SE461660B - Foerfarande foer analys av receptorers aktivitet hos celler - Google Patents

Description

461 660 L Patienten har skaffat sig en bild av sina symptom, som utgör grunden till anamnesen, vilken tas upp av läkaren. Med utgångspunkt från egna erfarenheter kan patienten ofta ange allergen (t.ex. gräs eller katt) och genom specialkunskaper grundade på kunskaper om sannolika allergen i olika miljöer, årstider etc kan läkaren få en ganska god bild av vilka allergen som är aktuella.

För att objektivisera detta finns det tester att tillgå._ De är av två typer, dels tester på patienten själv (in vivo- tester), dels tester på vävnadsprov, vanligen blodprov, från patienten (in vitro-tester). Dessa är i korthet som följer: In vivo kan den aktuella reaktionen uppnås genom att härma den process, som ger symptomen. Sålunda kan provokation ske genom att patienten andas in allergenet, varvid hösnuva och astma kan utlösas. Man kan droppa allergenet i ögonen och utlösa rinnande ögon etc.

Det vanligaste in vivotestet är dock hudtester, vanligast av dessa är s.k. pricktest, där en droppe av allergen i lösning eller i pulverform appliceras på huden varefter en smal lancett instickes igenom allergenet och underliggande hud.

Efter 20-30 minuter avläses resultatet, som utgöres av en kliande rodnad, vars diameter är ett grovt mått på graden av allergi. I en särskild droppe har vanligtvis också satts en referenssubstans som möjliggör bättre bedömning av reaktionen (histamin).

Testet utföres vanligen på armen, detta för att möjliggöra avsnörning av reaktionen från resten av, kroppen om en kraftig reaktion uppkommer. Man kan då lättare behandla en eventuell generalisering av reaktionen (anafylaktisk chock), vilken kan vara livshotande. 461 660 På detta sätt kan de s.k. typ 1 reaktionerna objektiviseras (hösnuva, vissa former av astma och utslag, röda ögon och överkänslighet mot vissa läkemedel, etc).

I dessa tester får allergenet diffundera in till de celler, som har receptorer på sin yta riktade mot allergenet. Dessa celler är de s.k. mastcellerna i vävnaderna. De har sin motsvarighet i blodbanan i de s.k. basofila leukocyterna, vilka finns i ett lågt antal i förhållande till övriga blodceller ( ca 0,5% av samtliga leukocyter eller vita blodkroppar). _ När mastcellen eller basofilen träffar på ett allergen under vissa förhållanden, tömmer den ut sitt innehåll av små korn, granula, ur vilka sedan histamin frisättes och ger upphov till symptomen när det reagerar med histaminreceptorer på andra celler.

In vítro kan också ett antal tester utföras för att objektivisera en allergi.

Den i Sverige vanligaste metoden är PRISTR-test( Paper Radio Immun Sorbent Test, Pharmacia), vilket innebär att halten av IgE-molekyler mätes. Den är vanligen högre hos allergiker än hos friska. IgE är de molekyler som utgör en del av receptorn på mastceller och basofila leukocyter för allergen. IgE bildas av lymfocyter och särskilt då dessa stimulerats av ett allergen. Lymfocyter släpper ut allergen i kroppsvätskorna och en liten del av dessa fastnar på mastceller och basofila leukocyter (även andra celler i vissa fall). Mindre än 0,l% av IgE är bundet till de reagerande basofila leukocyterna, men det råder sannolikt mycket stor variation i detta mellan olika individer.

Positivt PRIST innebär alltså inte att en allergisk reaktion mätes, utan att man utnyttjar det faktum att många, men inte alla, allergiker har högre IgE-halt i blod än friska. Man kan också mäta halten av specifika IgE för ett stort antal allergen. Testet kallas då RASTR (Pharmacia). Ofta är det 461 660 4 god korrelation mellan RAST och ett utfört pricktest, åtminstone om samma allergen används i de båda testens reagens. - Dessa båda tester används i varierande omfattning för att komplettera anamnes och prícktestning.

