SE461660B - Foerfarande foer analys av receptorers aktivitet hos celler - Google Patents
Foerfarande foer analys av receptorers aktivitet hos cellerInfo
- Publication number
- SE461660B SE461660B SE8302190A SE8302190A SE461660B SE 461660 B SE461660 B SE 461660B SE 8302190 A SE8302190 A SE 8302190A SE 8302190 A SE8302190 A SE 8302190A SE 461660 B SE461660 B SE 461660B
- Authority
- SE
- Sweden
- Prior art keywords
- reaction
- concentration
- allergen
- sample
- agent
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 22
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title claims description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims 5
- 239000013566 allergen Substances 0.000 claims description 69
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 48
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 31
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 29
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 29
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 210000003912 basophilic leucocyte Anatomy 0.000 claims description 16
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 15
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 12
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 12
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 claims description 10
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 claims description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 6
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 3
- -1 Ca2 + Chemical class 0.000 claims description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 claims 3
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 claims 1
- 238000005469 granulation Methods 0.000 claims 1
- 230000003179 granulation Effects 0.000 claims 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 32
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 28
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 18
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 14
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 13
- 229960004784 allergens Drugs 0.000 description 12
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 8
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 8
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 8
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 7
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000007799 cork Substances 0.000 description 4
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 3
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 3
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- 208000035285 Allergic Seasonal Rhinitis Diseases 0.000 description 2
- 206010002199 Anaphylactic shock Diseases 0.000 description 2
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 2
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 2
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 1
- 244000260524 Chrysanthemum balsamita Species 0.000 description 1
- 235000005633 Chrysanthemum balsamita Nutrition 0.000 description 1
- 102100025621 Cytochrome b-245 heavy chain Human genes 0.000 description 1
- 208000010201 Exanthema Diseases 0.000 description 1
- 102000000543 Histamine Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010002059 Histamine Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009438 IgE Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010073816 IgE Receptors Proteins 0.000 description 1
- 206010029719 Nonspecific reaction Diseases 0.000 description 1
- 102000016979 Other receptors Human genes 0.000 description 1
- 241000282320 Panthera leo Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 208000003251 Pruritus Diseases 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 229940074608 allergen extract Drugs 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 208000016532 chronic granulomatous disease Diseases 0.000 description 1
- 208000018631 connective tissue disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 201000005884 exanthem Diseases 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000005661 hydrophobic surface Effects 0.000 description 1
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 238000009940 knitting Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 208000000638 myeloperoxidase deficiency Diseases 0.000 description 1
- 210000004493 neutrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 206010037844 rash Diseases 0.000 description 1
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 1
- 230000008023 solidification Effects 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5091—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing the pathological state of an organism
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Physiology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
461 660 L Patienten har skaffat sig en bild av sina symptom, som utgör grunden till anamnesen, vilken tas upp av läkaren. Med utgångspunkt från egna erfarenheter kan patienten ofta ange allergen (t.ex. gräs eller katt) och genom specialkunskaper grundade på kunskaper om sannolika allergen i olika miljöer, årstider etc kan läkaren få en ganska god bild av vilka allergen som är aktuella.
För att objektivisera detta finns det tester att tillgå._ De är av två typer, dels tester på patienten själv (in vivo- tester), dels tester på vävnadsprov, vanligen blodprov, från patienten (in vitro-tester). Dessa är i korthet som följer: In vivo kan den aktuella reaktionen uppnås genom att härma den process, som ger symptomen. Sålunda kan provokation ske genom att patienten andas in allergenet, varvid hösnuva och astma kan utlösas. Man kan droppa allergenet i ögonen och utlösa rinnande ögon etc.
Det vanligaste in vivotestet är dock hudtester, vanligast av dessa är s.k. pricktest, där en droppe av allergen i lösning eller i pulverform appliceras på huden varefter en smal lancett instickes igenom allergenet och underliggande hud.
Efter 20-30 minuter avläses resultatet, som utgöres av en kliande rodnad, vars diameter är ett grovt mått på graden av allergi. I en särskild droppe har vanligtvis också satts en referenssubstans som möjliggör bättre bedömning av reaktionen (histamin).
Testet utföres vanligen på armen, detta för att möjliggöra avsnörning av reaktionen från resten av, kroppen om en kraftig reaktion uppkommer. Man kan då lättare behandla en eventuell generalisering av reaktionen (anafylaktisk chock), vilken kan vara livshotande. 461 660 På detta sätt kan de s.k. typ 1 reaktionerna objektiviseras (hösnuva, vissa former av astma och utslag, röda ögon och överkänslighet mot vissa läkemedel, etc).
