KR20030034069A - 장치 - Google Patents

장치 Download PDF

Info

Publication number
KR20030034069A
KR20030034069A KR1020027015131A KR20027015131A KR20030034069A KR 20030034069 A KR20030034069 A KR 20030034069A KR 1020027015131 A KR1020027015131 A KR 1020027015131A KR 20027015131 A KR20027015131 A KR 20027015131A KR 20030034069 A KR20030034069 A KR 20030034069A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cells
undifferentiated
cell
committed
receptor
Prior art date
Application number
KR1020027015131A
Other languages
English (en)
Other versions
KR100875089B1 (ko
Inventor
아불자다옐일함모하메드사레사에드
Original Assignee
트리스템 트레이딩 (사이프러스) 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27447916&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=KR20030034069(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from US09/568,254 external-priority patent/US9068164B1/en
Priority claimed from GB0101315A external-priority patent/GB0101315D0/en
Priority claimed from GB0107093A external-priority patent/GB0107093D0/en
Application filed by 트리스템 트레이딩 (사이프러스) 리미티드 filed Critical 트리스템 트레이딩 (사이프러스) 리미티드
Publication of KR20030034069A publication Critical patent/KR20030034069A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100875089B1 publication Critical patent/KR100875089B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/12—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of temperature
    • C12M41/14—Incubators; Climatic chambers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/04—Flat or tray type, drawers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/26—Constructional details, e.g. recesses, hinges flexible
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M27/00—Means for mixing, agitating or circulating fluids in the vessel
    • C12M27/02—Stirrer or mobile mixing elements
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/48—Automatic or computerized control
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0647—Haematopoietic stem cells; Uncommitted or multipotent progenitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K2035/124—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells the cells being hematopoietic, bone marrow derived or blood cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/12—Light metals, i.e. alkali, alkaline earth, Be, Al, Mg
    • C12N2500/14—Calcium; Ca chelators; Calcitonin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/14—Erythropoietin [EPO]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/22—Colony stimulating factors (G-CSF, GM-CSF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/39—Steroid hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/11—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from blood or immune system cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Abstract

본 발명은, 보다 수임된 세포를 보다 수임된 세포의 미분화된 세포로의 역분화를 유도하는 제제와 접촉시키는 수단을 포함하는 미분화된 세포를 제조하는 장치에 관한 것이다.

