SE448881B - Apparat for genomforandet av perfusionsodling av en eller flera cellkulturer samt forfarande for perfusionsodling av en eller flera cellkulturer - Google Patents

Description

20 25 30 448 881 Det finns sålunda behov av en enklare och billigare metod att bestämma toxicitet och en sådan metod har enligt uppfin- ningen åstadkommits genom stabila perfusionsodlingar av ani- mala celler i en speciellt utformad apparatur, som ger la- minär strömning av substratet.

Odling av cellkulturer sker genom att isolerade celler från djur och människor hålls vid liv och odlas utanför kroppen.

Den vanligaste typen av odling är den där cellerna place- ras i en skål av glas eller plast och omges av ett substrat som till sin sammansättning liknar kroppsvätskornas. Till odlingssubstratet kan en testsubstans sättas och föränd- ringar i cellerna mätes. Den koncentration av substansen som ger en viss definierad förändring (t ex i utseende, tillväxthastighet, storlek, 02-upptag, enzymaktivitet, el- ler förhållandet mellan levande och döda celler) utgör ett mått på substansens giftverkan i cellkulturen. En stor för- del med cellkulturer är att de möjliggör tester på mänsk- ligt material, genom att odlingar kan startas från celler i t ex blodprov, fostervattenprov eller vävnader som avlägs- nats vid kirurgiska ingrepp.

Då en cellkultur används för att studera biokemiska förlopp är det viktigt att odlingen sker i en väl definierad miljö.

Perfusionsodling erbjuder en möjlighet till detta, under förutsättning att den odlingsutrustning som man använder ger en jämn tillförsel av näringsmedium. Odlingskammarens flödesegenskaper är viktiga. ' Om perfusionsodlingar kunde hållas stabila skulle de kunna användas för grundläggande biokemiska studier av olika ani- mala celler, t ex inom medicinsk forskning och för bestäm- ning av akut toxicitet. För att kunna använda cellkulturer för uppföljning av biokemiska förlopp krävs att odlingen sker under mycket stabila förhållanden och detta har hit- tills inte kunna genomföras på ett tillfredsställande sätt. 10 15 20 25 448 881 'Enligt föreliggande uppfinning har stabila perfusionsod- lingar åstadkommits genom en speciellt utformad apparatur som ger ett mycket jämnt och i det närmaste laminärt flö- de. Metoden och apparaturen kommer i det följande att be- skrivas med hänvisning till bifogade sju ritningar, där Fig. l visar en perfusionskammare, där Fig. 2 visar hur apparaturen är hopkopplad, där Fig. 3 visar en schematisk framställning av en syrgas- mätningsutrustning, där Fig. 4 visar exempel på fysikaliska mätparametrar,där Fig. 5 visar effekten av tillsatt hexaklorofen, där Fig. 6 visar effekten av tillsatt KCN och där Fig. 7 visar effekt av Triton X-100 på utflödet av 3H-2-deoxy-D-glykos.

Beskrivning av testsystem Det aktuella testsystemet baseras på odling av neuroblas- toma celler C1300, 41A3 och påverkan på dessa celler mätt som allmänna cellbiologiska eller biokemiska förändringar, som en funktion av substratets innehåll av toxiska substan- ser. Den använda cellinjen lämpar sig väl för sådana mät- ningar då dess biologi och biokemi är väl undersökt.

Stamkulturen odlas i så kallade Costar.plastflaskor i ett kommersiellt substrat Ham's F10 som bl a innehåller 9% serum från nyfödd kalv och 4 % fetalt kalvserum.

Beskrivning av testapparaten Testapparaten består enligt Fig. 1A av en kropp 1, fram- ställd av polykarbonat. Kroppen är utformad med en svarvad 10 15 20 25 448 881 kona 2,3 i vardera änden. På varje konas topp finns en svar- vad försänkning 4,5 och djupet på denna försänkning bestäm- mer perfusionskammarens odlingsvolym. över den svarvade konan 2,3 skjuts en cellskâl 6, 7 med borttaget lock.Konan 2,3 har samma ytterdiameter som skålbottens insida. För tätning mellan kroppen 1 och odlingsskálen 6,7 är en Q-ring 8 anordnad, lämpligen utförd av fluor- eller silikongummi.

Via borrade hål 9,10,1l,l2 i försänkningens 4, 5 periferi förs medium ut resp in i kammaren. Försök med färgade lös- ningar visar att flödet blir i det närmaste laminärt. Ge- nom att kammaren tillverkas i genomskinligt material kan den i monterat skick användas vid ljusmikroskopiska stu- dier.

Anslutningar 13,14 av Luertyp är anordnade till kammaren och till dessa är kopplade slangar 15,16 av silikongummi, vil- ket möjliggör tillfredsställande syrsättning av substratet genom diffusion.

