生成障礙可分為α型、β型、δ型、δβ型。目前地中海貧血是全球最普遍的基因缺陷遺傳性疾病之一。據統計，4.83%的全球人口攜帶球蛋白突變基因，其中包括1.67%的α、β地中海貧血雜合子，同時包含1.92%攜帶鐮刀型細胞突變的血紅蛋白，0.95%攜帶血紅蛋白E，0.29%攜帶血紅蛋白C等。由此產生的有疾病症狀的血紅蛋白異常的全球人口出生率不少於0.024%，是一種常見的基因缺陷型疾病。

β地中海貧血(以下簡稱β地貧)是地中海貧血的一種，其發病機理是因為β球蛋白肽鏈發生基因突變，多數病人是點突變，少數是大片段基因缺失。基因缺失和某些點突變可以導致一部分β球蛋白肽鏈的合成完全被抑制，這類稱為β⁰ 地貧；而少數的點突變使β鏈的合成部分受到抑制，仍保留一部分肽鏈合成，這類稱為β⁺ 地貧，不同的組合可能出現不同的臨床症狀。β地貧基因突變類型非常多，據統計全球約有300多種基因異常，已發現的突變點有100多種，目前國內臨床報導的有28種。其中常見的突變有6種，β41-42(-TCTT缺失)，約占45%，IVS-II654(C到T點突變)，約占24%，β17(A到T點突變)，約占14%，TATA盒子-28(A到T點突變)，約占9%。Β71-72(+A插入突變)，約占2%，β26(G到A點突變)約占2%等。

重型β地貧的突變基因類型有兩種，其一是β純合子，契爾氏β⁰ 與β⁺ 地貧雙重雜合子，因為β球蛋白肽鏈生成近于完全受到抑制，體內無法產生β球蛋白鏈，由α鏈和β鏈組成的正常的血紅蛋白A合成減少或消失。雖然多餘的α鏈蛋白能與紅細胞內γ鏈結合形成血紅蛋白F，但是由於出生後，γ合成逐漸受到抑制(又稱為血紅蛋白鏈合成切換)，因此，多餘的α鏈會沉積在紅細胞內形成包涵體，附著在紅細胞膜表面上，使紅細胞膜特性發生改變，細胞變僵硬而導致變形能力下降，在骨髓中發生被破壞導致“無效造血”。部分地中海貧血的紅細胞雖然能夠在骨髓中生長發育成熟，並最終被釋放到外周血循環中，但當它們透過外周局部微循環(如脾臟等臟器)時，就會因為變形能力下降，容易發生機械破壞。由於上述原因，患兒在臨床上出現出生時無症狀，出生後由於HbF(胎兒血紅蛋白)表達而且紅細胞壽命長達120天，往往當6個月後由於 γ鏈合成被生理性抑制，血紅蛋白鏈合成切換為β鏈，同時由於基因缺陷無法合成β鏈，細胞發生病理改變引起破壞增加，呈現慢性溶血性貧血表現，進一步導致骨髓構成改變。治療過程中需反復輸血，導致含鐵血黃素沉著症，影響重要臟器功能。

鐮刀型紅細胞貧血，與β-地中海貧血類似，都屬於一種常染色體隱性遺傳病，不同的是該貧血症突變位點單一，由於β球蛋白的單一鹼基突變，正常的β基因的第6位元密碼子由GAG(編碼谷氨酸)突變為GTG(纈氨酸)所致。在突變純合子狀態，正常的α球蛋白和異常的β球蛋白形成四聚體複合物，稱為HbS, 該四聚體攜帶氧氣的能力是正常血紅蛋白的一半，在去氧狀態下聚集成多聚體，因形成的多聚體排列方向與膜平行，緊密接觸細胞膜，當多聚體數量達到一定程度後，細胞膜由正常的凹形變成鐮刀型。鐮刀型紅細胞，變形性差，容易破碎而發生溶血，造成血管堵塞，損傷，壞死等。

β-地中海貧血和鐮刀型紅細胞貧血的治療方法包括：一般支援治療、高劑量輸血及規律去鐵治療、造血幹細胞移植、誘導胎兒血紅蛋白藥物治療和探索性的基因治療。目前，所有治療方案中唯一有治癒希望的方法是異基因造血幹細胞移植，自1981年湯瑪斯進行了首例地貧患者造血幹細胞移植並取得成功後，造血幹細胞移植技術在全球多個地貧研究中心開展並成功取代了經典的輸血和去鐵的治療方案。然而，由於HLA全相合供者嚴重缺乏和移植後GVHD(graft-versus-host disease，移植物抗宿主反應)導致的死亡，依舊限制著造血幹細胞移植治療地中海貧血的廣發應用。與此同時，一直以來研究者們在持續探索治療地中海貧血的藥物，目前 FDA唯一批准用於臨床治療的口服藥物是羥基脲，主要透過誘導胎兒血紅蛋白表達緩解疾病臨床症狀，但由於該藥物的臨床療效不一致且存在很大的副作用，以及劑量相關的骨髓抑制，亟待開發新的治療方法治療β-地中海貧血和鐮刀型紅細胞貧血等相關貧血疾病。

在本說明書的整篇文本中引用了數篇檔。此處的每篇檔(包括任何期刊文章或摘要、公開或未公開的專利申請、授權專利、製造商的說明書、使用說明等)透過提述併入本文。然而，並非認可此處引用的檔事實上是本發明的現有技術。

本發明利用基因編輯技術，例如CRISPR/Cas9基因編輯技術，開發出了新一代的造血幹細胞，該造血幹細胞與現有技術的造血幹細胞相比，對BCL11A增強子基因敲除的效率大大增加，從而使分化成熟後的紅細胞胎兒血紅蛋白的表達大大提升，一定程度上解決了現有技術中BCL11A增強子編輯效率低，胎兒血紅蛋白表達量不能滿足臨床應用的問題。另外，本發明也進一步改善了對基因編輯後的造血幹細胞的培養和分化策略，不僅大大縮短了從造血幹細胞到成熟紅細胞的分化進程，同時也使收穫的成熟紅細胞的數量大大增加，從而部分滿足了臨床應用的要求。

具體地本發明關於如下各項：

1. 一種提高人造血幹細胞胎兒血紅蛋白(HbF)表達的方法，包括：

透過基因編輯技術破壞所述造血幹細胞中2號染色體上從CTTCCT序列上游0-15個核苷酸至該CTTCCT序列下游0-15個核苷酸的BCL11A基因組區域， 其中該BCL11A基因組區域位於chr2:60495236至chr2:60495271之間。

2. 項1所述的方法，其中所述BCL11A基因組區域序列為CTTCCT。3. 項1或2 所述的方法，其中所述基因編輯技術為基於鋅指核酸酶的基因編輯技術、TALEN基因編輯技術或CRISPR/Cas基因編輯技術。

項3所述的方法，其中所述基因編輯技術為CRISPR/Cas9基因編輯技術。

5. 項1-4任一項所述的方法，包括向所述造血幹細胞導入靶向所述BCL11A基因組區域的sgRNA以實現對所述BCL11A基因組區域的編輯。

6. 項3-5任一項所述的方法，包括向所述造血幹細胞導入包含選自SEQ ID NOs: 3、4、8和33-63任一序列的sgRNA以實現對所述BCL11A基因組區域的編輯。

7. 項3-6任一項的方法，將包含SEQ ID NO：4的序列的sgRNA導入所述造血幹細胞以實現對所述BCL11A基因組區域的編輯。

8. 項5-7任一項的方法，其中所述sgRNA是經過2’-O-甲基類似物和/或核苷酸間3’硫代修飾的。

9. 項8的方法，其中所述化學修飾為所述sgRNA的5’端前一個、二個和/或三個鹼基和/或3’端的最後一個鹼基的2’-O-甲基類似物修飾。

10. 項4-9任一項的方法，其中將所述sgRNA與Cas9編碼核苷酸共同導入所述造血幹細胞。

11. 項10的方法，其中透過電轉方法將sgRNA與Cas9編碼核苷酸共同導入所述造血幹細胞。

12. 項11的方法，其中所述電轉條件為200-600V，0.5ms-2ms。

13. 一種透過CRISPR/Cas9系統體外高效編輯造血幹細胞的方法，包括將靶向從CTTCCT序列上游0-15個核苷酸至該CTTCCT序列下游0-15個核苷酸的BCL11A基因組區域的sgRNA導入造血幹細胞，其中該BCL11A基因組區域位於chr2:60495236至chr2:60495271之間， 其中該sgRNA是經過2’-O-甲基類似物和/或核苷酸間3’硫代修飾的。

14. 項13的方法，包括將含有選自SEQ ID NO：4 、8和33-63任一序列的sgRNA導入造血幹細胞，其中該sgRNA是經過2’-O-甲基類似物和/或核苷酸間3’硫代修飾的。

15. 項13或14的方法，其中將所述sgRNA與Cas9編碼核苷酸共同導入所述造血幹細胞。

16. 項15的方法，其中透過電轉方法將sgRNA與Cas9編碼核苷酸共同導入所述造血幹細胞。

17. 項16的方法，其中所述電轉條件為200-600V，0.5ms-2ms。

18．透過項1~17中任一項所述的方法得到的造血幹細胞。

19. 一種透過基因改造使胎兒血紅蛋白(HbF)表達升高的人造血幹細胞，其中該造血幹細胞中第2號染色體上從CTTCCT序列上游0-15個核苷酸至該CTTCCT序列下游0-15個核苷酸的BCL11A基因組區域透過基因編輯技術被破壞，其中該BCL11A基因組區域位於chr2:60495236至chr2:60495271之間。

20. 透過分化培養項18或19所述的造血幹細胞獲得的、處於成熟紅細胞之前的不同分化階段的前體細胞。

21. 透過分化培養項18或19所述的造血幹細胞獲得的成熟紅細胞。

22. 一種製造透過基因改造使胎兒血紅蛋白(HbF)表達升高的成熟紅細胞或其前體細胞的方法，該方法包括：
(a)使用項1~17中任一項所述的方法得到基因改造的造血幹細胞；
(b)使用造血幹細胞紅系擴增和分化培養基對所述基因改造的造血幹細胞進行造血幹細胞紅系擴增和分化，
其中，所述造血幹細胞紅系擴增和分化培養基包括基礎培養基，以及生長因數的組合物，其中所述生長因數的組合物包括幹細胞生長因數（SCF）；白介素3（IL-3）和促紅細胞生成素（EPO）。

23. 根據項22所述的方法，該方法更包括：
使用紅系分化脫核培養基進行造血幹細胞紅系分化脫核，
所述紅系分化脫核培養基包含基礎培養基、生長因數、以及孕酮受體和糖皮質激素受體的拮抗劑和/或抑制劑。

24. 根據項23所述的方法，其中所述紅系分化脫核培養基中的生長因數包括促紅細胞生成素（EPO），所述孕酮受體和糖皮質激素受體的拮抗劑和/或抑制劑為選自下述化合物(I)~(IV)中的任一種或兩種及以上：
(I)

(II)
(III)
(IV)。

25. 透過項22~24中任一項所述的方法得到的成熟紅細胞或前體細胞。

26. 一種組合物，包含項18或19的造血幹細胞、或項20或25的前體細胞、或項21或25的成熟紅細胞。

27. 包含項18或19的造血幹細胞、或項20或25的前體細胞、或項21或25的成熟紅細胞的醫用製品。

28. 項18或19的造血幹細胞、或項20或25的前體細胞、或項21或25的成熟紅細胞在預防或治療有需要的受試者的疾病中的用途。

29. 項28的用途，所述疾病為貧血性疾病、失血性疾病、腫瘤或其它需要大量輸血進行預防或治療的疾病。

30. 根據項29的用途，其中所述疾病為β-地中海貧血或鐮刀型紅細胞貧血。

31. 項28-30中任一項的用途，其中所述受試者為人。

32. 項18或19的造血幹細胞、或項20或25的前體細胞、或項21或25的成熟紅細胞在製備預防或治療受試者疾病中的藥物或醫用製品中的用途。

33. 項32的用途，所述疾病為貧血性疾病、失血性疾病、腫瘤或其它需要大量輸血進行預防或治療的疾病。

34. 根據項33的用途，其中所述疾病為β-地中海貧血或鐮刀型紅細胞貧血。

35. 項32-34中任一項的用途，其中所述受試者為人。

36. 一種sgRNA構建體，包含靶向從CTTCCT序列上游0-15個核苷酸至該CTTCCT序列下游0-15個核苷酸的BCL11A基因組區域的sgRNA，其中該BCL11A基因組區域位於chr2:60495236至chr2:60495271之間。

37. 申請專利範圍第36項的構建體，包含選自SEQ ID NOs：3、4、8和33-63之一的核苷酸序列。

38. 項36或37的構建體，其包含2’-O-甲基類似物和/或核苷酸間3’硫代修飾。

39. 項38的構建體，其中所述化學修飾為在所述核苷酸序列的5’端的前一個、二個和/或三個鹼基和/或3’端的最後一個鹼基的2’-O-甲基類似物修飾。

40. 包含項36-39中任一項的構建體的載體、宿主細胞或製劑。

41. 包含項36-39中任一項的構建體在基因編輯造血幹細胞中的用途。

42. 一種治療或預防受試者貧血性疾病、失血性疾病、腫瘤或其它需要大量輸血進行預防或治療的疾病的方法，其包括給藥受試者項18或19的造血幹細胞，項20或25的前體細胞，或項21或25的成熟紅細胞。

43. 根據項42所述的方法，其中，所述疾病為β-地中海貧血或鐮刀型紅細胞貧血。

44. 根據項43所述的方法，其中，所述受試者為人。

發明效果

本發明透過實驗證明，透過破壞BCL11A基因中位於chr2:60495236至chr2:60495271之間的BCL11A基因組區域，例如CTTCCT的6bp鹼基序列，可以解除BCL11A基因對胎兒血紅蛋白合成的抑制，從而提高胎兒血紅蛋白的表達，表明“CTTCCT”序列及其相鄰的區域是BCL11A基因調控胎兒血紅蛋白表達的關鍵區域。

本發明的一些實施例中，透過用基因編輯方法破壞造血幹細胞中2號染色體上序列為CTTCCT（chr2: 60495251-60495256）的BCL11A基因組區域，製備了基因編輯的造血幹細胞，且透過實驗證明該基因編輯的造血幹細胞向紅系分化能顯著提升γ球蛋白和胎兒血紅蛋白（HbF）的表達；將其輸注動物體內，能重建動物模型的造血系統。同時，脫靶分析顯示本方法安全性高，幾乎檢測不到基因編輯所引起的副作用。

本申請關於對CD34陽性造血幹細胞的BCL11A增強子位點，尤其是破壞BCL11A基因中從CTTCCT序列上游0-15個核苷酸至該CTTCCT序列下游0-15個核苷酸區域，例如“CTTCCT”的6bp鹼基序列（chr2: 60495251-60495256），可以解除BCL11A基因對胎兒血紅蛋白合成的抑制，從而提高胎兒血紅蛋白的表達。

一方面，本發明提供一種提高人造血幹細胞胎兒血紅蛋白(HbF)表達的方法，包括：透過基因編輯技術破壞所述造血幹細胞中2號染色體上從CTTCCT序列上游0-15個核苷酸至該CTTCCT序列下游0-15個核苷酸的BCL11A基因組區域， 其中該BCL11A基因組區域位於chr2:60495236至chr2:60495271之間。在一些實施例中，所述BCL11A基因組區域的序列為CTTCCT。