I dessa tester får allergenet diffundera in till de celler, som har receptorer på sin yta riktade mot allergenet. Dessa celler är de s.k. mastcellerna i vävnaderna. De har sin motsvarighet i blodbanan i de s.k. basofila leukocyterna, vilka finns i ett lågt antal i förhållande till övriga blodceller ( ca 0,5% av samtliga leukocyter eller vita blodkroppar). _ När mastcellen eller basofilen träffar på ett allergen under vissa förhållanden, tömmer den ut sitt innehåll av små korn, granula, ur vilka sedan histamin frisättes och ger upphov till symptomen när det reagerar med histaminreceptorer på andra celler.
In vítro kan också ett antal tester utföras för att objektivisera en allergi.
Den i Sverige vanligaste metoden är PRISTR-test( Paper Radio Immun Sorbent Test, Pharmacia), vilket innebär att halten av IgE-molekyler mätes. Den är vanligen högre hos allergiker än hos friska. IgE är de molekyler som utgör en del av receptorn på mastceller och basofila leukocyter för allergen. IgE bildas av lymfocyter och särskilt då dessa stimulerats av ett allergen. Lymfocyter släpper ut allergen i kroppsvätskorna och en liten del av dessa fastnar på mastceller och basofila leukocyter (även andra celler i vissa fall). Mindre än 0,l% av IgE är bundet till de reagerande basofila leukocyterna, men det råder sannolikt mycket stor variation i detta mellan olika individer.
Positivt PRIST innebär alltså inte att en allergisk reaktion mätes, utan att man utnyttjar det faktum att många, men inte alla, allergiker har högre IgE-halt i blod än friska. Man kan också mäta halten av specifika IgE för ett stort antal allergen. Testet kallas då RASTR (Pharmacia). Ofta är det 461 660 4 god korrelation mellan RAST och ett utfört pricktest, åtminstone om samma allergen används i de båda testens reagens. - Dessa båda tester används i varierande omfattning för att komplettera anamnes och prícktestning.
Relativt lite blod åtgår för testet, som utnyttjar radiologisk teknik, vilket är vanlig analysteknik på större sjukhus i Sverige. Kostnaden för ett test är dock så hög att oftast endast in vivo-tester görs.
Det finns också andra metoder för invitrotester för allergi.
I forskningssammanhang används mastcellers och basofila leukocyters frisättning av histamin eller annan substans vid kontakt med allergen, men denna metodik är komplicerad och dyrbar, med ofta svârbedömda resultat, eftersom ännu inte halten av histamin i friska människors blod säkert har kunnat bestämmas och det är stora svårigheter att direkt i ett blodprov mäta eventuella förändringar. Man har i praktiskt taget alla beskrivna metoder varit tvungen att först anrika och tvätta cellerna innan reaktion, som sedan korreleras till hur mycket histamin det totalt finns i cellerna, vilket kräver stora blodvolymer per allergen.
I framför allt Frankrike har man också använt sig av teknik, där basofila leukocyter undersökts i allergisammanhang. I korthet har metodiken varit av ungeför följande modell, vilket också gäller om histaminfrisättningsmätníngar gjorts.
Ett blodprov har delats upp i portioner, eventuellt efter ett enklare anrikningssteg. Till varje portion har satts en viss halt av allergen. Vanligtvis har använts 6 portioner om någon ml basofilsuspension till vilka har satts en serie av allergenkoncentrationer (i den mån allergenextraktets verk- samma del kan mätas) från ca 1 ng i steg om en tiopotens till 1 mg. Detta varierar i viss utsträckning med allergenpreparatet, men ett spektrum på 1 miljon koncentrationsenheter har man varit tvungen att täcka in på grund av individuella variationer. Därefter har man väntat i 5 461 660 ca en halvtimme och sedan räknat basofila leukocyter i torkade och färgade blodutstryk i mikroskop.
Pâ grund av stor arbetsinsats har detta inte vunnit större spridning som allergitestmetod, trots att man faktiskt mäter reaktionen hos effektorcellen i allergisjukdomen på ett till sjukhuslaboratorium insänt prov i stället för på patienten som vid pricktest.
På allra senast tiden har ett par publikationer beskrivit användande av cellräknare med stor kapacitet i evalueringen av reaktionen, men fortfarande har blodvolymen blivit stor om många allergen testas, eftersom flera portioner använts för varje testat allergen.
De fördelar som skulle uppnås om basofila leukocyter i blodprov användes i allergidiagnostik är flera: Man studerar i princip samma initiala effektormekanism, som den som utlöser patientens symptom.
Blodprov kan skickas in till laboratorium istället för att patienten tar ledigt från arbetet för att belasta en sjukhusmottagning, som vid pricktest.
