BRPI0110751B1

BRPI0110751B1 - Dispositivo

Info

Publication number: BRPI0110751B1
Application number: BRPI0110751-8A
Authority: BR
Inventors: Ilham Mohamed Saleh Saeed Abuljadayel
Original assignee: Tristem Trading (Cyprus) Limited.
Priority date: 2000-05-10
Filing date: 2001-05-10
Publication date: 2019-10-01
Also published as: KR20030034069A; KR100875089B1; HK1044172A1; ITMI20010952A1; GB0215519D0; CA2446955C; IL152737A; CA2446955A1; WO2001085917A2; EP1366144B1; KR20070103522A; JO2295B1; ES2190727A1; JP2004515211A; GB0111488D0; ITMI20010952A0; FR2808800A1; NL1017973C2; NZ556592A; CH696146A5

Abstract

dispositivo. trata-se de um dispositivo para preparação de uma célula não-diferenciada, o dispositivo compreende meios para contato de uma célula mais comprometida com um agente que faz com que a célula mais comprometida retrodiferencie em uma célula não-diferenciada.

Description

DISPOSITIVO

CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um dispositivo.

Em mais detalhes, a presente invenção refere-se a um dispositivo para preparar uma célula não-diferenciada. Em particular, porém não exclusivamente, a presente invenção refere-se a um dispositivo para preparar uma célula nãodif erenciada de uma célula mais comprometida. Em um aspecto adicional, a presente invenção também se refere a um método de formar células não diferenciadas. O dispositivo também pode comunicar-se remotamente com o produtor/distribuidor/ fabricante/centro de chamadas/centro de serviço e similares, por exemplo para encomendar remotamente agente novo e/ou confirmar que operações estão sendo ou foram executadas corretamente. Desse modo, a invenção também se refere a métodos de fazer negócios envolvendo o dispositivo e seus usos, por exemplo comunicar-se remotamente com um produtor/distribuidor/fabricante/centro de chamadas/centro de serviço e similar e o produtor/distribuidor/fabricante/ centro de chamadas/centro de serviço e similar respondendo a tais comunicações (por exemplo, recebendo e preenchendo pedidos, recebendo e/ou processando e/ou respondendo a dados/informações referentes a operações e/ou sua precisão).

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A diferenciação é um processo pelo qual estruturas e funções de células são progressivamente comprometidas para dar origem a células mais especializadas, como a formação de células T ou células B de precursores hematopoiéticos

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2/176 imaturos. Portanto, à medida que as células se tornam mais comprometidas, elas se tornam mais especializadas. Na maioria dos tipos de células de mamíferos, a diferenciação de célula é um processo de um sentido que leva finalmente a células terminalmente diferenciadas. Contudo, embora alguns tipos de células persistam por toda a vida sem se dividirem e sem serem substituídas, muitos tipos de células continuam a dividir-se durante o tempo de vida do organismo e são submetidas à renovação. Isto pode ser por divisão simples (por exemplo, células de fígado) ou como no caso de células como células hematopoiéticas e células de epiderme, pela divisão de células tronco relativamente não-diferenciadas seguida pelo comprometimento de uma das células filha a um programa de diferenciação irreversível subseqüente. Todos esses processos, contudo, têm um aspecto em comum: as células mantêm seu estado de diferenciação ou se tornam mais diferenciadas. Elas não se tornam não-diferenciadas ou mesmo menos diferenciadas.

A retrodiferenciação é um processo pelo qual estruturas e funções de células são progressivamente alteradas para dar origem a células menos especializadas. Algumas células são submetidas naturalmente à diferenciação inversa limitada (retrodiferenciação) in vivo em resposta ao dano ao tecido. Por exemplo, observou-se que as células de fígado revertem a um padrão de expressão de enzimas similar ao padrão enzimico fetal durante regeneração do fígado (Curtin e Snell, 1983, Br. J. Câncer, Vol. 48; 495-505).

Em Wo96/23870 foi mostrado que era possível tratar

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3/176 células diferenciadas de modo que elas se tornaram células não-diferenciadas, incluindo células tronco. Essas células não-diferenciadas foram capazes de proliferar e dar origem à progênie rediferenciada da mesma linhagem ou qualquer outra linhagem. No caso de células hematopoiéticas retrodiferenciadas, essas células tronco são pluripotentes e podem dar origem a mais de uma linhagem de células. A descoberta seminal de WO96/23870 foi totalmente inesperada.

As implicações clínicas desta descobertas são imensas. Células tronco são extremamente difíceis de se obter de pacientes humanos. Elas são tipicamente obtidos do tecido umbilical, medula óssea ou sangue onde estão presentes apenas em quantidades muito pequenas. Contudo, a presente invenção provê um dispositivo para produzir células tronco de células mais comprometidas, em particular pelo processo de reetrodiferenciação.

US 6.087.168 revela um método de transdiferenciar células epidérmicas em células neuronais, em cujo método células epidérmicas são desdiferenciadas ou retrodiferenciadas com um meio apropriado. De modo semelhante, Lake JA e outros Journal of Cell Science 113, 556-566 (2000) e Rathjen J e outros Journal of Cell Science 112, 601-612 (1999) revelam a retrodiferenciação de células tronco embriônicas (ES) em células semelhantes a ectoderma primitiva prematura (EPL), em resposta a dois fatores separáveis.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Em um aspecto amplo é provido um dispositivo para

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4/176 preparar uma célula não-diferenciada, onde o dispositivo

compreende meios para permitir	que	uma célula	mais
comprometida retrodiferencie em	uma	célula	não
diferenciada.
Nenhum dos documentos do	estado	da técnica	(como

US 6.087.168, Lake e outros ou Rathjen e outros) revela um dispositivo adequado para uso na preparação de células não diferenciadas. Embora a preparação de células não diferenciadas possa ser realizada por uma pessoa versada no estado da técnica sem o uso de um dispositivo de acordo com a presente invenção, o produto final tende a ser inconsistente já que cada vez que o procedimento é conduzido os resultados dependem da habilidade e experiência da pessoa que realiza o procedimento. Além disso, o tempo de manuseio necessário para preparar manualmente células nãodif erenciadas é grande e desse modo não é eficaz em termos de custo para um laboratório.

Em uma modalidade especifica é provido um dispositivo para formar e/ou aumentar o número relativo de células não-diferenciadas em uma população de células incluindo células comprometidas, cujo dispositivo compreende uma câmara, meios para introduzir na referida câmara uma população de células incluindo células comprometidas, meios para introduzir na referida câmara meios de retrodif erenciação que são capazes de fazer com que uma célula comprometida retrodiferencie em uma célula nãodif erenciada, e meios de incubação para incubar as referidas células comprometidas na presença dos referidos meios de

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5/176 retrodiferenciação de tal modo que uma célula comprometida retrodiferencie em uma célula não diferenciada.

Em outra modalidade especifica, é provido um dispositivo para formar e/ou aumentar o número relativo de células não-diferenciadas em uma população de células incluindo células comprometidas, cujo dispositivo compreende uma câmara, meios para introduzir na referida câmara uma população de células incluindo células comprometidas, meios para introduzir na referida câmara um agente que faz com que uma célula comprometida retrodiferencie em uma célula nãodif erenciada, e meios de incubação para incubar o referido agente e referidas células comprometidas de tal modo que uma célula comprometida retrodiferencie em uma célula não diferenciada.

Preferivelmente, o agente engata um receptor que media captura, reconhecimento ou apresentação de um antigeno na superfície das células comprometidas. Mais preferivelmente, o receptor é um antigeno MHC classe I ou um antigeno MHC classe II, como um antigeno classe I selecionado do receptor Leucócito-humano-associado (HLA)-A, um receptor HLA-B, um receptor HLA-C, um receptor HLA-E, um receptor HLA-F ou um receptor HLA-G ou um antigeno classe II selecionado de um receptor HLA-DM, um receptor HLA-DP, um receptor HLA-DQ ou um receptor HLA-DR.

De forma adequada, o receptor pode compreende uma cadeia-β tendo regiões homólogas. Preferivelmente, o receptor pode compreender pelo menos a região homóloga da cadeia-β de HLA-DR.

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Tipicamente, as células comprometidas são células diferenciadas. Preferivelmente, as células comprometidas são células hematopoiéticas comprometidas, preferivelmente células selecionadas de células de formação de colônia de células-T (células CFC-T), células de formação de colônia de células-B (células CFC-B), células de formação de colônia de eosinófilo (células CFC-Eosin), células de formação de colônia de basófilo (células CFC-Bas), células de formação de colônia de monócito/granulócito (células CFC-GM), células de formação de colônia megacariócito (células CFCMEG) , células de formação de explosão de eritrócitos (células BFC-E), células de formação de colônia de eritrócitos (células CFC-E), células T e células B.

Em uma modalidade preferida da presente invenção, a célula mais comprometida não é uma célula cancerosa. Em outra modalidade preferida da presente invenção, o agente não é carcinogênico nem capaz de promover crescimento de câncer.

Em uma modalidade preferida, o agente é um anticorpo para o receptor, como um anticorpo monoclonal ao receptor. Os exemplos específicos incluem CR3/43 e anticorpo monoclonal TAL.1B5.

Em uma modalidade preferida o agente modula expressão de gene MHC. De forma adequada, o agente pode modular expressão MHC classe I⁺ e/ou MHC classe II⁺.

Preferivelmente, o agente é utilizado em combinação com um modificador de resposta biológica, como um agente de alquilação, por exemplo agente de alquilação que é

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7/176 ou compreende ciclofosfoamida.

Células não diferenciadas preferidas compreendem um antígeno de célula tronco. Em uma modalidade preferida, as células não diferenciadas são selecionadas de uma célula tronco embriônica, uma célula tronco pluripotente, uma célula tronco linfóide, uma célula tronco hematopoiética, uma célula tronco neuronal, uma célula tronco epitelial, uma célula tronco mesenquimal, uma célula tronco endodérmica e uma célula tronco mielóide. Preferivelmente, as células não diferenciadas são caracterizadas por uma ou mais das seguintes designações de marcador de superfície de célula: CD34+, HLA-DR-, CD38-, CD117, AC133, CD90 e/ou CD45 low. Mais preferivelmente, a célula não diferenciada é CD34⁺ e CD38^-, ainda mais preferivelmente, CD34⁺, CD38^-, HLADR- e CD451ow.

Desse modo em uma modalidade preferida a presente invenção também provê um dispositivo para aumentar o número relativo de células tendo uma designação de marcador de superfície de célula CD34⁺ e/ou CD38^- e/ou HLA-DR^- e/ou CD45 low e/ou CD90 e/ou CD117 e/ou AC133 em uma população de células incluindo células comprometidas, cujo dispositivo compreende:

(i) uma câmara, (ii) meios para introduzir na referida câmara uma população de células incluindo células comprometidas, (iii) meios para introduzir na referida câmara um agente que operavelmente prende as referidas células

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8/176 comprometidas; e (iv) meios de incubação operáveis para incubar as referidas células comprometidas que são presas pelo referido agente na referida câmara de tal modo que o número relativo de células CD34⁺ e/ou CD38^- e/ou HLA-DR^- e/ou CD45 low e/ou CD90 e/ou CD117 e/ou AC133 aumenta como resultado do referido aprisionamento.

Um dispositivo de acordo com a presente invenção pode compreender, ainda opcionalmente, meios de purificação ou isolamento para enriquecer as referidas células não diferenciadas, remover o agente e/ou recuperar as referidas células não diferenciadas da população de célula alterada. Preferivelmente, os meios de purificação compreendem meios para identificar um marcador de superfície de célula presente na superfície de célula da célula não diferenciada ou um marcador de superfície de célula presente na superfície das células comprometidas porém substancialmente ausente da superfície de célula das células não diferenciadas. De forma adequada, os meios de purificação podem utilizar anticorpos criados contra o marcador de superfície de célula, por exemplo. Os exemplos de marcadores adequados incluem CD34, CED45 e HLA-DR. Apenas como exemplo, um meio de purificação adequado é o sistema de purificação CliniMACs/Isolex CD34+. Em uma modalidade adicional da presente invenção tal meio de purificação ou isolamento pode ser, opcionalmente, provido como um meio de separação.

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Um dispositivo de acordo com a presente invenção pode compreender ainda opcionalmente meios de seleção negativa e/ou enriquecimento de células, a montante. Alternativamente, a população de células pode ser opcionalmente selecionada negativamente e/ou enriquecida em células antes da inserção no referido dispositivo.

Em outra modalidade preferida, a célula não diferenciada da invenção é CD34^- CD45^- e negativa para marcadores de linhagens hematopoiéticas.

As células mais diferenciadas podem ser da mesma linhagem que as células comprometidas originais ou de linhagem diferente.

Desse modo, além de produzir células não diferenciadas, um dispositivo de acordo com a presente

invenção	pode ser	utilizado para converter	células	de	uma
linhagem	naquelas	de outra linhagem.
	Por conseguinte, em um aspecto	adicional	a
presente	invenção	provê um dispositivo para	induzir	em	uma

população de células compreendendo células hematopoiéticas comprometidas de uma linhagem hematopoiética a fim de se tornarem células de outra linhagem hematopoiética, cujo dispositivo compreende:

(i) uma câmara, (ii) meio para introduzir na referida câmara uma população de células incluindo células comprometidas, (iii) meios para introduzir na referida câmara um agente que operavelmente prende um receptor que media

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10/176 captura, reconhecimento ou apresentação de um antígeno na superfície das referidas células hematopoiéticas comprometidas; e (iv) meios de incubação operáveis para incubar as referidas células hematopoiéticas comprometidas que são presas pelo referido agente na referida câmara de tal modo que se tornam células de outra linhagem hematopoiética como resultado do referido aprisionamento.

Preferivelmente, as referidas células hematopoiéticas comprometidas são de uma linhagem de células B e se tornam células de outra linhagem hematopoiética selecionadas de uma linhagem de células T e uma linhagem mielóide.

Células não-diferenciadas produzidas pelo dispositivo da presente invenção podem ser utilizadas para fabricar um medicamento para o tratamento de uma doença ou distúrbio imunológico. Similarmente, células comprometidas novamente produzidas de acordo com os métodos da presente invenção podem ser utilizadas para fabricar um medicamento para o tratamento de uma doença ou distúrbio imunológico.

A presente invenção é altamente vantajosa visto que é possível agora preparar facilmente células não diferenciadas de células mais comprometidas e a seguir utilizar aquelas células não diferenciadas como, ou para preparar, medicamentos in vitro ou in vivo ou suas combinações para o tratamento de distúrbios.

A presente invenção também é vantajosa visto que é

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11/176 possível utilizar o dispositivo para comprometer a célula não diferenciada preparada por retrodiferenciação com uma célula comprometida novamente, como uma célula diferenciada nova, visando corrigir ou remover a célula mais comprometida original ou corrigir ou remover um produto da mesma. Por exemplo, células não diferenciadas poderíam ser utilizadas para produzir células comprometidas novamente como as células que revestem os alvéolos dos pulmões, desse modo criando um mecanismo pelo qual tecido danificado ou doente dos pulmões pode ser substituído ou reparado (vide Le Page, New Scientist 19 de dezembro de 2000, pág. 20) .

O termo célula comprometida novamente significa uma célula derivada de uma célula não diferenciada - isto é, uma célula nova, mais comprometida. Mais comprometida significa mais diferenciada e pode ser facilmente determinado por referência a vias e estágios conhecidos e diferenciação de células.

A maioria das células não diferenciadas e células diferenciadas compreendem antígenos de Complexo de Histocompatibilidade Principal (MHC) Classe I e/ou antígenos Classe II. Se esses antígenos forem associados àquelas células então elas são denominadas células Classe I⁺ e/ou Classe II⁺. Preferivelmente, a célula mais comprometida é capaz de retrodiferenciar em uma célula não diferenciada MHC Classe I⁺ e/ou MHC\ Classe II⁺.

Preferivelmente, a célula mais comprometida é capaz de retrodiferenciar em uma célula não diferenciada compreendendo um antígeno de célula tronco.

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	Preferivelmente,	a	célula	mais	comprometida	é
capaz	de retrodiferenciar	em	uma célula	não diferenciada
CD34+.
	Preferivelmente,	a	célula	mais	comprometida	é

capaz de retrodiferenciar em uma célula progenitora linfoematopoiética.

Preferivelmente, a célula mais comprometida é capaz de retrodiferenciar em uma célula tronco pluripotente.

Preferivelmente, o referido aumento ocorre em 24 horas, preferivelmente 4 a 8 horas (de tal modo que quaisquer alterações não possam ser consideradas apenas por proliferação de células).

Tipicamente, a determinação de alterações nos números de células não diferenciadas é realizada pela monitoração de alterações nos números de células tendo marcadores de superfície de células característicos de células não diferenciadas. Os exemplos de marcadores de superfície de células adequados incluem CD34⁺, HLA-DR^-, CD38^-, AC133, CD90 e/ou CD45 low. Alternativamente, ou além disso, podem ser monitoradas diminuições nos números de células tendo marcadores de superfície de células típicos de células diferenciadas e células não diferenciadas.

De forma adequada, um dispositivo de acordo com a presente invenção pode, opcionalmente compreender ainda meios de rastreamento para monitorar as alterações no número de células tendo marcadores de superfície de células característicos de células não diferenciadas.

Preferivelmente as células comprometidas

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13/176 utilizadas no ensaio são células hematopoiéticas comprometidas como células selecionadas de células CFC-T, células CFC-B, células CFC-Eosina, células CFC-Bas, células

CFC-GM, células CFC-MEG, células BFC-E, células CFC-E, células T e células B, mais preferivelmente células B.