本申請中所指的BCL11A基因組區域的“CTTCCT”序列是指位於人2號染色體上第60495251位至第60495256位的序列，其中染色體核苷酸位置是根據GRCh38標準人類基因序列中的位置。所屬技術領域中具有通常知識者應明白該CTTCCT序列參照不同的人基因組序列，其位置可能有所不同。在一些實施例中，所述破壞從CTTCCT序列上游0-15個核苷酸至該CTTCCT序列下游0-15個核苷酸的BCL11A基因組區域，包括在此區域引入核苷酸序列的“添加和/或刪除（indel）”，例如引入任何類型（例如選自A、T、C、G）和/或數量（例如1-20、1-15、1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2個）的核苷酸的indel。在一些實施例中，所述的破壞包括用新的核苷酸序列置換原有的核苷酸序列，例如，用1個、2個、3個、4個、5個或6個核苷酸置換CTTCCT連續6個核苷酸中1個、2個、3個、4個、5個或6個核苷酸。在一些實施例中，所述的破壞包括從CTTCCT序列上游0-15個核苷酸至該CTTCCT序列下游0-15個核苷酸的BCL11A基因組區域敲入（knock-in）或敲除（knock-out）一段核苷酸序列，例如在CTTCCT連續6個核苷酸的區域敲入或敲除一段核苷酸序列。 根據基因分析結果顯示，“CTTCCT”的6bp鹼基序列包含了STAT1和ELF1基因的結合位點。

不受任何理論或假說的限制, 本發明中對CTTCCT及其附近區域的破壞，例如向該區域引入indel，可直接影響STAT1和ELF-1與BCL11A增強子的結合，能顯著高效地上調胎兒血紅蛋白的表達，例如本發明實施例透過Enhancer 2所證明的。圍繞“CTTCCT”區域的基因編輯，例如圍繞“CTTCCT”區域上游和/或下游1-15、1-14、1-13、1-12、1-11、1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2個核苷酸區域的基因編輯，例如在這些區域引入indel，也可以不同程度地提升胎兒血紅蛋白的表達，參見例如本發明圖10、23和24所示。

在一些實施例中，本發明中所破壞的BCL11A基因組區域為從CTTCCT序列上游0-15個核苷酸至該CTTCCT序列下游0-15個核苷酸的區域，其中該BCL11A基因組區域位於chr2:60495236至chr2:60495271之間。在一些實施例中，本發明中所破壞的BCL11A基因組區域為從CTTCCT序列上游0-14個核苷酸至該CTTCCT序列下游0-14個核苷酸的區域，其中該BCL11A基因組區域位於chr2:60495237至chr2:60495270之間。在一些實施例中，本發明中所破壞的BCL11A基因組區域為從CTTCCT序列上游0-13個核苷酸至該CTTCCT序列下游0-13個核苷酸的區域，其中該BCL11A基因組區域位於chr2:60495238至chr2:60495269之間。在一些實施例中，本發明中所破壞的BCL11A基因組區域為從CTTCCT序列上游0-12個核苷酸至該CTTCCT序列下游0-12個核苷酸的區域，其中該BCL11A基因組區域位於chr2:60495239至chr2:60495268之間。在一些實施例中，本發明中所破壞的BCL11A基因組區域為從CTTCCT序列上游0-11個核苷酸至該CTTCCT序列下游0-11個核苷酸的區域，其中該BCL11A基因組區域位於chr2:60495240至chr2:60495267之間。在一些實施例中，本發明中所破壞的BCL11A基因組區域為從CTTCCT序列上游0-10個核苷酸至該CTTCCT序列下游0-10個核苷酸的區域，其中該BCL11A基因組區域位於chr2:60495241至chr2:60495266之間。在一些實施例中，本發明中所破壞的BCL11A基因組區域為從CTTCCT序列上游0-9個核苷酸至該CTTCCT序列下游0-9個核苷酸的區域，其中該BCL11A基因組區域位於chr2:60495242至chr2:60495265之間。在一些實施例中，本發明中所破壞的BCL11A基因組區域為從CTTCCT序列上游0-8個核苷酸至該CTTCCT序列下游0-8個核苷酸的區域，其中該BCL11A基因組區域位於chr2:60495243至chr2:60495264之間。在一些實施例中，本發明中所破壞的BCL11A基因組區域為從CTTCCT序列上游0-7個核苷酸至該CTTCCT序列下游0-7個核苷酸的區域，其中該BCL11A基因組區域位於chr2:60495244至chr2:60495263之間。在一些實施例中，本發明中所破壞的BCL11A基因組區域為從CTTCCT序列上游0-6個核苷酸至該CTTCCT序列下游0-6個核苷酸的區域，其中該BCL11A基因組區域位於chr2:60495245至chr2:60495262之間。在一些實施例中，本發明中所破壞的BCL11A基因組區域為從CTTCCT序列上游0-5個核苷酸至該CTTCCT序列下游0-5個核苷酸的區域，其中該BCL11A基因組區域位於chr2:60495246至chr2:60495261之間。在一些實施例中，本發明中所破壞的BCL11A基因組區域為從CTTCCT序列上游0-4個核苷酸至該CTTCCT序列下游0-4個核苷酸的區域，其中該BCL11A基因組區域位於chr2:60495247至chr2:60495260之間。在一些實施例中，本發明中所破壞的BCL11A基因組區域為從CTTCCT序列上游0-3個核苷酸至該CTTCCT序列下游0-3個核苷酸的區域，其中該BCL11A基因組區域位於chr2:60495248至chr2:60495259之間。在一些實施例中，本發明中所破壞的BCL11A基因組區域為從CTTCCT序列上游0-2個核苷酸至該CTTCCT序列下游0-2個核苷酸的區域，其中該BCL11A基因組區域位於chr2:60495249至chr2:60495258之間。在一些實施例中，本發明中所破壞的BCL11A基因組區域為從CTTCCT序列上游0-1個核苷酸至該CTTCCT序列下游0-1個核苷酸的區域，其中該BCL11A基因組區域位於chr2:60495250至chr2:60495257之間。在一些實施例中，本發明中所破壞的BCL11A基因組區域序列為CTTCCT，其中該BCL11A基因組區域位於chr2:60495251至chr2:60495256之間。

在一些實施例中，該BCL11A基因組區域最上游位於該CTTCCT序列的上游第15個、14個、13個、12個、11個、10個、9個、8個、7個、6個、5個、4個、3個、2個、或1個核苷酸，或CTTCCT序列中的5’端的第1個、2個或3個核苷酸。 在一些實施例中，該BCL11A基因組區域最下游位於該CTTCCT序列的下游第15個、14個、13個、12個、11個、10個、9個、8個、7個、6個、5個、4個、3個、2個、或1個核苷酸，或CTTCCT序列中的3’端的第1個、2個或3個核苷酸。在一些實施例中，該BCL11A基因組區域最上游位於chr2: 60495253、chr2: 60495252、chr2: 60495251、chr2: 60495250、chr2: 60495249、chr2: 60495248、chr2: 60495247、chr2: 60495246、chr2: 60495245、chr2: 60495244、chr2: 60495243、chr2: 60495242、chr2: 60495241、chr2: 60495240、chr2: 60495239、chr2: 60495238、chr2: 60495237、或chr2:60495236。在一些實施例中，該BCL11A基因組區域最下游位於chr2: 60495254、chr2: 60495255、chr2:60495256、chr2:60495257、chr2:60495258、chr2:60495259、chr2:60495260、chr2:60495261、chr2:60495262、chr2:60495263、chr2:60495264、chr2:60495265、chr2:60495266、chr2:60495267、chr2:60495268、chr2:60495269、chr2:60495270、或chr2:60495271。該BCL11A基因組區域的最上游和最下游可以是以上任何一個最上游和最下游位置的組合，並且該BCL11A基因組區域不是GATAA位元點。

在一些實施例中，本發明所述的BCL11A基因組區域選自如下所示SEQ ID NO: 31或SEQ ID NO: 32的序列中的1-36個（如約1-4個、1-6個、1-8個、1-10個、1-15個、1-20個、1-25個、或1-30個）連續的核苷酸序列，並且該核苷酸序列不是GATAA：

SEQ ID NO：31（chr2:60495236至chr2:60495271之間的核苷酸序列）
atcagaggccaaacccttcctggagcctgtgataaa

SEQ ID NO: 32 （chr2:60495236至chr2:60495271之間的核苷酸序列的互補序列）
tttatcacaggctccaggaagggtttggcctctgat

因此，一方面，本發明關於一種提高人造血幹細胞胎兒血紅蛋白(HbF)表達的方法，包括：透過基因編輯技術破壞所述造血幹細胞中2號染色體上CTTCCT連續6個鹼基（chr2: 60495251-60495256）的BCL11A基因組區域。本發明還關於一種提高人造血幹細胞胎兒血紅蛋白(HbF)表達的方法，包括：透過基因編輯技術破壞所述造血幹細胞中2號染色體上圍繞CTTCCT連續6個鹼基區域上游和/或下游1-15、1-14、1-13、1-12、1-11、1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2個核苷酸的區域。

在一些實施方案中，所述基因編輯技術為基於鋅指核酸酶的基因編輯技術、TALEN基因編輯技術或CRISPR/Cas基因編輯技術。在一些實施方案中，所述基因編輯技術為CRISPR/Cas9基因編輯技術。

在一些實施方案中，所述方法包括向所述造血幹細胞導入靶向從CTTCCT序列上游0-15個核苷酸至該CTTCCT序列下游0-15個核苷酸的BCL11A基因組區域的sgRNA，其中該BCL11A基因組區域位於chr2:60495236至chr2:60495271之間,如包含CTTCC或與CTTCC互補的序列的sgRNA, 以實現對所述BCL11A基因組的編輯。在一些實施方案中，所述方法包括向所述造血幹細胞導入包含選自SEQ ID NOs: 3、4 、8和33-63任一序列的sgRNA以實現對所述BCL11A基因組的編輯。

本發明提供了用於基因編輯造血幹細胞所需的sgRNA（如經過化學修飾的sgRNA），其包含靶向從CTTCCT序列上游0-15個核苷酸至該CTTCCT序列下游0-15個核苷酸的BCL11A基因組區域的sgRNA，其中該BCL11A基因組區域位於chr2:60495236至chr2:60495271之間, 如包含CTTCC或與CTTCC互補的核苷酸序列，進一步其包含選自SEQ ID NOs: 3、4 、8和33-63任一的核苷酸序列。

本發明還提供用於β-地中海貧血和鐮刀紅細胞貧血患者的造血幹細胞的編輯方法。

本發明還提供了一種經基因編輯破壞本發明所述任一BCL11A基因組區域的造血幹細胞、成熟紅細胞或成熟紅細胞的前體細胞。 在一些實施例中，該造血幹細胞、成熟紅細胞或成熟紅細胞的前提細胞中經破壞的BCL11A基因組區域包含圖31所示的任一序列， 如Enhancer-2-Indels-1、2、3或4。

根據本發明的目的之一是基於CRISPR/Cas基因編輯技術，高效基因修飾CD34+造血幹細胞。例如可以從臍帶血或骨髓中獲得CD34陽性的造血幹細胞，並將Cas9和給定的sgRNA，透過優化的電轉條件導入造血幹細胞，對造血幹細胞進行基因編輯，並將基因編輯後的造血幹細胞移植進入實驗動物以評價該造血幹細胞重建造血系統的能力。所述sgRNA可以透過多種設計軟體，例如“CRISPR RGEN TOOLS”軟體，針對BCL11A的增強子，例如針對BCL11A(+58)位點進行設計。在一些實施方案中，對設計的sgRNA進行化學修飾，例如在其5’和3’末端3個鹼基處的2’-O-甲基類似物修飾和核苷酸間的3’硫代修飾。可以透過測試Cas9 mRNA和不同sgRNA的組合，獲取高效的sgRNA。在某些實施方案中，所述的造血幹細胞是透過使用臨床級別的磁柱分選獲得，用於基因編輯的Cas9蛋白編碼核苷酸以及經過化學修飾的sgRNA是經過體外轉錄實驗獲得。將基因編輯後的造血幹細胞向紅系分化，檢測紅細胞生成比例，例如，可以將基因編輯後的造血幹細胞移植進入經過輻照儀照射的NPG小鼠，評價重建造血系統的能力，也可以分離病人的CD34陽性的造血幹細胞，評價基因編輯效率、紅系分化能力、γ球蛋白和胎兒血紅蛋白的表達。

首先，本發明提供一種提高胎兒血紅蛋白(HbF)表達的方法，包括：透過CRISPR/Cas9編輯技術基因編輯造血幹細胞BCL11A的增強子位點。編輯過程針對造血幹細胞BCL11A的增強子位點靶向序列設計sgRNA。BCL11A的增強子根據其轉錄起始位元點的距離(kilo-base數)存在命名為+62、+58、+55的位元點，有報導稱BCL11A基因的紅系增強子能夠負向調控胎兒血紅蛋白(HbF)表達，其中距離轉錄起始位點55kb(kb表示1000個鹼基)，58kb、62kb位置是關鍵的調控區域。雖然已經有研究人員針對+55、+58、+62位點進行研究，但是上述三個位點前後的基因序列均在1000bp以上，總共約6000bp，因此所屬技術領域中具有通常知識者並不知曉具體編輯哪些區域可以實現理想的編輯效果，即使針對一個+58位點而言，基因編輯效率也差別很大(參見：Bauer, D. E. et al. An erythroid enhancer of BCL11A subject to genetic variation determines fetal hemoglobin level. Science. 342, 253–257 (2013)，以及 Canver MC, et al. BCL11A的增強子 dissection by Cas9-mediated in situ saturating mutagenesis. Nature. 2015 Nov 12;527(7577):192-7.)。因此，尋找到對編輯效率至關重要的具體區域是所屬技術領域中具有通常知識者首先面臨的問題。

本申請的發明人透過深入研究發現+58位置中150bp的鹼基序列（位於人類第2號染色體第60495197位至第60495346位元的區域，在本文中簡寫為chr2:60495197-60495346，其序列例如，如SEQ ID NO: 2所示)對基因編輯的效率影響很大，而其中最關鍵的區域為 “CTTCCT”6bp的鹼基序列區域。透過破壞該區域可以實現顯著高效地提升胎兒血紅蛋白的表達。破壞從CTTCCT序列上游0-15個核苷酸至該CTTCCT序列下游0-15個核苷酸的BCL11A基因組區域, 如圍繞CTTCCT序列上游和/或下游1-15、1-14、1-13、1-12、1-11、1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2個核苷酸的區域也能夠不同程度地提升胎兒血紅蛋白的表達。

本發明的sgRNA均能高效實現基因編輯正常供體和貧血病人來源的造血幹細胞，其中相對效率更高的候選的sgRNA均能顯著提高胎兒血紅蛋白的表達。有文獻報導透過針對+55、+58、+62位點設計sgRNAs文庫，利用CRISPR/Cas9進行細胞模型上的篩選，發現靶向+58處中“GATAA”位點是關鍵的調控序列，即包含”GATAA”序列的sgRNA所導致的胎兒血紅蛋白提升效果最明顯。 然而，值得注意的是，本發明中發現的sgRNA錨定的+58k附近的區域與現有技術中公開的關鍵的“GATAA”鹼基位點是不同的。

本發明的發明人發現在BCL11A基因組區域中序列“CTTCCT”是關鍵的靶點序列(圖31中箭頭指向的位置)。如果在基因編輯的細胞中該序列被破壞，則能夠顯著有效地上調胎兒血紅蛋白的表達。根據基因分析的結果顯示的“CTTCCT”6bp的鹼基序列，其包含了STAT1和ELF1基因的結合位點。其中，根據文獻報導STAT1的結合位元點是“TTCCnGGA”基序 (n代表任意鹼基) (Raja, et al. Nucleic Acids Research. 2008;George, et al. Journal of Biological Chemistry. 2001; Christoph, et al. Plos one. 2010), 而ELF-1的結合位點是“TTCC”基序 (Steven, et al. Scientific Reports. 2015; Yuang-Taung Juang, et al. The Journal of Immunology. 2007)。 透過本發明sgRNA導入的基因編輯對胎兒血紅蛋白的表達起到了顯著的提升作用，足以應用於臨床治療。