Risken för anafylaktisk chock eller andra reaktioner under testningen bortfaller. Vissa läkemedel och andra potentiellt farliga allergen kan testas utan men för patienten.
Endast den egentliga allergiska reaktionen studeras, andra ospecifika reaktioner av annan typ elimineras och diagnosen blir säkrare. gppfinningens ändamål och viktigaste kännetecken Ändamålet med föreliggande uppfinning är att erbjuda ett förfarande, vilket möjliggör klinisk tillämpning av raktioner av det inledningsvis nämnda slaget, t.ex. vid allergidiagnostik, varvid den erforderliga provmängden, 461 een 6 t.ex. blodvolymen, samt arbetsinsatsen för analysens genomförande, skall vara så liten som möjligt och förfarandet skall även lämpa sig för automatisering., Detta har uppnåtts genom att cellerna i ett och samma prov utsätts för en stigande agenskoncentration genom stegvis eller kontinuerlig agenstillsats, varvid cellerna utsätts för optimal agenskoncentration under så lång tid att den avsedda reaktionen medges att äga rum, och att provet därefter analyseras med avseende på reaktionsresultatet: Om agenskoncentrationen sedan överstiger den optimala har ingen betydelse, eftersom celler redan har reagerat.
Teoretisk bakgrund Mekanismen för reaktionen mellan basofila leukocyter och allergen kan beskrivas på följande sätt.
På cellytan finns receptorer för Igß-molekyler, som tillverkas av lymfocyter och frisätts till kroppsvätskorna, som hos alla människor innehåller en liten mängd IgE. Hos allergiker är halten ofta starkt stegrad (jfr PRIST och RAST-test).
Det råder en jämvikt mellan antalet fria IgE-molekyler och antalet till mastcellen och cellen bundna. Varje cell har ett stort antal IgE-receptorer (40-500 000 per cell).
IgE reagerar med allergen så att sammanbindning av flera IgE sker. Både fria och cellbundna IgE binder allergen, men endast de bundna ger fortsatt reaktion.
Halten av receptorer per cell, relativa antalet IgE molekyler som är bundna, förhållandet mellan fria och bundna, IgE:s affinitet till allergen och förmågan till fortsatt reaktion varierar från individ till individ. Detta betyder att mängden allergen som måste tillföras till ett prov med celler eller genom huden vid pricktest, varierar kraftigt med individen. Dessutom mäste både kravet inte för 7 461 een mycket och inte för lite allergen tillgodoses.
Reaktionen mellan allergen och IgE måste ske på följande sätt för att fortsatt reaktion skall utlösas; Varje till cellytan bundet IgE kan reagera med allergenet, men endast en liten del av alla IgE behövs för reaktionen skall ske, kanske tiotals. Den utlösande faktorn är den förändring som sker runt IgE-molekylen i cellmembranet som sker då ett allergen samtidigt binder ihop två eller möjligen flera IgE- molekyler. _ Är det för få allergen i förhållande till IgE kommer inte två IgE att samtidigt kunna binda samma allergen varvid inget vidare sker. Är det för många allergenmolekyler som kan binda IgE, kommer varje IgB att binda allergen, men sannolikheten att två samtidigt skall binda samma allergen minskar. När förhållandet mellan allergen och Igß är optimalt, dvs tvâ eller flera IgE har binds samman av allergen händer följande: Calciumjoner kan läcka in genom ett "hål" i cellmembranet, vilket hålls öppet under kort tid, troligen under sekunder.
Om tillräckligt med calcium kommer in i cellen utlöses mekanismer, som inom några minuter har kastat ut cellens granula ur densamma. Ur dessa frisätts bl.a. histamin och den allergiska reaktionen har startat.
Reaktionen kan registreras på olika sätt, varav ett sätt utgöra av räkning av basofila leukocyter, varvid de degranulerade cellerna ej räknas med. Numera finns automatiska maskiner för räkning av basofila leukocyter, T.ex. TECHNICON H6000. I forskningssammanhang används också metoder, där frisatta substanser mätes som ett mått på reaktionen. Dessa metoder är dock för närvarande arbets- krävande och dyrbara.
Den ovan beskrivna reaktionen sker mycket snabbt och det kritiska i den är att sammanbindning av minst två IgE per allergen måste ske. Denna bindning är en mycket snabb 461 660 3 reaktion, medan frisättningen av histamin sedan tar några minuter. När cellen väl reagerat är den tom på granula och kan inte vidare reagera eller (såvitt man vet åtminstone på människa) ej snabbt ta upp granula igen. Det gör då inget om allergenkoncentrationen är för hög om reaktionen redan skett.
