CN104877965B - 一种制备成熟红细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种制备成熟红细胞的方法。本发明利用同源性脐带血和胎盘源血内的干细胞在体外用刺激因子使干细胞定向红细胞扩增数十万倍，扩增后的干细胞和红细胞干/祖细胞在体外用刺激因子并和间充质干细胞共同培养和继续扩增，形成成熟的红细胞，其数量可以达到每个胎盘生成20到50个单位，每个单位10¹²个红细胞，这些细胞具有正常红细胞的功能，可以用于临床用血。本发明为体外大规模产业化生产用于临床的成熟红细胞提供了新方法。

Description

一种制备成熟红细胞的方法

技术领域

本发明属于生物制品领域，涉及一种制备成熟红细胞的方法。

背景技术

输血是安全用血的主要任务，在战时，伤员的出血是死亡的重要原因，如果能快速输血可以拯救战士的生病，而验血，配血要消耗大量时间，但如果有万能用血，直接输血，则可救治生命；在平时，血液的充份供给，输血的感染，污染问题的解决，稀有血型的用血，如中国人98％以为Rh阳性，如果有Rh阴性用血，则会非常难获得，因而离发现一条能够大量造成万能用血的来源，思考和研究如何能够获得更为安全和更有广泛来源的血液制备制品，尤其是生产万能红细胞，(所谓万能用血，就是采用来自于胎盘中Rh阴性“O”型血)这是保障用血的供应和安全的重要方法。国内外都对开发这类产品高度重视，投入很大的财力和物力。

人体内红细胞的生成过程是非常复杂的。在成年人的体内，红细胞是在骨髓中生成的，但是在早期的胚胎中，红细胞是在主动脉弓及胎盘、卵黄囊的中胚层细胞中生成的。随着胎龄的增长，在3个月后红细胞的生成转到脾和肝脏，5个月后在骨髓。而且目前有文章和试验指出，胎盘是为胎儿提供干细胞以及帮助干细胞成熟的重要组织。虽然有研究者也对其它可大量生成红细胞的祖系细胞进行了研究，包括脐带血、骨髓以及外周血，但是都不能满足临床的需要，脐带血量少，而骨髓和周围血来源困难。此外，对于急诊以及外伤患者中非常少见的O型阴性(O^—)血患者，血源紧张的问题就更加严重，所以，此研究解决血源问题意义尤其重大。

红细胞对于人体来说之所以重要，是因为它能将氧气运输到每个细胞。评价红细胞功能方法之一就是检测其携氧能力以及稳定性，即氧离曲线。用人类胚胎干细胞培养出的红细胞的氧离曲线，与正常红细胞是相似的，而且也随着pH值、2，3-二磷酸甘油酸的改变而改变，携带和释放氧的能力也符合标准。成熟红细胞没有细胞核,胞浆内充满血红蛋白,具有携带氧气和二氧化碳的功能。因为膜上含有ABO糖蛋白血型抗原,输血前需要检测血型。利用人胚胎干细胞培育出的红细胞与成熟红细胞相近。另外人们开发了诱导多能干细胞(iPS)，它能够在体外无限量制造成熟红细胞。这一研究有望减少人们对献血的依赖，对多种疾病进行研究，例如镰状细胞病。虽然成熟的红细胞不能自我复制，但在干细胞的分化过程中，由胚胎干细胞——多能干细胞—红系祖细胞具有复制能力，可以诱导性多能干细胞和胚胎干细胞，成功培育出在实验室中几乎可以无限复制增殖的红系祖细胞，并分化为成熟的红细胞。但是与成熟的红细胞相比，胚胎和iPS干细胞源性的红细胞有2个大问题，1.这更像胎儿红细胞，尽管在体外经过培养后，还是表现出了成年红细胞的特征。2.这种干细胞的来源是种无限增殖能力的细胞，具有肿瘤细胞的特性。

更多的人用骨髓、脐带血的造血干细胞分化成为成熟红细胞，也有用周围血的白细胞实现了在实验室里从干细胞中培养出功能性红血球，然后再输入人体，为建立输血用途的干细胞库做出了贡献。在造血微环境的帮助下，可以体外从干细胞生成正常的红细胞。但以上来源的干细胞问题是：胚胎或诱导多能干细胞(iPS)因为来源细胞有无限繁殖的可能，会形成肿瘤，一般不能应用于临床。骨髓来源困难；而脐带血和周围血扩增水平有限，所以如何可以达到数百万的扩增，满足临床输血的需要，可以进行大批量生产，是科研人员的努力方向。国外在这方面投入大批资金和人员，国内也有多人在做。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种制备成熟红细胞的方法。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

本发明的发明点在于：

利用来自于胎盘源血的造血干细胞不同发育阶段群、来自于胎盘源组织的间充质干细胞，或联合利用来自于同源性脐带血和胎盘的造血干细胞不同发育阶段群，以这三种干细胞来建立人造血库。

目前国内外体外制备红细胞的方法使用脐血、骨髓或外周动员的CD34⁺细胞或胚胎干细胞作为原料，而本发明利用胎盘源血单个核细胞为原料在体外生产成熟红细胞。从胎盘源血中分离出单个核细胞，可以用此细胞，也可以进步纯化为各个造血干细胞群，然后通过培养、制备和生产成熟的红细胞。这种通过加过不同细胞因子组合的诱导以及来自于胎盘或脐带组织采用丝烈霉素C或同位素灭活的间充质干细胞和造血干细胞共同培养，形成无核成熟红细胞。本发明的培养体系可使单个核细胞中的干细胞不断增殖并且只向红系方向分化。结构和功能分析结果表明，体外培养出的红细胞的平均细胞体积(MCV),平均血红蛋白含量(MCH),红细胞的最大变形指数,葡萄糖6磷酸脱氢酶及丙酮酸激酶的含量都和成人红细胞的特性类似。利用胎盘或胎盘和脐带血含有的造血干祖细胞，通过体外培养能大量生产出成人红细胞，从而为建立人造血库提供条件。

发明是发现胎盘源血内还含有红细胞干/祖细胞，这是脐带血中不含有的，(利用同源性脐带血和胎盘源血一起可以增加干细胞的含量)(这儿指的是血液里自然形成的干/祖细胞簇，不是干细胞，如图10所示)这种细胞不会形成白细胞克隆，但能形成大量的红细胞克隆。

本发明发现利用脐带血和胎盘源血内的干细胞可以在体外用刺激因子使干细胞定向红细胞扩增数百万倍，扩增后的干细胞和红细胞干/祖细胞在体外用刺激因子并和间充质干细胞共同培养和继续扩增，可以形成成熟的红细胞，其数量可以达到每个胎盘生成20到50个单位，每个单位10¹²个红细胞，这些细胞具有正常红细胞的功能，可以用于临床用血。

本发明也发现胎盘源血内也含有大量的红细胞干/祖细胞簇，也可以用于生成成熟红细胞。

基于上述发现，本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种制备成熟红细胞的方法，包含以下步骤：

(1)提取并纯化来自胎盘源血、脐带血的单个核细胞，或提取纯化来自于脐带血和/或胎盘源血的造血干细胞CD34⁺CD38⁺、CD34⁺CD38^-、造血前体干细胞CD133⁺CD34^+,、早期造血前体干细胞CD133⁺CD34^-或红系干/祖细胞CD34⁺CD72⁺中的一种或多种；