Relativt lite blod åtgår för testet, som utnyttjar radiologisk teknik, vilket är vanlig analysteknik på större sjukhus i Sverige. Kostnaden för ett test är dock så hög att oftast endast in vivo-tester görs.

Det finns också andra metoder för invitrotester för allergi.

I forskningssammanhang används mastcellers och basofila leukocyters frisättning av histamin eller annan substans vid kontakt med allergen, men denna metodik är komplicerad och dyrbar, med ofta svârbedömda resultat, eftersom ännu inte halten av histamin i friska människors blod säkert har kunnat bestämmas och det är stora svårigheter att direkt i ett blodprov mäta eventuella förändringar. Man har i praktiskt taget alla beskrivna metoder varit tvungen att först anrika och tvätta cellerna innan reaktion, som sedan korreleras till hur mycket histamin det totalt finns i cellerna, vilket kräver stora blodvolymer per allergen.

I framför allt Frankrike har man också använt sig av teknik, där basofila leukocyter undersökts i allergisammanhang. I korthet har metodiken varit av ungeför följande modell, vilket också gäller om histaminfrisättningsmätníngar gjorts.

Ett blodprov har delats upp i portioner, eventuellt efter ett enklare anrikningssteg. Till varje portion har satts en viss halt av allergen. Vanligtvis har använts 6 portioner om någon ml basofilsuspension till vilka har satts en serie av allergenkoncentrationer (i den mån allergenextraktets verk- samma del kan mätas) från ca 1 ng i steg om en tiopotens till 1 mg. Detta varierar i viss utsträckning med allergenpreparatet, men ett spektrum på 1 miljon koncentrationsenheter har man varit tvungen att täcka in på grund av individuella variationer. Därefter har man väntat i 5 461 660 ca en halvtimme och sedan räknat basofila leukocyter i torkade och färgade blodutstryk i mikroskop.

Pâ grund av stor arbetsinsats har detta inte vunnit större spridning som allergitestmetod, trots att man faktiskt mäter reaktionen hos effektorcellen i allergisjukdomen på ett till sjukhuslaboratorium insänt prov i stället för på patienten som vid pricktest.

På allra senast tiden har ett par publikationer beskrivit användande av cellräknare med stor kapacitet i evalueringen av reaktionen, men fortfarande har blodvolymen blivit stor om många allergen testas, eftersom flera portioner använts för varje testat allergen.

De fördelar som skulle uppnås om basofila leukocyter i blodprov användes i allergidiagnostik är flera: Man studerar i princip samma initiala effektormekanism, som den som utlöser patientens symptom.

Blodprov kan skickas in till laboratorium istället för att patienten tar ledigt från arbetet för att belasta en sjukhusmottagning, som vid pricktest.

Risken för anafylaktisk chock eller andra reaktioner under testningen bortfaller. Vissa läkemedel och andra potentiellt farliga allergen kan testas utan men för patienten.

Endast den egentliga allergiska reaktionen studeras, andra ospecifika reaktioner av annan typ elimineras och diagnosen blir säkrare. gppfinningens ändamål och viktigaste kännetecken Ändamålet med föreliggande uppfinning är att erbjuda ett förfarande, vilket möjliggör klinisk tillämpning av raktioner av det inledningsvis nämnda slaget, t.ex. vid allergidiagnostik, varvid den erforderliga provmängden, 461 een 6 t.ex. blodvolymen, samt arbetsinsatsen för analysens genomförande, skall vara så liten som möjligt och förfarandet skall även lämpa sig för automatisering., Detta har uppnåtts genom att cellerna i ett och samma prov utsätts för en stigande agenskoncentration genom stegvis eller kontinuerlig agenstillsats, varvid cellerna utsätts för optimal agenskoncentration under så lång tid att den avsedda reaktionen medges att äga rum, och att provet därefter analyseras med avseende på reaktionsresultatet: Om agenskoncentrationen sedan överstiger den optimala har ingen betydelse, eftersom celler redan har reagerat.

Teoretisk bakgrund Mekanismen för reaktionen mellan basofila leukocyter och allergen kan beskrivas på följande sätt.

