JPH0611236B2 - 細胞培養装置における細胞毒性の分析 - Google Patents

細胞培養装置における細胞毒性の分析

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JPH0611236B2 JP59500699A JP50069984A JPH0611236B2 JP H0611236 B2 JPH0611236 B2 JP H0611236B2 JP 59500699 A JP59500699 A JP 59500699A JP 50069984 A JP50069984 A JP 50069984A JP H0611236 B2 JPH0611236 B2 JP H0611236B2
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Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、細胞毒性物質に対する試験管内での培養評価
に基づく異常細胞の生体内反応性の予測方法及び装置に
関するものである。
発明の背景 組織病理学上同一種類の発癌性細胞又はその他の異常細
胞は、個々の患者において特定の薬剤治療に対し広範囲
の反応性を示すことが知られている。微生物感染を管理
するために使用される培養及び感受性分析と同様な予測
技術が、個々の場合に対する有効な化学治療を選択する
際大いに役立つ。
個別化した制癌剤療法がなければ、医者は同様な細胞障
害に対する過去の経験若しくは報告に頼るか、或いは試
行錯誤の過程を辿らざるを得ない。使用しうる制癌剤の
数が増大するにつれ、かつ投与量又は薬剤を改変するの
にしばしば使用される時間が制約されるにつれ、最適な
療法を選択する仕事は予測分析の助けなしには極めて困
難となる。
多くの予測方式が提案されている。たとえば、サルモン
等、「制癌剤に対するヒト幹細胞の感度差の定量」、ニ
ュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メジスン、第
２９８巻、第１３２１−１３２７頁（１９７８）。典型
的には、従来技術は、特定の制癌剤に短時間露出した後
にバイオプシ試料からの単一細胞懸濁物を軟質寒天にク
ローン化する。たとえば、ビック等、「ヒト膀胱の転移
細胞癌における細胞の寒天−メチルセルロースクローン
化分析の開発」、カンサー・リサーチ、第３９巻、第５
０５１−５０５６頁（１９７９）及びフォン・ホック
等、「軟質寒天培養におけるヒト悪性黒腫の直接的クロ
ーン化」、カンサー、第５０巻、第６９６−７０１頁
（１９３２）を寒天培養技術の詳細につき参照すること
ができる。
異常細胞に対する細胞毒性物質の効果を予測する寒天培
養試験の有用性を種々の困難性が制約している。バイオ
プシ癌細胞の小部分しか軟質寒天では増殖しない。たと
えば、黒腫試料からの細胞懸濁物を寒天板に接種する場
合、１：１０００の接種効率は稀でない。したがって、
種々異なる投与量にて種々異なる薬剤を比較して統計的
に有意の結果を得るには、極めて多数の細胞が必要とさ
れる。さらに、寒天に形成されるコロニーが最も悪性の
腫瘍細胞から生ずるとは限らない。さらに、典型的には
寒天技術は細胞を生理溶液中に懸濁すると共に接種前の
薬剤露出を比較的短時間（すなわち、１時間）に制限す
る。露出技術も、その後の寒天における増殖も、正確に
は生体内条件と同じでない。さらに、評価に必要とされ
る時間は、しばしば緊急を要する治療法の確立に比べて
比較的長い（すなわち、１４〜３０日間）、最後に、細
胞コロニーを計数する薬剤感受性の測定は主観的、統計
学上不正確、かつ時間のかかるものとなる。
化学療法の研究につき提案されている他の予測方式は、
合成毛細管のマトリックスで作成された細胞培養装置に
おいて増殖する細胞培養物を使用する。クワルトルス
等、「血液透析マトリックス灌流培養系：化学療法活性
腫瘍細胞の新規な研究技術」、インビトロ、第１６巻、
第２４６頁（１９８０）は、細胞培養装置系（アミコン
−ビタファイバー（Ｒ））で増殖した腫瘍細胞に対する
１種の制癌剤の効果を報告している。薬剤に露出した