(2)从纯化的单个核细胞或纯化的CD34⁺CD38⁺、CD34⁺CD38^-、CD133⁺细胞、红系干/祖细胞CD34⁺CD72⁺中的一种或多种中扩增干细胞：取1x10⁶/ml的单个核细胞置入培养瓶，所用的培养液为无血清培养液SFEM并和以下细胞因子共同培养细胞：1-10×10^-6mol/L糖皮质激素，50-200ng/ml SCF,50-200ng/ml Flt3-L,10-100ng/ml BMP4,10-100ng/ml IL-3,10-100ng/ml IL-11和1-10单位/ml EPO，每3-5天取细胞离心，更换新培养液，在换2-5次培养液后收集细胞用于下一步培养；

(3)细胞定向培养：取收集的上一步培养的细胞，离心1000rpm，去上清液，换用新的无血清SFEM培养液，并和以下细胞因子共同培养细胞：1-10×10^-6mol/L糖皮质激素，50-200ng/ml SCF，10-100ng/ml BMP4，10-100ng/ml IL-3，10-100ng IL-11，50-200ng/mlIGF-1和2-100单位/ml的EPO每2-5天换新培养液，在换2-5次培养液后，获得有核红细胞，收集细胞用于下一步培养；

(4)取收集的上一步获得的有核细胞，将其转移到间充质干细胞铺底的培养瓶内培养3～7天，其中所用的培养液为含2-10单位EPO的无血清培养液SFEM，或者含2-10单位EPO的加20％间充质干细胞滋养液的无血清培养液SFEM；

(5)取上一步培养的细胞在换液时使用不加任何细胞因子的培养液，还在间充质干细胞的环境下培养，此时扩增生成的红细胞，即为无核成熟的红细胞；其中所使用的培养液选自无血清培养液SFEM，或者加20％间充质干细胞滋养液的无血清培养液SFEM。

步骤(1)所述的单个核细胞为单独提取自胎盘源血或者脐带血的单个核细胞，或者为从胎盘源血或者脐带血中提取的单个核细胞的混合物。

所述的从胎盘源血中分离单个核细胞的方法优选：

(1)采用有机溶剂及生理缓冲液清除胎盘组织和脐带外表的透明质粘液，采用机械挤压及酶和生理缓冲液冲洗的方法，冲洗掉任何残留的血液；

(2)收集后的胎盘源血通过各层尼龙或钢丝滤网，最小的为50um,最大的为100mm，收集单个核细胞；

(3)将以上细胞收集到50毫升的离心管内，在离心机中以1,000rpm离心10分钟，去掉70％的液体，然后按照以下任一方法进行处理：

(a)收集的细胞和淋巴细胞分离液按1:4的比例混合，在离心机中以3,000rpm离心30分钟，去掉残存红细胞以及成熟的粒细胞，收集液面间的细胞，细胞用1640培养液洗二次；

(b)将提取的含有胎盘源血干细胞溶液和6％高分子羟乙基淀粉按1:3到1:6比例混合，800rpm，4℃离心5到20min，弃去红细胞，保留上清液,然后用低分子右旋糖酐(含盐)将其洗涤三次，把所收集的细胞制成单个核细胞混悬液。

本发明发现可以从脐带、胎盘组织提取间充质干细胞，这类干细胞和分化的造血干/祖细胞共同培养可以形成去核成熟红细胞。

提取间充质中干细胞包含以下步骤：(以胎盘组织为例)。

取塑料100cm²或75cm²的培养皿或培养瓶，在培养皿内放到1-5ml的培养液，培养液可用DMEM或2-Mebicm,或1640培养液，其中含有10％的血清，该血清可以是胎盘源血清(FBS)，也可以是无血清培养液，含有细胞刺激因子，像纤维细胞生长因子，白细胞生长因子等，培养时间为每3天换液一次，一直到显微镜下可见有成纤维状的细胞生长，此时，可将组织块去除，每3天换液一次，一直到细胞长满整个培养皿。此时采用胰酶清化细胞，清化的细胞经过用培养液清洗后，可以再次培养和再次保存，此时再次保存的细胞为一代，再次冻融，再次培养，再次收集细胞，应保存为二代，依次类推，目前已经证实一直到传代20代，胎盘间充质干细胞仍然保持原有的特性。

步骤(1)优选采用MACS磁珠从浓缩后的胎盘源血和脐带血单个核细胞中分选CD133⁺CD34⁺的造血前体干细胞，或者采用任何抗CD34或抗CD133的抗体和生物反应素结合，或者和第二抗体结合从浓缩后的胎盘单个核细胞中去分选CD34⁺CD38⁺，CD34⁺CD38^-或CD133⁺CD34⁺的造血前体干细胞以及红系干/祖细胞CD34⁺CD72⁺。

采用MACS磁珠从浓缩后的胎盘单个核细胞中分选CD133⁺CD34^－的早期造血前体干细胞的方法优选：用抗CD133磁珠单克隆抗体从单个核细胞中先分选出CD133阳性细胞群，然后再从CD133阳性细胞群中应用抗CD34磁珠单克隆抗体分选出其中的CD133⁺CD34^-细胞群。

步骤(2)中所述的细胞因子及其浓度优选：1×10^-6mol/L糖皮质激素，100ng/mlSCF,100ng/ml Flt3-L,15ng/ml BMP4,15ng/ml IL-3,15ng/ml IL-11和3单位/ml EPO。

步骤(4)和步骤(5)中所述的间充质干细胞通过以下方法获得：提取并培养胎盘间充质干细胞，待其其长满培养皿，然后采用丝裂要素C灭活间充质干细胞，使其不能再繁殖和生长，然后再和定向培养后的胎盘源血和脐带血单个核细胞或造血干细胞共同培养置备成熟红细胞。

所述的制备成熟红细胞的方法还包括收集无核的成熟红细胞，用于红细胞功能的各种鉴定以及保存无核的成熟红细胞。

所述的制备成熟红细胞的方法还包括对需要扩增和制备成熟红细胞的脐带血和胎盘源血先做血型检测，如果是O^－，这样获得的无核成熟红细胞为万能用血。

本发明方法中无核的成熟红细胞采用加甘油深低温冰箱-80-120℃保存方法；在需要细胞时，用甘油保存的细胞采用快速复温的方法，对无核成熟红细胞复苏，然后用生理盐水洗涤去甘油。

所述的糖皮质激素是一类肾上腺皮质激素的总称，可选自强多松，强的松龙，可(考)的松，地塞米松等，在本发明中优选地塞米松，它的效能最强。

按照本发明所述方法制备的成熟红细胞临床上可以用于下列疾病：

外伤出血，

手术用血

慢性病用血

遗传病，尤其是溶血性疾病用血

各种溶血性疾病

发明描述

本发明是以健康人胎盘，脐带为原料，分离其中的单个核细胞，然后以这个单个核细胞，或从中纯化的造血干细胞(CD34⁺、CD133⁺)，或来自于胎盘源血中红细胞形成细胞等为起始原料，再和来自于胎盘，脐带分离，培养的间充质干细胞作为基质细胞，在体外诱导，扩增使其向红细胞方向分化，为体外大规模产业化生产用于临床的成熟红细胞。

1.提取来自于胎盘源血内的单个核细胞

2.提取来自于脐带血内的单个核细胞

3.合并脐带血和胎盘源血内的单个核细胞数

4.纯化脐带、胎盘源血内的CD34⁺细胞群

5.纯化脐带、胎盘源血内的CD133⁺细胞群

6.先用PBS(磷酸缓冲液)做1：1稀释，然后置于淋巴细胞分离液表面(Histopaqnt)以450g，离心30分钟，取出表面的分层细胞，再用5溶的PBS稀释，再450g，30分钟离心，此即为单个核细胞。(1-100×10⁵/ml、)(这步是获得去掉红细胞的单个核细胞,是进步纯化单个核细胞)。