所屬技術領域中具有通常知識者可以理解，在獲知高效基因編輯區域後，所屬技術領域中具有通常知識者可以用任何基因編輯方法，例如基於鋅指核酸酶的基因編輯技術、 TALEN基因編輯技術和CRISPR/Cas(如CRISPR/Cas9)基因編輯技術，以及今後發現的其它基因編輯方法，對所獲知的高效基因編輯區域進行編輯，優化基因編輯條件，實現高效編輯的目的。因此，本發明涵蓋透過任何可利用的基因編輯方法對本發明所鑒定的選自序列3-25和33-63的BCL11A基因靶序列的技術方案。在一些優選實施方案中，本發明關於透過CRISPR/Cas9 基因編輯技術實現高效基因編輯的技術方案。

如本申請使用的，“CRISPR/Cas”是一種基因編輯技術，包括但不限於各種自然存在或人工設計的CRISPR/Cas系統, 如CRISPR/Cas9系統。自然存在的CRISPR/Cas系統(Naturally occurring CRISPR/Cas system)是細菌和古細菌在長期演化過程中形成的一種適應性免疫防禦，可用來對抗入侵的病毒及外源DNA。例如，CRISPR/Cas9的工作原理是 crRNA(CRISPR-derived RNA)透過鹼基配對與 tracrRNA(trans-activating RNA)結合形成 tracrRNA/crRNA 複合物，此複合物引導核酸酶 Cas9 蛋白在與 crRNA 配對的序列靶位點剪切雙鏈 DNA。而透過人工設計tracrRNA和crRNA，可以改造形成具有引導作用的sgRNA (single guide RNA )，足以引導 Cas9 對 DNA 的定點切割。作為一種 RNA 導向的 dsDNA 結合蛋白，Cas9 效應物核酸酶能夠共定位 RNA、DNA 和蛋白，從而擁有巨大的改造潛力。CRISPR/Cas系統可使用一類，二類或三類Cas蛋白。本發明的一些實施方式中，所述方法使用Cas9。 其他適用的CRISPR/Cas系統包括但不限於WO2013176772，WO2014065596，WO2014018423，US8,697,359 中所描述的系統和方法。

本發明的另一方面，關於可實現高效基因編輯的本發明的一系列sgRNA分子。

本發明中，“sgRNA（single guide RNA）” 和 “gRNA（guide RNA）”或可以是“單指導RNA” 、“合成的指導RNA”或“指導RNA”可互換使用。本發明的sgRNA包含靶向目標序列的指導序列。在優選實施方案中，本發明的sgRNA進一步包含tracr序列和tracr伴侶序列。

本發明中的“指導序列” (guide sequence)可以是指定靶向位點的約17-20bp的序列，且可與“引導序列”或“間隔子”互換使用。在形成CRISPR複合物的背景下，“靶序列”例如是指導序列經設計以與其具有互補性的序列，其中靶序列和指導序列間的雜交促進CRISPR複合物的形成，所述雜交要求“靶序列”和“指導序列”或稱“引導序列”有足夠的互補性，能引起雜交並促進CRISPR複合物形成即可，完全互補不是必須的。

“互補”是指“指導序列”或稱“引導序列”與靶核苷酸序列（就本發明而言為造血幹細胞中BCL11A基因組靶核苷酸序列）可以透過沃森和克裡克發現的核苷酸配對原則雜交。所屬技術領域中具有通常知識者可以理解，只要具有足夠的互補性，“指導序列”便可與靶核苷酸序列雜交，而不需要它們之間具有100%的完全互補。在一些實施方案中，當使用適當的比對演算法最佳比對時，指導序列及其相應靶序列間的互補程度可為約或大於約75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多。最佳比對可使用用於比對序列的任何適當的演算法確定，包括Smith-Waterman演算法、Needleman-Wimsch演算法、基於Burrows-Wheeler Transform的演算法等。

通常，在內源CRISPR系統的背景下，CRISPR複合物的形成(包括指導序列與靶序列雜交並與一種或多種Cas蛋白複合)導致靶序列中或靶序列附近(例如，距離靶序列1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50或更多鹼基對的範圍內)的一條鏈或兩條鏈的切割。不希望受理論所限，tracr序列可包含野生型tracr序列的全部或其一部分，例如野生型tracr序列約或大於約20、23、26、29、32、35、38、41、44、47、50、53、56、59、62、65、70、75、80、85或更多個核苷酸)或由上述組成的tracr序列還可形成CRISPR複合物的一部分，例如透過沿tracr序列的至少一部分與指導序列可操作連接的tracr伴侶序列的全部或一部分雜交。

在一些實施方案中，tracr序列與tracr伴侶序列具有足夠的互補性以雜交並參與CRISPR複合物的形成。與“靶序列”和“指導序列”或稱“引導序列”雜交的情況類似，完全互補並不是必須的，只要足以發揮其功能即可。在一些實施方案中，在最佳對齊的情況下，tracr序列沿tracr伴侶序列的長度具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%的互補性。

在本申請中，靶向BCL11A基因組區域的sgRNA序列包括互補於該BCL11A基因組區域至少17個，優選18個，優選19個，或優選20個連續核苷酸的sgRNA。在一些實施方案中，造血幹細胞BCL11A位點靶向序列如SEQ ID NO：31或32所示，並且針對SEQ ID NO：31或32所示的鹼基區域設計sgRNA，要求sgRNA序列互補於SEQ ID NO：31或32序列的至少17個，優選18個，優選19個，或優選20個連續核苷酸的序列。

具體來說，下表列出了靶向從CTTCCT序列上游0-15個核苷酸至CTTCCT序列下游0-15個核苷酸的BCL11A基因組區域的sgRNA序列。

在一些實施方式中，本發明提供一種提高人造血幹細胞胎兒血紅蛋白(HbF)表達的方法，包括：透過基因編輯技術破壞所述造血幹細胞中2號染色體第60495236位至第60495255位，尤其是第60495238位的BCL11A基因組區域。該基因編輯技術為基於鋅指核酸酶的基因編輯技術、TALEN基因編輯技術或CRISPR/Cas基因編輯技術，優選為CRISPR/Cas9基因編輯技術，優選所述BCL11A基因組靶核苷酸序列與包含SEQ ID NO:4的sgRNA的引導序列互補。本發明方法關於將包含SEQ ID NO：4的序列的sgRNA導入造血幹細胞以實現對所述BCL11A基因組的編輯，優選將所述sgRNA與Cas9編碼核苷酸（如mRNA）共同導入所述造血幹細胞，優選透過電轉條件為200-600V，0.5ms-2ms的電轉方法來將所述sgRNA與Cas9編碼核苷酸共同導入所述造血幹細胞。在一些實施方案中，該sgRNA是經過2’-O-甲基類似物和/或核苷酸間3’硫代修飾的，比如，化學修飾為所述sgRNA的5’端前一個、二個和/或三個鹼基和/或3’端的最後一個鹼基的2’-O-甲基類似物修飾。在一些實施方案中，本發明還關於一種造血幹細胞，該造血幹細胞中染色體2上第60495236位至第60495255位，尤其是第60495238位的BCL11A基因組靶序列中的一個或多個位點透過基因編輯技術被破壞。進一步，關於透過體外分化培養該造血幹細胞後得到的紅細胞，以及包含該紅細胞的醫用製品。

在一些實施方式中，本發明提供一種提高人造血幹細胞胎兒血紅蛋白(HbF)表達的方法，包括：透過基因編輯技術破壞所述造血幹細胞中2號染色體第60495247位至第60495266位，尤其是第60495263位的BCL11A基因組區域。該基因編輯技術為基於鋅指核酸酶的基因編輯技術、TALEN基因編輯技術或CRISPR/Cas基因編輯技術，優選為CRISPR/Cas9基因編輯技術，優選所述BCL11A基因組靶核苷酸序列與包含SEQ ID NO: 3的sgRNA的引導序列互補。本發明方法關於將包含SEQ ID NO：3的序列的sgRNA導入造血幹細胞以實現對所述BCL11A基因組的編輯，優選將所述sgRNA與Cas9編碼核苷酸（如mRNA）共同導入所述造血幹細胞，優選透過電轉條件為200-600V，0.5ms-2ms的電轉方法來將所述sgRNA與Cas9編碼核苷酸共同導入所述造血幹細胞。在一些實施方案中，該sgRNA是經過2’-O-甲基類似物和/或核苷酸間3’硫代修飾的，比如，化學修飾為所述sgRNA的5’端前一個、二個和/或三個鹼基和/或3’端的最後一個鹼基的2’-O-甲基類似物修飾。在一些實施方案中，本發明還關於一種造血幹細胞，該造血幹細胞中染色體2上第60495247位至第60495266位，尤其是第60495263位的BCL11A基因組靶序列中的一個或多個位點透過基因編輯技術被破壞。進一步，關於透過體外分化培養該造血幹細胞後得到的紅細胞，以及包含該紅細胞的醫用製品。

在一些實施方式中，本發明提供一種提高人造血幹細胞胎兒血紅蛋白(HbF)表達的方法，包括：透過基因編輯技術破壞所述造血幹細胞中2號染色體第60495252位至第60495271位，尤其是第60495268位的BCL11A基因組區域。該基因編輯技術為基於鋅指核酸酶的基因編輯技術、TALEN基因編輯技術或CRISPR/Cas基因編輯技術，優選為CRISPR/Cas9基因編輯技術，優選所述BCL11A基因組靶核苷酸序列與包含SEQ ID NO: 8的sgRNA的引導序列互補。本發明方法關於將包含SEQ ID NO：8的序列的sgRNA導入造血幹細胞以實現對所述BCL11A基因組的編輯，優選將所述sgRNA與Cas9編碼核苷酸（如mRNA）共同導入所述造血幹細胞，優選透過電轉條件為200-600V，0.5ms-2ms的電轉方法來將所述sgRNA與Cas9編碼核苷酸共同導入所述造血幹細胞。在一些實施方案中，該sgRNA是經過2’-O-甲基類似物和/或核苷酸間3’硫代修飾的，比如，化學修飾為所述sgRNA的5’端前一個、二個和/或三個鹼基和/或3’端的最後一個鹼基的2’-O-甲基類似物修飾。在一些實施方案中，本發明還關於一種造血幹細胞，該造血幹細胞中染色體2上第60495252位至第60495271位，尤其是第60495268位的BCL11A基因組靶序列中的一個或多個位點透過基因編輯技術被破壞。進一步，關於透過體外分化培養該造血幹細胞後得到的紅細胞，以及包含該紅細胞的醫用製品。

在一些實施例中，發明人設計了23條靶向BCL11A增強子的sg RNA。下表列出了該23條sg RNA所靶向的人染色體2上的基因組序列位置，以及每條sgRNA引發的Cas9切割位點。

分析上述23條sgRNA的切割位點發現，這些sgRNA所引發的Cas9切割位置集中在BCL11A基因第60495219位至第60495336位元基因組區域。並且靶向從CTTCCT序列上游0-15個核苷酸至CTTCCT序列下游0-15個核苷酸區域，　例如ＣＴＴＣＣＴ位元點的ｓｇＲＮＡ產生Indels的效率最佳和／或其脫靶效應較小，即可以高效地進行基因編輯。

進一步，在本發明中，發明人設計的sgRNA均能有效產生Indels，本發明優選的sgRNA選自SEQ ID NO s: 3、4 、8和33-63中任一個。

本發明的一個具體的實施方式更包括sgRNA的組合物，其包括本發明關於的上述任一sgRNA或其載體。

一般而言，sgRNA中的指導序列是與靶多核苷酸序列具有足夠的互補性以與靶序列雜交並指導CRISPR複合物與靶序列的序列特異性結合的任何多核苷酸序列。在一些實施方案中，當使用適當的比對演算法最佳比對時，指導序列及其相應靶序列間的互補程度為約或大於約80%、85%、90%、95%、97.5%、99%或更多。最佳比對可使用用於比對序列的任何適當的演算法確定，其非限制性實例包括Smith-Waterman演算法、Needleman-Wimsch演算法、基於Burrows-Wheeler Transform的演算法(例如Burrows Wheeler Aligner)、ClustalW、Clustai X、BLAT、Novoalign (Novocraft Technologies, ELAND ((Illumina, San Diego, CA)、SOAP (可在soap.genomics.org.cn獲得)和Maq (可在maq.sourceforge.net獲得)。在一些實施方案中，指導序列長度可以為約或大於約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或更多個核苷酸。在一些實施方案中，指導序列長度少於約75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、12或更少的核苷酸。指導序列指導CR1SPR複合物與靶序列的序列特異性結合的能力可透過任何適當的測定方法評估。例如，可向具有相應靶序列的宿主細胞提供足以形成CRISPR複合物的CRISPR系統的元件(包括待測試的指導序列)，如可透過使用編碼CRISPR序列元件的載體轉染，隨後評估靶序列內的優先切割(如透過如本文所述的Surveyor測定)來進行。同樣地，靶多核苷酸序列的切割可在測試管中透過提供靶序列、CRISPR複合物(包含待測試的指導序列和不同於指導序列的對照指導序列)的元件，並比較測試和對照指導序列在靶序列的結合或切割率，以此進行評估。也可以使用所屬技術領域中具有通常知識者知道的其它測定方法進行上述測定和評估。

在本發明中，進行基因編輯過程中所使用的sgRNA優選是經過化學修飾的。“化學修飾的sgRNA”指標對sgRNA進行特殊的化學修飾，例如在其5’和3’末端3個鹼基處的2’-O-甲基類似物修飾和/或核苷酸間的3’硫代修飾。

本發明人採用的經過化學修飾的sgRNA認為具有以下兩個優點。第一、由於sgRNA是單鏈形式的RNA，其半衰期非常短，進入到細胞後，會迅速降解(最長不超過12小時)，而Cas9 蛋白結合sgRNA發揮基因編輯作用則至少需要48hrs。因此，採用經過化學修飾的sgRNA，進入細胞後，穩定表達，與Cas9蛋白結合後，能高效基因編輯基因組，產生Indels。第二、未經修飾的sgRNA穿透細胞膜能力差，無法有效進入細胞或組織發揮相應功能。而經過了化學修飾的sgRNA穿透細胞膜的能力通常是增強的。在本發明中可以採用本領域中常用的化學修飾方法，只要能夠提高sgRNA穩定性(延長半衰期)和提升進入細胞膜能力，均可以使用。除了實施例中使用的具體的化學修飾之外，更包括採用其它的修飾方法，例如， Deleavey GF1, Damha MJ. Designing chemically modified oligonucleotides for targeted gene silencing. Chem Biol. 2012 Aug 24;19(8):937-54，以及Hendel et al. Chemically modified guide RNAs enhance CRISPR-Cas genome editing in human primary cells. Nat Biotechnol. 2015 Sep;33(9):985-989文獻中報導的化學修飾方法。

在一些實施方案中，所述sgRNA和/或Cas9編碼核苷酸（如mRNA）透過電轉導入造血幹細胞，例如，透過250-360V，0.5-1ms；250-300V，0.5-1ms; 250V 1ms; 250V 2ms; 300V 0.5ms; 300V 1ms; 360V 0.5ms; 或360V1ms的電轉條件導入造血幹細胞。在一些實施方案中，所述sgRNA和Cas9編碼核苷酸透過電轉方式共同導入造血幹細胞。在一些實施方案中，所述sgRNA透過電轉方式導入表達Cas9的造血幹細胞。

在一些實施方案中，所述Cas9編碼核苷酸為mRNA，如含有ARCA帽的mRNA。在一些實施方案中，所述Cas9編碼核苷酸在病毒載體中，如慢病毒載體。在一些實施方案中，所述Cas9編碼核苷酸包含如SEQ ID NO：26所述的序列。在一些實施方案中，所述sgRNA與Cas9編碼核苷酸在同一載體中。

本發明關於利用本發明關於的基因改造方法獲得的造血幹細胞，以及透過分化培養經所述基因改造得到的造血幹細胞獲得的、處於成熟紅細胞之前的不同分化階段的前體細胞，以及分化培養經所述基因改造得到的造血幹細胞獲得的成熟紅細胞。