後、培養細胞を細胞培養装置から取り出し、全細胞及び
生存細胞、並びに軟質寒天におけるコロニー形成能力及
び増殖につき分析した。
合成毛細管系は、生体内環境に一層類似した培養を与
え、かつ患者における活性物質の灌流に一層類似した方
法で毛細管を介して薬剤を培養物中へ導入しうるという
点で、軟質寒天技術よりも有利である。毛細管培養につ
いては、一般にシュラッター、「合成毛細管による細胞
培養」、メソッズ・イン・セル・バイオロジー、第XIV
巻、第９５−１０３頁（１９７６）を参照することがで
き、ここに参考のため引用する。
クワルトス（上記）により報告された化学療法活性を研
究するための毛細管技術は、寒天技術の有用性を制約す
ると同じ多くの問題を有する。クワルトルスとその共同
研究者等は、全細胞及び生存細胞を計数するために毛細
管系から細胞を取り出さねばならなかった。実際上、毛
細管マトリックスから細胞を破損なしに取り出すことは
極めて困難な仕事である。典型的には、酵素処理により
細胞を毛細管マトリックスから取り出すが、この処理は
生細胞に対するよりも死細胞に対して効果的であり、し
たがって定量結果を得るのは困難である。さらに、培養
物が酵素処理の後に失なわれ、再び使用することができ
ない。
さらに、細胞を取り出した後、顕微鏡下における生存細
胞の計数も同様に主観的かつ不正確となり、確かに時間
がかかる。生細胞の肉眼観察に頼る薬剤感受性試験は、
広範な臨床用途を見出すには程遠い。
治療剤に対する発癌細胞及びその他の異常細胞の生体内
反応性を予測するための簡単かつ効果的方法及び装置が
要望されている。予測培養系は容易に接種できねばなら
ず、かつ細胞増殖及び薬剤露出はヒト環境に近似せねば
ならない。より重要なことに、薬剤感受性は比較的短時
間で簡単かつ正確な方法により定量化できねばならず、
好ましくは医者が多段階法（すなわち、薬剤又は投与量
を変化させる）の影響を順次に測定しうるよう培養物の
破壊なしに特定薬剤の効果を読み取りうるように定量化
できねばならない。
発明の要点 広範な臨床用途が可能である簡単かつ鋭敏な細胞毒性分
析につき開示する。本発明による方法は、医者が細胞培
養装置における細胞生存性を評価することを可能にす
る。細胞培養装置における性細胞の数は、細胞膜による
フルオレセインなどのラベルの保持を測定して評価され
る。好適具体例において、培養細胞は蛍光色素を介して
フルオレセインを蓄積させることができる。
特に、蛍光色素は蛍光性基質（典型的にはたとえばフル
オレセインと脂肪族酸とのエステルのような非極性の蛍
光性基質）を細胞培養物中へ導入した場合に生ずる。蛍
光性基質は、酵素的に加水分解される細胞膜に浸透して
フルオレセインを遊離すると共に、青色光の下で細胞を
鮮やかな蛍光に染色する。フルオレセイン（すなわち陰
帯電した分子）は正常細胞の細胞質膜をよぎって容易に
は拡散しないので、この過程はフルオレセインの細胞内
蓄積をもたらす。一般に、本発明者等による「蛍光性エ
ステルの酵素加水分解による生存哺乳類細胞の膜性質の
研究」〔プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンス、第５５巻、第１号、第１
３４−１４１頁（１９６６）〕と題する論文を参照する
ことができる。しかしながら、死細胞を蛍光性基質で処
理すると、フルオレセインの細胞内蓄積は観察されな
い。したがって、細胞培養装置における細胞を蛍光性基
質の導入前に薬剤で死滅させると、基質を加水分解して
も細胞内フルオレセイン蓄積は生じない。したがって、
細胞毒性剤に対する細胞培養物の反応性を測定する本発
明の方法は、培養細胞によるフルオレセインの放出速度
の変化を監視することにある。
一面において、本発明は、バイオプシ細胞を培養するた
めの装置、すなわち細胞培養装置よりなっている。この
細胞培養装置は少なくとも１つの灌流毛細管若しくは膜
表面を含み、好ましくはバイオプシ組織の未解離断片を
接種して腫瘍の基礎細胞組成（多くの腫瘍は細胞異質性
を有することが示されている）を保持するような構造と
する。酸素及び栄養物の灌流、並びに細胞培養装置の三
次元構造は、寒天で増殖しえない腫瘍細胞でさえ増殖さ
