JP2002537851A

JP2002537851A - 作用物質のインビトロテスト法、その装置および使用

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Publication number: JP2002537851A
Application number: JP2000603418A
Authority: JP
Inventors: グレックナーヘルマ; レムケホルスト−ディーター; マイヤークリストフ
Original assignee: アコルディスインダストリアルファイバースゲゼルシャフトミットベシュレンクテルハフツング
Priority date: 1999-03-09
Filing date: 2000-03-08
Publication date: 2002-11-12
Also published as: WO2000053797A1; EP1159443A1

Abstract

(57)【要約】少なくとも、内部室および内壁を有し、かつ内部室中に設けられた第１および第２膜システムを有し、膜システムおよび内部室の内壁の間に細胞培養室が構成されている細胞培養容器を準備する工程、細胞培養室中に細胞培養物として細胞を、および細胞培養培地を装入する工程、第１の膜システムを用いて細胞培養室中に液体栄養培地を供給しかつ細胞培養室から代謝生成物を取りだす工程、第２の膜システムを用いて細胞培養室中に少なくとも１種のガス状媒体を供給する工程、細胞培養室中に少なくとも１種の作用物質を計量供給し、この計量供給を所定の作用物質濃度−時間−推移に従って行う工程、および細胞生存率を監視する工程を包含する細胞への作用物質のインビトロテスト法。更に装置、および白血病セルラインＣＣＲＦＣＥＭに対するイダルビシンの作用をテストするための前記装置の使用。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明はインビトロでの細胞への作用物質をテストするための方法、その装置
およびその使用に関する。

【０００２】作用物質、例えばガンの化学療法で使用される細胞増殖抑制剤のテストは様々
な理由で必要である。その際、完全に新規な作用物質であるかどうか、またはそ
の効果がすでに基本的に公知である作用物質であるかどうかを、識別しなければ
ならない。未知の作用物質においては先ず、例えば作用物質スクリーニングの範
囲において基本的な作用効果、投与量および最適な投与形、例えば経口または静
脈内等を調べなければならない。すでに公知の作用物質に関しては、例えば可能
な治療戦略を試験し、相互に比較する。その他の重要な問題点は、患者に特異的
なテストもしくは個々の患者における物質の患者特異的な作用効果である。これ
らの問題点の全てに関して異なるモデルシステムが提供されている。

【０００３】未知の物質作用の物質スクリーニングにおいては倫理上の理由から例外なく、
患者で実施するのではなく、動物モデルでインビボでもしくはセルラインでイン
ビトロで実施される。未知の細胞増殖抑制剤のスクリーニングのための動物モデ
ルは、ＷＯ９４／２５０７４およびＵＳ５６７６９２４に記載されているように
、受容動物処理のためにヒト腫瘍細胞試料を中空糸装置中にカプセル化し、受容
動物中に移植する、ということを基礎としている。しかしながら、動物モデルは
その性質から自動化することが困難であり、煩雑さと、高い費用と結びついてい
るので、このような方法はその限界を有する。更に、動物保護の考えが動物モデ
ルでのテストをますます困難なものにしている。

【０００４】多くの場合、齧歯類である実験動物でのテスト結果のヒトへの転用可能性には
問題がある。この際、ヒトと動物種との間の代謝の差が著しく重要であり、この
差は動物モデルにおいて異なる薬物動力学に導く。本発明の範囲において薬物動
力学とは、作用物質が異なる動力学で生物中に吸収、すなわち取り込み、分配、
代謝され、すなわち変換し、かつ再び分泌される、動的な工程であると理解され
る。この工程は時間的に重なりかつ相互依存して経過するので、この工程はイン
ビボにおいては相互に独立して定量されることはない。従って、文献（Konpendi
um Internistische Onkologie, 著者：H.J.Schmoll, K.Hoeffgen, K.Possinger,
Springer Verlag社、1996）中には擬制の体腔もしくはコンパートメント中での
薬剤の分配を記載する数学的モデルが使用されている。その際、作用物質の特性
および代謝と共に、特に投与剤形が物質の薬物動力学に作用する。作用物質の薬
物動力学は、インビボに通常使用される方法で、時間に関連づけて血清濃度を測
定することにより調べられる。

【０００５】物質のテストのためのインビトロモデルの使用も汎用されている。その際、高
い試料装入量を達成するためには、ヒト初代細胞を単層培養物に培養することが
患者特異的な試験に有利である。このような方法は、文献（例えば、G.J.L.Kasp
ers et al., Blood (1997), Band 90, No.7, ｐ2723-29およびR. Pieters, Bloo
d (1990), Band 76, No.11, ｐ76，2327-36）中に記載されている。公知のイン
ビトロ法の欠点は、そこで使用するマイクロタイタープレートが細胞の三次元で
の増殖を許容しないということである。固形腫瘍は、多分ｐＨ値および栄養素供
給における傾斜により、例えば異なる亜集団（subpopulation）に成長する。こ
の傾斜は細胞生存率、代謝および細胞増殖抑制剤での処置に対する感度の領域的
な変化を惹起する。三次元的な、組織類似の構造の悪性細胞は、細胞増殖抑制剤
に対して単層培養物とは異なる挙動を示し、このことは文献（J.J.Casciari et
al., J. Natl. Cancer Inst. (1994), Band 86, p1846-52およびK.M. Nicholson
et al., Ann. Oncology(1996), Band 7, Suppliment 1, Abstract）から明らか
である。

【０００６】公知インビトロ法の更なる欠点は、ヒト有機体中で経過する薬物動力学は現在
までインビトロにおいては実現化することはできない、ということである、すな
わち相当するインビトロ薬物動力学によりモデル化することはできない。しかし
ながら、本発明の範囲においてはインビトロ薬物動力学に関して記載されている
。そこでは、作用物質濃度が、標的細胞のインビボ環境におけると同様に、例え
ば白血病における血清中と同様に、この標的をどのような手段で達成するかに無
関係に、インビトロにおいて時間に関連して変化すると理解されるべきである。
この際、第１の判断基準は作用物質濃度の曲線または絶対値であり、インビボ状
況に対して時間軸は圧縮されていてもまたは引き延ばされていてもよい。