Preferivelmente um dispositivo de acordo com a presente invenção compreende ainda um ou mais, preferivelmente dois ou mais, mais preferivelmente três ou mais, e ainda mais preferivelmente quatro ou mais, dos 10 seguintes aspectos:

(i) meios de medição para medir o volume de uma população de células, (ii) meios de contagem (como um contador coulter, miniaturizado se necessário, ou outro citômetro adequado) para realizar contagens de células e desse modo medir a concentração de células de uma população de células, (iii) meios de transferência para transferir uma quantidade (como uma quantidade predeterminada) de uma população de células de um recipiente de estocagem para a câmara, cujos meios de transferência podem compreender opcionalmente uma bomba por exemplo,

	(iv)	meios	calculadores	para	calcular o	volume	de
25		agente	a ser adicionado à	câmara, o	volume	de
		agente	dependendo	tanto	do volume	como	da

concentração de células da população de células, (v) meios de transferência adicionais para transferir

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14/176 um volume (como um volume calculado) de agente para a câmara, cujos meios de transferência adicionais podem compreender opcionalmente por exemplo uma seringa acionada por um motor, um motor escalonado por exemplo, (vi) meio de controle de dióxido de carbono (como parte do meio de incubação, por exemplo) para controlar a concentração de dióxido de carbono na câmara, (vii) meio de controle de temperatura (como parte do meio de incubação, por exemplo) para controlar a temperatura na câmara, (viii) meio de mistura (como parte do meio de incubação, por exemplo) para misturar a população de células e agente no interior da câmara, (ix) meio de cronometragem (como parte do meio de incubação, por exemplo) para cronometrar o período de incubação e, opcionalmente, meio de exibição para exibir para o usuário o período de tempo restante e/ou meio de alarme para alertar o usuário do término do período de incubação, (x) meio de colheita para colher células da câmara, em particular para colher as células não diferenciadas da câmara, (xi) meios de remoção para remover uma população de células, compreendendo células não diferenciadas, da câmara para dentro de um recipiente de estocagem; o meio de remoção pode compreender uma bomba por exemplo, e

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15/176 (xii) meio de vedação para vedar um recipiente de estocagem compreendendo uma população de células que compreendem células não diferenciadas.

De modo adequado, em um dispositivo da presente invenção, os meios de transferência (iii) podem transferir uma quantidade (como uma quantidade predeterminada) de uma população de células diretamente de um paciente para a referida câmara (isto é, sem a necessidade do recipiente de estocagem) e/ou os meios de remoção (xi) podem remover uma população de células, compreendendo células não diferenciadas, da câmara diretamente para um paciente (isto é, sem a necessidade do recipiente de armazenagem).

De forma adequada, os meios de transferência (iii) podem compreender uma bomba peristáltica, cuja bomba transfere uma população de células de um recipiente de armazenagem via meios de interconexão, tubagem por exemplo, para a câmara. Preferivelmente, os meios de interconexão passam através de um contador coulter ou outro citômetro adequado (como mencionado em (ii)). Desse modo, a concentração de células da população de células pode ser calculada durante transferência da população de células do recipiente de estocagem para a câmara.

Preferivelmente, o(s) recipiente(s) de estocagem mencionado(s) em (iii) e (xi) acima são bolsas de estocagem, que são vantajosamente descartáveis. De preferência o recipiente de estocagem de (iii) é diferente do recipiente de estocagem de (xi), o primeiro sendo um recipiente de estocagem de entrada o último sendo um recipiente de

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16/176 estocagem de saída.

Preferivelmente, o meio de transferência adicional (v) compreende um reservatório de agente a fim de assegurar que agente suficiente seja disponível a qualquer momento. Quando o meio de transferência é uma seringa, o reservatório pode ser fornecido por uma seringa adicional, de tal modo que quando uma seringa se esgota a outra seringa começa a fornecer o agente.

Preferivelmente, o meio de controle de dióxido de carbono para controlar a concentração de dióxido de carbono na câmara compreende uma válvula, que permite a introdução de uma quantidade predeterminada de dióxido de carbono de um cilindro de gás. A quantidade predeterminada de dióxido de carbono é calculada utilizando o volume conhecido de ar na câmara, tubagem e recipiente de armazenagem de saída e o volume medido da população de células do recipiente de armazenagem de entrada. Adequadamente, o dióxido de carbono é introduzido na câmara através de um orifício que é igual àquele através do qual o agente é adicionado, desse modo o dióxido de carbono pode ser utilizado para soprar através todo agente restante no orifício e equipamento circundante. Além do acima, o meio de controle de dióxido de carbono pode compreender ainda uma bexiga de ar inflável para acomodar o volume extra de ar que resulta da introdução de dióxido de carbono adicional no sistema. Alternativamente, o recipiente de estocagem de entrada, após esvaziar, pode agir como uma soprar através de ar. Preferivelmente, dióxido de carbono é introduzido para produzir 5% de concentração final

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17/176 na câmara.

Os meios de controle de temperatura (xii) podem compreender adequadamente meios de aquecimento, cujos meios de aquecimento podem ser fornecidos por uma placa de calor posicionada abaixo da câmara, por exemplo. Alternativamente, os meios de aquecimento podem ser fornecidos por uma camisa de água aquecida localizada adjacente à câmara ou a uma porção da mesma. De preferência, a temperatura na câmara é controlada entre aproximadamente 25°C e aproximadamente 37°C.

Os meios de mistura (viii) compreendem, preferivelmente, pelo menos um braço de pá, que gira lentamente a fim de misturar a população de células e o agente na câmara. Um agitador magnético pode ser alternativamente utilizado. Como alternativa adicional, a câmara poderia ser agitada mecanicamente, por exemplo por agitação suave. Uma vantagem de utilizar um meio de mistura compreendendo pelo menos um braço de pá é que o braço também pode ser projetado para atuar como um raspador durante a colheita das células, isto é, de tal modo que à medida que o braço gira lentamente as células fixadas na superfície da câmara são suavemente desalojadas.

Vantajosamente,	os meios de	mistura	são	operáveis	para
efetuar movimento	giratório.
Preferivelmente, os	meios	de	remoção	(xi)
compreendem uma	bomba peristáltica.	Vantajosamente,	os

meios de remoção puxam a população de células, incluindo células não-diferenciadas, através de um orifício de saída

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18/176 na parte inferior da câmara e para dentro do recipiente de estocagem de saída via meios de interconexão, como tubagem, por exemplo.

Alternativamente ou além dos meios de remoção, um agente sequestrante e/ou quelante de ions livres, por exemplo um anticoagulante como EDTA, pode ser adicionado à câmara antes da remoção de uma população de células a partir da mesma. A adição de tal agente sequestrante e/ou quelante de ions à câmara faz com que colônias de células tronco se desagreguem em uma única suspensão de células e portanto facilita a remoção de células da câmara por meios de jato d'água.

Os meios de vedação (xii) compreendem preferivelmente um vedador térmico, cujo vedador térmico fecha o recipiente de estocagem de saída pressionando juntas duas porções do recipiente ou duas porções dos meios de interconexão imediatamente antes do recipiente até que haja uma vedação completa. Por exemplo, o vedador de calor pode resultar em uma vedação que tem aproximadamente 2 cm de largura, o vedador térmico corta então a vedação ao longo de uma porção central da mesma.

Preferivelmente, cada porção do dispositivo de acordo com a presente invenção é independente controlável por um sistema de computador central. Vantajosamente, o sistema de computador é capaz de receber sinais de entrada de uma porção do dispositivo, efetuando cálculos com base naqueles sinais de saída e enviando sinais de saída para uma mesma porção ou porção adicional do dispositivo.

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19/176

O dispositivo da presente invenção tem várias vantagens, em particular o dispositivo assegura que um resultado compatível seja obtido cada vez que o procedimento é realizado e que não ocorra desperdício de agente valioso. Além disso, o dispositivo pode ser programado para alertar ao usuário quando terminou retrodiferenciação e/ou exibir o tempo que resta antes do término. Se programado para fazer isto, o dispositivo pode induzir o usuário a adquirir agente novo. Isto quer dizer, o dispositivo pode monitorar o uso do agente e a quantidade armazenada, e desse modo pode induzir o usuário quando a quantidade de agente armazenado cai abaixo de um nível critico.

O dispositivo da presente invenção pode compreender ainda uma pluralidade de câmaras cada uma para produzir uma célula não-diferenciada comprometida com linhagens de células diferentes, por exemplo, músculo, cabelos, neurônios, etc. Desse modo, produção simultânea de células não-diferenciadas comprometidas com linhagens de células diferentes pode ocorrer. Preferivelmente, quando uma pluralidade de câmaras é utilizada cada câmara possui um orifício de saída separado e um recipiente de estocagem de saída separado.

A linhagem de células pode ser controlada no dispositivo da presente invenção pelo uso de plásticos tratados de modo diferente para a(s) câmara(s) ou pela adição de produtos químicos diferentes em cada câmara.

Preferivelmente, um ou mais dos componentes do dispositivo são descartáveis. Por exemplo, um ou mais dos

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20/176 seguintes componentes podem ser descartáveis: a câmara, o recipiente de estocagem de entrada, o recipiente de estocagem de saída, os meios de interconexão que conectam os recipientes de estocagem à câmara, e os meios de transferência adicionais (v) . De forma adequada, os componentes descartáveis podem ser fornecidos como um cartucho para inserção no dispositivo. Apenas como exemplo, um cartucho pode compreender uma primeira bolsa de sangue (recipiente de estocagem de entrada), uma câmara e uma segunda bolsa de sangue (saída) onde a câmara é conectada a cada uma das primeira e segunda bolsas de sangue por tubagem (meios de interconexão). De forma adequada, o dispositivo pode ser considerado como um sistema sendo parte instrumento e parte descartável.

Preferivelmente, a câmara e/ou outros componentes do dispositivo em contato com a população de células são formulados de material Classe VI USP, placas de policarbonato ou outros plásticos não capazes de fazerem outras formas de transformantes de células.

Preferivelmente, a população de células compreendendo células comprometidas é sangue.

Preferivelmente, o agente é um anticorpo.

Em um aspecto adicional, a presente invenção provê um método de preparar uma célula não diferenciada, o método compreendendo retrodiferenciar uma célula mais comprometida em uma célula não diferenciada, onde a retrodiferenciação da célula mais comprometida ocorre em uma célula mais comprometida em ou de uma amostra de sangue

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21/176 revestida buffy.

Em um aspecto ainda adicional, a presente invenção provê um método de preparar uma célula não diferenciada, o método compreendendo contatar uma célula mais comprometida em ou de uma amostra de sangue revestida buffy com um agente que faz com que a célula mais comprometida retrodiferencie em uma célula não-diferenciada.

Em uma modalidade preferida da presente invenção, a célula mais comprometida não é uma célula cancerosa. Em outra modalidade preferida da presente invenção, o agente não é carcinogênico nem é capaz de promover crescimento de câncer.

Preferivelmente, as células comprometidas são diferenciadas. Preferivelmente, as células comprometidas são células hematopoiéticas comprometidas, como célula selecionada de células CFC-T, células CFC-B, células CFCEosina, células CFC-Bas, células CFC-GM, células CFC-MEG, células BFC-E, células CFC-E, células T e células B, mais preferivelmente células B.

Preferivelmente, as células não diferenciadas são células não diferenciadas selecionadas de uma célula tronco pluripotente, uma célula tronco hematopoiética, uma célula tronco neuronal, uma célula tronco epitelial, uma célula tronco mesenquimal e uma célula tronco embriônica. Preferivelmente, as células não diferenciadas são caracterizadas por uma ou mais das seguintes designações marcadoras de superfície de células: CD34⁺, HLA-DR^-, CD38^-, CD117, AC133, CD90 e/ou CD451ow. Mais preferivelmente a

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22/176 célula não diferenciada é CD34⁺ e CD38^-, ainda mais preferivelmente, CD34⁺, CD38^-, HLA-DR^- e CD451ow.

De forma adequada, as células não diferenciadas são células MHC classe I⁺ e/ou MHC classe II⁺.

Preferivelmente, o agente prende um receptor que media captura, reconhecimento ou apresentação de um antígeno na superfície das células comprometidas. Mais preferivelmente, o receptor é um antígeno MHC Classe I ou um antígeno MHC classe II, como antígeno classe I selecionado de receptor Leucócito humano associado (HLA)-A, um receptor HLA-B, um receptor HLA-C, um receptor HLA-E, um receptor HLA-F ou um receptor HLA-G ou um antígeno classe II selecionado de um receptor HLA-DM, um receptor HLA-DP, um receptor HLA-DQ ou um receptor HLA-DR.

De modo adequado, o receptor pode compreender uma cadeia-β tendo regiões homólogas. Em uma modalidade, o receptor pode compreender pelo menos as regiões homólogas da cadeia-β de HLA-DR.

Em uma modalidade preferida, o agente é um anticorpo ao receptor, como um anticorpo monoclonal ao receptor. Os exemplos específicos incluem CR3/43 e anticorpo monoclonal TAL.1B5.

De forma adequada, o agente pode modular expressão de gene MHC, por exemplo expressão MHC classe I⁺ e/ou MHC classe II⁺.

Em uma modalidade preferida adicional da presente invenção é fornecido um método de aumentar o número relativo de células tendo uma designação de marcador de

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23/176 superfície de célula CD34⁺ e/ou HLA-DR^- e/ou CD38^- e/ou CD117 e/ou AC133 e/ou CD90 e/ou CD451ow em uma amostra de sangue revestida buffy, o método compreendendo contatar uma célula mais comprometida em uma amostra de sangue revestida buffy com um agente que prende operavelmente as referidas células comprometidas, como o número relativo de células CD34⁺ e/ou HLA-DR- e/ou CD38- e/ou CD117 e/ou AC133 e/ou CD90 e/ou CD451ow aumenta como resultado do referido aprisionamento.

Ainda em um aspecto adicional, a presente invenção provê um método de preparar uma célula não diferenciada, o método compreendendo contatar uma ou mais células diferenciadas em uma população de células com meios de retrodiferenciação eficazes para deslocar a razão de células diferenciadas normais na referida população, pelo que uma ou mais das referidas células diferenciadas é induzida a retrodiferenciar com uma (s) célula(s) não diferenciada(s).

Em um aspecto adicional, a presente invenção provê o uso de meios de retrodiferenciação para deslocar a razão de células diferenciadas normais em uma população de células para efetuar retrodiferenciação de uma ou mais das referidas células diferenciadas para uma(s) célula(s) não diferenciada(s).

Ainda em um aspecto adicional, a presente invenção provê um método de preparar uma célula não diferenciada, o método compreendendo retrodiferenciar uma célula diferenciada em uma população de células com uma célula não diferenciada, em que o ambiente que compreende a referida

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24/176 população de células compreendendo uma ou mais células diferenciadas é mudado de um primeiro ambiente para um segundo ambiente onde a concentração de íons livres do referido segundo ambiente é efetivamente modificado em comparação com o primeiro ambiente de modo a fazer com que uma ou mais das referidas células diferenciadas retrodiferencie para uma(s) célula(s) não diferenciada(s).

Em um aspecto ainda adicional, a presente invenção provê um método de preparar uma célula não diferenciada, o método compreendendo contatar uma ou mais células diferenciadas em uma população de células com meios de retrodiferenciação eficazes para deslocar a razão de células diferenciadas normais, cultivar a população de células em um primeiro ambiente livre de íons ou ion seqüestrado, e alterar o primeiro ambiente para um segundo ambiente onde a concentração de íons presentes no segundo ambiente é eficazmente modificado em comparação com o primeiro ambiente, desse modo para efetuar uma ou mais das células diferenciadas a fim de retrodiferenciar para uma(s) célula(s) não diferenciada(s).

Preferivelmente, os meios de retrodiferenciação são quaisquer meios que causam ruptura da razão de células diferenciadas normais em uma população de células, que é doravante denominada seleção negativa, na população das células e desse modo causam ruptura da razão de células diferenciadas normais em uma população de células.

Os meios de retrodiferenciação podem ser, por exemplo, quaisquer um ou mais dos que se seguem: um

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25/176 anticorpo (puro e conjugado (isto é ligado a ligandos livres e fixos como contas magnéticas, de vidro ou de poliestireno por exemplo); Histopaque, LymphoPrep (Sigma) ou qualquer outro meio de gradiente de densidade utilizado para separar células de acordo com a densidade das células; ou Dextrano (que causa sedimentação de hemácias, por exemplo). Outros meios adequados que causam deslocamento são mostrados em Vettese-Dadey (The Scientist, 13 de setembro de 1999, 13 (18) : 21) .

Preferivelmente, a concentração de ions livres do segundo ambiente é aumentada em comparação com aquela do primeiro ambiente.

Mais preferivelmente, a concentração de ions livres relativa dos primeiro e segundo ambientes é aumentada, isto é a concentração de ions livres no segundo ambiente é aumentada. Preferivelmente, a concentração de ions relativa é aumentada suficientemente para fazer com que uma ou mais das células diferenciadas retrodiferencie para uma (s) célula(s) não diferenciada(s). Apenas como exemplo, a transferência de células de um meio contendo 5 mM EDTA (um agente sequestrante e/ou quelante de ions livres) para um meio adicional contendo menos EDTA ou nenhum EDTA causa aumento na concentração de ions livres (por exemplo, concentração de ions de cálcio) suficiente para ocasionar retrodiferenciação.

Preferivelmente, o ion livre é um ânion.

Preferivelmente, o ion livre é um metal do grupo I ou grupo II.

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Preferivelmente, o ânion é um ion de cálcio e/ou um ion de magnésio.

De forma adequada, a concentração de ions livres de um ambiente pode ser modificada pelo tratamento do ambiente com um agente capaz de alterar relativamente a concentração de ions livres do ambiente.

Desse modo, em uma modalidade preferida a presente invenção provê um método de preparar uma célula não diferenciada, o método compreendendo retrodiferenciar uma célula diferenciada em uma população de células para uma célula não diferenciada, onde o ambiente compreendendo a referida população de células é modificado pelo tratamento de um primeiro ambiente com um agente capaz de alterar relativamente a concentração de ions livres do ambiente a fim de afetar um segundo ambiente.

Por exemplo, o primeiro ambiente pode ser tratado com um ou mais agentes sequestrantes de ions livres cuja presença é subseqüentemente removida ou reduzida desse modo para afetar um segundo ambiente tendo uma concentração de ions livres relativamente aumentada, desse modo efetuando a retrodiferenciação de uma ou mais células diferenciadas na população de células. Isto quer dizer, o agente sequestrante pode ser removido ou reduzido por exemplo removendo fisica/quimicamente o ou parte do agente sequestrante do primeiro ambiente ou transferindo a população de células para um segundo ambiente sem tal agente sequestrante de ions livres ou com um agente sequestrante de ions livres em uma concentração mais baixa do que no

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27/176 primeiro ambiente.

Em qualquer evento, o segundo ambiente tem uma concentração de ions livres aumentada em comparação com o primeiro ambiente, desse modo efetuando retrodiferenciação de uma ou mais células diferenciadas na população de células.