Detta innebär att cellerna kan utsättas för en stigande allergenkoncentration i ett och samma blodprov om bara den tid som optimalt allergenkoncentrationsíntervall passeras är tillräckligt lång, men_inte för lång för då kan möjligen reaktionen inhiberas. Således. bör optimalt intervall passeras på nâgra minuter, varefter allergenet kan stiga mycket höga nivåer utan att redan skedd degranulering påverkas. Detta efterliknar den naturliga processen i kroppen, då allergenet diffunderar till receptorn.
Exempel på praktiska lösningar av den uppfinningsenliga metoden l. Manuell eller automatisk pipettering av stigande allergenkoncentration till ett blodprov med tidsintervall mellan pipetteringarna.
Från patienten tages i Vacutainerrör med EDTA-tillsats 10 ml blod, som blandas genom att vagga röret. Till denna blodvolym sättes 25 ul Heparinlösning (Lövens injektionsvätska Heparin S000 IE/ml, spådd till 50018 per ml med fysiologisk koksalt).
Röret vaggas till blandning skett. I vissa fall kan upp till en vecka gammalt EDTA-blod användas om provet Eörvarats i kylskåp, eventuellt efter tillsats av vissa näringssubstrat.
Blodet delas upp i portioner om 300 ul i varje i lämpliga rör, t.ex polyetylenrör. 10 ml räcker till ca 30 portioner och därmed principiellt till 30 allergitestningar. Till ett av rören sättes 20 ul av 0,6M CaCl2 cch eventuellt 0,3 M Mgclg-lösning. 9 461 660 Till ett annat rör göres ej denna tillsats (kontrollrör).
Allergen, t.ex. från DOMÉ (pricktestlösning, t.ex. 5-gräs 4000 PNU/ml i 50% glycerin) spädes i ett antal rör enligt följande.
Spädningslösning Albuminlösning 16 g/1 (Kabi, albumin 200mg/ml spådd med Eysilogisk koksalt, sterilt utfört).
Lösning 6: Extraktet spätt l+l med spädningslösning Lösning S: Ovanstående spådd l+9 med spädningslösning Lösning 4: Ovanstående (5) spädd l+9 med spädningslösning Lösning 3: Ovanstående (4) spädd l+9 med spädningslösning Lösning 2: Ovanstående (3) spådd l+9 med spädningslösning Lösning 1: Ovanstående (2) spädd l+9 med spädningslösning Eventuell ytterligare spädning kan vara nödvändig.
Blodproven placeras i vattenbad 37OC. 20 ul av dessa lösningar sättes sedan till de två provrören i vattenbadet med ett intervall av några minuter mellan varje tillsats med början av den mest spädda lösningen. När den mest koncentrerade lösningen också reagerat i någon minut avbrytes reaktionen med ett överskott av EDTA-lösning, t.ex. 50 ul 10% KBEDTA i vatten, varvid kalciumjoner binds.
Rören placeras sedan i en TECHNICON H6000 - maskin eller i annan detektor, som kan mäta reaktionen.
Positiv test innebär att patientens basofila leukocyter har minskat i antal, ofta helt försvunnit, såsom detektorn' ser dem. (I kontrollröret utan kalciumjoner har antalet ej minskat). 2. Automatisk allergentillsats i Elödessystem. 461 660 I” En "continuous-flow"-utrustning kopplas ihop så att blodprov sugs in i en slang med viss hastighet (t.ex. 500 ul/minut) och sedan passerar förbi "stationer" med tillsatser av Ca-Mg lösning och allergen i stigande koncentration med vissa tidsintervall. När provet kommer ut i andra ändan på system har även EDTA-tillsättning skett och provet kan samlas upp i ett rör som sedan placeras i detektorn.
Härvid kan man tänka sig att gör en direktkoppling till ett automatiskt detektorsystem, t.ex. till basofilkanalen hos en HGOOO-maskin. . 3. Kontinuerlig tillsats av allergen genom diffusion, eluering eller kemisk reaktion till blodprovet.
På en lämplig bärare t.ex. en sticka av inert plastmaterial placeras i ena ändan en anordning, som kontinuerligt släpper ifrån sig allt högre koncentrationer av allergen eller annat agens vid andra receptoranalyser, som bygger på denna princip.