7.取1×10⁶/ml的单个核细胞置入培养瓶，所用的培养液为无血清培养液，Stemspa，SFEM(stemcell technologies，Cat：501强智公司)并和以下细胞因子共同培养细胞，1-10×10^-6mol/L糖皮质激素，50-200ng/ml SCF，50-200ng/ml FIt3－L，10-100ng/mlBMP4，10-100ng/ml IL-3，10-100ng/ml IL-11和1-10单位EPO/ml,每3-5天取细胞离心，更换新培养液。这步为干细胞扩增，并定向扩增为红细胞干/祖细胞。

8.在换2-5次培养液后，还是用同样SFEM培养液，换用细胞刺激因子，1-10×10－⁶mol/L糖皮质激素，50-200ng/ml SCF，10-100ng/ml BMP4，10-100ng IL-11和1-10单位EPO/ml，停用FIt3－L以及加50-200ng/ml，IGF-1和1-10单位/ml的EPO，每3-5天取细胞离心，更换培养液。这步为在定向扩增为红细胞干/祖细胞的同时向有核红细胞分化。

9.在换2-5次培养液后，细胞转移到在间充质干细胞铺底的培养瓶内，此时还用SFMM，但仅比上述培养要低的EPO浓度，一般在2单位/ml EPO。此步为向有核红细胞分化的同时向成熟红细胞形成。

10.中间不换液，培养3-7天，取细胞在换液时不加任何细胞刺激因子，还在间充质干细胞的环境下培养，此时扩增生成的红细胞，应为无核成熟的红细胞。

11.对上述培养的细胞可以检测其红细胞生成能力，分别取O，7，14天的单个核细胞检测CFU-E，BFU-E和CFU-GM等的集落生成能力，采用来自于强智公司购买的干细胞集落培养基做为集落细胞培养

12.生成红细胞鉴定。

a)形态鉴定：用Gemsa染色

b)流式细胞分析：采用血型蛋白A抗体，用流式分析。

c)红细胞功能测定。

发明详述

本发明所述的造血干/祖细胞为一群CD34⁺细胞群，在脐带血中这群CD34⁺中大部份为CD133⁺CD34⁺，只有小部份为CD133⁺CD34^-

本发明所述的造血前体干细胞为：CD133⁺CD34⁺干细胞群，它存在于脐带血中，占有很大比例。

本发明所述的早期造血前体干细胞，为CD133⁺CD34^－干细胞群在脐带血中含量非常低。在胎盘源血中，这三种干细胞群都存在，而造血前体干细胞和早期造血前体干细胞在胎盘中其浓度近乎相等。

在胎盘中，其干细胞的发育程度为CD133⁺CD34^-，也可能向血管内皮祖细胞发展：

CD133⁺CD34^－-——CD133⁺CD34⁺——CD133^-CD34⁺。

然后为：

粒细胞干/祖细胞

红细胞干/祖细胞

淋巴干/祖细胞

巨核干/祖细胞

在本发明中提到浓缩胎盘源血中的造血干细胞，(采用如淋巴细胞分层液)实际上这样获得的干细胞，是包含着这所有三个发育阶段的干细胞，不含有成熟的红、白细胞，但含有相当多的间充质干细胞。而在脐带血中浓缩和采用淋巴细胞分层液得到的细胞，实际上其CD34⁺细胞只占200-500分之一，大部份是分化后的干/祖细胞或成熟的粒性或淋巴及单核细胞。胎盘和骨髓中的造血微循环是有区别的，胎盘中的干细胞造血微循环只能不断生成干细胞，其中CD133⁺CD34^-绝大部份只存在胎盘内自身复制，而CD133⁺CD34⁺和CD133^-CD34⁺除了不断复制以外，其自身也存在分化，同时也不断进入脐带血液，通过脐带血进入骨髓，在骨髓中分化为各个阶段的成熟细胞，而在胎盘本身的微循环内这些干细胞并不能分化成熟为终未细胞，要成为终未细胞必须加入各种刺激因子，这些刺激因子有帮助干细胞复制的功能，像SCF，Fil-3，IL-6，IL-II等，也有帮助干细胞进一步分化为终未细胞的像EPO，G-CSF，TPO，IL-2，IL-3。

本发明制备成熟红细胞的方法包含以下步骤：

1.收集胎盘源血：在无菌环境下，收集残留在胎盘内的血，命名为胎盘源血。

收集的胎盘源血均通过各层尼龙或钢丝滤网，最小的为50um,最大的为100mm，收集单个核细胞。脐带血不用过滤。

将来自于胎盘源血的细胞收集到50毫升的离心管内，在离心机中以800离心10分钟，去掉70％的液体。然后可有以下二种方法。

一种是：收集的细胞和淋巴细胞分离液按1:4的比例混合。在离心机中以3,000rpm离心30分钟，去掉残存红细胞以及成熟的粒细胞，收集液面间的细胞，细胞用1640培养液洗二次。

另一种方法是将脐带血或胎盘源血和6％高分子羟乙基淀粉(Hespan,大于60，000道尔顿)按1:3到1:6比例混合，800rpm(500到1,000g)，4℃离心5到20分钟，弃去红细胞，保留上清液,然后用低分子右旋糖酐(含盐)将其洗涤三次，把所收集的细胞为浓缩单个核细胞，将其制成单个核细胞混悬液，并做单个核细胞计数，测定细胞活性，计算CD34、CD4、CD8细胞含量及做体外培养的白细胞集落(CFU-GM)，红，白细胞集落(CFU-GEMM)和间充质集落(CFU-F)。

提取胎盘造血前体干细胞(以此为例)：技术已经成为细胞磁性可以分选CD34阳性和CD133阳性的细胞金标准，有其强大的优势和广泛的用途：从小量分选到大规模分选，从高频细胞到稀有亚群的细胞分选，可以高效的、可重复的及高质量的细胞分离结果来自于胎盘内的干细胞群，可以实现细胞的全自动分选，而不需要专门的人员或技巧。细胞分选试剂可以从各种物种和样品中获得几乎所有类型的细胞，选柱用于快速分选被MACS磁珠标记的细胞，细胞即可被分选柱放大的磁场捕获。温和的分选环境，在保证细胞的回收率和纯度的同时，更保护了细胞表面抗原表位，因此，分选得到的细胞表位完好，细胞功能不受影响，用于从抗凝处理的全血中快速进行细胞的阴性分选，最多一次处理30mL全血，无需密度梯度离心等步骤，可以加速红细胞的沉降，以便去除非目的细胞，即可方便地从上清液中获得目的细胞。先采用含抗CD133的磁珠抗体从胎盘干细胞中浓缩纯化含CD133⁺的细胞，再用抗CD34磁珠抗体从含CD133⁺的细胞群内分离出CD133⁺CD34^-的干细胞群，从磁珠柱子流出的细胞即为早期造血前体干细胞。(4)还包含从脐带血和胎盘源血中其它组分的造血干细胞群：

1)这种细胞群来自于去除脐带血后残留在胎盘内的血液获得的单个核细胞。

2)这种细胞群在流式细胞仪(FACS)的检测中为CD34⁺CD38^-CDlin^-和CD34⁺CD38⁺CDlin⁺，几乎不存在于正常人周围血，但也存在于脐带血中。

3)这种干细胞包括二类干细胞，一类为CD34⁺CD38^-CDlin^-，的干细胞群，另一类为和CD34⁺CD38⁺CD lin⁺的干细胞，这2类干细胞都存在于提取的胎盘源血干细胞内，它可以通过胎盘分离浓缩后于液氮内长期保存。