Alternativamente, a população de células pode ser cultivada em um primeiro ambiente compreendendo uma concentração baixa ou zero de ions livres seguido pela transferência da população de células para ou ajuste do primeiro ambiente de modo que se torna um segundo ambiente compreendendo ions ou compreendendo ions em uma concentração mais elevada do que o primeiro ambiente, desse modo efetuando retrodiferenciação de um ou mais células diferenciadas na população de células. O termo baixo utilizado aqui inclui um ambiente com uma concentração de partida de ions livres relativamente baixa em relação à concentração final do segundo ambiente.

Desse modo, em uma modalidade preferida a presente invenção também provê um método de preparar uma célula não diferenciada, o método compreendendo retrodiferenciar uma célula diferenciada em uma população de células para uma célula não diferenciada, em que o ambiente que compreende a referida população de células compreendendo uma ou mais células diferenciadas é alterada de um primeiro ambiente tendo uma concentração baixa ou zero de ions de magnésio ou cálcio livres para um segundo ambiente compreendendo ion de magnésio ou cálcio livre ou compreendendo ions de magnésio o

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28/176 u cálcio livres em uma concentração mais elevada do que o primeiro ambiente, desse modo efetuando a retrodiferenciação de uma ou m ais células diferenciadas na população de células.

Sem desejar se limitar por teoria, pensa-se que alterações na concentração de íons, em particular aumentos na concentração de íons, faz com que as células na população de células se agreguem em colônias (por exemplo, sejam submetidas à agregação homotipica), e que o contato físico entre tais células possa induzi-las à retrodiferenciação.

Preferivelmente, o agente sequestrante é um agente de quelação de íons.

Preferivelmente, o agente sequestrante compreende tanto uma amina como um grupo carboxílico.

Preferivelmente, o agente sequestrante compreende uma pluralidade de grupos -N(CH2CO2H) _n, onde n=l ou n=2.

De forma adequada, o agente sequestrante pode ser selecionado de qualquer um ou mais dos que se seguem: EDTA, heparina, EGTA, DTPA, citrato trissódico e outros agentes quelantes similares e/ou anticoagulantes.

De forma adequada, o agente sequestrante deve ser adicionado em uma concentração suficientemente elevada de tal modo que a remoção da sua presença causa retrodiferenciação. Tipicamente, a concentração do agente sequestrante suficiente para causar retrodiferenciação quando a sua presença é removida é maior do que ou igual a aproximadamente 2mM.

Em uma modalidade preferida da presente invenção,

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29/176 a célula mais comprometida não é uma célula de câncer. Em outra modalidade preferida da presente invenção, o agente não é carcinogênico nem capaz de promover crescimento de câncer.

Preferivelmente, as células não diferenciadas são células não diferenciadas selecionadas de uma célula tronco pluripotente, uma célula tronco hematopoiética, uma célula tronco neuronal, uma célula tronco epitelial, uma célula tronco mesenquimal e uma célula tronco embriônica. Preferivelmente, as células não diferenciadas são caracterizadas por uma ou mais das seguintes designações de marcador de superfície de célula: CD34⁺' HLA-DR^-, CD38^-, CD117, AC133, CD90 e/ou CD451ow. Mais preferivelmente, a célula não diferenciada é CD34⁺ e CD38^-, ainda mais preferivelmente, CD34⁺, CD38^-, HLA-DR^- e CD451ow.

Desse modo, em uma modalidade preferida adicional a presente invenção também provê um método de preparar uma célula não diferenciada, o método compreendendo retrodiferenciar uma célula hematopoiética diferenciada em uma população de células para uma célula não diferenciada, onde o ambiente compreendendo a referida população de

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30/176 células que compreende uma ou mais células hematopoiéticas diferenciadas é alterada de um primeiro ambiente para um segundo ambiente onde a concentração de íons livres do referido segundo ambiente é eficazmente modificado em comparação com o primeiro ambiente para fazer com que uma ou mais das referidas células hematopoiéticas diferenciadas retrodiferencie em uma (s) célula(s) não diferenciada(s).

De modo adequado, as células não diferenciadas são células MHC Classe I⁺ e/ou MHC classe II⁺.

Em uma modalidade, a população de células incluindo células comprometidas é uma amostra de sangue revestida buffy ou é de uma amostra de sangue revestida buffy.

Vantajosamente, um método de acordo com a presente invenção pode ser utilizado para cultivar de forma eficaz, progenitores eritróides para a produção de eritrócitos, cujos eritrócitos podem ser utilizados para reabastecer deficiências em suprimentos de sangue, por exemplo. De forma adequada, um método de acordo com a presente invenção pode ser utilizado para produzir megacariócitos para uso em produção de plaquetas.

A fim de que a presente invenção possa ser claramente entendida e facilmente colocada em execução será feita referência agora, como exemplo, aos desenhos em anexo.

A figura 1 mostra uma vista em perspectiva de um dispositivo de acordo com a presente invenção com o seu painel frontal aberto, juntamente com uma inserção que mostra uma seção do dispositivo removido de seu ambiente em

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31/176 volta;

A figura 2 mostra uma vista em perspectiva do dispositivo da figura 1 com o seu painel frontal fechado;

A figura 3 mostra uma fotografia de células sangüineas;

A figura 4 mostra um gráfico da diferenciação de LSCs para formar células T e células B;

A figura 5 mostra um gráfico da diferenciação de MSCs para formar eosinófilos, basófilos, neutrófilos, megacariócitos, monócitos, eritrócitos, granulócitos, mastócitos, NKs, e linfócitos;

A figura 6 mostra células progenitoras linfoematopoiéticas;

A figura 7 mostra a aparição de células CD45^_CD14~ após tratamento com anticorpos CR3/43;

A figura 8 mostra uma imagem de microscópio de células B diferenciadas;

A figura 9 mostra uma imagem de microscópio de células não diferenciadas formadas por retrodiferenciação de células B;

A figura 10 mostra uma imagem de microscópio das mesmas células não diferenciadas que a figura 9 porém em uma ampliação menor;

A figura 11 mostra uma imagem de microscópio de células B diferenciadas;

A figura 12 mostra uma imagem de microscópio de células não diferenciadas formadas pela retrodiferenciação de células B;

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A figura 13 mostra uma imagem de microscópio de formação de células de granulócitos diferenciadas das mesmas células não diferenciadas da figura 12;

A figura 14 mostra em duas ampliações diferentes, imagens de microscópio de uma amostra de sangue não tratada de um paciente BCLL;

A figura 15 mostra imagens de microscópio de uma amostra de sangue tratada;

As figuras 16 e 17 mostram imagens de microscópio de tempo durante o tratamento de amostras de sangue;

A figura 18 mostra uma mancha do Sul;

A figura 19 mostra manchas do Sul adicionais obtidos utilizando células sangüineas periféricas de

pacientes	com B-CLL;
	A	figura 20	mostra	o uso de	três	agentes para
aumentar	o	número	relativo	de células	CD34+ em	uma
população	de	células;
	A	figura 21	mostra	um ensaio	de	colônias	de

células tronco utilizando microscopia de campo brilhante invertido;

A figura 22 mostra uma camada de células aderentes quando vista com microscopia de campo brilhante invertido; e

A figura 23 mostra duas imagens paradas de um video de tempo durante tratamento de células B com CR3/43 mab.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

I. Dispositivo

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O dispositivo é genericamente ilustrado pelo número de referência 1 e compreende um alojamento 2 tendo um painel frontal 3, cujo painel 3 pode ser aberto par a permitir acesso ao lado interno do dispositivo 1. Um recipiente de estocagem de entrada, a saber uma bolsa de sangue 4, fica suspenso de um gancho de suporte 5. O gancho de suporte 5 forma parte de uma balança eletrônica (não mostrada) , a qual é operável para pesar a bolsa de sangue de entrada 4.

O dispositivo compreende ainda uma câmara 6, cuja câmara 6 é interconectada à bolsa de sangue de entrada 4 via tubagem 7. A tubagem 7 compreende uma janela transparente 8, cuja janela é posicionada no interior de uma célula de f luxo do contador coulter, 9. Uma bomba peristáltica (não mostrada) é operável para puxar o sangue da bolsa de sangue de entrada 4 através da célula de fluxo de contador coulter 9 e para dentro da câmara 6.

As seringas 10 e 11 contêm antígeno e são individualmente acionadas por um motor escalonado (não mostrado). As seringas 10, 11 são permanentemente mantidas a 4°C no interior de um refrigerador Peltier isolado, travável, 12. Duas seringas 10, 11 são fornecidas a fim de assegurar que o dispositivo tenha sempre fornecimento suficiente de anticorpos. A esterilidade das seringas 10, 11 é mantida pelos dois antibióticos e filtros descartáveis de 0,2 pm (genericamente designados como numeral de referência 13).

O dispositivo compreende ainda um orifício de

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34/176 entrada de dióxido de carbono 14, o qual orienta o dióxido de carbono de um cilindro de gás (não mostrado) para o interior da câmara 6 via tubagem 15. As seringas 10, 11 também estão em comunicação de fluido com a câmara 6 via tubagem 15. Uma válvula 1 6 controla o fluxo de dióxido de carbono e antígeno através da tubagem 15. Meios de aquecimento (não mostrados) são fornecidos embaixo da câmara 6. No interior da câmara 6 há uma pá giratória 17, a qual é operável para misturar anticorpo e sangue no interior da câmara 6. Um dispositivo de cronometragem (não mostrado) monitora um período de incubação quando o anticorpo e sangue permanecem no interior da câmara 6. O tempo que resta para incubação pode ser exibido no display do painel de controle 18.

Um recipiente de estocagem de saída, a saber uma bolsa de sangue de saída 19 também fica suspensa no dispositivo 1 e é interconectada com a câmara 6 via tubagem 20. A tubagem 20 p assa através de um vedador térmico 21, o qual é operável para vedar o tubo 20 e desse modo a bolsa de sangue de saída 19. Uma bomba peristáltica adicional (não mostarda) é fornecida para bombear o conteúdo da câmara 6 para o interior da bolsa de sangue de saída 19.

A câmara 6 juntamente com a tubagem 7, 20 e a bolsa de sangue de saída 19 são itens descartáveis que são descartados após cada procedimento.

Em operação, o usuário insere no dispositivo 1 uma bolsa de sangue de saída 19, uma câmara 6 e tubagem 7, 20. A tubagem 20 é passada através do vedador térmico 21 e bomba

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35/176 peristáltica. A tubagem 7 é passada através da outra bomba peristáltica e célula de fluxo de contador coulter 9. O usuário também insere a bolsa de sangue 4 que contém sangue de um paciente e fixa a mesma à tubagem 7. Além do acima o usuário fixa a tubagem 15 da câmara 6 no filtro estéril 13. O usuário fecha então o painel frontal 3 do alojamento 2 e inicia o dispositivo 1 utilizando o teclado do dispositivo, 22.

O dispositivo 1 pesa automaticamente a bolsa de sangue de entrada 4. O peso da bolsa de sangue de entrada 4 é enviado automaticamente para um sistema de computação central (não mostrado) localizado no interior do dispositivo 1. Do peso da bolsa de sangue de entrada 4 o s sistema de computação pode determinar o volume de sangue na bolsa 4. A bomba peristáltica puxa então sangue da bolsa de sangue de entrada 4 através da tubagem 7. O sangue flui através da janela transparente 8 da tubagem 7 e o contador coulter 9 determina a concentração de células que passa através da tubagem 7. O contador coulter envia um sinal direto para o sistema de computação central. O sistema de computação central determina do volume calculado de sangue e da concentração de células o volume correto de anticorpos que necessita ser colocado através de seringa para o interior da câmara 6 por uma ou mais das seringas 10, 11. A bomba peristáltica continua a bombear o sangue da bolsa 4 até que um sinal seja recebido do sistema de computação central, que pára a bomba. O sinal do sistema de computação central é enviado em resposta a um sinal do contador coulter 9 para o

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36/176 sistema de computação central, cujo sinal é enviado quando o contador coulter 9 sente que não há mais células passando pela janela 8.

O sistema de computação central sinaliza então o motor escalonado (não mostrado) fixado nas seringas 10, 11 para comprimir uma ou mais das seringas 10, 11 a fim de fornecer o volume calculado de anticorpo para o interior da câmara 6 via tubagem 15.

O dispositivo então introduz, opcionalmente, dióxido de carbono através do orifício de entrada de dióxido de carbono 14 pela abertura da válvula 16 (o mecanismo de abrir e fechar da válvula 16 sendo controlável pelo sistema de computador central). A quantidade de dióxido de carbono a ser adicionada é calculada pelo sistema de computação central com base no volume conhecido de ar na câmara 6, tubagem 7, 20 e bolsa de sangue de saída 19 e volume calculado de sangue da bolsa de sangue de entrada. A concentração final de dióxido de carbono na câmara 6 é levada até aproximadamente 5%. O dióxido de carbono é introduzido na câmara 6 através da tubagem 15. O dióxido de carbono sopra desse modo através de qualquer anticorpo restante na tubagem 15, desse modo assegurando que todo o anticorpo liberado seja adicionado à câmara 6. A bolsa de sangue de entrada 4, após ficar vazia, atua como uma bexiga de ar para acomodar o volume adicional de gás após introdução do dióxido de carbono.

O dispositivo pode compreender ainda um aquecedor (não mostrado) , sob o controle do sistema de computador

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37/176 central, cujo aquecedor é situado embaixo d a câmara 6 e controla a temperatura na câmara 6 entre 25 e 37°C. Um termostato conectado ao aquecedor evita super- ou subaquecimento.

O sangue e agente de anticorpo são a seguir incubados na câmara 6 por um período predeterminado. De forma adequada, o período de incubação não excede 24 horas e

é preferivelmente	entre 4 e	8 horas.	0 tempo	selecionado
deve ser suficiente para	permitir	que	a	reação de
retrodiferenciação	ocorra.
Durante	incubação	os braços	de	Pá	17	giram
lentamente a fim	de efetuar	a mistura	do	anticorpo	e do

sangue.

Após término do período de incubação, os braços de pá 17 continuam a girar e atuam efetivamente como braços raspadores para desalojar quaisquer células presas na superfície d a câmara 6 e desse modo facilitar a colheita das células. A bomba peristáltica puxa o conteúdo da câmara 6 (isto é, sangue contendo células não diferenciadas, isto é células tronco) do fundo da câmara 6 e para o interior da bolsa de sangue de saída 19. A bomba continua a bombear até que um volume medido de sangue (como determinado pelo uso de uma bomba peristáltica calibrada) tenha entrado na bolsa de sangue de saída 19.

Finalmente, o vedador térmico 21 fixa a tubagem 20 e faz com que uma extensão de aproximadamente 2 cm da tubagem 20 seja vedada, o vedador 21 corta então a tubagem 20 aproximadamente no c entro da vedação.

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O dispositivo 1 pode notificar então o usuário de que o processo está concluído.

O usuário pode remover então a bolsa de sangue de saída 19. A câmara 6 juntamente com a tubagem 7, 20 e a bolsa de sangue de entrada 4 podem ser descartadas.

A bolsa de sangue de saída 19 pode, se necessário, ser transferida para um sistema d e purificação, por exemplo para um sistema a fim de identificar células tendo marcadores de superfície de células característicos de células não diferenciadas, embora alterações morfológicas também possam ser utilizadas como guia. O s sistema de purificação pode ser utilizado para remover agente de anticorpo e/ou opcionalmente enriquecer as células (tronco) não diferenciadas. Um sistema de purificação adequado é o sistema de purificação CliniMAcs/Isolex.

II. Células não diferenciadas e______células diferenciadas

Há muitas células não diferenciadas e células diferenciadas encontradas in vivo e o estado da técnica está repleto de ensinamentos gerais sobre as mesmas.

Como exemplo, com relação a células das linhagens de células hematopoiéticas, pode-se fazer referência a inter alia, Levitt e Mertelsman 1995 (Haematopoietic Stem Cells, publicado por Marcei Dekker Inc. - especialmente páginas 4559) e Roitt e outros (Immunology, 4^a edição, Eds. Roitt, Brostoff e Male 1996, Publ.Mosby - especialmente capitulo 10) .

Uma célula não diferenciada é uma célula imatura

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39/176 que não exibe um tipo diferenciado maduro porém é capaz de fornecer progênie que o faz. Um exemplo conhecido de uma célula não diferenciada é uma célula tronco.

Células tronco são células imaturas não diferenciadas, capazes de auto-renovação (divisão sem limite) e diferenciação (especialização). Essas células juvenis são abundantes em um embrião em desenvolvimento; contudo, seus números diminuem à medida que o desenvolvimento progride. Por contraste, um organismo adulto contém um número limitado de células tronco que são confinadas a certos compartimentos de corpo.

Acredita-se genericamente que células tronco sejam monopotentes, bipotentes ou pluripotentes. Células tronco monopotentes e bipotentes são mais limitadas em desenvolvimento e originam um ou dois tipos de células especializadas, respectivamente. Em contraste, as células tronco pluripotentes (PSCs) podem diferenciar-se em muitos tipos diferentes de células, originando tecido (que constituem órgãos) ou no caso de células tronco totipotentes, o organismo inteiro.

Células tronco pluripotentes, ao contrário de monopotentes ou bipotentes, são capazes de diferenciação multilinhagem, originando um tecido o qual consistiría em uma coleção de células de diferentes tipos ou linhagens.

A Célula Tronco Hematopoiética é um exemplo de uma célula tronco pluripotente que é encontrada entre células medulares e origina todas as diversas células sangüineas (incluindo leucócitos e eritrócitos).

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Sangue é um tecido de fluido, consistindo em Linfócito (Ly), Monócitos (Mo), Neutrófilos (Ne), Basófilos (Ba), Eosinófilos (Eso), Plaquetas (Pl) e Hemácias (Rbc) vide a figura 3. Este tecido especializado é produzido pela diferenciação de Células Tronco Hematopoiéticas (Hsc). Em geral, os leucócitos (circulo maior interno) combatem infecções enquanto as hemácias (circulo menor interno) transportam nutrientes, oxigênio e produtos residuais pelo corpo.