本發明關於包含透過本發明的方法獲得的藥物組合物，其包括利用本發明關於的基因改造方法獲得的造血幹細胞，或者透過分化培養經所述基因改造得到的造血幹細胞獲得的、處於成熟紅細胞之前的不同分化階段的前體細胞，或者分化培養經所述基因改造得到的造血幹細胞獲得的成熟紅細胞。

本發明關於的藥物組合物可以透過給藥包含細胞成分的醫藥製品常規使用的途徑，例如靜脈輸注途徑，給藥有此需要的受試者。給藥劑量可以基於受試者的病情和一般健康狀況具體確定。

在一些方面，本發明提供向造血幹細胞遞送包含本發明所述sgRNA和/或Cas9編碼核苷酸的方法。在一些實施方案中，所述遞送可使用常規的病毒和不基於病毒的基因轉移方法將所述構建體引入造血幹細胞或其它宿主細胞。非病毒遞送系統包括DNA質粒、RNA (例如本文所述的載體轉錄物)、裸核酸和脂質體。病毒載體遞送系統包括DNA和RNA病毒，其具有用於遞送至細胞的游離或整合的基因組。在一些實施方案中，發明人利用電轉方法將Cas9和sgRNA的編碼基因導入造血幹細胞中對造血幹細胞BCL11A基因組區域的具體序列進行基因編輯。經過反復實驗，發明人發現在200-600v，0.5ms-2ms的電轉條件下將Cas9的編碼核苷酸和sgRNA共同導入造血幹細胞的基因編輯效率顯著高於其它電轉條件下的基因編輯效率。

在一些實施方案中，經過化學修飾的sgRNA與Cas9 編碼基因共同電轉進入CD34+的造血幹細胞，產生高效的基因編輯效率(以Indels%表示)。實施例中的資料顯示，如果和Cas9 mRNA一起電轉的是未經化學修飾的sgRNA，其Indels效率只有2.7%，遠遠低於電轉經化學修飾的sgRNA時獲得的Indels效率(效率至少為10%以上)。

如本申請使用的，“Indel”全稱為插入/缺失, 即插入和缺失突變。

如本文使用，“造血幹細胞（hematopoietic stem and progenitor cells, HSPCs）”是發生各種血細胞的最原始的造血細胞。其主要特點是具有旺盛的增殖潛力、多向分化的能力和自我更新能力，因此，它不僅能分化、補充各種血細胞，還能透過自我更新保持幹細胞的特性和數量。造血幹細胞的分化程度和增殖能力不一，有異質性。多能造血幹細胞最原始，先分化為定向多能造血幹細胞，例如能生成粒系、紅系、單核系和巨核-血小板系的髓系造血幹細胞及能發生B淋巴細胞和T淋巴細胞的淋巴幹細胞。這兩類幹細胞既保持著造血幹細胞基本特點，又略有分化，分別負責“骨髓成分”和淋巴細胞的發生，故稱定向多能造血幹細胞。它們進一步分化成為造血祖細胞，此細胞雖然也是原始的血細胞，但是它已喪失造血幹細胞的許多基本特點，如已失去多向性分化能力，只能朝向一系或密切相關的二系細胞分化；失去了反復自我更新能力，而要依靠造血幹細胞的增殖分化來補充數量；增殖潛力有限，只能分裂數次。根據造血祖細胞所能分化生成的血細胞系多少，又分為單能造血祖細胞(只分化為一個血細胞系)和寡能造血祖細胞(可分化為2～3個血細胞系)。本發明“造血幹細胞”術語涵蓋多能造血幹細胞、定向多能造血幹細胞和造血祖細胞，是具有不同異質性的造血幹細胞的總稱。

在本發明的具體的實施方式中，本發明使用的待進行基因編輯的造血幹細胞(HSPCs)可來源於骨髓、臍帶血或外周血單個核細胞（Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)。

如本申請使用的，“ CRISPR RGEN” 是由韓國科學家Jin-Soo Kim的科研團隊開發的專門用於設計sgRNA的網站名稱，其網址為www.rgenome.net/about/。

如本文使用，“TIDE”指專門用於分析Indels效率的工具性網站名稱，其網址為tide-calculator.nki.nl。

如本文使用，“CD34、CD45RA、CD3、CD4、CD8、CD33、CD19、CD56、CD71、CD235a”是血液系統細胞的膜蛋白標誌物。

如本文使用，“BCL11A” 是一種轉錄因數，首先在小鼠中發現，作為逆轉錄病毒的結合位元點，被命名為Evi9, 後來在人類基因組中也發現這一基因，定位於2號染色體短臂2p13位點，主要在B淋巴細胞的生髮中心表達。

如本文使用，“HBB/ HBG”是血紅蛋白的不同亞型。血紅蛋白是高等生物體內負責運載氧氣的一種蛋白質。血紅蛋白由四條鏈組成，兩條α鏈和兩條β鏈，每一條鏈有一個包含一個鐵原子的環狀血紅素。氧結合在鐵原子上，由紅細胞運輸，供機體利用。

進一步，本發明還關於一種造血幹細胞，其是利用上述本發明的方法，透過CRISPR/Cas9編輯技術基因編輯造血幹細胞BCL11A的具體序列之後得到的造血幹細胞。此外，包含該造血幹細胞的製品也在本發明的範圍之內。

本發明關於的造血幹細胞或製品可以用於治療選自貧血性疾病、失血性疾病、腫瘤或其它需要大量輸血進行治療的疾病。尤其是可以用於治療β-地中海貧血或鐮刀型紅細胞貧血。

進一步，本發明關於一種紅細胞，其是透過下述體外分化培養透過本發明獲得的經過基因編輯的造血幹細胞而獲得的。

進一步，本發明關於從造血幹細胞到成熟紅細胞之間各個分化階段的前體細胞，其是透過下述造血幹細胞紅系擴增和分化步驟處理本發明獲得的經過基因編輯的造血幹細胞而獲得的。

其中，上述體外分化培養包括：造血幹細胞紅系擴增和分化步驟；以及造血幹細胞紅系分化脫核步驟。

所述紅系擴增和分化步驟使用造血幹細胞紅系擴增和分化培養基對造血幹細胞進行培養。

所述紅系分化脫核步驟使用紅系分化脫核培養基。

在一些實施方案中，所述造血幹細胞紅系擴增和分化培養基包含：基礎培養基，以及生長因數的組合物，其中，所述生長因數的組合物包括：幹細胞生長因數，即SCF；白介素3，即IL-3；以及促紅細胞生成素，即EPO。

在一些實施方案中，所述紅系分化脫核培養基包含基礎培養基、生長因數、以及孕酮受體和糖皮質激素受體的拮抗劑和/或抑制劑。

利用上述方法培養經基因編輯之後的造血幹細胞，該造血幹細胞可以透過兩步向成熟的紅細胞的分化，相比較現有技術，利用本發明的體外分化培養，只需14天，時間更短，相比于現有技術中必須要21天以上，該週期被大幅縮短。

在一些實施方案中，所述生長因數包括促紅細胞生成素，即EPO，所述孕酮受體和糖皮質激素受體的拮抗劑和/或抑制劑為選自下述化合物(I)~(IV)中的任一種或兩種及以上：
(I)
(II)
(III)
(IV)。

在一些實施方案中，所述造血幹細胞紅系擴增和分化培養基包含基礎培養基，所述基礎培養例如STEMSPAN™ SFEM II (STEM CELLS TECHNOLOGY Inc.), IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), X-VIVO 15, alpha-MEM, RPMI 1640和DF12等。所述生長因數，例如基礎培養基若選用STEMSPAN™ SFEM II，則需要額外添加的生長因數包括50-200 ng/ml SCF, 10-100 ng/ml IL-3, 1-10U/ml EPO，其中U的單位定義為：在特定的條件下，1 min能轉化1μmol底物的蛋白量，即1 IU=1μmol/min。目前國內外大多數臨床實驗室常省略國際二字，即將IU簡寫為U。EPO，促紅細胞生成素，主要是由腎臟為了回應低氧或者貧血而分泌的糖蛋白，在本實施例中，能促進造血幹細胞向分化。通常發揮作用時間是7天左右。

基礎培養基若選用STEMSPAN™ SFEM II外其它的基礎培養基，則需要添加有100X ITS(insuin-transferrin-selenium)(其中培養基中ITS中各物質的終濃度是：胰島素濃度是0.1 mg/ml、人轉鐵蛋白是0.0055mg/ml、硒元素6.7*10-6 mg/ml)(即主要包括胰島素、人轉鐵蛋白以及硒元素), 10-50 μg/ml 維生素C, 0.5-5% BSA(Bovine serum albuin，牛血清白蛋白)，生長因數，例如50-200 ng/ml SCF, 10-100 ng/ml IL-3, 1-10U/ml EPO。

此外，所屬技術領域中具有通常知識者可以理解，任何常用的基礎培養基均可以使用。例如可以列舉本領域中常用的基礎培養基，例如STEMSPAN™ SFEM II (購自STEM CELL TECHONOLOGIES)；例如購自Thermo Fisher的IMDM、DF12、Knockout DMEM、RPMI 1640、Alpha MEM、DMEM等。

此外，可以根據需要進一步在上述培養基中外加一些其他成分，例如可以外加ITS(即主要包括胰島素、人轉鐵蛋白以及硒元素)、L-穀氨醯胺、維生素C以及牛血清白蛋白。例如可以在IMDM培養基中外加ITS、外加2mM L-穀氨醯胺、外加10-50 µg/ml 維生素C以及0.5-5品質%的BSA(牛血清白蛋白)。此外，上述DF12可以外加同樣濃度的ITS，L-穀氨醯胺，維生素C和牛血清白蛋白。Knockout DMEM可以外加同樣濃度的ITS，L-穀氨醯胺，維生素C和牛血清白蛋白，RPMI 1640可以外加同樣濃度的ITS，L-穀氨醯胺，維生素C和牛血清白蛋白，Alpha MEM可以外加同樣濃度的ITS，L-穀氨醯胺，維生素C和牛血清白蛋白，DMEM也可以外加同樣濃度的ITS，L-穀氨醯胺，維生素C和牛血清白蛋白。在此，各種基礎培養基中外加的ITS的濃度可以是：胰島素濃度是0.1 mg/ml、人轉鐵蛋白是0.0055mg/ml、硒元素6.7×10-6 mg/ml。此外，外加的ITS各成分的濃度也可以根據實際需要來調整。ITS可以從Thermofisher購買，並根據需要調節成合適的最終使用濃度。

在一個實施方案中，所述紅系分化脫核培養基包含基礎培養基、生長因數和孕酮受體和糖皮質激素受體的拮抗劑。

在一個實施方案中，所述造血幹細胞紅系分化脫核培養基包含基礎培養基，例如STEMSPAN™ SFEM II (STEM CELLS TECHNOLOGY Inc.), IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), X-VIVO 15, alpha-MEM, RPMI 1640和DF12等。還包含生長因數，例如基礎培養基若選用STEMSPAN™ SFEM II，則需要額外添加的生長因數包括1-10U/ml EPO, 100-1000 μg/ml human transferrin(人轉鐵蛋白)，化學小分子為0.5-10 μmol//ml mifepristone。

基礎培養基若選用STEMSPAN™ SFEM II外其它的基礎培養基，則需要添加例如ITS(insuin-transferrin-selenium)(其中培養基中ITS中各物質的終濃度是：胰島素濃度是0.1 mg/ml、人轉鐵蛋白是0.0055mg/ml、硒元素6.7×10-6 mg/ml)(即主要包括胰島素、人轉鐵蛋白以及硒元素), 10-50 ug/ml 維生素C, 0.5-5% BSA(Bovine serum albuin,牛血清白蛋白)，生長因數，例如1-10U/ml EPO，100-1000ug/ml人轉鐵蛋白，化學小分子例如0.5-10μmol//ml mifepristone。

此外，所屬技術領域中具有通常知識者可以理解，任何常用的基礎培養基均可以使用。例如可以列舉本領域中常用的基礎培養基，例如STEMSPAN™ SFEM II (購自STEM CELL TECHONOLOGIES)；例如購自Thermo Fisher的IMDM、DF12、Knockout DMEM、RPMI 1640、Alpha MEM、DMEM等。

此外，可以根據需要進一步在上述培養基中外加一些其他成分，例如可以外加ITS(即主要包括胰島素、人轉鐵蛋白以及硒元素)、L-穀氨醯胺、維生素C以及牛血清白蛋白。例如可以在IMDM培養基中外加ITS、外加2mM L-穀氨醯胺、外加10-50 µg/ml 維生素C以及0.5-5品質%的BSA(牛血清白蛋白)。此外，上述DF12可以外加同樣濃度的ITS，L-穀氨醯胺，維生素C和牛血清白蛋白。Knockout DMEM可以外加同樣濃度的ITS，L-穀氨醯胺，維生素C和牛血清白蛋白，RPMI 1640可以外加同樣濃度的ITS，L-穀氨醯胺，維生素C和牛血清白蛋白，Alpha MEM可以外加同樣濃度的ITS，L-穀氨醯胺，維生素C和牛血清白蛋白，DMEM也可以外加同樣濃度的ITS，L-穀氨醯胺，維生素C和牛血清白蛋白。在此，各種基礎培養基中外加的ITS的濃度可以是：胰島素濃度是0.1 mg/ml、人轉鐵蛋白是0.0055mg/ml、硒元素6.7×10-6 mg/ml。此外，外加的ITS各成分的濃度也可以根據實際需要來調整。ITS可以從Thermofisher購買，並根據需要調節成合適的最終使用濃度。

本文中使用的mifepristone是一種化學合成的小分子，該小分子是孕酮受體和糖皮質激素受體的拮抗劑，結構式如下：
(I)
Mifepristone 化學結構圖

其它孕酮受體和糖皮質激素受體的拮抗劑和抑制劑也可應用到本發明中，包括Cyproterone Acetate，Geldanamycin，CORT 108297等。化學結構式如下：
(II)(III)
Cyproterone Acetate化學結構式 Geldanamycin 化學結構式
(IV)
CORT 108297化學結構式

在一些實施方案中，本發明的成熟紅細胞可透過包括下列a)-c)步驟的方法產生：a)使用本發明所述的任一方法對從人臍帶血中分離CD34陽性的HSPCs進行基因改造；b)將基因改造後的HSPCs經過5-10天，例如5天、6天、7天、8天、9天、10天，擴增和分化後獲得紅細胞前體細胞，例如成紅細胞（erythroblast）、有核紅細胞、幼紅細胞和網織紅細胞，c)將紅細胞前體細胞再經過7天的分化處理獲得成熟的紅細胞。

在一些實施方案中，本發明的成熟紅細胞成熟的紅細胞可透過包括下列步驟a)- d)的方法產生：

a)從人臍帶血中透過磁珠分選的方法分離CD34陽性的HSPCs；

b) 使用本發明所述的任一方法對所述的CD34陽性的HSPCs進行基因改造；

c)在無血清培養基（Serum-free medium (SFME)）中，添加額外的生長因數，經過5-10天，例如5天、6天、7天、8天、9天、10天擴增和分化後，將HSPCs分化成為紅細胞前體細胞，該階段的培養基命名為造血幹細胞紅系擴增和分化培養基（HSPCs erythroid expansion and differentiatin medium；縮寫為 HEEDM）；

d) 在無血清培養基（Serum-free medium (SFME)）中，添加額外的生長因數，經過7天分化後，即可獲得成熟的紅細胞，該階段的培養基命名為：造血幹細胞紅系分化脫核培養基（HSPCs erythroid differentiation enucleation medium, 縮寫為HEDEM）。

即針對經過編輯的CD34陽性的造血幹細胞，利用上述本發明的方法可以透過兩步就可以獲得成熟的紅細胞，整個過程的時間可以為10-18天、11-17天、12-16天、13-15天、10-17天、10-16天、10-15天或10-14天，這個時間將現有技術中利用三步或者四步的方法中的至少21天的週期大大縮短。