4)这种细胞在有干细胞刺激因子(G-CSF，EPO)的培养液中，具有大量增殖的功能，可以扩增到1000倍以上，其扩增后的终未细胞主要为红细胞系，(EPO的刺激下)，但如果和白细胞刺激因子共同培养，也可扩增为大量的白细胞。

表1

从表1中可分析：脐带血中CD34⁺CD38⁺占全血比例为0.2689±0.1133，细胞总数为1.2900±0.9313X10⁶；胎盘源血中CD34⁺CD38⁺占全血比例为0.243±0.487，细胞总数为2.385±1.214X10⁶；

表2

从表2中可分析：脐带血中CD34⁺CD38^－占全血比例为0.1313±0.0905，细胞总数为0.6350±0.5130X10⁶；胎盘源血中CD34⁺CD38⁺占全血比例为0.217±0.191，细胞总数为1.3345±0.2428X10⁶

5)从胎盘组织内可以采取组织小块贴壁培养或用胰酶、胶原酶消化的方法提取和培养胎盘源间充质干细胞。每克组织可以提取1X10⁴个细胞，而在贴壁生长的细胞可以传20代以上。2.培养生成红细胞。

共分以下步骤

第一步

纯化单个核细胞

也可用纯化的CD34⁺或CD133⁺干细胞

加干细胞扩增培养液

第二步

(5-15天)

干细胞定向干/祖细胞扩增——定向红干/祖细胞

第三步(5-15天)

向成熟红细胞扩增——有核红细胞去核

第四步(3-7天)

把已经培养好的间充质干细胞用同位素钴60照射或丝裂霉素C孵育30分钟灭活该干细胞的繁殖能力，然后再和需扩增的干细胞共同培养

有核红细胞去核，生成成熟红细胞

第五步(5-15天)

收集红细胞，各种检测

第六步(1-3天)

保存单个核细胞或纯化的造血干细胞(当提取的单个核细胞不需要一次性用完时，可以一部分用于红细胞扩增，其余部分深低温保存，待需要时可以复苏，再次用于红细胞扩增。

此方案中，大约3－10天后可以由干细胞生成红系细胞，然后迅速进入终末分化。10－25天后，有核红细胞分化成为成熟红细胞。

6.总结具体步骤如下：

(1)提取单个核细胞，

从胎盘源血+脐带血混和血中提取单个核细胞

从胎盘源血提取单个核细胞

从脐带血提取单个核细胞

收集来自于同源性的UCB和UPB对其相应的造血干细胞进行分析NC，特异性标志的干细胞，细胞活性等见表3和表4。可以看出UPB的NC是UCB的2-3倍，CD34阳性造血干细胞是UCB的1.5倍。

表3.来自于脐带血

表4.来自于胎盘源血

分别总结了来自同一个UCB和UPB合并后的NC和CD34⁺细胞的含量，分别为22.96±19.94(x108)和4.51±3.03(x106)。其中，含有CD133⁺CD34⁺和CD133⁺CD34^－细胞分别为1.18±1.78(x106)和0.64±1.42(x106)，

表5.脐带血和胎盘源血的总干细胞数

保存单个核细胞

采用单克隆CD34抗体或CD133抗体纯化来自于脐带血或胎盘源血的CD34⁺或CD133⁺干细胞。

保存纯化的CD34或CD133阳性干细胞。

(2)从单个核细胞或纯化的CD34或CD133阳性细胞中扩增干细胞。

取1-10×10⁶/ml单个核细胞或1-10×10⁴/mlCD34或CD133阳性细胞接种到无血清培养剂(Stemspan ^R SFEM，stemcell technologies强智公司代理)，同时添加各种细胞因子，包括以下但不限于还增加其它的细胞因子，1-10×10^-6mol/L糖皮质激素，50-200ng/mlSCF,50-200ng/ml FLT3-L,10-100ng/ml BMP4,10-100ng/ml IL-3,10-100ng/ml IL-II和1-10单位/ml EPO每3天更换新鲜培养液，如果细胞长到70％，要求细胞稀释3-10倍再继续培养。(3)第三步，细胞定向培养

收集第二步培养的细胞，离心1000rpm，去上清液，换用新培养液，但换用细胞刺激因子为-10×10^-6mol/L糖皮质激素，50-200ng/ml SCF，10-100ng/ml BMP4，10-100ng IL-11，50-200ng/ml IGF-1，10-100ng/ml IL-3，和2-100单位/ml的EPO每2-3天换新培养液，要使细胞浓度在10⁶/ml以下，如果高于此浓度，要用培养液稀释。

(4)第四步：成熟红细胞扩增

首先培养来自于人胎盘或脐带的间充质干细胞，此干细胞可以有二种方法。

1.酶消化：收集间充质干细胞：离心收集干细胞以及从胎盘组织分离羊膜和绒毛膜组织，用生理盐水洗涤后剪碎，采用0.25％的胰酶(Trypsin)或0.1-1％的胶原酶II(Collagenase)，或0.5％Dispense II酶，或加入0.05到0.2％的(Ethylene diamine tetraacetic acid)(EDTA)，在37度温箱内孵育或搅拌30到60分钟，收集、过虑、离心获得的细胞为胎盘间充质干细胞。

2.组织块培养法：提取胎盘间充质干细胞：把胎盘组织用无菌剪刀切开，减去羊膜，剪解胎盘组织，把组织剪成1-5立方厘米大小组织，然后置于离心管内800G，20分钟离心弃上清液，置于培养皿内培养。

胎盘间充质干细胞的培养：取塑料100cm²或75cm²的培养皿或培养瓶，在培养皿内放到1-5ml的培养液，培养液可用DMEM或2-Mebicm,或1640培养液，其中含有10％的血清，该血清可以是胎盘源血清(FBS)，也可以是无血清培养液，含有细胞刺激因子，像纤维细胞生长因子，白细胞生长因子等，培养时间为每3天换液一次，一直到显微镜下可见有成纤维状的细胞生长，此时，可将组织块去除，每3天换液一次，一直到细胞长满整个培养皿。此时采用胰酶清化细胞，清化的细胞经过用培养液清洗后，可以再次培养和再次保存，此时再次保存的细胞为一代，再次冻融，再次培养，再次收集细胞，应保存为二代，依次类推，目前已经证实一直到传代20代，胎盘间充质干细胞仍然保持原有的特性。

1)培养间充质干细胞，待其长满培养皿，然后采用丝裂要素或同位素灭活这些间充质干细胞，使其不能再繁殖和生长。用于与有核红细胞联合培养。

2)培养间充质干细胞，在长满培养皿后，收集它的上清液，称为间充质干细胞滋养液，用于和SFEM配制成20％的细胞培养液(即20％间充质干细胞滋养液，80％SEFM)。取成熟红细胞扩增后的细胞，置于20％的细胞培养液中，和上一步采用丝裂霉素或同位素灭活这些间充质干细胞一起培养，此培养液中不加任何细胞因子，仅加EPO，其浓度在1-5单位/ml。

从提取后的胎盘组织内用胰酶消化可以分离出大量的MSCs细胞，而从脐带组织中也可培养出MSCs，表6分别采用造血干细胞的标记CD133、CD34和间充质干细胞的标记CD29和CD105去分析和比较这四种胎盘不同部位来源的间充质干细胞。

表6.用流式细胞术检测来自UCB，UPB，PMSC and UMS四种不同来源的间充质干细胞数据.