Anteriormente, células tronco hematopoiéticas foram extraídas por isolamento de (i) medula óssea, (ii) sangue periférico com fator de crescimento mobilizado ou (iii) sangue de cordão (placenta). Recentemente, células tronco hematopoiéticas foram preparadas de células tronco embriônicas (ES), as quais são extraídas de embriões obtidos utilizando técnicas de fertilização in vitro. Essas células não diferenciadas são capazes de diferenciação de multilinhagem e reconstituição de todo tecido corpóreo, isto é, são totipotentes.

Os métodos de extração acima mencionados são incômodos, às vezes perigosos e em certos casos podem ser discutidos como não éticos, especialmente, no caso do método de extração de células tronco embriônicas.

Há diversas células tronco não diferenciadas da linhagem hematopoiética. Estas incluem células tronco pluripotentes (PSCs), células tronco linfóides (LSCs), e células tronco mielóides (MSCs), conhecidas coletivamente como células progenitoras linfoematopoiéticas (LPCs). LSCs

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41/176 e MSCs são individualmente formadas pela diferenciação de

PSCs. Consequentemente, LSCs e MSCs são mais comprometidas do que PSCs.

Os exemplos de células diferenciadas da linhagem hematopoiética incluem células T, células B, eosinófilos, basófilos, neutrófilos, megacariócitos, monócitos, eritrócitos, granulócitos, mastócitos e linfócitos.

Células T e células B são formadas pela diferenciação de LSCs. Consequentemente, células T e células B são mais comprometidas do que LSCs. Em mais detalhes, a cadeia de diferenciação é LSC -> pro-B-célula ou protimócito. Pro-B-célula -> pre-B-célula -> célula-B madura -> célula de plasma. Protimócito -> timócito comum > timócitos maduros (linhagens citotóxica/supressora ou auxiliar/indutora) - vide a figura 4.

Eosinófilos, basófilos, neutrófilos, megacariócitos, monócitos, eritrócitos, granulócitos, mastócitos, NKs, e linfócitos são formados pela diferenciação de MSCs. Consequentemente, cada uma dessas células é mais comprometida do que MScs. Em mais detalhes, a cadeia de diferenciação é MSC -> megacarioblasto imaturo (-> megacarioblasto -> megacariócito -> plaqueta) ou proeritroblasto (-> eritroblasto -> reticulócito -> eritrócito) ou célula tronco mielomonocitica, uma célula tronco bipotente que diferencia em um mieloblasto (-> promielócito -> meilócito -> granulócito) ou um monoblasto (-> promonócito -> monócito -> macrófago) - vide a figura 5.

As vias de diferenciação de hematopoiese foram

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42/176 desse modo extensamente caracterizadas e os diversos estágios de células são facilmente identificáveis de acordo com morfologia e marcadores de superfícies de células específicos de linhagem (vide abaixo).

Outras células tronco incluem células tronco neurais, células tronco multipotentes que podem gerar neurônios, atrócitos e oligodendrócitos (Nakafuku e Nakamura, 1995, J. Neurosci Res., vol. 41 (2): 153-68; Anderson, 1994, FASEB J., vol. 8 (10): 707-13; Morshead e outros, 1994, Neuron, vol. 13(5): 1071-82). Células satélites de músculo esqueletal são outro tipo de célula tronco, mais especificamente uma classe distinta de células miogênicas que são mantidas como células tronco quiescentes no adulto e podem originar novas células de músculo quando necessário ( (Bischoff, 1986, Dev Biol., vol. 115 (1): 129-39). Outros tipos de células tronco são células tronco epiteliais, um subconjunto de células basais, células tronco endodérmicas e células tronco mesenquimais.

Um tipo muito importante de células tronco são as células tronco embriônicas (ES). Essas células foram extensamente estudadas e caracterizadas. Realmente, as células ES são rotineiramente utilizadas na produção de animais transgênicos. Células ES foram mostradas como diferenciando in vitro em vários tipos de células incluindo precursores linfóides (Potocnik e outros, 1994, EMBO J., vol. 13(22): 5274-83) e células neurais. US 5.843.780 e US 6.200.806 revelam o isolamento de células ES de primatas. Células ES são caracterizadas por diversos marcadores

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43/176 específicos de estágio como marcadores embriônicos específicos de estágio 3 e 4 (SSEA-3 e SSEA-4), glicoproteínas com elevado peso molecular TRA-1-60 e TRA-181 e fosfatase alcalina (Andrews e outros, 1984, Hybridoma, vol.3: 347-361; Kannagi e outros, 1983, EMBO J., vol. 2: 2355-2361; Fox e outros, 1984, Dev. Biol., vol. 103; 263:266; Ozawa e outros, 1985, Cell. Differ., vol. 16: 169173) .

Vários antigenos são associados a células não diferenciadas e diferenciadas. O termo associado aqui significam as células que expressam ou são capazes de expressar ou apresentar ou são capazes de serem induzidas a apresentar, ou compreendem, o(s) respectivo(s) antígeno(s).

A maioria das células não diferenciadas e células diferenciadas compreendem antigenos de Complexo de Histocompatibilidade Principal (MHC) Classe I e/ou antigenos Classe II. Se esses antigenos forem associados àquelas células então eles são denominados células Classe I⁺ e/ou classe II⁺.

Cada antígeno especifico associado a uma célula não diferenciada ou a uma célula diferenciada pode agir como um marcador. Consequentemente, tipos diferentes de células podem ser distinguidos entre si com base em seu(s) antígeno(s) especifico(s) associado(s) ou com base em uma combinação especifica de antigenos associados.

Os exemplos desses antigenos marcadores incluem os antigenos CD34, CD19 e CD3. Se estes antigenos estiverem presentes então essas células especificas são denominadas

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44/176 células CD34⁺, CD19⁺ e CD3⁺ respectivamente. Se esses antígenos não estiverem presentes então essas células são denominadas células CD34^-, CD19^- e CD3~, respectivamente.

Em mais detalhes, PSCs são células CD34⁺ DR~n TdT~ (outros marcadores úteis sendo CD38^- e CD36 ⁺ ) . LSCs são células DR⁺, CD34⁺ e TdT⁺ (também CD38⁺) . MSCs são células CD34-, DR⁺, CD13+, CD33⁺, CD7⁺ e TdT⁺. Células B são células CD19+, CD21+, CD22+ e DR. Células T são células CD2+, CD3⁺ e CD4⁺ ou CD8⁺. Linfócitos imaturos são células CD4⁺ e CD8⁺. Células T ativadas são células DR⁺. Células exterminadoras naturais (NKs) são células CD56⁺ e CD16⁺. Linfócitos T são células CD7⁺. Leucócitos são células CD45^-. Granulócitos são células CD13⁺ e CD33⁺. Células de macrófago monócito são células CD14^- e DR⁺. Detalhes adicionais são fornecidos nas figuras 4 e 5.

Células tronco embriônicas expressam SSEA-3 e SSEA-4, glicoproteínas com elevado peso molecular TRA-1-60 e TRA-1-81 e fosfatase alcalina. Elas não expressam tambémSSEA-1, cuja presença é um indicador de diferenciação. Outros marcadores são conhecidos para outros tipos de células tronco, como Nestein para células tronco neuroepiteliais (J. Neurosci, 1985, vol.5: 3310). Células tronco mesenquimais são positivas para SH2, SH3, CD29, CD44, CD71,

CD90, CD106, CD120a e CD124, por exemplo e negativas para CD34, CD45 e CD14.

Alternativamente, ou além disso, muitas células podem ser identificadas por características morfológicas. A

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45/176 identificação de células utilizando microscopia, opcionalmente com técnicas de coloração é um ramo extremamente bem desenvolvido da ciência denominado histologia e as habilidades relevantes são amplamente possuídas no estado da técnica. Evidentemente, coloração de células será realizado apenas em alíquotas de células para confirmar identidade uma vez que colore em geral causam morte das células.

Consequentemente, procurando a presença dos marcadores de antígeno acima listados é possível identificar certos tipos de células (por exemplo quer seja ou não uma célula não diferenciada ou uma célula diferenciada) e a especialização daquele tipo de células (por exemplo se esta célula é uma célula T ou uma célula B).

Células não diferenciadas podem compreender quaisquer componentes que são relacionados à apresentação , captura ou reconhecimento de antigenos. Preferivelmente, a célula não diferenciada é uma célula MHC Classe I⁺ e/ou MHC Classe II⁺.

A célula mais comprometida pode compreender quaisquer componentes que estão relacionadas à apresentação, captura ou reconhecimento de antígeno. Preferivelmente, a célula mais comprometida é uma célula MHC Classe I⁺ e/ou MHC Classe II⁺.

A célula mais comprometida é qualquer célula derivada ou derivável de uma célula não diferenciada. Desse modo, em uma modalidade preferida, a célula mais comprometida também é uma célula não diferenciada. Como

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46/176 exemplo portanto a célula não diferenciada mais comprometida

pode ser uma	célula	tronco linfóide ou uma	célula	tronco
mielóide, e a	célula	não diferenciada é uma	célula	tronco
pluripotente.
Em	outra	modalidade preferida,	a	célula

mais comprometida é uma célula diferenciada, como uma célula CFC-T, uma célula CFC-B, uma célula CFC-Eosina, uma célula CFC-Bas, uma célula CFC-Bas, uma célula CFC-GM, uma célula CFC-MEG, uma célula BFC-E, uma célula CFC-E, uma célula T, uma célula B, um eosinófilo, um basófilo, um neutrófilo, um monócito, um megacariocito ou um eritrócito; e a célula não diferenciada é uma célula tronco mielóide, uma célula tronco linfóide ou uma célula tronco pluripotente.

Se a célula mais comprometida for uma célula diferenciada então preferivelmente a célula diferenciada é um linfócito B(ativado ou não ativado),um linfócito T (ativado ou não ativado), uma célula da linhagem de monócito macrófago, uma célula nucleada capaz de expressar antigenos classe I ou classe II, uma célula que pode ser induzida a expressar antigenos classe I ou classe I ou uma célula enucleada (isto é uma célula que não contém um núcleo - como uma hemácia).

Em modalidades preferidas alternativas a célula diferenciada é selecionada de qualquer um de um grupo de células compreendendo grandes linfócitos granulares, linfócitos nulos e células exterminadoras naturais cada uma expressando os receptores de superfície de célulaCD56 e/ouCD16.

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A célula diferenciada pode ser mesmo formada pela nucleação de uma célula enucleada.

III. Agentes

O agente prende operavelmente a célula mais comprometida a fim de retrodiferenciar aquela célula em uma célula não diferenciada. A este respeito, o agente para a retrodiferenciação da célula mais comprometida na célula não diferenciada pode agir em aprisionamento direto ou em aprisionamento indireto com a célula mais comprometida.

O agente pode agir intracelularmente na célula mais comprometida. Contudo, preferivelmente, o agente atua extracelularmente da célula mais comprometida.

Um exemplo de aprisionamento direto é quando a célula mais comprometida pelo menos tem um receptor de superfície de célula em sua superfície de célula, como uma cadeia-β tendo regiões homólogas (regiões que são comumente encontradas tendo a mesma seqüência ou uma seqüência similar) como aquelas que podem ser encontradas nas células B, e em que o agente prende diretamente o receptor de superfície de células. Outro exemplo é quando a célula mais comprometida tem um receptor de superfície de célula em sua superfície de célula como uma cadeia-α tendo regiões homólogas como aquelas que podem ser encontradas de células T, e onde o agente prende diretamente o receptor de superfície de células.

Um exemplo de aprisionamento indireto é quando a célula mais comprometida tem pelo menos dois receptores de superfície de célula em sua superfície de célula e

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48/176 aprisionamento do agente com um dos receptores afeta o outro receptor que então induz retrodiferenciação da célula mais comprometida.

O agente para a retrodiferenciação da célula mais comprometida em uma célula não diferenciada pode ser um composto ou composição química. Preferivelmente, contudo, o agente o é capaz de prender um receptor de superfície de células na superfície da célula mais comprometida. Desse modo, em uma modalidade preferida, o agente prende operavelmente um receptor presente na superfície da célula mais comprometida - cujo receptor pode ser expresso pela célula mais comprometida como um receptor que é capaz de ser expresso pela célula mais comprometida.

Por exemplo, agentes preferidos incluem qualquer um ou mais de monofosfato adenosina cíclica (cAMP),uma molécula CD4, uma moléculaCD8, uma parte ou todo um receptor de célula-T, um ligando (fixo ou livre),um peptideo, um receptor de célula-T (TCR),um anticorpo, um anticorpo reativo-cruzado, um anticorpo monoclonal, ou um anticorpo policlonal. Fatores de crescimento podem ser utilizados também, como fatores de crescimento hematopoiéticos, por exemplo eritropoietina e fator de estimulação de colônia de monócito-granulócito (GM-CSF).

Se o agente for um anticorpo, um anticorpo reativo-cruzado, um anticorpo monoclonal, ou um anticorpo policlonal, então preferivelmente o agente é qualquer um ou mais de um anticorpo, um anticorpo reativo-cruzado, um anticorpo monoclonal, ou um anticorpo policlonal para

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49/176 qualquer um ou mais de: cadeia β de um antígeno MHC classe II, a cadeia β de um antígeno MHC HLA-DR, a cadeia a de um antígeno MHC classe I ou classe II, a cadeia oc de antígeno HLA-DR, a cadeia OC e β do antígeno MHC classe II ou de um antígeno MHC classe I. Um exemplo de um anticorpo adequado é CR3/43(fornecido por Dako).

O termo anticorpo inclui os diversos fragmentos (quer derivados por divagem proteolitica ou tecnologia recombinante) e derivados que retêm atividade de ligação, como Fab, F(ab')2 e anticorpos ScFv, bem como mimético ou bioisoésteres dos mesmos. São também incluídos como anticorpos variantes geneticamente construídas onde algumas das seqüências de aminoácidos foram modificadas, por exemplo por substituição de resíduos de aminoácidos para aumentar a ligação ou onde os anticorpos foram feitos em uma espécie diferente para o organismo cujas células se deseja tratar de acordo com os métodos da invenção, para diminuir a possibilidade de reações imunes adversas(um exemplo disto são anticorpos monoclonais de camundongo humanizados).

Agentes utilizados para efetuar a conversão de uma célula mais comprometida em uma célula não diferenciada atuam preferivelmente extracelularmente da célula mais comprometida. Em particular, prefere-se que a célula mais comprometida compreenda um receptor que seja operavelmente preso pelo agente e o agente prenda operavelmente o receptor.

Por exemplo, o receptor pode ser um receptor de superfície de célula. Os exemplos específicos de receptores

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50/176 de superfície de células incluem receptores MHC classe I e classe II. Preferivelmente, o receptor compreende um componente α e/ou um componente β, como é o caso para os receptores MHC classe I e classe II.

Mais preferivelmente, o receptor compreende uma cadeia-β tendo regiões homólogas, por exemplo pelo menos as regiões homólogas da cadeia-β de HLA-DR.

Alternativamente, ou além disso, o receptor compreende uma cadeia-α tendo regiões homólogas, por exemplo pelo menos as regiões homólogas da cadeia-α de HLA-DR.

Preferivelmente, o receptor é um antígeno classe I ou lasse II do complexo de histocompatibilidade principal(MHC). Em modalidades preferidas o receptor de superfície de célula é qualquer um de: um receptor HLA-DR, um receptor DM, um receptor DP, um receptor DQ, um receptor HLA-F, ou um receptor HLA-G. Em modalidades mais preferidas o receptor de superfície de células é um receptor HLA-DR.

Preferivelmente, o agente é um anticorpo para o receptor, mais preferivelmente o agente é um anticorpo monoclonal ao receptor.

Outro exemplo preferido de um agente é um que modula expressão de gene MHC como expressão MHC Classe I⁺e/ou MHC Classe II⁺.

Em uma modalidade preferida, o agente é utilizado em combinação com um modificador de resposta biológica. Os exemplos de modificadores de resposta biológica incluem um agente de alquilação, um imunomodulador, um fator de crescimento, uma citocina, um receptor de superfície de

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51/176 células, um hormônio, um ácido nucléico, uma seqüência de nucleotideos, um antígeno ou um peptídeo. Um agente de alquilação preferido é ou compreende ciclofosfoamida.

Outros modificadores de resposta biológica preferidos incluem compostos capazes de regular ascendentemente expressão de antígeno MHC classe I e/ou classe II. Em uma modalidade preferida, isto é desse modo para permitir que um agente que se liga a um receptor MHC trabalhe deforma mais eficaz.

Uma vez que qualquer tipo de células pode ser feito expressar antigenos MHC classe I e/ou classe II, este deve prover um método para retrodiferenciação de uma ampla variedade de tipos de células quer eles expressem ou não constitutivamente, antigenos MHC classe I e/ou classe II.

IV. Métodos para retrodiferenciar células

Nos métodos da invenção, uma população de células compreendendo células comprometidas é contatada com um agente que prende operavelmente uma ou mais células comprometidas na população. A população de células é então incubada de modo a permitir que aquelas células que foram operavelmente presas pelo agente avancem através do processo de retrodiferenciação e finalmente se tornem não diferenciadas.

Preferivelmente, a etapa de contato compreende o agente prendendo qualquer um ou mais dos que se seguem: regiões homólogas da cadeia-α de antigenos classe I, regiões homólogas da cadeia-α de antigenos classe II, um receptor de superfície de células CD4, um receptor de

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52/176 superfície de células CD8, regiões homólogas da cadeia-β de antigenos da classe II na presença de linfócitos, regiões homólogas da cadeia-α de antigenos da classe I na presença de linfócitos, ou regiões homólogas da cadeia-α de antigenos classe II na presença de linfócitos. Preferivelmente, a etapa de contato ocorre na presença do modificador de resposta biológica (vide acima).

Tipicamente, a população de células é derivada de uma amostra biológica, como sangue ou tecidos relacionados incluindo medula óssea, tecido neuronal do sistema nervoso central ou sistema nervoso periférico, tecido de músculo, ou epiderme e/ou tecido de derme da pele (isto é, por meio de raspagem oral por exemplo). Preferivelmente, o material biológico é de origem pós-natal. Prefere-se utilizar sangue integral ou seus produtos processados, como plasma ou revestimento buffy, uma vez que sua remoção de indivíduos pode ser realizada com o mínimo de supervisão médica. Amostras de sangue são tipicamente tratadas com anticoagulantes como heparina ou citrato. Células na amostra biológica podem ser tratadas para enriquecer certos tipos de células, remover certos tipos de células ou dissociar células de uma massa de tecido. Métodos úteis para purificar e separar células incluem centrifugação (como centrifugação de gradiente de densidade), citometria de fluxo e cromatografia por afinidade (como o uso de contas magnéticas compreendendo anticorpos monoclonais para marcadores de superfície de células ou panning)(vide Vettese-Dadey The Scientist (13 de setembro de 1999) 13 (18):21).Como exemplo,

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53/176 a separação Ficoll-Hypaque é útil para remover eritrócitos e granulócitos para deixar células mononucleares como linfócitos e monócitos.