Description

장치{A device}
분화는, 보다 특수한 세포로 진화되도록 세포의 구조와 기능이 전진적으로수임되는 과정인데, 예를 들면, 미숙한 조혈 전구체로부터 T 세포 또는 B 세포가 형성되는 과정이다. 따라서, 이러한 세포는 보다 잘 수임되기 때문에, 보다 더 특수하게 진화된다. 대부분의 포유류 세포 유형에서는, 세포 분화 과정이 궁극적으로는 분화 세포를 가져다 주는 원-웨이(one-way) 과정이다. 그러나, 몇 가지 세포 유형은 전 생애에 걸쳐 분할되지 않고 또한 대체되지 않은 채로 존속되긴 하지만, 많은 세포 유형들은 해당 유기체의 전 생애에 걸쳐 지속적으로 분할되고 재생된다. 이는 간단한 분할(예: 간 세포)일 수 있거나, 또는 조혈 세포 및 상피 세포와 같은 세포의 경우처럼, 비교적 미분화된 줄기 세포가 분할된 다음 딸 세포 중의 하나에 수임됨으로써, 후속 비가역적 분화를 프로그래밍한다. 그러나, 이들 과정 모두는 특정한 공통적인 양상을 띠는데, 즉 세포가 이들의 분화 상태를 유지하거나 보다 분화된다는 것이다. 이들은 미분화되지 않거나, 심지어 덜 분화되지도 않는다.
역분화(retrodifferentiation)는 덜 특수한 세포로 진화되도록 세포의 구조와 기능이 전진적으로 변화는 과정이다. 몇 가지 세포는 본래, 조직 손상에 반응하여 생체내에서 제한된 역분화를 진행한다. 예를 들면, 간 세포는 간 재생 동안에 태아의 효소 패턴과 유사한 효소 발현 패턴으로 역전하는 것으로 관찰되었다[참조: Curtin and Snell, 1983, Br. J. Cancer, Vol. 48; 495-505].
WO 96/23870에서는, 분화 세포가 줄기 세포를 포함한 미분화 세포가 되도록, 상기 분화 세포를 처리하는 것이 가능하다는 사실이 밝혀졌다. 이들 미분화 세포는 동일한 계통 또는 기타 다른 계통의 재분화 자손을 증식 및 생산할 수 있다. 역분화 조혈 세포의 경우에는, 이들 줄기 세포는 다능성이고, 1종 이상의 세포 계통을 초래할 수 있다. 이러한 WO 96/23870의 생식에 관한 발견은 전혀 예상치 못한 것이었다.
이러한 발견과 관련하여 예상되는 임상 결과는 대단히 크다. 줄기 세포를 사람 환자로부터 획득하는 것은 매우 어려운 일이다. 이들 세포는 전형적으로는 제대 조직, 골수 또는 혈액으로부터 수득하는데, 이들은 극소량으로만 존재한다. 그러나, 본 발명은 특히 역분화 과정에 의해, 보다 수임된 세포로부터 줄기 세포를 생성하기 위한 장치를 제공해준다.
미국 특허 제6,087,168호에는 상피 세포를 신경 세포로 경분화(transdifferentiation)시키는 방법이 기재되어 있는데, 이러한 방법에서는, 상피 세포를 적당한 매질로 탈분화 또는 역분화시킨다. 마찬가지로, 문헌[참조: Lake et al., Journal of Cell Science 113, 556-566(2000) 및 Rathjen J et al., Journal of Cell Science 112, 601-612(1999)]에는 배아 줄기(ES: embryonic stem) 2개의 분리가능한 인자에 반응하여 초기 원시 외배엽 유사(EPL) 세포로 역분화되는 것이 기재되어 있다.
발명의 요약
광범위한 국면에 있어서는, 보다 수임된 세포를 미분화 세포로 역분화시키는 수단을 포함하는, 미분화 세포를 제조하기 위한 장치가 제공된다.
어떠한 선행 기술 문헌[참조예: Lake et al. 또는 Rathjen 등의 미국 특허 제6,087,168호]에도 미분화 세포를 제조하는데 사용하기 적합한 장치가 보고된 바없다. 당업자는 본 발명에 따르는 장치를 사용하지 않고서도 미분화 세포를 제조할 수 있긴 하지만, 이러한 과정이 수행될 때마다 생성되는 최종 생성물은 일관되지 못하고, 그 결과 또한 상기 과정을 수행하는 사람의 기술과 경험에 의존한다. 또한, 미분화 세포를 수 작업으로 제조하는데 소요되는 소위 "핸즈-온(hands-on)" 시간은 길므로, 실험 비용면에서 효율적이지 못하다.
한 특정 양태에서는, 챔버; 수임 세포(committed cell)를 포함한 세포 집단을 챔버내로 도입하기 위한 수단; 수임 세포를 미분화 세포로 역분화시키는 역분화 수단을 챔버내로 도입하기 위한 수단; 및 수임 세포를 미분화 세포로 역분화시키도록, 수임 세포를 역분화 수단의 존재하에 항온배양하는 항온배양 수단을 포함하는, 수임 세포를 포함한 세포 집단에서 미분화 세포를 형성시키고/시키거나 이의 상대적인 수를 증가시키기 위한 장치가 제공된다.
또 다른 특정 양태에서는, 챔버; 수임 세포를 포함한 세포 집단을 챔버내로 도입하기 위한 수단; 수임 세포를 미분화 세포로 역분화시키는 특정 제제를 챔버내로 도입하기 위한 수단; 및 수임 세포를 미분화 세포로 역분화시키도록, 제제를 수임 세포와 함께 항온배양하는 항온배양 수단을 포함하는, 수임 세포를 포함한 세포 집단에서 미분화 세포를 형성시키고/시키거나 이의 상대적인 수를 증가시키기 위한 장치가 제공된다.
바람직하게는, 상기 제제는 수임 세포의 표면에서 항원의 포획, 인식 또는 제시를 매개하는 수용체에 결합된다. 보다 바람직하게는, 상기 수용체는 MHC I부류 항원 또는 MHC II부류 항원, 예를 들면, 사람-백혈구-관련(HLA)-A 수용체, HLA-B 수용체, HLA-C 수용체, HLA-E 수용체, HLA-F 수용체 또는 HLA-G 수용체 중에서 선택된 I부류 항원; 또는 HLA-DM 수용체, HLA-DP 수용체, HLA-DQ 수용체 또는 HLA-DR 수용체 중에서 선택된 II부류 항원이다.
적합하게는, 상기 수용체가 상동 영역을 지닌 β-쇄를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 수용체가 적어도 HLA-DR의 β-쇄의 상동 영역을 포함할 수 있다.
전형적으로는, 수임 세포는 분화 세포이다. 바람직하게는, 이러한 수임 세포는 수임 조혈 세포, 바람직하게는 T-세포 콜로니 형성 세포(CFC-T 세포), B-세포 콜로니 형성 세포(CFC-B 세포), 호산구 콜로니 형성 세포(CFC-에오신 세포), 호염기구 콜로니 형성 세포(CFC-Bas 세포), 과립구/단구 콜로니 형성 세포(CFC-GM 세포), 거핵구 콜로니 형성 세포(CFC-MEG 세포), 적혈구 파열-형성 세포(BFC-E 세포), 적혈구 콜로니 형성 세포(CFC-E 세포), T 세포 및 B 세포 중에서 선택된 세포이다.
본 발명의 한 바람직한 양태에서는, 보다 수임된 세포는 암세포가 아니다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양태에서는, 상기 제제는 발암성이 아니고, 또한 암 성장을 증진시킬 수 없다.
바람직한 양태에서는, 상기 제제가 상기 수용체에 대한 항체, 예를 들면, 이러한 수용체에 대한 모노클로날 항체이다. 구체적인 예로는 CR3/43 및 모노클로날 항체 TAL.1B5가 있다.
한 바람직한 양태에서는, 상기 제제가 MHC 유전자 발현을 조정한다. 적합하게는, 상기 제제가 MHC I+부류 및/또는 MHC II+부류 발현을 조정할 수 있다.
바람직하게는, 상기 제제는 생물학적 반응 변형제, 예를 들면, 알킬화제, 예를 들면, 사이클로포스포아미드이거나 이를 포함하는 알킬화제와 연계해서 사용된다.
바람직한 미분화 세포는 줄기 세포 항원을 포함한다. 바람직한 양태에서는, 상기 미분화 세포가 배아 줄기 세포, 다능성 줄기 세포, 림프계 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 상피 줄기 세포, 간엽 줄기 세포, 내배엽 줄기 세포, 및 골수성 줄기 세포 중에서 선택된다. 바람직하게는, 미분화 세포는 다음의 세포 표면 마커 명칭들 중의 하나 이상을 특징으로 한다: CD34+, HLA-DR-, CD38-, CD117, AC133, CD90 및 CD45low. 보다 바람직하게는, 상기 미분화 세포가 CD34+및 CD38-이고, 보다 더 바람직하게는, CD34+, CD38-, HLA-DR-및 CD45low이다.
따라서, 바람직한 양태에서는, 본 발명은 또한,
(i) 챔버;
(ii) 수임 세포를 포함한 세포 집단을 챔버내로 도입하기 위한 수단;
(iii) 수임 세포를 작동적으로 교합시키는 제제를 챔버내로 도입하기 위한 수단; 및
(iv) CD34+및/또는 CD38-및/또는 HLA-DR-, 및/또는 CD45low 및 CD90 및/또는 CD117 및/또는 AC133 세포의 상대적인 수가 상기 교합의 결과로서 증가되도록,챔버내의 제제에 의해 교합된 수임 세포를 항온배양하도록 작동가능한 항온배양 수단을 포함하는, 수임 세포를 포함한 세포 집단에서 세포 표면 마커 명칭 CD34+및/또는 CD38-및/또는 HLA-DR-및/또는 CD45low 및 CD90 및/또는 CD117 및/또는 AC133을 갖는 세포의 상대적인 수를 증가시키기 위한 장치를 제공한다.
본 발명에 따르는 장치는 임의로, 상기 미분화 세포를 증강시키고, 상기 제제를 제거시고/시키거나 변형된 세포 집단으로부터 미분화 세포를 회수하기 위한 정제 또는 분리용 수단을 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 정제용 수단은 미분화 세포의 세포 표면 상에 존재하는 세포 표면 마커, 또는 수임 세포의 표면 상에는 존재하지만 미분화 세포의 표면에는 거의 존재하지 않는 세포 표면 마커를 동정하기 위한 수단을 포함한다. 적합하게는, 상기 정제용 수단은 예를 들어, 상기 세포 표면 마커에 대해 생성된 항체를 활용할 수 있다. 적합한 마커의 예에는 CD34, CD45 및 HLA-DR이 포함된다. 단지 예로써, 적합한 정제용 수단은 CliniMACs/Isolex CD34+ 정제 시스템이다. 본 발명의 추가의 양태에서는, 이러한 정제 또는 분리용 수단이 임의로, 별개의 수단으로서 제공된다.
본 발명에 따르는 장치는 임의로, 상단부 음성 선별 및/또는 세포 증강 수단을 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 한편, 세포 집단은 당해 장치내로 삽입되기에 앞서, 임의로, 음성 선별되고/되거나 세포 증강될 수 있다.
또 다른 바람직한 양태에서는, 본 발명의 미분화 세포가 CD34_, CD45_, 및 조혈 계통의 마커에 대해 음성이다.
보다 분화된 세포는 본래의 수임 세포와 동일한 계통이거나 상이한 계통일 수 있다.
따라서, 본 발명에 따르는 장치는 미분화 세포를 생성시킬 뿐만 아니라, 한 계통의 세포를 또 다른 계통의 세포로 전환시키는데 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 추가의 국면에서는,
(i) 챔버;
(ii) 수임 세포를 포함한 세포 집단을 챔버내로 도입하기 위한 수단;
(iii) 수임 조혈 세포의 표면에서의 항원의 포획, 인식 또는 표시를 매개하는 수용체가 작동적으로 교합되는 제제를 챔버내로 도입하기 위한 수단; 및
(iv) 상기 교합의 결과로서 상기 수임 조혈 세포가 또 다른 조혈 계통의 세포가 되도록, 챔버내의 제제에 의해 교합되는 수임 조혈 세포를 항온배양하도록 작동가능한 항온배양 수단을 포함하는, 상기 수임 조혈 세포를 포함하는 세포 집단에서, 하나의 조혈 계통의 세포가 또 다른 조혈 계통의 세포가 되도록 유도시키기 위한 장치가 제공된다.
바람직하게는, 상기 수임 조혈 세포는 B 세포 계통의 것이고, T 세포 계통 및 골수성 계통 중에서 선택된 또 다른 조혈 계통의 세포가 된다.
본 발명에 따르는 장치에 의해 생성된 미분화 세포를 사용하여, 면역학적 장애 또는 질병을 치료하기 위한 약제를 제조할 수 있다. 유사하게, 본 발명에 따르는 방법에 의해 생성된 재수임 세포를 사용하여, 면역학적 장애 또는 질병을 치료하기 위한 약제를 제조할 수 있다.
본 발명에 의해, 보다 수임된 세포로부터 미분화 세포를 용이하게 제조한 다음, 이러한 미분화 세포를 시험관내 또는 생체내, 또는 이의 조합 하에서 장애 치료용 약제로서 사용하거나 이러한 약제를 제조하기 위해 상기 미분화 세포를 사용하는 것이 가능하기 때문에, 본 발명은 상당히 유리하다.
본 발명은 또한 유리한데, 이는 본래의 더 수임된 세포를 교정 또는 제거하거나 또는 이의 생성물을 교정 또는 제거한다는 관점에서 보면, 역분화에 의해 제조된 미분화 세포를 재수임 세포, 예를 들면, 새로이 분화된 세포에 위임하기 위한 장치를 사용하는 것이 가능해졌기 때문이다. 예를 들면, 미분화 세포를 사용하여, 재수임 세포, 예를 들면, 폐의 폐포 내면 세포를 생성시킴으로써, 손상을 입거나 병에 걸린 폐 조직을 대체 또는 수복할 수 있는 메카니즘이 창출된다[참조: Le Page, New Scientist 19 December 2000, p20].
"재수임 세포"란 용어는 미분화 세포로부터 유도된 세포, 즉 새로운 보다 수임된 세포이다. "보다 수임된"이란 보다 분화되고, 공지된 세포 분화 경로 및 단계를 참조하여 용이하게 결정할 수 있다는 것을 의미한다.
대부분의 미분화 세포 및 분화 세포는 주요 조직적합성 복합체(MHC) I부류 항원 및/또는 II부류 항원을 포함한다. 이들 항원이 상기 세포와 연관되는 경우에는, 이들을 I+부류 및/또는 II+부류 세포로 부른다. 바람직하게는, 보다 수임된 세포는 MHC I+부류 및/또는 MHC II+부류 미분화 세포로 역분화될 수 있다.
바람직하게는, 보다 수임된 세포는 줄기 세포 항원을 포함하는 미분화 세포로 역분화될 수 있다.
바람직하게는, 보다 수임된 세포는 CD34+미분화 세포로 역분화될 수 있다.
바람직하게는, 보다 수임된 세포는 림프조혈 전구세포로 역분화될 수 있다.
바람직하게는, 보다 수임된 세포는 다능성 줄기 세포로 역분화될 수 있다.
바람직하게는, 상기 증가는 24시간, 더욱 바람직하게는 4 내지 8시간 이내에 일어난다(이로써, 어떠한 변화도 세포 증식으로써만 설명될 수 없다).
전형적으로는, 미분화 세포의 수적 변화에 관한 결정은 미분화 세포의 특징적인 세포 표면 마커를 갖는 세포의 수적 변화를 모니터링함으로써 수행한다. 적합한 세포 표면 마커의 예로는 CD34+, HLA-DR-, CD38-, AC133, CD90 및 CD45low가 있다. 또 다른 한편, 또는 또한, 분화 세포 및 미분화되지 않은 세포 특유의 세포 표면 마커를 갖는 세포의 수적 감소를 모니터링할 수 있다.
적합하게는, 본 발명에 따르는 장치는 임의로, 미분화 세포의 특징적인 세포 표면 마커를 갖는 세포의 수적 변화를 모니터링하기 위한 추적용 수단을 추가로 포함할 수 있다.
바람직하게는, 당해 검정에 사용된 수임 세포는 수임 조혈 세포, 예를 들면, CFC-T 세포, CFC-B 세포, CFC-에오신 세포, CFC-Bas 세포, CFC-GM 세포, CFC-MEG 세포, BFC-E 세포, CFC-E 세포, T 세포, 및 B 세포 중에서 선택된 세포, 더욱 바람직하게는 B 세포이다.
바람직하게는, 본 발명에 따르는 장치는 다음 양상들을 1종 이상, 바람직하게는 2종 이상, 더욱 바람직하게는 3종 이상, 더 더욱 바람직하게는 4종 이상 추가로 포함한다:
(i) 세포 집단의 용적을 측정하기 위한 측정 수단;
(ii) 세포 계수를 수행하여 세포 집단의 세포 농도를 측정하기 위한 계수 수단(예를 들면, 필요한 경우 소형화된 코울터 계수기, 또는 기타 적합한 세포계수기);
(iii) 소정의 양(예를 들면, 예정량)의 세포 집단을 저장 용기로부터 챔버내로 전달하기 위한 전달 수단(이는 예를 들어, 펌프를 임의로 포함할 수 있다);
(iv) 챔버내로 가해질 제제 용적을 계산하기 위한 계산기 수단(상기 제제의 용적은 세포 집단의 용적과 세포 농도에 좌우된다);
(v) 소정의 용적(예를 들면, 계산된 용적)의 제제를 챔버내로 전달하기 위한 추가의 전달 수단[이러한 추가의 전달 수단은 예를 들어, 모터(예: 스텝퍼-모터)에 의해 구동된 주사기를 임의로 포함할 수 있다];
(vi) 챔버내의 이산화탄소 농도를 제어하기 위한 이산화탄소 제어 수단(예를 들어, 항온배양 수단의 일부로서 제공됨);
(vii) 챔버내의 온도를 제어하기 위한 온도 제어 수단(예를 들어, 항온배양 수단의 일부로서 제공됨);
(viii) 상기 세포 집단과 제제를 챔버내에서 혼합하기 위한 혼합용 수단(예를 들어, 항온배양 수단의 일부로서 제공됨);
(ix) 항온배양 시간을 맞추기 위한 타이밍 수단(예를 들어, 항온배양 수단의일부로서 제공됨), 및 임의로, 사용자에게 남은 시간을 표시해주는 표시 수단, 및/또는 사용자에게 항온배양 완료를 알려주는 알람 수단;
(x) 세포를 챔버로부터 수거하기 위한, 특히 미분화 세포를 챔버로부터 수거하기 위한 수거용 수단;
(xi) 미분화 세포를 포함하는 세포 집단을 챔버로부터 꺼내어 저장 용기내로 주입하기 위한 제거 수단(이러한 제거 수단은 예를 들어, 펌프를 포함할 수 있다); 및
(xii) 미분화 세포를 포함하는 세포 집단을 함유하는 저장 용기를 밀봉하기 위한 밀봉 수단.
적합하게는, 본 발명의 장치에서는, 전달 수단(iii)이 소정의 양(예를 들면, 예정량)의 세포 집단을 환자로부터 직접 상기 챔버내로 전달할 수 있고/있거나(즉, 저장 용기를 사용할 필요가 없다) 제거 수단(xi)이 미분화 세포를 포함하는 세포 집단을 상기 챔버로부터 꺼내어 환자에게 직접 주입할 수 있다(즉, 저장 용기를 사용할 필요가 없다).
적합하게는, 상기 전달 수단(iii)이 연동(peristaltic) 펌프를 포함할 수 있는데, 이러한 펌프는 세포 집단을 상호접속 수단(예: 튜빙)을 통하여 저장 용기로부터 챔버로 전달해준다. 바람직하게는, 상기 상호접속 수단을 코울터 계수기 또는 기타 적합한 세포계수기[(ii)에 언급된 바와 같음]내로 통과시킨다. 이러한 방식으로, 세포 집단이 저장 용기로부터 챔버내로 전달되는 동안, 이러한 세포 집단의 세포 농도를 계산할 수 있다.
바람직하게는, 상기 (iii) 및 (xi)에서 언급된 저장 용기(들)는 유리하게 처리가능한 저장 백이다. 훨씬 더 바람직하게는, (iii)의 저장 용기는 (xi)의 저장 용기와 상이한데, 전자는 투입용 저장 용기이고 후자는 배출용 저장 용기이다.
유종바람직하게는, 추가의 전달 수단(v)은 충분한 양의 제제가 어떠한 때에도 이용가능하도록 하기 위한 제제 저장기를 포함한다. 상기 전달 수단이 주사기인 경우에는, 이러한 저장기에 추가의 주사기가 장착되어, 하나의 주사기가 고갈되면 다른 주사기가 해당 제제를 공급하기 시작한다.
바람직하게는, 챔버내의 이산화탄소의 농도를 제어하기 위한 이산화탄소 제어 수단은, 가스 실린더로부터 예정량의 이산화탄소를 도입해주는 밸브를 포함한다. 예정량의 이산화탄소는 챔버내의 공지된 공기 용적, 튜빙 및 배출용 저장 용기, 이러한 배출용 저장 용기로부터 측정된 세포 집단 용적을 이용하여 계산한다. 적합하게는, 이산화탄소는 해당 제제를 부가시킨 것과 동일한 포트룰 통하여 챔버내로 도입할 수 있는데, 이러한 방식으로 이산화탄소를 사용하여, 상기 포트 및 주변 장비내의 모든 잔여 제제내로 취입시킬 수 있다. 이러한 것에 덧붙여, 상기 이산화탄소 제어 수단은 부가의 이산화탄소를 해당 시스템에 도입함으로써 비롯되는 여분의 공기 용적을 수용하기 위한 팽창식 공기 주머니를 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 한편, 투입용 저장 용기가 일단 비게 되면, 이는 공기 주머니로서 작용할 수도 있다. 바람직하게는, 이산화탄소는 챔버내의 최종 농도가 5%가 되도록 도입한다.
온도 제어 수단(vii)은 적합하게는, 가열 수단을 포함하는데, 이러한 가열수단은 예를 들어, 챔버 밑에 위치한 열판으로써 제공될 수 있다. 또 다른 한편, 상기 가열 수단은 챔버 또는 이의 일부분에 인접하여 위치한 온수 재킷으로 제공될 수 있다. 훨씬 더 바람직하게는, 챔버내의 온도는 약 25 내지 약 37℃로 제어된다.
혼합 수단(viii)은 바람직하게는, 챔버내의 세포 집단과 제제를 혼합하기 위해 서서히 회전하는 하나 이상의 패들 암(paddle arm)을 포함한다. 자기 교반기가 또한 사용될 수도 있다. 추가의 대체 방안으로서, 상기 챔버를 기계적으로, 예를 들면, 온화하게 진탕시킴으로써 교반시킬 수 있다. 하나 이상의 패들 암을 포함하는 혼합 수단을 사용하는 경우의 이점은, 이러한 암이 세포 수거 동안에는 스크래퍼로서 작용하도록 고안될 수 있다는 것인데, 즉 상기 암이 천천히 회전함에 따라, 챔버 표면에 유착된 세포가 온화하게 제거된다는 것이다. 유리하게는, 상기 혼합 수단이 선회 운동하도록 작동될 수 있다.
바람직하게는, 상기 제거 수단(xi)은 연동 펌프를 포함한다. 유리하게는, 상기 제거 수단은 미분화 세포를 포함한 세포 집단을, 챔버 밑에 있는 배출용 포트를 통하여 꺼내어, 이를 상호적속 수단, 예를 들면, 튜빙을 통하여 배출용 저장 용기내로 주입한다.
또 다른 한편, 또는 제거 수단에 덧붙여, 이로부터 세포 집단을 제거하기에 앞서, 자유 이온 봉쇄제 및/또는 킬레이트제, 예를 들면, 항응고제, 예를 들면, EDTA를 챔버에 가할 수 있다. 이러한 이온 봉쇄제 및/또는 킬레이트제를 챔버에 가하면, 줄기 세포 콜로니가 단일 세포 현탁물로 분해되므로, 세포를 플러싱 수단에 의해 챔버로부터 제거하는 것이 촉진된다.
밀봉 수단(xii)은 열 밀봉기를 포함하는데, 이러한 열 밀봉기는 해당 용기의 두 부분 또는 용기 바로 앞의 상호접속 수단의 두 부분을, 완전히 밀봉될 때까지 함께 누름으로써 배출용 저장 용기를 밀폐시킨다. 예를 들면, 상기 열 밀봉기는 폭 약 2cm의 밀봉부를 만들 수 있으며, 이때 열 밀봉기는 이의 중심부를 따라 밀봉부를 절단한다.
바람직하게는, 본 발명의 장치의 각 부분은 중앙 컴퓨터 시스템에 의해 독립적으로 제어 가능하다. 유리하게는, 이러한 컴퓨터 시스템은 당해 장치 부분으로부터의 입력 신호를 수용할 수 있으며, 이로써 이러한 입력 신호를 기준으로 하여 계산할 수 있고 출력 신호를 당해 장치의 동일한 부분 또는 추가의 부분에 보낼 수 있다.
본 발명의 장치는 몇 가지 이점을 지니고 있는데, 특히 당해 장치는 해당 과정을 수행할 때마다 일치되는 결과가 수득되도록 해주고, 유용한 제제가 전혀 낭비되지 않게 한다. 또한, 당해 장치는 역분화가 완료될 때 이를 사용자에게 알려주고/주거나 완료되기까지 남아있는 시간을 표시해주도록 프로그래밍될 수 있다. 이와 같이 하도록 프로그래밍된 경우, 당해 장치는 사용자가 새로운 제제를 구입하도록 촉구할 수 있다. 다시 말하면, 당해 장치는 해당 제제의 사용과 저장량을 모니터링함으로써, 제제 저장량이 임계 수준 이하로 떨어지면, 사용자에게 이를 구입하도록 촉구할 수 있다.
본 발명의 장치는 각각, 상이한 세포 계통, 예를 들면, 근육, 모발, 신경원등에 수임된 미분화 세포를 생성하기 위한, 다수의 챔버를 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 상이한 세포 계통으로 수임된 미분화 세포를 동시에 생성할 수 있다. 바람직하게는, 다수의 챔버가 사용된 경우, 각 챔버는 별도의 배출용 포트와 별도의 배출용 저장 용기를 갖는다.
세포 계통은, 해당 챔버(들)에 대해 시차적으로 처리된 플라스틱을 사용하거나 각 챔버내로 상이한 화학물질을 가함으로써 본 발명의 장치에서 제어될 수 있다.
바람직하게는, 당해 장치의 하나 이상의 구성분은 1회용이다. 예를 들면, 다음 성분들 중의 하나 이상이 1회용일 수 있다: 챔버, 투입용 저장 용기, 배출용 저장 용기, 저장 용기와 챔버를 접속해주는 상호접속 수단, 및 추가의 전달 수단(v). 적합하게는, 상기 1회용 구성분은 당해 장치내로 삽입하기 위한 카트리지로서 공급될 수 있다. 단지 예로써, 카트리지는 제1 혈액 백(투입용 저장 용기), 챔버 및 제2(배출용) 혈액 백을 포함할 수 있는데, 여기서 상기 챔버는 튜빙(상호접속 수단)에 의해 제1 혈액 백과 제2 혈액 백 각각에 접속된다. 적합하게는, 당해 장치는 일부는 기기이고 일부는 1회용인 시스템으로서 간주될 수 있다.
바람직하게는, 세포 집단과 접촉하고 있는 당해 장치의 챔버 및/또는 기타 구성분은 기타 형태의 세포 형질전환체를 유발시키지 못하는, USP VI부류 재료, 폴리카보네이트 플라크 및/또는 기타 플라스틱으로부터 제형화시킨다.
바람직하게는, 수임 세포를 포함하는 세포 집단은 혈액이다. 바람직하게는, 상기 제제가 항체이다.
추가의 국면에 있어서, 본 발명은 보다 수임된 세포를 미분화 세포로 역분화시키는 단계를 포함하는, 미분화 세포의 제조 방법을 제공하며, 여기서, 보다 수임된 세포의 역분화는 백혈구연층 혈액 샘플 중의 또는 이러한 샘플로부터의 보다 수임된 세포에서 일어난다.
추가의 국면에서는, 본 발명은 백혈구연층 혈액 샘플 중의 또는 이러한 샘플로부터의 보다 수임된 세포를, 이러한 보다 수임된 세포를 미분화 세포로 역분화시켜주는 제제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 미분화 세포의 제조 방법을 제공해준다.
본 발명의 한 바람직한 양태에서는, 보다 수임된 세포는 암세포가 아니다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양태에서는, 상기 제제는 발암성이 아니고, 또한 암 성장을 증진시킬 수 없다.
바람직하게는, 상기 수임 세포는 분화 세포이다. 바람직하게는, 이러한 수임 세포는 수임 조혈 세포, 예를 들면, CFC-T 세포, CFC-B 세포, CFC-에오신 세포, CFC-Bas 세포, CFC-GM 세포, CFC-MEG 세포, BFC-E 세포, CFC-E 세포, T 세포, 및 B 세포 중에서 선택된 세포, 더욱 바람직하게는 B 세포이다.
바람직하게는, 미분화 세포는 다능성 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 상피 줄기 세포, 간엽 줄기 세포 및 배아 줄기 세포 중에서 선택된 미분화 세포이다. 바람직하게는, 이러한 미분화 세포는 다음의 세포 표면 마커 명칭들 중의 하나 이상을 특징으로 한다: CD34+, HLA-DR-, CD38-, CD117, AC133, CD90 및CD45low. 보다 바람직하게는, 상기 미분화 세포가 CD34+및 CD38-이고, 보다 더 바람직하게는, CD34+, CD38-, HLA-DR-및 CD45low이다.
적합하게는, 미분화 세포는 MHC I+부류 및/또는 MHC II+부류 세포이다.
바람직하게는, 상기 제제는 수임 세포의 표면에서 항원의 포획, 인식 또는 제시를 매개하는 수용체를 교합시킨다. 보다 바람직하게는, 상기 수용체는 MHC I부류 항원 또는 MHC II부류 항원, 예를 들면, 사람-백혈구-관련(HLA)-A 수용체, HLA-B 수용체, HLA-C 수용체, HLA-E 수용체, HLA-F 수용체 또는 HLA-G 수용체 중에서 선택된 I부류 항원; 또는 HLA-DM 수용체, HLA-DP 수용체, HLA-DQ 수용체 또는 HLA-DR 수용체 중에서 선택된 II부류 항원이다.
적합하게는, 상기 수용체가 상동 영역을 지닌 β-쇄를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 수용체가 적어도 HLA-DR의 β-쇄의 상동 영역을 포함할 수 있다.
바람직한 양태에서는, 상기 제제가 상기 수용체에 대한 항체, 예를 들면, 이러한 수용체에 대한 모노클로날 항체이다. 구체적인 예로는 CR3/43 및 모노클로날 항체 TAL.1B5가 있다.
적합하게는, 상기 제제는 MHC 유전자 발현, 예를 들면, MHC I+부류 및/또는 MHC II+부류 발현을 조정할 수 있다.
본 발명의 추가의 바람직한 국면에서는, 백혈구연층 혈액 샘플 중의 보다 수임된 세포를, 이러한 수임 세포가 작동적으로 교합된 제제와 접촉시켜, 세포 표면마커 CD34+및/또는 HLA-DR-및/또는 CD38-및/또는 CD117 및/또는 AC133 및/또는 CD90 및/또는 CD45low의 상대적인 수가 이러한 교합 결과로서 증가되도록 하는 단계를 포함하는, 백혈구연층 혈액 샘플 중의 상기 세포 표면 마커 CD34+및/또는 HLA-DR-및/또는 CD38-및/또는 CD117 및/또는 AC133 및/또는 CD90 및/또는 CD45low를 갖는 세포의 상대적인 수를 증가시키는 방법이 제공된다.
또한, 추가의 국면에서는, 본 발명은 세포 집단 중의 하나 이상의 분화 세포를, 상기 세포 집단 중의 정상적인 분화 세포의 비율을 변위시키기에 유효한 역분화 수단과 접촉시킴으로써, 상기 하나 이상의 분화 세포를 미분화 세포(들)로 역분화시키는 단계를 포함하는, 미분화 세포의 제조 방법을 제공한다.
추가의 국면에서는, 본 발명은 하나 이상의 상기 분화 세포를 미분화 세포(들)로 역분화시키기 위해 특정 세포 집단 중의 정상적인 분화 세포의 비율을 변위시키기 위한 역분화 수단의 용도를 제공한다.
추가의 국면에서는, 본 발명은 세포 집단 중의 분화 세포를 미분화 세포로 역분화시킴을 포함하는 방법으로서, 하나 이상의 분화 세포를 포함하는 상기 세포 집단을 포함하는 환경을 제1 환경에서부터 제2 환경으로 변화시키고, 이러한 제2 환경의 자유 이온 농도를 제1 환경과 비교해서 효과적으로 변형시켜, 하나 이상의 상기 분화 세포를 미분화 세포(들)로 역분화시키는, 미분화 세포의 제조 방법을 제공한다.
또한, 추가의 국면에서는, 본 발명은 세포 집단 중의 하나 이상의 분화 세포를, 정상적인 분화 세포의 비율을 변위시키기에 유효한 역분화 수단과 접촉시키는 단계; 상기 세포 집단을 자유 이온 또는 이온 봉쇄된 제1 환경에서 배양하는 단계; 및 제1 환경을 제2 환경으로 변화시키는데, 이러한 제2 환경내에 존재하는 이온의 농도를 제1 환경과 비교해서 효과적으로 변형시킴으로써, 하나 이상의 상기 분화 세포를 미분화 세포(들)로 역분화시키는 단계를 포함하는, 미분화 세포의 제조 방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 역분화 수단은 세포 집단내에서, 음성 선별로 후술되는, 이러한 세포 집단 중의 정상적인 분화 세포의 비율을 파괴시켜, 세포 집단 중의 정상적인 분화 세포의 비율을 파괴시키는 수단이다.
역분화 수단은, 예를 들어, 다음 중의 하나 이상일 수 있다: 항체[순수한 및 접합된 항체(즉, 자기, 유리 또는 폴리스티렌 비드 등의 고정 및 자유 리간드에 결합됨)]; 히스토플라크(Histoplaque), 림포프렙(LymphoPrep)(Sigma), 또는 세포의 밀도에 따라서 세포를 분리시키는데 사용되어 온 기타 모든 밀도 구배 매질; 또는 덱스트란(예를 들어, 적혈구의 침강을 유발시킨다). 세포 변위를 유발시키는 기타 적합한 수단이 다음 문헌에 제시되어 있다[참조: Vettese-Dadey(The Scientist, Sep 13 1999, 13(18):21].
바람직하게는, 제2 환경의 자유 이온 농도는 제1 환경의 것과 비교해서 증가된다.
보다 바람직하게는, 제1 환경과 제2 환경의 상대적인 자유 이온 농도는 증가하는데, 즉 제2 환경내의 자유 이온의 농도가 증가한다. 바람직하게는, 상대적인이온 농도는 상기 하나 이상의 분화 세포를 미분화 세포로 역분화시키기에 충분한 정도로 증가된다. 단지 예로써, 세포를, 5mM EDTA(자유 이온 봉쇄제 및/또는 킬레이트제)를 함유하는 매질로부터 EDTA를 덜 함유하거나 전혀 함유하지 않는 추가의 매질로 전달하면, 역분화를 유발시키기에 충분한 자유 이온 농도(예: 칼슘 이온 농도) 증가가 야기된다.
바람직하게는, 자유 이온은 음이온이다.
바람직하게는, 자유 이온은 I족 또는 II족 금속이다.
바람직하게는, 상기 음이온은 칼슘 이온 및/또는 마그네슘 이온이다.
적합하게는, 특정 환경의 자유 이온 농도는, 이러한 환경의 자유 이온 농도를 상대적으로 변화시킬 수 있는 제제로 상기 환경을 처리함으로써 변형시킬 수 있다.
따라서, 바람직한 양태에서는, 본 발명은 세포 집단 중의 분화 세포를 미분화 세포로 역분화시킴을 포함하는 방법으로서, 상기 세포 집단을 포함하는 환경을 제1 환경의 자유 이온 농도를 제2 환경에 대해 상대적으로 변화시킬 수 있는 제제로 상기 제1 환경을 처리함으로써 변형시키는, 미분화 세포의 제조 방법을 제공한다.
예를 들면, 제1 환경은 하나 이상의 자유 이온 봉쇄제로 처리할 수 있는데, 이의 존재는 후속 제거 또는 감소시켜, 상대적으로 증가된 자유 이온 농도를 갖는 제2 환경을 초래함으로써, 세포 집단 중의 하나 이상의 분화 세포를 역분화시킨다. 즉, 상기 봉쇄제는, 예를 들어, 제1 환경으로부터 이러한 봉쇄제 또는 이의 일부를물리적/화학적으로 제거하거나, 또는 이러한 자유 이온 봉쇄제를 사용하지 않거나 제1 환경보다 낮은 농도의 자유 이온 봉쇄제를 사용하여 상기 세포 집단을 제2 환경에 전달함으로써, 제거 또는 감소시킬 수 있다.
어떠한 경우든, 상기 제2 환경은 제1 환경과 비교해서 증가된 자유 이온 농도를 가짐으로써, 세포 집단 중의 하나 이상의 분화 세포를 역분화시킨다.
또 다른 한편, 세포 집단을 낮은 농도 또는 제로 농도의 자유 이온을 포함하는 제1 환경에서 배양한 다음, 이러한 세포 집단을 제1 환경에 전달하거나 이를 조정하여, 이온을 포함하거나 제1 환경보다 높은 농도의 이온을 포함하는 제2 환경이 되도록 함으로써, 상기 세포 집단 중의 하나 이상의 분화 세포를 역분화시킨다. 본원에 사용된 바와 같은 "낮은"이란 용어는 제2 환경의 최종 농도에 비해 자유 이온 출발 농도가 상대적으로 낮은 환경을 포함한다.
따라서, 본 발명의 바람직한 양태에서는, 하나 이상의 분화 세포를 포함하는 세포 집단을 포함하는 환경을, 자유 칼슘 또는 마그네슘 이온 농도가 낮거나 자유 칼슘 또는 마그네슘 이온을 함유하지 않는 제1 환경으로부터 자유 칼슘 또는 마그네슘 이온을 포함하거나 제1 환경보다 높은 농도의 자유 칼슘 또는 마그네슘 이온을 포함하는 제2 환경으로 변화시킴으로써, 상기 세포 집단 중의 하나 이상의 분화 세포를 역분화시키는 단계를 포함하는, 미분화 세포의 제조 방법이 또한 제공된다.
특정 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 이온 농도의 변화, 특히 이온 농도의 증가로 인해, 세포 집단 중의 세포가 콜로니로 응집되고(예를 들면, 동형성 응집이 진행된다), 이러한 세포들 간의 물리적 접촉으로 인해, 이들이 역분화될 수 있는것으로 여겨진다.
바람직하게는, 상기 봉쇄제는 이온 킬레이트제이다.
바람직하게는, 상기 봉쇄제는 음이온과 카복실 그룹 모두를 포함한다.
바람직하게는, 상기 봉쇄제는 다수의 -N(CH2CO2H)n그룹(여기서, n은 1 또는 2이다)을 포함한다.
적합하게는, 상기 봉쇄제는 다음 중의 하나 이상으로부터 선택될 수 있다: EDTA, 헤파린, EGTA, DTPA, 삼나트륨시트레이트 및 기타 유사한 킬레이트제 및/또는 항응고제.
적합하게는, 상기 봉쇄제는 이의 존재를 제거하는 것이 역분화를 야기시키기에 충분한 고농도로 부가되어야 한다. 전형적으로는, 이의 존재가 제거될 때 역분화를 유발시키기에 충분한 봉쇄제의 농도는 약 2mM 이상이다.
본 발명의 한 바람직한 양태에서는, 보다 수임된 세포는 암세포가 아니다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양태에서는, 상기 제제는 발암성이 아니고, 또한 암 성장을 증진시킬 수 없다.
바람직하게는, 상기 수임 세포는 분화 세포이다. 바람직하게는, 이러한 수임 세포는 수임 조혈 세포, 예를 들면, CFC-T 세포, CFC-B 세포, CFC-에오신 세포, CFC-Bas 세포, CFC-GM 세포, CFC-MEG 세포, BFC-E 세포, CFC-E 세포, T 세포, 및 B 세포 중에서 선택된 세포, 더욱 바람직하게는 B 세포이다.
바람직하게는, 미분화 세포는 다능성 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 신경 줄기세포, 상피 줄기 세포, 간엽 줄기 세포 및 배아 줄기 세포 중에서 선택된 미분화 세포이다. 바람직하게는, 이러한 미분화 세포는 다음의 세포 표면 마커 명칭들 중의 하나 이상을 특징으로 한다: CD34+, HLA-DR-, CD38-, CD117, AC133, CD90 및/또는 CD45low. 보다 바람직하게는, 상기 미분화 세포가 CD34+및 CD38-이고, 보다 더 바람직하게는, CD34+, CD38-, HLA-DR-및 CD45low이다.
이와 같이, 본 발명의 추가의 바람직한 양태에서는, 본 발명은 세포 집단 중의 분화 조혈 세포를 미분화 세포로 역분화시킴을 포함하는 방법으로서, 하나 이상의 분화 조혈 세포를 포함하는 상기 세포 집단을 포함하는 환경을 제1 환경에서부터 제2 환경으로 변화시키고, 이러한 제2 환경의 자유 이온 농도를 제1 환경과 비교해서 효과적으로 변형시켜, 하나 이상의 상기 분화 조혈 세포를 미분화 세포(들)로 역분화시키는, 미분화 세포의 제조 방법을 제공한다.
적합하게는, 상기 미분화 세포는 MHC I+부류 및/또는 MHC II+부류 세포이다.
한 양태에 있어서, 수임 세포를 포함한 세포 집단은 백혈구연층 혈액 샘플이거나, 백혈구연층 혈액 샘플로부터 기원된 것이다.
유리하게는, 본 발명에 따르는 방법을 사용하여, 적혈구를 생성하기 위해 적혈구계 전구세포를 효과적으로 배양할 수 있는데, 이러한 적혈구를 사용하여 예를 들어, 혈액 공급업체의 부족분을 보충해줄 수 있다. 적합하게는, 본 발명에 따르는 방법을 사용하여, 혈소판 생성에 사용하기 위한 거핵구를 생성할 수 있다.
본 발명을 명백하게 이해하고 용이하게 수행할 수 있도록 하기 위해, 첨부된 도면을 예로써 하여 참조할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따르는 장치의 정면 패널이 개방되어 있는 당해 장치의 투시도인데, 이와 함께 당해 장치의 한 섹션이 이의 주변부로부터 꺼내져 삽입부로 도시되어 있다.
도 2는 당해 장치의 정면 패널이 닫혀져 있는, 제1도의 장치의 투시도이다.
도 3은 혈액 세포의 사진이다.
도 4는 T 세포 및 B 세포를 형성하기 위한 LSC의 분화 챠트를 도시한 것이다.
도 5는 호산구, 호염기구, 호중구, 거핵구, 단구, 적혈구, 과립구, 비만 세포, NKs 및 림프구를 형성하기 위한 MSCs의 분화 챠트를 도시한 것이다.
도 6은 림프조혈 전구세포를 도시한 것이다.
도 7은 CR3/43 항체로 처리한 후의 CD45_CD14_세포의 외관을 도시한 것이다.
도 8은 분화된 B 세포의 현미경 사진이다.
도 9는 B 세포를 역분화시킴으로써 형성된 미분화 세포의 현미경 사진이다.
도 10은 저배율로 찍은 것을 제외하고는 도 9와 동일한 미분화 세포의 현미경 사진이다.
도 11은 분화된 B 세포의 현미경 사진이다.
도 12는 B 세포를 역분화시킴으로써 형성된 미분화 세포의 현미경 사진이다.
도 13은 도 12와 동일한 미분화 세포로부터 분화된 과립구 세포를 형성하는 현미경 사진이다.
도 14는 BCLL 환자로부터의 처리되지 않은 혈액 샘플의 2종의 상이한 배율의 현미경 사진이다.
도 15는 처리된 혈액 샘플의 현미경 사진이다.
도 16 및 도 17은 혈액 샘플을 처리하는 동안 저속 촬영된 현미경 사진이다.
도 18은 써던 블롯을 도시한 것이다.
도 19는 B-CLL 환자로부터의 말초혈 샘플을 사용하여 수득된 추가의 써던 블롯을 도시한 것이다.
도 20은 특정 세포 집단에서의 CD34+세포의 상대적인 수를 증가시키기 위한 3종의 제제의 사용을 도시한 것이다.
도 21은 역전 명시야 현미 기술을 이용한 줄기 세포의 콜로니 검정을 도시한 것이다.
도 22는 역전 명시야 현미 기술로 관찰했을 때의 유착 세포 층을 도시한 것이다.
도 23은 B 세포를 CR3/43mab로 처리하는 동안 시간 저속 촬영 비디오로부터의 2종의 스틸 영상을 도시한 것이다.
본 발명은 장치에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 미분화 세포를 제조하기 위한 장치에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 보다 수임된 세포로부터 미분화 세포를 제조하기 위한 장치에 관한 것이다. 추가의 국면에 있어서, 본 발명은 또한, 미분화 세포의 형성 방법에 관한 것이다. 당해 장치는 또한, 예를 들어, 새로운 제제를 원격적으로 주문하고/하거나 작동이 정확하게 수행되고 있는지 또는 수행되었는지를 확인하기 위해, 생산자/분배자/제조업자/콜 센터/서비스 센터 등과 원격적으로 통신할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한, 당해 장치 및 이의 사용과 관련하여 사업을 수행하는 방법에 관한 것인데, 예를 들면, 생산자/분배자/제조업자/콜 센터/서비스 센터 등과 원격적으로 통신하고, 이러한 통신에 응답하는 생산자/분배자/제조업자/콜 센터/서비스 센터 등과 원격적으로 통신한다(예를 들면, 주문을 수신 및 채우고, 이의 작동 및/또는 교정에 관한 데이터/정보를 수신 및/또는 처리 및/또는 응답한다).
I. 장치