せうると思われる。さらに、蛍光検出装置の感度を与え
れば、細胞培養装置は少数の細胞を受け入れるように設
計することができ、かくして結腸癌バイオプシ物又は幼
児細胞バイオプシ物のような限られた寸法のバイオプシ
試料からも多くの同時試験を行なうことができる。
他面において、本発明は細胞毒性試験を行なうための系
を包含し、この系はバイオプシ細胞を増殖させうる培地
若しくは細胞培養装置と、この細胞培養装置へ酸素化栄
養物を供給する手段と、前記細胞培養装置中へ蛍光性基
質を導入する手段と、前記細胞培養装置中へ制癌剤を導
入する手段と、放出された蛍光を測定する手段とを備え
る。好ましくは、蛍光は蛍光計により測定され、データ
を自動的に集めかつ細胞培養装置へ制癌剤を接種した直
後にコンピュータで測定する。本発明は単一目的の装置
で実施しうるが、医者は蛍光計と多目的コンピュータを
用いて培養装置及び蛍光性基質を含むキットにより本発
明の方式を採用することができる。
さらに、好適具体例は培養装置が限定された個数の灌流
毛細管若しくは表面を有しかつ少数のバイオプシ細胞を
接種するよう設計したものであるが、他の細胞培養装置
に置換することもできる。たとえば、次の細胞培養装置
を挙げることができる：半透膜につき１９７４年６月２
８日付けでクナゼック等に対し発行された米国特許第3,
８２1,０８７号；細胞培養系につき１９７４年１２月１
０日付けでハウスに対し発行された米国特許第3,８５3,
７１２号；細胞培養装置につき１９７６年４月６日付け
でハダド等に対し発行された米国特許第3,９４8,７３２
号；編織毛細管束につき１９８０年１月２２日付けでク
ナゼック等に対し発行された米国特許第4,１８1,９２２
号；細胞培養反応器につき１９８０年５月６日付けでフ
ェデル等に対し発行された米国特許第4,２０1,８４５
号；毛細管装置につき１９８０年９月１２日付けでクナ
ゼック等に対し発行された米国特許第4,２２0,７２５
号；組織培養のための装置につき１９８０年１２月２３
日付けでホワイトに対し発行された米国特許第4,２４1,
１８７号；及び増殖組織装置につき１９８１年１２月２
９日付けでレイトンに対し発行された米国特許第4,３０
8,３５１号（これら公報の教示を参考のためここに引用
する）。
本発明の方法は、多くの方法で実施することができる。
急速作用を示す化学治療剤を試験する場合、細胞培養装
置に細胞を接種し、かつその装置上で増殖する培養物を
次いで細胞が高度に蛍光発色性となるまで（約１５分
間）蛍光性基質と共に灌流することができる。次いで、
灌流を増殖培地に戻し、そして細胞からのフルオレセイ
ンの流出物を定常状態に達するまで監視する。次いで、
急速作用剤を細胞培養装置中へ直接に又は灌流により導
入し、直ちに細胞毒性作用を流出物における変化により
測定する。
或いは、遅延（すなわち、放射線様）作用を示す薬剤を
用い、流出物の動力学及び蛍光性の一層詳細な記録を蛍
光性基質による一連の灌流を行なった後の細胞培養装置
につき得ることができる。次いで、遅延剤を細胞培養装
置中へ所定時間導入する（これは数分間〜数日間の範囲
で変化することができる）。次いで、蛍光性基質の灌流
を反復し、蛍光動力学における基線読みからの変化を測
定して、細胞培養装置に残存する生細胞の個数及びした
がって薬剤に対する感度を決定する。これら２つの技術
を組み合せて或いは改変して本発明の基本原理から逸脱
することなく多数の方法で使用しうることが明らかであ
ろう。
個々の細胞培養物に対する効果につき本発明により試験
しうる各種の治療剤又は化学物質は次のものを包含す
る：アドリヤマイシン、ミトマイシン、アクチノマイシ
ン、ネオマイシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、
クロラムブシル、シス−プラチヌム、６−メルカプトプ
リン、メトトレキセイト、シクロホスファミド、メルフ
アレン、カルムスチン、メチルエステルＤＯＰＡ、ＢＣ
ＮＵ、ＤＴＩＣ、５−フルオロウラシル、ｍ−ＡＭＳ
Ａ、ミトキサントロン、メチルＧＡＧ、アシビシン、サ
イミジン、ホルモン、抗生物質、プロスタグランジン及
びリンホキン並びにＸ線又は入手しうるようになった他