Frisättningen måste ske så att det optimala intervallet passeras under tillräckligt men ej för lång tid. En Rsticka lämplig för ändamålet kan tillverkas av t.ex. GELBOND eller ritfilm vars ena sida är hydrofil. Till denna yta kan agaros bindas. Agarosen kan sedan användas för att binda allergenlösning, varvid allergenet diffunderar in i agarosen. Placeras ytterligare, ev mera koncentrerad agaros eller gelatin ovanpå den tidigare agarosen, efter det att denna torkat in, kan genom diffusion en koncentrations- gradient uppnås inom ett mycket tunt agaroskikt, när allt torkat efter den andra diffusionen. Ovanpå denna kan sedan t.ex. gelatin, där en svagare koncentration =a1lergen placerats, också torkas in. Placeras denna sticka i ett rör med blod eller suspension av celler i ilämplig vätska från allergiker, kan om lämplig agaroskonc etc används en degranuleringsreaktion komma till stånd. Till provet sättes också calcium (eller redan på stickan i snabblöslig form), varefter stickan placeras i röret under viss tid. Den tas ih H 461 660 därefter bort och efter ev. EDTA-tillsats är provet färdigt för detektorn. Denna metod efterliknar diffusionen av allergen till mastcellerna vid pricktest.
Exempel på tillverkning av sticka testad för gräs, lövträd, prästkrage, kvalster, damm, katt och häst på ett antal allergiker.
DOMB pricktestallergen som ovan används, taget direkt ur förpackning. _ Varm 0,25% agaroslösning (SEAKEM) i vatten hälles ut på hydrofob yta som är vågrätt placerad till ett skikt av ca 3 mm. Efter stelníng, utstansas cylindrar med samma diameter som bredden på Gelbond(R)-stickan och placeras alldeles vid ena ändan på hydrofila sidan. På denna gelcylinder placeras "l av aktuell pricktestlösning och detta får diffundera medan en Värmefläkt används för att försiktigt torka gelen eller den läggs så att gelen hänger uppochned över en bordskant och torkas. När cylinderna torkat in till en fläck, placeras en likadan cylinder ovanpå fläcken och industningssteget med samtidig tillbakadiffusion av allergen upprepas. Stickan är klar för användning.
Tag t.ex. 400 ul blod med tillsatser eller cellsuspension.
Tillsätt Calciumlösning enligt tidigare beskriven manuell metod 20 ul 0,6 M Ca och eventuellt 0,3 M Mg. Placera röret i vattenbad 37OC. Placera en sticka i röret och skaka då och då röret eller rör om med stickan så att blodet får kontakt med hela agarosytan åtminstone i kortare perioder. Tag ur stickan efter ca 30 minuter och sätt till EDTA för att bryta reaktionen genom att binda calcium. Röret placeras därefter i detektorn. Positiv reaktion som ovan beskrivits.
Den i exemplet angivna stickan har testats genom att radioaktivt märkt protein, med molvíkt 22 000 (de flesta allergen ligger i storlek här) fått diffundera ut i blod som beskrivits. Efter 30 minuter var 90% av radioaktiviteten utanför stickan, efter 5 minuter ungefär en tredjedel. Genom lz 461 660 modifieringen av bindningssubstans, eventuell protein- bindning, av allergen etc. kan detta varieras.
Kontinuerlig tillsats genom diffusion eller elnering kan även ske från substans som själv löses upp i blodet. Det enklaste är en "tablett" gjord av t.ex. gelatin, vilken helt löses upp och försvinner som ett tecken på att reaktionen är slut.
Allergenet kan även vara bundet till ett olösligt ämne, t.ex. en tablett av typ “slow release", vanlig i läkemedels- sammanhang. ' Allergenet kan även lösas ut frân röret självt eller från en kork som passar i röret, vilket efter korkning vänds upp och ned för reaktion och sedan efter "avkorkning" placeras i detektorn.
Man kan även tänka sig en kork som passar till röret och som är utformad som en behållare. Korken är fästat en pappers- remsa eller en kapillär som innehåller ett absorberande material, t.ex. en träd som indränkts i allergenlösning med lämpliga tillsatser och torkats. Röret med blod korkas med denna anordning. Kapillären skall nå ned till blodet.
Elueringslösning hälls sedan i korken och sugs upp av träden, varvid allergenet successivt friges i andra av kapillären till blodet.
Allergenet kan även tillsättas provet kemiskt bundet till t.ex. ett protein, från vilket det successivt Eriges till provet genom kemisk reaktion.
Den uppfinningsenliga metoden är naturligtvis inte begränsad till de ovan beskrivna utföringsexemplen och till basofila leukocyters 'reaktion med allergen. Exempel på andra sjukdomstillstånd som kan diagnosticeras med metoden ifråga är bindvävssjukdomar och rheumatoid artrit, varvid man använder sig av basofila leukocyters reaktion med cellkärne- extrakt eller renfiramställda DNA-molekyler. Andra (q '3 461 een tíllämpningsområden kan vara studium av neutrofila leukocyters bakteriedödande förmåga hos patienter med defekt immunförsvar (t.ex. kronisk granulomatös sjukdom, myeloperoxídasbrist m.m.)' samt trombocyters reaktion på stimuli av typ kollagen eller av proteaskaskadsystemens produkter.