【０００７】今日公知の作用物質テストのための全てのインビトロ法の第３の欠点は、組合
せ治療を模倣することができないことである。このことは決定的なことである、
それというのも今日化学療法単独での、すなわち単独治療での処置は例外であり
、多くの治療は、異なる細胞増殖抑制剤を時間的に順次適用する組合せ治療であ
り、このことはハンドブック（Konpendium Internistische Onkologie, 著者：H
.J.Schmoll, K.Hoeffgen, K.Possinger, Springer Verlag社、1996）からも明ら
かであるためである。インビトロにおける標準法においては、生物におけるよう
に、一度アッセイ中に導入した作用物質を、次の作用物質を投与する前に、再び
取り去ることは、従来できなかった。

【０００８】前記の３つ全ての欠点は、化学療法に対する実際の腫瘍の挙動を現在インビト
ロにおいて良好にシミュレーションすることができないということに導く。この
ことは、細胞への作用物質のテストのための従来公知のインビトロ法の予測した
値に対する疑問が専門分野において増大することに導く。

【０００９】こうして、前記欠点を少なくとも著しく減少させる、細胞への作用物質のイン
ビトロテスト法、前記方法のために使用することのできる装置に対する需要があ
る。

【００１０】従って、本発明の課題は前記欠点を少なくとも著しく減少させ、かつ特にイン
ビボ薬物動力学への相当するインビトロ薬物動力学の近似を可能にし、異なる作
用物質との組合せ治療を模倣することのできる、細胞への作用物質のインビトロ
テスト法、前記方法のために使用することのできる装置を提供することである。

【００１１】この課題は、少なくとも次の工程：ａ）内部室および内壁を有し、かつ内部室中に設けられた第１および第２膜シス
テムを有し、膜システムおよび内部室の内壁の間に細胞培養室が構成されている
細胞培養容器を準備し、ｂ）細胞培養室中に細胞培養物として細胞を、および細胞培養培地を装入し、ｃ）第１の膜システムを用いて細胞培養室中に液体栄養培地を供給しかつ細胞培
養室から代謝生成物を取りだし、ｄ）第２の膜システムを用いて細胞培養室中に少なくとも１種のガス状媒体を供
給し、ｅ）細胞培養室中に少なくとも１種の作用物質を計量供給し、この計量供給を所
定の作用物質濃度−時間−推移に従って行い、かつｆ）細胞生存率を監視する、を包含する、細胞への作用物質のインビトロテスト法により解決する。

【００１２】テストすべき作用物質とは、本発明の範囲においては検査すべき細胞に対する
作用がテストの前に公知ではないかもしくは十分に知られていない物質であると
理解すべきである。この際、ガス状の作用物質、例えば呼吸毒またはその他の場
合により毒性に作用するガスであってもよい。前記の定義された物質には有利に
細胞増殖抑制剤、抗生物質、サイトカイン、成長因子または抗ウィルス剤を使用
する。更に、これらの物質を溶かした形で細胞培養室中に導入することができる
のであれば、基本的に前記の全ての物質を細胞に対する作用に関してテストする
ことができる。

【００１３】本発明による方法において、有利には初代細胞からまたはセルラインからなる
細胞培養物をテストすることができ、この際特に腫瘍セルラインを使用するのが
有利である。細胞培養室の容積が少なくとも０.３ｍｌで、最高で２.０ｍｌであ
り、特に有利には０.５ｍｌ〜１.５ｍｌである。これにより、非常に僅かな量の
細胞材料を使用するので、例えばガン患者から本発明方法のために非常に僅かな
量の細胞を採取すればよい。

【００１４】細胞培養容器の内部室中に存在する第１の膜システムは液体栄養培地の供給の
ために好適である、少なくとも１つの半透過性膜からなっており、すなわちこの
膜壁を介して連続的な物質輸送が拡散性または対流性輸送機構により可能となる
。必要により、すなわち栄養培地の拡散性または対流性輸送が必要であるかどう
かにより、ナノ濾過膜、限外濾過膜またはマイクロ濾過膜を使用する。例えば、
透析膜、例えばCuprophan^（Ｒ）または親水性微孔性膜、例えば微孔性ポリエー
テルスルホン−膜を使用する。細胞培養容器の内部室中に存在する第２の膜シス
テムは少なくとも１つのガス移送膜、特に例えばOxyphan^（Ｒ）として市販され
ている酸素化膜からなる。第１および第２の膜システムの膜は有利に中空繊維膜
である。

【００１５】本発明方法の有利な実施形においては、第１および第２の膜システムが内部室
中で複数の位置で層状に重なり合っている中空繊維からなる、細胞培養容器を使
用する。

【００１６】細胞培養物の装入は本発明による方法の有利な実施形においては、蓋を有する
細胞培養容器を使用し、細胞培養培地中の細胞密度を調節し、細胞培養容器の蓋
を開け、細胞培養容器の内部室中に所望の容積の細胞懸濁液をピペットで計量し
て装入し、かつ細胞培養容器を蓋で閉めることにより行われる。

【００１７】本発明方法の更に有利な実施形においては、細胞培養物の装入を内部室の側壁
中の開口部を介して行うことができ、この開口部は例えば細胞培養器の外側に存
在する接続部を注射器または同様な装置のために有している。

【００１８】本発明方法の第３の有利な実施形においては、細胞培養物の装入を細胞培養容
器の内部室中への出入が可能である少なくとも１つの隔壁（Septum）を介して行
うこともできる。