당해 장치는 일반적으로 참조 번호 1로써 표시되며, 정면 패널(3)을 갖는 하우징(2)을 포함하는데, 이러한 패널(3)을 개방하여 당해 장치(1) 내부로의 접근을 허용할 수 있다. 유입 저장 용기, 즉 혈액 백(4)은 지지체 훅(5)으로부터 매달려 있다. 이러한 지지체 훅(5)은 전자 저울(도시되지는 않음)의 일부를 형성하고, 이러한 저울은 투입용 혈액 백(4)을 칭량하도록 작동된다.
당해 장치는 챔버(6)를 포함하고, 이러한 챔버(6)는 튜빙(7)을 통하여 투입용 혈액 백(4)에 상호접속된다. 튜빙(7)은 투명 창(8)을 포함하고, 이 창은 코울터 계수기 플로우 셀(9) 내부에 위치해 있다. 연동 펌프(도시되지는 않음)는 코울터 계수기 플로우 셀(9)을 통하여 투입용 혈액 백(4)으로부터 혈액을 뽑아내어 이를 챔버(6)내로 주입시키도록 작동된다.
주사기(10, 11)는 항원을 포함하는데, 이는 각각 스텝퍼-모터(도시되지 않음)에 의해 구동된다. 주사기(10, 11)는 잠금 장치가 있는 절연 펠티에(Peltier) "냉동고"(12)내에서 4℃ 하에 영구적으로 보존한다. 당해 장치가 항상 충분한 항체를 공급받도록 하기 위해 2개의 주사기(10, 11)가 제공된다. 주사기(10, 11)의 멸균성은 항생제와 1회용 0.2㎛ 필터(일반적으로 참조 번호 13으로 명시됨)에 의해 유지시킨다.
당해 장치는 이산화탄소 유입 포트(14)를 추가로 포함하는데, 이는 가스 실린더(도시되지는 않음)로부터의 이산화탄소를 튜빙(15)을 통하여 챔버(6)내로 지시한다. 주사기(10, 11)는 또한, 튜빙(15)을 통하여 챔버(6)와 유체 전달한다. 밸브(16)는 튜빙(15)을 통하여 이산화탄소와 항원의 흐름을 제어한다. 가열 수단(도시되지 않음)이 챔버(6) 밑에 제공된다. 챔버(6)내에는 회전 가능하능한 패들(17)이 있고, 이는 챔버(6)내에서 항체와 혈액을 혼합시키도록 작동된다. 타이밍 장치(도시되지 않음)는 항체와 혈액이 챔버(6)내에 남아 있는 항온배양 기간을 모니터링해준다. 나머지 항온배양 시간이 제어 패널 디스플레이(18) 상에 표시될 수 있다.
배출용 저장 용기, 즉 배출 혈액 백(19)이 또한 당해 장치(1)에 매달려 있고, 이는 튜빙(20)을 통하여 챔버(6)와 상호접속되어 있다. 튜빙(20)은 열 밀봉기(21)를 통과하는데, 상기 밀봉기는 튜브(20)를 밀봉시켜 결국에는 배출 혈액 백(19)을 밀봉시킨다. 추가의 연동 펌프(도시되지 않음)가 제공되어, 챔버(6) 내용물을 배출 혈액 백(19)내로 펌핑한다.
챔버(6)는 튜빙(7, 20) 및 배출 혈액 백과 함께 1회용 품목이므로, 각 과정 후에 처분한다.
작동시, 사용자는 당해 장치(1)내로 배출 혈액 백(19), 챔버(6) 및 튜빙(7, 20)을 삽입한다. 튜빙(20)은 열 밀봉기(21)와 연동 펌프내로 통과한다. 튜빙(7)은 다른 연동 펌프와 코울터 계수기 플로우 셀(9)내로 통과한다. 사용자는 또한, 특정 환자로부터의 혈액을 함유하는 혈액 백(4)을 삽입하고, 이를 튜빙(7)에 유착시킨다. 상기 이외에도, 사용자는 챔버(6)의 튜빙을 멸균 필터(13)에 유착시킨다. 이어서, 사용자는 하우징(2)의 정면 패널(3)을 닫고 장치 키보드(22)를 사용하여장치(1)를 작동시킨다.
장치(1)는 투입용 혈액 백(4)을 자동으로 칭량한다. 투입용 혈액 백(4)의 중량은 장치(1)내에 위치한 중앙 컴퓨터 사용 시스템(도시되지 않음)에 자동으로 전송된다. 투입용 혈액 백(4)의 중량으로부터, 컴퓨터 사용 시스템은 백(4)내의 혈액 용적을 결정할 수 있다. 이어서, 연동 펌프는 튜빙(7)을 통하여 투입용 혈액 백(4)으로부터 혈액을 뽑아낸다. 이 혈액은 튜빙(7)의 투명 창(8)으로부터 흐르는데, 코울터 계수기(9)가 이러한 튜빙(7)내로 통과하는 세포 농도를 결정해준다. 코울터 계수기는 신호 지시를 중앙 컴퓨터 사용 시스템에 전송한다. 중앙 컴퓨터 사용 시스템은 이와 같이 계산된 혈액 용적과 세포 농도로부터, 주사기(10, 11) 중의 하나 이상에 의해 챔버(6)내로 주사할 필요가 있는 항체의 정확한 용적을 결정한다. 신호가 중앙 컴퓨터 사용 시스템으로부터 수신될 때까지 연동 펌프는 백(4)으로부터 혈액을 지속적으로 펌프한 다음, 펌프를 중단시킨다. 중앙 컴퓨터 사용 시스템으로부터의 신호가 코울터 계수기(9)로부터의 신호에 응답하여 중앙 컴퓨터 사용 시스템으로 전송되는데, 더 이상의 추가의 세포가 창(8)을 통과하지 않는다는 것을 코울터 계수기(9)가 감지할 때 신호를 전송한다.
이어서, 중앙 컴퓨터 사용 시스템은 주사기(10, 11)에 유착된 스텝퍼-모터(도시되지 않음)에 신호를 보내 하나 이상의 주사기(10, 11)를 압착시켜, 계산된 용적의 항체를 튜빙(15)을 통하여 챔버(6)내로 전달한다.
이어서, 당해 장치는 밸브(16)를 개방함으로써[밸브(16)의 개폐 기전은 중앙 컴퓨터 사용 시스템에 의해 제어 가능하다] 이산화탄소 유입 포트(14)를 통하여 이산화탄소를 임의로 도입한다. 부가될 이산화탄소의 양은 챔버(6), 튜빙(7, 20) 및 배출용 혈액 백(19) 중의 공기의 공지된 용적과, 투입용 혈액 백으로부터 계산된 혈액 용적에 기초하여 중앙 컴퓨터 사용 시스템에 의해 계산된다. 챔버(6)내의 이산화탄소의 최종 농도는 약 5%이다. 이산화탄소는 튜빙(15)을 통하여 챔버(6)내로 도입한다. 이로써, 이산화탄소를 튜빙(15)내에 잔존하는 모든 항체내로 취입함으로써, 방출된 항체 모두가 챔버(6)로 부가되도록 한다. 투입용 혈액 백이 일단 비게 되면, 이는 이산화탄소의 도입 후, 부가의 가스 용적을 수용하기 위한 공기 주머니로서 작용한다.
당해 장치는 중앙 컴퓨터 사용 시스템의 제어 하에 가열기(도시되지 않음)를 추가로 포함할 수 있는데, 이러한 가열기는 챔버(6) 밑에 위치시키고, 챔버(6)내의 온도를 25 내지 37℃로 제어한다. 가열기에 접속된 온도 조절기는 과도한 가열과 불충분한 가열을 방지해준다.
이어서, 혈액과 항체 제제를 챔버(6)에서 예정된 기간 동안 항온배양한다. 적합하게는, 항온배양 기간이 24시간을 초과하지 않고, 바람직하게는 4 내지 8시간이다. 선택된 시간은 역분화가 발생되기에 충분한 시간이어야 한다.
항온배양 동안, 패들 암(17)을 서서히 회전시켜, 항체와 혈액이 혼합되도록 한다.
항온배양 기간이 완료되면, 패들 암(17)은 지속적으로 회전되고 스크래퍼 암으로서 효과적으로 작용하여, 챔버(6) 표면에 유착된 모든 세포를 제거함으로써 세포의 수거를 촉진시킨다. 연동 펌프는 챔버 바닥(6)으로부터 챔버(6)의 내용물(즉, 미분화 세포(즉, 줄기 세포)를 함유하는 혈액)을 뽑아내어 배출용 혈액 백(19)에 주입한다. 이 펌프는 측정된 용적의 혈액(구경 연동 펌프를 사용하여 결정된 바와 같음)이 배출용 혈액 백(19)내로 유입될 때까지 펌핑을 지속한다.
최종적으로, 가열 밀봉기(21)로 튜빙(20)을 고정시키고, 튜빙(20)의 약 2cm 길이가 밀봉되도록 한 다음, 밀봉기(21)가 대략 밀봉부 중앙쪽으로 튜빙(20)을 절단한다.
이어서, 장치(1)는 해당 공정이 완료되었다는 것을 사용자에게 통지할 수 있다.
이때, 사용자는 배출용 혈액 백(19)을 제거할 수 있다. 챔버(6)를 튜빙(7, 20) 및 투입용 혈액 백(4)과 함께 처분할 수 있다.
배출용 혈액 백(19)을 필요에 따라, 정제 시스템, 예를 들면, 미분화 세포의 특징적인 세포 표면 마커를 갖긴 하지만, 형태학적 변화가 지침으로서 사용될 수도 있는 세포를 동정해주는 시스템에 전달할 수 있다. 이러한 정제 시스템을 사용하여, 항체 제제를 제거하고/하거나 미분화(줄기) 세포를 임의로 증강시킬 수 있다. 적합한 정제 시스템은 CliniMACs/Isolex 정제 시스템이다.
II. 미분화 세포 및 분화 세포
생체내에서 발견되는 미분화 세포와 분화 세포는 많으며, 당해 분야에는 이들에 관한 개략적인 교시가 충분히 보고되었다.
예로써, 조혈 세포 계통의 세포에 관해서는 특히 다음 문헌을 참조할 수 있다[참조: Levitt and Mertelsman 1995 (Haematopoietic Stem Cells, published by Marcel Dekker Inc - 특히 pages 45-59) and Roitt et al. (Immunology, 4th Edition, Eds. Roitt, Brostoff and Male 1996, Publ. Mosby - 특히 Chapter 10)].
미분화 세포는 성숙한 분화 특징을 나타내지는 않지만 이를 나타내는 자손을 생산할 수는 있는 미숙한 세포이다. 미분화 세포의 널리 공지된 예는 줄기 세포이다.
줄기 세포는 자가 재생(제한없이 분할됨) 및 분화(진화)할 수 있는 미분화된 미숙 세포이다. 이들 미숙한 세포는 발생 배아에 풍부하지만, 이들의 수는 발생이 진행됨에 따라 감소한다. 이와는 대조적으로, 성인 유기체는 제한된 수의 줄기 세포를 함유하는데, 이는 특정한 신체 구획으로 한정된다.
줄기 세포는 일반적으로, 단능성(monopotent), 이능성(bipotent) 또는 다능성(pluripotent)인 것으로 여겨진다. 단능성 및 이능성 줄기 세포는 발생에서 보다 제한되며, 각각 1종 또는 2종의 진화된(특수) 세포를 생성시킨다. 이와는 달리, 다능성 줄기 세포(PSC)는 많은 상이한 유형의 세포로 분화되어, 조직(기관을 구성하는 조직)을 생성시키거나 전능(totipotent) 줄기 세포의 경우에는, 전 유기체를 생성시킨다.
다능성 줄기 세포는 단능성 및 이능성 줄기 세포와는 달리, 다중계통 분화할 수 있어, 상이한 유형 또는 계통의 세포 집합으로 이루어질 수 있는 조직을 생성시킨다.
조혈 줄기 세포가 골수 세포 중에서 발견되고 각종의 모든 혈액 세포(백혈구및 적혈구 포함)를 생성시키는 다능성 줄기 세포의 한 예이다.
혈액은 림프구(Ly), 단구(Mo), 호중구(Ne), 호염기구(Ba), 호산구(Eso), 혈소판(Pl) 및 적혈구(Rbc)로 이루어진 유체 조직이다(도 3 참조), 이러한 진화된 조직은 조혈 줄기 세포(Hsc)를 분화시킴으로써 생성된다. 일반적으로, 백혈구(보다 큰 원 내부)는, 적혈구(보다 작은 원 내부)가 영양분, 산소 및 폐기물을 신체 여기저기로 수송하는 동안 감염과 싸운다.
기존에는, 조혈 줄기 세포를, (i) 골수, (ii) 성장 인자 동원된 말초혈 또는 (iii) 제대 혈액(태반)으로부터 분리함으로써 추출하였다. 최근에는, 조혈 줄기 세포를 배아 줄기(ES) 세포로부터 제조하였는데, 이는 시험관내 수정 기술을 이용하여 수득된 배아로부터 추출하였다. 이들 미분화 세포는 다중-계통 분화할 수 있고, 모든 신체 조직을 재구성할 수 있는데, 즉 전능성 세포이다.
상기 언급된 추출 방법은 성가시고, 종종 위험하며, 특정한 경우, 특히 배아 줄기 세포 추출 방법에서는, 비윤리적인 문제가 제기될 수 있다.
조혈 계통의 수 많은 미분화 줄기 세포가 존재한다. 이들로는 다능성 줄기 세포(PSC), 림프계 줄기 세포(LSC) 및 골수성 줄기 세포(MSC)가 있는데, 이들은 통틀어서 림프조혈 전구세포(LPC)로서 공지되어 있다.
LSC와 MSC는 각각, PSC를 분화시킴으로써 형성된다. 따라서, LSC와 MSC는 PSC 보다 수임된 세포이다.
조혈 계통의 분화 세포의 예로는 T 세포, B 세포, 호산구, 호염기구, 호중구, 거핵구, 단구, 적혈구, 과립구, 비만 세포 및 림프구가 있다.
T 세포와 B 세포를 LSC를 분화시킴으로써 형성된다. 따라서, T 세포와 B 세포는 LSC 보다 수임된 세포이다. 보다 상세히 언급하면, 분화 고리는 LSC →프로-B-세포 또는 전흉선세포이다. 프로-B-세포 →프리-B-세포 →성숙한 B-세포 →혈장 세포. 전흉선세포 →공통 흉선세포 →성숙한 흉선세포(헬퍼/유도인자 또는 세포독성/억제인자 계통)[도 4 참조].
호산구, 호중기구, 호중구, 거핵구, 단구, 적혈구, 과립구,비만 세포, NK 및 림프구는 MSC를 분화시킴으로써 형성된다. 따라서, 이들 세포 각각은 MSC 보다 수임된 세포이다. 보다 상세히 언급하면, 분화 고리는 MSC →미숙한 거핵구( →거핵아구 →거핵구 →혈소판) 또는 전적혈아구( →적혈아구 →망상구 →적혈구) 또는 골수단구성 줄기 세포, 즉 골수아구( →전골수구 →골수구 →과립구) 또는 단아구( →전단구 →단구 →매크로파아지)로 분화되는 이능성 줄기 세포이다[도 5 참조].
따라서, 조혈 분화 경로는 광범위하게 특징적이고, 각종 세포 단계가 형태학 및 계통 특이적 세포 표면 마커에 따라서 용이하게 동정 가능하다(하기 참조).
기타 줄기 세포에는 신경 줄기 세포, 신경원을 생성시킬 수 있는 다능성 줄기 세포, 성상 세포 및 올리고수지상 세포가 포함된다[참조: Nakafuku and Nakamura, 1995, J. Neurosci Res., vol 41(2):153-68; Anderson, 1994, FASEB J., vol 8(10): 707-13; Morshead et al., 1994, Neuron, Vol 13(5): 1071-82]. 골격근 수반 세포는 또 다른 유형의 줄기 세포인데, 보다 구체적으로 언급하면, 성인에게서 휴지기 줄기 세포로서 유지되고 필요할 때 새로운 근육 세포를 생성시킬 수 있는 독특한 부류의 근원성 세포이다[참조: Bischoff, 1986, Dev Biol., vol115(1):129-39]. 기타 유형의 줄기 세포는 상피 줄기 세포, 기저 세포의 서브세트, 내배엽 줄기 세포 및 간엽 줄기 세포이다.
매우 중요한 유형의 줄기 세포는 배아 줄기(ES) 세포이다. 이들 세포는 광범위하게 연구되었으며 성상 확인되었다. 실제로, ES 세포는 형질전환성 동물을 생산하는데 통상 사용된다. ES 세포는 시험관내에서 림프계 전구체[참조: Potocnik et al., 1994, EMBO J., vol 13(22): 5274-83] 및 신경 세포를 포함한 여러 세포 유형으로 분화시키는 것으로 밝혀졌다. 미국 특허 제5,843,780호 및 미국 특허 제6,200,806호에는 영장류 ES 세포의 분리 방법이 기재되어 있다. ES 세포는 수 많은 단계 특이적 마커, 예를 들면, 단계 특이적 배아성 마커 3 및 4(SSEA-3 및 SSEA-4), 고분자량 당단백질 TRA-1-60 및 TRA-1-81 및 알칼린 포스파타제에 의해 성상 확인된다[참조: Andrews et al., 1984, Hybridoma, vol 3:347-361; Kannagi et al., 1983, EMBO J., vol 2:2355-2361; Fox et al., 1984, Dev. Biol., vol 103: 263-266; Ozawa et al., 1985, Cell. Differ., vol 16: 169-173].
각종 항원이 미분화 세포 및 분화 세포와 연관되어 있다. 여기에서 "연관된"이란 용어는 각각의 항원(들)을 발현하거나 발현할 수 있거나, 이를 표시하거나 또는 표시하도록 유도시킬 수 있거나, 또는 이를 포함하는 세포를 의미한다.
대부분의 미분화 세포 및 분화 세포는 주요 조직적합성 복합체(MHC) I부류 항원 및/또는 II부류 항원을 포함한다. 이들 항원이 상기 세포와 연관되는 경우에는, 이들을 I+부류 및/또는 II+부류 세포로 부른다.
미분화 세포 또는 분화 세포와 연관된 각각의 특이적 항원은 마커로서 작용할 수 있다. 따라서, 상이한 유형의 세포는 이들과 연관된 특정한 항원(들) 또는 연관된 항원의 특정한 조합에 기초하여 서로 구별할 수 있다.
이들 마커 항원의 예로는 항원 CD34, CD19 및 CD3이 있다. 이들 항원이 존재하는 경우에는, 이들 특정한 세포를 각각 CD34+, CD19+및 CD3+세포로 부른다. 이들 항원이 존재하지 않는 경우에는, 이들 세포를 각각 CD34_, CD19_및 CD3_세포로 부른다.
보다 상세히 언급하면, PSC는 CD34+DR_TdT_세포(기타 유용한 마커는 CD38_및 CD36+이다). LSC는 DR+, CD34+및 TdT+세포(또한 CD38+)이다. MSC는 CD34_, DR+, CD13+, CD33+, CD7+및 TdT+세포이다. B 세포는 CD19+, CD21+, CD22+및 DR_세포이다. T 세포는 CD2+, CD3+, 및 CD4+또는 CD8+세포이다. 미숙한 림프구는 CD4+및 CD8+세포이다. 활성화된 T 세포는 DR+세포이다. 천연 킬러 세포(NK)는 CD56+및 CD16+세포이다. T 림프구는 CD7+세포이다. 백혈구는 CD45+세포이다. 과립구는 CD13+및 CD33+세포이다. 단구 매크로파아지 세포는 CD14+및 DR+세포이다. 부가의 상세한 내역이 도 4 및 5에 제시되어 있다.
배아 줄기 세포는 SSEA-3 및 SSEA-4, 고분자량 당단백질 TRA-1-60 및 TRA-1-81 및 알칼린 포스파타제를 발현한다. 이들은 SSEA-1을 발현하지 않는데, 이의 존재가 분화의 지표이다. 기타 마커가 기타 유형의 줄기 세포에 공지되어 있는데, 예를 들면, 신경상피 줄기 세포에 대해서는 네스테인(Nestein)이 공지되어 있다[참조: J. Neurosci. 1985, Vol 5:3310]. 간엽 줄기 세포는 SH2, SH3, CD29, CD44, CD71, CD90, CD106, CD120a 및 CD124에 대해 양성이고, CD34, CD45 및 CD14에 대해서는 음성이다.
또 다른 한편, 또는 또한, 많은 세포가 형태학적 특징에 의해 동정될 수 있다. 임의로 염색 기술과 함께, 현미경을 이용한 세포의 동정은 극도로 널리 개발된, 조직학으로 불리우는 과학 지류이며, 관련 기술이 당업계에 널리 공유되고 있다. 명료한 세포 염색은 세포 분취량에 대해서만 수행하여 이의 정체성을 확인하는데, 이는 염색으로 인해 일반적으로 세포가 사망할 수도 있기 때문이다.
따라서, 상기 열거된 항원 마커의 존재 여부를 관찰함으로써, (예를 들어, 세포가 미분화 세포이든지 분화 세포이든지 간에) 특정의 세포 유형을 동정하고, (이 세포가 T 세포이든지 B 세포이든지 간에) 상기 세포 유형의 진화를 확인하는 것이 가능하다.
미분화 세포는 항원 표시, 포획 또는 인식과 연관되는 어떠한 구성분도 포함할 수 있다. 바람직하게는, 미분화 세포가 MHC I+부류 및/또는 MHC II+부류 세포이다.
보다 수임된 세포는 항원 표시, 포획 또는 인식과 연관되는 어떠한 구성분도포함할 수 있다. 바람직하게는, 보다 수임된 세포가 MHC I+부류 및/또는 MHC II+부류 세포이다.
보다 수임된 세포는 미분화 세포로부터 유도되거나 유도가능한 모든 세포이다. 따라서, 한 바람직한 양태에서는, 보다 수임된 세포가 또한 미분화 세포이다. 따라서, 예를 들면, 보다 수임된 미분화 세포는 림프계 줄기 세포 또는 골수성 줄기 세포일 수 있으며, 미분화 세포는 다능성 줄기 세포이다.
보다 수임된 세포는 분화 세포, 예를 들면, CFC-T 세포, CFC-B 세포, CFC-에오신 세포, CFC-Bas 세포, CFC-Bas 세포, CFC-GM 세포, CFC-MEG 세포, BFC-E 세포, CFC-E 세포, T 세포, B 세포, 호산구, 호염기구, 호중구, 단구, 거핵구 또는 적혈구이고; 미분화 세포는 골수성 줄기 세포, 림프계 줄기 세포 또는 다능성 줄기 세포이다.
보다 수임된 세포가 분화 세포인 경우, 이러한 분화 세포는 바람직하게는 B 림프구(활성화 또는 비활성화), T 림프구(활성화 또는 비활성화), 매크로파아지 단구 계통으로부터의 세포, I부류 또는 II부류 항원을 발현할 수 있는 유핵 세포, I부류 또는 II부류 항원의 발현을 유도할 수 있는 세포, 또는 탈핵 세포(즉, 핵을 함유하지 않는 세포, 예를 들면, 적혈구)이다.
또 다른 바람직한 양태에서는, 분화 세포가 큰 과립성 림프구, 영(null) 림프구 및 천연 킬러 세포(각각 CD56 및/또는 CD16 세포 표면 수용체를 발현한다)를 포함하는 그룹 중의 어느 하나로부터 선택된다.
분화 세포는 심지어, 탈핵 세포를 핵형성시킴으로써 형성될 수도 있다.
III. 제제
당해 제제는 세포를 미분화 세포로 역분화시키기 위해 보다 수임된 세포를 작동적으로 교합시킨다. 이와 관련하여, 보다 수임된 세포세포를 미분화 세포로 역분화시키기 위한 제제는 보다 수임된 세포를 직접적으로 교합시키거나 간접적으로 교합시키는데 작용할 수 있다.
상기 제제는 보다 수임된 세포내에서 세포내적으로 작용할 수 있다. 그러나, 바람직하게는 이러한 제제는 보다 수임된 세포의 세포외적으로 작용한다.
직접적인 교합의 한 예는, 보다 수임된 세포가 이의 세포 표면 상에 하나 이상의 세포 표면 수용체, 예를 들면, B 세포 상에서 발견될 수 있는 바와 같은, 상동 영역(동일하거나 유사한 서열을 갖는 것으로 통상 밝혀진 영역)을 갖는 β-쇄를 가질 경우이며, 여기서 상기 제제는 세포 표면 수용체를 직접 교합시킨다. 또 다른 예는 보다 수임된 세포가 이의 세포 표면 상에 세포 표면 수용체, 예를 들면, T 세포 상에서 발견될 수 있는 바와 같은, 상동 영역을 갖는 α-쇄를 가질 경우이며, 여기서 상기 제제는 세포 표면 수용체를 직접 교합시킨다.
간접 교합의 예는 보다 수임된 세포가 이의 세포 표면 상에 2개 이상의 세포 표면 수용체를 가질 경우인데, 제제가 이들 수용체 중의 하나를 교합시키면 다른 수용체에도 영향을 미쳐, 보다 수임된 세포의 역분화를 유도시킨다.
보다 수임된 세포를 미분화 세포로 역분화시키기 위한 제제는 화학적 화합물또는 조성물일 수 있다. 그러나, 바람직하게는, 이러한 제제는 보다 수임된 세포의 표면 상에 세포 표면 수용체를 교합시킬 수 있다. 따라서, 바람직한 양태에서는, 상기 제제가 보다 수임된 세포의 표면 상에 존재하는 수용체(이러한 수용체는 보다 수임된 세포에 의해 발현될 수 있다), 예를 들면, 보다 수임된 세포에 의해 발현될 수 있는 수용체를 작동적으로 교합시킨다.
예를 들면, 바람직한 제제에는 사이클릭 아데노신 모노포스페이트(cAMP), CD4 분자, CD8 분자, T 세포 수용체의 일부 또는 전부, 리간드(고정 또는 자유), 펩타이드, T 세포 수용체(TCR), 항체, 교차반응성 항체, 모노클로날 항체, 또는 폴리클로날 항체 중의 어느 하나 이상이 포함된다. 성장 인자, 예를 들면, 조혈 성장 인자, 예를 들면, 에리트로포이에틴 및 과립구-단구 콜로니 자극 인자(GM-CSF)를 사용할 수도 있다.
당해 제제가 항체, 교차 반응성 항체, 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체인 경우, 이러한 제제는 바람직하게는, 다음 중의 어느 하나 이상에 대한 항체, 교차 반응성 항체, 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체 중의 어느 하나 이상이다: MHC II부류 항원의 β-쇄, MHC HLA-DR 항원의 β-쇄, MHC I부류 또는 II부류 항원의 α-쇄, HLA-DR 항원의 α-쇄, MHC II부류 항원의 α-쇄 및 β-쇄, 또는 MHC I부류 항원의 α-쇄 및 β-쇄. 적합한 항체의 예는 CR3/43(공급원: Dako)이다.
용어 "항체"에는 결합 활성을 보유하고 있는 각종 단편(단백질 분해적 절단에 의해 유도되든지 아니면 재조합 기술에 의해 유도되든지 간에) 및 유도체, 예를들면, Fab, F(ab')2및 scFv 항체 뿐만 아니라 이의 모사체 또는 생체동배체가 포함된다. 또한, 항체로서, 유전공학적으로 처리된 변이체가 포함되는데, 여기서는 아미노산 서열 중의 일부를 예를 들어, 아미노산 잔기를 치환시킴으로써 변형시켜 결합성을 향상시키거나, 또는 항체를 상이한 종에서, 본 발명에 따르는 방법으로 처리하고자 하는 세포를 지닌 유기체로 만들어, 불리한 면역 반응 가능성을 저하시킨다(이의 예가 "사람화" 마우스 모노클로날 항체이다).
보다 수임된 세포를 미분화 세포로 전환시키는데 사용된 제제는 바람직하게는, 보다 수임된 세포의 세포외적으로 작용한다. 특히, 보다 수임된 세포가 상기 제제에 의해 작동적으로 교합이능한 수용체를 포함하고, 이 제제가 상기 수용체를 작동적으로 교합시키는 것이 바람직하다.
예를 들면, 상기 수용체는 세포 표면 수용체일 수 있다. 세포 표면 수용체의 구체적인 예로는 MHC I부류 및 II부류 수용체가 있다. 바람직하게는, 이러한 수용체는 MHC I부류 및 II부류 수용체에 대한 경우처럼 α성분 및/또는 β성분을 포함한다.
보다 바람직하게는, 상기 수용체는 상동 영역, 예를 들면, 적어도 HLA-DR의 β-쇄의 상동 영역을 갖는 β-쇄를 포함한다.
또 다른 한편, 또는 또한, 상기 수용체는 상동 영역, 예를 들면, 적어도 HLA-DR의 α-쇄의 상동 영역을 갖는 α-쇄를 포함한다.
바람직하게는, 상기 수용체는 주요 조직적합성 복합체(MHC)의 I부류 또는 II부류 항원이다. 바람직한 양태에서는, 세포 표면 수용체가 다음들 중의 어느 하나일 수 있다: HLA-DR 수용체, DM 수용체, DP 수용체, DQ 수용체, HLA-A 수용체, HLA-B 수용체, HLA-C 수용체, HLA-E 수용체, HLA-F 수용체, 또는 HLA-G 수용체. 보다 바람직한 양태에서는, 상기 세포 표면 수용체가 HLA-DR 수용체이다.
바람직하게는, 상기 제제가 상기 수용체에 대한 항체, 보다 바람직하게는 상기 제제가 상기 수용체에 대한 모노클로날 항체이다.
제제의 또 다른 바람직한 예는 MHC 유전자 발현, 예를 들면, MHC I+부류 및/또는 MHC II+부류 발현을 조정하는 것이다.
바람직한 양태에서는, 상기 제제를 생물학적 반응 변형제와 연계해서 사용한다. 생물학적 반응 변형제의 예에는 알킬화제, 면역조정제, 성장 인자, 사이토킨, 세포 표면 수용체, 호르몬, 핵산, 뉴클레오타이드 서열, 항원 또는 펩타이드가 포함된다. 바람직한 알킬화제는 사이클로포스포아미드이거나 이를 포함한다.
기타 바람직한 생물학적 반응 변형제에는 MHC I부류 및/또는 II부류 항원 발현을 상향 조절할 수 있는 화합물이 포함된다. 바람직한 양태에서는, MHC 수용체와 결합하는 제제가 보다 효율적으로 작동하도록 해주는 것이다.
어떠한 세포 유형도 MHC I부류 및/또는 II부류 항원을 발현하도록 만들 수 있기 때문에, 이는 이들이 MHC I부류 및/또는 II부류 항원을 구성성으로 발현하든지 아니면 발현하지 않든지 간에 광범위한 세포 유형을 역분화시키는 방법을 제공해야 한다.
IV. 세포의 역분화 방법
본 발명의 방법에서는, 수임 세포를 포함하는 세포 집단을, 이러한 집단 중의 하나 이상의 수임 세포를 작동적으로 교합시키는 제제와 접촉시킨다. 이어서, 상기 세포 집단을 항온배양하여, 상기 제제에 의해 작동적으로 교합된 세포가 역분화 과정을 통하여 진행되어 궁극적으로 미분화되도록 한다.
바람직하게는, 상기 접촉 단계가 다음 중의 어느 하나 이상을 교합시키는 세포를 포함한다: I부류 항원의 α-쇄의 상동 영역, II부류 항원의 α-쇄의 상동 영역, CD4 세포 표면 수용체, CD8 세포 표면 수용체, 림프구의 존재하의 II부류 항원의 β-쇄의 상동 영역, 림프구의 존재하의 I부류 항원의 α-쇄의 상동 영역, 또는 림프구의 존재하의 II부류 항원의 α-쇄의 상동 영역. 바람직하게는, 접촉 단계는 생물학적 반응 변형제(상기 참조)의 존재하에 일어난다.
전형적으로는, 세포 집단은 생물학적 샘플, 예를 들면, 혈액, 또는 골수를 포함한 관련 조직, 중추 신경계 또는 말초 신경계로부터의 신경원 조직, 근육 조직, 또는 피부로부터의 표피 및/또는 진피(즉, 예를 들어, 경구 스크랩핑을 통함)로부터 유도된다. 바람직하게는, 생물학적 물질은 출생 후 기원이다. 전혈 또는 이의 가공 생성물, 예를 들면, 혈장 또는 백혈구연층을 사용하는 것이 바람직한데, 이는 의학적 관리를 최소한으로 하면서 이들을 피검체로부터 분리할 수 있기 때문이다. 혈액 샘플은 전형적으로는 헤파린 또는 시트레이트 등의 항응고제로 처리한다. 생물학적 샘플 중의 세포를 처리하여, 특정 세포 유형을 증강시키거나, 특정세포 유형을 제거하거나 또는 조직 덩어리로부터 세포를 해리시킬 수 있다. 세포를 정제 및 분리하는데 유용한 방법에는 원심분리(예: 밀도 구배 원심분리), 유세포 분석법 및 친화 크로마토그래피(예: 세포 표면 마커에 대한 모노클로날 항체를 포함하는 자기 비드의 사용, 또는 패닝)가 포함된다[참조: Vettese-Dadey The Scientist(Sep. 13 1999) 13 (18):21]. 예를 들면, 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque) 분리가 적혈구 및 과립구를 제거하여 단핵 세포(예: 림프구 및 단구) 만을 잔존시키는데 유용하다.
세포는 본질적으로 1차 배양물이기 때문에, 세포 집단에 적합한 영양분을 보충하여 생육성을 유지시키는 것이 필요할 수 있다. 적합한 배양 조건은 당업자에게 공지되어 있다. 그럼에도 불구하고, 환자로부터 생물학적 샘플을 제거한 후 가능한 한 빨리, 전형적으로는 12시간 이내, 바람직하게는 2 내지 4시간 이내에 세포 집단의 처리를 개시하는 것이 바람직하다. 세포 생육성은 널리 공지된 기술, 예를 들면, 트립판 블루 배제를 이용하여 체크할 수 있다.
세포 집단은 일반적으로, 특정 제제와 함께 2시간 이상, 전형적으로 2 내지 24시간, 바람직하게는 2 내지 12시간 동안 항온배양한다. 항온배양은 전형적으로는 약 실온, 예를 들면, 약 22℃ 내지 약 37℃ 이하(33℃ 포함)에서 수행한다. 역분화 과정의 진행은 작은 분취량의 샘플을 제거하고, 현미경 및/또는 유세포 분석법을 이용하여 세포를 검사함으로써 주기적으로 체크할 수 있다. 또 다른 한편, 당해 장치는 역분화 과정의 진행을 온-라인 모니터링하기 위한 추적 수단을 포함할 수 있다.
목적하는 세포 유형의 상대적인 수가 적합한 수준(이는 예를 들면, 0.1%로 낮을 수 있거나 5% 정도로 높을 수 있다)으로 증가하게 되면, 이로써 생성된 변화된 세포 집단을 수 많은 방식으로 사용할 수 있다. 형성된 미분화 세포 수에 관해서 언급하면, 줄기 세포의 증식 능력을 판단하는 것이 중요하다. 몇몇 상황하에서는, 형성된 줄기 세포 또는 기타 미분화 세포의 수가 낮을 것으로 여겨질 수 있지만, 연구 결과, 다능성 조혈 줄기 세포의 50% 만이 공여자 마우스에서 전체 조혈 시스템을 재구성할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 치료학적 활용에는 다수의 세포 형성이 요구되지 않는다.
보다 수임된 세포를 미분화 세포로 전환시키는 것은, 당해 제제를 약제학적 담체 또는 희석제와 혼합하여 환자에게 생체내 투여함으로써 수행할 수 있다. 그러나, 많은 경우에 있어, 역분화를 시험관내/생체내에서 수행하는 것이 바람직하다.
시험관내에서 수득된 처리된 세포 집단을 최소의 처리 과정을 수반하면서 후속 사용할 수 있다. 예를 들면, 이들을 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 단순히 조합하여, 줄기 세포를 필요로 하는 환자에게 투여할 수 있다.
그러나, 세포 집단에 미분화 세포를 증강시키거나, 이러한 세포를 해당 세포 집단으로부터 정제시키는 것이 요망될 수 있다. 이는 수 많은 방법을 사용하여 편리하게 수행할 수 있다[참조: Vattese-Dadey-The Scientist 13 (18):21 Sep 1999]. 본 발명에 따르는 장치는 상기 미분화 세포를 증강시키거나 이러한 미분화 세포를 변형된 세포 집단으로부터 회수하기 위한 정제 또는 분리용 수단을 임의로 포함할수 있다. 예를 들면, 세포는 크로마토그래피 및/또는 유세포 분석법을 사용하여, 세포 표면 마커에 근거하여 정제할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 세포 집단으로부터 미분화 세포를 광범위하게 정제하는 것이 필요하지도 않고 또한 요망되지도 않을 것인데, 이는 상기 세포 집단에 존재하는 기타 세포(예: 줄기 세포)가 줄기 세포 생육성과 기능을 유지할 수 있기 때문이다.
유세포 분석법은 혼합 집단내에서 세포를 성상 확인할 뿐만 아니라 세포를 분류하기 위한, 널리 확증되고 신뢰성있는 강력한 기술이다. 따라서, 상기 정제 또는 분리용 수단은 유세포 계수기를 포함할 수 있다. 유세포 분석법은 액상 분산액 중의 입자의 물리적 특징에 근거하여 작동되는데, 이는 광빔으로 검색할 때 구별될 수 있다. 이러한 입자는 물론 세포일 수 있다. 물리적 특징에는 세포 크기 및 구조, 또는 최근 수년간 매우 대중적으로 된 바와 같이, 형광성 항체에 접합된 모노클로날 항체에 의해 결합된 세포 표면 마커가 포함된다.
문헌[참조: Kreisseg et al., 1994, J. Hematother 3(4):263-89]에는 "항-CD34 모노클로날 항체의 생체 이용 효율 때문에, 다중파라미터 유세포 분석법은 조혈 줄기 세포 및 전구세포를 결정하기 위한 선택 도구가 되었다"라고 언급되어 있으며, 이에는 유세포 분석법에 의해 CD34-발현성 세포를 정량화 및 성상 확인하기 위한 일반적인 기술이 기재되어 있다. 추가로, 문헌[참조: Korbling et al., 1994, Bone Marrow Transplant. 13:649-54]에는 CD34+세포를 면역흡착시킨 다음, HLA-DR 발현에 근거하여 유세포 분석법으로 상기 세포를 정제하는 기술이 교시되어있다. 상기 논의된 바와 같이, CD34+는 줄기 세포/전구세포와 연관하여 유용한 마커이다.
기타 물리적 특징에 근거하여 줄기 세포를 분류하기 위한 유세포 분석 기술이 또한 이용 가능하다. 예를 들면, 문헌[참조: Visser et al., 1980, Blood Cells 6:391-407]에는 줄기 세포를 이들의 크기와 구조에 근거하여 분리할 수 있다고 언급되어 있다. 문헌[참조: Grogan et al., 1980, Blood Cells, 6:625-44]에는 또한, "살아있는 줄기 세포를 단순한 조혈 조직으로부터 검증가능한 고도의 순도도 분류할 수 있다"라고 언급되어 있다.
세포 표면 마커의 존재 여부 또는 기타 물리적 특성에 근거하여 세포를 선별하는 것 뿐만 아니라(양성 선별), 음성 기준을 이용하여 세포 집단을 증강, 정제할 수 있다. 예를 들면, CD4, CD8, CD42 및 CD3 등의 계통 특이적 마커를 보유하고 있는 세포는 유세포 분석법 또는 친화 크로마토그래피함으로써 세포 집단으로부터 제거할 수 있다.
세포를 정제하는데 매우 유용한 기술은 자기 비드에 연결된 항체 또는 기타 친화 리간드의 사용을 포함한다. 상기 비드를 세포 집단과 함께 항온배양하고, 친화 리간드가 결합된 세포 표면 마커(예: CD34)를 갖는 세포를 포획한다. 이러한 세포를 함유하는 샘플 튜브를 자기 샘플 농축기에 위치시키는데, 여기서는 상기 비드가 튜브 측면에 유착된다. 1회 이상의 세척 단계 후, 관심있는 세포를 기타 세포로부터 부분적으로 또는 거의 완전히 정제하였다. 음성 선별 포맷으로 사용되는경우, 액상을 따라 냄으로써 비드에 결합된 세포를 세척하는 것 대신, 상기 액상을 유지시켜, 결과적으로 비드에 결합된 세포를 세포 집단으로부터 효과적으로 제거시킨다.
이들 친화 리간드 이용 정제 방법은 어떠한 세포 유형을 이용해서도 사용할 수 있는데, 상기 세포 유형에 대한 적합한 마커를 성상 확인하였거나 성상 확인할 수 있다.
문헌[참조: Urbankova et al., 1996.(J. Chromatogr B Biomed Appl. 687:449-52]에는 중력장 유동 분별시킴으로써 마우스 골수 현탁액으로부터 조혈 줄기 세포를 미소제조하는 방법이 교시되어 있다. 상기 문헌에는 추가로, 상기 방법을 마우스 골수로부터 줄기 세포를 성상 확인하는데 사용하였는데, 이는 이들 세포가 골수 중의 다른 세포 보다 크므로 이들을 혼합물로부터 분리하는 것이 가능하기 때문이라고 언급되어 있다. 따라서, 세포 표면 마커 이외의 기타 물리적 파라미터를 사용하여 줄기 세포를 정제 및/또는 증강시킬 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 생성된 미분화 세포 및 정제된 미분화 세포를 포함하는 세포 집단은 공지된 기술을 사용하여 시험관내에서 유지시킬 수 있다. 전형적으로는, 세포에 대한 적합한 성장 환경을 제공해주기 위해, 포유류 혈청, 예를 들며, FBS, 및 임의로 자가 혈장이 보충된 최소 성장 배지, 예를 들면, 한크스(Hanks), RPMI 1640, 둘벡코 최소 필수 배지(DMEM) 또는 이스코브(Iscove) 변형 둘벡코 배지를 사용한다. 바람직한 양태에서는, 줄기 세포를 공급기 층, 예를 들면, 지질(stromal) 세포 층 상에서 배양한다[참조: Deryugina et al., 1993,Crit Rev. Immunology, vol 13:115-150]. 지질 세포는 전구세포를 미분화 상태로 유지시키는 인자를 분비하는 것으로 여겨진다. 줄기 세포에 대한 장기간 배양 시스템이 문헌[참조: Dexter et al., 1977 (J. Cell Physiol, vol 91:335) and Dexter et al., 1979 (Acta. Haematol., vol 62:299)]에 기재되어 있다.
예를 들면, 문헌[참조: Lebkowski et al., 1992 (Transplantation 53(5):1011-9)]에는 폴리스티렌 표면 상에 공유적으로 고정화된 모노클로날 항체를 사용하는 것에 기초한 기술을 사용하여, 사람 CD34+조혈 세포를 정제할 수 있다는 사실과; 이러한 과정에 의해 정제된 CD34+세포가 85% 이상의 생육도로 유지될 수 있다는 사실이 교시되어 있다. 문헌[참조: Lebkowski et al, 1993 (J. Hematother, 2(3):339-42)]에는 또한, 사람 CD34+세포를 분리 및 배양하는 방법이 기재되어 있다. 각종 방법에 관한 고찰을 위해서는 다음 문헌을 참조할 수 있다[Haylock et al., 1994 (Immunomethods, vol 5(3):217-25)].
수 많은 시험관내 검정, 예를 들면, CFC 검정(하기 실시예 참조)을 사용하여, 줄기 세포 정체를 확인할 수 있다. 장기간 배양 개시 세포(LTC-IC) 검정을 사용하여, 극히 원시적인 조혈 줄기 세포를 종종 측정한다[참조: Eaves et al., 1991. J. Tiss. Cult. Meth. Vol 13:55-62]. LTC-IC는 조혈 작용을 5 내지 12주 동안 지속시킨다.
미분화 세포를 포함하는 세포 집단, 및 미분화 세포를 포함하는 정제된 제제를 추가의 사용을 위해 동결시킬 수 있다. 세포를 동결시킨 다음 이들을 후속 해동시키는데 적합한 기술이 당해 분야에 공지되어 있다. 본 발명에 따르는 장치는 임의로, 미분화 세포를 포함하는 세포 집단 및/또는 미분화 세포를 포함하는 정제된 제제를 동결시키기 위한 동결 수단을 추가로 포함할 수 있다.
한 국면에 있어서, 바람직하게는, 역분화가 백혈구연층 혈액 샘플로부터의 세포 또는 이러한 샘플 중의 세포에 대해 일어난다. 용어 "백혈구연층"은 응고되지 않은 혈액을 원심분리시키거나 정치시켜 둘때 적혈구와 혈장 층 사이에 형성되는 백혈구 층을 의미한다.
V. 세포 집단 중의 정상적인 분화 세포 비율의 변위
정상 조직에서는, 분화 세포와 미분화 세포를 포함한 각종 유형의 세포의 상대적인 수는 소정 시간에 통상적으로 일정하다. 예를 들면, 건강한 21세 개인의 백혈구 계수치는 전형적으로 약 8 x 106/ml인데, 이의 27%가 림프구이고, 6%가 단구이며 67%가 과립구이다. 이러한 세포 수준(상대적인 수와 절대적인 세포 계수치 모두를 포함함)은 질병을 앓는 동안에는 교란되는데, 이는 B 세포 만성 림프구성 백혈병(B-CLL)을 앓는 환자의 백혈병성 혈액의 경우이다.
분화 세포의 상대적인 수(즉, 비율)는, 백혈구 또는 백혈구연층을 히스토파크(histopaque) 위에 층 형성시켜 과립구를 제거하여 분화 세포를 미분화 세포로 역분화시킴으로써, 예를 들어, 단핵 세포 분획에서 혼란, 교란 또는 변위시킬 수 있는데, 이러한 미분화 세포는 자가 재생(증식)되고 각종 세포 유형으로 역분화되어 변위된 세포를 보충할 것이다.
분화 세포의 상대적인 수(즉, 비율)는 또한, 적혈구, 혈소판, 과립구, 단구 및 T 림프구를 제거한 후에(항체 피복된 자기 비드를 사용하여 음성 선별하거나 밀도 구배 배지 상에서 원심분리시킴으로써 수행됨), 예를 들어, 백혈구연층(건강한 혈액 공급자로부터 수득됨)에서 혼란, 교란 또는 변위시킬 수 있다. 이러한 처리는 소위 음성 선별 또는 특정 유형의 분화 세포의 증강으로 불리우며, 이는 변위된 조직의 한 예이다. 이러한 세포를, 예를 들면, 칼슘 함유 배지, 예를 들면, 이스코브 변형된 둘벡코 배지(ISDM)에서 배양할 경우, 분화 세포는 미분화 세포로의 역분화를 진행하고, 이러한 미분화 세포는 자가 재생(증식)되고 각종 세포 유형으로 역분화되어 변위된 세포를 보충할 것이다.
이러한 과정 동안, 세포는 먼저, 역분화를 진행하기 위해 콜로니로 군집하는 것으로 관찰되었다(동질세포성 응집을 진행한다). 보다 수임된 세포가 일단 미분화 세포로 전환되면, 이들은 변위된 세포의 상대적인 수를 보충할 노력으로, 각종 재분화 세포 유형으로 증식 및 발생하는 능력을 획득하게 된다.