Uma vez que as células são essencialmente culturas primárias, pode ser necessário suplementar populações de células com nutrientes adequados para manter viabilidade. Condições de cultura adequadas são conhecidas pela pessoa versada no estado da técnica. Não obstante, o tratamento de populações de células é preferivelmente iniciado assim que possível após remoção de amostras biológicas de pacientes, tipicamente no prazo de 12 horas, preferivelmente em 2 a 4horas. A viabilidade de células pode ser verificada utilizando técnicas bem conhecidas como exclusão de azul tripano.

Populações de células são genericamente incubadas com um agente por pelo menos duas horas, tipicamente entre 2 e 24 horas, preferivelmente entre 2 e 12 horas. Incubações são tipicamente realizadas de aproximadamente temperatura ambiente, por exemplo aproximadamente 22°C, até aproximadamente 37°C, incluindo 33°C. O progresso do procedimento de retrodiferenciação pode ser verificado periodicamente removendo uma pequena alíquota da amostra e examinando células utilizando microscopia e/ou citometria de fluxo. Alternativamente, o dispositivo pode compreender meios de rastreamento para monitoração on-line do progresso do procedimento de retrodiferenciação.

Após os números relativos do tipo de célula desejado terem aumentado para um nível adequado, que pode

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54/176 ser por exemplo tão baixo quanto 0,1% ou tão elevado quanto 5%, as populações de células alteradas resultantes podem ser utilizadas em diversos modos. Com relação aos números de células não diferenciadas formadas, é importante apreciar a capacidade de proliferação de células tronco. Embora sob algumas circunstâncias, os números de células tronco ou outras células não diferenciadas formadas possa parecer ser baixo, os estudos mostraram que apenas 50 células tronco hematopoiéticas pluripotentes podem reconstituir um sistema hematopoiético inteiro em um camundongo doador. Desse modo a utilidade terapêutica não requer a formação de um grande número de células.

A conversão de células mais comprometidas em células não diferenciadas também pode ser realizada in vivo por administração do agente, misturado com um veiculo farmacêutico ou diluente, a um paciente. Contudo, preferese em muitos casos que a retrodiferenciação seja realizada in vitro/ex vivo.

Populações tratadas de células obtidas in vitro podem ser utilizadas subseqüentemente com processamento mínimo. Por exemplo, podem ser simplesmente combinadas com um veiculo farmaceuticamente aceitável ou diluente e administradas a um paciente necessitando de células tronco.

Pode ser contudo desejável enriquecer a população de células para as células não diferenciadas ou purificar as células da população das células. Isto pode ser convenientemente realizado utilizando diversos processos (vide Vattese-Dadey - The Scientist 13 (18): 21 de setembro

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55/176 de 1999). Um dispositivo de acordo com a presente invenção pode compreender opcionalmente meios de purificação ou isolamento para enriquecer as referidas células não diferenciadas ou recuperar as referidas células não diferenciadas da população de células alteradas. Por exemplo células podem ser purificadas com base nos marcadores de superfície de células utilizando cromatografia e/ou citometria de fluxo. Não obstante, freqüentemente não será necessário nem desejável purificar extensamente células não diferenciadas da população de células uma vez que outras células presentes na população (por exemplo células estromais) podem manter a função e viabilidade de células de tronco.

Citometria de fluxo é uma técnica bem estabelecida, segura e potente para caracterizar células nas populações mistas bem como para separar células. Desse modo, os meios de purificação ou isolamento podem compreender um citômetro de fluxo. Citometria de fluxo opera com base em características físicas de partículas em suspensão liquida, que podem ser distinguidas quando interrogadas com um feixe de luz. Tais partículas podem evidentemente ser células. Características físicas incluem tamanho e estrutura de células ou, como se tornou muito popular nos últimos anos, marcadores de superfície de células ligados por anticorpos monoclonais conjugados com moléculas fluorescentes.

Kreisseg e outros, 1994, J. Hematother 3(4): 26389, declaram Devido à disponibilidade de anticorpos

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56/176 monoclonais anti-CD34, citometria de fluxo de multiparâmetros se tornou a ferramenta escolhida para determinação de células progenitoras e tronco hemapoiéticas e continuam descrevendo técnicas gerais para quantificação e caracterização de células que expressam CD34 por citometria de fluxo. Além disso, Korbling e outros, 1994, BoneMarrow Transplant. 13: 649-54, revelam purificação de células CD34⁺por imunoadsorção seguido por citometria de fluxo baseada na expressão HLA-DR. Como discutido acima, CD34⁺ é um marcador útil com relação a células progenitoras/células tronco.

Técnicas de citometria de fluxo para separar células tronco baseadas em outras características físicas também são disponíveis. Por exemplo, Visser e outros, 1980, Blood Cells 6:391-407 revelam que células tronco podem ser isoladas com base em seu tamanho e grau de estrutura. Grogan e outros, 1980, Blood Cells, 6:625-44 também revelam que células tronco viáveis podem ser separadas de tecidos hematopoiéticos simples em pureza elevada e verificável.

Também a seleção para células com base na presença de um marcador de superfície de células outra propriedade física (seleção positiva), populações de células podem ser enriquecidas, purificadas utilizando critérios negativos. Por exemplo, células que possuem marcadores específicos de linhagem como CD4, CD8, CD42 e CD3 podem ser removidos da população de células por citometria de fluxo ou cromatografia por afinidade.

Uma técnica muito útil para purificar células envolve o uso de anticorpos ou outros ligandos por afinidade

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57/176 ligados a contas magnéticas. As contas são incubadas com a população de células e células que têm um marcador de superfície de células, como CD34, ao qual o ligando de afinidade se liga, são capturadas. O tubo de amostra contendo as células é colocado em um concentrador de amostra magnético onde as contas são atraídas para os lados do tubo. Após um ou mais estágios de lavagem, as células de interesse foram parcial ou substancialmente totalmente purificadas de outras células. Quando utilizadas em um formato de seleção negativo, em vez de lavar células ligadas às contas descartando a fase liquida, a fase liquida é mantida e consequentemente, as células ligadas às contas são efetivamente removidas da população de células.

Estes métodos de purificação baseados em ligando por afinidade podem ser utilizados com qualquer tipo de células para os quais marcadores adequados foram caracterizados ou podem ser caracterizados.

Urbankova e outros, 1996 (J. Chromatogr B Biomed Appl. 687: 449-52) revelam a micropreparação de células tronco hematopoiéticas de uma suspensão de medula óssea de camundongo por fracionamento de fluxo de campo gravitacional. Urbankova e outros, 1996, comentam ainda que o método foi utilizado para a caracterização de células tronco de medula óssea de camundongo porque essas células são maiores do que as outras células na medula óssea e é portanto possível separar as mesmas da mistura. Desse modo, parâmetros físicos diferentes dos marcadores de superfície de célula podem ser utilizados para purificar/enriquecer

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58/176 células tronco.

Populações de células compreendendo células não diferenciadas e células não diferenciadas purificadas produzidas pelos métodos da invenção podem ser mantidas in vitro utilizando técnicas conhecidas. Tipicamente, meios de crescimento mínimo como Hanks, RPMI 1640, Meios Essenciais Mínimos de Dulbecco (DMEM) ou Meio de Dulbecco Modificado por Iscove são utilizados, suplementados com soro de mamífero como FBS, e opcionalmente plasma autólogo, a fim de fornecer um ambiente de crescimento adequado para as células. Em uma modalidade preferida, células tronco são cultivadas em camadas alimentadoras como camadas de células estromais (vide Deryugina e outros, 1993, Crit. Rev. Immunology, vol. 13: 115-150). Acredita-se que células estromais secretem fatores que mantenham células progenitoras em um estado não diferenciado. Um sistema de cultura a longo prazo para células tronco é descrito por Dexter e outros, 1977 (J. Cell Physiol., vol. 91: 335) e Dexter e outros, 1979 (Acta. Haematol., vol. 62: 299).

Por exemplo, Lebkowski e outros, 1992 (Transplantation 53(5): 1011-9) revela que células hematopoiéticas CD34⁺ humanas podem ser purificadas utilizando uma tecnologia baseada no uso de anticorpos monoclonais que são covalentemente imobilizados em superfícies de poliestireno e que as células CD34⁺purificadas por este processo podem ser mantidas com viabilidade superior a 85%. Lebkowski e outros, 1993 (J. Hematother., 2(3): 339-42) também revela como isolar e

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59/176 cultivar células CD34⁺ humanas. Vide também Haylocke outros, 1994 (lummunomethods, vol. 5(3): 217-25) para um exame de vários métodos.

A confirmação de identidade de células tronco pode ser realizada utilizando diversos ensaios in vitro como ensaios CFC (vide também, os exemplos). Células tronco hematopoiéticas muito primitivas são freqüentemente medidas utilizando o ensaio de célula de inicio de cultura a longo prazo (LTC-IC) (Eaves e outros, 1991. J. Tiss. Cult. Meth. vol. 13:55-62). LTC-ICs mantêm haemapoiese por 5 a 12 semanas.

Populações de células compreendendo células não diferenciadas e preparados purificados compreendendo células não diferenciadas podem ser congeladas para uso futuro. Técnicas adequadas para congelar células e subseqüentemente revivê-las são conhecidas no estado da técnica. Um dispositivo de acordo com a presente invenção pode compreender ainda opcionalmente meios de congelamento para congelar populações de células compreendendo células não diferenciadas e/ou preparados purificados compreendendo células não diferenciadas.

Em um aspecto, preferivelmente a retrodiferenciação ocorre para células de ou em amostras de sangue revestido buffy. O termo revestido buffy quer dizer a camada de células brancas que se forma entre a camada de células vermelhas e o plasma quando sangue não coagulado é centrifugado ou deixado em repouso.

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V. Deslocamento da razão de células diferenciadas normais em uma população de células

Em tecido normal o número relativo dos vários tipos de células, incluindo células diferenciadas e não diferenciadas, em um dado momento é normalmente constante. Por exemplo, uma contagem de leucócitos de um indivíduo de 21 anos, saudável, seria tipicamente aproximadamente 8 x 10⁶por ml, dos quais 27% são linfócitos, 6%são monócitos e 67% são granulócitos. O nível de tais células (incluindo tanto

o número	relativo	como	a contagem	de	células	absoluta) é
perturbadc	> durante	a	doença, como	é	o caso	no sangue
leucêmico	de pacientes	com leucemia	linfocitica	crônica de
células B	(B-CLL).
	0 número	relativo (isto	é,	razão)	de células

diferenciadas pode ser perturbado, alterado ou deslocado por exemplo em frações de células mononucleares colocando sangue integral ou revestimentos buffy em Histopaque a fim de remover granulócitos, desse modo para efetuar retrodiferenciação de células diferenciadas em células não diferenciadas, cujas células não diferenciadas se autorenovarão (proliferarão) e rediferenciarão em uma variedade de tipos de células para reabastecer as células deslocadas.

O número relativo (isto é, razão) de células diferenciadas também pode ser perturbado, alterado ou deslocado, por exemplo, em revestimentos buffy (obtidos de doadores de sangue, saudáveis) após remoção (por centrifugação em meio gradiente de densidade ou seleção negativa utilizando contas magnéticas revestidas com

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61/176 anticorpo) de hemácias, plaqueta, granulócitos, monócitos e linfócitos T. Este tratamento pode ser denominado seleção negativa ou enriquecimento de um certo tipo de célula diferenciada e é um exemplo de um tecido deslocado. Quando tais células são cultivadas, por exemplo, em um meio contendo cálcio como Meio de Dulbecco Modificado por Iscove (ISDM), células diferenciadas serão submetidas à retrodiferenciação em células não diferenciadas, cujas células não diferenciadas se auto-renovarão (proliferarão) e rediferenciarão em uma variedade de tipos de células para reabastecer as células deslocadas.

Durante este processo as células são primeiramente vistas se agrupando em colônias (são submetidas a agregação homocitica) a fim de serem submetidas à retrodiferenciação. Após as células mais comprometidas se converterem em células não diferenciadas elas adquirem a capacidade de proliferarem e desenvolverem em uma variedade de tipos de células retrodiferenciadas, em um esforço para reabastecer o número relativo de células deslocadas.

Meios de retrodiferenciação operáveis para deslocar a razão de células diferenciadas normais em uma população de células incluem, por exemplo, anticorpos (puros e conjugados, isto é ligados a ligandos fixos e livres como contas magnéticas, de vido ou poliestireno por exemplo); Histopaque, LymphoPrep ou qualquer meio gradiente de densidade utilizado para separar células de acordo com a densidade das células; ou Dextrano (capaz de causar sedimentação de hemácias, por exemplo). Outros meios de

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62/176 retrodiferenciação adequados podem ser identificados em um artigo por Vettese-Dadey (vide The Scientist (13 de setembro de 1999) 13 (18) :21) .

A exposição de células deslocadas a agente de quelação adequado, incluindo EDTA, EGTA e heparina (cujo agente de quelação pode ser mencionado como modificador de resposta biológica) pode fazer com que células mais comprometidas retrodiferenciem em células não diferenciadas. Por exemplo, a exposição de células deslocadas a EDTA por um período de tempo predeterminado seguido pelo cultivo das células em um meio contendo cálcio que contém cortisona fez com que células mais comprometidas retrodiferenciassem em células não diferenciadas. Essas células por sua vez se auto-renovaram e embarcaram em uma nova via de diferenciação, originando progenitores de eritróide como unidade de formação de explosão-eritróide (BFU-eritróide). Os progenitores de eritróide podem ser cultivados e expandidos por longos períodos de tempo e podem ser utilizados no tratamento de distúrbio de sangue vermelho e falta de sangue vermelho.

VI. Alteração da concentração de íons livres de um meio que compreende uma população de células

A exposição de células diferenciadas a um agente de quelação de íons, como por exemplo EGTA, por um dado período de tempo seguido pela cultura de tais células em um meio contendo cálcio, como IMDM, contendo hidrocortisona faz com que células mais comprometidas retrodiferenciem em células não diferenciadas. Essas células por sua vez se

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63/176 auto-renovam e embarcam em uma nova via de diferenciação originando progenitores megacariociticos, como unidades de formação de colônia-megacariócitos (CFU-Meg), que origina finalmente plaquetas.

VII. Métodos para comprometer novamente células não diferenciadas

Uma aplicação importante de células não diferenciadas da presente invenção está na reconstituição de tecidos, por exemplo tecido nervoso ou células hematopoiéticas. Isto envolve diferenciar as células não diferenciadas produzidas pelos métodos da invenção. Isto pode ser realizado simplesmente administrando as células não diferenciadas a um paciente, tipicamente em um local especifico de interesse como a medula óssea, cordão espinhal ou pulmão, e permitindo que as condições fisiológicas naturais no paciente efetuem a diferenciação. Um exemplo especifico disto é a reconstituição ou suplementação do sistema hematopoiético, por exemplo no caso de pacientes com AIDS com número reduzido de linfócitos CD4⁺.

Alternativamente, a diferenciação (também denominada recomprometimento, aqui) pode ser efetuada in vivo e células expandidas então, por exemplo, administradas terapeuticamente. Isto é genericamente realizado pela administração de fatores de crescimento. Por exemplo, ácido retinóico foi utilizado para diferenciar células ES em células neuronais. Metilcelulose seguido por co-cultura com uma linhagem estromal de medula óssea e IL-7 foi utilizado para diferenciar células ES em precursores de linfócitos

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64/176 (Nisitani e outros, 1994, Int. Immuno., vol 6(6): 909-916). Le Page (New Scientist 16 de dezembro de 2000) revela que células ES podem ser diferenciadas em células epiteliais de pulmão. Bischoff, 1986 (Dev. Biol., vol. 115(1): 129-39) revela como diferenciar células satélite de músculo em fibras de músculo maduras. Células precursoras neurais podem ser expandidas com fator de crescimento de fibroblasto básico e fator de crescimento epidérmico (Nakafuku e Nakamura, 1995, J. Neurosci. Res., vol. 41(2): 153-168). Células tronco hematopoiéticas podem ser expandidas utilizando diversos fatores de crescimento incluindo GM-CSF, eritropoeitina, fator de célula tronco e interleucinas (II1, IL-3, IL-6) - vide Metcalf, 1989 (Nature, vol. 339: 2730) para um exame desses diversos fatores.

Potocnik e outros, 1994 (EMBO J., vol. 13(22): 5274-83) demonstraram até mesmo a diferenciação de células ES em células hematopoiéticas utilizando condições de oxigênio baixo (5%).

Desse modo, em uma modalidade preferida da presente invenção a célula não diferenciada é a seguir comprometida em uma célula recomprometida, como uma célula diferenciada. A célula recomprometida pode ser da mesma linhagem que a célula mais comprometida da qual a célula não diferenciada foi derivada. Alternativamente, a célula recomprometida pode ser de uma linhagem diferente da célula mais comprometida da qual a célula não diferenciada foi derivada. Por exemplo, um linfócito B pode ser retrodiferenciado em uma célula tronco CD34⁺ CD38^- HLA-DR^-.

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A célula tronco pode ser subseqüentemente recomprometida ao longo de uma linhagem de células B (a mesma linhagem) ou uma linhagem de linfóide (linhagem diferente).

O comprometimento da célula não diferenciada em uma célula recomprometida, como uma célula diferenciada, pode ser efetuado em vários modos conhecidos da pessoa versada. Notadamente o cultivo das células não diferenciadas em um modo especifico e em uma diferenciação de meios específicos em células selecionada, pode ser efetuado.

Apenas como exemplo, células não diferenciadas

podem	ser	diferenciadas	em	miócitos cardíacos seguindo	o
regime	de	cultivo salientado:
		1° dia: Passar	as	células não diferenciadas	em
densidade	normal em uma	placa gelatinizada para liberar	a

cultura de células de fibroblasto contaminantes.