På cellytan finns receptorer för Igß-molekyler, som tillverkas av lymfocyter och frisätts till kroppsvätskorna, som hos alla människor innehåller en liten mängd IgE. Hos allergiker är halten ofta starkt stegrad (jfr PRIST och RAST-test).

Det råder en jämvikt mellan antalet fria IgE-molekyler och antalet till mastcellen och cellen bundna. Varje cell har ett stort antal IgE-receptorer (40-500 000 per cell).

IgE reagerar med allergen så att sammanbindning av flera IgE sker. Både fria och cellbundna IgE binder allergen, men endast de bundna ger fortsatt reaktion.

Halten av receptorer per cell, relativa antalet IgE molekyler som är bundna, förhållandet mellan fria och bundna, IgE:s affinitet till allergen och förmågan till fortsatt reaktion varierar från individ till individ. Detta betyder att mängden allergen som måste tillföras till ett prov med celler eller genom huden vid pricktest, varierar kraftigt med individen. Dessutom mäste både kravet inte för 7 461 een mycket och inte för lite allergen tillgodoses.

Reaktionen mellan allergen och IgE måste ske på följande sätt för att fortsatt reaktion skall utlösas; Varje till cellytan bundet IgE kan reagera med allergenet, men endast en liten del av alla IgE behövs för reaktionen skall ske, kanske tiotals. Den utlösande faktorn är den förändring som sker runt IgE-molekylen i cellmembranet som sker då ett allergen samtidigt binder ihop två eller möjligen flera IgE- molekyler. _ Är det för få allergen i förhållande till IgE kommer inte två IgE att samtidigt kunna binda samma allergen varvid inget vidare sker. Är det för många allergenmolekyler som kan binda IgE, kommer varje IgB att binda allergen, men sannolikheten att två samtidigt skall binda samma allergen minskar. När förhållandet mellan allergen och Igß är optimalt, dvs tvâ eller flera IgE har binds samman av allergen händer följande: Calciumjoner kan läcka in genom ett "hål" i cellmembranet, vilket hålls öppet under kort tid, troligen under sekunder.

Om tillräckligt med calcium kommer in i cellen utlöses mekanismer, som inom några minuter har kastat ut cellens granula ur densamma. Ur dessa frisätts bl.a. histamin och den allergiska reaktionen har startat.

Reaktionen kan registreras på olika sätt, varav ett sätt utgöra av räkning av basofila leukocyter, varvid de degranulerade cellerna ej räknas med. Numera finns automatiska maskiner för räkning av basofila leukocyter, T.ex. TECHNICON H6000. I forskningssammanhang används också metoder, där frisatta substanser mätes som ett mått på reaktionen. Dessa metoder är dock för närvarande arbets- krävande och dyrbara.

Den ovan beskrivna reaktionen sker mycket snabbt och det kritiska i den är att sammanbindning av minst två IgE per allergen måste ske. Denna bindning är en mycket snabb 461 660 3 reaktion, medan frisättningen av histamin sedan tar några minuter. När cellen väl reagerat är den tom på granula och kan inte vidare reagera eller (såvitt man vet åtminstone på människa) ej snabbt ta upp granula igen. Det gör då inget om allergenkoncentrationen är för hög om reaktionen redan skett.

Detta innebär att cellerna kan utsättas för en stigande allergenkoncentration i ett och samma blodprov om bara den tid som optimalt allergenkoncentrationsíntervall passeras är tillräckligt lång, men_inte för lång för då kan möjligen reaktionen inhiberas. Således. bör optimalt intervall passeras på nâgra minuter, varefter allergenet kan stiga mycket höga nivåer utan att redan skedd degranulering påverkas. Detta efterliknar den naturliga processen i kroppen, då allergenet diffunderar till receptorn.

Exempel på praktiska lösningar av den uppfinningsenliga metoden l. Manuell eller automatisk pipettering av stigande allergenkoncentration till ett blodprov med tidsintervall mellan pipetteringarna.

Från patienten tages i Vacutainerrör med EDTA-tillsats 10 ml blod, som blandas genom att vagga röret. Till denna blodvolym sättes 25 ul Heparinlösning (Lövens injektionsvätska Heparin S000 IE/ml, spådd till 50018 per ml med fysiologisk koksalt).