Claims (4)
1. Förfarande för analys av receptorers aktivitet i ett antal prov vardera innehållande vissa vävnadsceller, t.ex. blodceller, där den avsedda reaktionen sker vid ett visst, exempelvis för olika individer varierande\optimalt förhållande mellan koncentrationerna av receptor och det agens som receptorn interagerar med, medan en för låg koncentration icke ger en adekvat reafíion och en' för hög koncentration tenderar att störa reaktionen, så att ett korrekt resultat ej upp- nås, varvid förfarandet innefattar tillsättande av ett agens till sagda prov inne- hållande celler, vars reaktion skall analyseras, och efter det att reaktionen ägt rum i respektive prov analys företages av detsamma för bestämning av resulta- tet av receptorernas aktivitet, k ä n n e t e c k n a t d ä r a v, att tillsät- tande av agenset sker stegvis eller kontinuerligt upp till en viss förutbestämd och i en i huvudsak för proven gemensam slutkoncentration, som är så hög att den erfarenhetsmässigt fastställda högsta, för en adekvat reaktion erforderliga koncentrationen vid provinnehåll av det slag, som skall analyseras, uppnås eller överskrides, och att detta sker i ett tidsförlopp som är så utdraget i förhållande till receptorernas reaktionshastighet vid sagda aktivitet, att under det utdragna tidsförloppet av stigande agenskoncentratíon, cellerna utsätts för en agenskon- centration, som befinner sig så nära den för uppnående av en adekvat reaktion optimala agenskoncentrationen under en så lång tid av tidsförloppet att den av- sedda reaktionen medges äga rum väsentligen utan störning genom det under det utdragna tidsförloppet fortsatta tillsättandet av agenset, så att den slutliga analysen kommer att avse cellernas reaktion uppkommen vid sagda optimala för- hållande mellan koncentrationerna av receptor och agens trots den variation i sagda koncentration, som kan förekomma inom serien av sagda prov och trots att den optimala koncentrationen ej fastställts i förväg för de enskilda proverna.
2. Förfarande enligt patentkrav 1, där receptorerna utgörs av IgE-moleky- ler bundna till cellytan hos basofila leukocyter och agenset av allergenpartiklar eller -molekyler och där vid positivt resultat, vid ett visst optimalt förhållande mellan IgE-molekyler och allergen sker en av vissa joner, t.ex. Ca2+ , initierad basofil degranulering av cellerna med åtföljande frisättning av histamin, k ä n - n e t e c k n a t d ä r a v, att till provet, som är ett blodprov eller annat vävnadsprov eller cellsuspension i lämpligt medium, tillsättes stegvis eller kon- tinuerligt allergen så att koncentrationen av detta successivt ökas i provet till /Zlfi 461 660 den förutbestämda koncentrationen, och att sagda koncentrationsökning genom- förs medelst sagda utdragna tidsförlopp under så lång tid, att den avsedda reaktionen medges äga rum vid i huvudsak optimal allergenkoncentration, varvid efter avslutad tillsats analys av provet genomförs genom klassificering av baso- fila leukocyter med avseende på deras granulering eller alternativt genom mät- ning av histamin eller andra substanser, som frisätts vid degranuleringen, eller deras effekt på andra mätbara skeenden.
3. ' Förfarande enligt patentkrav 1 eller 2, k ä n n e t e c k n a t d ä r a v, att tillsättande sker, så att en progressivt stigande koncentration erhålles före- trädesvis en koncentrationsstegring enligt en logaritmisk kurva.
4. För-farande enligt patentkrav 1, 2 eller 3, k ä n n e t e c k n a t_ d ä r - a v, att agenset tillsätts provet bundet såsom en kropp från vilken det successivt friges exempelvis genåm diffusion, eluering, upplösning eller kemisk reaktion.