세포 집단 중의 정상적인 분화 세포의 비율을 변위시키도록 작동가능한 역분화 수단에는 예를 들어, 항체(순수한 및 접합된, 즉 고정 및 자유 리간드, 예를 들면, 자기, 유리 또는 폴리스티렌 비드에 결합된 항체); 히스토파크, 림포프렙(LymphoPrep), 또는 세포의 밀도에 따라서 세포를 분리하는데 사용되는 모든 밀도 구배 배지; 또는 덱스트란(예를 들어, 적혈구의 침강을 유발시킬 수 있음)이 포함된다. 기타 적합한 역분화 수단은 다음 문헌에서 확인할 수 있다[참조:Vettese-Dadey (The Scientist (Sep. 13 1999) 13(18): 21)].
변위된 세포를 적합한 킬레이트제(EDTA, EGTA 및 헤파린 포함)(이러한 킬레이트제는 생물학적 반응 변형제로서 지칭될 수 있다)에 노출시키면, 훨씬 더 수임된 세포가 미분화 세포로 역분화될 수 있다. 예를 들면, 변위된 세포를 예정 시간 동안 EDTA에 노출시킨 다음, 이 세포를 코르티손을 함유하는 칼슘 함유 배지에서 배양하면, 보다 수임된 세포가 미분화 세포로 역분화된다. 이들 세포는 결구, 자가 재생되고 새로운 분화 경로에 들어가, 적혈구계 전구세포, 예를 들면, 파열 형성 단위-적혈구계(BFU-적혈구계)를 생성시킨다. 이러한 적혈구계 전구세포를 장기간 동안 배양 및 확장시킬 수 있고, 이를 적혈구 장애 및 적혈구 결핍을 치료하는데 사용할 수 있다.
VI. 세포 집단을 포함하는 배지의 자유 이온 농도를 변화시킴
분화 세포를 소정의 시간 동안 이온 킬레이트제, 예를 들면, EGTA에 노출시킨 디음, 이 세포를 하이드로코르티손을 함유하는 칼슘 함유 배지(예: IMDM)에서 배양하면, 보다 수임된 세포가 미분화 세포로 역분화된다. 이들 세포는 결과적으로, 자가 재생하고 새로운 분화 경로로 들어가, 거핵구성 전구세포, 예를 들면, 콜로니 형성 단위-거핵구(CFU-Meg)를 생성시키며, 이로써 혈소판이 생성된다.
VII. 미분화 세포를 재수임하는 방법
본 발명의 미분화 세포의 특정의 중요한 적용 분야는 조직, 예를 들면, 신경조직 또는 조혈 세포를 재구성하는데 사용하는 것이다. 이는 본 발명의 방법에 의해 생성된 미분화 세포를 분화시키는 것을 포함한다. 이는 미분화 세포를 환자, 전형적으로 환자의 관심있는 특정한 부위, 예를 들면, 골수, 척수 또는 폐에 단순히 투여한 다음, 이러한 환자내의 천연 생리학적 상태가 분화되도록 함으로써 수행될 수 있다. 이의 구체적인 예는, 예를 들어, CD4+림프구 수가 감소된 AIDS 환자의 경우에, 조혈 시스템을 재구성 또는 보충하는 것이다.
또 다른 한편, 분화(본원에서 "재수임"으로 지칭되기도 함)을 시험관내에서 수행하고 세포를 확장시킨 다음, 치료학적으로 투여할 수 있다. 이는 일반적으로, 성장 인자를 투여함으로써 수행된다. 예를 들면, 레티노산을 사용하여 ES 세포를 신경 세포로 분화시킨다. 골수 지질주 및 IL-7와 공동 배양한 다음에 메틸셀룰로즈를 사용하여 ES 세포를 림프구 전구체로 분화시킨다[참조: Nisitani et al., 1994, Int. Immuno., vol 6(6): 909-916]. 문헌[참조: Le Page (New Scientist 16 December 2000)]에는 ES 세포를 폐 상피 세포로 분화할 수 있다고 교시되어 있다. 문헌[참조: Bischoff, 1986 (Dev. Biol., vol 115(1): 129-39)]에는 근육 수반 세포를 성숙한 근육 섬유로 분화시키는 방법이 교시되어 있다. 신경원 전구체 세포는 염기성 섬유아세포 성장 인자 및 표피 성장 인자로 확장시킬 수 있다[참조: Nakafuku and Nakamura, 1995, J. Neurosci. Res., vol 41(2): 153-168]. 조혈 줄기 세포는 GM-CSF, 에리트로포이에틴, 줄기 세포 인자 및 인터루킨(IL-1, IL-3, IL-6)를 포함한 수 많은 성장 인자를 사용하여 확장시킬 수 있다. 이들 각종 인자에 관한 고찰은 다음 문헌을 참조할 수 있다[Metcalf, 1989 (Nature, vol 339:27-30].
문헌[참조: Potocnik et al., 1994 (EMBO J., vol 13(22): 5274-83)]에서는 ES 세포를 저산소(5%) 조건을 이용하여 조혈 세포로 분화시키는 것이 입증되었다.
따라서, 본 발명의 바람직한 양태에서는, 미분화 세포를 재수임 세포, 예를 들면, 분화 세포로 수임시킨다. 이러한 재수임 세포는 미분화 세포가 유도되는 보다 수임된 세포와 동일한 계통의 것일 수 있다. 또 다른 한편, 상기 재수임 세포는 미분화 세포가 유도되는 보다 수임된 세포와 상이한 계통의 것일 수 있다. 예를 들면, B 림프구를 CD34+CD38_HLA-DR_줄기 세포로 역분화시킬 수 있다. 줄기 세포를, B 세포 계통(동일한 계통) 또는 림프계 계통(상이한 계통)을 따라 후속 재수임시킬 수 있다.
미분화 세포를 재수임 세포(예: 분화 세포)로 수임시키는 것은 당업자에게 공지된 각종 방식으로 수행할 수 있다. 특히, 미분화 세포를 특정한 방식으로 특정한 배지에서 배양함으로써, 선별된 세포로의 분화를 수행할 수 있다.
예를 들면, 미분화 세포는 다음의 강조된 배양 섭생을 수행함으로써 심장 근세포로 분화시킬 수 있다:
1일째: 젤라틴화 판 상의 정상 밀도로 존재하는 미분화 세포를 섬유아세포가 포함된 배양물내로 자유롭게 통과시킨다.
콜로니가 떠오를 때까지 정상적인 계대접종을 위해 세포를 트립신 처리한다.느슨하게 연결된 세포 클럼프를 함께 유지하기 위해 조심스럽게 조작한다. 이어서, 세포 1:3을 LIF 비함유 ES 세포 배양 배지 중의 세균 등급의 페트리 디쉬내로 직접 도말한다(하기 참조).
3일째: 상기 배지를 조심스럽게 탈기시킨다. 응집체가 너무 흡인되는 것을 피할 수 있다.
5일째: 3일째에서와 같이 탈기시키고 배지를 대체시킨다.
7일째: 세포를 24 윌(wheel) 조직 배양 등급 판내로 도말한다.
9일째: 배지 반감기를 변화시키고, 비팅을 관찰한다.
11일째: 배지의 반감기를 변화시키고, 비팅을 관찰한다.
추가의 예로써, 미분화 세포를 다음의 과정을 수행함으로써 신경교 세포 및 신경원으로 분화시킬 수 있다.
1일째: 젤라틴화 판 상의 정상 밀도로 존재하는 미분화 세포를 섬유아세포가 포함된 배양물내로 자유롭게 통과시킨다.
콜로니가 떠오를 때까지 정상적인 계대접종을 위해 세포를 트립신 처리한다. 느슨하게 연결된 세포 클럼프를 함께 유지하기 위해 조심스럽게 조작한다. 이어서, 세포 1:3을 1μM 모든-트랜스 레티노산(Sigma로부터 입수 가능함)을 함유하는 LIF 비함유 배지 중의 세균 등급의 페트리 디쉬내로 직접 도말한다.
3일째: 세포 응집체를 수집하고, LIF 또는 RA를 함유하지 않는 ES 세포 배양 배지 중에서 조직 배양 디쉬에 재도말한다(6cm 조직 배양 디쉬당 대략 25개 세포 응집체). 상기 배지를 조심스럽게 탈기시킨다.
8일째: 배지의 반감기를 변화시킨다. 이 날부터, 상기 세포의 10% 이상에서 신경원 표현형이 나타난다. 이들를 크레실 바이올렛(Cresyl Violet)으로 특수하게 염색시키면, 이는 N-CAM 항원에 대해 강력히 양성이다.
당업자는 미분화 세포를 선별된 모든 분화 세포로 수임하는데 적합한 과정을 용이하게 인지할 것이다.
본 발명의 미분화 줄기 세포는 통상적인 어떠한 배아 줄기(ES) 세포 배양 기술을 사용해서도 배양할 수 있다. 단지 예를 들면, 미분화 또는 ES 세포 배양에 적합한 배지가 다음에 상세히 언급되어 있다.
배지 100ml를 제조하기 위한 조성:
DMEM(GIBCO cat# 11965-062) 80ml
15% FCS 15ml
Pen/Strep 1ml
L-글루타민 1ml
MEM 비필수 아미노산(GIBCO cat#11140-050) 1ml
Lif(105U/ml) 1ml
BME(0.1M) 0.2ml
상기 Lif는 1ml 앰풀에서 107U/ml의 LIF ESGRO AMRAD로 되는데, 이를 100ml DMEM 및 10% FCS에서 희석시키고 -20℃에서 5ml 분취량으로 저장한다.
BME에 관해 언급하면, 0.1ml의 BME(14.4M)을 14.3ml PBS에 가하고, 0.2마이크론 아크로디스크내로 여과시킨 다음, -20℃에서 1개월까지 저장할 수 있다.
추가의 적합한 배지는 예를 들면, PMEF 배지일 수 있고, 이러한 배지 100ml는 다음에 상세된 바와 같이 제조한다:
DMEM(GIBCO cat#11965-062) 88ml
10% FCS 10ml
Pen/Strep 1ml
L-글루타민 1ml
BME(0.1M) 0.2ml
ES 세포를 배양하는데 적합한 기타 배지는 당업자에게 용이하게 명백할 것이다.
VIII. 역분화 제제를 동정하기 위한 검정
상기 언급된 제제 이외에도, WO 96/23870 또는 본 발명의 검정 방법을 사용하여 추가의 적합한 제제를 동정할 수 있다. 후자의 국면에 관해 언급하면, 본 발명은 또한, 수임 세포를 포함하는 세포 집단을 후보 물질과 접촉시키는 단계; 및 이러한 세포 집단 중의 미분화 세포의 상대적인 수가 증가되었는지를 결정하는 단계를 포함하는(여기서, 상기 접촉은 백혈구연층의 존재하에 일어난다), 수임/분화 세포를 미분화 세포로 역분화시킬 수 있는 물질을 동정하는 방법을 제공한다.
적합한 후보 물질에는 세포 표면 수용체와 결합되는 리간드, 예를 들면, 항체 생성물(예: 모노클로날 및 폴리클로날 항체, 단일 쇄 항체, 키메릭 항체 및 CDR-이식된 항체), 예를 들면, 세포 표면 수용체와 결합되는 항체가 포함된다. 특별히 관심있는 세포 표면 수용체가 상기 언급되어 있고, 이에는 CD 명칭, 예를 들면, CD4 및 CD8을 갖는 표면 단백질 및 MHC 수용체가 포함된다. 세포 표면 수용체와 결합되는 기타 리간드에는 성장 인자가 포함된다.
더우기, 조합 라이브러리, 펩타이드 및 펩타이드 모사체, 규정된 화학적 실체, 올리고뉴클레오타이드, 및 천연 생성물 라이브러리를 대상으로 하여, 역분화제로서의 활성에 대해 스크리닝할 수 있다. 후보 물질을, 반응당 10개 물질의 배치에서 초기 스크린에 사용할 수 있는데, 억제를 나타내는 이들 배치 물질을 대상으로 하여, 개별적으로 시험하였다.
전형적인 검정은 수임 세포를 포함하는 분취량의 세포를 적합한 용기(예: 다중웰 판)내에 위치시킴을 포함한다. 후보 물질을 상기 웰에 가하고, 이 세포를 상기 웰에서 항온배양한다. 항온배양은 전형적으로는 약 실온, 예를 들면, 약 22℃ 내지 약 37℃ 이하(33℃ 포함)에서 수행한다.
역분화 과정은 작은 분취량의 세포를 제거하고, 현미경 및/또는 유세포 분석법을 이용하여 세포를 검사함으로써 미분화 세포의 수적 변화가 있었는지를 결정함으로써 측정할 수 있다. 전형적으로는, 미분화 세포의 수적 변화를 결정하는 것은 미분화 세포의 특징적인 세포 표면 마커를 갖는 세포의 수적 변화를 모니터링함으로써 수행하지만, 형태학적 변화가 또한 지침으로서 사용될 수도 있다. 적합한 세포 표면 마커의 예에는 CD34+가 포함된다. 또 다른 한편, 또는 또한, 분화 세포 및 미분화되지 않은 세포 특유의 세포 표면 마커를 갖는 세포의 수적 감소는, 예를 들어, CD3, CD4 및 CD8 등의 계통 특이적 마커를 보유하고 있는 세포의 상대적인 수 감소를 모니터링해줄 수 있다.
바람직하게는, 미분화 세포 특유의 세포 표면 마커를 갖는 세포의 어떠한 수적 증가도 24시간, 더욱 바람직하게는 4 내지 8시간 이내에 일어나므로, 어떠한 변화도 세포 증식으로써만 설명될 수 없다.
예를 들어, 세포 표면 수용체, 예를 들면, MHC I부류 또는 II부류 수용체와 결합하는 제제를 예비스크리닝하는 것이 요망될 수 있다. 이때, 표적 세포 표면 수용체와 결합하는 것으로 동정된 모든 제제를 상기 검정에 사용하여, 역분화에 대한 이들의 효과를 결정할 수 있다. 특정한 예로서, 항체 결합성 도메인을 발현하는 파아지 디스플레이 라이브러리를 사용하여, 표적 세포 표면 마커, 예를 들면, MHC II부류 수용체의 β-쇄의 상동 영역과 결합하는 항체 단편(전형적으로는, scFvs)을 동정할 수 있다. 적합한 결합성 검정은 당해 분야에 공지되어 있고, 이는 파아지 디스플레이 라이브러리의 발생과 스크리닝에 대해서와 같다. 최적의 항체 또는 항체 단편을 동정하기 위한, 예를 들면, 역분화를 수행하는 것으로 이미 밝혀진 항체 유도체의 돌연변이 유발된 라이브러리를 스크리닝하기 위한 검정을 사용할 수도 있다.
IX. 용도
본 발명은 수임 세포를 미분화 세포로 역분화시키는 방법 및 장치를 제공한다. 특히, 본 발명은 보다 분화된 세포로부터 줄기 세포를 제조하는 방법 및 장치를 제공한다. 이와 관련하여 예상되는 임상 결과는 대단히 큰데, 이는 줄기 세포가 광범위한 치료학적 적용 분야에 사용되고 있지만, 지금까지는 이를 획득하기가 어렵고, 성가시며, 종종 윤리적으로 논쟁의 여지가 있다.
본 발명에 따라서 생성된 줄기 세포를 사용하여, 특이적 세포 집단, 예를 들면, 조혈 세포 집단 또는 이의 아집단, 예를 들면, CD4 T-림프구를 환자내에 거주시킬 수 있다. 줄기 세포를 생성하기 위해 사용된 보다 수임된 세포는 동일한 환자 또는 이와 부합된 공여자로부터의 것일 수 있다. 따라서, 본 발명에 따라서 생성된 줄기 세포를 사용하여, 특수(진화된) 세포 조직 및 기관을 재구성 및 치유할 수 있다. 예를 들면, 미분화 세포를 사용하여, 재수임 세포, 예를 들면, 폐의 폐포 내면 세포를 생성시킴으로써, 손상을 입거나 병을 앓는 폐 조직을 대체 또는 수복할 수 있는 메카니즘이 창출된다[참조: Le Page, New Scientist 19 December 2000, p20].
따라서, 본 발명에 따라서 생성된 줄기 세포를 환자내로 도입하여, 세포를 신체내에 거주시킬 수 있다. 적합하게는, 줄기 세포를 먼저 이식한 다음 거주시킨다.
적합하게는, 줄기 세포를 리포솜성 전달을 이용하여 생체내 도입할 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한, 적합한 희석제, 담체 또는 부형제와 혼합된, 당해 장치 또는 상기 공정들 중의 어느 하나에 의해 제조된 미분화 세포를 포함하는 약제를 포괄한다.
한 양태에서는, 미분화 세포를 포함하는 약제를 사용하여, 유익한 보다 수임된 세포, 예를 들면, 정확한 게놈 구조를 갖는 세포를 생성시킴으로써, 부정확한 게놈 구조를 갖는 보다 수임된 세포에 의해 야기되거나 이와 연관하여 야기된 모든 증상 또는 질환을 경감시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한, 본 발명의 방법에 의해 미분화 세포를 형성하는 단계; 및 이러한 미분화 세포를 재수임 세포로 수임시킴으로써, 이러한 세포의 게놈 및/또는 핵의 배열 또는 재배열로 인해 후천적 돌연변이가 제거되는 단계를 포함하는, 보다 수임된 세포로부터 상기 후천적 돌연변이를 제거하는 방법을 제공한다.
바람직하게는, 당해 제제를 상기 게놈의 면역글로불린 영역 또는 TCR 영역내로 삽입시킨다.
본 발명은 또한, 보다 수임된 세포를, 이러한 보다 수임된 세포를 미분화 세포로 역분화시키는 특정 제제와 접촉시킴으로서 미분화 세포를 제조하는 단계; 및 이러한 미분화 세포를 재수임 세포로 수임시키는 단계를 포함하는데, 이러한 미분화 세포 또는 재수임 세포가 결함있는 세포 또는 원치않는 세포에 영향을 미쳐, 이러한 결함있는 세포 또는 원치않는 세포로부터 비롯된 질병 또는 장애 증상을 경감시키거나 이러한 질병 또는 질환을 앓는 환자를 치료하는, 상기 질병 또는 장애를 앓는 환자를 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 한편, 미분화 세포를 사용하여, 부정확한 게놈 구조를 갖는 보다 수임된 세포에 의해 유발되거나 이와 연관하여 유발된 모든 증상이나 질환을 치료해주는 실체를 생성시키는 보다 수임된 세포를 제조할 수 있다.
예를 들면, 본 발명을 사용하여, 미분화 세포로 역분화시킨 보다 수임된 세포에 의해 발현되는 항원에 대한 항체 또는 T 세포 수용체를 제조할 수 있다. 이와 관련하여, 상기 항원은 태아특이적 항원 또는 교차 반응성 태아특이적 항원일 수 있다.
본 발명에는 또한, 미분화 세포 및 보다 수임된 세포의 수준을 제어하기 위한 방법 및 장치가 포함된다. 예를 들면, 본 발명에는 본 발명에 따르는 방법에 의해 미분화 세포를 형성하는 단계; 및 이러한 미분화 세포에 영향을 미치는 세포 소멸 유전자를 활성화시키는 단계, 예를 들면, 세포 사망을 유발시킴을 포함하는 방법이 포함된다.
바람직한 양태에서는, 본 발명은 특정 유전자를 보다 수임된 세포내로 도입하는 단계; 및 본 발명에 따르는 방법에 의해 미분화 세포를 제조함으로써, 이러한 유전자가 미분화 세포내에 존재하도록 하는 단계를 포함하는, 미분화 세포의 게놈내로 상기 유전자를 도입하는 방법에 관한 것이다.
보다 바람직한 양태에서는, 본 발명은 특정 유전자를 보다 수임된 세포의 게놈내로 삽입하는 단계; 및 본 발명에 따르는 방법에 의해 미분화 세포를 제조함으로써, 이러한 유전자가 미분화 세포내에 존재하도록 하는 단계를 포함하는, 미분화 세포의 게놈내로 상기 유전자를 도입하는 방법에 관한 것이다.
상기 유전자는, 이로부터 수득된 미분화 세포 및 보다 분화된 세포가 병원성 감염(예: 바이러스성 감염)에 대해 보다 더 내성이 있도록 해주는 유전자일 수 있다. 특히, 예를 들면, AIDS 환자로부터의 B 림프구를 사용하여 줄기 세포를 생성시킨 다음, 이것이 HIV 감염에 대해 내성이 있도록 유전공학적으로 처리한다. 확장되어 환자내로 도입되는 경우, 이로써 생성된 헬퍼 T 림프구는 또한, HIV 감염에 대해 내성이 있을 수 있다.
또 다른 양태에서는, 본 발명은 특정 유전자를 보다 수임된 세포의 게놈내로 삽입하는 단계; 및 본 발명에 따르는 방법에 의해 미분화 세포를 제조함으로써, 이러한 유전자가 미분화 세포내에 존재하도록 하는 단계를 포함하는, 미분화 세포내로 상기 유전자를 도입하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 미분화 세포를 재수임 세포로 수임시키는 단계; 및 이러한 재수임 세포를 골수종에 융합시키는 단계를 포함하는, 미분화 세포를 제조하기 위한 본 발명의 방법을 포괄하기도 한다. 이로써, 다량의 목적 생성물, 예를 들면, 항체 또는 항원 또는 호르몬 등을 시험관내에서 발현할 수 있다.
본 발명은 이들 본 발명의 방법들 중의 어느 하나에 의해 제조된 미분화 세포를 포괄한다.
추가의 양태에서는, 본 발명에 따르는 장치 및/또는 방법을 사용하여, 적혈구를 생성하기 위해 적혈구계 전구세포를 효과적으로 배양할 수 있는데, 이러한 적혈구를 사용하여 예를 들어, 혈액 공급업체의 부족분을 보충해줄 수 있다. 적합하게는, 본 발명에 따르는 방법을 사용하여, 혈소판 생성에 사용하기 위한 거핵구를 생성할 수 있다.
대체 양태에서는, 본 발명의 장치 및/또는 방법을 미분화 세포의 뱅크, 즉 처리된 세포의 뱅크를 제조하는데 사용할 수 있다.
본 발명의 기타 국면에는 다음이 포함된다:
보다 수임된 세포로부터 미분화 세포를 제조하기 위한, 본 발명의 제제 중의 어느 하나의 용도;
B-림프구 또는 T-림프구로부터의 모노클로날 또는 폴리클로날 또는 특이적 항체; 매크로파아지 단구 계통으로부터의 세포; I부류 또는 II부류 항원을 발현할수 있는 유핵 세포; I부류 또는 II부류 항원 발현을 유도할 수 있는 세포; 탈핵 세포; 단편화 세포; 또는 세포 소멸성 세포 중의 어느 하나를 생성하기 위한, 본 발명의 방법에 따라서 제조된 미분화 세포의 용도;
B-림프구로부터 유효인자 T-림프구를 생성하거나 이와 반대로 생성하기 위한, 본 발명의 방법에 따라서 제조된 미분화 세포의 용도;
약제, 예를 들면, B-림프구, T-림프구, 매크로파아지 단구 계통으로부터의 세포, I부류 또는 II부류 항원을 발현할 수 있는 유핵 세포, I부류 또는 II부류 항원 발현을 유도할 수 있는 세포 또는 탈핵 세포를 포함하거나 이로부터 만들어진 약물 중의 어느 하나를 생성하기 위한, 본 발명의 방법에 따라서 제조된 미분화 세포의 용도.
본 발명은 또한, 전술된 용도 및 생성물을 활용하는 방법, 또는 이러한 방법으로부터 제조된 조성물을 포괄한다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따르는 미분화 세포 또는 이로부터 수득된 생성물을 적합한 희석제, 담체 또는 부형제와 혼합하여 포함하는 약제를 포괄한다.
한 바람직한 양태에서는, 당해 약제가 본 발명에 따르는 미분화 세포로부터 수득된 항체 또는 항원을, 적합한 희석제, 담체 또는 부형제와 혼합하여 포함한다.
바람직하게는, 상기 약제는 다음 중의 어느 하나를 치료하기 위한 것이다: 암, 자가면역 질환, 혈액 장애, 세포성 또는 조직 재생, 기관 재생, 기관 또는 조직 이식체 치료, 또는 선천성 대사 장애.
본 발명의 방법, 및 이러한 방법에 의해 수득된 생성물, 예를 들면, 미분화세포를, 예를 들어, 역분화, 분화 및 정체성을 연구하고, 새로운 발생적 항원 및 군집 분화 항원을 연구하기 위한 조사에 사용할 수 있다.
X. 투여
본 발명의 줄기 세포 및 수임 세포, 뿐만 아니라 세포를 역분화시키는 것으로 밝혀진 항원을 치료학적 방법에 사용할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 세포 또는 제제를 각종 성분들과 조합하여, 본 발명의 조성물을 생성시킨다. 보다 바람직하게는, 상기 조성물을 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 조합하여 약제학적 조성물(이는 사람 또는 동물용일 수 있다)을 생성시킨다. 적합한 담체 및 희석제에는 등장성 식염수, 예를 들면, 인산염 완충 식염수가 포함된다. 본 발명의 조성물은 직접 주사함으로써 투여할 수 있다. 당해 조성물은 비경구, 근육내, 정맥내, 피하, 안내, 경우 또는 경피 투여용으로 제형화할 수 있다.
세포를 포함하는 조성물은 전형적으로는 주사 또는 이식함으로써 전달한다. 세포는 현탁액 중에서 전달하거나 지지체 매트릭스, 예를 들면, 천연 및/또는 합성의 생분해가능한 매트릭스내에 포매시킬 수 있다. 천연 매트릭스에는 콜라겐 매트릭스가 포함된다. 합성 생분해가능한 매트릭스에는 폴리무수물 및 폴리락트산이 포함된다. 이들 매트릭스는 생체내에서 허약한 세포를 지지해주기 위해 제공되고, 이는 비-조혈 세포에 바람직하다.
전달은 또한, 제어식 전달일 수 있는데, 즉 이는 수 분 내지 수 시간 또는 수 일에 걸쳐 이루어질 수 있다. 전달은 전신성(예를 들면, 정맥내 주사)이거나관심있는 특정한 부위에서 직접 이루어질 수 있다.
세포는 전형적으로는 1 x 105내지 1 x 107개 세포/kg의 용적으로 투여한다. 예를 들면, 70kg 환자에게는 조혈 조직을 재구성하기 위해 14 x 106개의 CD34+세포를 투여할 수 있다.
본원에 기재된 투여 경로 및 투여량은 단지 지침일 뿐인데, 이는 당업자는 특정의 환자 및 상태에 대한 최적의 투여 경로와 투여량을 용이하게 결정할 수 있을 것이기 때문이다.
다음에 명세된 모든 방법은 본 발명에 따르는 장치로 사용하기에 적합하다.
A. 재료 및 방법
환자
B 세포 만성 림프구성 백혈병을 앓는 환자, 항체 결핍증을 앓는 환자(IgA 결핍증 및 X 염색체 연결된 소아 저감마글로불린혈증 포함), HIV 감염 및 AIDS 증상을 나타내는 환자, CMV 감염을 앓는 환자, 호지킨 림프종을 앓는 환자, 급성 T 세포 백혈병을 앓는 환자, 블라스토사이토시스(blastcytosis)을 앓는 6일생 유아, 각장 감염과 임상 질환을 나타내는 각종 환자, 대 혈액, 골수, 및 건강한 혈액 공급자의 증강된 B-림프구 제제로부터의 EDTA를 함유하는 라벤더(lavender) 상단 튜브에서 혈액 샘플을 수득하였다. 부가적으로, 백혈구연층 혈액 샘플을 건강한 공여자로부터 수득하였다.
임상 및 실험 조건
이들의 혈액 샘플에 적용된 각종 유형의 처리를 포함한, 환자의 임상 및 실험적 처리 조건이 표 1에 기재되어 있다. 코울터 계수기를 이용하여 분화성 백혈구 세포(WBC)를 수득하고, 이들 역시 동일한 표에 포함되어 있다.
혈액 처리
일단 수득한 혈액 샘플을, HLA-DR 항원의 β-쇄의 상동 영역에 대한 순수한 모노클로날 항체와 함께 챔버내에 도입한 다음, 실온에서 최대 24시간 동안 혼합시켜 둔다. 일부 샘플을 먼저 15분 동안 혼합한 후, 이들을 22℃하의 챔버내에 항온배양시킨다. 혈액 샘플에 부가된 모노클로날 항체의 농도는 혈액 1ml당 10 내지 50㎕로 다양하다.
또한, 기타 처리를 동일한 농도로 적용하는데, 이에는 HLA-DR 항원의 α-쇄의 상동 영역에 대한 모노클로날 항체, I부류 항원의 상동 영역에 대한 모노클로날 항체, CD4에 대한 모노클로날 항체, CD8에 대한 모노클로날 항체, 및 HLA-DR 항원의 β-쇄의 상동 영역에 대한 PE 접합된 모노클로날 항체를 부가하는 것이 포함된다.
기타 처리 방법에는 HLA-DR 항원의 α및 β-쇄의 상동 영역에 대한 모노클로날 항체를 혈액 샘플에 동시에 부가하는 것이 포함된다.
더우기, 사이클로포스포아미드 등의 알킬화제를, HLA-DR 항원의 β-쇄의 상동 영역에 대한 순수한 모노클로날 항체와 조합하여 혈액 샘플에 가한다.
이들 처리를 수행한 후, 혈액 샘플을 제조업자의 지시에 의해 지시된 바와 같이 표지된 모노클로날 항체 패널로 염색한 다음, 유세포 분석법을 이용하여 분석한다.
모노클로날 항체와의 항온배양 기간은 2시간, 4시간, 6시간, 12시간 내지 24시간 간격이다.
표지된 항체
다음 모노클로날 항체를 사용하여, 유세포 분석법에 의해 세포 상의 다음 마커를 표지하였다: CD19 및 CD3, CD4 및 CD8, DR 및 CD3, CD56&16 및 CD3, CD45 및 CD14, CD8 및 CD3, CD8 및 CD28, 시뮬테스트 대조군(IgG FITC + IgG2aPE), CD34 및 CD2, CD7 및 CD13&33, CD10 및 CD25, CD5 및 CD10, CD5 및 CD21, CD7 및 CD5, CD13 및 CD20, CD23 및 CD57, 및 CD25 및 CD45 RA(Becton & Dickenson and DAKO). 부가의 마커에는 다음이 포함될 수 있다: CD71(적혈구 마커), CD61(거핵구 마커), 글리코포린 A(적혈구 마커), AC133(줄기 세포 마커), CD38(원시 줄기 세포 마커), CD90(줄기 세포 마커) 및 CD117(다능성 줄기 세포 마커).
처리되고 처리되지 않은, 각 백혈구연층 샘플을 포함한 각 환자의 혈액 샘플을, 본 발명에 따르는 장치내에서 다수의 상기 패널을 사용하여 분석함으로써, 상이한 유형의 처리에 수반된 면역표현형 변화를 고려하는데, 이는 동일한 혈액 샘플의 상이한 분취량을 대상으로 수행한다. 처리되지 않은 샘플 및 기타 대조군 처리물을 동시에 염색 및 분석하였다.
유세포 분석
전혈 샘플을 제조업자의 지시에 따라서 염색 및 용해시킨다. 음성 대조군 역추적을 포함한 PAINT A GATE 소프트웨어(BDIS) 또는 시뮬테스트를 수반한 FACScan@ 상에서 유세포 분석법을 수행하였다. 10,000 내지 20,000개 사건을 획득하고, 이를 리스트 모드 파일(list mode file)에 저장하였다.
형태학
현미경과 라이트(Wright's) 염색을 이용하여 형태학을 분석하였다.
증강되거나 정제된 B-세포(또는 정상) 림프구 또는 백혈구연층 혈액 샘플로부터의 줄기 세포의 제조
다음 과정 전반에 걸쳐 무균 기술을 사용해야 한다:
(A)단핵 세포 분리:
(i) 히스토파크, 림포프렙, 또는 모든 림프구 분리 매질(sp.grav 1.077) 상에서 30분 동안 400g로 원심분리시킴으로써 말초혈/백혈구연층 샘플로부터 단핵 세포를 수득한다.
(ii) 단핵 세포를 50ml 원추형 튜브에 수집하고, 이를 2% 열 활성화 태아 송아지 혈청(FCS) 및 2mM EDTA 또는 0.6% 시트레이트를 함유하는 30ml의 한크스 발란스 염 용액(Ca2+및 Mg+비함유, Sigma)으로 세척한 다음, 400g으로 10분 동안 원심분리시킨다.
(iii) 세척 후, 세포를 계수하고, 트립판 블루 및 혈구계수기를 사용하여 생육성을 평가한다.
(iv) B 세포 계수치가 70%(20 x 109/L, WBC) 이상으로 높을 경우에는, A(iv)를 직접 수행한다.
(v) B 세포 계수치가 70%(20 x 109/L, WBC) 아래로 낮을 경우에는, 다음 섹션 C에 기재되는 바와 같이, Macs 마이크로비드 또는 Facs Vantage 정제 기술을 사용하여 음성 선별을 수행한다.
(vi) 세포 펠릿을, 10% FCS(열 불활성화됨) 및 10% HS(열 불활성화됨)를 함유하는 IMDM 배지(100㎍/ml 스트렙토마이신)에 3 x 106/ml 농도로 재현탁시키고, 혈액 백에 위치시킨다. 주: FCS 및 HS가 전혀 입수 가능하지 않을 경우에는, 20 내지 50% 자가 혈장을 사용한다.
B-CLL을 앓는 환자의 말초혈 샘플로부터 수득된 단핵 분획물에서 줄기(미분화) 세포의 제조
백혈구 계수치가 20 x 10/ml를 초과하는 경우(이때, 백혈구의 50% 이상이 B 세포이다)에는 음성 선별을 수행하지 말아야 한다는 것을 제외하고는, 상기 단핵세포 분리(A)에 대한 프로토콜을 수행한다.
다음 과정을 본 발명에 따르는 장치에서 수행할 수 있다:
(B)순수한 CR3/43(Dako) 모노클로날 항체를 사용한 세포 처리:
단핵 세포 분리를 A(vi)에서 수행한 후, 다음 과정을 진행한다:
(i) 투입용 혈액 백(상기 A(vi)로부터)을 지지체 훅에 위치시킨다.
(ii) 6개 웰이 있는 챔버를 사용하고, 당해 장치가 2ml의 세포 현탁액을 투입용 혈액 백(상기 A(vi)로부터)으로부터 상기 다중 웰 배양 트레이 또는 챔버의 각 웰에 부가하도록 프로그래밍한다.
(iii) 당해 장치가 적당한 수의 웰을 각각, CR3/43 mab를 함유하는 주사기로부터 CR3/43(순수한 모노클로날 항체; Dako) 99㎕/ml(또는 백혈구연층 샘플에 대해서는 49.5㎕/ml)로 처리하고, 기타 웰은 처리하지 않은 채로 두도록(음성 대조군) 프로그래밍한다.
(iv) 상기 챔버를 5% CO2, 37℃(또는 33℃) 및 흡습 대기 하에 항온배양한다.
(C)세포의 정제:
세포를 분리 및 정제하기 위한 각종 방법이 공지되어 있다[참조: Vettese-Dadey Scientist 13(18): 21 Sep 13 1999].
특정한 적합한 방법은 MACS 마이크로비드(Miltenyl Biotec; 이것이 제조업자의 지시를 수행하는데 최상의 것이다)를 사용하여 B 세포를 음성 선별하는 것이다:
(i) 상기 섹션 A에서와 같이 단핵 세포를 수득한다.
(ii) 세포를 펠릿화하고, 이를 HBSS(2% FCS 및 2mM EDTA 또는 0.6% 시트레이트로 이루어짐) 중의 108개 전체 세포당 300㎕의 최종 용적으로 재현탁시킨다.
(iii) 108개 전체 세포당, CD2(IgG1, DAKO)에 대한 순수한 모노클로날 항체 100㎕를 가한다.
(iv) 동일한 세포 현탁액에 108개 전체 세포당, CD33(IgG1, DAKO)에 대한 순수한 모노클로날 항체 50㎕를 가한다.
(v) 이 혼합물을 실온에서 10분 동안 항온배양한다.
(vi) 세포를 HBSS(2% FCS 및 2mM EDTA를 함유함)로 세척하고, 동일한 완충액을 이용하여, 108개 전체 세포당 400㎕의 최종 농도로 재현탁시킨다. 400g으로 10분 동안 원심분리시킨다. 펠릿을 HBSS(상기 참조)에 재현탁시킨다.
(vii) 108개 전체 세포당 100㎕의 래빗트 항-마우스 IgG1 표지된 마이크로비드를 가한다(또는 제조업자의 지시에 따른다).
(viii) 세포를 철저히 혼합하고, 6 내지 12℃(fridge)에서 15분 동안 항온배양한다.
(ix) 다시, 세포를 HBSS(2% FCS 및 2mM EDTA를 함유함)로 세척하고, 400g으로 10분 동안 원심분리시킨 다음, 동일한 완충액을 사용하여, 108개 전체 세포당 500㎕의 최종 농도로 재현탁시킨다.
(x) MS+/RS+칼럼을 MACS 분리기의 자기장에 어셈블리한다. 단핵 세포 계수치가 높을 경우에는, 2개의 MS+/RS+칼럼을 사용한다.
(xi) 칼럼을 3ml의 HBSS(2% FCS 및 2mM EDTA를 함유함)로 세척한다.
(xii) 세포를 칼럼내로 통과시킨 다음, HBSS(2% FCS 및 2mM EDTA를 함유함) 4 x 500㎕로 세척한다.
(xiii) 세포를 용출시키고 원추형 튜브에 수집한 다음, 펠릿화하고 IMDM에 재현탁시키고, 이를 섹션 A(vi)에서와 같이 혈액 백에 위치시킨다.
(D)FACSVantage 정제된 B 세포:
(i) 상기 섹션 A에 기재된 바와 같이, B-CLL 환자의 말초혈 샘플로부터 단핵 세포를 수득한다.
(ii) 이들 세포를 CD19-PE 및 CD20-FITC 접합된 모노클로날 항체의 조합물로 염색하여 B 세포를 동정한다.
(iii) CD19/CD20 형광을 기준으로 하여, 다음 기기(Beckton Dickenson FACS Vantage) 및 488nm에서 방사하는 아르곤 레이저를 사용하여 대략 107개 세포를 분류시킨다.
(iv) 정제된 세포를, 50% FCS를 함유하는 한크스 발란스 염 용액으로 세척한 다음, 5% CO2하의 가습 항온배양기에서 37℃에서 밤새 회수한다.
(v) 세포를 펠릿화하고 재현탁시킨 다음, 섹션 A에 기재된 바와 같이, 혈액 백에 위치시킨다.
(vi) 상기 섹션 B에 기재된 바와 같이 CR3/43으로 처리한다.
전혈 세포에서 줄기 세포의 제조
세포를 전혈 중의 순수한 CR3/43(Dako) 모노클로날 항체로 처리하는 것은 본 발명에 따르는 장치에서 수행할 수 있다:
(i) WBC 계수치가 30 내지 200 x 109/L(73 내지 95% B 림프구 범위)인 환자를 선별한다.
(ii) 정맥 천자에 의해 세포를, 시트레이트, EDTA- 또는 방부제 비함유 헤파린 함유 튜브내로 수집하고, 이를 혈액 백에 위치시킨다. 바람직하게는, 수집된 세포를 즉시 사용하고, 적합하게는 수집한지 약 6시간 이내에 사용한다. 그러나, 질소 하에 저장/동결된 혈액을 해동시킨 후 사용할 수 있다.
(iii) 전혈을 포함하는 (ii)로부터의 혈액 백을 본 발명에 따르는 장치내에 위치시킨다.
(iv) 코울터 계수기를 사용하여 자동화 분화성 백혈구 계수를 수행한다. 백혈구 계수치가 30 내지 200 x 106/ml(이의 60 내지 95%가 B 세포이다)인 환자를 바람직하게 선별한다.
(v) 혈액의 생육성을 자동으로 평가할 수도 있고, 적합한 방법에는 프로피듐 요오다이드 및 유세포 분석법을 이용하는 방법, 또는 염화암모늄 용액을 사용하여 적혈구를 용해시킨 후의 혈구계수법 및 트립판 블루를 이용하는 방법이 포함된다.
(vi) CR3/43 항체를, 당해 장치의 챔버내에서 전혈 샘플에 1 내지 3㎕/106세포의 최종 농도로 가한다(예를 들어, WBC 계수치가 50 x 109/L이면, 50㎕의 CR3/43 모노클로날 항체, 159㎕/ml의 마우스 IgG 농도를 혈액 1ml 당 가해야 한다).
(vii) 당해 장치의 챔버내의 패들을 사용하여 혈액과 항체를 철저히 혼합하고, 예정된 시간, 2시간 이상 동안 실온, 바람직하게는 18 내지 37℃하에 항온배양된 챔버내에 둔다.
(viii) 당해 장치의 추적 수단을 사용하여 mAbs를 가한지 0시간, 2시간, 6시간 및 24시간 후에, 유세포 분석법, 클론 검정, 장기간 배양 및/또는 PCT 분석을 이용하여 혈액 세포를 분석한다.
주: mAb CR3/43에 의해, 시험 튜브 바닥내에 유착 세포가 형성되고 B 세포가 동형성 응집되기 때문에, 구멍이 큰 피펫 팁을 사용하여 샘플 세포를 철저히 혼합한 후에 분석한다.
상기 분석 내내 균질한 세포 집단을 수득하기 위해서는, CR3/43 처리하기에 앞서 혈액 샘플을 다수의 챔버내에 별개의 분취량으로 나눈다.
배양된 B 세포를 CR3/43 모노클로날 항체로 처리함으로써 생성된 줄기 세포를 분석하기 위한 제제
본 발명의 방법을 사용하여 생성된 줄기 세포를 수 많은 시점, 예를 들면, 매 2시간, 7시간, 24시간, 매일, 7일마다 또는 장기간(장기간 배양 배지를 세포에 매주 수개월 동안 공급함) 평가할 수 있다. 하나 이상의 처리 및 대조군 웰을 매시점마다 분석할 수 있는데, 그후 연속해서 상기 처리 및 대조군 웰을 분석한다.
이러한 평가는 본 발명의 장치내에 혼입된 추적 수단에 의해 자동으로 이루어질 수도 있다.
(i) 구멍이 큰 피펫을 사용하여 비유착 층을 온화하게 제거하고, 구멍이 큰 피펫을 통하여 반복해서 탈기시킴으로써 세포 클럼프를 파열시켜 단일 세포 현탁물을 수득한다.
(ii) 세포 스크랩퍼를 사용하여, 유착 층을 스크랩하고 세포 클럼프를 파열시켜, 구멍이 큰 피펫을 통하여 반복해서 탈기시킴으로써 단일 세포 현탁물을 수득한다.
(iii) 또 다른 한편, 먼저 HBBS로 세정한 다음 웰당 2ml의 0.25% 트립신을 가함으로써 유착 층을 트립신 처리한 다음, 37℃에서 10분 동안 항온배양한다.
(iv) 구멍이 큰 피펫으로 반복해서 피펫팅함으로써 세포 클럼프를 온화하게 교란시킨다.
(v) 10분 후, 20%의 FFCS와 함께 최종 농도로 항온배양하여 트립신을 불활성화시킨다.
(vi) 상기 (ii) 또는 (v)에서 수득된 배양 세포를 매 시점마다 각 유형에 대해 풀링하고(즉, 처리된 및 처리되지 않은 세포) 400g으로 10분 동안 원심분리시킨다.
(vii) PCR 분석을 위해(C 참조), (vi)에서 수득된 세포 펠릿(처리된 및 처리되지 않은 세포)를 직접 사용해야 한다.
(viii) 클론 검정 분석을 위해, 상기 단계 (ii) 또는 단계 (v)에서 수득된 세포 펠릿(처리된 및 처리되지 않은 세포)을, 2% 열 불활성화 FCS를 함유하는 IMDM에 재현탁시킨다. 작은 분취량의 세포를 꺼내어 세포를 계수하고, 트립판 블루 및 혈구계수기를 사용하여 이들의 생육성을 평가할 수 있다
(ix) FAC 분석을 위해, 상기 단계 (ii) 또는 단계 (v)에서 수득된 세포 펠릿(처리된 및 처리되지 않은 세포)을, 2% 열 활성화 FCS 및 5mM EDTA를 함유하는 한크스 발란스 염 용액(칼슘 및 마그네슘 비함유)에 재현탁시킨다.
줄기 세포의 분석:
다음 방법을 줄기 세포의 평가에 사용할 수 있다. 본 발명에 따르는 장치는 다음에 상세된 방법 또는 이의 일부를 수행하기 위한 추적 장치를 포함할 수 있다.
(A)면역표현형:
전혈 샘플에 대한 면역표현형 분석을 위해(유세포 분석법을 이용함), 다음을수행한다:
(i) 면역염색시키고(제조업자 지시에 따름), 적혈구를 용해시키며, 항온배양 기간 후 세포를 세척하고 mAb로 처리한다. 공급원(Beckton Dickinson)로부터의 용해 및 세척 용액을 전형적으로 사용할 수 있다.
(ii) 백혈구(전혈 중, 단핵 분획물, MACS 마이크로비드 음성 선별된 B 세포 또는 분류된 B-CLL)를, 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 또는 피코에리트린(PE)에 직접 접합된 mAbs로 표지시켜야 한다.
(iii) 면역표현형 분석에 사용된 패널 마커는 다음과 같은 것일 수 있다:
·CD38 PE + CD45 FITC + CD34 PE-Cy5
·CD19 PE + CD10 FITC + CD34 PE-Cy5
·CD117 PE + CD3 FITC + CD34 PE-Cy5
·CD33 PE + CD61 FITC + CD34 PE-Cy5
·글리코포린 A PE + CD71 FITC + CD34 PE-Cy5
·AC133 PE + CD90 FITC + CD34 PE-Cy5
·CD19 PE + CD5 FITC
·IgG1 PE + IgG1 FITC + IgG1 PE-Cy5(이소형 음성 대조군)
(iv) IMK + 키트(Beckton Dickinson)를 사용하여 이중 표지화를 수행할 수 있다:
다음 모노클로날 항체 쌍으로 이루어짐:
·CD45-FITC 및 CD14-PE;
·CD19-PE 및 CD3-FITC;
·CD8-PE 및 CD4-FITC;
·HLA-DR-PE 및 CD3-FITC; 및
·CD56, CD16-PE 및 CD3-FITC.
또한, IgG1-FITC 및 IgG2-PE에 대한 이소형 매치 음성 대조군이 포함된다.
(v) 공급원[Dako and Becton Dickinson]에 의해 제조되는 다음의 부가의 항체를 사용할 수도 있다:
PE-접합됨: 항-CD8, 항-CD33, 항-CD13, 항-CD34, 항-CD19, 항-CD2, 항-CD14, 항-CD33 및 항-CD5;
FITC-접합됨: 항-CD3, 항-CD7, 항-IgM, 항-CD22, 항-CD20, 항-CD10, 항-CD7, 항-CD16, 항-TCRαβ.
(vi) 다음을 사용할 수도 있다:
·CD34에 특이적인 친화 정제된 IgG3mAb(Dako)를 사용할 수 있고, 이를 2차 항체로서 FITC- 또는 PE-표지된 고우트 항-마우스 면역글로불린 F(ab)'2단편으로 탐지한다.
·Quantum Red(PE-Cy5)-접합된 항-CD34(Dako)를 사용하기도 한다.
(vii) FACScan 또는 FACS Vantage(Becton Dickinson) 또는 기타 모든 유세포 분석기를 사용하여 세포를 분석한다. 등수의 100,000개 세포를 분석하고 시간을 기록한다.
(viii) 독점적 소프트웨어[Paint-a-Gate, Lysis II, Consort 30 and CellQuest 소프트웨어]를 사용하여 데이터를 분석한다.
백혈구연층 샘플의 표현형 분석을 위해(유세포 분석법을 이용함), 예를 들면, 다음을 수행한다:
(i) 면역염색시키고(제조업자 지시에 따름), 적혈구를 용해시키며, 항온배양 기간 후 세포를 세척하고 mAb로 처리한다. 공급원(Beckton Dickinson)로부터의 용해 및 세척 용액을 전형적으로 사용할 수 있다.
(ii) 백혈구를, 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 피코에리트린(PE) 또는 RPE-Cy5에 직접 접합된 mAbs로 이중 또는 단일 표지시켜야 한다.
다음의 표지된 마커를 적합하게 사용할 수 있다:
CD34(줄기 세포 마커), CD19(림프구 마커), CD45(백혈구 마커), CD3(T-림프구 마커), CD33(골수 세포 마커), CD71(적혈구 마커), CD61(거핵구 마커), 글리코포린 A(적혈구 마커), AC133(줄기 세포 마커), CD38(원시 줄기 세포 마커), CD90(줄기 세포 마커), CD10(림프계 줄기 세포 마커), CD117(다능성 줄기 세포 마커), IgG1(음성 대조군).
(B)형태학:
형태학 분석용:
광학 현미 기술
(i) 구멍이 큰 피펫 팁을 사용하여 2% 열 활성화 FCS를 함유하는 IMDM에서세포를 철저히 재현탁시킨다.
(ii) 라이츠(Leitz) 현미경 하에 적당한 염색 용액을 사용하여 검사하는데, 예를 들면, 매이 및 그린발트 염색 용액(BDH Chemical Ltd)을 골수계 및 림프계 세포 분석에 사용할 수 있다. 당업자는 기타 콜로니의 동정에 적합한 기타 염색물, 예를 들면, 라이트(Wright) 또는 김사(Giemsa) 염색물을 용이하게 인지할 것이다.
(iii) B-CLL 림프구의 형태학적 분석을 혈액 필름 또는 세포원심분리된 제제에서 각각 수행할 수 있다.
공촛점 현미 기술
(i) 상기 언급된 바와 같이 B 세포(건강한 혈액 공급자의 백혈구연층으로부터 수득된 건강한 B 세포 또는 B-CLL)를 수득한다.
(ii) B 세포를 상기 언급된 바와 같이 CR3/43 모노클로날 항체로 처리한다.
(iii) 2ml의 세포 현탁액을 기관 배양 디쉬에 가한다(이러한 디쉬의 바닥을 공학적으로 처리하여 커버-슬립을 갖게 한다).
(iv) 15㎕의 모노클로날 항체를 CD19 FITC-접합체에 가하고 15㎕의 모노클로날 항체를 CD34 PE/Cy5-접합체에 가한다(Quantum Red).
(v) 프로피듐 요오다이드를 사용하여 생육성을 평가하고, Hoechst를 사용하여 핵을 염색시킨다.
(C)VDJ/JHF 유전자 전위의 PCR 분석
항체 처리 전 및 후(2시간, 6시간 및 24시간)에 B-CLL 말초혈 및 백혈구연층 샘플로부터의 주형 DNA를 사용하여 PCR(Perkin Elmer 열 사이클러)함으로써, IgH 유전자의 VDJ 및/또는 JHF 영역을 분석한다. 이러한 프로토콜은 다음 문헌으로부터 채택된 것이다[참조: Stolc et al., American Journal of Hematology 38:1-8; 1991]. 상기 JHF 프라이머를, 발아주 형태에서 면역글로불린 중쇄 유전자의 양성 탐지에 사용한다. JH6 프라이머를 면역글로불린 중쇄 유전자에 대한 양성의 내부 대조군으로서 사용한다. B 세포에서의 백혈병 영역 뿐만 아니라 정상적인 림프구에서의 JHF 영역은 항상 결실되어 있으므로, 증폭시킬 수 없는 반면, 내부 대조군인 JH6 유전자는 본래 상태를 유지한다. β-액틴 유전자를 대조군으로서 사용한다.
(i) 다음 키트[Qiagen QiAmp Maxi 혈액 키트]를 사용하여 전혈로부터 게놈성 DNA를 분리한다. 최대 수율 프로토콜을 사용한다. 각 샘플(처리된 및 처리되지 않음)로부터 모든 DNA를 추출한다.
(ii) 1.5% 아가로즈 겔 상에서 DNA의 1:5 희석물 및 니트를 수행하여, 농도와 질을 평가한다.
(iii) PCR - 2 내지 3㎕ 니트 게놈 DNA 주형을 96℃에서 5분 동안 가열한다.
I)JH6a/JH6g JHFa/JHFg
다음 표에 따라서 4명 환자(8종의 반응물 처리된 및 처리되지 않음)에 대해 충분한 "마스터믹스"를 제조한다. 이를 경우에 따라 확대 또는 축소시킬 수 있다.
용적/㎕ [최종]
뉴클레아제-비함유 수 370 -
PCR 10 x 완충액 80 1x
*25mM MgCl2 64 2mM
*5mM dNTPs 128 0.8mM
10μM P1 80 1μM
10μM P2 80 1μM
5U/㎕ Taq pol. 2 10단위
*튜브를 각각 5초 동안 2 내지 3회 와동시킨 후, 샘플을 평형시키기 위해 사용한다.
95㎕의 "마스터믹스"를, 변성 게놈 DNA를 함유하는 각 튜브에 등분한다. 열 사이클러를 다음과 같이 설정한다: 95℃에서 1분 30초간; 55℃에서 2분간; 72℃에서 1분 30초간(35주기); 및 72℃에서 5분간(1주기).
II)β-액틴
상기 I)에서 기재된 바와 같이 8개 반응에 충분한 "마스터믹스"를 제조한다. 경우에 따라, 확대 또는 축소시킬 수 있다.
용적/㎕ [최종]
뉴클레아제-비함유 수 380 -
PCR 10 x 완충액 80 1x
*25mM MgCl2 48 1.5mM
*5mM dNTPs 128 0.8mM
10μM P1 80 1μM
10μM P2 80 1μM
5U/㎕ Taq pol. 2 10단위
*튜브를 각각 5초 동안 2 내지 3회 와동시킨 후, 샘플을 평형시키기 위해 사용한다.
95㎕의 "마스터믹스"를, 변성 게놈 DNA를 함유하는 각 튜브에 등분한다. 열 사이클러를 다음과 같이 설정한다: 95℃에서 1분 30초간; 55℃에서 2분간; 72℃에서 1분 30초간(25주기); 및 72℃에서 5분간(1주기).
PCR용 프라이머
IgH JHF 유전자의 240bp 단편을 증폭시키기 위해 고안된 제1 세트의 프라이머는 다음과 같다:
JHFa AAA GGT GCT GGG GGT CCC CTG
JHFb CCC AGT GCT GGA AGT ATT CAG C
영역 6을 연결하는 IgH JHF 유전자의 242bp 단편을 증폭시키기 위해 고안된 제2 세트의 프라이머는 다음과 같다:
JH6a CAT TGT GAT TAC TAC TAC TAC TAC
JH6b GAT CCT CAA GGC ACC CCA GTG C
β-액틴 유전자의 249bp 단편을 증폭시키기 위해 고안된 제3 세트의 프라이머는 다음과 같다:
베타 ACT-1 AAG GCC AAC CGC GAG AAG AT
베타 ACT-2 TCG GTG AGG ATC TTC ATG AG
(D)VDJ 유전자 전위의 써던 분석
(i) BamHI/HindII를 사용하여, 처리된 및 처리되지 않은 말초혈 샘플 또는 정제된 B 세포(B-CLL 환자로부터)로부터의 게놈 DNA를 절단한다 - 전형적으로는, 본 분석을 수행하기에 충분한 양의 DMA를 제공하기 위해서는, 수 많은 웰로부터의세포가 요구된다.
(ii) 상기 분해물을 0.8% 아가로즈 겔 상에서 용해시키고, 이를 제조업자의 지시에 따라서 젠스크린(GeneScreen®) 나일론 막(Dupont)에 옮긴다[Southern, 1975].
(iii) 태반성 게놈 DNA[Calbiochem, Oncogene Science]로부터 분리된32P-표지된 사람 JHDNA 프로브를 사용하여, IgH 유전자좌의 J 영역을 분석함으로써, IgH 유전자의 전위를 성상 확인할 수 있다.
(iv) 현상에 앞서, 자기방사를 -70℃에서 수 일 동안 유지시켜야 한다.
(E)장기간 배양:
상기 언급된 바와 같이 제조된 세포 배양물을, 장기간 배양 배지[이스코브 변형된 둘벡코 배지(IMDM - Gibco BRL Life Technologies Ltd), 10% 열 활성화 FCS, 10% 열 활성화 말 혈청(HS), 1% 하이드로코르티손, 1% 페니실린/스트렙토마이신 5 x 10M 스톡 용액]를 사용하여 매주 공급함으로써 장기간 동안 유지할 수 있다(장기간 배양).
(i) 먼저, CR3/43 처리를 개시한 시점으로부터 특정한 시점, 예를 들어 24시간 후에, 2ml의 장기간 배양 배지를 가함으로써 각 웰 중의 세포를 희석시킨다.
(ii) 성장 배지의 절반을 제거하면서, 매주 웰에 공급한다.
(iii) 상-대비 현미 기술을 이용하여 웰을 검사한다.
(F)클론 검정:
(i) 처리를 개시한지 매시점 후에, 비유착 세포의 배양 배지 중의 300㎕을 상기 언급된 바와 같이 수득할 수 있다.
(ii) 상기 배양 배지 중의 세포 현탁액에, 3ml의 메코컬트 GFH4434[StemCell Technologies, IMDM 중의 메틸셀룰로즈, FCS, BSA, L-글루타민, rh 줄기 세포 인자, rh GM-CSF, rh IL-3 및 rh 에리트로포이에틴으로 이루어짐]을 가한다.
(iii) 세포 혼합물 1.1ml을 취하고, 이를 3회 도말한다.
(iv) 상기 판을 5% CO2및 5% O2가 있는 가습 페트리 디쉬에서 37℃ 하에 14일 동안 항온배양한다.
(v) 상-대비 현미 기술을 이용하여 CR3/43 모노클로날 항체로 처리하기 전 및 후에 웰을 검사한다.
(vi) 14일 후, 상기 세포(콜로니)를 유세포 분석법, 공촛점 현미 기술 및/또는 PCR에 의해 분석할 수 있다.
(vii) 클론 분석을 수행하는 경우에는, 알코올 에어로솔을 피해야 하는데, 이는 세포 클럼핑 또는 파괴를 유발시킬 수 있어, 양 유형의 세포(처리된 및 처리되지 않음) 생존을 방해하기 때문이다.
B. 결과
CD19 및 CD3 패널
본 발명에 따르는 장치내의 혈액 샘플을, HLA-DR 항원의 β-쇄의 상동 영역에 대한 모노클로날 항체로 처리하면, CD19+세포의 상대적인 수가 항상 감소하였다. 이러한 마커는 pan B-세포 항원이다(표 참조). 상기 항원은 모든 성숙 단계에서 모든 사람 B 림프구 상에 존재하지만, 말단 분화된 혈장 세포에서는 상실된다. 따라서, 이는 B 세포가 미분화 세포로 역분화되었다는 것을 지시해준다.
동일하게 처리하면, 특히 B-CLL을 갖는 환자의 혈액에서의 CD3+세포의 상대적인 수가 상당히 증가하였는데, 이는 CD3_CD19_세포의 상대적인 수 증가를 항상 수반한다. CD3은 모든 성숙한 T 림프구 상에 존재하고 흉선세포의 65 내지 85% 상에 존재한다. 이 마커는 항상 α-/β- 또는 감마/델타 T 세포 수용체(TCR)과 연합되는 것으로 밝혀졌는데, 이들 복합체는 함께, 세포 내부에 대한 시그날을 형질도입하는데 중요하다. 따라서, 이는 B 세포가 미분화 세포로 역분화된 다음, 새로운 분화 세포, 즉 T 세포로 수임되었다는 것을 지시해준다.
신규한 세포 클론이, CD19 및 CD3 마커, 즉 CD19+및 CD3+세포를 공동 발현하는 B-CLL 환자의 처리된 혈액에서 발견되는데(처리를 개시한지 2, 6 및 24시간 후에 환자 2, 3 & 4, 챠트 1 참조), 이러한 처리는 본 발명에 따르는 장치내에서 수행할 수 있다. 상이한 조건을 지닌 기타 환자들은 이들 세포 클론의 상대적인 수 증가를 나타내었다. 이들 세포는 예외적으로 크고 무겁게 과립화되었으며, 극도로 높은 수준의 CD19가 이들의 세포 막 위에서 발현되었다. 이러한 CD3 마커는 정상의 성숙한 림프구 상에서 발현된 것과 유사한 수준으로, 상기 세포 상에서 발현되는 것으로 보인다.
표 2에는, 환자 번호 2, 3 및 4가 동일한 환자를 나타내는 실제적인 수이고, 이들의 묘사는 단순히, 시간에 따라 혈액에 대한 처리 효과를 나타낸 것이다(상기 환자의 실험 및 임상적 조건에 대한 표 1 참조).
처리된 샘플 중의 CD19+CD3+클론은 시간에 따라 감소하는 것으로 보이는데, 이로써 본래의 수준이, 2, 6 및 24시간째에 처리되지 못한 샘플에서 결정된 수준에 도달한다.
동일한 크기와 과립성(granulity)의 또 다른 유형의 세포를 처리된 샘플에서 탐지하는데, 이들 세포는 이들 표면 상에서 높은 수준의 CD19 발현을 나타내지만, CD3 마커에 대해서는 음성이고 FC 수용체가 풍부하다. 그러나, 이들 세포의 상대적인 수는 시간에 따라 감소하는 것으로 여겨진다. 특히 관심있는 것은, 혈액 샘플을 처리한지 2 및 6시간 후에는 증가하는 것으로 초기 관찰된 세포 그룹에서의 CD19CD3 세포의 상대적인 수가, 혈액 샘플(2, 3 및 4)을 처리한지 24시간째에는 감소된 것이다. 그러나, WBC 집단의 코울터 계수치는 혈액을 HLA-DR 항원의 β-쇄의 상동 영역에 대한 모노클로날 항체로 처리하면 감소되었다. 이러한 발견은 이러한 유형의 처리로 인해, 코울터에 의해서는 탐지될 수 없지만(표 1) 표면 마커, 크기 및 과립도에 근거하여 세포를 계수하는 유세포 분석법에 의해 측정될 때 고려될 수있는 불규칙한 세포가 생성된다는 것을 제시해준다. 더우기, 이들 불규칙한 세포는 현미경 하에 라이트 염색을 이용하여 형태를 분석함으로써 고려될 수 있다. 이러한 현상의 유세포 분석 챠트가 챠트(1, 2, 3 & 4)에 제시되어 있고, 혈액 샘플 처리시 수득된 면역표현형 변화는, CD19+및 CD3+림프구가 세포의 상호접속 그룹이긴 하지만 줄기 세포와 비교해서 CD19 및 CD3의 상대적 발현에 근거하여 별개로 잔존한다는 것을 제시해준다.
표 2에서, 환자 번호 5 및 6이 동일한 환자를 나타내긴 하지만, 처리된 및 처리되지 않은 혈액 샘플의 분석은 시간에 따라 및 동일한 시간에 모니터링한다(표 1 참조).
B 세포 악성 종양을 갖지 않는 환자의 혈액은 B-CLL 환자의 혈액과 비교할 때 유사한 면역표현형 변화 경향을 나타내지만, 이러한 변화는 동일한 정도가 아니다. 그러나, 이들 환자의 혈액 중의 B 림프구 및 MHC II부류 양성 세포의 상대적 및 절대적 수는, B-CLL 환자의 혈액에서 발견되는 것과 비교할 때 극도로 낮다.
둘 다 B 세포 결핍성인 X 염색체 연결된 유아 저감마글로불린혈증을 앓는 두 형제는, 이들의 혈액 처리시 CD3+세포의 상대적인 수 측면에서 상이한 면역표현형 변화를 나타내었다. 아프지 않는 2개월된 보다 어린 형제는 이의 혈액 처리시, 약간의 CD3+세포의 상대적인 수 증가를 나타내었는데, 이는 CD3_CD19_세포의 상대적인 수 감소를 수반하였다. 한편, DR 항원을 발현하는 활성화된 T 세포의 수가 상대적으로 많고, 매우 아픈 2년생의 다른 형제는 이의 혈액 처리시 CD3+세포의 수 감소를 나타내었다. 이들 두 환자로부터 수득된 혈액 샘플이 극도로 작기 때문에 일어날 수도 있는 기타 면역표현형 변화를 측정하기 위해 기타 어떠한 마커도 사용하지 않았다(표 2, ID 43/BD 및 04/BD).
표 2의 환자 91은 혈액 처리 후 CD3+세포의 상대적인 수 감소를 나타내는데, 이는 CD3_CD19_세포의 상대적인 수 증가를 수반하였다. 그러나, 기타 표면 마커, 예를 들면, CD4 및 CD8를 분석하면(표 3 참조), 환자는 이의 혈액내에서의 CD4+CD8+세포의 상대적인 수가 높은 것으로 관찰되었고, 이는 DR 항원의 β-쇄에 대한 모노클로날 항체로 혈액 샘플을 처리하기에 앞서 인지되었으며, 이들 이중 양성 세포는 혈액 처리 후 인지가능한 수준으로 감소되었다. 더우기, 추가의 마커를 분석한 경우에는, CD3+세포의 상대적인 수가 상승된 것으로 나타났다(표 4 참조).
본 발명에 따르는 장치에서 DR 항원의 β-쇄에 대한 모노클로날 항체로 처리될 때 건강한 혈액 공여자로부터 수득된 B-림프구의 증강된 제제는 CD3+세포의 상대적인 수가 상당히 증가된 것으로 나타났는데, 이는 항상 CD19+세포의 상대적인 수 감소와 CD19_CD3_세포의 상대적인 수 감소를 수반하였다. CD4 및 CD8 등의 마커를 이용한 추가의 분석 결과는 이들 마커의 상대적인 수가 동시에 증가된 것으로 나타난다. 그러나, 동일한 모노클로날 항체로 처리될 때 동일한 혈액 공여자의 T림프구의 증강된 제제는 동일한 변화를 나타내지 못하였다.
CD4 및 CD8 패널
CD4 항원은 사람 면역결핍증 바이러스에 대한 수용체이다. CD4 분자는 I부류 항원 상의 CD8 결합 부위와 유사한 영역인 B2 도메인에서 MHC II부류 항원과 결합된다. CD4를 II부류 항원에 결합하면, 항원에 대한 T 세포 반응성이 증진되어, I부류 항원에 대한 CD8의 결합을 증진시킨다. CD8 항원은 사람 억제인자/세포독성 T 림프구 서브세트 상에 존재할 뿐만 아니라 천연 킬러(NK) 림프구 및 대부분의 정상적인 흉선 세포의 서브세트 상에 존재한다. CD4 및 CD8 항원은 흉선세포에서 공동 발현되고, 이들 세포는 이들이 T 림프구로 성숙됨에 따라 어느 한 마커를 상실한다.
CD4 및 CD8 마커 - 하기 참조- 분석시, 및 표 2에 제시된 대다수의 혈액 샘플로부터, B-림프구가 미분화 세포로 역분화되는 과정과 T-림프구로 후속 분화되는 과정이 존재한다는 것을 뒷받침해주는 염색 패턴이 나타난다.
혈액 샘플을 이들 유형의 세포의 β-쇄의 상동 영역에 대한 모노클로날 항체로 처리한 후에 항상 나타난 CD4+CD8+세포(이는 이중 양성 세포이다)는 B-CLL 환자의 처리된 혈액 샘플에서는 현저히 증가하였으며, 처리되지 않은 샘플에서는 모두 부재하였다(표 3 및 챠트 1, 2, 3 & 4 참조). 동일한 표본에서는, CD8+세포 및 CD4+세포 등의 단일 양성 세포의 상대적인 수는 동시에 증가하는 것으로 인지되었다. 더우기, 적어도 B 세포에 대응하는 B-CLL의 경우에서는, CD4_CD8_세포의 상대적인 수 감소가, 시간에 따라 측정할 때 동일한 수준을 유지하는 처리되지 않은 표본과 비교해서 처리된 샘플에서 현저하게 인지되었다. 그러나, 처리된 샘플에서 시간에 따른 CD4+CD8+세포의 상대적인 수 측정 결과, 단일 양성 세포의 수 증가가 이중 양성 세포의 상대적인 수 감소와 공존하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 유형의 면역표현형 변화는 흉선에서 T 림프구 계통의 전구세포의 특징적인 흉선 발생이다(환자 번호 2, 3 및 4). CD4 항원은 헬퍼/유도인자 T-림프구 서브세트(CD4+CD3+) 및 대다수의 정상 흉선 세포 상에 존재한다. 그러나, 상기 항원은 단구의 세포 표면 상에 저밀도 존재하고, 단구 및 매크로파아지의 세포질내에 존재한다(CD3_CD4+).
낮은 CD4+세포의 상대적인 수는, 본 발명에 따르는 장치에서 처리를 수행한 후, 상이한 혈액 샘플에서 상이하게 영향을 받는다. 이러한 세포 유형의 상대적인 수는 처리되지 않은 샘플과 비교해서 처리 후 B-CLL 환자의 혈액 샘플에서 전혀 영향을 받지 않는 것으로 보인다. 이러한 낮은 수준의 CD4 발현은 단구 및 극히 초기 흉선세포 상에서 발견된다.
처리 중인 환자 HIV+25는 CD4와 CD8을 동시에 발현하는 이중 양성 세포의 수를 상당히 증가시킨 것으로 나타났다. 한편, 치료 중인 환자 91은 이러한 아유형의 세포의 감소를 나타냈는데, 이러한 현상의 관찰은 시간 의존적이다. CD8+세포의 상대적인 수는 시간에 따라 측정될 때 B-CLL 환자의 처리되지 않은 혈액 샘플에서 증가하는 것으로 관찰된 반면, CD4+및 CD4+낮은 세포의 상대적인 수는 동일한시간에 감소하는 것으로 관찰되었다(표 3, 환자 2, 3 및 4).
DR 및 CD3 패널
DR 마커는 단구, 수지상 세포, B 세포 및 활성화 T-림프구 상에 존재한다.
처리된 및 처리되지 않은 샘플을 상기 패널로 분석한 결과, 혈액 샘플을 CD19 및 CD3 마커로 분석할 경우에 수득된 것과 유사한 면역표현형 변화를 나타낸 것으로 밝혀졌으며(표 2 참조), 앞서 언급된 바와 같은 항원은 각각 pan B 및 T 세포 마커이다.
본 발명에 따르는 장치에서 혈액을 모노클로날 항체로 처리하는 것은, DR+B-림프구의 상대적인 수에 영향을 미쳐 DR+세포의 수준이 저하되는 것으로 여겨진다. 이와는 대조적으로, CD3+(T-세포) 세포의 상대적인 수는 상당히 증가한다(표 4 및 챠트 참조). 더우기, B-CLL 환자의 처리된 대다수의 혈액 샘플에서 증가된 활성화 T 세포 및 이들 유형의 세포의 상대적인 수는 기타 질환 환자의 처리된 샘플에 가변적으로 영향을 미친다.
더우기, DR 높은 양성 세포의 상대적인 수는 B-CLL 환자 및 이의 혈액내에 DR+CD34+블라스트(blast)가 증가된 6일생 유아의 처리된 샘플에서 상당한 것으로여겨진다. 그러나, 이러한 환자의 혈액내에 존재하는 블라스트가 처리 전 및 후에는 T 및 B-세포 마커에 대해 음성이지만, 처리 후에는 골수성 계통 항원에 대해 보다 양성이 되었다는 것을 인지해야 한다. CD3_DR_세포의 상대적인 수는 대다수의 처리된 혈액 샘플에서 증가하였으며, 이는 CD3+세포(T-세포)의 상대적인 수 증가에 비례하고, DR+세포(B-세포)의 상대적인 수에 반비례하였다.
CD56&16 및 CD3 패널
CD56&CD16 마커는 세포의 이종 그룹, 일반적으로 큰 과립상 림프구 및 천연 킬러(NK) 림프구로서 공지된 림프구의 서브세트 상에서 발견된다. CD16 항원은 거의 모든 휴지기 NK 림프구 상에서 발현되고, 특정 개개인으로부터의 몇몇 CD3+T 림프구 상에서 약하게 발현된다. 이 항원은 과립구 상에 보다 낮은 양으로 발견되고, 큰 호아주르성(azurophilic) 과립을 함유하는 림프구와 연합된다. CD16 항원은 IgG FC 수용체 III이다.
다양한 수의 CD16+림프구는 CD57 항원 또는 저밀도 CD8 항원, 또는 둘 다를 공동 발현한다. 대부분의 개개인에게는, CD5, CD4 또는 CD3 항원 등의 기타 T 림프구 항원과 중복되는 것이 사실상 없다. CD56 항원은 본질적으로 모든 휴지기 및 활성화된 CD16+NK 림프구 상에 존재하고, 이들 세포의 서브세트는 비-주요 조직적합성 복합체 제한된 세포독성을 수반한다.
B-CLL 및 몇몇 기타 환자의 처리된 및 처리되지 않은 혈액 샘플을 기타 상태로 면역표현처리한 결과, 대량으로 과립화되고 중간 크기의 CD56&CD16 항원을 공동 발현하는 세포의 상대적인 수 증가가 나타났다(표 5 및 챠트 1, 2, 3 & 4 참조). 이들 관찰 결과는 CD3 항원만을 발현하는 세포(CD56 및 CD16 마커는 발현하지 않음) 및 CD56&CD16 및 CD3 마커를 함께 공동 발현하는 세포의 상대적인 수의 현저한 증가를 또한 수반하였다.
표 5에서, 환자 번호 2, 3 및 4는 동일한 혈액 샘플을 나타내지만, (처리 전 및 후) 2시간, 6시간 및 24시간째에 각각 분석한 것이다. 이 샘플은 혈액을 DR 항원의 β-쇄의 상동 영역에 대한 모노클로날 항체로 처리하면, CD56+및 CD16+세포, CD3+세포 및 CD56+및 CD16+CD3+세포의 자발적인 생성이 야기된다는 것을 보여주는데, 이러한 관찰들은 항상 B 세포 마커(CD19, DR, CD56, CD16CD3)의 소멸을 수반하였다.
처리 전 및 후에 상기 혈액 샘플을 전진적으로 분석한 결과, CD56+및 CD16+세포 수준은 시간에 따라 감소하였으나, CD3+세포의 수준은 시간에 따라 증가한 것으로 나타났다.
B-CLL 환자 7의 혈액 샘플은, 처리된 및 처리되지 않은 샘플에서 관찰된 면역표현형 변화와 비교할 때 CD56, CD16 및 CD3 항원을 발현하는 세포의 어떠한 수적 변화도 나타내지 않았는데, 이는 부가된 모노클로날 항체의 양이 B 림프구의 수에 비해 극도로 낮기 때문이다. 그러나, 상기 환자의 혈액 샘플을 별도의 경우에 적당량의 모노클로날 항체로 처리한 결과, CD3+, CD56+&CD16+, 및 CD56+및 CD16+CD3+세포의 상대적인 수가 상당히 증가된 것으로 나타났다.
기타 질환을 앓는 환자의 혈액 샘플은 이들 세포 수준의 다양한 변화를 나타내었는데, 이는 처리 전, 처리 동안 및 아마도 환자의 임상 상태에서 혈액 중에 존재하는 B-림프구의 수에 의존적인 것으로 여겨진다.
CD45 및 CD14 패널
CD45 항원은 모든 사람 백혈구(말초혈 중의 호염기구, 림프구, 단구, 다형핵 세포 및 호산구 포함), 흉선, 비장 및 편도선, 및 골수 중의 백혈구 전구세포 상에 존재한다.
CD14는 정상 말초혈 단구의 70 내지 93%, 흉막 또는 복막 유체 식세포의 77 내지 90% 상에 존재한다. 이러한 항원은 과립구 상에 약하게 발현되고, 자극되지 않은 림프구, 분열 촉진 인자-활성화 T 림프구, 적혈구 또는 혈소판 상에는 존재하지 않았다.
CD45 항원은 단백질 티로신 포스파타제 계열이고, 이 분자는 외부 자극(항원)과 상호작용하여 Scr-계열 구성원을 통하여 시그날 형질도입을 수행하여, 세포 성장과 분화를 조절시켜 준다.
특히 B-CLL 환자로부터 수득된, 처리된 혈액 샘플에 DR 항원의 β-쇄를 교합시킨 것은, 이러한 처리가 B-림프구 상의 CD45 항원 수준에 영향을 미친다는 것을 제시해준다. DR 항원의 β-쇄의 자극시 발생되는 전반적인 면역표현형 변화는, CD45 및 CD14 발현 수준 뿐만 아니라 전방 스캐터 및 측면 스캐터에 의해 결정된 바와 같은 형태학(각각, 크기 및 과립도)에 기초하여 분리할 수 있는 상이한 유형의 세포를 생성시키는 것으로 여겨지는데, 이들 결과가 표 6 및 챠트(1, 2, 3 & 4)에 제시되어 있다. CR3/43 항체로의 처리 후 CD45_CD14_세포의 외형을 입증해주는 도 7을 참조할 수 있다. 이들 세포는 조혈 세포가 아니다.
본 발명에 따르는 장치에서 처리시, CD45 낮은 세포의 상대적인 수(처리되지 않은 샘플과 비교할 때)는 상당히 증가하였고, 이로써 CD45 및 CD14 항원을 공동 발현하는 세포의 상대적인 수가 증가하였다. 이러한 유형의 면역표현형 변화는 CD45 높은 세포의 상대적인 수(처리되지 않은 샘플과 비교할 때) 감소와 일치한다. 그러나, 상기 후자 세포 집단은 형태학 및 CD45 발현도에 기초하여 추가로 나눌 수 있다. 한 유형은 챠트내에 존재하는 나머지 세포와 비교할 때 상당히 크고 상당히 고수준의 CD45 항원을 갖는다(챠트 1, 2, 3 및 4 참조). 시간에 따라 처리한 후 상기 패널을 분석한 결과(표 6, 환자 2, 3 및 4, 및 챠트 1 참조), CD45+세포의 상대적인 수는 초기에 시간에 따라 급격하게 감소되어, CD45 낮은 세포를 생성시킨다. 그러나, 24시간 후에 혈액을 검사한 결과, 반대의 상황이 나타났다.
샘플 5 및 7은 기타 B-CLL 환자로부터 수득된 기타 샘플을 사용하여 수득된것과 반대의 면역표현형 변화를 나타내는데, 이는 상기 샘플이 모노클로날 항체와의 항온배양 시간의 훨씬 초기에 분석되었기 때문이다. 사실상, 처리 후의 순차적인 혈액 샘플 분석 결과는 B 림프구에 의해 진행된 면역표현형 변화가 시간 의존적이라는 것을 제시해주는데, 이는 이것이 발생 단계를 나타내고 X 시간에 측정된 면역표현형 변화가 X 플러스 시간에서 동일한 것으로 간주되지 않기 때문이다. 그러나, 이들 유형의 변화는 체내에서 보다 엄격한 방식으로 일어나야만 하는데, 그렇치 않으면 면역병리학이 계속해서 일어날 수도 있다. B 세포 악성 종양을 갖지 않는 기타 환자로부터의 혈액 샘플 처리 효과는 세포의 면역표현형에 있어서의 다양한 변화를 보여주는데, 이는 B 림프구가 소량으로 존재하기 때문이다. 그러나, 건강한 혈액 공여자로부터 수득된 B 림프구의 증강된 분획을 처리하면, B 림프구 계수치가 높은 B-CLL을 이용하여 수득된 것과 유사한 면역표현형 변화가 나타난다.
CD8 및 CD3 패널
CD8 항원 결정기는 I부류 MHC 분자와 상호작용하여, CD8+ T 림프구와 표적 세포 간의 유착성을 증가시킨다. 이러한 유형의 상호작용은, 휴지기 림프구의 활성화를 향상시킨다. CD8 항원을 단백질 티로신 키나제(p56ick)에 커플링시킴으로써, CD8/p56ick 복합체는 T 림프구 활성화에 역할을 담당할 수 있다.
B-CLL 환자로부터 수득된 본 발명에 따르는 장치내의 혈액 샘플을 β-쇄의 모노클로날 항체로 처리하면, CD3CD8 및 CD3(CD4CD3인 것으로 예상된다) 양성 세포의 상대적인 수가 상당히 증가함으로써, 초기에 발생된 이중 양성 세포가 성숙한 T림프구로의 발생을 진행하고 있다는 것을 보다 명백히 지시해준다. 이는 CD19 및 DR에 의해 직접적으로 측정할 수 있고 CD8_CD3_항원에 의해 간접적으로 측정될 수 있는 과정이다. 시간에 따라 동일한 환자의 처리된 혈액 샘플을 일련으로 평가한 것은, 흉선 세포 발생과 동일한 과정과 일치하는 것으로 보인다(표 7, 환자 2, 3 및 4, 및 챠트 1 참조).
CD8+세포의 상대적인 수는 처리된 및 처리되지 않은 샘플에서 시간에 따라 증가하였지만, 처리되지 않은 샘플에서 보다 높은 정도로 증가하였다. 한편, CD8+CD3+세포의 상대적인 수는 처리되지 않은 샘플에서 시간에 따라 감소하였다. 그러나, 처리 혈액 샘플중 CD3+세포의 상대적인 수는 시간이 지남에 따라 증가하며, 이러한 유형의 세포는 CD4+CD3+단일 양성 세포, 즉 흉선세포 성숙형에 거의 상응한다. 또한, 이러한 샘플은 다른 패널로도 면역표현형화되며(상기한 표 3, 4, 5 및 6 참조), 전체적인 변화의 원인은 T 림프구 전구세포 및 자손세포 생성시의 B 세포에 있다.
별개의 분취량중 B-CLL을 앓는 환자의 혈액 샘플(표 1, 2, 3, 4, 5, 6 및 7의 2번, 3번 및 4번)은 처리하지 않거나, DR 항원 β-쇄의 상동 영역에 대한 PE 공액화 모노클로날 항체 및 동일 모노클로날 항체의 비공액형으로 처리한다. PE 공액화 처리와 비교하면, 동일 혈액 샘플을 비공액형 항체로 처리하는 경우에 유의 수준으로 관찰되는 CD 양성 세포 및 관련 마커(예: CD4)의 상대적인 수의 변화가없음이 명백하게 나타난다. 그러나, 시간이 지남에 따라 표면에 DR 항원이 발현되지 않는 CD45 양성 세포수의 증가가 관찰된다(표 8 참조). 시간이 지남에 따라 면역표현형화되는 경우, 비처리 샘플에서 유사한 결과가 발견된다(표 6). 또한 CD45 발현 세포의 상대적인 수는 시간이 지남에 따라 감소되며, 이러한 현상은 동일 환자의 비처리 샘플(시간에 따라 측정)에서도 나타난다(챠트 1A 참조).
사람 백혈구연층 샘플로부터 유래한 세포의 FAC 분석
본 발명에 따른 장치중 백혈구연층 샘플을 CR3/43 모노클로날 항체로 처리하면, CD34(줄기 세포 마커)가 보다 많이 발생하고 CD19(B 림프구 마커)가 보다 적게 발생한다(표 21 참조).
콜로니 형성 분석은, 비처리 샘플에서는 적혈구 유형의 콜로니가 우세하지만, 처리 샘플에서는 주요 콜로니형인 다능성세포 콜로니와 함께 과립구/대식세포 및 거핵세포가 다양하게 나타나며 적혈구 콜로니 형성 단위도 관찰된다는 것을 보여준다.
이러한 결과는 처리 세포가, 다른 림프구조혈 경로를 따라 분화되어 다양한 특화된 세포주를 보다 잘 생성할 수 있음을 입증한다.
C. T-림프구형성시 상이한 특이성이 있는 다른 모노클로날 항체의 효과 비교
CD19 및 CD3 패널
본 발명에 따른 장치에서, 혈액 샘플을 DR 항원 α-쇄의 상동 영역 및 MHC I부류 항원의 상동 영역에 대한 모노클로날 항체로 처리하면, CD3+세포수는 감소하고 CD19+세포수는 증가한다. 동일 혈액을 DR 항원 β-쇄의 상동 영역에 대한 모노클로날 항체로 처리하면, CD19+세포수는 감소하고 CD3+세포수는 증가한다. 사이클로포스포아미드가 있는 DR 항원 β-쇄의 상동 영역에 대한 모노클로날 항체로 처리하면 동일한 효과가 나타난다(표 14, B-CLL을 앓는 환자 5/6, 2시간 처리).
동일 샘플중 CD19+및 CD3+세포의 전방 분석은, DR 항원 β-쇄의 상동 영역에 대한 모노클로날 항체로 처리한 혈액에서 CD3+세포의 상대적인 수만이 증가된다는 것을 보여준다(표 14, 환자 5/6, 24시간 처리 후). 그러나, 사이클로포스포아미드 + DR 항원 β-쇄에 대한 모노클로날 항체로 처리한 혈액 샘플의 전방 분석(24시간 후 환자 5/6, 표 14)은, 정확하게 동일한 조건하에 2시간 동안 항온배양한 후 관찰한 것과 비교하면 CD19+및 CD3+세포의 상대적인 수가 역전된다는 것을 보여준다.
일반적으로, 동일 환자의 혈액 샘플을 DR 항원 α-쇄의 상동 영역에 대한 모노클로날 항체 또는 I부류 항원 α-쇄의 상동 영역에 대한 모노클로날 항체로 처리하면, 비처리 샘플에 비해 CD19+세포(팬 B 마커) 상대적인 수가 증가하는 것으로 나타난다. CD19-CD3-세포의 상대적인 수는 DR 항원 α-쇄의 상동 영역에 대한 모노클로날 항체 또는 I부류의 상동 영역에 대한 모노클로날 항체로 처리한 혈액 샘플중에서 약간 감소한다(표 14 및 챠트 2, 3 및 4 참조). 환자 9의 혈액 샘플을 I부류 항원에 대한 모노클로날 항체로 처리하면 CD3+세포의 상대적인 수는 증가하고 CD19+및 CD19-CD3-세포의 상대적인 수는 약간 감소한다. 그러나, 건강한 혈액 공여자의 B-림프구 풍부 제제물을 DR 항체의 α-쇄 또는 β-쇄에 대한 모노클로날 항체로 처리하면, B-CLL을 앓는 환자로부터 수득한 샘플과 유사한 면역표현형적 변화를 나타낸다.
HIV+및 IgA 결핍 환자를 DR 항원의 β-쇄에 대한 모노클로날 항체로 처리하면, CD3+세포의 상대적인 수는 증가하고 CD19+세포의 상대적인 수는 감소한다. 그러나, 동일 혈액 샘플을 I부류 항원의 상동 영역에 대한 모노클로날 항체로 처리하면 동일한 효과를 나타내지 않는다. B 세포 결핍 환자로부터 수득한 혈액 샘플(34/BD 및 04/BD)을 DR 항원의 β-쇄, I부류 항원 및 CD4 항원에 대한 모노클로날 항체로 처리하면, 다양한 면역표현형적 변화가 나타난다.
CD4 및 CD8 패널
CD19 및 CD3 패널(표 14)를 사용하여 분석한 혈액 샘플은 CD4 및 CD8 패널로도 면역표현형화된다(표 15). 이들 패널 둘 다는 서로 부합하고 서로를 뒷받침한다. B-CLL을 앓는 환자의 혈액 샘플(표 15, 환자 5/6 및 10, 챠트 2, 3 및 4)을 DR 항원 β-쇄의 상동 영역에 대한 모노클로날 항체 또는 사이클로포스포아미드가부가된 싱ㄱ; 모노클로날 항체와 함께 2시간 동안 항온배양하면, CD8+및 CD4+세포의 상대적인 수 및 이들 마커를 함께 발현하는 세포의 상대적인 수가 증가한다. 반면에, 동일 샘플을 DR 항원 α-쇄의 상동 영역 또는 I부류 항원 α-쇄의 상동 영역에 대한 모노클로날 항체로 처리하면, 동일한 효과가 나타나지 않는다.
사이클로포스포아미드와 DR 항원 β-쇄의 상동 영역에 대한 모노클로날 항체로 2시간 및 24시간 항온배양한 후 수득한 면역표현형화 경향을 비교하면, CD4 및 CD8 양성 세포의 상대적인 수가 역전되는 변화가 나타나고(표 15, B-CLL을 앓는 환자 5/6, 2시간 및 24시간), 이러한 변화는 동일 혈액 샘플을 CD19 및 CD3 패널로 분석한 경우에 수득되는 것과 일치한다(표 14, 동일한 환자). 이러한 결과는 미분화 세포가 T-림프구 또는 B-림프구로 분화될 수 있으므로 후속 분화가 역전된다는 것을 나타낸다.
DR 및 CD3 패널
DR 및 CD3(표 16)으로 수득한 면역표현형적 변화는, 동일 혈액 샘플을 DR 항원 β-쇄 또는 α-쇄의 상동 영역에 대한 모노클로날 항체 또는 I부류 항원에 대한 모노클로날 항체 또는 사이클로포스포아미드가 있는 DR 항원 β-쇄의 상동 영역에 대한 모노클로날 항체로 처리한지 2시간 후 분석한, CD19 및 CD3 패널, 및 CD4 및 CD8 패널(표 14 및 15, 챠트 2, 3 및 4)로 수득한 결과를 뒷받침한다.
이러한 결과로부터, DR 항원 β-쇄의 상동 영역에 대한 모노클로날 항체가DR+세포로부터 CD3 양성 세포를 대단히 많이 생성할 수 있음을 알 수 있다.
또한, DR 항원 α-쇄 또는 사이클로포스포아미드가 연결된 분자의 β-쇄가 연루된 모노클로날 항체로 처리(장시간 항온배양)하면 CD19+세포 또는 DR+세포의 상대적인 수 증가가 촉진된다.
CD56&16 및 CD3 패널
본 발명에 따른 장치에서 혈액 샘플(특별하게는 B-림프구 수가 높은 B-CLL을 앓는 환자의 혈액 샘플)을 DR 항원 β-쇄의 상동 영역에 대한 모노클로날 항체로 처리하면 CD56 및 16 양성 세포의 상대적인 수가 증가한다.
이러한 환자에서 혈액 샘플을 β-쇄에 대한 모노클로날항체로 처리하면 CD3+, CD56+및 CD16+CD3+세포의 상대적인 수가 증가하는데, 이는 CD3, CD19, DR 및 CD3 패널을 사용하여 동일 혈액 샘플을 분석하는 동일 처리에서 나타낸 이전 관찰을 뒷받침한다.
CD45 및 CD14 패널
본 발명에 따른 장치에서 DR 항원 β-쇄 또는 α-쇄, 사이클로포스포아미드가 있는 β-쇄 또는 I부류 항원에 대한 모노클로날 항체로 처리한 혈액 샘플은 또한 CD45 및 CD14(표 18)로 분석한다. 저 CD45, 고 CD45 및 중간 CD45의 도식은 임의적이다. 혈액 샘플 5/6(2시간)을 DR 항원 β-쇄에 대한 모노클로날 항체 또는사이클로포스포아미드가 있는 모노클로날 항체로 처리하면, 저 CD45+세포가 생성되고 중간 CD45+세포의 상대적인 수는 증가한다. 그러나, 전 처리는 고 CD45+세포의 상대적인 수를 증가시키고, 후 처리는 중간 CD45+세포의 상대적인 수를 감소시키는데, 이러한 결과는 시간에 의존적인 것으로 나타난다.
환자 5/6 및 10(B-CLL)의 혈액 샘플을 I부류 항원에 대한 모노클로날 항체로 처리하면, 중간 CD45+세포의 상대적인 수가 감소한 것으로 나타나고, 비처리 샘플과 비교시 동일 처리한 혈액 샘플 09 및 HIV+에서 유사한 결과가 관찰된다. HIV+및 IgA/D 환자의 혈액 샘플을 I부류 항원에 대한 모노클로날 항체로 처리하면, DR 항원 β-쇄에 대한 모노클로날 항체로 처리한 샘플 또는 비처리 샘플에 비해 저 CD45+세포의 상대적인 수가 증가한다. 그러나, 이러한 환자의 혈액 샘플을 DR 항원 β-쇄의 상동 영역에 대한 모노클로날 항체로 처리하면, 중간 CD45+세포의 상대적인 수가 감소한다. IgA/D 환자의 혈액 샘플을 I부류 항원에 대한 모노클로날 항체로 처리하면 샘플중 중간 CD45+세포가 감소한다. MHC II부류 항원의 DR 항원 β-쇄의 상동 영역에 대한 모노클로날 항체로 처리한 혈액 샘플에서는 매우 크고 무거우며 과립형이고 높은 CD45 항원 수준을 발현하는 세포가 나타난다(챠트 1, 2, 3 및 4 참조).
CD8 및 CD28 패널
CD28 항원은 말초혈 T(CD3+) 림프구에 약 60 내지 80%, CD8+림프구에 50% 및 비성숙 CD3-흉선세포에 5% 존재한다. 흉선세포 성숙중에, CD28 항원 발현은, 대부분의 CD4+CD8+비성숙 흉선세포상에서는 저밀도이지만 실질적으로 모든 성숙한 CD3+, CD4+또는 CD8+ 흉선세포상에서는 고밀도로 증가된다. 세포 활성화는 CD28 항원 밀도를 추가로 증가시킨다. CD28 발현은 또한 CD8+림프구를 2종의 기능적인 그룹으로 분할한다. CD8+CD28+림프구는 동종항원 특이적 세포독성을 매개하는데, 이는 주조직적합복합체(MHC) I부류에 제한된다. 세포 증식 억제는 CD8+CD2-서브셋에 의해 매개된다. CD28 항원은 세포 유착 분자로 활성화된 B 림프구에 존재하는 B7/BB-1 항원에 대한 리간드로서 작용한다.
본 발명에 따른 장치에서, B-CLL을 앓는 환자의 혈액 샘플(표 19, 환자 5/6 및 8)을 DR 항원 β-쇄의 상동 영역에 대한 모노클로날 항체로 처리하면, CD8+, CD28+및 CD8+CD28+세포의 상대적인 수가 증가하는데 다른 유형의 처리는 세포수를 증가시키지 않는다.
CD34 및 CD2 패널
CD34 항원은, 단능성 전구세포(CFU-GM 및 BFU-E) 및 다능성 전구세포(CFU-GEMM, CFU-Mix 및 CFU-blast)를 포함하여 골수에 있는 비성숙 조혈 전구세포 및 모든 조혈 콜로니 형성 세포상에 존재한다. CD34는 또한 간질 세포 전구체상에서 발현한다. 정상 뼈중 말단 데옥시뉴클레오타이딜 트랜스퍼라제(TdT)+ B- 및 T-림프양 전구체는 CD34+이다. CD34 항원은 CD33 항원을 발현하지만 CD14 및 CD15 항원은 결여된 초기 골수세포, 및 CD71 항원을 발현하고 CD45 항원을 약간 발현하는 초기 적혈구 세포상에 존재한다. CD34 항원은 모세관 내피 세포상에서도 발견되면 사람 흉선세포에서는 약 1%가 발견된다. 정상 말초혈관 림프구, 단핵구, 과립구 및 혈소판은 CD34 항원을 발현하지 않는다. CD34 항원 밀도는 초기 조혈 전구세포상에서 가장 높으며 세포가 성숙함에 따라 감소된다. 완전히 분화된 조혈 세포에서는 이 항원이 존재하지 않는다.
비수임 CD34+전구세포는 CD38-, DR-이고 계통 특이적 항원(예: CD71, CD33, CD10 및 CD5)이 결여되어 있지만, 계통 수임 CD34+세포는 CD38 항원을 고밀도로 발현한다.