【００１９】細胞は懸濁細胞としてまたは付着必要性の細胞として存在していてよく、この
際懸濁細胞は一般に血液から由来する細胞であり、付着必要性の細胞は一般に体
組織に由来する細胞である。後者の細胞は分割していない組織片として直接細胞
培養器の内部室中に装入するか、またはこの組織片を最初に個別にし、その後懸
濁細胞と同様にして装入する。有利には付着必要性細胞のためには細胞培養室の
内部室に細胞が優先して付着する表面を装備する。この表面がタンパク質被覆ポ
リカーボネートからなるか、または付加的に細胞培養容器の内部室中に導入した
ポリエステルからなる繊維材料からなるのが有利である。

【００２０】本発明方法の実施形においては、細胞培養室は細胞培養室ｍｌ当たり少なくと
も細胞１×１０^５、特に好適には細胞培養室ｍｌ当たり少なくとも細胞１×１０ ^６を有する。特に有利な実施形においては細胞培養室中の細胞密度は細胞培養室
ｍｌ当たり細胞５×１０^７より大である。本発明方法の有利な実施形においては
、懸濁細胞を細胞培養室ｍｌ当たり少なくとも細胞１×１０^５の細胞密度で使用
する。このことにより、血中における細胞密度に近似することが可能である。付
着必要性細胞の使用の際にも、相応する細胞増殖後に体組織の細胞密度に近似さ
せるために、本発明方法を細胞培養室ｍｌ当たり少なくとも細胞１×１０^５の細
胞密度で使用するのが有利である。

【００２１】全ての細胞が第１および第２の膜システムのそれぞれ最も近い膜に対して０μ
ｍ〜６００μｍの平均間隔を有するのが有利である。これにより、細胞に均質に
栄養培地およびガスが供給される。同時に、代謝生成物が均質に再び導出され、
こうして全体として、インビボの環境に近似した状態が細胞培養物中でシミュレ
ーションされる。

【００２２】液体培地としてもしくは細胞培養培地として、通常栄養素を細胞に供給するた
めにもしくは細胞を培養するために使用される培地を使用することができる。有
利にはＲＰＭＩ１６４０を使用する。本発明方法の特に有利な実施形において
は、ＲＰＭＩ１６４０およびウシ胎仔血清を含有する栄養培地を使用する。

【００２３】ガス状媒体として、酸素分圧ｐＯ_２０〜１６０ｍｍＨｇおよび二酸化炭素分
圧ｐＣＯ_２０〜１１５ｍｍＨｇを有する、ガス混合物を使用するのが有利であ
る。本発明方法の有利な実施形においては、細胞培養培地が重炭酸塩緩衝剤を含
有し、供給したガス状媒体中のｐＣＯ_２を細胞培養培地のｐＨ値が６.８〜７.８
の間に存在するように調節する。

【００２４】ガス状媒体の所望の組成は、本発明方法がこの組成により占められている室中
で実施されることにより調節することができる。この場合、ガス状の媒体の供給
は第２の膜システム中に無菌フィルターを介して行われる。

【００２５】第２の膜システムが交流式で作動し、ガス供給管およびガス排出管と結合して
いる場合、この膜システムはガス状の代謝生成物の除去のためにも有利に使用さ
れる。

【００２６】該方法の有利な実施形においては、個々の作用物質および／または複数の作用
物質の組合せを時間をずらせて計量供給する。こうして、例えば個々の作用物質
をある時間にわたって複数の連続する分量に分割して投与するか、または異なる
個々の作用物質を時間をずらせて細胞培養培地に計量供給することができる。同
様にして、作用物質組合せの連続を時間をずらせて計量供給することができ、こ
の際作用物質組合せはその組成を同じに保持するかまたは変化させることができ
る。最後に、本発明の方法においては個々の作用物質も前記のような作用物質組
合せも時間をずらせて計量供給することができる。

【００２７】作用物質供給は直接または第１の膜を介して、もしくはガス状の作用物質であ
る場合第２の膜システムを介して細胞培養室中に行われる。第１の膜システムを
介して作用物質が供給される場合には、作用物質は栄養培地流に取り込まれ、栄
養培地と共に第１の膜システムの膜を介して細胞培養室中に入る。第２の膜シス
テムを介してガス状の作用物質を供給する場合、作用物質はガス状の媒体中に取
り込まれガス状媒体と共に第２の膜システムの膜を介して細胞培養室中に入る。
このことは勿論両方の膜システムの膜がそれぞれの作用物質に関して透過性でな
ければならないことを意味している。第１もしくは第２の膜システムを介しての
作用物質の供給において作用物質濃度−時間−推移は、例えば第１もしくは第２
の膜システムの透過性により、作用物質供給の期間によりおよび作用物質濃度に
より調節することができる。前記の方法は個々の作用物質および／または作用物
質の組合せの最も異なる薬物動力学のシミュレーションも可能にする。例えば、
作用物質供給は持続注入と類似の傾斜状に、または静脈内投与に類似したピーク
の形に行うことができる。

【００２８】作用物質テストの間、細胞培養容器を細胞の培養に好適な温度、有利には３７
℃に保持する。

【００２９】細胞生存率（Vitalitaet）の監視とは、本発明の範囲においては、代謝活性、
増殖、アポトーシスまたは一般的細胞死の監視と理解される。

【００３０】細胞生存率の監視のためには、本発明方法の有利な実施形において細胞生体染
色剤を使用する。特に有利であるのは、アラマルブルー（alamar Blue）^（Ｒ）
である。この物質は栄養培地および第１の膜システムを介して細胞培養室中に供
給することができる。アラマルブルー^（Ｒ）は細胞の膜を介して細胞の内部に侵
入し、そこで代謝により蛍光染料に変換する。従って、そのようにして生じた蛍
光染料は細胞生存率のための尺度として利用することができ、かつ蛍光センサを
用いてオンラインでまたは試料採取した後に培養培地中で検出される。特に有利
であるのは、細胞培養室中で試料を採取する必要がなく、細胞培養室を後にした
液体流中で行うことができることである。その他の利点は、第１の膜システムを
介して細胞生体染色剤を供給することができるだけでなく、再び完全に取り出す
ことができることであり、このことにより染色剤による細胞培養物の妨害が補正
可能であり、かつ可逆性である。