Priority Applications (11)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SE8302190A SE461660B (sv) | 1983-04-19 | 1983-04-19 | Foerfarande foer analys av receptorers aktivitet hos celler |
EP84901829A EP0172822B1 (en) | 1983-04-19 | 1984-04-18 | Method for analysis of the activity of receptors of certain cells |
AT84901829T ATE50001T1 (de) | 1983-04-19 | 1984-04-18 | Verfahren zur analyse der taetigkeit von rezeptoren bestimmter zellen. |
JP59501792A JPS61500275A (ja) | 1983-04-19 | 1984-04-18 | 一定の細胞のレセプタの活性分析方法及びその装置 |
AU28668/84A AU2866884A (en) | 1983-04-19 | 1984-04-18 | Forfarande och anordning for analys av receptorers aktivitet hos vissa celler |
DE8484901829T DE3481202D1 (de) | 1983-04-19 | 1984-04-18 | Verfahren zur analyse der taetigkeit von rezeptoren bestimmter zellen. |
PCT/SE1984/000148 WO1984004109A1 (en) | 1983-04-19 | 1984-04-18 | Method and device for analysis of the activity of receptors of certain cells |
NO845082A NO845082L (no) | 1983-04-19 | 1984-12-18 | Fremgangsmaate og anordning for analyse av reseptorers aktivitet hos visse celler |
DK612384A DK612384D0 (da) | 1983-04-19 | 1984-12-19 | Fremgangsmaade og anordning til analyse af receptorers aktivitet hos visse celler |
FI851965A FI851965L (fi) | 1983-04-19 | 1985-05-17 | Foerfarande och anordning foer analys av receptorers aktivitet hos vissa celler. |
US07/159,514 US4812402A (en) | 1983-04-19 | 1988-02-19 | Method of determining hypersensitivity to an allergen |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SE8302190A SE461660B (sv) | 1983-04-19 | 1983-04-19 | Foerfarande foer analys av receptorers aktivitet hos celler |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
SE8302190D0 SE8302190D0 (sv) | 1983-04-19 |
SE8302190L SE8302190L (sv) | 1984-10-20 |
SE461660B true SE461660B (sv) | 1990-03-12 |
Family
ID=20350871
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SE8302190A SE461660B (sv) | 1983-04-19 | 1983-04-19 | Foerfarande foer analys av receptorers aktivitet hos celler |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4812402A (sv) |
EP (1) | EP0172822B1 (sv) |
JP (1) | JPS61500275A (sv) |
DE (1) | DE3481202D1 (sv) |
FI (1) | FI851965L (sv) |
NO (1) | NO845082L (sv) |
SE (1) | SE461660B (sv) |
WO (1) | WO1984004109A1 (sv) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AT392481B (de) * | 1989-04-18 | 1991-04-10 | Keplinger Klaus | Verfahren zum nachweis fuer die anwesenheit von aids-viren im menschlichen organismus |
SE513475C2 (sv) * | 1996-11-22 | 2000-09-18 | Peridoc Ab | Hudsticktestkit |
WO1998032014A1 (de) * | 1997-01-20 | 1998-07-23 | Orpegen Pharma Gmbh | Basophilen-degranulationstest |
JP3707303B2 (ja) * | 1999-06-30 | 2005-10-19 | 株式会社日立製作所 | ヒスタミン計測方法およびヒスタミン計測装置 |
WO2017053991A1 (en) | 2015-09-25 | 2017-03-30 | University Of Notre Dame Du Lac | Nanoallergens and uses thereof |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE2431918A1 (de) * | 1974-07-03 | 1976-01-22 | Bbc Brown Boveri & Cie | Verfahren und vorrichtung zur kontinuierlichen bestimmung und auswertung der humantoxizitaet von fluessigkeiten |
CH613523A5 (en) * | 1975-06-27 | 1979-09-28 | Inst Nat Sante Rech Med | Method for displaying basophils |
FR2396974A1 (fr) * | 1977-07-04 | 1979-02-02 | Anvar | Procede de detection et d'etude d'une activite cellulaire ou analogue et moyens pour la mise en oeuvre d'un tel procede |
US4343782A (en) * | 1978-04-20 | 1982-08-10 | Shapiro Howard M | Cytological assay procedure |
FR2467401A1 (fr) * | 1979-10-12 | 1981-04-17 | Weck Alain De | Procede de mesure de la degranulation des basophiles par flow-cytometrie, utile pour le diagnostic des allergies, et reactif de coloration pour la mise en oeuvre de ce procede |
DE3038255A1 (de) * | 1980-10-10 | 1982-05-19 | Wolfgang Prof. 7500 Karlsruhe Mehlhardt | Verfahren und vorrichtung zur pruefung von biologischen wirkungen physikalischer und/oder chemischer agenzien |
SE448881B (sv) * | 1981-03-12 | 1987-03-23 | Erik Walum | Apparat for genomforandet av perfusionsodling av en eller flera cellkulturer samt forfarande for perfusionsodling av en eller flera cellkulturer |
DE3147763A1 (de) * | 1981-12-02 | 1983-06-09 | Stickl, Helmut, Prof.Dr.Med., 8033 Krailling | Nachweisverfahren zur in vitro-bestimmung des bei einer allergie korrespondierenden allergens |