Följande kriterier gäller för perfusionskammaren: (l) Cellerna sås ut och odlas i sin normala miljö.

I detta fall i Falcon odlingsskålar samt i en odlingsinkubator av sedvanlig typ. (2) Kammaren är enkel, praktisk och oöm att handha.

Lösa packningar, skruvar, glas osv har eliminerats. (3) Den är autokïaverbar. (4) Den är billig och enkel att framställa. (5) Den lämpar sig för ljusmikroskopiska studier. (6) Den kan användas i de flesta typer av perfusions- applikationer. »in F! 10 15 20 25 30 448 881 Det är som tidigare nämnts viktigt att flödet i perfusions- cellen blir i det närmaste laminärt så att cellens bioke- miska aktivitet ej störs av turbulent strömning. Ström- ningen i cellen bestäms av kanalerna i cellen och deras diameter och sträckning i perfusionscellen. Följande di- ametrar har t ex befunnits lämpliga. Se Fig. 1 9 2,0 mm 10 2,0 mm 11 2,0 mm 12 2,0 mm 13 4,0 mm 14 4,0 mm Det är vidare viktigt för god strömningsgeometri att kana- len 10-11 har en vinkel mot horisontalplanen som är 5Q°-550 Dessa màtt gäller föfi<¶1apparat med dubbelkammare med en diameter av 46 mm på cellen enligt Fig. l och för de norå mala flödeshastigheterna ca 1 ml/min. Genom att reglera flödeshastigheten kan man se till att laminär strömning erhålles.

Kroppen och kammaren kan ha ett annat.utseende som avviker från Fig. 1, men apparaturen skall innefatta ett slutet rum för perfusionskammaren.

Med den beskrivna apparaturen kan man på ett mycket enkelt sätt utnyttja sig av perfusionsteknik vid cellbiologiska studier och detta är till stor del ett resultat av att skålen ingår som en del i den monterade kammaren. Cellerna behöver inte lossas och förflyttas till ett annat under- lag utan kan växa vidare på sitt vanliga underlag, fast i en miljö som kan hållas konstant tack vare perfusionstek- nik. Tack vare den enkla konstruktionen bör apparaturen kunna tillverkas relativt billigt och därigenom utgöra en 10 15 20 25 448 881 möjlighet för ett ökat användande av perfusionsteknik för cellbiologiska studier. Apparaturen anslutes på ett enkelt sätt medelst slangar och kan lätt flyttas till olika mät- ställen.

Sammanfattningsvis kan konstateras att den beskrivna appa- raturen är enkel i sin konstruktion, vanliga cellodlings- skålar utnyttjas, den bör kunna produceras relativt bil- ligt, den har visat sig ha goda genomflödesegenskaper,den är lämpad för mikroskopiska studier samt att den har vi- sat sig praktiskt användbar i en rad toxikologiska och all- mänt cellbiologiska studier.

Fig. lB visar en kropp 1 för perfusion av endast en skål 2.

Fíg. 2 visar kopplingen av apparaturen. Från ett förlag 17 pumpas mediet medelst en pump 18 genom slangar 19 till per- fusionskammaren 20 via anslutningarna 21,22.

Fig. 3 visar en schematisk uppställning av en syrgasmät- ningsutrustning. Enligt figuren är 23 en behållare, 24 en pump, 25 en anordning för syrsättning av medium via sili- konslang, 26 ett luftlås, 27,28 syrgaselektroder av Clark- typ, 29 en kalibreringsslinga, 30 en odlingskammare(dubbel) 31 ett uppsamlingskärl för förbrukat medium och 32 en skrivare med förstärkarenhet.

Fig. 4 visar exempel på fysikaliska mätparametrar möjliga att införa i ett fler-parametriskt system. Figuren visar uppmätta förändringar då fullständig celldöd inträtt. Pil markerar tillsats av toxisk substans. 10 15 20 25 448 881. 7 kurvorna anger: 1 pH 2 D02 3 ORP 4 Trypan Effekten av tillsats av hexaklorofen på syrgasförbrukning- en framgår av Fig. 5 och Fig. 6 visar effekten av tillsats av KCN på syrgasförbrukningen.

Fig. 7 visar effekt på Triton X-100 på utflödet av 3H-2-deoxy-D-glykos från odlade neuroblastoma celler i per- fusionssystemet. Kurvorna ange kontroll (1), 0,015% (2), 0.022 % (3) och 0.03 % Triton (4).

I diagrammet anger y-axeln log kvarvarande aktivitet i % av total.