【００３１】本発明方法において、細胞生存率の監視のために細胞の状態に関する情報を提
供する少なくとも１つのセンサを使用することができる。この際、このセンサは
増殖、生存率、アポトーシスまたは一般的な細胞死を測定するための小型化した
センサである。特に蛍光に関するセンサが有利である。

【００３２】本発明による方法においては、工程監視に好適なセンサを使用することができ
る。温度、ｐＨ、酸素の分圧ｐＯ_２、または二酸化炭素の分圧ｐＣＯ_２、グルコ
ースまたは乳酸の監視のためのセンサを使用することが有利である。特に有利な
実施形においては、センサを細胞培養容器の内部室中にマイクロセンサとして組
み込み、これにより細胞培養物へのセンサの妨害的な影響をなくす。更に、１つ
以上の前記センサを細胞培養室中にまたは栄養培地中に使用することもでき、セ
ンサシグナルをオンラインで追跡する。こうして、例えばｐＨ、ｐＯ_２、グルコ
ースおよび乳酸を同時に測定することができる。前記オンラインセンサ法（on-l
ine Sensorik）の代わりに、または加えて、本発明方法中の有利なその他の分析
法はＭＭＴ−アッセイ（Mitochondriale Reduktion von Tetrazoliumfarbstoff
）または貫流サイトメトリーのような終点測定法である。

【００３３】更に、この課題は以下の装置により解決する、この装置は内部室を有する細胞
培養培地中の細胞培養物を取り込むために好適な細胞培養容器を包含し、この際
内部室中に少なくとも１つの栄養培地を供給するための第１の手段および少なく
とも１つのガス状媒体を供給するための第２の手段が配置されており、この際こ
れらの手段はそれぞれ供給側および排出側を有し、かつこの際前記手段と内部室
の内壁との間に細胞培養室が構成されており、かつこの際第１の手段はその供給
側で栄養培地計量供給ユニットを介して少なくとも１つの栄養培地容器と流体結
合しており、かつ第２の手段はその供給側でガス計量供給ユニットを介して少な
くとも１つのガス貯蔵容器と流体結合しており、この際この装置は細胞培養室の
容積が最高で５ｍｌ、および少なくとも０.１ｍｌの容積を有すること、該装置
が更に細胞培養室中に少なくとも１つの作用物質を供給するための手段および細
胞培養室中に作用物質濃度−時間−推移を設定するための手段を有することを特
徴とする。

【００３４】本発明による装置の有利な実施形においては第１の手段はその排出側で廃棄物
容器と流体結合をしている。

【００３５】更に有利な実施形においては、第１の手段はその排出側で再循環管を介して少
なくとも１つの栄養培地容器と流体結合している。第１の手段の排出側と廃棄物
容器との間の導管中には、一定の代謝生成物を単離するかまたは検出することの
できる装置が取り付けられていてよい。

【００３６】細胞培養容器の内部室中に存在する第１の手段は有利に液体培地の供給のため
に好適な少なくとも１つの膜からなる。

【００３７】第１の手段の少なくとも１つの膜は有利に半透過性の膜からなり、この膜は液
体栄養培地の供給に好適である。すなわち拡散性または対流性の輸送機構の故に
膜壁を介して連続的な物質輸送を可能にする。必要により、すなわち栄養培地の
拡散性または対流性輸送が必要であるかどうかにより、ナノ濾過膜、限外濾過膜
またはマイクロ濾過膜を使用する。例えば、透析膜、例えばCuprophan^（Ｒ）ま
たは親水性微孔性膜、例えば微孔性ポリエーテルスルホン−膜を使用する。

【００３８】細胞培養容器の内部室中に存在する第２の膜システムは少なくとも１つのガス
交換に好適な膜からなる。

【００３９】第２の手段の少なくとも１つの膜は有利に酸化膜からなり、特に有利に少なく
とも１つのOxyphan^（Ｒ）膜からなる。

【００４０】本発明により、第２の膜はガス貯蔵容器と流体結合している。この際、ガス貯
蔵容器は例えば人口孵化器のガス室からなり、ガス室と第２の膜はガス透過性の
無菌膜を介して接触していてよい。本発明の装置の有利な実施形において第２の
膜はガス超過圧下にある少なくとも１つのガス貯蔵容器と少なくとも１つの計量
供給ユニットを介して流体結合している。これにより、簡単な方法で種々のガス
成分を異なる濃度に調節することができる。

【００４１】本発明による装置の有利な実施形においては、第１および第２の手段の膜は中
空繊維から構成されている。

【００４２】中空繊維が内部室中で複数の位置で層状に重なり合って配置されているのが特
に有利である。

【００４３】更に有利な実施形においては、それぞれの手段を構成する中空繊維の最大間隔
は相互に５０μｍ〜６００μｍである。

【００４４】有利な実施形においては、細胞培養容器は床と蓋を有し、これは内部室を限定
し、相互に相対し、かつ透明な材料からなる。床および蓋の透明性は作用物質テ
ストの間の細胞の顕微鏡観察を可能にする。

【００４５】特に有利な実施形においては、床中に細胞培養容器を３７℃に恒温保持するた
めに好適な加熱システムを、例えば加熱シートの形で、例えば細胞培養物の顕微
鏡での観察のために十分な透明性を可能にする加熱シートの形で組み込まれてい
る。

【００４６】細胞培養室は０.３ｍｌ〜３.０ｍｌの容積であるのが有利である。この小型化
の利点は特に細胞、作用物質、液体培地およびガス媒体の僅かな使用量にある。

【００４７】本発明の装置において作用物質供給のための有利な手段は少なくとも１つの作
用物質貯蔵容器、少なくとも１つの作用物質計量供給ユニットから、および少な
くとも１つの作用物質容器をそれぞれ作用物質計量供給ユニットを介して直接ま
たは第１の手段を介して細胞容器の細胞培養室と結合する導管システムからなる
。