WO1983002953A1 (en) * | 1982-02-19 | 1983-09-01 | Endotronics Inc | Process and apparatus for controlling patterns of chemicals stimuli administration to biological tissue |
-
1983
- 1983-04-19 SE SE8302190A patent/SE461660B/sv not_active IP Right Cessation
-
1984
- 1984-04-18 JP JP59501792A patent/JPS61500275A/ja active Pending
- 1984-04-18 WO PCT/SE1984/000148 patent/WO1984004109A1/en active IP Right Grant
- 1984-04-18 DE DE8484901829T patent/DE3481202D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1984-04-18 EP EP84901829A patent/EP0172822B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-12-18 NO NO845082A patent/NO845082L/no unknown
-
1985
- 1985-05-17 FI FI851965A patent/FI851965L/fi not_active Application Discontinuation
-
1988
- 1988-02-19 US US07/159,514 patent/US4812402A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
NO845082L (no) | 1984-12-18 |
WO1984004109A1 (en) | 1984-10-25 |
US4812402A (en) | 1989-03-14 |
SE8302190D0 (sv) | 1983-04-19 |
FI851965A0 (fi) | 1985-05-17 |
SE8302190L (sv) | 1984-10-20 |
DE3481202D1 (de) | 1990-03-08 |
FI851965L (fi) | 1985-05-17 |
EP0172822B1 (en) | 1990-01-31 |
JPS61500275A (ja) | 1986-02-20 |
EP0172822A1 (en) | 1986-03-05 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Blaxhall et al. | Routine haematological methods for use with fish blood | |
Schimpff et al. | Abnormalities in cell-mediated immunity in patients with Cryptococcus neoformans infection | |
Edwards | Immunologic investigations of meningococcal disease: I. Group-specific Neisseria meningitidis antigens present in the serum of patients with fulminant meningococcemia | |
Roland et al. | Hematology as a diagnostic tool in bovine medicine | |
Goldenfarb et al. | Reproducibility in the hematology laboratory: the microhematocrit determination | |
Mittler et al. | Studies on the artificial feeding of the aphid Myzus persicae (Sulzer)—I. Relative uptake of water and sucrose solutions | |
Astor et al. | Human leukocyte migration inhibition in agarose using four antigens: Correlation with skin reactivity | |
Franzmann | Environmental sources of variation of bighorn sheep physiologic values | |
Smith et al. | Changes in circulating equine erythrocytes induced by brief, high‐speed exercise | |
RU2010101909A (ru) | Способ выявления или лечения реакции "трансплантат против хозяина" | |
CN103380376B (zh) | 固体支持物和从其中回收生物材料的方法 | |
NO830732L (no) | Fremgangsmaate for detektering eller bestemmelse av histamin i histaminholdige materialer, spesielt legemsvaesker og et analytisk middel for bruk i en slik fremgangsmaate | |
SE461660B (sv) | Foerfarande foer analys av receptorers aktivitet hos celler | |
MARLER | Some hematologic and blood chemistry values in two herds of American bison in Kansas | |
RU2737336C1 (ru) | Способ определения иммунологической реактивности организма животных | |
Ketchel et al. | The influence of a plasma factor on in vitro leucocyte migration | |
Bourdillon et al. | An improved screening procedure for blood phenylalanine. | |
Ahmed et al. | The impacts of medications misused for body weight gain on complete blood count (CBC) concentration of female rabbits | |
Caflisch et al. | In situ micropuncture study of pancreatic duct pH | |
Ballas et al. | Studies on the mechanism of T-cell-mediated lysis: XIII. Lectin-dependent T-cell-mediated cytotoxicity is supported by Con A-coupled Sepharose beads | |
Wijsmuller | The problem of comparing tuberculins for potency | |
CN206671345U (zh) | 一种快速检测红霉素残留的免疫胶体金试剂板 | |
Herrera-Barragan et al. | Harris’s hawks (Parabuteo unicinctus) hematological parameters in different tropical locations | |
Williams | From Weapon To Wall: Investigating The Link Between Cast-Off Bloodstain Patterns, Blood Dynamics And Assailant Kinematics | |
Frey et al. | Effects of prerace exercise, frusemide, sex and ambient temperature on blood sodium, bicarbonate and pH values in Standardbred horses |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
NAL | Patent in force |
Ref document number: 8302190-7 Format of ref document f/p: F |
|
NUG | Patent has lapsed |
Ref document number: 8302190-7 Format of ref document f/p: F |