(5)第五步：培养成熟红细胞

在换液后，细胞和含有间充质干细胞一起培养，此时不加任何因子也不用EPO，使细胞生长培养，此过程中红细胞会成熟，去掉细胞核，成为无核的红细胞。

第六步：收集无核的红细胞，用于红细胞功能的各种鉴定

形态鉴定：用Gemsa染色

流式细胞分析：采用血型蛋白A抗体，用流式分析红细胞形成；用可以和DNA结合的萤光染料Syto－16检测细胞核是否存在。

红细胞功能测定；像和氧气结合能力，细胞形态，渗透压等。

对上述培养细胞细胞可以检测其红细胞生成能力，分别取O，7，14天的单个核细胞检测CFU-E，BFU-E和CFU-GM等的集落生成能力，采用培养基为集落细胞生成液。

附图说明

图1为同源性的脐带血加胎盘源血的NC细胞总量。1为同源性的UCB加UPB的NC细胞总量；2为同源性的UCB加UPB的CD34阳性细胞总量。

图2采用流式细胞仪检测脐带血和胎盘源血CD34+造血干细胞的含量。从该图中可以证实胎盘源血中也含CD34+造血干细胞。A～D图为脐带血结果，E～H图为胎盘源血结果。

A图和E图中P1门圈出的为CD45阳性白细胞群，左下角为红细胞碎片，P5圈出的为淋巴细胞群，CD45强阳性，SSC较小；B图和F图中P3门圈出CD34阳性、SSC较小的所有细胞(此处省略了P2[Live]门所涉图，P2门为PI染料圈出的活细胞)，P3门的左边界参考同型对照组而来；C图和G图中P4门圈出CD45弱阳性、SSC较小的细胞，造血干细胞应为CD45弱阳性；D图和H图中P6门圈出淋巴细胞和稍微大一点的原始细胞，可明显看出呈群分布，因此P6门圈出的即为CD34+造血干细胞数目，造血干细胞的比例为P6数目/P1数目。

图3 24小时和14天脐带血(UCB)和胎盘源血(UPB)的集落、克隆培养的比较。来自脐带血和胎盘源血的单个核细胞分别做了24小时和14天的CFU-GM和CFU-GEMM集落细胞培养。胎盘源血在24小时就能够生成红细胞和白细胞集落，而在14天后其集落相互之间融合成大和成片细胞。而脐带血在24小时内几乎没有集落，大都为细胞簇(Cluster)，在14天后生成红细胞和白细胞集落。

图4比较脐带和胎盘源血内的前体造血干细胞，即CD133阳性细胞群。A～D图为脐带血，E～H图为胎盘源血。结果显示出在脐带血中的CD133⁺和在胎盘源血中的CD133⁺细胞都有表达，但脐带血中的CD133⁺CD34^－几乎没有，而在胎盘源血中其含量几乎和CD133⁺CD34⁺细胞群相等。

A图和E图中P11门圈出CD133阳性、SSC较小的所有细胞(P11门来自于P2[Live]门，P2门为PI染料圈出的活细胞，P1门则为圈出的CD45阳性细胞群，此处已省略该图，可参考CD34+检测图A)，P11门的左边界参考同型对照组而来；B图和F图中P12门圈出CD45弱阳性、SSC较小的细胞，造血前体干细胞应为CD45弱阳性(参照CD34+检测)；C图和G图中P13门圈出淋巴细胞和稍微大一点的原始细胞，可明显看出呈群分布，因此P13门圈出的即为CD133+造血前体干细胞数目，造血前体干细胞的比例为P13数目/P1数目；D图和H图为CD133+细胞群中的CD34表达，D图可看出脐带血CD133+细胞群中大部分为CD34+细胞，含有少量CD34-细胞；H图可看出胎盘源血CD133+细胞群中除了含有CD34+细胞外，还含有几乎等同量的CD34-细胞，这是和脐带血所不同的。

图5比较了前体造血干细胞在脐带血和胎盘源血中的含量。CD133⁺细胞总数无显著性差异P>0.5,但CD133⁺C34^—细胞在二者的含量有显著性差异P>0.0001。

图6把分离后的CD133阳性细胞群和阴性集落细胞群分别做CFU检测。我们采用CD133⁺细胞分离试剂盒可以把CD133阳性和阴性细胞群从UPB中分离，把分离后的这两个细胞群分别做CFU检测。CFU细胞培养24小时后在CD133^-细胞群中的CFU-GM和CFU-GEMM有细胞集落形成，而在CD133⁺细胞群中CFU-GM和CFU-GEMM没有集落，只有至少数的细胞簇(cluster).14天后，CD133^-的细胞集落中，集落细胞开始减少，而CD133⁺细胞群中CFU-GM和CFU-GEMM的集落开始生长，25天以后，CD133^-的CFU集落开始消失成为散在单个细胞而CD133⁺的CFU-GEMM和CFU-GM有集落细胞生长。

图7采用流式细胞仪分析脐带血和胎盘源血内的MSCs(间充质干细胞)。纵坐标为细胞数，横坐标位荧光反映强度。分析胎盘源血中含有比脐带血更大量的MSCs。采用流式细胞仪分析胎盘源血和脐带血内的MSCs。免疫分型抗体为CD105和CD29。胎盘源血含有大量的CD105和CD29双阳性细胞，而脐带血中几乎不含有这类细胞。A～D图为脐带血，E～H图为胎盘源血。

A图和E图中左侧下角为细胞碎片，呈现明显分群的三群细胞分别为淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞(自下而上)，P1门圈出的为淋巴细胞，间充质干细胞存在于淋巴细胞群中；B图和F图显示的为CD105和CD29的表达，其中CD105+CD29+细胞可视为间充质干细胞，C、G图和D、H图显示的为单一CD105和CD29的表达。

图8显示具有间充质免疫学标记CD29、CD105或具有双阳性标记的脐带和胎盘源血的细胞，由图可见UPB中含有更多的这种细胞，二者有明显的统计学差异(P<0.001)。

图9比较提取和培养来自于脐带组织，胎盘源血，胎盘实体组织，胎盘羊膜，绒毛膜的间充质干细胞的形态学，A为UPB、B为UCB、C为PMSCs、D为UMSCs，显然，从形态学上这些细胞无差异，都是在培养中呈贴壁纤维样细胞生长。

图10：采用流式分析脐带血中CD34和CD38细胞，P3门圈出CD34阳性、SSC较小的所有细胞,(P11门来自于P2[Live]门，P2门为PI染料圈出的活细胞，P1门则为圈出的CD45阳性细胞群，在左侧方格上方为CD34⁺和CD38⁺细胞，在左侧方格下方为CD34⁺和CD38^—细胞。

图11：采用流式分析胎盘源血中CD34和CD38细胞，P3门圈出CD34阳性、SSC较小的所有细胞,(P11门来自于P2[Live]门，P2门为PI染料圈出的活细胞，P1门则为圈出的CD45阳性细胞群，在左侧方格上方为CD34⁺和CD38⁺细胞，在左侧方格下方为CD34⁺和CD38^—细胞。

图12：胎盘源血中能分化，增殖成定向红细胞系—干/祖细胞簇

图13:胎盘源血中具有扩增能力的干细胞簇

图14:第一步：胎盘和脐带血中分离的单个核细胞(富含造血，CD133⁺或CD34⁺干细胞)，这是制造红细胞的起源细胞。图放大200倍。

图15：第二步：胎盘和脐带血中分离的单个核细胞(富含造血，CD133⁺或CD34⁺干细胞)在SCF，IL和EPO等刺激因子的作用下，分化增生，可增生到百万倍。其中有大量的红细胞和有核细胞。图放大400倍