De parametrar som kan användas för att studera cellernas tillstånd under perfusion är främst: D02 pH se Fig. 4 se Fig. 4 och 5 Redoxpotential se Fig. 4 Exempel på andra parametrar som kan användas är ATP (adeno- sintrifosfat)-innehåll.och LDH (laktatdehydrogenas)-aktivi- tet i perfusionsvätskan. Dessa fungerar då som indikatorer på membranläckage och koncentrationen av dem kan förväntas öka efter exponering. Ett annat sätt att mäta membranläckage är att studera utflödet av en isotopmärkt markör (Se Exem- pel 5). Man kan ocksâ mäta upptagning av trypanblàtt i döda celler med hjälp av ljusabsorption (se exempel 4 och Fig.4).

Uppfinningen kommer nu att närmare beskrivas genom följan- de genomföringsexempel. 10 15 20 25 448 881 -ɧ§@EÉl_l Jämförelse mellan perfusionsodling i ovan beskrivna cell och en operfunderad kultur Använd cellinje är Neuroblastoma Cl300,substrat F10 enligt Ham, R.G.

Exp Cell REs, 29 (1963)p 515 87%) Kalvserum 9% Fetalt kalvserum 4% Perfusion utfördes i ett recirkulerat system med perfu~ sionsvolym på 100 ml. Perfusionshastigheten var 1 ml/min.

Kulturerna kontrollerades i mikroskop under perfusionsti- den. Efter 7 dygn var koncentrationen av celler i perfun- derade skålar 14 ggr ursprungskoncentrationen. Motsvaran- de siffra för kontrollkulturerna dvs operfunderade kul- turer var 6 ggr.

I perfusionskulturerna sågs inga tecken på att tillväxt- kurvan börjat plana ut. I kontrollkulturerna hade dock till- växten avstannat. Antalet celler per cmz var då försöket avbröts 350 000 i perfusionskulturen.

Eës@eel_ê Effekten av hexaklorofen på syrgasförbrukningen hos neuroblastoma celler Cellinje och substrat som i exempel 1.

Tillsats av heXaklOr0fên skedde vid två tillfällen markerade i Fig.5 Efter 6 minuter från mätningspunkten tillsattes 2,5 pg/ml(1) och efter ytterligare 30 minuter 25 ug(ml (2).

Försöksuppsättningen visas i Fig. 3 och pumphastigheten var 1 ml/min. Försöket visar att systemet på ett mycket 10 15 20 25 448 881 känsligt sätt reglerar 02-upptagningen hos cellerna.

Exempel_3_ Effekt av tillsatts av kaliumcyanid på syrgasförbrukning hos neuroblastomaceller.

Cellinje och substrat lika exempel 2. Odlingsvolym och pump~ hastighet som i exempel 1. Tillsats av KCN l mM skedde 5 min efter mätningsstart.

Effekten framgår av Fig. 6. §ëÉ@EÉl_É_ Bestämning av LDSO-värden genom celldöd uppmätt som absorption av trypanblått Med hjälp av ljusabsorptionsmätningar kan ackumuleringen av Trypanblâtt, (en färgad substans som tas upp i döda celler) beräknas. Det har visat sig att celldöd i neuroblastoma cel- ler korrelerar väl till LDSO-värden erhållna från djurförsök för följande testade substanser: aceton, bensen, n~butanol, t-butanolí dioxan, n-propanol, HgCl2, CH3HgC1, CdCl2, K2cr2o7 óch pp-DDT.

En korrelationskoefficient.på 0.98erhöl1s vid jämförelse.

Eës@2sl_â Läckage av 3H-2-deoxy-D-glykos fràn odlade celler som ett mått på membranskada Substansen 2-deogy-D-glykos (2DG) tas upp av cellen över mem- branet via ett specifikt transportsystem. Inuti cellen om- vandlas 2DG på ett sådant sätt att dess förmåga att passera genom cellmembranet drastiskt minskar. Detta innbär att om 10 15 448 881 10 sodlade celler placeras i en lösning innehållande radioaktivt märkt 2DG kommer radioaktiviteten att anrikas inne i celler- na, medan celler vars membran skadats genom närvaro av (miljö-)toxiska ämnen släpper ut 2DG i lösningen igen. Den i cellen ansamlade radioaktiviteten minskar då. Graden av minskningen kan tas som mått pá cellmembranskadans storlek.

Detta förhållande har utnyttjats i denna metod. Sedan celler- na fått ta upp radioaktivt ZDG under två timmar tvättas icke upptagen radioaktivitet bort, cellerna placeras sedan i perfusionssystemet och perfunderas med en hastighet av 1 ml/min. Uppsamling av perfusatet sker med hjälp av en fraktíonssamlare som byter uppsamlingskärl var 5:e min.

Då radioaktiviteten mäts i perfusionsvätskan finner man att aktiviteten långsamt läcker ut ur cellerna. Detergenten Tri- ton X-100 har använts som modellsubstans för membranska- dande ämnen och man har funnit att utflödet av radioaktivi- tet från odlade neuroblastoma celler ökar i närvaro av Triton. Ökningens storlek är korrelerad till koncentratio- nen Triton (jfr Fig. 7).