Tripsinizar as células como para passagem normal até que as colônias sejam levantadas. Manipular suavemente a fim de manter os pedaços de células, frouxamente ligados,

juntos.	A seguir revestir diretamente as	células	1:3	em
pratos	Petri do	tipo bacteriano em meio	de cultura	de
células	ES livres	LIE (vide abaixo).
	3^o dia:	aspirar cuidadosamente o	meio.	Evitar

sugar uma quantidade demasiada dos agregados. A seguir acrescentar novo meio.

^o dia: aspirar como no 3^o dia e substituir o meio.

7^o dia: revestir as células em uma placa do tipo cultura de tecido de 24 rodas.

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9^o dia: alterar metade do meio e observar batida.

11° dia: alterar metade do meio e observar batida.

Como exemplo adicional, as células não diferenciadas podem ser diferenciadas em células gliais e neurônios seguindo o procedimento salientado:

I^o dia: passar as células não diferenciadas em densidade normal em uma placa gelatinizada para liberar a cultura de células de fibroblastos contaminantes.

Tripsinizar as células como para passagem normal até que as colônias sejam levantadas. Manipula suavemente a fim de manter os pedaços de células frouxamente ligados, juntos. A seguir revestir diretamente as células 1:3 em pratos Petri do tipo bacteriano em meio livre LIF contendo ΙμΜ ácido retinóico all-trans (comercializado por Sigma).

3^o dia: Coletar agregados de células e revestir novamente em pratos de cultura de tecido (aproximadamente 25 agregados de células por prato de cultura de 6 cm de tecido) em meio de cultura de células ES sem LIF ou RA. Aspirar cuidadosamente meio.

8^o dia: Mudar metade do meio. Deste dia em diante pelo menos 10% das células apresentam fenótipos neuronais. São coloridas especificamente com Violeta Cresil e fortemente positivos para o antígeno N-CAM.

Uma pessoa versada estaria prontamente ciente de procedimentos adequados para efetuar o comprometimento de uma célula não diferenciada em qualquer célula diferenciada selecionada.

Uma célula tronco não diferenciada da presente

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67/176 invenção pode ser cultivada utilizando qualquer técnica de cultivo de células tronco embriônica (ES) de rotina. Apenas como exemplo, um meio adequado para cultura de células ES ou não diferenciadas é detalhado abaixo.

Para prepara 100 ml de meio:

DMEM (GIBCO cat# 11965-062	80 ml
15% FCS	15 ml
Pen/Strep	1 ml
L-Glutamina	1 ml
aminoácidos não essenciais MEM(GIBCO cat#11140-050	1 ml
Lif (10³ U/ml)	1 ml
BME (0,1 M)	0,2 ml

O Lif vem em ampolas de 1 ml como LIF ESGRO AMRAD

a 10⁷ U/ml, este pode ser diluído em 100 ml DMEM e FCS a 10%
e armazenado	em alíquotas de	5 ml	a - 20.
Com	relação a BME,	0, 1	ml de BME	(14, 4M)	pode ser
adicionado a	14,3 ml de	PBS,	filtrado	através	de um
acrodisco de	0,2 micron, e armazenado a - 20	por até	1 mês .
Um	meio adequado	adicional pode	ser por	exemplo

meio PMEF 100 ml do qual é preparado como detalhado abaixo:

DMEM (GIBCO cat# 11965-062	88 ml
10% FCS	10 ml
Pen/Strep	1 ml
L-Glutamina	1 ml
BME (0,1 M)	0,2 ml

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Outros	meios adequados	para	cultivar	células	ES
seria facilmente	evidente	para aqueles	versados	no estado	da
técnica.
VIII.	Ensaios	para	identificar	agentes	de

retrodiferenciação

Além dos agentes mencionados acima, agentes adequados adicionais podem ser identificados utilizando métodos de ensaio de WO96/23870 ou da presente invenção. Em relação ao aspecto mencionado por último, a presente invenção também provê um método para identificar uma substância capaz de retrodiferenciar uma célula comprometida/diferenciada em uma célula não-diferenciada, cujo método compreende contatar uma população de células compreendendo células comprometidas com uma substância candidata e determinando se há aumento nos números relativos de células não diferenciadas na referida população de células, onde o referido contato ocorre na presença de um revestimento buffy.

Substâncias candidatas adequadas incluem ligandos que se ligam a receptores de superfície de células como produtos de anticorpo (por exemplo, anticorpos monoclonais e policlonais, anticorpos de cadeia única, anticorpos quiméricos e anticorpos enxertados-CRD), como anticorpos que se ligam a receptores de superfície de células. Receptores de superfície de células de interesse especifico são descritos acima e incluem receptores MHC e proteínas de superfície com designações de CD, como CD4 e CD8. Outros ligandos que se ligam a receptores de superfície de célula

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69/176 incluem fatores de crescimento.

Além disso, bibliotecas de combinação, peptideo e mimético de peptideo, entidades químicas definidas, oligonucleotideos, e bibliotecas de produtos naturais podem ser examinadas em relação à atividade como agentes de retrodiferenciação. As substâncias candidatas podem ser utilizadas em um exame inicial em bateladas, por exemplo, de 10 substâncias por reação, e as substâncias daquelas bateladas que mostram inibição testadas individualmente.

Um ensaio típico compreende colocar uma alíquota de células compreendendo células comprometidas em um recipiente adequado como uma placa de multicavidades. Uma substância candidata é adicionada à cavidade e as células incubadas na cavidade. Incubações são tipicamente realizadas de aproximadamente temperatura ambiente, por exemplo aproximadamente 22°C até aproximadamente 37°C incluindo 33°C.

Retrodiferenciação pode ser medida removendo uma pequena alíquota de células e examinando as células por microscopia e/ou citometria de fluxo a fim de determinar se houve alteração nos números de células não-diferenciadas. Tipicamente, a determinação de alterações nos números de células não diferenciadas é realizada monitorando alterações nos números de célula tendo marcadores de superfície de célula característicos de células não diferenciadas, embora alterações morfológicas também possam ser utilizadas como guia. Os exemplos de marcadores de superfície de célula adequados incluem CD34⁺. Alternativamente, ou além disso,

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70/176 reduções nos números de células tendo marcadores de superfície de células típicos de células diferenciadas e não células não-diferenciadas podem ser monitoradas, por exemplo uma redução nos números relativos de células que possuem marcadores específicas de linhagem como CD3, CD4 e CD8.

Preferivelmente, qualquer aumento nos números de células tendo características típicas de células não diferenciadas ocorre no prazo de 24 horas, preferivelmente 4 a 8 horas, de tal modo que quaisquer alterações não podem ser unicamente levadas em consideração por proliferação de células.

Pode ser desejável pré-examinar os agentes que se ligam a, por exemplo, receptores de superfície de células, como receptores MHC classe I ou classe II. Quaisquer agentes identificados como ligando a receptores de superfície de células alvo podem ser então utilizados no ensaio acima a fim de determinar seu efeito sobre retrodiferenciação. Como exemplo especifico, bibliotecas de exibição de fago que expressam domínios de ligação de anticorpo podem ser utilizadas para identificar fragmentos de anticorpos (tipicamente scFvs) que se ligam a um marcador de superfície de célula alvo, como a região homóloga da cadeia-β dos receptores MHC classe II. Ensaios de ligação adequados são conhecidos no estado da técnica, como o é a geração e exame de bibliotecas de exibição de fago. Os ensaios também podem ser utilizados para identificar anticorpos otimizados ou fragmentos de anticorpo, por exemplo para examinar uma biblioteca mutagenizada de

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71/176 derivados de um anticorpo já mostrado como efetuando retrodiferenciação.

IX. Usos

A presente invenção provê métodos de e um dispositivo para retrodiferenciar células comprometidas em células não diferenciadas. Em particular, a presente invenção provê um método e dispositivo para preparar uma célula tronco de uma célula mais diferenciada. As implicações clínicas disto são enormes uma vez que células tronco estão sendo utilizadas em uma ampla variedade de aplicações terapêuticas porém até agora foram difíceis, incômodas e às vezes eticamente controversas para se obter.

Células tronco produzidas de acordo com a presente invenção podem ser utilizadas para repovoar populações de células específicas em um paciente, como uma população de células hematopoiéticas ou uma subpopulação da mesma, como linfócitos-T CD4. As células mais comprometidas utilizadas para produzir as células tronco podem ser do mesmo paciente ou um doador correspondente. Desse modo, células tronco produzidas de acordo com a presente invenção podem ser utilizadas para cicatrizar e reconstituir tecido de célula especializada e órgãos. Por exemplo, células não diferenciadas poderiam ser utilizadas para produzir células recomprometidas como as células que revestem os alvéolos dos pulmões, desse modo criando um mecanismo pelo qual tecido de pulmão danificado ou doente pode ser substituído ou reparado (vide Le Page, New Scientist 19 de dezembro de 2000, pág. 20) .

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Desse modo, as células tronco produzidas de acordo com a presente invenção podem ser introduzidas no paciente para repovoar células no corpo. De forma adequada, as células tronco primeiramente enxertam e a seguir repovoam.

De modo adequado, as células tronco podem ser introduzidas i vivo utilizando transferencia lipossomal.

Desse modo, a presente invenção também abrange um medicamento que compreende uma célula não diferenciada preparada por qualquer um desses processos ou pelo dispositivo misturado com um diluente, veiculo ou excipiente adequado.

Em uma modalidade, o medicamento compreendendo a célula não diferenciada pode ser utilizado para produzir uma célula mais comprometida vantajosa, como uma tendo uma estrutura genômica correta, a fim de aliviar quaisquer sintomas ou condições causados por ou associados a uma célula mais comprometida tendo uma estrutura genômica incorreta. Desse modo, a presente invenção também provê um processo de remover uma mutação adquirida de uma célula mais comprometida onde o método compreende formar uma célula não diferenciada pelo método de acordo com a presente invenção, comprometer a célula não diferenciada em uma célula recomprometida, pelo que o arranjo ou rearranjo do genoma e/ou núcleo da célula faz com que a mutação seja removida.

Preferivelmente, o gene é inserido na região de imunoglobulina ou região TCR do genoma.

A presente invenção também provê um método de tratar um paciente que sofre de uma doença ou um distúrbio

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73/176 resultante de uma célula defeituosa ou uma célula indesejada, o método compreendendo preparar uma célula nãodiferenciada pelo contato de uma célula mais comprometida com um agente que faz com que a célula mais comprometida retrodiferencie na célula não-diferenciada, e a seguir comprometendo opcionalmente a célula não diferenciada em uma célula recomprometida; onde a célula não diferenciada, ou a célula recomprometida, afeta a célula defeituosa ou a célula indesejada para aliviar os sintomas da doença ou distúrbio ou curar o paciente da doença ou condição.

Alternativamente, a célula não-diferenciada poderia ser utilizada para produzir uma célula mais comprometida que produz uma entidade que cura quaisquer sintomas ou condições causados por ou associados a uma célula mais comprometida tendo uma estrutura genômica incorreta.

Por exemplo, a presente invenção pode ser utilizada para preparar anticorpos ou receptores de células T para um antígeno que é expresso pela célula mais comprometida a qual retrodiferenciou na célula não diferenciada. A este respeito, o antígeno pode ser um antígeno fetoespecifico ou um antígeno fetoespecifico reativo-cruzado.

A presente invenção também inclui um processo de e um dispositivo para controlar os níveis de células não diferenciadas e células mais comprometidas. Por exemplo, a presente invenção inclui um método que compreende formar uma célula não diferenciada pelo método de acordo com a presente

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74/176 invenção e a seguir ativar um gene de apoptose para afetar a célula não diferenciada, como ocasionar a morte da mesma.

Em uma modalidade preferida, a presente invenção refere-se a um processo de introduzir um gene no genoma de uma célula não diferenciada, onde o processo compreende introduzir o gene em uma célula mais comprometida, e a seguir preparar uma célula não diferenciada pelo método de acordo com a presente invenção, pelo que o gene está presente na célula não diferenciada.

Em uma modalidade mais preferida a presente invenção refere-se a um processo de introduzir um gene no genoma de uma célula não diferenciada, onde o processo compreende inserir o gene no genoma de uma célula mais comprometida, e a seguir preparar uma célula não diferenciada pelo método de acordo com a presente invenção, pelo que o gene está presente na célula não diferenciada.

O gene pode ser um gene que torna a célula nãodiferenciada e células mais diferenciadas obtidas do mesmo, mais resistente a infecções patogênicas como infecção viral. Em particular, como exemplo, linfócitos B de pacientes com AIDS podem ser utilizados para produzir células tronco que são a seguir construídas para serem resistentes a infecção por HIV. Quando expandidos e introduzidos nos pacientes, os linfócitos T auxiliares resultantes também podem ser resistentes à infecção por HIV.

Em uma modalidade alternativa a presente invenção refere-se a um processo de introduzir um gene em uma célula não diferenciada, onde o processo compreende inserir o gene

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75/176 no genoma de uma célula mais comprometida, e a seguir preparar uma célula não diferenciada pelo método de acordo com a presente invenção, pelo que o gene está presente no genoma da célula não-diferenciada.

Além disso, a presente invenção também abrange o método da presente invenção para prepara uma célula não diferenciada, onde o método inclui comprometer a célula não diferenciada em uma célula recomprometida e a seguir fundir a célula recomprometida com um mieloma. Isto permite a expressão in vitro de grandes quantidades do produto desejado, como um anticorpo ou um antígeno ou um hormônio etc.

A presente invenção abrange uma célula nãodiferenciada preparada por qualquer um desses processos da presente invenção.

Em uma modalidade adicional, o dispositivo e/ou método de acordo com a presente invenção pode ser utilizado para cultivar de forma eficaz progenitores de eritróide para a produção de eritrócitos, cujos eritrócitos podem ser utilizados para reabastecer deficiências em suprimentos de sangue por exemplo. De modo adequado, um método de acordo com a presente invenção pode ser utilizado para produzir megacariócitos para uso em produção de plaqueta.

Em uma modalidade alternativa, o dispositivo e/ou método da presente invenção pode ser utilizado na preparação de bancos de células não diferenciadas, isto é bancos de células tratadas.

Outros aspectos da presente invenção incluem:

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O uso de qualquer um dos agentes da presente invenção para preparar uma célula não diferenciada de uma célula mais comprometida.

O uso de uma célula não diferenciada produzida de acordo com o método da presente invenção para produzir qualquer um de um anticorpo monoclonal ou policlonal ou especifico de um linfócito-B ou um linfócito-T; uma célula da linhagem de monócito de macrófago; uma célula nucleada capaz de expressar antígenos classe I ou classe II; uma célula capaz de ser induzida a expressar antígenos classe I ou classe II; uma célula enucleada; uma célula fragmentada; ou uma célula apóptica.

O uso de uma célula não diferenciada produzida de acordo com o método da presente invenção para produzir linfócitos-T efetores de linfócitos-B e/ou vice versa.

O uso de uma célula não diferenciada produzida de acordo com o método da presente invenção para produzir qualquer um ou mais de; um medicamento, como um medicamento que compreende ou feito de um linfócito-B, um linfócito-T, uma célula da linhagem de monócito de macrófago, uma célula nucleada capaz de expressar um antigeno classe I ou classe II, uma célula capaz de ser induzida a expressar um antigeno classe I ou classe II, ou uma célula enucleada.

A presente invenção também abrange processos que utilizam os usos acima mencionados e produtos ou composições preparados de tais processos.

A presente invenção também abrange um medicamento que compreende uma célula não diferenciada de acordo com a

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77/176 presente invenção ou um produto obtido a partir dai misturado com um diluente, veiculo ou excipiente adequado.

Em uma modalidade preferida o medicamento compreende um anticorpo ou antígeno obtido de uma célula não diferenciada de acordo com a presente invenção misturado com um diluente, veiculo ou excipiente adequado.

Preferivelmente, o medicamento é para o tratamento de qualquer um de: câncer, doenças auto-imunes, distúrbios de sangue, regeneração celular ou de tecido, regeneração de órgão, o tratamento de transplantes de tecido ou órgão, ou distúrbios metabólitos congênitos.

Os métodos da invenção e produtos obtidos por esses métodos, como células não-diferenciadas, podem ser utilizados na pesquisa, por exemplo para estudar retrodiferenciação, diferenciação e identificar e estudar novos antigenos de desenvolvimento e agrupar antigenos de diferenciação.

X. Administração

Células-tronco e células recomprometidas da presente invenção, bem como agentes mostrados como retrodiferenciando células, podem ser utilizados em métodos terapêuticos. Preferivelmente, as células ou agentes da invenção são combinados com diversos componentes para produzir composições da invenção. Mais preferivelmente as composições são combinadas com um veiculo ou diluente farmaceuticamente aceitável a fim de produzir uma composição farmacêutica (que pode ser para uso humano ou animal) . Veículos e diluentes adequados incluem soluções salinas

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78/176 isotônicas, por exemplo solução salina tamponada com fosfato. A composição da invenção pode ser administrada por injeção direta. A composição pode ser formulada para administração parenteral, intramuscular, intravenosa, subcutânea, intra-ocular, oral ou transdérmica.

As composições compreendendo células são tipicamente fornecidas por injeção ou implante. Células podem ser fornecidas em suspensão ou embutidas em uma matriz de suporte como matrizes biodegradáveis naturais e/ou sintéticas. Matrizes naturais incluem matrizes de colágeno. Matrizes biodegradáveis sintéticas incluem polianidridos e ácido polilático. Essas matrizes fornecem suporte para células frágeis in vivo e são preferidas para células não hemapoéticas.

O fornecimento também pode ser por fornecimento controlado, isto é, durante um período de tempo que pode ser de vários minutos a várias horas ou dias. O fornecimento pode ser sistêmico (por exemplo por injeção intravenosa) ou dirigido a um local de interesse específico.

As células são tipicamente administradas em doses de lxlO⁵ a lxlO⁷ células por kg. Por exemplo um paciente com 70kg pode receber 14xl0⁶ células CD34⁺ para reconstituição de tecidos hematopoiéticos.

As vias de administração e dosagens descritas são destinadas apenas como guia uma vez que um clínico versado será capaz de determinar facilmente a via de administração ideal e dosagem para qualquer paciente e condição específica.

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79/176

Todos os métodos detalhados abaixo são adequados para uso com um dispositivo de acordo com a presente invenção.