【００４８】本発明の装置の有利な実施形においては細胞培養室中の作用物質−濃度−時間
推移の設定のための手段は第１の手段の膜の透過性にある。

【００４９】有利な実施形においては本発明による装置は細胞生存率の監視のための手段を
包含する。

【００５０】本発明の装置の特に有利な実施形は、細胞生存率の監視のための手段として、
細胞培養物の状態に関する情報を提供するために好適である少なくとも１つのセ
ンサを有する。センサが増殖、生存率、アポトーシスまたは一般的な細胞死を測
定するための小型化センサであるのが有利である。特に有利であるのは蛍光のセ
ンサである。

【００５１】本発明の装置は経過の監視に好適なセンサを有していてよく、この際このセン
サは温度、ｐＨ、酸素の分圧ｐＯ_２、または二酸化炭素の分圧ｐＣＯ_２、グルコ
ースまたは乳酸のためのセンサであり、細胞培養容器の内部室中に設けられてい
る。

【００５２】この際前記センサは個別にまたは組み合わせて細胞培養容器中に設けられてい
てよい。

【００５３】本発明の基礎になっている課題は更に本発明による装置少なくとも２個を有す
るモジューラ式（modulare）作用物質テストシステムにより解決する。

【００５４】モジューラ式作用物質テストシステムは好適な方法でモジューラ式構成に配置
されている本発明による装置６個、２４個または９６個を含有するのが有利であ
る。

【００５５】最後に、本発明の基礎になっている課題は、細胞への作用物質の効果をインビ
トロテストするために本発明による装置または本発明による作用物質テストシス
テムを使用することにより解決する。

【００５６】本発明による装置もしくは本発明によるモジューラ式作用物質テストシステム
は細胞の生存率に対する薬物動力学の影響を調べるために好適である。

【００５７】本発明を以下に図面および実施例につき詳細に説明する。単純化した概略的な
図で示す：図１：本発明による装置のフローチャートである、図２ａ：本発明による装置を有するモジューラ式作用物質テストシステムの断
面図、図２ｂ：本発明による装置を備える段を上下に３段に配置したモジューラ式作
用物質テストシステムの断面図、図３：本発明による装置を６個包含するモジューラ式作用物質テストシステム
の断面図、図４ａ：３つの作用物質濃度−時間−推移を示す分布１〜３、図４ｂ：４つの異なる細胞培養容器中の生存細胞の図、装入（接種物）および
収穫（細胞収穫）。

【００５８】図１は導管１４および栄養培地計量供給ユニット３を介して細胞培養容器１の
内部室２中に含有されている第１の手段の供給側と流体結合している栄養培地容
器４を示す。細胞培養容器１の内部室２中に存在する第１の手段の排出側は導管
１４を介して廃棄物容器１０と流体結合している。第１の手段の排出側と廃棄物
容器１０との間の導管１４中には一定の代謝生成物を単離または検出することが
できる装置１２が存在する。再循環導管１１は細胞培養容器１の内部室２中に存
在する第１の手段の排出側から流出する液体の栄養培地容器４中への返還を可能
にする。作用物質貯蔵容器７は導管システム９、作用物質計量供給ユニット８お
よび導管９ｂを介して細胞培養容器１の内部室２中に存在する第１の手段の供給
側と流体結合する。前記の構成で作用物質は第１の手段を介して細胞培養容器１
の内部室２中に達する。切り替え要素９ｃおよび導管９ａは作用物質貯蔵容器７
と細胞培養容器１の内部室２との間の直接的な流体結合を可能にする。少なくと
も１つのガス貯蔵容器６はガス計量供給ユニット５を介して細胞培養容器１の内
部室２中に存在する第２の手段の供給側と流体結合しており、その排出側はガス
排出管６ａと結合している。

【００５９】図２ａは支持部材１３中に固定されているモジューラ式作用物質テストシステ
ムの断面図である。栄養培地容器４は、ここではホースポンプとして記載されて
いる栄養培地計量供給ユニット３を介して栄養培地導管１４で細胞培養容器１の
内部室中の第１の手段１ａの供給側と流体結合しており、この際栄養培地計量供
給ユニット３と第１の手段１ａの供給側との結合は導管１４および９ｂにより実
現されている。細胞培養容器１の内部室中の第１の手段１ａの排出側は導管１４
を介して廃棄物容器１０と流体結合している。しかしながら、本発明による複数
の装置の排出側が１つの共同の廃棄物容器と結合していてもよい。細胞培養容器
１はベースプレート１５上に配置されており、その上に固定機構で固定されてい
る。ベースプレート１５中に組み込まれて加熱シートが存在し、これは細胞培養
容器および培地を細胞培養容器中に培地が入る直前に、必要な温度、有利に３７
℃に温度調節するために好適である。この加熱シートの組み込みが細胞培養物の
肉眼によるまたは顕微鏡による観察のために利点である細胞培養容器の床の十分
な透明性を可能とする限り、この加熱シートは細胞培養容器１の床中に組み込ま
れていてもよい。細胞培養容器１の前および後に試料採取に好適である装置１６
が存在し、例えばこれは隔壁（septum）として構成されていてよい。作用物質貯
蔵容器７は導管システム９、作用物質計量供給ユニット８および導管９ｂを介し
て細胞培養容器１中に存在する第１の手段１ａの供給側と結合する。液体を通す
導管は有利には内径１ｍｍのシリコーンチューブである。

【００６０】図２ｂは、本発明の装置をそれぞれ１つの支持部材１３中に有する段を３段重
ねて有するモジューラ式作用物質テストシステムの断面図である。図２ｂは、本
発明による装置のモジューラ式配置によりこれらの装置の多数を準備することが
でき、これにより多数のインビトロ作用物質テストを同時に実施することができ
ることを、明らかにしている。