の薬剤。
細胞培養装置からの蛍光生物質の流出物は、灌流ネット
ワークの戻り流から採取した試料により測定することが
でき（蛍光物質は毛細管又は膜を通過するので）、或い
は細胞室から直接に試料採取することにより測定するこ
とができる。実際上、蛍光の測定値は、細胞室から直接
に採取した試料において４倍程度まで強くなりうること
が判明した。本発明の方法は、医者が薬剤の長期かつ異
なる組み合せと設計した計画との効果を試験することを
可能にする。さらに、本発明の方式によれば、薬剤が陰
性の細胞毒性試験を示せば、細胞培養装置はその後の薬
剤試験に役立てることができる。さらに、種々異なるフ
ルオレセイン誘導体を用いて合成された蛍光性基質を用
いることにより、フルオレセインの急速又は遅延放出を
測定するよう選択することができる。たとえば、二酢酸
フルオレセインを用いる場合、細胞内蛍光の半減期は約
４５分間（３７℃）であるのに対し、二酢酸６−カルボ
キシフルオレセインを用いる場合の半減期は８時間以上
まで伸びる。さらに、温度は蛍光色素に対し変調効果を
有し、したがってフルオレセイン流出物の調節に使用す
ることができる。各種フルオレセイン誘導体及びその比
較動力学の説明については、ロットマン及びペーパーマ
スター、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・
サイエンス、第５５巻、第１３４−１４１頁（１９６
６）を参照することができる。同様にして、他の蛍光性
化合物も使用することができる。
次いで、本発明を或る種の好適具体例及び実験結果につ
き説明する。しかしながら、本発明の思想及び範囲を逸
脱することなく種々の変化及び改変をなしうることが明
らかであろう。たとえば、好適具体例はバイオプシ組織
の未解離断片を培養装置に接種することを含むが、単一
細胞懸濁物を使用して培養装置に接種することもでき
る。
さらに、たとえばキブコ・コーポレーション社など多く
の会社から市販されている各種の増殖培地を栄養物とし
て使用することができる。これらの培地は、たとえばダ
ルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ロスウェル・
パーク培地（ＲＰＭＩ）及びミニマル・イーグル培地
（ＭＥＭ）のような名称で販売され、典型的にはアミノ
酸と塩とビタミンと血清とその他の栄養物とからなって
いる。或いは、臨床用途においては、試験する薬剤に対
する生体内露出をさらに真似るため、増殖培地の全部又
は１部につきバイオプシ患者からの血清を使用するもの
も好適である。
さらに、本発明の主たる目的は化学療法剤に対する癌細
胞の反応性を予測する方法及び装置を提供することであ
るが、他の用途も重要であることが判明した。たとえ
ば、他の細胞異常性に対する薬剤も試験することがで
き、かつ化学療法の特定経過が患者に引き起こす副作用
を尺度として非発癌細胞に対する薬剤の効果を評価する
際に本発明による方法を使用することもできる。さら
に、細胞培養装置が単に細胞培養容器としてではなくヒ
ト器官に対する移植可能な置換体として可能になる場
合、本発明は移植前にこの種の装置を試験する理想的な
方法を提供する。
図面の簡単な説明 第１図は本発明で使用しうる細胞培養装置の略図であ
り、 第２ａ及び２ｂ図は本発明に使用しうる他の細胞培養装
置の略側面図及び平面図であり、 第３図は本発明の培養分析装置の略図であり、 第４図は本発明による細胞毒性剤での処理前後における
細胞培養物に対する蛍光活性のグラフである。
好適具体例の詳細な説明 第１図を参照して、培養装置１０は、細胞室１２と毛細
管１８と外殻２４とを備えて示されている。毛細管１８
は、封止手段２６によって外殻２４に封止される。操作
に際し、細胞を装置１０中へ開口部１４を介して接種
し、かつ開口部１６を介して洗い出すことができ（又は
単一の開口部を使用することもできる）。他方、増殖培
地及び薬剤は毛細管１８を介して２０から出口２２に移
動する。
第２図において、２枚の平たい膜シート３２と外殻２４
とにより包囲された細胞室１２を備える他の細胞培養装
置３０が示されている。膜シート３２は、封止リング３