Claims (1)

1. _ . 11 448 881 PATENTKRAV 1. Apparatur för genomförandet av perfusionsodling av en eller flera oellkulturer av animalt eller humant ursprung, k ä n n e t e o k- n a d av en företrädesvis oylindrisk kropp (1) av ett före- trädesvis genomskinligt material, företrädesvis plast, i ena änden eller i båda ändarna utformad med en svarvad kona (2,3) med samma ytterdiameter som innerdiametern hos botten på en cir- kulär cellodlingsskål av standardutförande (6,7) med borttaget look, som är avsedd att skjutas över den svarvade konan och bilda en sluten kammare utgörande odlingsutrymme, vilken kona (2,3) har en svervad försänkning (4,5) vid toppen, med borrade hål (9-12) i försänkningens periferi för tillförande resp bort- förande av substrat genom kanaler, förbundna med anslutningar (1s,1s) till ledningar såsom slangar. Apparatur enligt patentkrav 1, k ä n n e t e o k n a d där- av, att kroppen (1) är utformad som en dubbelkon med en kona (2,3) i vardera änden och med en kanal (10-11) som förbinder de båda försänkningarna. Apparatur enligt patentkrav 2, k ä n n e t e c k n a d där- av att kanalen(1D-11) bildar en vinkel av storleksordningen 50-55b med horisontalplanet genom kroppen (1). Apparatur enligt något eller några av patentkraven 1-3, k ä n n e t e c k n a d därav, att kroppen (1) är till- verkad av polykarbonatplast. Apparatur enligt något eller några av patentkraven 1-4, k ä n n e t e c k n a d därav, att kroppen (1) är kopplad till organ (27,28) för syrgasmätning. 12 448 881 9! 10. 11. 12. 13. Apparatur enligt något eller några av patentkraven 1-5, k ä n n e t e c k n a d. därav, att kammaren är ansluten till en pump (18-24),som ger ett Flöde så avpassat att laminär strömning erhålles. Förfarande för perfusionsodling av en eller flera cellkul~ turer av animalt eller humant ursprung, k ä n n e t e c k- n a t därav, att nämnda cellkultur eller kulturer förvaras i odlingsutrymmet i en apparat enligt något eller några av patsntkraven 1-4 och att nämnda eellkultur eller cellkulturer utsättas för ett kontinuerligt företrädesvis laminärt subetrat~ Flöde så att odlingen genomtöree under stabila förhållanden. Förfarande enligt patentkrav 7, k ä n n e t e c k n a t därav, att en cellkultur användes som innehåller neuroblastoma celler. Förfarande enligt patentkraven 7-B, k ä n n e t e c k n a t där- av, att till suhstratflödet tillsättes en testsubstane. Förfarande enligt patentkrav 9, k ä n n e t e c k n a t därav, att förändringen i cellernas syreupptagning bestämmas. Förfarande enligt patentkrav 9, k ä n n e t e o k n a t därav, att förändringen i antalet levande celler bestämmas. Förfarande enligt patentkrav 11, k ä n n e t e c k n a t därav, att antalet döda celler uppmätes som en funktion av en ljusab- sorbtion efter tillsats av ett lämpligt färgämne, töreträdes- vis trypanblått. Förferande enligt patentkrav 10, k ä n n e t e c k n a t därav, att förändringen av eubstratets pH-värde fastställes vid passage av cellerna. 14. 15. 16. 17. 4-48 881 Förfarande enligt patentkrav 10, k ä n n e t e o k n a t därav, att förändringen i redoxpotantial fastställas. Fürfarande enligt patentkraven 7-9, k ä n n e t e c k n a t där- av, att odlade celler placeras i en lösning, innehållande ett ra- dioaktivt märkt ämne som tas upp av cellerna och anrikas i dessa men åter släpps ut i lösningen från celler, vars membran skadats av toxiska ämnen, varefter icke upptaget radioaktivt ämne avlägs- nas, cellerna placeras i perfusionssystemet och perfunderas, ett membranskadande ämne tillsättes, utflödet av radioaktivitet mäts i perfusionsvätskan och ökningen av utflödet av radíoaktivitet användes för bestämning av det tillsatta membranskadande ämnets toxiska verkan. Fürfarande enligt något eller några av patentkraven 7-15, k ä n- n e t e c k n a t därav, att fastställda förändringar utnyttjas för bestämning av toxiciteten på de ämnen som tillförts substratet. Förfarande enligt patentkrav 16, k ä n n e t a c k n a d därav, att fastställda förändringar utnyttjas för framtagning av data på akut toxicitet, motsvarande LDSÜ-värden.