【００６１】図３は、本発明の装置６個を固定する支持部材１３中のモジューラ式作用物質
テストシステムの平面図である。これらの装置の５個は図２ａで記載した装置と
同一のものである。第６番目の、図３の一番下に示した装置は組合せ治療に好適
な配置１７を示す、その３つの作用物質貯蔵容器１８ａ、１８ｂおよび１８ｃは
それぞれ独自の作用物質ポンプ１９ａ、１９ｂおよび１９ｃを介して、第１の手
段の供給側と流体結合している。作用物質貯蔵容器７および作用物質計量供給ユ
ニット８と共に、図３の一番下の本発明による装置の細胞培養容器中で４つの作
用物質での組合せ治療を実施することができる。

【００６２】モジューラ式作用物質テストシステムの装置は、栄養培地、細胞培養物、作用
物質および廃棄溶液を外界に対して遮断する。装置の作用物質と接触する全ての
部分は使い捨て製品として構成されているのが有利である。従って、すでに記載
した固定機構により、操作する人が部分的に高毒性の作用物質と接触することな
く、モジューラ式システムの全ての装置を個別に前記システムから除去すること
ができる。培地、作用物質および細胞培養物と接触する全ての部分は滅菌可能で
なければならない。１０日間を越える装置の無菌作業が証明されている。

【００６３】こうして装置のモジューラ式配置は異なる薬物動力学および作用物質組合せで
の非常に多数の作用物質テストを可能にすることが明らかになり、このためには
モジューラ式システムの個々の装置の数および配置を多様に選択することの可能
性も寄与する。例えば、作用物質添加なしの参照装置を作用物質を添加した装置
と平行に作動することができる。個々の装置からなるシステムのモジューラ式構
成は従来の細胞培養容器（９６−穴プレート、２４−穴プレートおよび６−穴プ
レート）に対して、個々の装置の個別のマニピュレーションの利点も有する。他
方、種々の異なる流路において同じマニピュレーション（同じ試料、同じ処理）
を実施することもできる（複数測定）。

【００６４】６つの装置からなるモジューラ式作用物質テストシステムの重さは１０ｋｇよ
り軽く、問題なく一人の人が運ぶことができる。小さな寸法の故に、例えば２４
装置からなるモジューラ式作用物質テストシステムも市販のＣＯ_２−インキュベ
ータ中でも作業することができる。

【００６５】システム制御、試料同定、データ採取およびデータ評価のためには、有利にパ
ソコンを使用することができ、その画面で瞬時に存在する測定値を追跡すること
ができる。更に、個別の流路間のデータ比較も可能である。評価ソフトウェアは
参照流路および作用物質流路間の差異の分析のような、トレンド分析ためにも好
適である。結果は患者に関連づけて評価することもメモリーすることもできる。

【００６６】次の実施例は細胞の生存率に対する薬物動力学の影響を測定するために如何に
モジューラ式作用物質テストシステムを使用することができるかを示す。

【００６７】実施例：白血病セルラインＣＣＲＦＣＥＭを細胞培養培地（PRMI 1640およびPRMI 16
40に対してウシ胎仔血清１０容積％）ｍｌ当たり１×１０^７の密度で、および３
００μｌの容積で、本発明による装置４個からなる本発明によるモジューラ式作
用物質テストシステムの４つの細胞培養容器中に装入する。

【００６８】モジューラ式作用物質テストシステムを、人口孵卵器中に閉じこめ、そこでは
温度が３７℃であり、ＣＯ_２５％、Ｎ_２７４％およびＯ_２２１％からなるガス状
媒体が存在する。前記ガス状媒体の供給は細胞培養容器１〜４の内部室中のOxyp
han^（Ｒ）として構成された第２の膜システム中に滅菌フィルターを介して拡散
的に行われる。栄養培地としてはＲＰＭＩ１６４０およびＲＰＭＩ１６４０に
対して１０容積％のウシ胎仔血清を使用する。２４時間の間、栄養培地を流速７
ｍｌ／分で再循環させ、これにより白血病セルラインにCuprophan^（Ｒ）-中空繊
維として構成された第１の膜システムの膜を介して栄養培地が供給される。２４
時間の再循環の後、栄養培地供給を中断し、細胞増殖抑制剤イダルビシン（Idar
ubicin）を３つの異なる作用物質濃度−時間−推移で、１分当たり０.２ｍｌの
栄養培地の流速でCuprophan^（Ｒ）−膜を介して本発明による装置のそれぞれの
細胞培養容器中に以下に記載するように計量供給する：作用物質濃度−時間−推移は図４ａの分布１〜３に記載されている。

【００６９】分布１：前記細胞培養培地１ｍｌ当たりイダルビシン０.２０μｇの溶液を７
５分間かけて細胞培養容器１中にCuprophan^（Ｒ）−中空繊維を介して導入する
。

【００７０】分布２：前記細胞培養培地１ｍｌ当たりイダルビシン０.５０μｇの溶液を２
０分間かけて細胞培養容器２のCuprophan^（Ｒ）−中空繊維を介して導入する。
引き続き、前記細胞培養培地１ｍｌ当たりイダルビシン０.２５μｇの溶液を２
０分間の間細胞培養容器２のCuprophan^（Ｒ）−中空繊維を介して導通する。

【００７１】分布３：前記細胞培養培地１ｍｌ当たりイダルビシン１.００μｇの溶液を１
５分の間細胞培養容器３のCuprophan^（Ｒ）−中空繊維を介して導通する。