４によって外殻２４に封止される。支持体又は毛細管
（図示せず）を室１２中へ挿入して、膜を離間させると
共に追加栄養物を供給することができる。操作に際し、
細胞並びに蛍光性基質及び洗浄溶液を、入口４２及び弁
４４を介して細胞室１２中へ導入することができる。栄
養物は、開口部６２を介して独立的に又は図示したよう
に上部栄養室６６と下部室６８とを接続するハウジング
６４に対し直列で循環させる。細胞培養装置の内部にお
いて、栄養物は膜３２を横断して灌流し、培養細胞に供
給される。弁４６を開放して蛍光測定を行なうことがで
き、栄養物は細胞培養装置を通して循環される。灌流流
れは、開口部４８から流出する定常流出を与える。
本発明の培養装置は種々の他の形態とすることもでき
る。毛細管は各種の半透性材料、たとえば酢酸セルロー
ス、ポリカーボネート、ポリスルホン又はアクリル共重
合体のいずれか形成することができ、さらに必要に応じ
たとえばコラーゲンのような物質で被覆して細胞付着を
促進することもできる。毛細管はアミコン・コーポレー
ション社、ダウ・ケミカル・コーポレーション社、フロ
ー・ラボラトリース社又はビオーラド・ラボラトリース
社を含む多くの製造業者から入手することができ、選択
透過性の薄壁を有して電解質、塩、溶解ガス及び治療剤
を阻害なく通過させることができる一方、１0,０００〜
１０0,０００ダルトンの巨大分子を制限する。これらは
典型的には、厚さ２５〜７５μｍの壁部を有しかつ約２
００μｍの内径を有する。さらに、たとえばエチコン・
インコーポレーション社、ミリポア・コーポレーション
社、ヌクレオポア・コーポレーション社などの会社は、
同様な選択透過性壁を有する膜表面を製造している。好
ましくは、毛細管又は膜材料は蛍光性基質の低い吸収を
示すべきである。何故なら、吸収及び自然加水分解はよ
り高い背景の蛍光をもたらすからである。さらに、器官
の容積は好ましくは小さく、すなわち2,000〜100,000個
の培養細胞に対する容積で充分とすべきである。
第３図には、本発明の蛍光色素系４０の１具体例が示さ
れている。灌流手段１８と細胞室１２とを備える細胞培
養装置１０には、開口部１４を介して細胞を接種するこ
とができる。これら細胞には流入流れ３４を介して栄養
物及び試験すべき薬剤を施こす一方、流出流れ３６を蛍
光計５０により監視する。典型的には、蛍光計５０は、
光源５２と集光レンズ５４及び５６と光電子増培管５８
と関連コンピュータ及び表示手段６０（これは組み込み
式でも分離型でもよい）とからなっている。
蛍光計５０を通過した後、流出流れ３６は次いで貯槽７
０に戻り、２２で栄養物が補給され、次いでポンプ７２
によりガス拡散手段７４を介してポンプ輸送され（シリ
コーンチューブを使用して酸素及び二酸化炭素を増殖培
地へ供給することができる）、かつ細胞培養装置１０へ
流入流れ３４として戻す。或いは、蛍光計の試料を開口
部１４若しくは１６から採取することができる。細胞培
養装置は培養器（図示せず）中に封入して、細胞培養装
置の温度を制御することができる。
試験すべき薬剤は、開口部１４を介して細胞室中へ直接
に導入することができ、又は流入流れ３４を介して間接
的に或いは薬剤を増殖培地貯槽７０（これは生体内条件
に匹敵しうる希釈率を得るのに好適である）へ加えるこ
とによって導入することもできる。必要に応じ、細胞は
酵素脱着（すなわち、トリプシンの内部循環）とフラツ
シングとにより細胞培養装置から除去することができ
る。
一連の実験において、培養装置として市販の毛細管装置
（アミコン・ビタファイバー（Ｒ）３×５０型）を用い
て第３図の装置を試験した。アミコン装置は必要以上に
多数の毛細管を有したが、アクリル共重合体毛細管はミ
ニマル・イーグル培地（ＭＥＭ）と蛍光性基質とを培養
黒腫細胞に流す際に良好に機能した。基質としては二酢
酸フルオレセイン（ＦＤＡ）の代りにモノ酢酸フルオレ
セイン（ＦＭＡ）を使用した。何故なら、ＦＤＡは高度
に疎水性の毛細管において非特異的吸収及び加水分解に
より蛍光背景を生ずるからである。この問題は、遊離カ
ルボキシル基を有しかつ極めて極性の大きいＦＭＡを使
用して軽減することができる。（従来の研究が示したと