如上所述，本發明關於一種製造透過基因改造使胎兒血紅蛋白(HbF)表達升高的成熟紅細胞或其前體細胞的方法，該方法包括：(a)使用本發明的所關於的基因改造方法得到造血幹細胞；(b)使用上述造血幹細胞紅系擴增和分化培養基對基因改造過的造血幹細胞進行造血幹細胞紅系擴增和分化。

進一步，本發明關於一種製造透過基因改造使胎兒血紅蛋白(HbF)表達升高的成熟紅細胞或其前體細胞的方法，該方法包括：(a)使用本發明的所關於的基因改造方法得到造血幹細胞；(b)使用上述造血幹細胞紅系擴增和分化培養基對基因改造過的造血幹細胞進行造血幹細胞紅系擴增和分化；以及(c)使用紅系分化脫核培養基進行造血幹細胞紅系分化脫核。本發明還關於上述方法中使用的造血幹細胞紅系擴增和分化培養基和/或紅系分化脫核培養基在擴增和/或分化造血幹細胞或成熟紅細胞的前體細胞中的用途。

如本申請使用的，“分化”指其中細胞的結構或功能在分裂、增殖和其生長過程中特化的現象，即，生物體細胞或組織的特徵和功能改變以實施給予細胞或組織的功能。一般而言，其指其中相對簡單的系統分為兩種或多種性質不同的部分系統的現象。

如本申請使用的，“Ficoll液密度梯度離心法”，其基本原理是血液中的不同成分的比重存在差異，在低速密度梯度離心時，可將不同的細胞層粉離開。紅細胞和粒細胞密度大於分層液體，並且因紅細胞遇到ficoll液之後會迅速凝集成串錢狀而積于管底。唯有於分層液體密度相當的單個核細胞富集在血漿層和分層液之間，即白膜層，造血幹細胞即存在於此層，透過後續磁珠分選即可獲得。在本發明中，單個核細胞是利用商售的淋巴細胞分離管獲得。

如本申請使用的，“成熟紅細胞”是指血液中含量最多的一類細胞，具有攜帶氧氣、胺基酸、二氧化碳等營養物質的功能。成熟的紅細胞沒有線粒體和細胞核。

如本申請使用的，“白介素3, IL-3”是指由啟動的CD4和CD8陽性的T淋巴細胞產生的一種細胞因數，其主要生物學功能是參與調控骨髓中造血幹細胞的增殖和分化。

如本申請使用的，“促紅細胞生成素，Erythropoietin，EPO”是指erythroblasts即紅細胞前體細胞分泌產生的一種生長因數。在成體中，是有腎皮質腎小管周圍間質細胞和肝臟分泌產生的糖蛋白。EPO能刺激造血幹細胞分化形成成紅細胞。

在一些實施方案中，幹細胞因數，stem cell factor (SCF)包括肥大細胞生長因數（MGF），Kit配體（KL）及Steel因數（SLF）。

如本申請使用的，“ 造血幹細胞紅系擴增和分化培養基”是指幫助HSPCs的細胞大量擴增和向紅系祖細胞分化的配演體系。本發明中該培養基包含兩種主要成分，分別是基礎培養基和生長因數添加劑。基礎培養基是無血清體系，可以是STEMSPAN™ SFEM II (STEM CELLS TECHNOLOGY Inc.), 也可以是IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium)，外加ITS (Thermofisher)和L-gulutamin(Thermofisher)和維生素C和牛血清白蛋白。生長因數添加劑為IL-3, SCF, EPO的不同濃度的組合。

如本申請使用的，“造血幹細胞紅系分化脫核培養基”是指幫助紅系祖細胞進一步擴增分化成為脫核的紅細胞培養基。本發明中該培養基包含兩種主要成分，分別是基礎培養基和生長因數及化學小分子添加劑。基礎培養基是無血清體系，可以是STEMSPAN™ SFEM II (STEM CELLS TECHNOLOGY Inc.), 也可以是IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium)，外加ITS (Thermofisher)和L-gulutamin(Thermofisher)和維生素C和牛血清白蛋白。生長因數及化學小分子添加劑包括EPO和人轉鐵蛋白，以及化學小分子mifepristone。

在一些實施方案中，造血幹細胞透過磁珠分選， 例如把細胞用超級順磁性的 MACS MicroBeads （MACS微型磁珠）特異性地標記，磁性標記完後，把這些細胞透過一個放在強而穩定磁場中的分選柱。分選柱裡的基質造成一個高梯度磁場。

被磁性標記的細胞滯留在柱裡而未被標記的細胞則流出。當分選柱移出磁場後，滯留柱內的磁性標記細胞就可以被洗脫出來，這樣就完全可以獲得標記和未標記的兩個細胞組份。

在本發明的一些具體的實施方式中，利用本發明的所述的sgRNA，透過本發明描述的基因改造方法，對3個不同的臍帶血來源的造血幹細胞進行改造，可以實現高效基因編輯，效率達到至少40%以上，例如50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、或90%以上。例如，甚至於針對於優選的sgRNA，平均基因編輯效率達到80%。

在本發明的一些具體實施方式中，向小鼠移植了經本發明基因編輯方法得到的造血幹細胞，與移植了未經過基因編輯的造血幹細胞相比，在移植了經基因編輯的造血幹細胞之後，小鼠人源的hCD45表達比例持續增高，在外周血樣品中，由第6周的20%提高到16周的60%，16周的骨髓中比例甚至達到90%，脾臟達到70%, 表明經過基因編輯的造血幹細胞能夠快速、高效地植入小鼠模型的造血系統，細胞體內分化功能正常。

在本發明的一些具體實施方式中，利用本發明的基因編輯方法對臍帶血來源的造血幹細胞進行改造，然後利用本發明的“兩步法”分化方法進行分化，即利用造血幹細胞紅系擴增和分化培養基進行擴增和分化，然後利用造血幹細胞紅系分化脫核培養基進行進一步分化。透過檢測顯示，分化後的紅細胞其血紅蛋白（hemoglobin，HBG）表達相比於原始的紅細胞的HBG表達提高了20%-90%、甚至於提高了100%，即提高約1倍(為原始的2倍)，胎兒血紅蛋白表達相比於原始的紅細胞的胎兒血紅蛋白的表達也提高了20%-90%、甚至於高達100%，即提高約1倍(為原始的2倍)，甚至於高達200%，即提高約2倍(為原始的3倍)，甚至於高達300%，即提高約3倍(為原始的4倍)，甚至於高達400%，即提高約4倍(為原始的5倍)，甚至於高達500%以上，即提高約5倍以上(為原始的6倍以上)等。

實施例

此後，本發明將參照實施例進一步說明。對所屬技術領域中具有通常知識者顯而易見的是這些實施例僅出於說明目的而不應理解為對本發明保護範圍的限制。因此，本發明的實質性保護範圍將透過所附申請專利範圍和其等同物限定。

實施例 1 ：高效基因編輯臍帶血來源的 CD34 陽性的造血幹細胞

1-1: 利用K562細胞測試電轉條件

由於造血幹細胞來源少且單次分離成本高，因此在本實施例中選擇癌症細胞系K562(購買自ATCC公司，網址：https://www.atcc.org)作為測試電轉條件的模型細胞系。

具體地，以下為具體實施步驟。

第一批實驗：電轉5×105個K562細胞，GFP mRNA(序列如SEQ ID No. 1所示)的量為5μg, 選用BTX830電轉儀器，分別測試在250V 1ms, 360V 1ms, 400V 1ms, 500V 1ms的條件下，4天後流式分析實驗檢測GFP表達和7-AAD表達，GFP表示電轉效率，7-AAD表示電轉後細胞的生長狀態即活力(viability)。

SEQ ID No.1：GFP mRNA的序列資訊：
atgagtaaaggagaagaacttttcactggagttgtcccaattcttgttgaattagatggtgatgttaatgggcacaaattttctgtcagtggagagggtgaaggtgatgcaacatacggaaaacttacccttaaatttatttgcactactggaaaactacctgttccatggccaacacttgtcactactttctcttatggtgttcaatgcttttcaagatacccagatcatatgaaacggcatgactttttcaagagtgccatgcccgaaggttatgtacaggaaagaactatatttttcaaagatgacgggaactacaagacacgtgctgaagtcaagtttgaaggtgatacccttgttaatagaatcgagttaaaaggtattgattttaaagaagatggaaacattcttggacacaaattggaatacaactataactcacacaatgtatacatcatggcagacaaacaaaagaatggaatcaaagttaacttcaaaattagacacaacattgaagatggaagcgttcaactagcagaccattatcaacaaaatactccaattggcgatggccctgtccttttaccagacaaccattacctgtccacacaatctgccctttcgaaagatcccaacgaaaagagagaccacatggtccttcttgagtttgtaacagctgctgggattacacatggcatggatgaactatacaaatag。

第二批實驗：電轉5×105 K562細胞，上述GFP mRNA的量為5μg, 選用BTX830電轉儀器，測試分別在250V 1ms, 250V 2ms, 300V 0.5ms, 300V 1ms，360V 0.5ms, 360V1ms條件下，4天後流式分析實驗檢測GFP表達和7-AAD表達，GFP表示電轉效率，7-AAD表示電轉後細胞的生長狀態即活力(viability)。

第三批實驗：電轉5×105 K562細胞，上述GFP mRNA的量為5μg, 選用BTX830電轉儀器，測試分別在250V 1ms, 250V 1ms, 300V 1ms, 300V 1ms條件下，4天後流式分析實驗檢測GFP表達和7-AAD表達，GFP表示電轉效率，7-AAD表示電轉後細胞的生長狀態即活力(viability)。結果如圖2和3所示。

其中，圖2顯示在癌症細胞系K562上進行多批次實驗檢測的最佳電轉條件下，在電轉GFP 4天後的螢光顯微鏡拍照圖。“V”指脈衝電壓，“ms”指脈衝時間。

圖3在癌症細胞系K562上進行多批次實驗檢測的最佳電轉條件下，在電轉GFP 4天後，流式分析7-AAD和GFP表達統計分析圖，流式分析中的7-AAD陰性代表細胞活率，7-AAD(7-胺基-放線菌素D)是一種核酸染料，它不能通過正常質膜，隨著細胞凋亡、細胞死亡過程，質膜對7-AAD的通透性逐漸增加，在合適波長激發光的激發下可發出明亮的紅色螢光，7-AAD陰性為正常活力細胞；GFP效率表示電轉效率。其中，以“250-1”為例，其表示250V電壓，1ms 脈衝時間。

本實驗的資料表明針對癌症細胞系K562，在“300V 1ms”的電轉條件下，電轉效率和細胞活率的綜合指標最高，在以後的實驗中將作為後續實驗的電轉條件。

1-2. 利用300v 1ms電轉GFP mRNA進入造血幹細胞

選取上一步驟中效率和活率最高的條件300V 1ms，向5×105造血幹細胞(購買自澳賽爾斯生物技術(上海)有限公司, www.allcells.c)電轉上述GFP mRNA，4天後檢測GFP和CD34的表達情況。結果如圖4、5所示。

其中，圖4為在300V, 1ms電轉條件下，電轉上述GFP mRNA 進入造血幹細胞4天後的螢光顯微鏡拍照圖，分別包括明場、綠色通道、紅色通道和明場綠色通道疊加四個視野。

圖5為在300V, 1ms電轉條件下，電轉GFP mRNA 進入造血幹細胞4天後流式分析GPF和CD34蛋白表達情況。其中圖5中的對照組是造血幹細胞，但是沒有轉入GFP mRNA, 且流式分析不染CD34抗體的情況。

根據圖4和5的結果可以看出，本實驗的資料顯示利用“300V 1ms”的電轉條件，在臍帶血來源的造血幹細胞上GFP的表達比例高。

1-3: 利用CRISPR/Cas9電轉臍帶血來源的造血幹細胞來編輯BCL11A 位點

A、針對BCL11A的增強子 58K位元點(該目標58K位元點的序列如SEQ ID NO: 2所示)，利用“CRISPR RGEN TOOLS”軟體設計針對BCL11A(+58)位點的多條sgRNA並合成經過化學修飾的sgRNA，資訊如圖6、7、8所示。

SEQ ID NO: 2：CL11A enhancer 58K位點150bp序列：
ctgccagtcctcttctaccccacccacgcccccaccctaatcagaggccaaacccttcctggagcctgtgataaaagcaactgttagcttgcactagactagcttcaaagttgtattgaccctggtgtgttatgtctaagagtagatgcc

SEQ ID NO: 3：名稱為BCL11A的增強子-1的sgRNA(有時也簡稱為enhancer-1)：
cacaggctccaggaagggtt

SEQ ID NO: 4：名稱為BCL11A的增強子-2的sgRNA(有時也簡稱為enhancer-2)：
atcagaggccaaacccttcc

SEQ ID NO: 5：名稱為BCL11A的增強子-3的sgRNA(有時也簡稱為enhancer-3)：
ctaacagttgcttttatcac

SEQ ID NO: 6：名稱為BCL11A的增強子-4的sgRNA(有時也簡稱為enhancer-4)：
ttgcttttatcacaggctcc

SEQ ID NO: 7：名稱為BCL11A的增強子-5的sgRNA(有時也簡稱為enhancer-5)：
ttttatcacaggctccagga

SEQ ID NO: 8：名稱為BCL11A的增強子-6的sgRNA(有時也簡稱為enhancer-6)：
tttatcacaggctccaggaa

SEQ ID NO: 9：名稱為BCL11A的增強子-7的sgRNA(有時也簡稱為enhancer-7)：
tgggtggggtagaagaggac

SEQ ID NO: 10：名稱為BCL11A的增強子-8的sgRNA(有時也簡稱為enhancer-8)：
gggcgtgggtggggtagaag

SEQ ID NO: 11：名稱為BCL11A的增強子-9的sgRNA(有時也簡稱為enhancer-9)：
ttagggtgggggcgtgggtg

SEQ ID NO: 12：名稱為BCL11A的增強子-10的sgRNA(有時也簡稱為enhancer-10)：
attagggtgggggcgtgggt

SEQ ID NO: 13：名稱為BCL11A的增強子-11的sgRNA(有時也簡稱為enhancer-11)：
gattagggtgggggcgtggg

SEQ ID NO: 14：名稱為BCL11A的增強子-12的sgRNA(有時也簡稱為enhancer-12)：
tctgattagggtgggggcgt

SEQ ID NO: 15：名稱為BCL11A的增強子-13的sgRNA(有時也簡稱為enhancer-13)：
ctctgattagggtgggggcg

SEQ ID NO: 16：名稱為BCL11A的增強子-14的sgRNA(有時也簡稱為enhancer-14)：
cacgcccccaccctaatcag

SEQ ID NO: 17：名稱為BCL11A的增強子-15的sgRNA(有時也簡稱為enhancer-15)：
ttggcctctgattagggtgg

SEQ ID NO: 18：名稱為BCL11A的增強子-16的sgRNA(有時也簡稱為enhancer-16)：
tttggcctctgattagggtg

SEQ ID NO: 19：名稱為BCL11A的增強子-17的sgRNA(有時也簡稱為enhancer-17)：
gtttggcctctgattagggt

SEQ ID NO: 20：名稱為BCL11A的增強子-18的sgRNA(有時也簡稱為enhancer-18)：
ggtttggcctctgattaggg

SEQ ID NO: 21：名稱為BCL11A的增強子-19的sgRNA(有時也簡稱為enhancer-19)：
aagggtttggcctctgatta

SEQ ID NO: 22：名稱為BCL11A的增強子-20的sgRNA(有時也簡稱為enhancer-20)：
gaagggtttggcctctgatt

SEQ ID NO: 23：名稱為BCL11A的增強子-21的sgRNA(有時也簡稱為enhancer-21)：
actcttagacataacacacc

SEQ ID NO: 24：名稱為BCL11A的增強子-22的sgRNA(有時也簡稱為enhancer-22)：
cttcaaagttgtattgaccc

SEQ ID NO: 25：名稱為BCL11A的增強子-23的sgRNA(有時也簡稱為enhancer-23)：
ctcttagacataacacacca

如上所述，針對BCL11A的增強子 58K位點的150bp序列設計了上述23條sgRNA。

B、選取300V 1ms的電轉條件，發明人合成了Cas9 mRNA(序列如SEQ ID No.26所示)和經過化學修飾的上述設計的23條sgRNA。其中，對於23條sgRNA的化學修飾是指對於sgRNA的5’端的前三個鹼基以及3’端的最後三個鹼基進行了2’-O-甲基類似物修飾和核苷酸間的3’硫代修飾。如下述化學式所示，左側是化學修飾後的sgRNA, 右側是未經過修飾的sgRNA。