图16：第三步：红细胞定向培养。第一阶段：培养的细胞中有大量细胞死亡，细胞数下降，这些死亡细胞是在培养前已经分化成熟的白细胞。图放大400倍

图17：第三步：红细胞定向培养。第二阶段：培养的细胞中有大量细胞生成，细胞数大量增多。图放大400倍

图18：第三步：红细胞定向培养。第三阶段：培养的细胞中有大量细胞生成，白细胞和有核红细胞数大量增多。图放大400倍

图19：第四步：成熟红细胞扩增。红细胞定向培养。培养的细胞中有大量细胞生成，大量有核红细胞数生成。图放大400倍。

图20：第五步：培养成熟红细胞。干细胞在含EPO培养液中经培养，可见大批细胞转化成带有血红蛋白的细胞。

图21:横坐标为CD71-APC荧光强度纵坐标为CD34-PE荧光强度，左图为脐带血CD71&CD34的表达，右图为胎盘源血CD71&CD34的表达，从图中可明显看出胎盘源血比脐带血含有更多CD71+CD34+细胞，其含量约是脐带血的10-15倍。

图22：同源脐带血、胎盘源血体外制备红细胞流程图

注1：如果同源性脐带血和胎盘源血的血型为O^-，这样以后培养出来的人造血即为万能红细胞。

注2：

(1)有核细胞计数，

(2)红细胞计数，

(3)血红蛋白定量，

(4)流式细胞仪(CD45,CD133,CD34)干细胞间充质干细胞(CD105,CD29)定性、定量，

(5)集落细胞CFU-E、CFU-GM、CFU-GEMM定量，

(6)细胞染色(单个核细胞，有核红细胞，网织红细胞)，

(7)红细胞系统分化细胞定性、定量(早幼、中幼、晚幼红细胞)，

(8)红细胞膜蛋白定量(血型蛋白A抗体)，

(9)有核细胞冰冻保存(采用DMSO冰冻保存)，

(10)无核红细胞冰冻保存(采用甘油冰冻保存)，

(11)红细胞结构和功能分析：红细胞体积，平均血红蛋白量葡萄糖6磷酸膜氢酶含量，丙酮酸激酶含量。

(12)成熟红细胞应用(动物实验，临床试验)。

注3：体外扩增造血干细胞也可和造血干细胞体外定向扩增分化合为一步。

注4：体外造血干细胞定向分化增值也可和体外造血干细胞定向分化有核红细胞合为一步

具体实施方式

实施例1收集胎盘单个核细胞和造血干细胞

首先，征得孕妇或其直接亲属同意捐献胎盘组织后，查阅孕妇的所有检验报告，证实无任何的病毒、梅毒等和血液有关的病毒感染，然后详细询问孕妇的生育、疾病、遗传、感染等病史，在一切均为正常后，孕妇分娩后，无菌收集胎盘和脐带血。收集完后的脐带血及胎盘组织均附有条形码标签，存放于4℃冰箱。存放时间一般不超过48小时。收集的脐带血采用流式细胞仪检测造血干细胞标记CD34的含量以及造血干细胞的集落培养。

收集胎盘必须征得孕妇的同意，并签订同意书，孕妇和其亲人不得有各种传染病，像肝炎，艾滋病(AIDS)等，当产妇逸出胎儿后，不得干扰母亲和胎儿治疗，等胎儿溢出后，无菌的获取胎盘，无菌的保存到胎盘盒内以无菌的运输到公司。在运输时的温度为4-20℃，时间在36小时以内，胎盘到公司后，在无菌的环境中打开胎盘，采用无菌生理盐水，并放生理盐水、磷酸缓冲液、DMEM或1640培养液等冲洗胎盘，一直到胎盘外的剩余血都冲洗完毕。在脐静脉靠近胎盘组织内，温度以20-40℃要求，可以清楚看到导管进入到胎盘源血管内，然后用无菌胶布在脐静脉和导管处固定，采用同样的方法，用两根导管分别插入脐动脉内，并以固定，然后这些导管外接一个输液袋，来清洗胎盘24-36个小时，在此过程中，可以不断挤压胎盘，使胎盘内的液体不断流到收集瓶中，收集瓶中的液体体积一般在300-2000毫升之间。收集液内可以含有50-100/ml单位的青霉素或50-100微克/ml的链霉素以及1-10单位/ml的肝素。清洗液为生理盐水，磷酸盐缓冲液或DMEM-1640培养液，导出流速为每分钟10-50毫升，挤压胎盘速度可在开始较慢以后而加快。当流出液不再发红，或细胞数低于100/毫升时，此时收集的液体为胎盘源血，里面的细胞为胎盘源血细胞。

在离心机内400g，10分钟，室温收集的细胞再用PBS，生理盐水或细胞培养液洗涤，收集的细胞计数，测完活性，活性需大于90％。

采用MACS细胞磁珠分选法分选从胎盘源血单个核细胞中分离出造血前体干细胞。其原理是采用和磁珠相结合的抗CD34或抗CD133单克隆抗体来进行CD133⁺CD34^-的造血前体干细胞的分选。由于MACS细胞磁珠分选法有放大的磁珠捕获，温和的分选环境，能够保证细胞的活性和回收率以及纯度，因而本发明以其为代表来分选，纯化来自于胎盘源血的造血前体干细胞，其方法分为二部分：首先采用磁珠和抗CD133抗体从浓缩后的胎盘源血干细胞群中分离出所有CD133阳性的细胞。然后再用磁珠和抗CD34抗体和分离出的CD133阳性细胞反应，分离出其中CD34阴性的细胞。以下以小柱子为例：分离胎盘源血或胎盘组织中单个核细胞按1∶2的比例加到淋巴细胞分层液体表面，，400g常温离心30min，小心吸取中间白细胞层的单个核细胞到50ml离心管中，加磷酸缓冲液洗3次。

采用购自于的MACS公司的磁珠抗体标记法分选CD133⁺CD34⁺前体造血干细胞。来自于加磷酸缓冲液洗后的细胞，换用含牛血清蛋白的缓冲液体，单个核细胞调整到1×10⁸到1×10⁹之间，加入FcR阻断剂充分混匀后4℃孵育30min，然后再加入带有鼠抗人CDl33单克隆抗体和磁珠相结合的试剂，充分混匀后4℃孵育60min，期间不断反复混匀，取出后放到一个具有强而稳定磁场背景的CDl33⁺分选柱，把所有液体通过柱子，和磁珠结合的抗CDl33⁺细胞抗体和具有CD133抗原的细胞相结合而滞留在柱里，不具有CD133抗原的细胞不会和磁珠结合而被洗出，这里含有人们常提到的CD133^－CD34⁺细胞。把分选柱移出磁场，因为没有了磁场，可以用缓冲液把滞留在柱内的CDl33⁺细胞洗脱下来，这里包括CD133⁺CD34⁺和CD133⁺CD34^－细胞。应用以上相同原理，然后再加入的是带有鼠抗人CD34单克隆抗体和磁珠相结合的试剂，而开始孵育的细胞是CD133⁺CD34⁺和CD133⁺CD34^－细胞。洗脱的细胞为CD133⁺CD34^－，而在柱子内滞留，然后洗脱的为CD133⁺CD34⁺细胞。