Röret vaggas till blandning skett. I vissa fall kan upp till en vecka gammalt EDTA-blod användas om provet Eörvarats i kylskåp, eventuellt efter tillsats av vissa näringssubstrat.

Blodet delas upp i portioner om 300 ul i varje i lämpliga rör, t.ex polyetylenrör. 10 ml räcker till ca 30 portioner och därmed principiellt till 30 allergitestningar. Till ett av rören sättes 20 ul av 0,6M CaCl2 cch eventuellt 0,3 M Mgclg-lösning. 9 461 660 Till ett annat rör göres ej denna tillsats (kontrollrör).

Allergen, t.ex. från DOMÉ (pricktestlösning, t.ex. 5-gräs 4000 PNU/ml i 50% glycerin) spädes i ett antal rör enligt följande.

Spädningslösning Albuminlösning 16 g/1 (Kabi, albumin 200mg/ml spådd med Eysilogisk koksalt, sterilt utfört).

Lösning 6: Extraktet spätt l+l med spädningslösning Lösning S: Ovanstående spådd l+9 med spädningslösning Lösning 4: Ovanstående (5) spädd l+9 med spädningslösning Lösning 3: Ovanstående (4) spädd l+9 med spädningslösning Lösning 2: Ovanstående (3) spådd l+9 med spädningslösning Lösning 1: Ovanstående (2) spädd l+9 med spädningslösning Eventuell ytterligare spädning kan vara nödvändig.

Blodproven placeras i vattenbad 37OC. 20 ul av dessa lösningar sättes sedan till de två provrören i vattenbadet med ett intervall av några minuter mellan varje tillsats med början av den mest spädda lösningen. När den mest koncentrerade lösningen också reagerat i någon minut avbrytes reaktionen med ett överskott av EDTA-lösning, t.ex. 50 ul 10% KBEDTA i vatten, varvid kalciumjoner binds.

Rören placeras sedan i en TECHNICON H6000 - maskin eller i annan detektor, som kan mäta reaktionen.

Positiv test innebär att patientens basofila leukocyter har minskat i antal, ofta helt försvunnit, såsom detektorn' ser dem. (I kontrollröret utan kalciumjoner har antalet ej minskat). 2. Automatisk allergentillsats i Elödessystem. 461 660 I” En "continuous-flow"-utrustning kopplas ihop så att blodprov sugs in i en slang med viss hastighet (t.ex. 500 ul/minut) och sedan passerar förbi "stationer" med tillsatser av Ca-Mg lösning och allergen i stigande koncentration med vissa tidsintervall. När provet kommer ut i andra ändan på system har även EDTA-tillsättning skett och provet kan samlas upp i ett rör som sedan placeras i detektorn.

Härvid kan man tänka sig att gör en direktkoppling till ett automatiskt detektorsystem, t.ex. till basofilkanalen hos en HGOOO-maskin. . 3. Kontinuerlig tillsats av allergen genom diffusion, eluering eller kemisk reaktion till blodprovet.

På en lämplig bärare t.ex. en sticka av inert plastmaterial placeras i ena ändan en anordning, som kontinuerligt släpper ifrån sig allt högre koncentrationer av allergen eller annat agens vid andra receptoranalyser, som bygger på denna princip.

Frisättningen måste ske så att det optimala intervallet passeras under tillräckligt men ej för lång tid. En Rsticka lämplig för ändamålet kan tillverkas av t.ex. GELBOND eller ritfilm vars ena sida är hydrofil. Till denna yta kan agaros bindas. Agarosen kan sedan användas för att binda allergenlösning, varvid allergenet diffunderar in i agarosen. Placeras ytterligare, ev mera koncentrerad agaros eller gelatin ovanpå den tidigare agarosen, efter det att denna torkat in, kan genom diffusion en koncentrations- gradient uppnås inom ett mycket tunt agaroskikt, när allt torkat efter den andra diffusionen. Ovanpå denna kan sedan t.ex. gelatin, där en svagare koncentration =a1lergen placerats, också torkas in. Placeras denna sticka i ett rör med blod eller suspension av celler i ilämplig vätska från allergiker, kan om lämplig agaroskonc etc används en degranuleringsreaktion komma till stånd. Till provet sättes också calcium (eller redan på stickan i snabblöslig form), varefter stickan placeras i röret under viss tid. Den tas ih H 461 660 därefter bort och efter ev. EDTA-tillsats är provet färdigt för detektorn. Denna metod efterliknar diffusionen av allergen till mastcellerna vid pricktest.