在上述確定的電轉條件下向臍帶血來源的CD34陽性的造血幹細胞(購買自澳賽爾斯生物技術(上海)有限公司, www.allcells.com，電轉了上述23條經過化學修飾sgRNA，4天後透過TIDE分析Indels效率。結果如圖9所示。同樣，在本實施例中，作為對比，將未經化學修飾的sgRNA也透過同樣的方法電轉，但是未經化學修飾的sgRNA，其Indels效率只有2.7%，在以後的實施例中使用的均是經化學修飾的sgRNA。

圖9顯示在CD34陽性造血幹細胞上，電轉Cas9 mRNA和23條sgRNA，4天後提取該CD34陽性的造血幹細胞的基因組，選取sgRNA切割位點左右各約450bp，總長度為903bp的片段進行擴增，用於擴增的引物序列序列如下所示。

正向引物: cacctcagcagaaacaaagttatc(SEQ ID NO: 29)

反向引物：gggaagctccaaactctcaa(SEQ ID NO: 30)

切割位點選擇：以Enhancer-2為例, 5‘-ctaacagttg cttttatcac-3’,切割位點在3’端右側(Cong L, et al. Science. 2013)。

針對上述擴增片段進行Sanger測序，測序時使用的上下游引物序列如SEQ ID NO: 27和SEQ ID NO: 28所示。針對測序結果利用TIDE軟體分析產生Indels效率的統計分析。其中，TIDE軟體是線上分析Indels效率的軟體，以一代測序結果為基礎，分析Indels引起的雙峰突變的效率，可以參考tide.deskgen.com。

結果表明，在該電轉條件下，本實施例中合成的23條sgRNA均能夠成功基因編輯造血幹細胞，都可以有效地產生Indels，效率至少10%。其中效率最高的是Enhancer-2。

SEQ ID NO: 26：Cas9 mRNA序列
gacaagaagtacagcatcggcctggacatcggcaccaactctgtgggctgggccgtgatcaccgacgagtacaaggtgcccagcaagaaattcaaggtgctgggcaacaccgaccggcacagcatcaagaagaacctgatcggagccctgctgttcgacagcggcgaaacagccgaggccacccggctgaagagaaccgccagaagaagatacaccagacggaagaaccggatctgctatctgcaagagatcttcagcaacgagatggccaaggtggacgacagcttcttccacagactggaagagtccttcctggtggaagaggataagaagcacgagcggcaccccatcttcggcaacatcgtggacgaggtggcctaccacgagaagtaccccaccatctaccacctgagaaagaaactggtggacagcaccgacaaggccgacctgcggctgatctatctggccctggcccacatgatcaagttccggggccacttcctgatcgagggcgacctgaaccccgacaacagcgacgtggacaagctgttcatccagctggtgcagacctacaaccagctgttcgaggaaaaccccatcaacgccagcggcgtggacgccaaggccatcctgtctgccagactgagcaagagcagacggctggaaaatctgatcgcccagctgcccggcgagaagaagaatggcctgttcggcaacctgattgccctgagcctgggcctgacccccaacttcaagagcaacttcgacctggccgaggatgccaaactgcagctgagcaaggacacctacgacgacgacctggacaacctgctggcccagatcggcgaccagtacgccgacctgtttctggccgccaagaacctgtccgacgccatcctgctgagcgacatcctgagagtgaacaccgagatcaccaaggcccccctgagcgcctctatgatcaagagatacgacgagcaccaccaggacctgaccctgctgaaagctctcgtgcggcagcagctgcctgagaagtacaaagagattttcttcgaccagagcaagaacggctacgccggctacattgacggcggagccagccaggaagagttctacaagttcatcaagcccatcctggaaaagatggacggcaccgaggaactgctcgtgaagctgaacagagaggacctgctgcggaagcagcggaccttcgacaacggcagcatcccccaccagatccacctgggagagctgcacgccattctgcggcggcaggaagatttttacccattcctgaaggacaaccgggaaaagatcgagaagatcctgaccttccgcatcccctactacgtgggccctctggccaggggaaacagcagattcgcctggatgaccagaaagagcgaggaaaccatcaccccctggaacttcgaggaagtggtggacaagggcgcttccgcccagagcttcatcgagcggatgaccaacttcgataagaacctgcccaacgagaaggtgctgcccaagcacagcctgctgtacgagtacttcaccgtgtataacgagctgaccaaagtgaaatacgtgaccgagggaatgagaaagcccgccttcctgagcggcgagcagaaaaaggccatcgtggacctgctgttcaagaccaaccggaaagtgaccgtgaagcagctgaaagaggactacttcaagaaaatcgagtgcttcgactccgtggaaatctccggcgtggaagatcggttcaacgcctccctgggcacataccacgatctgctgaaaattatcaaggacaaggacttcctggacaatgaggaaaacgaggacattctggaagatatcgtgctgaccctgacactgtttgaggacagagagatgatcgaggaacggctgaaaacctatgcccacctgttcgacgacaaagtgatgaagcagctgaagcggcggagatacaccggctggggcaggctgagccggaagctgatcaacggcatccgggacaagcagtccggcaagacaatcctggatttcctgaagtccgacggcttcgccaacagaaacttcatgcagctgatccacgacgacagcctgacctttaaagaggacatccagaaagcccaggtgtccggccagggcgatagcctgcacgagcacattgccaatctggccggcagccccgccattaagaagggcatcctgcagacagtgaaggtggtggacgagctcgtgaaagtgatgggccggcacaagcccgagaacatcgtgatcgaaatggccagagagaaccagaccacccagaagggacagaagaacagccgcgagagaatgaagcggatcgaagagggcatcaaagagctgggcagccagatcctgaaagaacaccccgtggaaaacacccagctgcagaacgagaagctgtacctgtactacctgcagaatgggcgggatatgtacgtggaccaggaactggacatcaaccggctgtccgactacgatgtggaccatatcgtgcctcagagctttctgaaggacgactccatcgacaacaaggtgctgaccagaagcgacaagaaccggggcaagagcgacaacgtgccctccgaagaggtcgtgaagaagatgaagaactactggcggcagctgctgaacgccaagctgattacccagagaaagttcgacaatctgaccaaggccgagagaggcggcctgagcgaactggataaggccggcttcatcaagagacagctggtggaaacccggcagatcacaaagcacgtggcacagatcctggactcccggatgaacactaagtacgacgagaatgacaagctgatccgggaagtgaaagtgatcaccctgaagtccaagctggtgtccgatttccggaaggatttccagttttacaaagtgcgcgagatcaacaactaccaccacgcccacgacgcctacctgaacgccgtcgtgggaaccgccctgatcaaaaagtaccctaagctggaaagcgagttcgtgtacggcgactacaaggtgtacgacgtgcggaagatgatcgccaagagcgagcaggaaatcggcaaggctaccgccaagtacttcttctacagcaacatcatgaactttttcaagaccgagattaccctggccaacggcgagatccggaagcggcctctgatcgagacaaacggcgaaaccggggagatcgtgtgggataagggccgggattttgccaccgtgcggaaagtgctgagcatgccccaagtgaatatcgtgaaaaagaccgaggtgcagacaggcggcttcagcaaagagtctatcctgcccaagaggaacagcgataagctgatcgccagaaagaaggactgggaccctaagaagtacggcggcttcgacagccccaccgtggcctattctgtgctggtggtggccaaagtggaaaagggcaagtccaagaaactgaagagtgtgaaagagctgctggggatcaccatcatggaaagaagcagcttcgagaagaatcccatcgactttctggaagccaagggctacaaagaagtgaaaaaggacctgatcatcaagctgcctaagtactccctgttcgagctggaaaacggccggaagagaatgctggcctctgccggcgaactgcagaagggaaacgaactggccctgccctccaaatatgtgaacttcctgtacctggccagccactatgagaagctgaagggctcccccgaggataatgagcagaaacagctgtttgtggaacagcacaagcactacctggacgagatcatcgagcagatcagcgagttctccaagagagtgatcctggccgacgctaatctggacaaagtgctgtccgcctacaacaagcaccgggataagcccatcagagagcaggccgagaatatcatccacctgtttaccctgaccaatctgggagcccctgccgccttcaagtactttgacaccaccatcgaccggaagaggtacaccagcaccaaagaggtgctggacgccaccctgatccaccagagcatcaccggcctgtacgagacacggatcgacctgtctcagctgggaggcgac

SEQ ID NO: 27 測序引物
cacctcagcagaaacaaagttatc

SEQ ID NO: 28 測序引物
gggaagctccaaactctcaa

C、根據上述實驗結果，選取基因編輯效率相對高效的Enhancer-2、Enhancer-3、Enhancer-4、Enhancer-5以及Enhancer-6，在300V 1ms的電轉條件，電轉Cas9 mRNA和Enhancer-2、Enhancer-3、Enhancer-4、Enhancer-5以及Enhancer-6進入臍帶血來源的造血幹細胞4天後檢測Indels效率，結果如圖10所示。圖10顯示電轉Cas9 mRNA和BCL11A的增強子-2 sgRNA、Enhancer-3 sgRNA、Enhancer-4 sgRNA、Enhancer-5 sgRNA以及Enhancer-6 sgRNA進入3個不同臍帶血來源的CD34陽性的造血幹細胞，4天後，採用與上述相同的方法利用TIDE軟體分析產生Indels效率的統計分析。

圖10的結果表明在3個不同的臍帶血來源的造血幹細胞上，5條sgRNA均實現高效基因編輯，效率達到至少40%以上，其中效率最高的是Enhancer-2 sgRNA, 平均基因編輯效率達到80%，顯著高於Enhancer-3、Enhancer-4、Enhancer-5以及Enhancer-6，同時比現有的文獻報導的在造血幹細胞上基因編輯效率高(Xu, et al. Molecular Therapy. 2017; DeWitt, et al. Sci Transl Med. 2016)。

基於此，後續實驗以Enhancer-2 sgRNA為目的靶點開展。

實施例 2 ：基因編輯臍帶血來源的造血幹細胞的體外克隆形成

本實驗關於基因編輯臍帶血來源的造血幹細胞的克隆形成單位(CFU, colony-formation units)檢測。

選取300V 1ms的電轉條件，電轉Cas9 mRNA和Enhancer-2進入臍帶血來源的造血幹細胞, 將800-1000個細胞重懸入1ml H4434(購自加拿大STEM CELLS TECHNOLOGIES)和IMDM(購自Thermo Fisher)以及FBS(購自Thermo Fisher)的混合液中，14天後顯微鏡下觀察CFU-M、BFU-E、CFU-E、CFU-G、CFU-GM、GEMM等不同形態的克隆形成數目，結果如圖11 所示。其中，圖11 顯示電轉Cas9 mRNA和BCL11A的增強子-2 sgRNA進入臍帶血來源的CD34陽性造血幹細胞，2天後進行體外克隆形成實驗(CFU檢測)，14天後統計不同血液系統的克隆數目，BFU-E、CFU-M、CFU-GM、CFU-E、CFU-G、CFU-MM代表紅系、髓系、淋巴系等血液系統不同譜系的克隆形成。其中，Mock: 代表未經過基因編輯的細胞。

根據實施例2的資料表明，與未經過基因編輯的造血幹細胞相比，基因編輯後的細胞功能體外分化功能正常，能分化不同血液系統譜系的克隆。

實施例 3 ：基因編輯臍帶血來源的造血幹細胞重建小鼠模型的造血系統

選取300V 1ms的電轉條件，電轉Cas9 mRNA和Enhancer-2進入臍帶血來源的造血幹細胞，移植進入經過輻照儀照射的NPG免疫缺陷小鼠模型(購自北京維通達生物技術有限公司(Beijing Vitalstar Biotechnology, Inc.)。在移植6周、8周、10周、12周、16周後的外周血中檢測人CD45和小鼠CD45的表達情況，同時檢測移植16周後骨髓、脾臟的人CD45和小鼠CD45的表達情況，其結果如圖12和圖14所示。其中移植到小鼠中的方法為：在細胞移植24小時前，進行1.0Gy 射線照射，清除小鼠模型的骨髓。隨後將用20μL 0.9%的生理鹽水重懸的1.0×106的細胞注射到小鼠的尾靜脈中，隨後放入潔淨級別的動物房中飼養。

圖12和圖14的結果表明經過基因編輯的造血幹細胞，移植進入小鼠模型後，與未經過基因編輯的造血幹細胞相比，經過基因修飾的細胞隨著時間延長，人源的hCD45表達比例持續增高，在外周血樣品中，由第6周的20%提高到16周的60%，16周的骨髓中比例甚至達到90%，脾臟達到70%, 表明經過基因編輯的造血幹細胞能夠快速、高效地植入小鼠模型的造血系統，細胞體內分化功能正常。而現有的文獻報導表明，6周後外周血中CD45表達比例在1-10%之間，16周後CD45表達比例在20-40%之間，骨髓中CD45表達比例在50%左右，因此，本發明中的動物實驗結果明顯好于現有領域中報導的移植實驗結果(Xu, et al. Molecular Therapy. 2017; DeWitt, et al. Sci Transl Med. 2016; Mettananda, et al. Nature Communications. 2017)。

同時，在移植基因編輯的細胞的小鼠中，16周後檢測了人源的CD3、CD4、CD8、CD33、CD19、CD56等細胞膜蛋白的表達如圖13、14、15所示。結果表明，經過基因修飾的細胞能正常表達這些蛋白，表明可以分化為T細胞、B細胞、巨噬細胞等血液系統的細胞，能高效重建小鼠模型的造血系統。與現有文獻報導結果相比，首先我們檢測了CD3、CD4、CD8、CD33、CD19、hCD56等6個細胞膜表面蛋白判定T細胞、髓系細胞、B細胞和NK細胞等在小鼠血液中表達情況，更準確地評估移植的人造血幹細胞重建小鼠造血系統的能力，而現有文獻中僅測試了CD3、CD19、CD56、CD33等蛋白表達。其次我們檢測了外周血、骨髓和脾臟等三個重要的血液系統相關組織中以上6個蛋白的表達譜，更全面地評估了重建小鼠造血系統的能力, 而現有文獻中只以骨髓作為檢測的組織(Chang, et al. Methods & Clinical Development. 2017; DeWitt, et al. Sci Transl Med. 2016; Mettananda, et al. Nature Communications. 2017)。

此外，雖然基因編輯的細胞能夠快速、高效重建小鼠模型的造血系統。針對重建小鼠模型的細胞是否發生了基因編輯的判斷結果如圖16所示，提取移植前細胞、移植16周後外周血、骨髓和脾臟的基因組，擴增目的片段和Sanger測序，透過TIDE分析，檢測Indels效率。結果表明移植16周後的外周血、骨髓和脾臟的人源細胞均發生了基因編輯，效率與移植前細胞相似，在50~70%之間。

實施例 4 ：基因編輯臍帶血來源的造血幹細胞紅系分化檢測 γ 球蛋白和胎兒血紅蛋白表達

4-1. 紅細胞分化

選取300v 1ms的電轉條件，電轉Cas9 mRNA和Enhancer-2進入臍帶血來源的造血幹細胞，利用下述“兩步法”分化方案進行分化。

其中兩步法分化為利用造血幹細胞紅系擴增和分化培養基進行分化，然後利用造血幹細胞紅系分化脫核培養基進行分化。

造血幹細胞紅系擴增和分化培養基為基礎培養基為StemSpan™ SFEM II, 生長因數為50-200 ng/ml SCF, 10-100 ng/ml IL-3, 1-10U EPO/ml，培養條件：利用造血幹細胞紅系擴增和分化培養基培養造血幹細胞1.0×105 cells/ml，擴增7天。