对需要扩增和置备成熟红细胞的脐带血和胎盘源血先做血型检测，如果是O^－，这样按照实施例5获得的无核成熟红细胞即为万能用血。

实施例2：胎盘早期造血前体干细胞流式和干细胞检测的特征

胎盘造血前体干细胞在浓缩分离后都需要在表面标记上观察细胞的特征，常用的技术有流式细胞仪(Flowcytometry)和免疫细胞化学(immunocytochemistry)和分子生物学技术检查细胞DNA或RNA等基因的变化，常采用PCR或RT-PCR等方法，常发现这类造血前体干细胞的表面标记为CD133⁺CD34⁺，而早期造血前体干细胞的表面标记为CD133⁺CD34^－，较为普遍的是胎盘造血前体干细胞在即将分化成单向干细胞时的表面标志为CD34^－，CD38^－，而CD133⁺，若是向血液系统细胞分化时，其表面标志进一步特征为CD34⁺，CD38⁺，和CD133^－。

实施例3胎盘间充质干细胞的培养

提取的胎盘间充质干细胞以DMEM，1640或培养液加50-100/ml单位的青霉素，50-100/微克/ml的链霉素，1-10单位/ml的肝素。10-20％的小牛或胎牛血清，也可用人AB血清，培养液中可以有像CSF，白细胞刺激因子，干细胞刺激因子的培养液培养胎盘间充质干细胞，也可以采用不加血清仅仅含有各种刺激因子的培养液培养细胞。可以采用100×100cm的培养皿，也可采用75cm²的培养瓶培养胎盘间充质干细胞。也可采用间充质干细胞培养液Mesenchymal Stem Cell Growth Medium，(MSCGM)，第一种方法是组织块细胞在37℃，CO₂5％的培养箱中培养10-15天，非贴壁细胞都在提取培养液时去除。在15天后，即可用显微镜观察到长满盘底的纤维状贴壁细胞。当细胞长满培养皿或培养瓶后，即可用0.25％胰酶-EDTA消化，悬浮贴壁细胞，收集细胞，可以再次培养，也就是细胞传代，本发明的胎盘间充质干细胞可以培养，消化传代，保存，再培养，再扩增，一直可以传代20次，细胞还具有同样的功能，没有变异。第二种方法是采用德国强智公司(美天旎公司)的温和组织处理器，将组织和胶原酶，胰酶一起混和，在处理器中振荡，离心混合约30分钟，去除组织和悬液后用3000-5000转离心20分钟将在底部的细胞和培养液混合在二氧化碳温箱中培养10-15天。

实施例4胎盘间充质干细胞流式细胞检测的特征

胎盘间充质干细胞在贴壁培养后都需要在形态学和细胞表面标记上细胞的特征，常用的技术有流式细胞仪(Flowcytometry)和免疫细胞化学(immunocytochemistry)和分子生物学技术检查细胞DNA或RNA等基因的变化，常采用PCR或RT-PCR等方法，常发现这类间充质干细胞的表面标记为CD10⁺，CD29⁺，CD34^-，CD38^-，CD44⁺，CD45^-，CD54⁺，CD90⁺，SH2⁺，SH3⁺，SH4⁺，SSEA3^-，SSEA4^-，OCT4^-以及ABCP⁺，较为普遍的是胎盘间充质干细胞在即将分化成单向干细胞时的表面标志为CD34^-，CD38^-，而CD133⁺，若是向血液系统细胞分化时，其表面标志进一步特征为CD34⁺，CD38⁺，和CD133^-。

实施例5体外培养红细胞

对需要扩增和置备成熟红细胞的脐带血和胎盘源血先做血型检测，如果是O^－，这样获得的无核成熟红细胞即为万能用血。起始细胞可以是来自于脐带和胎盘源血内的单个核细胞也可以是纯化后的造血干/祖细胞。以下为一个具体实例。

(1)在收集脐带血的同时无菌收集胎盘。

(2)从脐带血中取样做血型鉴定。对ABO血型采用正、反向法，采用3个来源的抗Rh单克隆抗体明确Rh血型，仅用同一来源O^－的脐带血和胎盘源血在体外培养红细胞。这样获得的红细胞为万能用血。

(3)在脐带血内加1:4的高分子羟乙基淀粉，4℃，800rpm，5分钟离心，此方法可以去掉80％以上的红细胞。获得富含白细胞的血浆。把该血浆放于淋巴细胞分离液体界面上，4℃，3,000rpm，30分钟离心，收集在界面上的白细胞层，该层即为脐带血单个核细胞。

(4)对胎盘进行洗涤，用无菌生理盐水冲洗后获得的血为胎盘源血。

(5)对胎盘源血重复步骤(3)，获得胎盘源血单个核细胞。

(6)初始细胞总数为2.8X10⁹，其中CD34⁺为5.62X10⁶，CD133⁺为1.71X10⁶，CD133⁺CD34^—为2.62X10⁵，CD34⁺CD38⁺为4.75X10⁶、CD34⁺CD38^-为1.76X10⁶。此次实验将脐带血和胎盘源血单个核细胞混合。

(7)采用部分单个核细胞做实验，多余的细胞放置5个冰冻袋中保存，可以为以后复苏再用。

(8)取1x10⁶/ml的单个核细胞置入培养瓶，所用的培养液为无血清培养液SFEM并和以下细胞因子共同培养细胞：10^-6mol/L地塞米松，100ng/ml SCF,50ng/ml Flt3-L,15ng/ml BMP4,15ng/ml IL-3,15ng/ml IL-11和3单位/ml EPO，每3天取细胞离心，更换新培养液，在换3次培养液后收集细胞用于下一步培养；

(9)细胞定向培养：取收集的上一步培养的细胞，离心1000rpm，去上清液，换用新的无血清SFEM培养液，并和以下细胞因子共同培养细胞：10^-6mol/L地塞米松，100ng/mlSCF，15ng/ml BMP4，15ng/ml IL-3,15ng/ml IL-11，50ng/ml IGF-1和4单位/ml的EPO每2-5天换新培养液，在换3次培养液后，获得有核红细胞，收集细胞用于下一步培养；

(10)取收集的上一步获得的有核细胞，将其转移到间充质干细胞铺底的培养瓶内培养7天，其中所用的培养液为含2单位/ml EPO的无血清培养液SFEM。

(5)取上一步培养的细胞在换液时使用不加任何细胞因子的培养液，还在间充质干细胞的环境下培养，此时扩增生成的红细胞，即为无核成熟的红细胞；其中所使用的培养液选自无血清培养液SFEM。

实施例6体外培养的红细胞检测

流式细胞术分析：各阶段培养的细胞：用PBS/洗涤1次，然用于染色有核细胞和血型糖蛋白A抗体(anti-glycophorin A-PE)，用于染色红系细胞，重悬上样流式细胞仪分析。

红细胞结构和功能鉴定：取培养结束时得到的红细胞，测定平均细胞体积(MCV)、平均血红蛋白含量(MCH)和平均血红蛋白浓度(MCHC)，根据激光衍射程度检测值可得到变形指数(DI)，通过分光光度法测定红细胞葡萄糖6磷酸脱氢酶和丙酮酸激酶的水平。

所用的起始原料可以是胎盘源血单个核细胞、纯化的干/祖细胞或全血细胞，可以是仅仅胎盘源血细胞、也可以是胎盘和脐带血合并后的干细胞。虽然干细胞细胞的扩增能力远高于单个核细胞，但二者都可以用于作为生产红细胞的材料，都得到更多的红细胞。在第1天就可见大的细胞出现，到第4天时就需要不断的分瓶，这是很重要的，过度生长的细胞，很快就会自发性的凋亡，这样可以扩增出大量红细胞。为了观察干细胞在生长、增殖和分化过程中的形态学变化，我们用染色观察。随着培养天数的增加，可以看到细胞向红细胞分化的各个阶段，即从原幼红细胞，早幼红细胞、中幼红细胞，晚幼红细胞分化，最后大多数细胞分化成去核的红细胞，其形态与正常红细胞相似。