【００７２】細胞培養容器４の内部室中ではイダルビシンを供給しない。この細胞培養容器
は対照として使用される。作用物質のその都度の添加は前記作用物質濃度−時間
−推移の全てに関してその都度の曲線の下に同じ面積（area under curve, AUC
）が生じるように行われた。細胞増殖抑制剤の計量供給の後、細胞培養容器を１
時間新鮮な栄養培地（PRMI 1640およびPRMI 1640に対してウシ胎仔血清１０容積
％）で洗浄し、その際栄養培地を流速０.２ｍｌ／分で第１の膜システムの膜を
介して、かつ膜から流出した液体流はそれぞれの廃棄物容器中に流れる。その後
、栄養培地再循環を流速７ｍｌ／分で再び開始する。７２時間後、それまで使用
した栄養培地を同じであるが新鮮な栄養培地に代える。９６時間後、細胞を４つ
の細胞培養容器から収穫し、トリパンブルー−染色により生存細胞の数を調べ、
かつ生存率として次の計算式により収穫細胞の総数に対する収穫した生存細胞の
数のパーセンテージを調べる：生存率＝（収穫した生存細胞／収穫した細胞の総数）×１００（％）図４ｂ中では、“接種物”の後に細胞培養容器１〜４中に装入した生存細胞の
数が示されている。細胞は３００μｌの容積中に、細胞培養培地１ｍｌ当たり１
×１０^７の細胞密度で存在するので、細胞培養器１〜４中の生存細胞の数は３０
×１０^５である。図４ｂ中で“細胞収穫”の後ろには、細胞収穫により得られた
生存細胞の数が示されている。分布１の作用物質濃度−時間−推移は生存細胞の
数が最も低下したことを示す。