A. MATERIAIS E MÉTODOS

PACIENTES

Amostras de sangue foram obtidas em tubos top de lavender contendo EDTA de pacientes com leucemia linfocitica crônica de células-B, pacientes com deficiência de anticorpos (incluindo deficiência de igA e hipogamaglobulinaemias infantis ligadas-X), pacientes com infecções por HIV e sindrome de AIDS, um paciente com infecção CMV, um paciente com linfomas de Hodgkin, um paciente com leucemia de células-T aguda, um bebê com 6 dias de idade com blastcitose, vários pacientes com condições clinicas e infecções diversas, sangue de cordão, medula óssea, e preparados de linfócito-B enriquecidos de doadores de sangue saudáveis. Adicionalmente, amostras de sangue revestido buffy foram obtidas de doadores saudáveis.

CONDIÇÕES EXPERIMENTAIS E CLÍNICAS

As condições de tratamento experimental e clinico de pacientes, incluindo diversos tipos de tratamento aplicados a suas amostras de sangue, são descritas na Tabela 1. Contagens de leucócitos diferenciais (WBC) foram obtidos utilizando um Contador Coulter e estes estão incluídos na mesma tabela.

TRATAMENTO DE SANGUE

Amostras de sangue, após serem obtidas, foram introduzidas em uma câmara juntamente com anticorpo

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80/176 monoclonal puro para a região homóloga da cadeia-β do antígeno HLA-DR (DAKO) e deixadas misturar-se em temperatura ambiente por um máximo de 24 horas. Algumas amostras foram misturadas primeiramente por 15 minutos após o que foram deixadas incubar na câmara a 22°C. A concentração de anticorpo monoclonal adicionado às amostras de sangue variou de 10-50 μΐ/ml de sangue.

Além disso, outros tratamentos foram aplicados nas mesmas concentrações e esses incluiram adição de um anticorpo monoclonal à região homóloga da cadeia-α do antígeno HLA-DR, um anticorpo monoclonal à região homóloga de antigenos classe I, um anticorpo monoclonal a CD4, um anticorpo monoclonal a CD8, e um anticorpo monoclonal conjugado PE para a região homóloga da cadeia-β do antígeno HLA-DR.

Outros tratamentos incluiram a adição simultânea de anticorpos monoclonais a regiões homólogas das cadeias-a e β do antígeno HLA-DR para amostras de sangue.

Adicionalmente, agentes de alquilação como ciclofosfoamida foram adicionados a amostras de sangue em combinação com anticorpo monoclonal puro à região homóloga da cadeia-β do antígeno HLA-DR.

Após esses tratamentos as amostras de sangue foram coloridas com painéis de anticorpos monoclonais rotulados como instruído pelas instruções do fabricante e a seguir analisados utilizando citometria de fluxo.

Períodos de incubação com anticorpos monoclonais variaram de intervalos de 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12

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81/176 horas a 24 horas.

ANTICORPOS ROTULADOS

Os seguintes anticorpos monoclonais foram utilizados para detectar os seguintes marcadores em células por citometria de fluxo: CD19 e CD3, CD4 e CD8, DR e CD3, CD56 & 16 e CD3, CD45 e CD14, CD8 e CD3, CD8 e CD28, controle simulteste (IgGl FITC + IgG2a PE), CD34 e CD2, CD7 e CD13 & 33, CD10 e CD25, CD5 e CD10, CD5 e CD21, CD7 e CD5, CD13 e CD20, CD23 e CD57 e CD25 e CD45 RA (Becton & Dickenson e DAKO). Marcadores adicionais podem incluir CD71 (marcador de hemácias), CD61 (marcador de megacariócito), Glicoforina A (marcador de hemácias), AC133 (Marcador de célula tronco), CD38 (marcador de célula tronco primitiva) , CD90 (marcador de célula tronco) e CD117 (marcador de célula tronco pluripotente).

A amostra de sangue de cada paciente, tanto tratada como não tratada, e incluindo cada amostra revestida buffy, foi analisada utilizando uma pluralidade do painel acima em um dispositivo de acordo com a presente invenção a fim de ser responsável pelas alterações imunofenotipicas que acompanharam diferentes tipos de tratamentos e estes foram realizados em diferentes alíquotas da mesma amostra de sangue. Amostras não tratadas e outros tratamentos de controle foram colocados e analisados simultaneamente.

CITOMETRIA DE FLUXO

A amostra de sangue integral foi colorida e lisada de acordo com as instruções do fabricante. A análise de citometria de fluxo foi realizada em um FACScan® com

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82/176 simulteste ou software PAINT A GATE (BDIS) que incluiu rastreamento posterior de controles negativos. 10.000 a

20.000 eventos foram adquiridos e armazenados em arquivos de modo de lista.

MORFOLOGIA

A morfologia foi analisada utilizando microscopia e coloração de Wright.

PREPARAÇÃO DE CÉLULAS TRONCO DE LINFÓCITOS B-CLL (OU NORMAL) PURIFICADOS OU ENRIQUECIDOS OU DE AMOSTRAS DE SANGUE REVESTIDO BUFFY.

Técnicas assépticas devem ser utilizadas durante todos os procedimentos que se seguem:

(A) separação de células mononucleares:

(i) Obter células mononuclueares de amostras revestidas buffy/sangue periférico por centrifugação em Histopaque, LymphoPrep, ou qualquer meio de separação de Linfócitos (grav. sp. 1.077) por 30 min. a 400 g.

(ii) Coletar células mononucleares em um tubo cônico de 50 ml e lavar com 30 ml de solução de sal equilibrada de Hank (Ca²⁺ e Mg⁺ livre, Sigma) contendo soro de vitelo fetal ativado a calor a 2% (FCS) e 2 mM EDTA ou citrato a 0,6%, e centrifugar a 400 g por 10 min.

(iii) Após lavagem, contar as células e avaliar a viabilidade utilizando azul de tripano e hemocitômetro.

(iv) Se a contagem de células-B for elevada, acima

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83/176 de 70% (20 x 10⁹/L, WBC), prosseguir direto para A (vi) .

(v) Se a contagem de células-B for baixa, abaixo de 70% (20 x 10⁹/L, WBC). Realizar seleção negativa utilizando microcontas Macs ou técnica de purificação FacsVantage, como descrito abaixo na Seção C.

(vi) Suspender novamente a pelota de células em uma concentração de 3 x 10⁶/ml em meio IMDM (100 gg/ml de estreptomicina), contendo FCS a 10% (inativado a calor) e HS a 10% (inativado a calor), colocar em bolsa de sangue. Observação: se não houver FCS e HS disponível, utilizar plasma autólogo a 20% a 50%.

PREPARAR CÉLULAS TRONCO (NÃO DIFERENCIADAS) EM FRAÇÕES MONONUCLEARES OBTIDAS DE AMOSTRAS DE SANGUE PERIFÉRICO DE PACIENTES COM B-CLL.

Seguir o protocolo para separação de células mononucleares (A) acima, exceto que a seleção negativa não deve ser realizada quando a contagem de leucócitos exceder 20 x 10⁶ por ml do qual mais de 50% dos leucócitos são células B.

Os seguintes procedimentos podem ser realizados em um dispositivo de acordo com a presente invenção.

(B) Tratamento de células utilizando anticorpo monoclonal CR3/43 (Dako) puro:

Após obter a separação de células mononucleares em

A (vi), prosseguir com o que se segue:

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84/176 (i) colocar a bolsa de sangue de entrada A (vi) acima) no gancho de suporte, (ii) utilizar uma câmara com seis cavidades, programar o dispositivo para acrescentar 2 ml de suspensão de células da bolsa de sangue de entrada [de A (vi) acima] em cada cavidade desta c]amara ou bandeja de cultura de multi-cavidades.

(iii) Programar o dispositivo para tratar um número apropriado de cavidades cada com 99 μΐ/ml (ou 49,5 μΐ/ml em relação a amostras revestidas buffy) de CR3/43 (anticorpo monoclonal puro, Dako) de uma seringa contendo CR3/43 mab e deixar as outras cavidades não tratadas (controle negativo).

(iv) Incubar a câmara em CO2 a 5% a 37°C (ou 33°C) em uma atmosfera úmida.

(C) Purificação de células:

Vários métodos são conhecidos para a separação e purificação de células (vide Vettese-Dadey Scientist 13(18):21 13 de setembro de 1999).

Um método adequado é seleção negativa de células B utilizando microcontas MACS (Miltenyi Biotec, aqui é melhor seguir as instruções do fabricante):

(i) Obter células mononucleares como na Seção A acima.

(ii) Formar em pelotas e suspender novamente as células em um volume final de 300 μΐ por 10⁸ de total de células em HBSS (consistindo em FCS a 2% e 2 mM EDTA ou citrato a 0,6%).

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85/176 (iii) Adicionar 100 μΐ por 10⁸ de total de células de anticorpo monoclonal puro a CD2 (IgGl, DAKO).

(iv) À mesma suspensão de células adicionar 50 μΐ por 10⁸ por total de células de anticorpo monoclonal puro a CD33 (IgGl, DAKO).

(v) Deixar a mistura incubar por 10 minutos em temperatura ambiente.

(vi) Lavar células com HBSS (contendo FCS a 2% e 2 mM EDTA) e suspender novamente em uma concentração final de 400 μΐ por 10⁸ de total de células, com o mesmo tampão. Centrifugar em 400 g por 10 min. Suspender novamente a pelota em HBSS (como acima).

(vii) Adicionar 100 μΐ de microcontas rotuladas IgGl anti-camundongo de coelho por 10⁸ de total de células (ou seguir as instruções do fabricante).

(viii) Misturar vigorosamente as células e incubar a 6°C até 12°C (geladeira) por 15 minutos.

(ix) Lavar novamente as células com HBSS (contendo FCS a 2% e 2 mM EDTA) , centrifugar a 400 g x 10 min. e suspender novamente em uma concentração final de 500μ1 por 10⁸ de total de células, com o mesmo tampão.

(x) Montar a coluna MS⁺/RS⁺ no campo magnético do separador MACS. Se a contagem de células mononucleares for elevada utilizar duas colunas MS+/RS+.

(xi) Lavar a coluna com 3 ml de HBSS (contendo FCS a 2% e 2 mM EDTA).

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D) (xii) Passar as células através da coluna e a seguir lavar com 5 x 500μ1 com HBSS (contendo FCS a 2% e 2 mM EDTA).

(xiii) Eluir e coletar as células em um tubo cônico, a seguir formar em pelotas e suspender novamente em IMDM e colocar em uma bolsa de sangue como na Seção A (vi).

Células B purificadas FACSVantage:

(i) Obter células mononucleares de amostras de sangue periférico de pacientes B-CLL, como descrito na Seção A, acima.

(ii) Colorir essas células com uma combinação de anticorpos monoclonais conjugados CD20-FITC e CD19-PE para identificar as células B.

(iii) Com base na fluorescência CD19/CD20, separar aproximadamente 10⁷ células utilizando um Beckton Dickenson FACS Vantage e laser de argônio emitindo a 488 nm.

(iv) Lavar as células purificadas com solução de sal equilibrada Hanks contendo FCS a 50% e a seguir permitir que se recupere durante a noite a 37°C em um incubador umidifiçado a 5% CO2.

(v) Formar em pelotas e suspender novamente as células, e colocar em uma bolsa de sangue, como descrito na Seção A (vi) acima e a seguir tratar com CR3/43 como descrito na Seção B acima.

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PREPARAR CÉLULAS TRONCO EM CÉLULAS DE SANGUE INTEGRAL

O tratamento de células com anticorpo monoclonal CR3/43 (Dako) puro em sangue integral pode ser realizado em um dispositivo de acordo com a presente invenção:

(i) Selecionar pacientes com contagens WBC de 30200x10 ⁹/L (variando de 73-95% de linfócitos B).

(ii) Coletar sangue por venipuntura em tubos contendo heparina isenta de preservativo, EDTA ou

citrato, colocar	o	sangue	em uma bolsa	de sangue.
Preferivelmente,	o	sangue coletado é	utilizado
imediatamente e	de	forma	adequada, no	período de
aproximadamente	6	horas	da coleta.	Contudo,

sangue estocado/congelado sob nitrogênio também pode ser utilizado após descongelamento.

(iii) Colocar a bolsa de sangue de (ii) compreendendo o sangue integral no dispositivo de acordo com a presente invenção.

(iv) A contagem de leucócitos diferencial, automatizada é conduzida utilizando um contador Coulter. Pacientes com contagens de leucócitos de 30-200 x 10⁶ por mol (dos quais 60-95% são células B) são preferivelmente selecionados.

(v) A viabilidade do sangue também pode ser avaliada automaticamente, métodos adequados incluem iodeto de propidio e citometria de fluxo ou azul Tripano e um hemocitômetro após lise de hemácias utilizando solução de cloreto de amônio.

(vi) O anticorpo CR3/43 é adicionado a uma amostra

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88/176 do sangue integral na câmara do dispositivo, em uma concentração final de 1-3 μ1/10⁶ células (por exemplo se a contagem WBC foi de 50 x 10⁹/L então 50 μΐ de anticorpo monoclonal CR3/43, concentração

IgG de camundongo	de 159	μρ/ιηΐ,	deve ser
adicionado por	ml de	sangue).
(vii) Misturar	o	sangue	e	o	anticorpo
vigorosamente	utilizando uma	Pá	na	câmara do
dispositivo e	deixar por um	período	de tempo
predeterminado,	não	inferior	a	2	horas, em

temperatura ambiente, preferivelmente entre 18°C e 37°C, na câmara incubada.

(viii) Analisar células de sangue utilizando citometria de fluxo, ensaios clonais, cultura a longo prazo e/ou análise PCT Oh, 2 h, 6 h e 24 h após a adição de mAbs utilizando meios de rastreamento do dispositivo.

Observação: devido à agregação homotipica de células B e a formação de células aderentes no fundo do tubo de teste, induzida por mAb CR3/43. misturar vigorosamente e amostrar células utilizando extremidades de pipeta de diâmetro largo, antes da análise.

A fim de obter uma população uniforme de células por toda a análise, dividir a amostra de sangue em alíquotas separadas em uma pluralidade de câmaras antes do tratamento com CR3/43.

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PREPARAÇÃO PARA ANÁLISE DE CÉLULAS TRONCO PRODUZIDAS POR

TRATAMENTO DE CÉLULAS B CULTIVADAS COM ANTICORPO

MONOCLONAL CR3/43.

Células tronco produzidas utilizando os métodos da invenção podem ser avaliadas em diversos pontos de tempo, por exemplo, a cada 2 h, 7h, 24 h, diariamente, 7 dias ou por períodos mais longos (meses, após alimentação semanal de células com meio de cultura a longo prazo) . Uma ou mais cavidades de tratamento e controle podem ser analisadas em cada ponto de tempo, com as cavidades de controle e tratamento restantes sendo analisadas em período de tempo sucessivo posteriormente.

Esta avaliação também pode ser feita automaticamente por meios de rastreamento incorporados no dispositivo da presente invenção.

(i) Remover suavemente a camada não aderente utilizando uma pipeta de diâmetro largo e romper os pedaços de células por aspiração repetida através de uma pipeta de diâmetro largo a fim de obter uma suspensão de células, única.

(ii) Utilizando um raspador de células, raspar a camada aderente e romper suavemente pedaços de células a fim de obter suspensão de células única por aspiração repetida através de uma pipeta de diâmetro largo.

(iii) Alternativamente, tripisinizar a camada aderente primeiramente enxaguando com HBSS e a seguir adicionando 2 ml de tripsina a 0,25% por

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90/176 cavidade e incubar a 37°C por 10 minutos.

(iv) Agitar suavemente os pedaços de células por pipetagem repetida em uma pipeta de diâmetro largo.

(v) Após 10 min. incubar com 20% de FCS até uma concentração final a fim de inativar a tripsina.

(vi)	Células de	cultura obtidas	em	(ii)	ou	(v)
acima	podem ser	agrupadas para cada	tipo	(isto	é,
células tratadas	e não tratadas)	em	cada	ponto	de
tempo	e centrifugadas a 400 g por	10	min.
(vii)	Para análi	se de PCR (vide	C) ,	a pelota	de

células (células tratadas e não tratadas) obtida em (vi) deve ser utilizada diretamente.

(viii) Para análise de ensaio clonal, a pelota de célula (células tratadas e não tratadas) obtida na etapa (ii) ou etapa (v) acima é suspensa novamente em IMDM contendo 2% de FCS ativado a calor. Uma pequena alíquota de células pode ser removida para contar as células e avaliar sua viabilidade utilizando azul tripano e um hemocitômetro.

(ix) Para análise de FACs, suspender novamente a pelota de células (células tratadas e não tratadas) obtida na etapa (ii) ou etapa (v) acima em Solução de Sal Equilibrada Hanks (isenta de magnésio e cálcio) contendo 2% de FCS ativado a calor e 5 mM EDTA.

ANÁLISE DE CÉLULAS TRONCO:

Os seguintes métodos podem ser utilizados para a

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91/176 avaliação de células tronco. O dispositivo de acordo com a presente invenção pode incluir meios de rastreamento para realizar o ou parte dos métodos detalhados abaixo.

(A) Imunofenótipo:

Para análise imunofenotipica (utilizando

Citometria de Fluxo) para amostras de sangue integral:

(i) Imunocolorir (de acordo com instruções do fabricante), lisar os eritrócitos e lavar as células após o período de incubação e tratar com mAb. Soluções de lisar e lavagem da Becton Dickinson podem ser tipicamente utilizadas.

(ii) Leucócitos (em sangue integral, fração mononuclear, microcontas MACS células B negativamente selecionadas ou B-CLL separado) devem ser rotulados com mAbs conjugados diretamente com isotiocianato de fluoresceina (FITC) ou ficoeritrina (PE).

(iii) Os marcadores de painel utilizados na análise imunofenotipica podem ser como a seguir:

. CD38 PE + CD45 FITC + CD34 PE-Cy5 . CD19 PE + CD10 FITC + CD34 PE-Cy5 . CD117 PE + CD3 FITC + CD34 PE-Cy5 . CD33 PE + CD61 FITC + CD34 PE-Cy5 . Glicoforine A PE + CD71 FITC + CD34 PE-Cy5 . AC133 PE + CD90 FITC + CD34 PE-Cy5 . CD19PE + CD5 FITC . IgGl PE + IgGl FITC + IgGl PE-Cy 5 (controle negativo de isotipo)

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92/176 (iv) Rotulação dupla utilizando kit IMK+ (Becton Dickinson) pode ser realizada: consistindo nos seguintes pares de anticorpos monoclonais:

. CD45-FITC e CD14-PE;

. CD19-PE e CD3-FITC;

. CD8-PE e CD4-FITC;

. HLA-DR-PE e CD3-FITC; e . CD56, CD16-PE e CD3-FITC.