ころでは、ＦＭＡはＦＤＡと同様に良好な基質である
が、その使用は固有の蛍光性により制限されている。し
かしながら、本発明の方法においてはＦＭＡの蛍光性は
阻害的でなく、寧ろＦＭＡ濃度を監視するのに使用する
ことができる。）。他の用途においては、フルオレセイ
ン誘導体又は蛍光性基質をより少ない毛細管或いは吸収
性の少ない毛細管材料と組み合せて使用するのが好適で
ある。
アミコン３×５０装置により形成された培養装置培養物
は、５0,０００ダルトンまでの分子の灌流を可能にし、
かつ細胞室における液体は繊維の内側で発生した圧力に
より流動させた。細胞室内で細胞を阻害することなく試
料採取するには、この条件がより好適であると判明し
た。他の用途においては、より少ない又はより多い透過
性栄養物循環手段が好ましい。蛍光性基質としてＦＭＡ
を使用する場合、生細胞を含有する装置と比較との間に
は相当な蛍光色素の差が観察された。
蛍光性基質を室温で導入し、次いで初期蛍光の大部分を
洗浄除去する方法が確率された。洗浄後、装置を３７℃
となし、そしてフルオレセイン流出物の動力学につき監
視した。この工程に関する原理は、細胞が２７℃よりも
３７℃においてフルオレセインを１０倍早く分泌する一
方、毛細管繊維により流される残留フルオレセインの割
合は殆んど温度により影響されないことである。次い
で、試験薬剤を導入し、そして蛍光性基質の導入、洗浄
及び監視の工程を記録される蛍光色素動力学の変化につ
き反復した。
第４図には、ホルムアルデヒド及びメトトレキセイトに
よる処理の結果を示す。黒点は薬剤を導入する前に上記
の系で採取した蛍光の測定値を示し（基線データ）、他
方白点はホルムアルデヒドにより処理の後の蛍光色素動
力学を示す。図示したように、生細胞培養物は温度が３
７℃まで上昇すると直ちに蛍光発生の大きな上昇を示し
た。この薬剤に露出された後、培養物は温度の移動の後
に著しく低い蛍光を示し、このことは薬剤が細胞を死滅
させるのに有効でありかつ培養物がもはや蛍光色素を示
しえなかったことを示している。この実験の結果は、細
胞を細胞培養装置から取り出した後に慣用の生存試験を
用いて細胞を肉眼観察することにより確認された。黒四
角は、同様な細胞培養装置ユニットをメトトレキセイト
剤（１ｍ当り0.9μｇ）で３６時間処理した後の蛍光
色素動力学を示している。
臨床用途において、本発明の方式は１個若しくはそれ以
上の培養装置へのバイオプシ試料の分配を含む。培養物
が定常状態まで増殖した後、各ユニットにつき基線又は
ユニット輪郭を得る。（基線は、細胞の個数及び組成に
応じて変化することができる）。輪郭形成の後、試験す
べき薬剤をユニット中に導入し、輪郭の変化は各薬剤に
対する細胞培養物の感受性を反映する。何らの効果も観
察されなければ（或いは最小の効果しか観察されなけれ
ば）、異なる薬剤又はより多い投与量、或いは相乗的組
み合せを同じユニットの使用により再び試験することが
できる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特公 昭57−21978（ＪＰ，Ｂ２) 特公 昭54−6634（ＪＰ，Ｂ２) Ｂｕｌｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｃｏｎｔａ ｍ Ｔｏｘｉｃｏｌ，29（６），Ｐ．739 −746，1982 Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃ ｔａ，711（３），Ｐ．539−550，1982

Claims (18)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】(a)哺乳動物細胞を細胞培養装置で培養
    し、 (b)これら細胞を蛍光性基質と接触させて生細胞により
    蛍光の特徴的初期量を放出させ、 (c)治療剤を該装置中へ導入し、かつ (d)治療剤に対する細胞の感受性の指標として細胞から
    放出される蛍光の変化を測定する ことを特徴とする、治療剤に対するバイオプシした哺乳
    動物細胞の感受性の分析方法。
  2. 【請求項２】蛍光の変化を測定する工程が、さらに細胞