Exempel på tillverkning av sticka testad för gräs, lövträd, prästkrage, kvalster, damm, katt och häst på ett antal allergiker.

DOMB pricktestallergen som ovan används, taget direkt ur förpackning. _ Varm 0,25% agaroslösning (SEAKEM) i vatten hälles ut på hydrofob yta som är vågrätt placerad till ett skikt av ca 3 mm. Efter stelníng, utstansas cylindrar med samma diameter som bredden på Gelbond(R)-stickan och placeras alldeles vid ena ändan på hydrofila sidan. På denna gelcylinder placeras "l av aktuell pricktestlösning och detta får diffundera medan en Värmefläkt används för att försiktigt torka gelen eller den läggs så att gelen hänger uppochned över en bordskant och torkas. När cylinderna torkat in till en fläck, placeras en likadan cylinder ovanpå fläcken och industningssteget med samtidig tillbakadiffusion av allergen upprepas. Stickan är klar för användning.

Tag t.ex. 400 ul blod med tillsatser eller cellsuspension.

Tillsätt Calciumlösning enligt tidigare beskriven manuell metod 20 ul 0,6 M Ca och eventuellt 0,3 M Mg. Placera röret i vattenbad 37OC. Placera en sticka i röret och skaka då och då röret eller rör om med stickan så att blodet får kontakt med hela agarosytan åtminstone i kortare perioder. Tag ur stickan efter ca 30 minuter och sätt till EDTA för att bryta reaktionen genom att binda calcium. Röret placeras därefter i detektorn. Positiv reaktion som ovan beskrivits.

Den i exemplet angivna stickan har testats genom att radioaktivt märkt protein, med molvíkt 22 000 (de flesta allergen ligger i storlek här) fått diffundera ut i blod som beskrivits. Efter 30 minuter var 90% av radioaktiviteten utanför stickan, efter 5 minuter ungefär en tredjedel. Genom lz 461 660 modifieringen av bindningssubstans, eventuell protein- bindning, av allergen etc. kan detta varieras.

Kontinuerlig tillsats genom diffusion eller elnering kan även ske från substans som själv löses upp i blodet. Det enklaste är en "tablett" gjord av t.ex. gelatin, vilken helt löses upp och försvinner som ett tecken på att reaktionen är slut.

Allergenet kan även vara bundet till ett olösligt ämne, t.ex. en tablett av typ “slow release", vanlig i läkemedels- sammanhang. ' Allergenet kan även lösas ut frân röret självt eller från en kork som passar i röret, vilket efter korkning vänds upp och ned för reaktion och sedan efter "avkorkning" placeras i detektorn.

Man kan även tänka sig en kork som passar till röret och som är utformad som en behållare. Korken är fästat en pappers- remsa eller en kapillär som innehåller ett absorberande material, t.ex. en träd som indränkts i allergenlösning med lämpliga tillsatser och torkats. Röret med blod korkas med denna anordning. Kapillären skall nå ned till blodet.

Elueringslösning hälls sedan i korken och sugs upp av träden, varvid allergenet successivt friges i andra av kapillären till blodet.

Allergenet kan även tillsättas provet kemiskt bundet till t.ex. ett protein, från vilket det successivt Eriges till provet genom kemisk reaktion.

Den uppfinningsenliga metoden är naturligtvis inte begränsad till de ovan beskrivna utföringsexemplen och till basofila leukocyters 'reaktion med allergen. Exempel på andra sjukdomstillstånd som kan diagnosticeras med metoden ifråga är bindvävssjukdomar och rheumatoid artrit, varvid man använder sig av basofila leukocyters reaktion med cellkärne- extrakt eller renfiramställda DNA-molekyler. Andra (q '3 461 een tíllämpningsområden kan vara studium av neutrofila leukocyters bakteriedödande förmåga hos patienter med defekt immunförsvar (t.ex. kronisk granulomatös sjukdom, myeloperoxídasbrist m.m.)' samt trombocyters reaktion på stimuli av typ kollagen eller av proteaskaskadsystemens produkter.