【００７３】細胞培養容器１〜４からの細胞生存率は以下の結果を示す。

【００７４】細胞容器生存率１２９％２３６％３４７％４９０％

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明による装置のフローチャート図

【図２ａ】本発明による装置を有するモジューラ式作用物質テストシステムの断面図

【図２ｂ】本発明による装置を備える段を上下に３段に配置したモジューラ式作用物質テ
ストシステムの断面図

【図３】本発明による装置を６個包含するモジューラ式作用物質テストシステムの断面
図

【図４ａ】３つの作用物質濃度−時間−推移を示す分布１〜３の図

【図４ｂ】４つの異なる細胞培養容器中の生存細胞の図

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年５月３１日（２００１．５．３１）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｍ 3/06 Ｃ１２Ｍ 3/06 Ｇ０１Ｎ 21/64 Ｇ０１Ｎ 21/64 Ｆ //(Ｃ１２Ｍ 1/34 Ｃ１２Ｒ 1:91 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｍ 1/38 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｑ 1/04 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者クリストフマイヤードイツ連邦共和国ザールブリュッケンヴァルトヴィーゼ５Ｆターム(参考） 2G043 AA03 BA16 CA03 DA02 EA01 FA03 GA07 GB21 4B029 AA07 AA08 AA12 AA14 BB11 CC01 FA04 FA09 FA11 GB05 GB06 GB08 4B063 QA01 QA18 QQ08 QQ20 QQ98 QR69 QR77 QS24 QS36 QS39 QX02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ａ）内部室および内壁を有し、かつ内部室中に設けられた第
１および第２膜システムを有し、膜システムおよび内部室の内壁の間に細胞培養
室が構成されている細胞培養容器を準備し、ｂ）細胞培養室中に細胞培養物として細胞を、および細胞培養培地を装入し、ｃ）第１の膜システムを用いて細胞培養室中に液体栄養培地を供給しかつ細胞培
養室から代謝生成物を取りだし、ｄ）第２の膜システムを用いて細胞培養室中に少なくとも１種のガス状媒体を供
給し、ｅ）細胞培養室中に少なくとも１種の作用物質を計量供給し、この計量供給を所
定の作用物質濃度−時間−推移に従って行い、かつｆ）細胞生存率を監視する、工程を少なくとも包含する、細胞への作用物質のインビトロテスト法。
【請求項２】作用物質として細胞増殖抑制剤、抗生物質、サイトカイン、
成長因子または抗ウィルス剤を使用する、請求項１記載の方法。
【請求項３】細胞培養物として、初代細胞を使用する、請求項１または２
記載の方法。
【請求項４】細胞培養物として腫瘍セルラインを使用する、請求項１また
は２記載の方法。
【請求項５】細胞培養室の容積が少なくとも０.１ｍｌおよび最高で５ｍ
ｌである、請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。
【請求項６】細胞培養室の容積が少なくとも０.３ｍｌおよび最高で３.０
ｍｌである、請求項５記載の方法。
【請求項７】第１の膜システムとして少なくとも１つの半透過性膜または
少なくとも１つの親水性微孔性膜を使用し、かつ第２の膜システムとして少なく
とも１つのガス移送膜を使用する、請求項１から６までのいずれか１項記載の方
法。
【請求項８】第１および第２の膜システムが中空繊維からなり、この中空
繊維は複数の位置で層状に重ねて配置されている、請求項１から７までのいずれ
か１項記載の方法。
【請求項９】取り外し可能な蓋を有する細胞培養容器を使用し、細胞培養
培地中に所望の細胞密度を調節し、細胞培養容器の蓋を開け、細胞培養容器の内
部室中に所望の容積の細胞懸濁液をピペットで計量して装入し、かつ引き続き細
胞培養容器を蓋で閉めることにより細胞培養物を装入する、請求項１から８まで
のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】細胞培養培地としてＲＰＭＩ１６４０を使用する、請求
項１から９までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】細胞培養室ｍｌ当たり少なくとも細胞１×１０^５を装入す
る、請求項１から１０までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】全ての細胞が第１および第２の膜システムのそれぞれ最も
近い膜に対して０μｍ〜６００μｍの平均間隔を有する、請求項１から１１まで
のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】液体栄養培地としてＲＰＭＩ１６４０を使用する、請求
項１から１２までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】ガス状媒体がｐＯ_２０〜１６０ｍｍＨｇおよびｐＣＯ_２
０〜１１５ｍｍＨｇを有する、請求項１から１３までのいずれか１項記載の方法
。
【請求項１５】細胞培養培地が重炭酸塩緩衝剤を含有し、供給したガス状
媒体中のｐＣＯ_２を細胞培養培地のｐＨ値が６.８〜７.８であるように調節する
、請求項１から１４までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】ガス状代謝生成物を第２の膜システムにより細胞培養室か
ら除去する、請求項１から１５までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】個々の作用物質および／または複数の作用物質の組合せを
時間的にずらせて計量供給する、請求項１から１６までのいずれか１項記載の方
法。
【請求項１８】作用物質計量供給を直接または第１の膜システムを介して
細胞培養室中に行う、請求項１から１７までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】作用物質濃度−時間−推移の設定を第１の膜システムの透
過性により、作用物質の添加時間によりおよび作用物質濃度により行う、請求項
１から１８までのいずれか１項記載の方法。
【請求項２０】細胞培養容器を温度３７℃に保持する、請求項１から１９
までのいずれか１項記載の方法。
【請求項２１】細胞生存率を細胞生体染色剤を用いて監視する、請求項１
から１８までのいずれか１項記載の方法。
【請求項２２】細胞生体染色剤としてアラマルブルー^（Ｒ）を用いる、請
求項２１記載の方法。
【請求項２３】細胞生存率を少なくとも１つのセンサで監視する、請求項
１から２２までのいずれか１項記載の方法。
【請求項２４】蛍光のためのセンサを使用する、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】細胞培養培地中の細胞培養物を取り込むために好適な、内
部室（２）を有する細胞培養容器（１）を包含し、この際内部室中に少なくとも
１つの栄養培地を供給するための第１の手段および少なくとも１つのガス状の媒
体を供給するための第２の手段が配置されており、この際これらの手段はそれぞ
れ供給側および排出側を有し、かつこの際前記手段および内部室の内壁の間に細
胞培養室が形成されており、かつこの際第１の手段はその供給側で栄養培地計量
供給ユニット（３）を介して少なくとも１つの栄養培地容器（４）と流体結合し
、かつ第２の手段はその供給側でガス計量供給ユニット（５）を介して少なくと
も１つのガス貯蔵容器（６）と流体結合している装置において、細胞培養室の容
積が最高で５ｍｌおよび最低で０.１ｍｌであり、該装置が細胞培養室中に少な
くとも１つの作用物質を供給するための手段（７）、（８）、（９）、（９ａ）
、（９ｂ）および（９ｃ）および作用物質濃度−時間−推移を設定するための手
段を更に有することを特徴とする装置。
【請求項２６】第１の手段がその排出側で廃棄物容器（１０）と流体結合
する、請求項２５記載の装置。
【請求項２７】第１の手段がその排出側で再循環管（１１）を介して少な
くとも１つの栄養培地容器（４）と流体結合する、請求項２５記載の装置。
【請求項２８】第１の手段が液体栄養培地の供給に好適な少なくとも１つ
の膜からなる、請求項２５から２７までのいずれか１項記載の装置。
【請求項２９】第２の手段がガス交換に好適な少なくとも１つの膜からな
る、請求項２５から２８までのいずれか１項記載の装置。
【請求項３０】細胞培養容器（１）が、内部室を限定し、相互に相対し、
かつ透明な材料からなる床および蓋を有する、請求項２５から２９までのいずれ
か１項記載の装置。
【請求項３１】細胞培養容器（１）の床に加熱システムが組み込まれてい
る、請求項３０記載の装置。
【請求項３２】第１の手段の少なくとも１つの膜が半透過性膜であるか、
または親水性微孔性膜である、請求項２５から３１までのいずれか１項記載の装
置。
【請求項３３】第２の手段の少なくとも１つの膜が酸化性膜である請求項
２５から３２までのいずれか１項記載の装置。
【請求項３４】第１および第２の手段の膜が中空繊維である、請求項２５
から３３までのいずれか１項記載の装置。
【請求項３５】中空繊維が内部室中で複数の位置で層状に重なり合って配
置されている請求項２５から３４までのいずれか１項記載の装置。
【請求項３６】それぞれの手段を構成する中空繊維の最大間隔が相互に５
０μ〜６００μｍである、請求項３５記載の装置。
【請求項３７】細胞培養室の容積が０.３ｍｌ〜３.０ｍｌである、請求項
２５から３６までのいずれか１項記載の装置。
【請求項３８】作用物質供給のための手段が少なくとも１つの作用物質貯
蔵容器（７）、少なくとも１つの作用物質計量供給ユニット（８）および導管シ
ステム（９）からなり、この導管システムは少なくとも１つの作用物質貯蔵容器
（７）をそれぞれの作用物質計量供給ユニット（８）を介して、直接（９ａ）ま
たは第１の手段（９ｂ）を介して、細胞培養容器（１）の細胞培養室と結合して
いる、請求項２５から３７までのいずれか１項記載の装置。
【請求項３９】細胞生存率を監視するための手段を包含する、請求項２５
から３８までのいずれか１項記載の装置。
【請求項４０】細胞生存率を監視するための手段が少なくとも１つのセン
サからなる、請求項３９記載の装置。
【請求項４１】センサが蛍光センサである、請求項４０記載の装置。
【請求項４２】請求項２５から４１までのいずれか１項記載の装置少なく
とも２個を有することを特徴とする、モジューラ式作用物質テストシステム。
【請求項４３】請求項２５から４１までのいずれか１項記載の装置６個、
２４個または９６個からなる、請求項４２記載のモジューラ式作用物質テストシ
ステム。
【請求項４４】細胞に対する作用物質の作用をインビトロテストするため
の、請求項２５から４１までのいずれか１項記載の装置または請求項４２または
４３記載のモジューラ式作用物質テストシステムの使用。
【請求項４５】細胞の生存率に対する薬物動力学の影響を調べるための請
求項４４記載のモジューラ式作用物質テストシステムの使用。