这里以单个核细胞干细胞扩增为例：

扩增倍数：单个核细胞在干细胞扩增阶段可达到100-1,000倍，在干细胞到红细胞的定向培养中，单个核细胞可扩增到10-100其中约70-90％为有核红细胞，总的扩增倍数为10³-10⁵

集落培养：在干细胞扩增前的CFU中有大量的红细胞(BFU-E，CFU-E)以及白细胞(CFU-GM)，红白细胞(CFU-GEMM集落形成。当开始干细胞向定向红细胞培养后，可见白细胞和红细胞集落BFU-E逐步减少和红细胞集落而CFU-E逐渐增加，表明干细胞向干/祖红细胞分化，直到红细胞形成。

平均红细胞体积(MCV)：在120到140fl之间(正常人为80-100fl)平均血红蛋白含量(MCH)：35到39pg之间，正常人为29-35pg

葡萄糖6磷酸脱氢酶的含量为30-40u/g血红蛋白(正常人为30－35u/g血红蛋白)

丙酮酸激酶的含量为80-100u/g血红蛋白(正常人为70－85u/g血红蛋白)

七.小结：本专利从胎盘中分离出成人最年轻的干细胞，然后采用一系列检查确认出不存在病毒和细菌等。把分化的细胞可以再培养，再次冰冻保存，几乎可以无限应用。人体内红细胞的生成是非常复杂的，要经过多个步骤才能完成，其中包括红系祖细胞向成熟红细胞的分化。我们的专利表明，将人胎盘干细胞分化并培养成有功能性的携氧红细胞是可行的，这为建立人造血迈出了重要一步。

Claims (9)

1.一种制备成熟红细胞的方法，其特征在于包含以下步骤：

（1）提取并纯化来自胎盘源血的单个核细胞，或提取纯化来自于胎盘源血的造血干细胞CD34⁺CD38⁺、CD34⁺CD38^-、造血前体干细胞CD133⁺CD34⁺、早期造血前体干细胞CD133⁺CD34^-或红系干／祖细胞CD34^＋CD72^＋中的一种或多种；

所述的胎盘源血通过以下方法获得：在无菌的环境中打开胎盘，采用无菌生理盐水、磷酸缓冲液、DMEM或1640培养液冲洗胎盘，一直到胎盘外的剩余血都冲洗完毕，在脐静脉靠近胎盘组织内，温度20-40℃，将导管插入到胎盘源血管内，然后用无菌胶布在脐静脉和导管处固定，采用同样的方法，用两根导管分别插入脐动脉内，并固定，然后这些导管外接一个输液袋，来清洗胎盘24-36个小时，在此过程中，不断挤压胎盘，使胎盘内的液体不断流到收集瓶中，收集瓶中的液体体积在300-2000毫升之间，清洗液为生理盐水，磷酸盐缓冲液或DMEM-1640培养液，含有50-100单位/mL的青霉素或50-100微克/ml的链霉素，以及1-10单位/ml的肝素，导出流速为每分钟10-50毫升，挤压胎盘速度在开始较慢而后加快，当流出液不再发红，或细胞数低于100/毫升时，此时收集的液体为胎盘源血，里面的细胞为胎盘源血细胞；

（2）从纯化的单个核细胞或纯化的CD34⁺CD38⁺、CD34⁺CD38^-、CD133⁺细胞、红系干／祖细胞CD34^＋CD72^＋中的一种或多种中扩增干细胞：取 1x10⁶/ml的单个核细胞置入培养瓶，所用的培养液为无血清培养液SFEM并和以下细胞因子共同培养细胞:1-10×10^-6mol/L糖皮质激素，50-200ng/ml SCF，50-200ng/ml Flt3-L，10-100ng/ml BMP4，10-100ng/ml IL-3，10-100ng/ml IL-11和1-10单位/ml EPO，每3-5天取细胞离心，更换新培养液，在换2-5次培养液后收集细胞用于下一步培养；

（3）细胞定向培养：取收集的上一步培养的细胞，离心1000rpm，去上清液，换用新的无血清SFEM培养液，并和以下细胞因子共同培养细胞：1-10×10^-6mol/L糖皮质激素，50-200ng/ml SCF，10-100ng/ml BMP4 ，10-100ng/ml IL-3，10-100ng IL-11，50-200ng/mlIGF-1和2-100单位/ml的EPO,每2-5天换新培养液，在换2-5次培养液后，获得有核红细胞，收集细胞用于下一步培养；

（4）取收集的上一步获得的有核细胞，将其转移到间充质干细胞铺底的培养瓶内培养3~7天，其中所用的培养液为含2-10单位/mL EPO的无血清培养液SFEM，或者含2-10单位/mLEPO的加20％间充质干细胞滋养液的无血清培养液SFEM；

（5）取上一步培养的细胞在换液时使用不加任何细胞因子的培养液，还在间充质干细胞的环境下培养，此时扩增生成的红细胞，即为无核成熟的红细胞；其中所使用的培养液选自无血清培养液SFEM，或者加20％间充质干细胞滋养液的无血清培养液SFEM。

2.根据权利要求1所述的制备成熟红细胞的方法，其特征在于步骤（1）所述的单个核细胞为单独提取自胎盘源血的单个核细胞。

3.根据权利要求1所述的制备成熟红细胞的方法，其特征在于步骤（1）采用MACS磁珠从浓缩后的胎盘源血单个核细胞中分选CD133⁺CD34⁺的造血前体干细胞，或者采用任何抗CD34或抗CD133的抗体和生物反应素结合，或者和第二抗体结合从浓缩后的胎盘单个核细胞中去分选CD34^＋CD38⁺，CD34⁺CD38^-或CD133⁺CD34⁺的造血前体干细胞以及红系干／祖细胞CD34^＋CD72^＋。

4.根据权利要求3所述的制备成熟红细胞的方法，其特征在于采用MACS磁珠从浓缩后的胎盘源血单个核细胞中分选CD133⁺CD34^－的早期造血前体干细胞的方法为：用抗CD133磁珠单克隆抗体从单个核细胞中先分选出CD133阳性细胞群，然后再从CD133阳性细胞群中应用抗CD34磁珠单克隆抗体分选出其中的CD133⁺CD34^-细胞群。

5.根据权利要求1所述的制备成熟红细胞的方法，其特征在于步骤（2）中所述的细胞因子及其浓度为:1×10^-6mol/L糖皮质激素，100ng/ml SCF，100ng/ml Flt3-L，15ng/ml BMP4，15ng/ml IL-3，15ng/ml IL-11和3单位/ml EPO。

6.根据权利要求1所述的制备成熟红细胞的方法，其特征在于所述的制备成熟红细胞的方法还包括收集无核的成熟红细胞，用于红细胞功能的各种鉴定以及保存无核的成熟红细胞。

7.根据权利要求1所述的制备成熟红细胞的方法，其特征在于所述的制备成熟红细胞的方法还包括对需要扩增和制备成熟红细胞的胎盘源血先做血型检测，如果是O^－，这样获得的无核成熟红细胞为万能用血。

8.根据权利要求6所述的制备成熟红细胞的方法，其特征在于无核的成熟红细胞采用加甘油深低温冰箱-80到-120℃保存方法；在需要细胞时，用甘油保存的细胞采用快速复温的方法，对无核成熟红细胞复苏，然后用生理盐水洗涤去甘油。

9.根据权利要求1或5所述的制备成熟红细胞的方法，其特征在于所述的糖皮质激素选自强多松、强的松龙、可的松或地塞米松。