대부분의 CD34+세포는 CD45RO 또는 CD45RA 항원을 상호적으로 발현한다. 급성 B-림프성 백혈병 및 급성 골수성 백혈병의 약 60%는 CD34 항원을 발현한다. 이 항원은 만성 림프성 백혈성(B 또는 T 계통) 또는 림프종에서는 발현되지 않는다. CD2 항원은 T 림프구 및 자연 살해 림프구(NK)의 서브셋에 존재한다.
결과는 챠트 2, 3 및 4에 나타내었다.
B-CLL을 앓는 환자의 혈액 샘플(표 20, 환자 5/6, 2시간)을 DR 항원의 β-쇄 또는 α-쇄에 대한 모노클로날 항체로 처리한 후 분석하면, DR 항원의 β-쇄에 대한 모노클로날 항체로 처리한 후에 CD34+및 CD34+CD2+세포의 상대적인 수가 현저하게 증가한 것으로 나타난다. 동일한 혈액 샘플이 상기한 패널로 면역표현형화되기 때문에(표 14 및 19 참조), 다른 마커의 경우에 관찰된 CD34+및 CD34+CD2+세포의 상대적인 수 증가가 CD4+CD8+, CD8+CD3+및 CD4+CD3+단일 양성(SP) 세포의 상대적인 수 증가와 일치하는 것 같다. 또한 HLA-DR 항원의 β-쇄 참여를 배제한 것으로 보이는 이러한 결과는 B 림프구 억제를 통해 T-림프구를 형성시키는 과정을 직접적으로 지지한다.
동일하게 24시간 동안 처리한 후 분석하면, CD34+세포는 T 림프구 상대적인 수를 추가로 증가시킨 수준으로 감소되는 것 같다. 초기에 T-림프구를 형성시키는 역분화 과정이 역전되어 B 림프구를 형성시킬 수 있다. 전 과정은 사이클로포스포아미드가 있는 HAL-DR 항원의 β-쇄에 대한 모노클로날 항체로 2시간 동안 처리하면 관찰되지만, 후 과정은 동일 샘플을 동일하게 처리한 후 24시간 동안 항온배양한 후에 관찰된다(챠트 2).
HIV+환자의 혈액 샘플(표 20, 환자 HIV+)을 HLA-DR 항원의 β-쇄에 대한 모노클로날 항체로 처리하면 CD34+및 CD2+CD34+세포의 상대적인 수가 증가하고, 동일한 혈액 샘플을 HLA-DR 항원의 β-쇄 및 α-쇄에 대한 모노클로날 항체를 함께 가한 경우에도 증가한다. 그러나, 이 혈액 샘플을 HAL-DR 항원의 α-쇄에 대한 모노클로날 항체로 처리하면 CD34+세포 수준에 영향을 주지 않는다. 백혈병으로 조사되었고 혈액중 비정형 세포(blast)수가 매우 높은 6일령 영아로부터 수득한 혈액 샘플(BB/ST, 표 20))을 HLA-DR 항원의 β-쇄에 대한 모노클로날 항체 또는 동일 항원의 α-쇄에 대한 모노클로날 항체 또는 이들 모노클로날 항체를 함께 처리하면 다음과 같은 면역표현형적인 변화가 일어난다.
비처리 혈액 샘플을 분석하면, CD34+및 DR+세포의 상대적인 수가 현저하게 증가하고, β-쇄에 대한 모노클로날 항체로 처리하면 CD34+세포의 상대적인 수가 추가로 증가하지만, HLA-DR 항원의 α-쇄에 대한 모노클로날 항체 또는 동일 항원의 α-쇄 및 β-쇄에 대한 모노클로날 항체를 함께 처리하면 세포의 상대적인 수는 감소한다. 그러나, 후 처리는 CD34+CD2+세포의 상대적인 수를 증가시키며, 동일한 혈액 샘플을 HLA-DR 항원의 β-쇄에 대한 모노클로날 항체만으로 처리하면 반대가 된다. 24시간 후 동일 환자의 처리 및 비처리 혈액 분취량을 분석하면, CD34+의 상대적인 수는 HLA-DR 항원의 β-쇄에 대한 모노클로날 항체 처리시에만 매우 높은 수준으로 유지되고 상기한 다른 모든 처리시에는 감소된다. 24시간 후, 후 처리는 CD34+CD2+세포의 상대적인 수를 지속적으로 감소시킨다.
이러한 결과는, β-쇄를 통한 HLA-DR 항원의 관여가 CD2+CD34+집단 또는 보다 성숙한 유형의 세포(예: B-CLL을 앓는 환자의 B 림프구)로부터 보다 많은 CD34+의 생성을 촉진시키며, 이러한 유형의 처리가 역분화를 촉진시킨다는 것을 나타낸다. 그러나, 24시간 후 혈액 샘플의 면역표현형화는, 이러한 유형의 세포가 다른 계통과 함께 존재하는 것 같으며, CD7 및 CD13&33 패널로 처리한 혈액 샘플 분석시 이러한 세포가 존재하거나 오히려 관찰되는 골수계에 그 자체가 수임된다는 것을 제시한다.
MHC II부류 항원의 β-쇄의 상동 영역에 대한 모노클로날 항체로 처리하면, 건강한 개체의 풍부한 분획(CD19 비드 사용) 및 B-CLL의 B 림프구의 면역표현형적 특성이 변화된다. 이는 B 림프구의 형태학적 변화도 수반한다. 비처리 혈액 도말에서 유리 슬라이드에 콜로니화된 것으로 관찰되는 B 림프구는 과립구, 단핵구, 원시세포처럼 보이는 다수의 세포 및 유핵 적혈구 세포로 대체된다. 처리 또는 비처리 혈액 도말에서 유사분열 형태 또는 중요한 세포 죽음은 관찰되지 않는다.
표 20의 결과는, 또한 본 발명의 방법에 따르면 보다 성숙한 미분화 세포로의 역분화에 의해 미분화 세포를 제조할 수 있다는 중요한 발견을 추가로 입증한다.
D. 현미경 사진
상기한 항원 시험 외에, 본 발명의 방법은 현미경을 사용하여 가시화한다.본 발명의 장치는 추적 수단에 의해 변화를 자동 축적하도록 프로그래밍할 수 있다.
이러한 관점에서, 도 8은 본 발명의 방법을 실시하기 전의 분화된 B 세포의 현미경 사진을 나타낸 것이다. 도 9는, 제제가 HLA-DR 항원의 β-쇄의 상동 영역에 대한 모노클로날 항체인 본 발명에 따른 B 세포의 역분화에 의해 형성된 미분화 세포의 현미경 사진을 나타낸 것이다. 미분화 세포는 어둡게 염색된 세포 응집체이다. 도 10은 동일한 미분화 세포의 현미경 사진을 나타내지만 배율이 낮다.
따라서, 도 8 내지 10은 본 발명의 방법에 의해 B 세포를 미분화 줄기 세포로 역분화시킬 수 있음을 가시적으로 입증한다.
도 11은 본 발명의 방법을 실시하기 전에 분화된 B 세포의 현미경 사진이다. 도 12는, 사용된 제제가 HLA-DR 항원의 β-쇄의 상동 영역에 대한 모노클로날 항체인, 본 발명에 따른 B 세포의 역분화에 의해 형성된 미분화 세포의 현미경 사진을 나타낸 것이다. 또한, 미분화 세포는 어둡게 염색된 세포 응집체이다. 도 13은 도 12의 동일한 미분화 세포로부터 분화된 과립구 세포 형성의 현미경 사진이다.
따라서 도 11 내지 13은, 미분화 세포가 본래의 분화된 세포와 상이한 계통에 있는 새로운 분화된 세포로 수임됨으로써 본 발명의 방법에 의해 B 세포가 미분화 줄기 세포로 역분화된다는 것을 가시적으로 입증한다.
이러한 현미경 실험은 또한, 상기한 바와 같은 CR3/43 모노클로날 항체로 처리한 BCLL 환자의 혈액을 사용하여 실시한다. 상기에서 논의한 바와 같이 BCLL 세포의 혈액은 B 림프구를 정상수보다 많이 포함하기 때문에 역분화 과정 연구에 유용한 도구이다. 이 결과는 도 14 내지 17에 상세하게 나타내었다.
도 14는 BCLL 환자의 비처리된 혈액 샘플을 2종의 상이한 배율로 나타낸 것이다. 비처리된 B 림프구(청색 세포)는 전형적인 형태, 즉 응축된 염색질 구조 및 희박한 세포질을 나타낸다. 잔류하는 세포는 적혈구(적혈구 세포)이다.
혈액 샘플을 항체 CR3/43으로 처리하면 먼저 B 림프구가 모여 응집체가 된다(도 15).
응집된 B 세포는 점차적으로 전형적인 형태를 잃어버리는데, 이는 미분화 세포에서 전형적인 조약돌 모양의 세포 영역 형성, 염색질 구조 탈응축, 돌출 핵소체 등장, 세포 용적 확대 및 세포질 호염기성 미분화 세포로 특징지울 수 있다(도 16). 느슨해진(탈응축된) 염색질 구조는 분화 세포에 비해 미분화 세포의 중요한 특징이다. 이는 소정의 세포 계통을 따라 수임되는 경우에 필요한 유전자 발현에서, 변화를 결정하는 전사 단위에 보다 광범위하게 접근할 필요가 있기 때문인 것 같다. 이와 반대로, 보다 분화된 세포는 전사적으로 활성인 염색질이 소량만 필요하기 때문에 보다 응축된 염색질을 갖는 것으로 익히 공지되어 있다.
미분화 세포의 등장은 분화된 형태를 갖는 세포(17A 내지 17J)의 등장을 항상 수반한다. 중요한 것은, (i) 하나 이상의 세포 분열을 완수하기에는 항온배양 시간이 너무 짧고 (ii) 유사분열 형태가 보이지 않으며 (iii) 백혈구의 절대적인 수가 처리 전후에 동일하게 유지되기 때문에 증식에 의해 이러한 세포를 생성시킬 수 없다는 점이다. 또한 덜 분화된 전구세포는 이들의 보다 분화된 전구세포와 연관되어 있는 것으로 나타나는데(도 17J의 골수양 전구체를 참조한다), 이는 이들특화된 세포가 분화에 의해 생성된다는 것을 지시한다.
현미경 사진 도 17A 내지 17J는 B-CLL 림프구를 CR3/43 모노클로날 항체로 처리한 후에 나타난 분화 세포의 유형을 보여준다: 혈소판(Pl)-도 17A, 호중구(Ne)-도 17B, 호산구(Eso)-도 17C, 거핵세포(Meg)-도 17D, 호염기구(Ba)-도 17G, 림프구(Ly)-도 17H, 단핵구(Mo)-도 17I 및 골수양 전구세포(Mp)-도 17J. 도한 적혈구 전구세포 및 대식세포도 나타난다(데이터는 제시하지 않음).
이를 요약하면, 이러한 현미경 결과는 성숙한 B 림프구 수준이 높은 BCLL 환자의 샘플중 B 세포 형태가 변한다는 것을 나타낸다. 현미경 사진은, 먼저 응집이 일어나고 전구세포로부터 분화된 세포(호중구, 호염기구, 호산구, 거핵세포, 혈소판, 림프구, 대식세포, 과립구, 간상 과립구 및 간질 세포 유사 세포)로 점차 형태가 달라지는 다양한 세포가 등장하는 B 림프구의 형태 변화를 나타낸다.
또한 매우 중요한 것은 적혈구 및 골수양 전구세포가 존재한다는 것이다(도 17 및 데이터는 제시하지 않음). 골수양 전구세포는 다른 세포와 형태학적으로 분명히 구분되는데, 보다 크며 뚜렷한 핵 형태를 가지며, 또한 세포질 과립을 포함하고 있다.
따라서 현미경 데이터는 세포 표면 마커에 기초하여 유세포 분석 데이터가 보여주는 것을 형태학적으로 지지한다. 이러한 데이터로, B 림프구를 MHC HLA-DR β-쇄로 처리하면 B 림프구의 수가 감소하고 비성숙 전구세포를 포함한 다른 조혈 계통의 세포수가 증가된다는 결론을 내릴 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 MHC II부류 α-쇄에 대한 항체(모노클로날 항체,TAL.1B5)로 처리하면, T 세포를 미분화 줄기 세포로 역분화시키고 미분화 세포를 본래의 분화된 세포와는 상이한 계통의 새로운 분화된 세포로 분화시킨 것을 현미경으로 관찰할 수 있다(데이터는 제시하지 않음).
E. 역분화된 림프구에서 VDJ 재조합 재배열의 분석
배경기술에 의해, 본 실험에 사용된 분화된 세포(B 림프구, 또는 T 림프구의 특성이 있는 세포)는 성숙한 Ig 또는 TCR을 각각 암호화하는 재배열이 이미 발생한 유전자를 갖는다. 재배열 과정에서, 최종부의 일부가 아닌 DNA의 중간부는 TCR 또는 Ig 유전자를 발현하고, 이러한 수용체의 가변(V) 영역 암호화 단편과 불변(C) 영역 암호화 단편 사이에 있는 주 DNA가 게놈으로부터 스플라이싱된다. 이러한 절단된 단편은 염색체외 DNA의 형태로 세포내에 유지된다. 실제 역분화되는 세포의 경우, 절단된 DNA는 게놈내에 재삽입되어 세포가 본래의 분화를 진행시키는 것과 유사한 상태로 세포내에 유지된다. 이러한 이유로, 분화 상태를 특징짓는 재배열된 DNA와 비교하여, DNA가 이의 재배열되지 않은 상태 또는 생식세포계 상태로 돌아가는 경우에 재배열된 유전자의 서열에 상보적인 프로브는 보다 큰 DNA 제한 단편과 하이브리드화될 것으로 예상된다.
1. 다우디(Daudi) 세포에서 TCR 유전자의 재배열
도 18의 써던 블롯을 수득한 실험에서, 한개의 재배열 TCR 유전자(다른 것들은 결실)가 있는 익히 공지된 세포주인 다우디 B 세포 림프구를 사용한다. 다우디세포로부터 게놈 DNA를 제조하고 EcoRI으로 분해한 다음, 전기영동하고 TCR β-쇄 DNA 프로브로 프로빙한다. 사람 환자로부터 정제한 B 림프구보다는 다우디 세포를 사용하는데, 이는 이들 세포가 클론으로 연관되어 있어 분해된 게놈 DNA의 써던 블롯에 의해 명백히 확인할 수 있는 동일 유전자 재배열이 있는 동질한 세포 집단을 생성하기 때문이다. 정상 혈액 샘플에서 상이한 세포는 상이한 재배열을 가지므로, 써던 블롯에 얼룩으로 나타난다.
TCR β-쇄를 암호화하는 기능적인 유전자는, 림프구 성숙과정 동안에 연속적인 체세포 재배열에 의해 림프구에서 어셈블리되어 V 단편, D 단편 및 J 단편을 생성한다. 이러한 재배열의 매우 확실한 설명은 다음 문헌에 나타나있다[참조 문헌: Genes VI, Lewin, Oxford University Press, 1997 pages 1994-1023-a standard undergraduate text book]. 특정 페이지는 하기에서 인용하였다.
먼저, D 단편은 재조합 과정에 의해 D-J 결합 반응중에 몇몇 J 단편중 하나에 결합한다. 그런 다음, 다수의 가능한 V 단편(<60)중 하나가 생성된 DJ 단편에 결합(V-D 결합)하여 완전한 TCR β-쇄 유전자를 형성한다. RNA 프로세싱 동안에 스플라이싱된 J 단편이 개재되어, 재배열된 VDJ 유전자 단편에 불변 유전자 엑손이 근접할 수 있음에도 불구하고, 불변 영역 유전자는 재배열된 VDJ 단편의 하부스트림에 있다(Lewin, p998).
사람 세포에는 Cβ1 및 Cβ2라는 2종의 상이한 TCR β-T쇄 불변 영역 유전자 단편이 있는데, 이들은 상이한 위치에 있으며 각각 6개 또는 7개의 결합 영역(Jβ) 유전자 단편(Jβ1 및 Jβ2) 및 1개의 D 단편(Dβ1 및 Dβ2)의 집단에 의해 진행된다[도 1을 참조한다; 참조 문헌: Toyonaga et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 8642-8628 and Lewin, p1017].
V, D 및 J-C 단편을 근접시키는 재조합 과정은, V, D 및 J-C 유전자 서열의 재조합 말단에 위치하는 9량체 또는 7량체 서열을 인식하는, RAG-1 및 RAG-2를 포함한 다수 단백질에 의해 촉매된다. 이러한 9량체/7량체 서열의 배향에 따라 재조합이 역전되거나 결실된다. 이러한 유형의 과정 모두는 게놈 DNA의 제한효소 단편 패턴을 변화시킨다. 또한, 결실로 절단된 단편이 완전히 손실되지는 않는다. 오히려 절단된 단편의 말단을 재결합시켜 세포내에 존재하는 원형 DNA를 형성한다[참조 문헌: Okazaki et al., 1987, Cell 49: 477-85; Davis et al., 1991, J. EXp. Med. 173: 743-6; Livak and Schatz, 1996, Mol. Cell Biol. 16: 609-18; Harriman et al. 1993, Annu Rev Immunol. 11: 361-84]. 세포가 이배체 염색체 상보체를 갖기 때문에 각 유전자 단편은 물론 2개의 대립유전자를 갖는다.
정상 생식세포계 상태에서, Cβ1 및 Cβ2 유전자는 도 1에 나타낸 것과 같이 배열된다[참조 문헌: Toyonaga et al., 1985]. 게놈 DNA를 EcoRI으로 분해하면, 실험에 사용된 프로브에 의해 검출할 수 있는 2개의 적절한 밴드가 생성된다(프로브는 Cβ1으로부터 유도되고 표지된 DNA 단편으로 높은 서열 상동성에 기인하여 Cβ와 또한 하이브리드화한다): (i) Cβ1 서열을 포함하는 12kb 밴드; 및 (ii) Cβ2 서열을 포함하는 4kb 밴드. 이러한 생식세포계 형태는 미분화 비성숙 세포에서 나타난다(도 18의 레인 A). 이러한 생식세포계 형태는 또한 도 18의 레인 3으로 완벽하게 나타나는데(CR3/43 항체로 2시간), 레인 1의 것과 동일한 패턴을 나타낸다.
분화된 상태에서, Cβ1 및 Cβ2 둘 다의 대립유전자는 재배열되어 Cβ1 위치에 12kb 단편이 없거나 Cβ2 위치에 4kb 단편이 없다. 사실 Cβ1 위치 유래의 비하이브리드화 단편은 겔에 존재한다(이는 재조합의 결과로 Cβ1 대립유전자 둘 다의 하이브리드화 서열이 결실되었기 때문이다). Cβ2 위치의 경우, 재조합의 결과로 양쪽 염색체상에서 상이한 "대립유전자"에 상응하는 2개의 주요 밴드가 실제 존재한다. 4kb보다는 작은 가장 큰 밴드는 두개의 재배열 대립유전자중 하나의 단편에 상응한다. 가장 작은 밴드는 다른 재배열 대립유전자의 단편이다. 중간의 소수 밴드는 상이한 재배열을 갖는 다우디 세포의 서브클론으로부터 유도된 것 같다-따라서 각 대립유전자는 몰량 이하로 존재한다. 그럼에도 불구하고, 재배열 상태는 주요 밴드 둘 다가 분명하게 보이는 레인 1에 명백하게 나타난다.
MHC-DR의 α-쇄와 결합하는 음성 대조 항체(TAL.1B5)로 2시간 반응시키면, 실질적으로 상위 밴드가 손실되지만 가장 낮은 밴드는 레인 1의 비처리된 세포의 것과 유사한 강도를 갖는다(레인 2 참조). 이에 대해 가능한 설명은, 세포가 분화되어 하나의 대립유전자의 Cβ2 위치에서 추가로 재조합이 일어나 Cβ2 서열이 손실된다는 것이다. 이는 공지된 현상과 완벽하게 일치한다.
음성 대조 항체로 24시간 동안 반응시키면 비처리된 세포에 나타낸 3개의 밴드가 복구된다(레인 4 참조). 그러나, 밴드는 레인 2에 나타난 밴드보다 실질적으로 낮은 위치로 이동한다. 이러한 현상이 발생하는 이유는 분명하지 않다. 가능한 설명은 결실된 서열이 재통합된다는 것인데, 이는 루핑 아웃 절단 재통합 모델(looping-out-excision-reintegration model)과 일치한다[참조 문헌: Malissenet al., 1986, Nature 319: 28-32]. 그럼에도 불구하고 2시간 또는 24시간 동안 TAL.1B5의 항체를 사용한 결과는 생식세포계 패턴의 재배열을 지시하지 않는다. 레인 2 및 4는 실질적으로 음석 대조를 나타내는데, α-쇄에 대한 항체는 생식세포계 서열을 복구하지 않는다.
이와 반대로, 2시간 후 MHC-DR의 β-쇄에 대한 모노클로날 항체(CR3/43)로 수득한 결과는 생식세포계 형태에 상응하는 밴드 패턴, 즉 12kb 밴드 및 4kb 밴드를 나타낸다(레인 3을 레인 A와 비교한다). 바꾸어 말하면, 이러한 결과는 Cβ1 및 Cβ2 위치에서의 생식세포계 제한 패턴이 모든 대립유전자에서 복구된다는 것을 나타낸다.
이러한 결과로부터 레인 3에 나타난 밴드의 패턴이, 생식세포계 형태를 재생하는 분화된 세포의 게놈 DNA의 재배열을 지시한다고 결론내릴 수 있다.
이러한 발견의 중요성은 언급된 적이 없었다. 결실을 포함한 게놈 재배열은 역으로 게놈을 분화과정이 일어나기 전에 존재하였던 상태로 복구할 수 있다. 가장 가능성있는 설명은, 분화 동안에 Cβ2 대립유전자의 재배열에 의한 역위가 역전되고, 12kb 밴드의 손실을 유발하는 Cβ1 서열의 결실도 복구된다는 것이다. 잃어버린 Cβ1 서열의 공급원은 본래의 결실 과정에서 핵에 존재하게된 유전자부체성 원형 DNA일 것이다. 이러한 원형 DNA의 존재는 이전 문헌에 목록이 작성되어 있다(상기한 참조 문헌 참고). 그럼에도 불구하고 생식세포계 게놈의 이러한 복구가 발생하는 정확한 기전은 중요하지 않다. 중요한 것이 이것이 발생한다는 것이다.
본 발명에 따른 장치에서 MHC-DR β-쇄에 대한 모노클로날 항체(CR3/43)로 24시간 동안 지속적으로 항온배양하면 보다 복잡한 밴드 패턴이 나타난다(레인 5). 그러나, 이러한 밴드는 비처리된 대조구에서 동일 밴드를 나타내지 않는다. 특히 프로브와 하이드리드화하는 약 12kb의 단편은 여전히 존재한다("Cβ2 대립유전자"). 또한 "Cβ2 대립유전자"로 표시된 밴드는 비처리된 대조구에서 나타나는, 4kb 밴드보다 작은 밴드에 상응하지 않는다는 것을 인지하는 것이 중요하다(레인 1). 레인 5에 나타난 결과에 대해 가장 가능성있는 설명은, 재배열된 TCR 유전자가 특징인 T 세포의 것과 하이브리드화 패턴이 흡사하기 때문에 2차 재배열 과정이 일어난다는 것이다(이러한 설명은 T 세포의 세포 마커 특성을 지닌 세포 증가를 보여주는 유세포 분석 데이터와 일치한다). 그럼에도 불구하고 정확한 분자적 설명에 관계없이, 24시간 동안 CR3/43 항체에 노출된 레인 5의 결과는 2시간 동안 노출시켜 수득한 레인 3의 결과를 지지한다.
2. B-CLL 세포에서 Ig 유전자 재배열
도 19B의 써던 브롯은 만성 림프성 백혈병(B-CLL)을 앓는 환자의 말초혈액 세포를 사용하여 수득하였다. 이러한 많은 모노클로날 B 세포로부터 게놈 DNA를 제조하고 BamHI 및 HindIII로 분해한 다음 전기영동하고 TCR DNA 프로브로 프로빙한다. 이러한 B-CLL 세포는 상기한 바와 같이 CR3/43(HLA-DR, DP 및 DQ의 항 II부류 MHC 쇄)으로 24시간 동안 처리한다. 블롯은 방사능표지된 Ig J 영역 프로브로 프로빙한다. 비처리 세포로부터 수득한 레인 A의 2개의 밴드는 2개의 재배열된 Ig대립유전자를 나타낸다(부계 및 모계). 이러한 밴드는 세포를 항체로 처리한지 24시간 후의 패턴을 나타낸 레인 B에서는 나타나지 않는다. 이들의 위치에서는 생식세포계 Ig 유전자의 특징인 5.4kb 밴드가 나타난다.
도 19A에 나타낸 또다른 실험에서, 세포를 비처리하거나 지정된 시간 동안 항 II부류 MHC β-쇄 항체로 처리한다. 분화된 세포(대조) 및 항체 처리된 B-CLL 세포(겔의 좌측 절반)에서의 Ig VDJ 영역은 PCR로 증폭시킨다. 이로써 비처리 세포로부터 VDJ 증폭 산물을 수득한다. 그러나, 항체 처리된 세포에서는 밴드가 관찰되지 않는데, 이는 절단된 게놈 DNA의 삽입 결과로서 "생식세포계" DNA 형태가 VDJ용 특정 프라이머를 사용한 PCR 증폭에는 맞지않기 때문이다. 유사한 실험(겔의 우측)은 β-액틴을 암호화하는 내부관리 대조 유전자의 양상을 볼 수 있게 한다. 처리여부에 관계없이 β-액틴 PCR 증폭 산물에는 차이가 없다. 따라서, 이러한 "대조" 유전자는 동일 조건하에 동일한 세포의 Ig 유전자의 완전한 변화를 유발하는 역분화 과정에 영향을 받지 않는 것으로 나타난다.
상기한 결과는 세포를 적절한 세포 표면 수용체에 연루된 제제로 처리하면, 분화 상태의 특징인 염색체 DNA 재배열의 퇴행이 관찰됨으로써, 분자 수준에서 입증되고 모니터링되는 세포의 역분화가 유도된다는 것을 보여준다. 따라서, 분자적 유전자 및 형태적인 변화를 기본으로 하여, B 림프구계 세포를 II부류 MHC β-쇄와 연루된 제제(mAb)로 처리하면 역분화가 일어난다고 결론지을 수 있다. 이와 반대로, 동일 세포를 II부류 α-쇄와 관련돤 항체로 처리하면 역분화가 유사하게 유도되지 않는다. 어느 편인가 하면, 이들은 B 세포 경로를 따라 분화(진행)되는 것으로 나타난다.
F. B 림프구 역분화에 대한 추가 연구
BCLL 환자의 FACsVantage 정제된 BCLL 세포(95% 순수한 B 세포)는 본 발명에 따른 장치에서 상기한 바와 같이 CR3/43 항체로 처리하고, 세포는 유세포 분석법으로 처리한다. 하기 표 A에 나타낸 결과는 상기에서 수득한 결과를 추가로 뒷받침한다. B 림프구계(CD19, CD20 및 CD22)에 특징적인 세포 표면 마커가 있는 세포수는 상당히 감소하지만 이와 함께 CD34+세포수가 상당히 증가한다. 표 A로부터 알 수 있는 중요한 점은 CD34 음성 및 계통 음성 세포 모두의 세포수가 증가된다는 것이다. 이러한 미분화 세포는 조혈계로 수임되지 않으며 분화시 CD34+줄기 세포로 진행된다. 또한 광학현미경에 의해 샘플 조사는 비조혈 세포의 형태학적 특징을 지닌 유착 세포 유형의 범위를 보여준다.
마커 0시간 2시간 24시간
CD20 73 67 16
CD14 0 3 23
CD34 0 1 23
CD7 0 2 0
CD16 8 3 2
CD19 95 71 1
CD22 5 3 2
CD33 0 0 0
CD3 0 0 0
동일 세포상에 CD34 세포 표면 마커가 등장함으로써 수반되는 CD 19 세포 표면 마커의 손실이 또한 입증되었고 공초점 현미경을 사용하여 실시간으로 비디오에 녹화하였다. CD3/43 mab를 가하기 전에, B 림프구를 CD19에 대한 FITC 공액화 모노클로날 항체로 녹색으로 염색시킨다. CR3/43 mab를 가한 후, 세포의 녹색 형광은 사라지고 CD34에 대한 PE/Cy5(또는 퀀텀 레드) 공액화 모노클로날 항체로 녹색이 아닌 적색으로 염색된다(시간 경과 비디오로부터의 2개의 정지된 영상을 보여주는 도 23을 참조한다). 결과는 B 림프구 역분화 과정 동안에 계통 특이적 마커(예: CD19)가 손실되고 줄기 세포 마커(예: CD34)가 재발현된다는 것을 확실히 뒷받침한다.
G. B 림프구의 조혈 줄기 세포로의 역분화를 유도하는 다른 제제
초기 연구는 실제 3종의 제제를 확인하였다: 과립구/단핵구 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 에리트로포에틴 및 mAb CR3/43. 본 발명에 따른 장치에서 다량의 정제된 정상 B 림프구 제제를 CR3/43 및 TAL.1B5에 대해 기술한 것과 유사한 방법에 의해 이들 3종의 제제 중 하나로 처리하고 처리한 샘플은 상기한 바와 같은 유세포 분석법으로 조사한다. 음성 대조 세포와 비교시, GM-CSF, 에리트로포에틴 또는 mAb CR3/43으로 처리한 3종의 샘플 모두는 역분화와 일치하는 변화를 나타낸다. 특히 이들 3종의 제제 모두는 세포 집단에서 CD34+세포의 상대적인 수를 증가시킨다(도 20을 참조). 그러나 가장 큰 효과는 CR3/43으로 나타났으며, 결과적으로 본원에서 발표한 보다 상세한 연구를 위해 이 제제를 선택하였다.
H. 역분화 과정에 의해 생성되는 조혈 줄기 세포의 특성
콜로니 형성 검정
유세포 분석법에 의해 관찰되는 CD34+세포, 및 미분화 조혈 세포의 특성을 지니고 현미경으로 구분되는 미분화 세포를 확인하기 위해, II부류 MHC β-쇄에 대한 항체(CR3/43, 상기 참조)로 처리한 혈액 샘플로 콜로니 형성 검정-원시 조혈 세포의 능력을 평가하기 위해 당해 분야에서 공지된 표준 방법-을 실시한다. 콜로니 형성 검정은 추적 기전의 일부로서 본 발명에 다른 장치에서 자동으로 수행할 수 있다.
조혈 줄기 세포에 대한 시험관내 콜로니 검정은, 표현형적 및 기능적으로 성숙된 골수세포 및/또는 적혈구 세포로 증식, 분화 및 발생될 수 있는 능력을 지닌 원시 전구세포의 정량을 가능하게 한다. 예를 들어, 시험관내에서 성장 인자의 존재하에 줄기 세포를 연질 겔 매트릭스에 씨딩하고 고정시키면 클론을 성장(증식)시키고 분화시킬 수 있다.
도 21은 역위 명시야 현미경을 사용하여 본 발명의 방법에 따라 생성시킨 줄기 세포의 콜로니 검정을 나타낸 것이다. 본 검정에서, 건강한 혈액 공여자의 백혈구연층으로부터 수득한 B 세포를 CR3/43 mab로 처리한 다음, 재료 및 방법 부분에서 상기한 바와 같이 콜로니 검정을 실시한다.
도 21의 패널(a) 내지 (e)는 다음과 같다:
a) 배양 접시의 명시야 현미경은 ×3의 배율인데, 이는 심지어 나안으로도 용이하게 관찰할 수 있는 적혈구, 골수세포 및 혼합(성숙한 골수세포 및 적혈구 세포로 구성)된 콜로니를 보여준다. 각 콜로니는 증식 및 후속적인 분화에 의해 단일 조혈 줄기 세포로부터 생성된다.
b) MIX-CFC. 이 콜로니는 단일 다능성 조혈 줄기 세포로부터 생성된다(줄기 세포는 골수계 및 적혈구계 세포를 생성할 수 있다).
c) M-CFC. 이 콜로니는 대식세포로 구성된다.
d) GM-CDC. 이 콜로니는 대식세포, 과립구 및 거핵세포를 포함한 골수계로 이루어진다.
e) BFU-E. 이 콜로니는 정적아구 및 무핵 적색 세포와 같은 골수계에 속해있는 세포로 이루어져있다. 세포의 적색은 헤모글로빈이 많기 때문이다. 이러한 콜로니의 거대한 크기는 이것이 거의 원시 줄기 세포로부터 생성된다는 것을 나타낸다.
동일한 결과는 B-CLL 세포로 관찰된다(데이터로 제시하지 않음). 비처리 B 세포는 조혈 콜로니를 생성하지 않는다(데이터로 제시하지 않음). 따라서 이러한 결과는, II부류 MHC β-쇄에 대한 모노클로날 항체 CR3/43으로 처리한 혈액 샘플중에는 가시적인 조혈 줄기 세포가 존재하지만 비처리 세포에는 존재하지 않는다는 것을 입증한다.
장기간 배양
장기간 검정으로 조혈 줄기 세포의 자체 재생력을 조사한다. 본 배양에서는 골수 조혈의 대부분의 성분들을 시험관내에서 재생한다. 본 배양의 중요 특징은 조혈을 유지하는 것으로, 이는 부가된 성장 인자의 부재하에 일어난다. 본 검정에서 조혈 과정은 절대적으로 골수 유도된 간질 세포의 유착 층 성립에 좌우된다. 간질 세포(예를 들어 섬유아세포, 지방세포, 및 간엽세포계에 속하는 모든 유형의 세포를 포함한 다양한 비조혈 세포로 구성)는 적절한 환경(성장 인자의 분비 및 세포외 매트릭스 합성)을 제공하여 줄기 세포의 생존, 자체 재생, 증식 및 분화를 촉진함으로써 조혈을 지지한다.
본 검정에서, 건강한 혈액 공여자의 백혈구연층으로부터 수득된 B 세포(동일 결과가 B-CLL 세포로 수득된다)를 CR3/43 mab로 처리하면, 시간에 따라 항체 부가 시간내에 유착 세포층이 형성된다.
간질 세포(주로 섬유아세포/간엽세포형 세포/역위 명시야 현미경으로 조사시 나타나는 광 굴절성 거대 세포로 구성된 블랭킷(blanket) 세포-도 22 참조)로 이루어진 유착 층은 조혈 세포의 성장 및 발달을 12주 이상까지 지지한다(이러한 세포는 조혈 세포와 친밀하게 접촉한다). 또한 유착 층에서 볼 수 있는 것은, 조혈 세포의 지속적 생성 근원인 원시 조혈 세포 그룹이다(또한 어둡게 나타나는 세포의 조약돌 영역/응집체로 공지되어 있다).
조혈 부위의 응집체를 형성하는 소원세포로 이루어진 간질층(밝게 나타나는 세포의 응집체)의 상부에는 비유착 층이 있다. 이러한 층은 줄기 세포를 포함하며 또한 조혈계의 보다 수임된 전구세포를 포함한다. 비유착 층은 MIX-CFC, GM-CFC,M-CFC, BFU-E(콜로니 검정을 사용하여 측정) 및 CFU-F(콜로니 형성 단위-섬유아세포)를 생성할 수 있다(장기간 배양 배지에서 서브배양하는 경우).
I. HLA-DR의 β-액틴에 대한 항체로 처리한 세포의 RT-PCR
유전자 전사는 CD34, c-키트(줄기 세포 인자의 리간드), ε-헤모글로빈(헤모글로빈의 배아형) 및 β-액틴 유전자의 경우에는 CR3/43 mab로 처리한 라모스(Ramos; B 림프구) 및 K562(적혈구성 백혈병) 세포에서 측정한다.
방법
CR3/43 mab로 처리하기 전 및 후에 RNAZOL(CINA BIOTECH)을 사용하여 mRNA를 추출한다. mRNA는 표준 완충액 4㎕, dNTP 2㎕, RANSIN 1㎕, 역전 프라이머 1㎕(랜덤 6량체 프라이머) 및 MMLV 역전사효소 1㎕로 5분 동안 실온에서 항온배양하여 6량체로 역전사를 프라이밍한다. 이 혼합물을 38℃에서 1시간 더 항온배양한다. 그런 다음, 표준 조건하에 CD34, c-키트, ε-헤모글로빈 및 β-액틴 서열을 증폭시키도록 고안된 프라이머를 사용하여 PCR을 실시한다. 프라이머는 발행된 데이터에 따라 랜들 인스티튜트 킹스 칼리지(Randell Institute Kings College)에서 합성하였다.
결과
수득한 결과는, CR3/43 mAb로 처리한 후 β-액틴 mRNA의 수준은 변하지 않았지만 CD34, c-키트 및 ε-헤모글로빈 mRNA 모두가 상당히 증가되었음을 보여준다. CD34 및 c-키트에 대한 결과는 B 림프구의 역분화가 조혈 줄기 세포를 생성함을 입증하는 상기한 상세한 데이터를 추가로 지지한다.
ε-헤모글로빈에 대해서 수득한 결과는 ε-헤모글로빈이 배아 세포에서만 정상 발현되기 때문에 보다 흥미롭다. 따라서, CR3/43 mAb로 처리하면, 조혈 줄기 세포뿐만 아니라 심지어 배아 줄기 세포같은 원시 미분화 세포도 생성할 수 있다.
J. 요약
요약하면 본 발명에 따른 장치는 분화된 세포를 줄기 세포로 역분화시키는데 사용할 수 있다. 실시예는, 시간과 관련하여 말초 혈액 샘플중 림프구 조혈에 영향을 미치는 줄기 세포 생성에 사용될 수 있는 T 및 B 림프구의 발생 및 발달에 관한 흥미로운 발견을 제시한 시험관내 실험을 기술하고 있다.
B 림프구 수가 높은 B 세포 만성 림프성 백혈병(B-CLL)을 앓는 환자로부터 수득한 말초 혈액 샘플을 II부류 항원의 β-쇄의 상동 영역에 대한 모노클로날 항체로 처리하면, 흉선세포 마커 CD4 및 CD8 항원에 대해 이중 양성인 단일 양성(SP) T 림프구 및 이의 전구세포의 상대적인 수가 현저하게 증가하고 이들은 동시에 공동 발현된다. 그러나, 이러한 현상은 B 림프구의 상대적인 수의 상당한 감소를 항상 수반한다. 동일한 혈액 샘플을 II부류 항원의 α-쇄의 상동 영역 또는 I부류-항원의 상동 영역에 대한 모노클로날 항체로 처리하는 경우에는 이러한 관찰이 인지되지 않는다.
본 발명에 따른 장치에서 B 세포 만성 림프성 백혈병(CLL)을 앓는 환자로부터 수득한 전혈을 HLA-DR 항원의 β-쇄의 상동 영역에 대한 모노클로날 항체로 처리하면 T-림프구가 형성된다. 이러한 사건은 CD4 및 CD8 마커를 공동발현하는 이중 양성 세포의 등장으로 나타나며, CD34 및 공존자를 발현하는 세포의 등장은 단일 양성 CD4+CD3+및 CD8+CD3+림프구의 수를 증가시킨다. 또한, 이러한 세포 생성시 발생하는 면역표현형적 변화는, 특히 시간에 따라 흉선세포 발달에서 인용한 것과 동일하다.
전혈을 DR 항원의 β-쇄의 상동 영역에 대한 모노클로날 항체로 2시간 동안 항온배양하여 생성한 이중 양성 세포(DP)의 %는 시간이 지남에 따라 감소되고, 이러한 사건은 이와 동시에 및 시간이 지남에 따라 단일 양성 CD4+CD3+및 CD8+CD3 세포의 %를 증가시킨다. TCR α 및 β-쇄도 이러한 유형의 세포상에서 발현된다.
B 림프구는 CD19, CD21, CD23, IgM 및 DR과 같은 마커 손실이 일정하게 관찰되는데, 이는 CD34+및 CD34+CD2+세포의 등장, CD7+세포의 증가, CD8+CD28+및 CD28+세포의 증가, CD25+세포의 증가, CD10+및 CD34+세포, 및 CD34+및 CD19+세포의 등장, CD5+세포 및 저수준 CD45 항원 발현 세포의 증가와 일치한다. 이러한 변화는 혈액을 HLA-DR 항원의 β-쇄의 상동 영역에 대한 모노클로날 항체로 처리한 것에 기인한다.
이러한 처리와 관련된 면역표현형적 변화는 역분화 및 후속되는 B 림프구의수임(즉, 재수임)과 일치하는데, 이는 B-CLL을 앓는 환자의 혈액중 백혈 세포의 다수가 B 림프구이기 때문이다. 또한 HLA-DR 항체의 β-쇄에 대한 모노클로날 항체 및 사이클로포스포아미드로 처리한 후에 T 림프구가 되도록 유도된 B-CLL 환자의 B-림프구는 이러한 지속적인 항온배양 후에 B 림프구로 돌아갈 수 있다.
CD16&56, CD3, CD8 및 CD3 패널이 있는 HLA-DR 항원의 β-쇄에 대한 모노클로날 항체로 처리한 샘플 분석시, 이러한 마커를 발현하는 세포의 상대적인 수는 CD19, CD3, DR 및 CD3과 같은 패널로 측정된 것과 일치하여 지속적으로 증가한다. 네플로메트리(nephlometry) 및 면역전기영동을 사용하여, HIV 감염된 환자의 처리 및 비처리 샘플의 상층액을 조사하면 IgG 수준이 증가한 것으로 나타났는데, 이는 B 세포가 혈장 세포 상태를 통과해야 한다는 것을 지시한다. 상기한 모든 세포의 상대적인 수의 증가는 또한 다량의 CD56&16 항원을 발현하는 중간 크기의 무거운 과립화 세포의 등장에 수반된다. 매우 크고 무거운 과립화된 다른 세포가 일시적으로 관찰되며, 이는 CD34에 대해서 양성이며 CD4CD8 마커에 대해 이중 양성이다. 다른 일시적 세포가 또한 관찰되는데, 이는 크고 과립되었으며 CD3 및 CD19 수용체에 대해 양성이다. B 림프구의 다수에 존재하는 CD25는 손실되고, 수가 항상 증가하는 것으로 관찰된 새로 형성된 T 림프구에 의해 발현된다.
B-CLL을 앓는 환자의 전혈을 DR-항원 β-쇄의 상동 영역에 대한 모노클로날 항체로 처리한 후에 CD28+CD8+및 CD28+세포가 나타난다. 이러한 결과는 HLA-DR 항원의 β-쇄의 상동 영역에 대한 모노클로날 항체로 혈액을 처리한 것에 기인한다.
이러한 방식으로 일어나는 T 림프구형성은 건강한 혈액 공여자의 말초 혈액, 제대혈, 골수, HIV+를 포함한 다양한 감염을 앓는 환자 및 AIDS 환자, 및 건강한 혈액 공여자, IgA 결핍 환자 및 다양한 다른 상태의 환자의 혈액 샘플로부터 수득한 B 림프구가 풍부한 분획에서도 관찰된다. 또한, HLA-DR 항원의 β-쇄의 상동 영역에 대한 모노클로날 항체로 BCLL 환자의 두명의 샘플에서 골수계 마커를 분석하면, CD13 및 CD33과 같은 골수계 마커를 발현하는 세포의 상대적인 수가 상당히 증가하는 것으로 나타난다.
이러한 마커는 CD56&16 또는 CD7 항원과 공동발현된다. 그러나, T 림프구 마커가 있고 골수계 항원이 없는 CD7+세포의 상대적인 수는 별개의 세포 집단에서 관찰된다. 이러한 특별한 관찰은 비처리된 샘플이나 HLA-DR 항원의 α-쇄의 상동 영역 또는 I부류 항원에 대한 모노클로날 항체로 처리한 샘플에서는 나타나지 않는다(챠트 2 및 3을 참조한다). 이러한 최종 결과는 HLA-DR 항원의 β-쇄를 통해 일단 개시된 B 림프구가 T 림프구 전구세포로 역행될 수 있을뿐만 아니라 골수계 및 적혈구계로 존재할 수 있음을 제시한다.
요약하면, 본 발명에서 제시한 데이터는 본 발명에 따른 장치에서 (i) 한 계통의 건강한 세포를, 몇몇 다른 혈통의 세포 표면 마커 및 형태학적 특성을 지닌 세포로 역전시킬 수 있으며, (ii) 분화된 B 림프구 및 T 림프구로부터 원시 전구세포의 세표 표면 마커 및 형태학적 특성을 지닌 세포(예: 줄기 세포)를 수득할 수 있음을 입증한다.
다수의 실험이 BCLL 세포로 수행되었음을 인지해야 한다. BCLL 세포는 성숙한 B 림프구로, 혈장 세포의 최종 분화된 상태로 분화될 수 없다. 대신에 염색체 결핍에 기인하여, 이들은 높은 수준의 증식을 나타내기 때문에 BCLL 환자의 혈액중 B 림프구의 수가 많아진다. 선행 기술에서 상기한 종양 세포의 수와는 반대로, BCLL 세포는 본 발명의 방법에 사용하기 전에 어떠한 형태의 제한된 역분화도 일어나지 않는다. 또한 이들은 게놈 구조, 세포 마커 및 세포 형태 측면에서 미분화 세포의 어떠한 특성도 나타내지 않는다. 모든 측면에서 이들은 성숙한 B 림프구이다.
따라서, 몇몇 악성 세포가 제한된 정도의 미분화 세포 특성을 다소 나타내더라도, B 림프구 연구에 대해 완벽하게 수용가능한 실험 시스템인 BCLL 세포의 경우에는 아니다. 실제, BCLL 및 다우디 세포는 본 실험과 관련된 어떠한 측면에서도 정상 세포와 크게 구별되지 않는다. 사실 모델 시스템으로서 BCLL 세포의 적합성은 마텐스 등에 의해 뒷받침된다[참조 문헌: Martensson et al., 1989, Eur. J. Immunol. 19: 1625-1629, p1625, rhs, 1stpara].
또한 건강한 공여자의 사람 백혈구연층 혈액 샘플을 CR3/43 모노클로날 항체로 처리하면 CD34(줄기 세포 마커)가 증가하고 CD19(B 림프구 마커)가 감소한다.
본 발명의 방법에 의해 생성된 줄기 세포는 어떠한 조직의 줄기 세포일 수도 있으며 림프구 조혈 전구세포에만 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 변형은 당 분해의 숙련가에게 명백할 것이다.
당분야의 숙련가에게 명백한 바와 같이, 본 발명의 장치는 본질적으로 본원에서 기술한 수임 세포 및/또는 제제를 포함하여 세포 집단과 함께 사용하는데는 제한이 없으며, 제제와 유동액을 혼합하고 항온배양하는데 필요한 어떠한 과정과도 함께 사용하기에 적합하다.
상기한 명세서에서 언급한 모든 문헌은 본원에서 참조 문헌으로 인용한다. 본 발명의 범위 및 범주를 벗어나지 않으면서 본 발명에서 기술한 방법 및 시스템의 다양한 변형 및 변화가 당분야의 숙련가에게 명백할 것이다. 본 발명이 바람직한 특정 양태와 관련되어 기술되더라도, 청구되는 본 발명이 이러한 특정 양태에만 지나치게 제한되지 않는다는 것을 이해해야한다. 실제, 분자 생물학 또는 관련 분야의 숙련가에게는 명백한, 본 발명을 수행하는데 있어 기술한 방식의 변형은 하기하는 청구범위내에 포함된다.
환자 ID 진단 EXPT COND WBC/LX10-9B A % 림프B A #림프/L10X-9B A 제제ML/mL
HIV+ AIDS 6시간22℃에서 항-B20항-I
IgA-D IgA결핍 6시간22℃에서 항-B20항-I20
EXPT COND: 실험 조건B: 처리 전A: 처리 후항-B: HLA-DR 항원의 β-쇄의 상동 영역에 대한 모노클로날 항체항-A: HLA-DR 항원의 α-쇄의 상동 영역에 대한 모노클로날 항체항-I: I부류 항원의 상동 영역에 대한 모노클로날 항체항-AB: 함께 첨가된 항-B 및 항-A항-4: CD4 항원에 대한 모노클로날 항체항-I+II+4: 함께 첨가된 항-I 및 항-B 및 항-4독성제: 사이클로포파마이드ML/ml: ml당 마이크로 리터L: 리터
챠트 1
챠트 1A
챠트 2
챠트 3
챠트 4