造血幹細胞紅系分化脫核培養基為基礎培養基為STEMSPAN™ SFEM II, 生長因數為1-10U EPO, 100-1000 μg/ml 人轉鐵蛋白，化學小分子為0.5-10 μm mifepristone，將利用上一步驟培養的1.0×106 cells/ml 細胞在造血幹細胞紅系分化脫核培養基分化5天。

然後，檢測CD71和CD235a表達，如圖17所示。實驗組和對照組均能高效分化成為紅細胞，CD71和CD235a的表達比例均在90%以上。

4-2. 檢測γ球蛋白和胎兒血紅蛋白表達

提取上述紅細胞分化後的細胞的mRNA, 反轉錄成cDNA，透過螢光定量PCR檢測BCL11A、HBB、HBG等基因的表達，如圖18所示。結果表明，基因敲除BCL11A enhancher位點的細胞BCL11A基因表達下調1倍，HBG表達提高一倍。

檢測紅系分化後的細胞的胎兒血紅蛋白表達，如圖19所示，流式分析結果表明基因敲除BCL11A enhancher位點的細胞，胎兒血紅蛋白表達提高約1倍。

實施例 5 ：基因編輯 β- 地中海貧血病人來源的造血幹細胞的 BCL11A 的增強子位點

5-1. β-地中海貧血病人外周血來源的造血幹細胞分離

透過常規的磁珠分選獲得CD34陽性的造血幹細胞。結果如圖20所示。

5-1. 電轉β-地中海貧血病人外周血來源的造血幹細胞

選取300V 1ms的電轉條件，電轉Cas9 mRNA和Enhancer-2、Enhancer-3、Enhancer-4、Enhancer-5以及Enhancer-6進入β-地中海貧血病人外周血來源的造血幹細胞，4天後檢測Indels效率，結果如圖21所示。表明在3個不同的病人外周血來源的造血幹細胞上，5條sgRNA均可實現高效基因編輯，其中，效率最高的是Enhancer-2，達到至少70%以上。

實施例 6 ：基因編輯貧血病人外周血來源的造血幹細胞紅系分化檢測 γ 球蛋白和胎兒血紅蛋白表達

將實施例5中經過基因編輯的造血幹細胞進行體外紅系分化，方法見實施例4-1。分化結果如圖22所示，實驗結果表明對照組、Enhancer-2、Enhancer-3、Enhancer-4、Enhancer-5以及Enhancer-6紅系分化效率相似，均高表達CD71和CD235a細胞膜蛋白。

12天後，提取紅細胞分化後的細胞的mRNA, 反轉錄成cDNA，透過螢光定量PCR檢測BCL11A、HBB、HBG、HBA等基因的表達，如圖23所示。結果表明，除Enhancer-6以外，Enhancer-2、Enhancer-3、Enhancer-4和Enhancer-5均能下調細胞中 BCL11A基因表達，其中Enhancer-2效果最為顯著下調約1倍左右；此外，Enhancer-2、Enhancer-3、Enhancer-4、Enhancer-5以及Enhancer-6均能夠提高γ球蛋白表達，其中效果最顯著的是Enhancer-2， γ球蛋白表達提高9倍，符合臨床治療的標準。與現有文獻中的結果相比，首先我們以重症地貧病人來源的造血幹細胞作為起始的評估細胞來源，精確驗證了本發明的方法符合臨床治療的要求，而現有文獻只使用了正常人的骨髓或者外周血的樣本；其次，現有文獻中報導的提高胎兒血紅蛋白的倍數只在4-7倍之間，低於本發明中提高胎兒血紅蛋白的表達比例。由此表明，本發明的實驗結果顯著優於現有的文獻報導(Chang et al. Methods& Clinical Development. 2017; Mattew C et al. Nature.2015)。

此外，為了更精確地評估Enhancer-2、Enhancer-3、Enhancer-4、Enhancer-5以及Enhancer-6基因編輯BCL11A enhancer位點對於胎兒血紅蛋白(HbF)和正常血紅蛋白(HbA)的蛋白表達量的影響，在本發明中，我們提取了造血幹細胞分化12天後獲得的紅細胞的蛋白，進行了HPLC試驗(High Performance Liquid Chromatography, 高效液相色譜法)，如圖27、28和29所示。結果表明，1)保留時間約為5.4 min和10 min處的色譜峰分別代表HbF和HbA。2) 與未經過基因編輯的細胞相比，Enhancer-2、Enhancer-3、Enhancer-4、Enhancer-5以及Enhancer-6基因編輯的細胞HbF表達量更高(峰更高和峰面積更大), HbA的表達量更低(峰更低和峰面積更小)，表明基因編輯BCL11A enhancer位點提高了HbF的表達，且下調了HbA的表達。3)其中，Enhancer-2的HbF/HbA的比例為約為5.28，mock的HbF/HbA的比例為約為0.79，提高了6.68倍，顯著高於Enhancer-3、Enhancer-4、Enhancer-5以及Enhancer-6對於HbF/HbA的比例倍數。在臨床上，如本發明的背景中所述重型β地貧患者由於β球蛋白缺失，血液中的血紅蛋白由少量的HbA和占絕大部分的HbF組成，通常重型β地貧患者的血紅蛋白約為20g/L，其中HbF占比達到90%以上。我們按照占比90%計算，經過基因編輯後的細胞HbF表達量提高了6.68倍，最終的血紅蛋白量為20*0.9*6.68+20*0.1=122.24 g/L, 正常人的血紅蛋白表達量的範圍是115-150g/L之間，該結果完全符合臨床治療的標準(Antonio Cao, et al. Genes in Medicine. 2010; 2010 年《重型β地中海貧血的診斷和治療指南》)。與現有文獻相比，本發明是唯一在β地貧患者的造血幹細胞上，透過HPLC實驗精確評估了基因編輯BCL11A enhancer提高胎兒血紅蛋白的有效性的發明研究，且結果表明顯著提高了胎兒血紅蛋白的表達，達到治療重型β地貧患者的臨床要求(Chang et al. Methods& Clinical Development. 2017; Mattew C et al. Nature.2015；Lin Ye， et al. PNAS. 2016; Matthew H. Porteus, Advances in Experimental Medicine and Biology. 2013)。

實施例 7 ：基因編輯貧血病人外周血來源的造血幹細胞體外克隆形成

選取300V 1ms的電轉條件，電轉Cas9 mRNA和Enhancer-2進入貧血病人外周血來源的造血幹細胞, 將500-800個細胞重懸入1ml H4434(購自加拿大STEM CELLS TECHNOLOGIES)和IMDM(購自Thermo Fisher)以及FBS(購自Thermo Fisher)的混合液中，14天後顯微鏡下觀察CFU-M、BFU-E、CFU-E、CFU-G、CFU-GM、GEMM等不同形態的克隆形成數目，結果如圖25 所示。

本實驗資料表明，與未經過基因編輯的造血幹細胞相比，基因編輯後的細胞功能體外分化功能正常，能分化不同血液系統譜系的克隆。

實施例 8 ：基因編輯貧血病人外周血來源的造血幹細胞的脫靶效應

本實驗關於基因測序方法，具體是透過2代測序技術(Next generation sequencing, NGS)分析基因編輯貧血病人外周血來源的造血幹細胞的脫靶效應(off-target effect)。

選取300V 1ms的電轉條件，電轉Cas9 mRNA和Enhancer-2進入貧血病人外周血來源的造血幹細胞, 擴增4天後，提取基因組進行2代測序分析。我們透過軟體預測了14個潛在的脫靶位點，結果如圖22所示。

本實驗資料表明，基因編輯中靶(on-target)效率為76%，而14個潛在的脫靶位點的比率均低於0.3%，與二代測序本身誤差相當，由此可見，在測序誤差範圍內，我們並沒有檢測到由於基因編輯而導致的脫靶現象，所以該基因編輯方案是安全的。

根據上述實施例的資料可以看出，針對不同來源的細胞，Enhancer-2均顯示出最好的效果。

實施例9

選取300v 1ms的電轉條件，電轉Cas9 mRNA和Enhancer-2進入貧血病人外周血來源的造血幹細胞，隨後進行上述實施例4的“兩步法”進行紅細胞分化，除了在實施例9中，擴增的時間為4天，然後分化14天，經過14天之後，進行HbF染色，透過流式分選分離獲得高表達HbF(約10%比例)和低表達HbF(約10%比例)的細胞，提取基因組分別進行2代測序分析（深度測序分析）。

其中HbF染色的步驟如下：1)收集培養板中的細胞，600g 5min離心，去除上清；2)加入4攝氏度預冷的含有0.05%戊二醛的磷酸鹽緩衝液，室溫固定10分鐘。600g 5min離心，去除上清；3)加入含有0.1%BSA的磷酸鹽緩衝液，吹打重懸，600g 5min離心，去除上清。重複三次，以盡可能去除殘留的戊二醛；4)加入含有0.1% Triton X-100的0.1%BSA的磷酸鹽緩衝液，室溫放置4 min，600g 5min離心，去除上清；5)加入含有0.1%BSA的磷酸鹽緩衝液，吹打重懸，600g 5min離心，去除上清；6)加入含有0.1%BSA的磷酸鹽緩衝液100 ul， 加入5ul HbF流式抗體，室溫染色15分鐘；7)加入0.1%BSA的磷酸鹽緩衝液，600g 5min離心，去除上清; 8)加入0.1%BSA的磷酸鹽緩衝液 100ul, 吹打重懸，上機進行流式分析。

將高表達HbF和低表達HbF的兩群細胞進行深度測序分析對比之後，分析結果如圖31所示，根據圖31可以看出在高表達HbF的細胞群中主要有5類基因型，其中，野生型的效率，占比是46.47%，“-5”占比是14.38%，“-1”占比是14.60%，“-4”占比是14.55%，“+1”占比是10.00%。該結果表明主要是“-5”、“-1”、“-4”、“+1”四種基因型的細胞高表達了胎兒血紅蛋白HbF。從上述4種基因型中可以看出序列“CTTCCT”是關鍵的靶點序列(圖31中箭頭指向的位置)。根據實施例9的結果顯示如果在基因編輯的細胞中該序列被破壞，則能夠有效地上調胎兒血紅蛋白的表達。

根據基因分析的結果顯示的“CTTCCT”6bp的鹼基序列，其包含了STAT1和ELF1基因的結合位點。其中，根據文獻報導STAT1的結合位元點是“TTCCnGGA”基序 (n代表任意鹼基) (Raja, et al. Nucleic Acids Research. 2008;George, et al. Journal of Biological Chemistry. 2001; Christoph, et al. Plos one. 2010), 而ELF-1的結合位點是”TTCC”基序(Steven, et al. Scientific Reports. 2015; Yuang-Taung Juang, et al. The Journal of Immunology. 2007)。

其中，STAT1和ELF1都是參與血液系統發育、紅細胞發育中關鍵的調控轉錄因數。其中，STAT1透過和轉錄因數BCL11A結合形成調控網路，負向調控紅細胞發育(Jason D Buenrostro, et al. BioRxiv. 2017 ;Keita Kirito, et al. Blood. 1998)；而轉錄因數ELF-1在血液系統發育過程中，與GATA-2，FLI-1形成複合物，啟動下游關鍵轉錄因數GATA1的表達(Gemma, et al. Developmental Biology. 2006)。

本發明的實驗結果提示，透過破壞BCL11A基因中包含“CTTCCT”6bp的鹼基序列，破壞了STAT1和ELF-1的結合位點使STAT1和ELF-1不能結合到BCL11A enhancer上，解除了BCL11A基因對胎兒血紅蛋白合成的抑制，從而提高血液中胎兒血紅蛋白的表達。

工業實用性

根據本發明，本發明的方法有以下幾個優點，首先本方法能夠基因編輯地中海貧血病人來源的造血幹細胞，完全滿足臨床治療地中海貧血和鐮刀型紅細胞貧血的要求；其次，透過使用經過化學修飾的sgRNA, 基因編輯效率高，顯著提高胎兒血紅蛋白的表達，細胞能夠重建模型小鼠的造血系統；最後，脫靶分析顯示安全性高。基於此，本發明開發的方法將有可能代替傳統的造血幹細胞移植治療技術來治癒重型地中海貧血和鐮刀型紅細胞貧血的患者。

儘管已提及具體特徵對本發明進行詳細描述，但對所屬技術領域中具有通常知識者顯而易見的是此描述僅用於優選的實施方案而非限制本發明的範圍。因此，本發明的實質範圍會透過所附申請專利範圍和其等同物來進行限定。

無。

圖1 基因編輯自體造血幹細胞治療β-地中海貧血和鐮刀紅細胞貧血的治療路線。從病人體內動員外周血，透過體外分離獲得CD34陽性的造血幹細胞，體外經過基因編輯，提高胎兒血紅蛋白表達，將經過基因修飾的自體造血幹細胞回輸病人。

圖2在癌症細胞系K562上多批次實驗檢測最佳電轉條件，電轉GFP 4天後的螢光顯微鏡拍照圖。“V”指脈衝電壓，“ms”指脈衝時間。

圖3在癌症細胞系K562上多批次實驗檢測最佳電轉條件，電轉GFP 4天後，流式分析7-AAD和GFP表達統計分析圖，以7-AAD表示細胞活率，7-AAD(7-胺基-放線菌素D)是一種核酸染料，它不能通過正常質膜，隨著細胞凋亡、細胞死亡過程，質膜對7-AAD的通透性逐漸增加，在合適波長的激發光的激發下可發出明亮的紅色螢光，7-AAD陰性為正常活力細胞；用GFP表示電轉效率。“250-1”表示250V電壓，1ms 脈衝時間，“250-1-1”， “250-1-2”分別表示250V 1ms, 兩個重複；“300-1-1”，“300-1-2”分別表示300v 1ms, 兩個重複。

圖4在300V, 1ms電轉條件下，電轉GFP mRNA 進入造血幹細胞4天後的螢光顯微鏡拍照圖，分別包括明場、綠色通道、紅色通道和明場綠色通道疊加四個視野。

圖5在300V, 1ms電轉條件下，電轉GFP mRNA 進入造血幹細胞4天後流式分析GPF和CD34蛋白表達情況。

圖6針對人BCL11A的增強子58K位置設計的多條sgRNA的示意圖。

圖7針對人BCL11A的增強子58K 位點的150bp序列資訊。

圖8針對人BCL11A的增強子 58K位點150bp的位置設計的23條sgRNA的具體DNA 序列資訊。

圖9在CD34陽性造血幹細胞上，電轉Cas9 mRNA和多條sgRNA 4天後提取基因組，擴增片段和Sanger測序，TIDE軟體分析產生Indels效率的統計分析。

圖10電轉Cas9 mRNA和BCL11A的增強子-2、3、4、5和6 sgRNA(即圖中的Enhancer-2、3、4、5和6)進入3個不同臍帶血來源的CD34陽性造血幹細胞，4天後，TIDE軟體分析產生Indels效率的統計分析。

圖11 電轉Cas9 mRNA和BCL11A的增強子-2 sgRNA進入臍帶血來源的CD34陽性造血幹細胞，2天後進行體外克隆形成實驗(CFU檢測)，14天後統計不同血液系統的克隆數目，BFU-E、CFU-M、CFU-GM、CFU-E、CFU-G、CFU-MM代表紅系、髓系、淋巴系等血液系統不同譜系的克隆形成。其中，Mock: 代表未經過基因編輯的細胞。

圖12電轉Cas9 mRNA和BCL11A的增強子-2 sgRNA進入造血幹細胞，同時移植經過基因修飾和未經過基因修飾的細胞進入經過輻照儀照射的NPG免疫缺陷小鼠模型，6周、8周、10周、12周、16周後，在小鼠外周血檢測人CD45陽性細胞的比例，同時移植16周後在小鼠骨髓和脾臟中檢測人CD45陽性細胞的比例，其中CD45陽性細胞的比例的計算方式為人CD45陽性細胞%/(人CD45陽性細胞%+小鼠CD45陽性細胞%)，人CD45陽性細胞%和小鼠CD45陽性細胞%分別是透過流式分析實驗測得的結果。Mock: 代表未經過基因編輯的細胞。Enhancer-2代表經過基因編輯的細胞。