    を基質と接触させた後であるが治療剤を導入する前に溶
    出される蛍光を測定し、次いでこの測定値を治療剤の導
    入後に基質と第２回目に接触させた後に溶出された蛍光
    の第２測定値と比較する工程を含む請求の範囲第１項記
    載の方法。
  3. 【請求項３】蛍光の変化を測定する工程が、さらに蛍光
    活性の量の変化を測定する工程を含む請求の範囲第１項
    記載の方法。
  4. 【請求項４】蛍光の変化を測定する工程が、さらに蛍光
    活性の動力学の変化を測定する工程を含む請求の範囲第
    １項記載の方法。
  5. 【請求項５】蛍光の変化を測定する前に装置の温度を変
    化させる工程をさらに含む請求の範囲第１項記載の方
    法。
  6. 【請求項６】細胞を蛍光性基質と接触させる工程が、さ
    らに加水分解の際にフルオレセインを遊離するフルオレ
    セイン含有化合物と細胞を接触させる工程を含む請求の
    範囲第１項記載の方法。
  7. 【請求項７】細胞を蛍光性基質と接触させる工程が、さ
    らに二酢酸フルオレセイン、モノ酢酸フルオレセイン及
    びその誘導体よりなる群から選択され、細胞中に吸収さ
    れかつ加水分解した後にフルオレセインを遊離する少な
    くとも１種の基質と細胞を接触させる工程を含む請求の
    範囲第１項記載の方法。
  8. 【請求項８】細胞を培養する工程が、さらに酸素化栄養
    物を潅流により供給する細胞室を備えた細胞培養装置に
    おいて細胞を培養する工程を含む請求の範囲第１項記載
    の方法。
  9. 【請求項９】栄養物を少なくとも１個の半透性毛細管に
    より細胞室中へ潅流させる請求の範囲第８項記載の方
    法。
  10. 【請求項１０】栄養物を少なくとも１個の半透膜表面に
    より細胞室中へ潅流させる請求の範囲第９項記載の方
    法。
  11. 【請求項１１】細胞を培養する工程がさらに装置中を循
    環する増殖培地の潅流により酸素化栄養物を供給される
    細胞室を有する細胞培養装置において細胞を培養する工
    程を含み、かつ装置から溶出される蛍光の変化を測定す
    る工程がさらに装置の下流における増殖培地の蛍光を測
    定する工程を含む請求の範囲第１項記載の方法。
  12. 【請求項１２】(a)細胞を増殖させうる細胞培養装置
    と、 (b)酸素化栄養物を装置へ供給する手段と、 (c)蛍光誘発化合物を装置中へ導入して生細胞に蛍光の
    初期の特徴的量を放出させる手段と、 (d)治療剤を装置中へ導入して培養細胞の１部を死滅さ
    せる手段と、 (e)試験期間中に細胞により放出された蛍光を測定する
    手段と (f)細胞培養物の薬剤に対する感受性の指標として、初
    期放出蛍光と治療剤の導入後に放出された蛍光とを比較
    する手段 からなることを特徴とする、患者から採取された細胞の
    治療剤に対する感受性の試験装置。
  13. 【請求項１３】装置の温度を変化させる手段をさらに備
    える請求の範囲第１２項記載の装置。
  14. 【請求項１４】酸素化栄養物を供給する手段が、さらに
    少なくとも１個の半透性毛細管を含む請求の範囲第１２
    項記載の装置。
  15. 【請求項１５】酸素化栄養物を供給する手段が、さらに
    少なくとも１つの半透膜表面を含む請求の範囲第１２項
    記載の装置。
  16. 【請求項１６】酸素化栄養物を供給する手段が、細胞と
    接触する装置内の半透性循環系及び増殖培地貯槽、ポン
    プ及び装置外部のガス拡散器からなる請求の範囲第１２
    項記載の装置。
  17. 【請求項１７】酸素化栄養物を供給する手段及び蛍光誘
    発性化合物を導入する手段の両者が、装置に備わった半
    透性循環系を含む請求の範囲第１２項記載の装置。
  18. 【請求項１８】放出蛍光を測定する手段が蛍光計である
    請求の範囲第１２項記載の装置。
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