Claims (97)

  1. 챔버, 수임 세포(committed cell)를 포함한 세포 집단을 챔버내로 도입하는 수단, 수임 세포를 미분화 세포로 역분화시킬 수 있는 역분화 수단을 챔버내로 도입하는 수단, 및 수임 세포를 미분화 세포로 역분화시키도록, 수임 세포를 역분화 수단의 존재하에 항온배양하는 항온배양 수단을 포함하는, 수임 세포를 포함한 세포 집단에서 미분화 세포를 형성시키고/시키거나 미분화 세포의 상대적인 수를 증가시키는 장치.
  2. 챔버, 수임 세포를 포함한 세포 집단을 챔버내로 도입하는 수단, 수임 세포를 미분화 세포로 역분화시키는 제제를 챔버내로 도입하는 수단, 및 수임 세포를 미분화 세포로 역분화시키도록, 상기 제제 및 수임 세포를 항온배양하는 항온배양 수단을 포함하는, 수임 세포를 포함한 세포 집단에서 미분화 세포를 형성시키고/시키거나 미분화 세포의 상대적인 수를 증가시키는 장치.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 세포 집단의 용적을 측정하는 측정 수단을 포함하는 장치.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포수를 계수하고, 세포 집단의 세포 농도를 측정하는 수단을 포함하는 장치.
  5. 제4항에 있어서, 세포수를 계수하는 수단이 코울터(coulter) 계수기, 바람직하게는 소형화된 계수기 또는 다른 적합한 세포측정기인 장치.
  6. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 소정량의 세포 집단을 저장 용기로부터 챔버에 전이시키는 전이 수단을 포함하는 장치.
  7. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 저장 용기로부터 예정된 양의 세포 집단을 챔버에 전이시키는 전이 수단을 포함하는 장치.
  8. 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 챔버에 첨가되는 제제 용적을 계산하는 계산 수단을 포함하는 장치.
  9. 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 소정의 용적의 제제를 챔버에 전이시키는 추가의 수단, 바람직하게는 모터에 의해 구동되는 주사기를 추가로 포함하는 장치.
  10. 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 계산된 용적의 제제를 챔버에 전이시키는 전이 수단을 추가로 포함하는 장치.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 추가의 전이 장치가 모터에 의해 구동되는 주사기인 장치.
  12. 제1항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, 챔버내의 이산화탄소 농도를 조절하는 이산화탄소 조절 수단을 포함하는 장치.
  13. 제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, 챔버내의 온도를 조절하는 온도 조절 수단을 포함하는 장치.
  14. 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, 챔버내에서 세포 집단 및 제제를 혼합하는 혼합 수단을 포함하는 장치.
  15. 제1항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 있어서, 항온배양 기간을 타이밍하는 타이밍 수단을 포함하는 장치.
  16. 제1항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 있어서, 항온배양 기간의 잔류 시간을 사용자에게 표시하는 표시 수단을 포함하는 장치.
  17. 제1항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 있어서, 항온배양 기간의 완료를 사용자에게 알려주는 알람 수단을 포함하는 장치.
  18. 제1항 내지 제17항 중의 어느 한 항에 있어서, 챔버로부터 세포를 수집하는 수집 수단을 포함하는 장치.
  19. 제18항에 있어서, 수집 수단이 미분화 세포를 챔버로부터 수집하는 장치.
  20. 제1항 내지 제19항 중의 어느 한 항에 있어서, 미분화 세포를 포함한 세포의 샘플을 챔버로부터 제거하여 저장 용기로 전이시키는 제거 수단을 포함하는 장치.
  21. 제1항 내지 제20항 중의 어느 한 항에 있어서, 미분화 세포를 포함한 세포 집단을 포함하는 저장 용기를 밀봉하는 밀봉 수단을 포함하는 장치.
  22. 제1항 내지 제21항 중의 어느 한 항에 있어서, 수임 세포가 비-암세포인 장치.
  23. 제1항 내지 제22항 중의 어느 한 항에 있어서, 수임 세포가 분화 세포인 장치.
  24. 제1항 내지 제23항 중의 어느 한 항에 있어서, 수임 세포가 수임 조혈 세포인 장치.
  25. 제1항 내지 제24항 중의 어느 한 항에 있어서, 수임 세포가 CFC-T 세포, CFC-B 세포, CFC-에오신 세포, CFC-Bas 세포, CFC-GM 세포, CFC-MEG 세포, CFC-E 세포, T 세포 및 B 세포로부터 선택되는 장치.
  26. 제1항 내지 제25항 중의 어느 한 항에 있어서, 미분화 세포가 다능성 줄기 세포인 장치.
  27. 제1항 내지 제26항 중의 어느 한 항에 있어서, 미분화 세포가 조혈 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 상피 줄기 세포, 간엽 줄기 세포, 내배엽 줄기 세포 및 배아 줄기 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 줄기 세포인 장치.
  28. 제1항 내지 제27항 중의 어느 한 항에 있어서, 미분화 세포가 하나 이상의 세포 표면 마커 명칭: CD34+, HLA-DR-, CD38-, CD117, AC133, CD90 및/또는 CD45low를 특징으로 하는 장치.
  29. 제1항 내지 제28항 중의 어느 한 항에 있어서, 미분화 세포가 MHC I+부류 및/또는 MHC II+부류 세포인 장치.
  30. 제1항 내지 제29항 중의 어느 한 항에 있어서, 제제가 수임 세포의 표면에서 항원의 포획, 인식 또는 제시를 매개하는 수용체를 교합시키는 장치.
  31. 제30항에 있어서, 수용체가 MHC I부류 항원 또는 MHC II부류 항원인 장치.
  32. 제31항에 있어서, I부류 항원이 HLA-A 수용체, HLA-B 수용체, HLA-C 수용체, HLA-E 수용체, HLA-F 수용체 또는 HLA-G 수용체이며 II부류 항원이 HLA-DM 수용체, HLA-DP 수용체, HLA-DQ 수용체 또는 HLA-DR 수용체인 장치.
  33. 제32항에 있어서, 수용체가 HLA-DR 수용체인 장치.
  34. 제30항에 있어서, 수용체가 상동 영역을 갖는 β-쇄를 포함하는 장치.
  35. 제34항에 있어서, 수용체가 적어도 HLA-DR의 β-쇄의 상동 영역을 포함하는 장치.
  36. 제30항에 있어서, 제제가 수용체에 대한 항체인 장치.
  37. 제36항에 있어서, 제제가 수용체에 대한 모노클로날 항체인 장치.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체 CR3/43 및 모노클로날 항체 TAL 1B5로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 장치.
  39. 제2항 내지 제38항 중의 어느 한 항에 있어서, 제제가 MHC 유전자 발현을 조절하는 장치.
  40. 제39항에 있어서, 제제가 MHC I+부류 및/또는 MHC II+부류 발현을 조절하는 장치.
  41. 제1항 내지 제40항 중의 어느 한 항에 있어서, 수임 세포를 포함하는 세포 집단이 백혈구연층 혈액 샘플이거나 백혈구연층 혈액 샘플로부터 유래되는 장치.
  42. 챔버, 조혈 세포를 포함한 세포 집단을 챔버내로 도입하는 수단, 수임 조혈 세포를 미분화 세포로 역분화시킬 수 있는 역분화 수단을 챔버내로 도입하는 수단, 및 수임 조혈 세포를 미분화 세포로 역분화시키도록, 수임 세포를 역분화 수단의 존재하에 항온배양하는 항온배양 수단을 포함하여, 조혈 세포를 포함한 세포 집단에서 미분화 세포를 형성시키고/시키거나 미분화 세포의 상대적인 수를 증가시키는 장치.
  43. 챔버, 수임 세포를 포함한 세포 집단을 챔버내로 도입하는 수단, 수임 세포와 작동적으로 교합시키는 제제를 챔버내로 도입하는 수단, 및 챔버내에서의 교합의 결과로서 CD34+및/또는 HLA-DR-및/또는 CD38-및/또는 CD117 및/또는 AC133 및/또는 CD90 및/또는 CD45low 세포의 상대적인 수를 증가시킬 수 있도록, 챔버내에서 제제에 의해 교합된 수임 세포를 항온배양할 수 있는 항온배양 수단을 포함하는, 수임 세포를 포함한 세포 집단에서 세포 표면 마커 명칭 CD34+및/또는 HLA-DR-및/또는 CD38-및/또는 CD117 및/또는 AC133 및/또는 CD90 및/또는 CD45low를 갖는 세포를 형성시키고/시키거나 상대적인 수를 증가시키는 장치.
  44. 보다 수임된 세포를 미분화 세포로 역분화시킴을 포함하여, 미분화 세포를 제조하는 방법으로서, 보다 수임된 세포의 역분화가 백혈구연층 혈액 샘플내의 보다 수임된 세포 또는 이로부터 유래된 보다 수임된 세포에서 발생하는 방법.
  45. 백혈구연층 혈액 샘플 중의 보다 수임된 세포를, 보다 수임된 세포를 미분화 세포로 역분화시키는 제제와 접촉시시킴을 포함하여, 미분화 세포를 제조하는 방법.
  46. 제44항 또는 제45항에 있어서, 수임 세포가 비-암세포인 방법.
  47. 제44항 내지 제46항 중의 어느 한 항에 있어서, 수임 세포가 분화 세포인 방법.
  48. 제44항 내지 제47항 중의 어느 한 항에 있어서, 수임 세포가 수임 조혈 세포인 방법.
  49. 제44항 내지 제48항 중의 어느 한 항에 있어서, 수임 세포가 CFC-T 세포, CFC-B 세포, CFC-에오신 세포, CFC-Bas 세포, CFC-GM 세포, CFC-MEG 세포, CFC-E 세포, T 세포 및 B 세포로부터 선택되는 방법.
  50. 제44항 내지 제49항 중의 어느 한 항에 있어서, 미분화 세포가 다능성 줄기 세포인 방법.
  51. 제44항 내지 제50항 중의 어느 한 항에 있어서, 미분화 세포가 조혈 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 상피 줄기 세포, 간엽 줄기 세포 및 배아 줄기 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 줄기 세포인 방법.
  52. 제1항 내지 제51항 중의 어느 한 항에 있어서, 미분화 세포가 하나 이상의 세포 표면 마커 명칭: CD34+, HLA-DR-, CD38-, CD117, AC133, CD90 및/또는 CD45low를 특징으로 하는 방법.
  53. 제44항 내지 제52항 중의 어느 한 항에 있어서, 미분화 세포가 MHC I+부류 및/또는 MHC II+부류 세포인 방법.
  54. 제44항 내지 제53항 중의 어느 한 항에 있어서, 제제가 수임 세포의 표면에서 항원의 포획, 인식 또는 제시를 매개하는 수용체를 교합시키는 방법.
  55. 제54항에 있어서, 수용체가 MHC I부류 항원 또는 MHC II부류 항원인 방법.
  56. 제55항에 있어서, I부류 항원이 HLA-A 수용체, HLA-B 수용체, HLA-C 수용체, HLA-E 수용체, HLA-F 수용체 또는 HLA-G 수용체이고, II부류 항원이 HLA-DM 수용체, HLA-DP 수용체, HLA-DQ 수용체 또는 HLA-DR 수용체인 방법.
  57. 제56항에 있어서, 수용체가 HLA-DR 수용체인 방법.
  58. 제54항에 있어서, 수용체가 상동 영역을 갖는 β-쇄를 포함하는 방법.
  59. 제58항에 있어서, 수용체가 적어도 HLA-DR의 β-쇄의 상동 영역을 포함하는방법.
  60. 제54항에 있어서, 제제가 수용체에 대한 항체인 방법.
  61. 제60항에 있어서, 제제가 수용체에 대한 모노클로날 항체인 방법.
  62. 제60항 또는 제61항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체 CR3/43 및 모노클로날 항체 TAL 1B5로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  63. 제45항 내지 제62항 중의 어느 한 항에 있어서, 제제가 MHC 유전자 발현을 조절하는 방법.
  64. 제63항에 있어서, 제제가 MHC I+부류 및/또는 MHC II+부류 발현을 조절하는 방법.
  65. 수임 세포를 작동적으로 교합시키는 제제를 백혈구연층 혈액 샘플 중의 보다 수임된 세포와 접촉시켜, 교합의 결과로서 CD34+및/또는 HLA-DR-및/또는 CD38-및/또는 CD117 및/또는 AC133 및/또는 CD90 및/또는 CD45low 세포의 상대적인 수를 증가시킴을 포함하여, 백혈구연층 혈액 샘플 중의 세포 표면 마커 명칭 CD34+및/또는 HLA-DR-및/또는 CD38-및/또는 CD117 및/또는 AC133 및/또는 CD90 및/또는 CD45low를 갖는 세포의 상대적인 수를 증가시키는 방법.
  66. 세포 집단 중의 정상 분화 세포의 비율을 변위시키기에 효과적인 역분화 수단을 세포 집단 중의 하나 이상의 미분화 세포와 접촉시켜, 하나 이상의 분화 세포를 미분화 세포로 역분화시킴을 포함하여, 미분화 세포를 제조하는 방법.
  67. 세포 집단 중의 정상 분화 세포의 비율을 변위시켜, 하나 이상의 분화 세포를 미분화 세포로 역분화시키는 역분화 수단의 용도.
  68. 세포 집단 중의 분화 세포를 미분화 세포로 역분화시킴을 포함하여, 미분화 세포를 제조하는 방법으로서, 하나 이상의 분화 세포를 포함한 세포 집단을 포함하는 환경을 제1 환경으로부터 제1 환경보다 자유 이온 농도가 하나 이상의 분화 세포를 미분화 세포로 역분화시키기에 효과적으로 변화된 제2 환경으로 변화시키는 방법.
  69. 세포 집단 중의 하나 이상의 분화 세포를 정상 분화 세포의 비율을 대체하기에 효과적인 역분화 수단과 접촉시키고, 이온 자유화 또는 이온 봉쇄된 제1 환경내에서 세포 집단을 배양하고, 제1 환경을 제1 환경보다 존재하는 이온 농도가 하나이상의 분화 세포를 미분화 세포로 역분화시키기에 효과적으로 변화된 제2 환경으로 변화시킴을 포함하여, 미분화 세포를 제조하는 방법.
  70. 제66항, 제67항 및 제69항 중의 어느 한 항에 있어서, 역분화 수단이 세포 집단내 음성 선택을 유도하여, 세포 집단 중의 정상 분화 세포의 비율을 파괴하는 수단인 방법 또는 용도.
  71. 제66항, 제67항, 제69 및 제70항 중의 어느 한 항에 있어서, 역분화 수단이 항체, 세포 밀도에 따라 세포를 분리하는데 사용되는 밀도 구배 배지 또는 적혈구 세포의 침강을 유발하는 물질 중의 하나 이상인 방법 또는 용도.
  72. 제68항 또는 제69항에 있어서, 제2 환경의 자유 이온 농도가 제1 환경의 자유 이온 농도보다 증가되는 방법.
  73. 제68항, 제69항 및 제72항 중의 어느 한 항에 있어서, 제2 환경의 상대 자유 이온 농도가 제1 환경의 상대 자유 이온 농도보다 증가되는 방법.
  74. 제68항, 제69항, 제72항 및 제73항 중의 어느 한 항에 있어서, 자유 이온이 음이온인 방법.
  75. 제68항, 제69항 및 제72항 내지 제74항 중의 어느 한 항에 있어서, 자유 이온이 I족 금속 또는 II족 금속인 방법.
  76. 제68항, 제69항 및 제72항 내지 제75항 중의 어느 한 항에 있어서, 자유 이온이 칼슘 이온 및/또는 망간 이온인 방법.
  77. 제68항, 제69항 및 제72항 내지 제76항 중의 어느 한 항에 있어서, 환경의 자유 이온 농도를 상대적으로 변화시킬 수 있는 제제로 제1 환경을 처리하여, 제2 환경을 초래함으로써, 환경의 자유 이온 농도를 변화시키는 방법.
  78. 제77항에 있어서, 제1 환경을 하나 이상의 이온 봉쇄제로 처리하고, 후속적으로 이를 제거하거나 농도를 감소시킴으로써, 자유 이온 농도가 상대적으로 증가된 제2 환경을 초래하여, 세포 집단 중의 하나 이상의 분화 세포를 역분화시키는 방법.
  79. 제68항, 제69항 및 제72항 내지 제78항 중의 어느 한 항에 있어서, 제1 환경을 하나 이상의 이온 봉쇄제로 처리하고, 후속적으로 세포 집단을 제1 환경보다 자유 이온 농도가 증가된 제2 환경으로 전이시켜, 세포 집단 중의 하나 이상의 분화 세포를 역분화시키는 방법.
  80. 제68항, 제69항 및 제72항 내지 제78항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포 집단을 자유 이온 농도가 낮거나 자유 이온을 함유하지 않는 제1 환경에서 배양하고, 세포 집단을, 제1 환경보다 높은 농도의 자유 이온을 포함하는 제2 환경으로 전이시키거나 제1 환경보다 높은 농도의 자유 이온을 포함하는 제2 환경이 되도록 제1 환경을 조절하여, 세포 집단 중의 하나 이상의 분화 세포를 역분화시키는 방법.
  81. 제78항 또는 제79항에 있어서, 봉쇄제가 자유 이온 킬레이트제인 방법.
  82. 제78항, 제79항 및 제81항 중의 어느 한 항에 있어서, 봉쇄제가 아민 및 카복실 그룹 둘 다를 포함하는 방법.
  83. 제78항, 제79항, 제81항 및 제82항 중의 어느 한 항에 있어서, 봉쇄제가 다수의 -N(CH2CO2H)n(여기서, n은 1 또는 2이다) 그룹을 포함하는 방법.
  84. 제78항, 제79항 및 제81항 내지 제83항 중의 어느 한 항에 있어서, 봉쇄제가 1종 이상의 EDTA, 헤파린, EGTA, DTPA, 시트르산삼나트륨 및 다른 유사 킬레이트제 및/또는 항응고제로부터 선택될 수 있는 방법.
  85. 제78항, 제79항 및 제81항 내지 제84항 중의 어느 한 항에 있어서, 봉쇄제가충분히 고농도로 첨가되어, 봉쇄제 존재의 제거시 역분화가 유발되는 방법.
  86. 제85항에 있어서, 봉쇄제 존재의 제거시 역분화를 유발하기에 충분한 봉쇄제의 농도가 약 2mM 이상인 방법.
  87. 제66항 내지 제86항 중의 어느 한 항에 있어서, 보다 분화된 세포가 비-암세포인 방법.
  88. 제66항 내지 제87항 중의 어느 한 항에 있어서, 보다 분화된 세포가 수임 조혈 세포인 방법.
  89. 제66항 내지 제88항 중의 어느 한 항에 있어서, 보다 분화된 세포가 CFC-T 세포, CFC-B 세포, CFC-에오신 세포, CFC-Bas 세포, CFC-GM 세포, CFC-MEG 세포, CFC-E 세포, T 세포 및 B 세포로부터 선택되는 방법.
  90. 제66항 내지 제89항 중의 어느 한 항에 있어서, 미분화 세포가 다능성 줄기 세포인 방법.
  91. 제66항 내지 제90항 중의 어느 한 항에 있어서, 미분화 세포가 조혈 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 상피 줄기 세포, 간엽 줄기 세포, 내배엽 줄기 세포 및 배아줄기 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 줄기 세포인 방법.
  92. 제66항 내지 제91항 중의 어느 한 항에 있어서, 미분화 세포가 하나 이상의 세포 표면 마커 명칭: CD34+, HLA-DR-, CD38-, CD117, AC133, CD90 및/또는 CD45low를 특징으로 하는 방법.
  93. 제66항 내지 제92항 중의 어느 한 항에 있어서, 미분화 세포가 MHC I+부류 및/또는 MHC II+부류 세포인 방법.
  94. 제66항 내지 제93항 중의 어느 한 항에 있어서, 수임 세포를 포함한 세포 집단이 백혈구연층 혈액 샘플이거나 백혈구연층 혈액 샘플로부터 유래되는 방법.
  95. 세포 집단 중의 분화 세포를 미분화 세포로 역분화시킴을 포함하여, 미분화 세포를 제조하는 방법으로서, 하나 이상의 분화 세포를 포함하는 세포 집단을 포함하는 환경을, 칼륨 또는 마그네슘 자유 이온을 함유하지 않거나 이의 농도가 낮은 제1 환경으로부터 칼슘 또는 마그네슘 자유 이온을 포함하거나 제1 환경보다 고농도의 칼슘 또는 마그네슘 자유 이온을 포함하는 제2 환경으로 변화시켜, 세포 집단 중의 하나 이상의 분화 세포를 역분화시키는 방법.
  96. 세포 집단 중의 분화 조혈 세포를 미분화 세포로 역분화시킴을 포함하여, 미분화 세포를 제조하는 방법으로서, 하나 이상의 분화 조혈 세포를 포함하는 세포 집단을 포함하는 환경을 제1 환경으로부터 제1 환경보다 자유 이온 농도가 효과적으로 변화되는 제2 환경으로 변화시켜, 세포 집단 중의 하나 이상의 분화 조혈 세포를 미분화 세포로 역분화시키는 방법.
  97. 세포 집단 중의 분화 세포를 미분화 세포로 역분화시킴을 포함하여, 미분화 세포를 제조하는 방법으로서, 세포 집단을 포함하는 환경의 자유 이온 농도를 상대적으로 변화시킬 수 있는 제제로 제1 환경을 처리하여 제2 환경을 초래함으로써, 세포 집단을 포함하는 환경을 변화시키는 방법.
KR1020027015131A 2000-05-10 2001-05-10 수임 세포를 포함한 세포 집단에서 미분화 세포의 상대적인 수를 증가시키기 위한 장치 KR100875089B1 (ko)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/568,254 US9068164B1 (en) 1995-02-02 2000-05-10 Method of preparing an undifferentiated cell
US09/568,254 2000-05-10
GB0101315.0 2001-01-18
GB0101315A GB0101315D0 (en) 2001-01-18 2001-01-18 A device
US27149701P 2001-02-26 2001-02-26
US60/271,497 2001-02-26
GB0107093A GB0107093D0 (en) 2001-03-21 2001-03-21 A device
GB0107093.7 2001-03-21
PCT/GB2001/002056 WO2001085917A2 (en) 2000-05-10 2001-05-10 A device