Claims (4)

461 660 PATENTKRAV

1. Förfarande för analys av receptorers aktivitet i ett antal prov vardera innehållande vissa vävnadsceller, t.ex. blodceller, där den avsedda reaktionen sker vid ett visst, exempelvis för olika individer varierande\optimalt förhållande mellan koncentrationerna av receptor och det agens som receptorn interagerar med, medan en för låg koncentration icke ger en adekvat reafíion och en' för hög koncentration tenderar att störa reaktionen, så att ett korrekt resultat ej upp- nås, varvid förfarandet innefattar tillsättande av ett agens till sagda prov inne- hållande celler, vars reaktion skall analyseras, och efter det att reaktionen ägt rum i respektive prov analys företages av detsamma för bestämning av resulta- tet av receptorernas aktivitet, k ä n n e t e c k n a t d ä r a v, att tillsät- tande av agenset sker stegvis eller kontinuerligt upp till en viss förutbestämd och i en i huvudsak för proven gemensam slutkoncentration, som är så hög att den erfarenhetsmässigt fastställda högsta, för en adekvat reaktion erforderliga koncentrationen vid provinnehåll av det slag, som skall analyseras, uppnås eller överskrides, och att detta sker i ett tidsförlopp som är så utdraget i förhållande till receptorernas reaktionshastighet vid sagda aktivitet, att under det utdragna tidsförloppet av stigande agenskoncentratíon, cellerna utsätts för en agenskon- centration, som befinner sig så nära den för uppnående av en adekvat reaktion optimala agenskoncentrationen under en så lång tid av tidsförloppet att den av- sedda reaktionen medges äga rum väsentligen utan störning genom det under det utdragna tidsförloppet fortsatta tillsättandet av agenset, så att den slutliga analysen kommer att avse cellernas reaktion uppkommen vid sagda optimala för- hållande mellan koncentrationerna av receptor och agens trots den variation i sagda koncentration, som kan förekomma inom serien av sagda prov och trots att den optimala koncentrationen ej fastställts i förväg för de enskilda proverna.

2. Förfarande enligt patentkrav 1, där receptorerna utgörs av IgE-moleky- ler bundna till cellytan hos basofila leukocyter och agenset av allergenpartiklar eller -molekyler och där vid positivt resultat, vid ett visst optimalt förhållande mellan IgE-molekyler och allergen sker en av vissa joner, t.ex. Ca2+ , initierad basofil degranulering av cellerna med åtföljande frisättning av histamin, k ä n - n e t e c k n a t d ä r a v, att till provet, som är ett blodprov eller annat vävnadsprov eller cellsuspension i lämpligt medium, tillsättes stegvis eller kon- tinuerligt allergen så att koncentrationen av detta successivt ökas i provet till /Zlfi 461 660 den förutbestämda koncentrationen, och att sagda koncentrationsökning genom- förs medelst sagda utdragna tidsförlopp under så lång tid, att den avsedda reaktionen medges äga rum vid i huvudsak optimal allergenkoncentration, varvid efter avslutad tillsats analys av provet genomförs genom klassificering av baso- fila leukocyter med avseende på deras granulering eller alternativt genom mät- ning av histamin eller andra substanser, som frisätts vid degranuleringen, eller deras effekt på andra mätbara skeenden.

3. ' Förfarande enligt patentkrav 1 eller 2, k ä n n e t e c k n a t d ä r a v, att tillsättande sker, så att en progressivt stigande koncentration erhålles före- trädesvis en koncentrationsstegring enligt en logaritmisk kurva.

4. För-farande enligt patentkrav 1, 2 eller 3, k ä n n e t e c k n a t_ d ä r - a v, att agenset tillsätts provet bundet såsom en kropp från vilken det successivt friges exempelvis genåm diffusion, eluering, upplösning eller kemisk reaktion.