圖13 電轉Cas9 mRNA和BCL11A的增強子-2 sgRNA進入臍帶血來源的造血幹細胞，同時移植經過基因修飾和未經過基因修飾的細胞進入經過輻照儀照射的NPG免疫缺陷小鼠模型，16周後分別在小鼠骨髓、脾臟、外周血中檢測CD3、CD4、CD8、CD33、CD56、CD19等人細胞膜蛋白占人CD45蛋白的比例。Mock: 代表未經過基因編輯的細胞。Enhancer-2代表經過基因編輯的細胞。

圖14 電轉Cas9 mRNA和BCL11A的增強子-2 sgRNA進入臍帶血來源的造血幹細胞，移植經過基因修飾細胞進入經過輻照儀照射的NPG免疫缺陷小鼠模型，16周後分別在小鼠骨髓、脾臟、外周血中，流式分析檢測小鼠CD45、人CD45、CD3、CD4、CD8的表達結果。SSC-H通道代表側向角散射，其代表細胞的顆粒度，值越大代表細胞的顆粒度越大，顆粒度指細胞表面的皺折度，細胞內亞細胞器、顆粒的數目等。

圖15 電轉Cas9 mRNA和BCL11A的增強子-2 sgRNA進入臍帶血來源的造血幹細胞，移植經過基因修飾細胞進入經過輻照儀照射的NPG免疫缺陷小鼠模型，16周後分別在小鼠骨髓、脾臟、外周血中，流式分析檢測一隻小鼠的人CD33、CD56、CD49。SSC-H通道代表側向角散射，其代表細胞的顆粒度，值越大代表細胞的顆粒度越大，顆粒度指細胞表面的皺折度，細胞內亞細胞器、顆粒的數目等。

圖16 電轉Cas9 mRNA和BCL11A的增強子-2 sgRNA進入臍帶血來源的造血幹細胞，提取移植前細胞和移植後16周的外周血、骨髓、脾臟的基因組，擴增目的片段和Sanger測序，透過TIDE軟體分析基因編輯Indels效率。

圖17 電轉Cas9 mRNA和BCL11A的增強子-2 sgRNA進入臍帶血來源的造血幹細胞，進行紅細胞分化，12天後檢測。A圖代表分化後的紅細胞拍照圖；B圖代表檢測人CD71和人235a 兩個膜蛋白表達，表示紅系分化效率。Mock: 代表未經過基因編輯的細胞。Enhancer-2代表經過基因編輯的細胞。

圖18 電轉Cas9 mRNA和BCL11A的增強子-2 sgRNA進入臍帶血來源的造血幹細胞，進行紅細胞分化，12天後透過螢光定量PCR檢測BCL11A 、 HBB 、 HBG 等基因mRNA表達。Mock: 代表未經過基因編輯的細胞。Enhancer-2代表經過基因編輯的細胞。

圖19電轉6μg Cas9 mRNA和4ug BCL11A的增強子-2 sgRNA進入臍帶血來源的造血幹細胞向紅細胞分化12天後的細胞內胎兒血紅蛋白HbF的表達情況。左側是流式分析圖，右側是胎兒血紅蛋白表達統計分析圖。Mock: 代表未經過基因編輯的細胞。Enhancer-2代表經過基因編輯的細胞。

圖20 檢測新鮮分離的β地中海貧血病人的外周血中CD45和CD34的表達，左側是對照組，右側是實驗組。實驗樣品分別來自3名β-地中海貧血病人。

圖21電轉Cas9 mRNA和BCL11A的增強子-2、3、4、5和6 sgRNA(即圖中的Enhancer-2、3、4、5和6) 進入3個不同β地中海貧血病人的外周血分離的CD34陽性的造血幹細胞，4天後，TIDE軟體分析產生Indels效率的統計分析。

圖22電轉電轉Cas9 mRNA和BCL11A的增強子-2 sgRNA 進入β地中海貧血病人的外周血分離的CD34陽性的造血幹細胞，提取基因組，NGS深度測序分析14個潛在的脫靶位點統計圖。

圖23 電轉Cas9 mRNA和BCL11A的增強子-2、3、4、5和6 sgRNA(即圖中的Enhancer-2、3、4、5和6)進入β地中海貧血病人來源的造血幹細胞，進行紅細胞分化，12天後檢測。A圖代表分化後的紅細胞拍照圖；B圖代表檢測人CD71和人235a 兩個膜蛋白表達，表示紅系分化效率。Mock: 代表未經過基因編輯的細胞。Enhancer-2、3、4、5和6代表經過基因編輯的細胞。

圖24電轉電轉Cas9 mRNA和BCL11A的增強子-2、3、4、5和6 sgRNA(即圖中的Enhancer-2、3、4、5和6)進入β地中海貧血病人的外周血分離的CD34陽性的造血幹細胞，紅細胞分化12天後，檢測BCL11A和γ-球蛋白的基因表達。Mock: 代表未經過基因編輯的細胞。Enhancer-2、3、4、5和6代表經過基因編輯的細胞。

圖25 電轉Cas9 mRNA和BCL11A的增強子-2 sgRNA進入β地中海貧血病人來源的CD34陽性的造血幹細胞，2天後進行體外克隆形成實驗(CFU 檢測)，14天後統計不同血液系統的克隆數目，BFU-E、CFU-M、CFU-GM、CFU-E、CFU-G、CFU-MM代表紅系、髓系、淋巴系等血液系統不同譜系的克隆形成。

圖26 電轉Cas9 mRNA和BCL11A的增強子-3（Enhancer-3）、增強子-4（Enhancer-4）或增強子-5（Enhancer-5）sgRNA進入β地中海貧血病人來源的CD34陽性的造血幹細胞，評估基因編輯效率，BCL11A 基因表達和γ-球蛋白的基因表達。A)電轉4天後，TIDE軟體分析不同sgRNAs產生Indels效率的統計分析; B)電轉造血幹細胞後，進行紅細胞分化，12天後檢測BCL11A基因表達。C)電轉造血幹細胞後，進行紅細胞分化，12天後檢測γ-球蛋白基因表達。Mock: 代表未經過基因編輯的細胞。Enhancer-3, Enhancer-4, Enhancer-5代表經過Enhancer-3, Enhancer-4, Enhancer-5 sgRNA導入後基因編輯的細胞。

圖27顯示代表未經過基因編輯的細胞(Mock)和經過基因編輯的細胞(利用增強子2 sg RNA編輯的)後的色譜結果，顯示HbF和HbA的表達量。

圖28顯示代表未經過基因編輯的細胞(Mock)和經過基因編輯的細胞(利用增強子3、4、5、以及6 sg RNA編輯的)後的色譜結果，顯示HbF和HbA的表達量。

圖29顯示根據圖27和圖28中的色譜結果進行計算後的HbF和HbA表達量的比值。

圖30顯示實施例9中透過HbF染色之後的高表達HbF(約10%比例)和低表達HbF(約10%比例)的細胞所占的比例。

圖31顯示對實施例9中的高表達HbF(約10%比例)和低表達HbF(約10%比例)的細胞，提取基因組分別進行2代測序分析的結果。

Claims (44)

1. 一種提高胎兒血紅蛋白(HbF)表達的方法，包括： 透過基因編輯技術破壞造血幹細胞中2號染色體上從CTTCCT序列上游0-15個核苷酸至所述CTTCCT序列下游0-15個核苷酸的BCL11A基因組區域， 其中所述BCL11A基因組區域位於chr2:60495236至chr2:60495271之間。
2. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中所述BCL11A基因組區域序列為CTTCCT。
3. 如申請專利範圍第1項或第2項所述的方法，其中所述基因編輯技術為基於鋅指核酸酶的基因編輯技術、TALEN基因編輯技術或CRISPR/Cas基因編輯技術。
4. 如申請專利範圍第3項所述的方法，其中所述基因編輯技術為CRISPR/Cas9基因編輯技術。
5. 如申請專利範圍第1項或第2項所述的方法，包括向所述造血幹細胞導入靶向所述BCL11A基因組區域的sgRNA以實現對所述BCL11A基因組區域的編輯。
6. 如申請專利範圍第5項所述的方法，包括向所述造血幹細胞導入包含選自SEQ ID NOs: 3、4、8和33-63任一序列的sgRNA以實現對所述BCL11A基因組區域的編輯。
7. 如申請專利範圍第5項所述的方法，將包含SEQ ID NO：4的序列的sgRNA導入所述造血幹細胞以實現對所述BCL11A基因組區域的編輯。
8. 如申請專利範圍第5項所述的方法，其中所述sgRNA是經過2’-O-甲基類似物和/或核苷酸間3’硫代修飾的。
9. 如申請專利範圍第8項所述的方法，其中所述修飾為所述sgRNA的5’端前一個、二個和/或三個鹼基和/或3’端的最後一個鹼基的2’-O-甲基類似物修飾。
10. 如申請專利範圍第5項所述的方法，其中將所述sgRNA與所述Cas9編碼核苷酸共同導入所述造血幹細胞。
11. 如申請專利範圍第10項所述的方法，其中透過電轉方法將所述sgRNA與所述Cas9編碼核苷酸共同導入所述造血幹細胞。
12. 如申請專利範圍第11項所述的方法，其中所述電轉條件為200-600V，0.5ms-2ms。
13. 一種透過CRISPR/Cas9系統體外高效編輯造血幹細胞的方法，包括將靶向從CTTCCT序列上游0-15個核苷酸至所述CTTCCT序列下游0-15個核苷酸的BCL11A基因組區域的sgRNA導入所述造血幹細胞，其中所述BCL11A基因組區域位於chr2:60495236至chr2:60495271之間，其中所述sgRNA是經過2’-O-甲基類似物和/或核苷酸間3’硫代修飾的。
14. 如申請專利範圍第13項所述的方法，包括將含有選自SEQ ID NO：4、8和33-63任一序列的sgRNA導入所述造血幹細胞，其中所述sgRNA是經過2’-O-甲基類似物和/或核苷酸間3’硫代修飾的。
15. 如申請專利範圍第13項或第14項所述的方法，其中將所述sgRNA與所述Cas9編碼核苷酸共同導入所述造血幹細胞。
16. 如申請專利範圍第15項所述的方法，其中透過電轉方法將所述sgRNA與所述Cas9編碼核苷酸共同導入所述造血幹細胞。
17. 如申請專利範圍第16項所述的方法，其中所述電轉條件為200-600V，0.5ms-2ms。
18. 一種透過如申請專利範圍第1項或第13項所述的方法得到的造血幹細胞。
19. 一種透過基因改造使胎兒血紅蛋白(HbF)表達升高的造血幹細胞，其中所述造血幹細胞中第2號染色體上從CTTCCT序列上游0-15個核苷酸至所述CTTCCT序列下游0-15個核苷酸的BCL11A基因組區域的sgRNA導入所述造血幹細胞，其中所述BCL11A基因組區域位於chr2:60495236至chr2:60495271之間。
20. 一種透過分化培養如申請專利範圍第19項所述的造血幹細胞獲得的、處於成熟紅細胞之前的不同分化階段的前體細胞。
21. 一種透過分化培養如申請專利範圍第19項所述的造血幹細胞獲得的成熟紅細胞。
22. 一種製造透過基因改造使胎兒血紅蛋白(HbF)表達升高的成熟紅細胞或其前體細胞的方法，所述方法包括： (a)使用如申請專利範圍第1項或第13項所述的方法得到基因改造的造血幹細胞； (b)使用造血幹細胞紅系擴增和分化培養基對所述基因改造的造血幹細胞進行造血幹細胞紅系擴增和分化， 其中，所述造血幹細胞紅系擴增和分化培養基包括基礎培養基，以及生長因數的組合物，其中所述生長因數的組合物包括幹細胞生長因數（SCF）、白介素3（IL-3）和促紅細胞生成素（EPO）。
23. 如申請專利範圍第22項所述的方法，所述方法更包括： 使用紅系分化脫核培養基進行造血幹細胞紅系分化脫核，所述紅系分化脫核培養基包含基礎培養基、生長因數、以及孕酮受體和糖皮質激素受體的拮抗劑和/或抑制劑。
24. 如申請專利範圍第23項所述的方法，其中所述紅系分化脫核培養基中的所述生長因數包括促紅細胞生成素（EPO），所述孕酮受體和所述糖皮質激素受體的拮抗劑和/或抑制劑為選自下述化合物(I)~(IV)中的任一種或兩種及以上：(I)(II)(III)(IV)。
25. 一種透過如申請專利範圍第22項至第24項中任一項所述的方法得到的成熟紅細胞或前體細胞。
26. 一種組合物，包含如申請專利範圍第19項所述的造血幹細胞、或如申請專利範圍第20項所述的前體細胞、或如申請專利範圍第21項所述的成熟紅細胞。
27. 一種包含如申請專利範圍第19項所述的造血幹細胞、或如申請專利範圍第20項所述的前體細胞、或如申請專利範圍第21項所述的成熟紅細胞的醫用製品。
28. 一種如申請專利範圍第19項所述的造血幹細胞、或如申請專利範圍第20項所述的前體細胞、或如申請專利範圍第21項所述的成熟紅細胞在預防或治療有需要的受試者的疾病中的用途。
29. 如申請專利範圍第28項所述的用途，所述疾病為貧血性疾病、失血性疾病、腫瘤或其它需要大量輸血進行預防或治療的疾病。
30. 如申請專利範圍第29項所述的用途，其中所述疾病為β-地中海貧血或鐮刀型紅細胞貧血。
31. 如申請專利範圍第28項所述的用途，其中所述受試者為人。
32. 一種如申請專利範圍第19項所述的造血幹細胞、或如申請專利範圍第20項所述的前體細胞、或如申請專利範圍第21項所述的成熟紅細胞在製備預防或治療受試者疾病中的藥物或醫用製品中的用途。
33. 如申請專利範圍第32項所述的用途，所述疾病為貧血性疾病、失血性疾病、腫瘤或其它需要大量輸血進行預防或治療的疾病。
34. 如申請專利範圍第33項所述的用途，其中所述疾病為β-地中海貧血或鐮刀型紅細胞貧血。
35. 如申請專利範圍第32項所述的用途，其中所述受試者為人。
36. 一種sgRNA構建體，包含靶向從CTTCCT序列上游0-15個核苷酸至所述CTTCCT序列下游0-15個核苷酸的BCL11A基因組區域的sgRNA，其中所述BCL11A基因組區域位於chr2:60495236至chr2:60495271之間。
37. 如申請專利範圍第36項所述的構建體，包含選自SEQ ID NOs：3 、4 、8和33-63之一的核苷酸序列。
38. 如申請專利範圍第36項或第37項所述的構建體，其包含2’-O-甲基類似物和/或核苷酸間3’硫代修飾。
39. 如申請專利範圍第38項所述的構建體，其中所述修飾為在所述核苷酸序列的5’端的前一個、二個和/或三個鹼基和/或3’端的最後一個鹼基的2’-O-甲基類似物修飾。
40. 一種包含如申請專利範圍第36項所述的構建體的載體、宿主細胞或製劑。
41. 一種包含如申請專利範圍第36項所述的構建體在基因編輯造血幹細胞中的用途。
42. 一種治療或預防受試者貧血性疾病、失血性疾病、腫瘤或其它需要大量輸血進行預防或治療的疾病的方法，其包括給藥受試者如申請專利範圍第19項所述的造血幹細胞，如申請專利範圍第20項所述的前體細胞，或如申請專利範圍第21項所述的成熟紅細胞。
43. 如申請專利範圍第42項所述的方法，其中，所述疾病為β-地中海貧血或鐮刀型紅細胞貧血。
44. 如申請專利範圍第43項所述的方法，其中，所述受試者為人。