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020077023304A Division KR100967071B1 (ko) 2000-05-10 2001-05-10 보다 수임된 세포로부터 미분화 세포를 형성시키기 위한장치 및 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20030034069A true KR20030034069A (ko) 2003-05-01
KR100875089B1 KR100875089B1 (ko) 2008-12-22

Family

ID=27447916

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020027015131A KR100875089B1 (ko) 2000-05-10 2001-05-10 수임 세포를 포함한 세포 집단에서 미분화 세포의 상대적인 수를 증가시키기 위한 장치
KR1020077023304A KR100967071B1 (ko) 2000-05-10 2001-05-10 보다 수임된 세포로부터 미분화 세포를 형성시키기 위한장치 및 방법

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020077023304A KR100967071B1 (ko) 2000-05-10 2001-05-10 보다 수임된 세포로부터 미분화 세포를 형성시키기 위한장치 및 방법

Country Status (27)

Country Link
US (1) US8163536B2 (ko)
EP (1) EP1366144B1 (ko)
JP (2) JP4860883B2 (ko)
KR (2) KR100875089B1 (ko)
AR (1) AR030280A1 (ko)
AT (1) ATE440944T1 (ko)
AU (1) AU5647701A (ko)
BE (1) BE1014172A3 (ko)
BR (2) BRPI0110751B1 (ko)
CA (2) CA2776904A1 (ko)
CH (1) CH696146B9 (ko)
CY (1) CY1109515T1 (ko)
DE (1) DE60139716D1 (ko)
DK (1) DK1366144T3 (ko)
ES (2) ES2190727B1 (ko)
FR (1) FR2808800B1 (ko)
GB (2) GB2366295B (ko)
HK (2) HK1044172A1 (ko)
IL (2) IL152737A0 (ko)
IT (1) ITMI20010952A1 (ko)
JO (1) JO2295B1 (ko)
MA (1) MA25677A1 (ko)
MX (1) MXPA02012295A (ko)
NL (1) NL1017973C2 (ko)
NZ (2) NZ556592A (ko)
SA (1) SA01220163B1 (ko)
WO (1) WO2001085917A2 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200056390A (ko) * 2017-08-22 2020-05-22 이덱스 헬스 앤 사이언스 엘엘씨 바이오 프로세스 및 기타 프로세스를 위한 장치 및 방법

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6946246B1 (en) * 1997-04-08 2005-09-20 The United States Of America As Represented By The Administrator Of The National Aeronautics And Space Administration Production of functional proteins: balance of shear stress and gravity
US7565647B2 (en) * 2002-03-22 2009-07-21 Sun Microsystems, Inc. Markup compiler that outputs MIDlets
TWI288779B (en) * 2002-03-28 2007-10-21 Blasticon Biotech Forschung Dedifferentiated, programmable stem cells of monocytic origin, and their production and use
DE10231655A1 (de) * 2002-07-12 2004-02-26 Blasticon Biotechnologische Forschung Gmbh Transplantat-Akzeptanz induzierende Zellen monozytären Ursprungs, sowie deren Herstellung und Verwendung
WO2004011049A1 (ja) * 2002-07-25 2004-02-05 Japan Science And Technology Agency 生体組織材料を処理する交互浸漬装置および交互浸漬方法
KR20060040671A (ko) * 2003-07-11 2006-05-10 블라스티콘 바이오테크놀로지셰 포르슝 게엠베하 단구성 기원의 자기 유래 자가 관용성 유도 세포 및약제학적 제제에 있어서의 이의 용도
GB0410130D0 (en) * 2004-05-06 2004-06-09 Molmed Spa Cell preparation
US7259011B2 (en) * 2004-05-20 2007-08-21 Paul Lucas Pluripotent adult stem cells
US7909806B2 (en) * 2004-09-23 2011-03-22 Anthrogenesis Corporation Cord blood and placenta collection kit
US7147626B2 (en) * 2004-09-23 2006-12-12 Celgene Corporation Cord blood and placenta collection kit
EP3354723B1 (en) 2005-08-29 2023-12-13 Technion Research & Development Foundation Ltd. Media for culturing stem cells
DK1993575T3 (da) 2006-03-07 2019-10-14 Geeta Shroff Sammensætninger omfattende humane embryostamceller og derivater deraf, fremgangsmåder til anvendelse og fremgangsmåder til fremstilling
DK3441459T3 (da) 2006-08-02 2021-06-07 Technion Res & Dev Foundation Fremgangsmåder til ekspansion af embryonale stamceller i en suspensionskultur
AR065584A1 (es) * 2007-03-01 2009-06-17 Cryo Cell Internat Inc Obtencion aislamiento y crioconservacion de celulas endometriales / menstruales
GB0917565D0 (en) * 2009-10-08 2009-11-25 Univ Nottingham An observation cell arrangement
GB2474492B (en) * 2009-10-19 2014-05-21 Tristem Trading Cyprus Ltd Treatment using reprogrammed mature adult cells
EP4166652A1 (en) 2009-11-12 2023-04-19 Technion Research & Development Foundation Ltd. Culture media, cell cultures and methods of culturing pluripotent stem cells in an undifferentiated state
EP2639294A1 (fr) * 2012-03-15 2013-09-18 CellProthera Automate et procédé automatisé de culture cellulaire
SG11201603166UA (en) 2013-10-24 2016-05-30 Ospedale San Raffaele Srl Method
WO2016183231A1 (en) 2015-05-12 2016-11-17 Baker Group, LLP Method and system for a bioartificial organ
CA3025057A1 (en) 2016-05-25 2017-11-30 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Methods and compositions for treating cancers
US11679148B2 (en) 2017-11-24 2023-06-20 Institut National De La Santé Et De La Recherche Médicale (Inserm) Methods and compositions for treating cancers
CN108889357A (zh) * 2018-05-10 2018-11-27 刘英文 一种检验科样品临时存储装置
US20210236633A1 (en) 2018-08-06 2021-08-05 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating cancers
CN111560345A (zh) * 2019-05-10 2020-08-21 华中科技大学同济医学院附属协和医院 一种猪原代瓣膜内皮细胞分离纯化方法
WO2022207889A1 (en) 2021-04-01 2022-10-06 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Liver organoid manufacturing methods, liver organoids obtained with the same, and uses thereof

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4058367A (en) * 1976-05-19 1977-11-15 Gilford Instrument Laboratories Inc. Automatic asynchronous fluid processing apparatus
US4563907A (en) * 1983-10-31 1986-01-14 Micromedic Systems Inc. Direct reading automatic pipette
US4812314A (en) * 1986-02-24 1989-03-14 Yissum Research & Dev. Co. Of The Hebrew Univ. Of Jerusalem And Hadassah Medical Organization Lipid replacement therapy
JPS63196854A (ja) * 1987-02-10 1988-08-15 Toa Medical Electronics Co Ltd リンパ球亜群の測定方法およびその装置
US5004681B1 (en) 1987-11-12 2000-04-11 Biocyte Corp Preservation of fetal and neonatal hematopoietic stem and progenitor cells of the blood
US5399493A (en) * 1989-06-15 1995-03-21 The Regents Of The University Of Michigan Methods and compositions for the optimization of human hematopoietic progenitor cell cultures
US5763266A (en) * 1989-06-15 1998-06-09 The Regents Of The University Of Michigan Methods, compositions and devices for maintaining and growing human stem and/or hematopoietics cells
US5635387A (en) * 1990-04-23 1997-06-03 Cellpro, Inc. Methods and device for culturing human hematopoietic cells and their precursors
WO1993016384A1 (en) * 1992-02-07 1993-08-19 Abbott Laboratories Method for accurately enumerating and sensitively qualifying heterogeneous cell populations in cytolytic processing conditions
AU685743B2 (en) * 1992-03-04 1998-01-29 Regents Of The University Of Michigan, The Methods, compositions and devices for maintaining and growing human stem and/or hematopoietic cells
WO1996002255A1 (fr) * 1994-07-15 1996-02-01 Taiyo Kagaku Co., Ltd. Composition medicamenteuse contenant un derive d'acide sialique
US5843780A (en) 1995-01-20 1998-12-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Primate embryonic stem cells
AU704236B2 (en) * 1995-02-02 1999-04-15 Stichting Centraal Laboratorium Van De Bloedtransfusiedienst Van Het Nederlandse Rode Kruis Enrichment of hematopoietic stem cells from blood or bone marrow
GB2297558B (en) * 1995-02-02 1997-01-08 Ilham Mohamed Sale Abuljadayel Conversion of a more committed cell to an undifferentiated cell
GB9502022D0 (en) * 1995-02-02 1995-03-22 Abuljadayel Ilham M S A method for preparing lymphohaematopoietic progenitor cells
US5627070A (en) * 1995-07-26 1997-05-06 Celltherapy, Inc. Cell growing device for in vitro cell population expansion
US5902732A (en) * 1995-10-04 1999-05-11 Cytoscan Sciences Llc Drug screening process measuring changes in cell volume
US6227202B1 (en) * 1996-09-03 2001-05-08 Maulana Azad Medical College Method of organogenesis and tissue regeneration/repair using surgical techniques
EA001551B1 (ru) * 1996-11-11 2001-04-23 Бык Гюльден Ломберг Хемише Фабрик Гмбх Бензонафтиридины в качестве бронхиальных терапевтических средств
AU6691798A (en) * 1997-03-07 1998-09-22 Metabasis Therapeutics, Inc. Novel indole and azaindole inhibitors of fructose-1,6-bisphosphatase
FR2771421B1 (fr) * 1997-11-27 2001-05-04 Bertin & Cie Dispositif d'amplification de cellules hematopoietiques et ses applications
AU770896C (en) * 1998-09-29 2006-09-07 Gamida Cell Ltd. Methods of controlling proliferation and differentiation of stem and progenitor cells
IL137757A0 (en) * 1998-02-17 2001-10-31 Gamida Cell Ltd Method of controlling proliferation and differentiation of stem and progenitor cells
ES2338405T3 (es) * 1999-02-04 2010-05-07 Pluristem Ltd. Metodo y aparato para mantenimiento y expasion de celulas madre hemopoyeticas y/o celulas progenitoras.
JP2002537851A (ja) * 1999-03-09 2002-11-12 アコルディス インダストリアル ファイバース ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 作用物質のインビトロテスト法、その装置および使用
FR2794130B1 (fr) * 1999-05-26 2003-01-03 Bertin Technologies Sa Procede et dispositif de culture de cellules a applications multiples
IL147669A0 (en) * 1999-07-29 2002-08-14 Baranowitz Steven Method for transdifferentiation of body tissues
US6624621B2 (en) * 2000-04-03 2003-09-23 Howard L. North, Jr. Particle counter volume sensor

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200056390A (ko) * 2017-08-22 2020-05-22 이덱스 헬스 앤 사이언스 엘엘씨 바이오 프로세스 및 기타 프로세스를 위한 장치 및 방법

Also Published As

Publication number Publication date
KR100875089B1 (ko) 2008-12-22
HK1044172A1 (zh) 2002-10-11
ITMI20010952A1 (it) 2002-11-10
GB0215519D0 (en) 2002-08-14
CA2446955C (en) 2012-07-17
IL152737A (en) 2010-11-30
CA2446955A1 (en) 2001-11-15
WO2001085917A2 (en) 2001-11-15
EP1366144B1 (en) 2009-08-26
KR20070103522A (ko) 2007-10-23
JO2295B1 (en) 2005-09-12
ES2190727A1 (es) 2003-08-01
JP2004515211A (ja) 2004-05-27
GB0111488D0 (en) 2001-07-04
ITMI20010952A0 (it) 2001-05-10
FR2808800A1 (fr) 2001-11-16
NL1017973C2 (nl) 2002-11-08
NZ556592A (en) 2011-03-31
CH696146A5 (fr) 2007-01-15
NZ540481A (en) 2009-02-28
AU5647701A (en) 2001-11-20
NL1017973A1 (nl) 2001-11-13
MA25677A1 (fr) 2003-04-01
JP2011155984A (ja) 2011-08-18
SA01220163B1 (ar) 2007-04-24
BE1014172A3 (fr) 2003-06-03
DK1366144T3 (da) 2009-12-21
ES2190727B1 (es) 2004-09-01
KR100967071B1 (ko) 2010-07-01
MXPA02012295A (es) 2004-08-12
CH696146B9 (fr) 2009-06-15
BRPI0110751B1 (pt) 2019-10-01
EP1366144A2 (en) 2003-12-03
GB2366295A (en) 2002-03-06
GB2375351A (en) 2002-11-13
FR2808800B1 (fr) 2007-07-06
ATE440944T1 (de) 2009-09-15
US8163536B2 (en) 2012-04-24
US20030064503A1 (en) 2003-04-03
IL152737A0 (en) 2003-07-06
HK1091860A1 (en) 2007-01-26
ES2330190T3 (es) 2009-12-07
AR030280A1 (es) 2003-08-20
WO2001085917A3 (en) 2003-10-09
CA2776904A1 (en) 2001-11-15
BR0110751A (pt) 2004-04-06
GB2375351B (en) 2003-11-26
CY1109515T1 (el) 2014-08-13
GB2366295B (en) 2003-09-10
DE60139716D1 (de) 2009-10-08
JP4860883B2 (ja) 2012-01-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100875089B1 (ko) 수임 세포를 포함한 세포 집단에서 미분화 세포의 상대적인 수를 증가시키기 위한 장치
US20110143431A1 (en) Method Of Preparing An Undifferentiated Cell
US7410773B2 (en) Method of preparing an undifferentiated cell
US9068164B1 (en) Method of preparing an undifferentiated cell
CN100390264C (zh) 一种设备
AU2006203449B2 (en) A Device
AU7243100A (en) A method of preparing an undifferentiated cell
AU2005201200B2 (en) A Method of Preparing an Undifferentiated Cell
GB2297558A (en) Conversion of a more committed cell into an undifferentiated cell
AU751866B2 (en) A method of preparing an undifferentiated cell
BR122012019753B1 (pt) processo de retrodiferenciação de células comprometidas
AU751928B2 (en) A method of preparing an undifferentiated cell

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
A107 Divisional application of patent
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20121129

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20131129

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20141128

Year of fee payment: 7

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20150930

Year of fee payment: 8

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20161125

Year of fee payment: 9

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170929

Year of fee payment: 10

LAPS Lapse due to unpaid annual fee