São incluídos também controles negativos e correspondência de isotipo para IgGi-FITC e IgG_2aPE. .

(v) Os seguintes anticorpos adicionais também podem ser utilizados os quais são fabricados por Dako e Becton Dickinson:

conjugado-PE: anti-CD8, anti-CD33, anti-13, antiCD34, anti-CD19, anti-CD2, anti-CD14, anti-CD33 e anti-CD5;

conjugado-FITC; anti-CD3, anti-CD7, anti-IgM, anti-CD22, anti-CD20, anti-CDIO, anti-CD7, antiCD16, anti-TCRap.

(vi) O seguinte também pode ser utilizado.

Além disso mAb IgG₃ purificado por afinidade específico para CD34 (Dako) pode ser utilizado e é detectado com fragmento F(ab)'₂ de imunoglobulina anti-camundongo de cabra rotulado PE ou FITC como anticorpo secundário (DAKO).

anti-CD34 conjugado (PE-Cy5) Vermelho Quantum (Dako) também foi utilizado.

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93/176 (v) Analisar células utilizando FACScan ou FACS Vantage (Becton Dickinson) ou qualquer outro citômetro de fluxo. Um número igual de eventos 100.000 células devem ser analisadas e o tempo observado.

(vi) Analisar dados utilizando software Paint-aGate, Lysis II, Consort 30 e CellQuest de propriedade.

Para análise Imunofenotipica (utilizando

Citometria de fluxo)	de amostras	revestidas	buffy	por
exemplo:
(i) Imunocolorir (de acordo com instruções	do
fabricante),	lisar os eritrócitos e	lavar	as
células após	o período de	incubação e	tratar	com
mAb. Soluções de lisar	e lavagem	da Becton

Dickinson podem ser tipicamente utilizadas.

(ii) Leucócitos devem ser rotulados duplamente ou individualmente com mAbs conjugados diretamente com isotiocianato de fluoresceina (FITC) , ficoeritrina (PE) ou RPE-Cy5.

Os seguintes marcadores rotulados podem ser utilizados de forma adequada:

CD34 (marcador de célula tronco); CD19 (marcador de linfócito B) ; CD45 (marcador de leucócitos); CD3 (marcador de linfócitos-T); CD33 (marcador de milócito); CD71 (marcador de hemácias); CD61 (marcador de megacariócito); Glicoforina A (marcador de hemácias); AC133 (marcador de célula tronco); CD38 (marcador de célula tronco

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94/176 primitiva); CD90 (marcador de célula tronco); CD10 (marcador de célula tronco linfóide); CD117 (marcador de célula tronco pluripotente); IgGl (controle negativo).

(B) Morfologia:

Para análise morfológica:

Microscopia Leve (i) Suspender novamente células vigorosamente em IMDM contendo 2% de FCS ativado a calor utilizando extremidades de pipeta de diâmetro largo.

(ii) Examinar sob um microscópio Leitz utilizando uma solução de coloração apropriada, por exemplo Solução de Coloração May and Greenwald (BDH Chemical Ltd.) pode ser utilizada para a análise de células linfóides e mielóides. A pessoa versada estará prontamente ciente de outras colorações adequadas para a identificação de outras colônias, por exemplo colorações de Giemsa ou de Wright.

(iii) A análise morfológica de linfócitos B-CLL pode ser realizada em películas de sangue ou preparados citocentrifugados, respectivamente. Microscopia Confocal (i) Obter células B como descrito acima (B-CLL ou células B saudáveis obtidas de revestimento buffy de doadores de sangue saudáveis) (ii) Tratar células B com anticorpo monoclonal CR3/43 como descrito acima.

(iii) Adicionar 2 ml de suspensão de células a um

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95/176 prato de cultura de órgão (o fundo deste prato é construído para ter uma capa).

(iv) Adicionar 15 μΐ de anticorpo monoclonal a con jugado-FITC CD19 e 15 μΐ de anticorpo monoclonal a conjugado CD34 PE/Cy 5 (Quantum Red).

(v) Usar lodeto de propídio para avaliar a viabilidade e Hoechst para colorir os núcleos.

(C) Análise PCR de rearranjo de gene VDJ/JHF

A região VDJ e/ou JHF do gene IgH foi analisada por PCR (dispositivo de ciclo térmico Perkin Elmer) utilizando DNA de gabarito de amostras de revestimento buffy e de sangue periférico B-CLL antes e após (2 horas, 6 h e 24 h) de tratamento de anticorpos. Este protocolo é adaptado de Stolc e outros (American Journal of Hematology 38:1-8; 1991). Os preparados de JHF são utilizados para a detecção positiva de gene de cadeia intensa de imunoglobulina em uma configuração de linha de germe. Os preparados JH6 são utilizados como um controle interno positivo para o gene de cadeia intensa de imunoglobulina. Nas células B, leucêmicos bem como em linfócitos normais a região JHF é sempre deletada e portanto não pode ser amplificada, enquanto o gene JH6 um controle interno, permanece intacto. O gene de β-actina foi utilizado como controle.

(i) Isolar DNA genômica de sangue integral utilizando kit de sangue Qiagen QiAMp Maxi. Utilizar o protocolo de rendimento máximo. Extrair todo DNA de cada amostra (tratada e não tratada).

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96/176 (ii) Passar diluições puras e de 1:5 de DNA em um gel agarose a 1,5% a fim de avaliar a concentração e qualidade.

(iii) Aquecer-PCR 2-3gL de gabarito de DNA genômico puro a 96°C por 5 minutos.

I) JH6a/JH6g JHFa/JHFg

Preparar uma mistura mestre suficiente para 4 pacientes (8 reações tratadas e não tratadas) de acordo com a tabela detalhada abaixo. Esta pode ser aumentada ou 10 reduzida conforme apropriado.

	Volume/gL	[Final]
Água isenta de nuclease	370	—
PCR 10 x Tampão	80	lx
*25mM MgCl₂	64	2mM
*5mM dNTPs	128	0, 8mM
10 gM PI	80	1 gM
10 μΜ P2	80	1 gM
5U/gL Taq pol.	2	10 unidades

*Girar os tubos 2-3 vezes cada por 5 segundos antes do uso a fim de equilibrar a amostra.

Separar em alíquota 95 gL de mistura mestre em cada tubo contendo DNA genômico desnaturado. Ajustar o dispositivo de ciclo térmico a 95°C por 1 min. 30 s; 55°C por 2 min; 72°C por 1 min 30 s (35 ciclos); e 72°C por 5 min. (1 ciclo).

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II) β-actina

Preparar uma mistura mestre suficiente para 8 reações como descrito em I) acima. Aumentar ou reduzir conforme apropriado.

	Volume/gL	[Final]
Água isenta de nuclease	380	—
PCR 10 x Tampão	80	lx
*25mM MgCl₂	48	1, 5mM
*5mM dNTPs	128	0, 8mM
10 μΜ Pl	80	1 μΜ
10 μΜ P2	80	1 μΜ
5U/gL Taq pol.	2	10 unidades

Separar em alíquota 95 gL de mistura mestre em cada tubo contendo DNA genômico desnaturado. Ajustar o dispositivo de ciclo térmico a 95°C por 1 min. 30 s.; 55°C por 2 min.; 72°C por 1 min. 30 s. (25 ciclos); e 72°C por 5 min. (1 ciclo).

Preparados para PCR

O primeiro conjunto de preparados, elaborados para ampliar um fragmento de 240 bp do gene IgH JHF foi como a seguir:

JHFa AAA GGT GCT GGG GGT CCC CTG

JHFb CCC AGT GCT GGA AGT ATT CAG C

O segundo conjunto de preparados, elaborados para

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ampliar	um fragmento de 242 bp do gene IgH JHF unindo a
região	6 foi como a seguir: JH6a CAT TGT GAT TAC TAC TAC TAC TAC JH6b GAT CCT CAA GGC ACC CCA GTG C 0 terceiro conjunto de preparados, elaborados para
ampliar	um fragmento de 249 bp do gene β-actina foi como a
seguir:	Beta ACT-1 AAG GCC AAC CGC GAG AAG AT Beta ACT-2 TCG GTG AGG ATC TTC ATG AG
(D)	Análise Southern de rearranjo de genes VDJ (i) Digerir o DNA genômico de amostras de sangue periférico tratadas e não tratadas ou células B purificadas (de pacientes B-CLL) , utilizando BamHI/HindII - tipicamente células de diversas cavidades são necessárias para fornecer uma quantidade suficiente de DNA a fim de conduzir a análise. (ii) Os digestos foram dissolvidos em géis agarose a 0,8% e transferidas para membranas de náilon GeneScreen® (Dupont) de acordo com as instruções do fabricante (Southern, 1975). (iii) 0 rearranjo do gene IgH pode ser caracterizado por análise da região J do local IgH, utilizando sonda de DNA Jh humana rotulada ³²P isolada de DNA genômico placental (Calbiochem, Oncogene Science). (iv) Autorradiografias devem ser mantidas a -70°C por vários dias antes da revelação.

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99/176 (E) Cultura a longo prazo:

Cultuas de células preparadas como descrito acima podem ser mantidas por períodos mais longos (cultura a longo prazo) por alimentação semanal utilizando meio de cultura a longo prazo (Meio de Dulbecco Modificado de Iscove (IMDMGibco BRL Life Technologies Ltd.), 10% de FCS ativado a calor, 10% de soro de cavalo ativado a calor (HS), 1% de hidrocortisona, 1% de penicilina/estreptomicina 5 x 10^-7 M solução de estoque).

(i) Primeiramente, seguir um certo ponto de tempo, por exemplo 24 horas, do inicio do tratamento com CR3/43 diluir células em cada cavidade por adição de 2 ml de meio de cultura a longo prazo.

(ii) Alimentar as cavidades semanalmente após remoção de metade do meio de crescimento.

(iii) Inspecionar cavidades utilizando microscopia de contraste de fase.

(F) Ensaios clonais:

(i) Após cada período de tempo seguindo a iniciação de tratamento, 300 μΐ em meio de cultura das células não aderentes podem ser obtidos como descrito acima.

(ii) Adicionar à suspensão de células no meio de cultura acima, 3 ml de methocult GFH4434 (StemCell Technologies, consistindo em metilcelulose em IMDM, FCS, BSA, L-glutamina, fator de célula tronco rh, GM-CSF rh, IL-3 rh e eritropoietina rh) .

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100/176

(iii) Tomar	1, 1 ml de	mistura	de	células e
revestir em	triplicata.
(iv) Incubar	as placas a	37°C	em	um	prato Petri
umidifiçado	com CO₂ a 5% e	O2 a	5%	por	14 dias.

(v) Inspecionar as cavidades antes e após o tratamento com anticorpo monoclonal CR3/43 utilizando microscopia de contraste de fase.

(vi) Após 14 dias as células (colônias) podem ser analisadas por citometria de fluxo, microscopia confocal e/ou PCR.

(vii) Ao realizar o ensaio clonal deve-se evitar aerossol de álcool, pois isto origina agrupamento ou destruição de células, impedindo a sobrevivência dos dois tipos de células (tratadas e não tratadas).

B. RESULTADOS

PAINEL CD3 E CD19

O tratamento de amostras de sangue no dispositivo de acordo com a presente invenção com anticorpo monoclonal na região homóloga da cadeia-β do antígeno HLA-DR sempre diminuiu o número relativo de células CD19⁺. este marcador é um antígeno de célula-B pan (vide as Tabelas). Este antígeno está presente em todos os linfócitos B humanos em todos os estágios de maturação porém se perde em células de plasma terminalmente diferenciadas. Consequentemente, esta é uma indicação de que células B estavam retrodiferenciando em células não diferenciadas.

O mesmo tratamento fez com que o número relativo

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101/176 de células CD3⁺ aumentasse acentuadamente especialmente em sangue de pacientes com B-CLL, que sempre foi acompanhado por um aumento no número relativo em células CD3^_CD19~. CD3 está presente em todos os linfócitos-T maduros e em 65%-85% de timócitos. Este marcador é encontrado sempre em associação a receptores de células-T α-/β- ou gama/delta (TCR) e juntos esses complexos são importantes para transduzir sinais para o interior da célula. Consequentemente, esta é uma indicação de que célula B estavam retrodiferenciando em células não diferenciadas e sendo então comprometidas com novas células diferenciadas, a saber células T.

Um novo clone de células apareceu no sangue tratado de pacientes B-CLL co-expressando os marcadores CD19 e CD3 - isto é células CD19⁺ e CD3⁺ (vide o Gráfico 1, paciente 2, 3 & 5 em 2 h, 6h e 24h do inicio do tratamento), cujo tratamento pode ser realizado no dispositivo de acordo com a presente invenção. Outros pacientes com condições diferentes mostraram um aumento no número relativo desses clones de células. Essas células eram excepcionalmente grandes e intensamente granuladas e níveis extremamente elevados de CD19 foram expressos em sua membrana de células. O marcador CD3 parece ser expresso nessas células em níveis similares àqueles expressos em linfócitos maduros normais.

Na Tabela 2, os números de paciente 2, 3 e 4 são na realidade números que representam o mesmo paciente e sua delineação foi simplesmente para mostrar o efeito de tratamento sobre o sangue com o tempo (vide a Tabela 1 para

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102/176 condição clinica e experimental deste paciente).

Os clones CD19⁺CD3⁺ em amostras tratadas parece diminuir com o tempo, atingindo níveis originais daqueles determinados em amostra não tratada em 2 h, 6 h e 24 h.

Outro tipo de célula do mesmo tamanho e granulosidade foi detectado em amostras tratadas e essas células tinham níveis elevados de CD19 expresso em sua superfície porém foram negativas para o marcador CD3 e ricos em receptores FC. Contudo, o número relativo dessas células pareceu diminuir como tempo. De interesse, em 24 horas de tratamento de amostra de sangue (2, 3 e 4) houve uma redução no número relativo de células CD19^_CD3~ em um grupo de células que foi inicialmente observado como aumentando após 2 e 6 horas de tratamento de amostras de sangue. Contudo, contagens Coulter de populações WBC foram reduzidas no tratamento de sangue com anticorpo monoclonal na região homóloga da cadeia-β do antígeno HLA-DR. Esta descoberta sugere que este tipo de tratamento origina células atípicas que não podem ser detectadas por Coulter (Tabela 1) porém podem ser levadas em consideração quando medidas por citometria de fluxo que conta as células com base em marcadores de superfície, tamanho e granulosidade. Além disso, essas células atípicas foram levadas em consideração por análise de morfologia utilizando coloração de Wright sob um microscópio. Gráficos citométricos de fluxo desses fenômenos são representados nos Gráficos (1, 2, 3 & 4) e as alterações imunofenotipicas obtidas no tratamento de amostras de sangue parecem sugerir que linfócitos CD19⁺ e

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CD3⁺ são um grupo interconectado de células porém permanecem distintos com base na expressão relativa de CD19 e CD3 em comparação com células tronco.

Na Tabela 2, os números de paciente 5 e 6 representam o mesmo paciente porém análise de amostras de sangue tratada e não tratada foram monitoradas como tempo e ao mesmo tempo(vide a Tabela 1).

O sangue do paciente sem malignidade de célula-B mostrou tendências similares de alterações imunofenotipicas quando comparado com sangue de pacientes com B-CLL porém as alterações não foram até o mesmo ponto. Contudo, o número relativo e absoluto de linfócitos-B e células positivas MHC Classe I no sangue desses pacientes são extremamente baixos em comparação com aqueles encontrados no sangue de pacientes com B-CLL.

Dois irmãos ambos com hipogamaglobulinemia infantil ligada-X que tinham deficiência de células B mostraram diferentes alterações imunofenotipicas no número relativo de células CD3⁺ no tratamento de seu sangue. O irmão mais novo tinha 2 meses de idade e não estava doente, no tratamento de seu sangue, mostrou um leve aumento no número relativo de células CD3⁺ que foi acompanhado por uma redução no número relativo de células CD3~CD19~. Por outro lado, o outro irmão que tinha 2 anos de idade e estava extremamente doente e com um número relativamente elevado de células T ativadas expressando os antigenos DR mostrou uma redução no número de células CD3⁺ no tratamento de seu sangue. Nenhum outro marcador foi utilizado para medir

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104/176 outras alterações imunofenotípicas que poderiam ter ocorrido porque as amostras de sangue obtidas desses dois pacientes era extremamente pequena (Tabela 2, ID 43/BD e 04/BD).

O paciente 91 na Tabela 2 mostra uma redução no número relativo de células CD3⁺ após o tratamento de sangue que foi acompanhado por um aumento no número relativo de células CD3~ CD19^-. Contudo, na análise de outros marcadores de superfície como CD4 e CD8 (vide a Tabela 3) observou-se que o paciente tinha um número relativo elevado de células CD4⁺CD8⁺ em seu sangue e isto foi observado antes do tratamento de amostras de sangue com anticorpo monoclonal para a cadeia-β do antígeno DR e essas células positivas duplas diminuíram apreciavelmente após o tratamento do sangue. Além disso, quando marcadores adicionais foram analisados o número relativo de células CD3⁺ foi visto como tendo elevado (vide a Tabela 4).

Uma preparação enriquecida de linfócitos-B obtidos de doadores de sangue saudáveis quando tratados com anticorpo monoclonal para a cadeia-β de antigenos DR em um dispositivo de acordo com a presente invenção mostrou um aumento acentuado no número relativo de células CD3⁺ que foi acompanhado sempre por uma redução no número relativo de células CD19⁺ e por um aumento no número relativo de células CD19^_CD3~. A análise adicional utilizando marcadores como CD4 e CD8 mostra um aumento concomitante no número relativo desses marcadores. Contudo, uma preparação enriquecida de linfócitos T dos mesmos doadores de sangue quando tratados com o mesmo anticorpo monoclonal não mostrou as mesmas

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105/176 alterações.

PAINEL CD4 E CD8

O antígeno CD4 é o receptor para o vírus de imunodeficiência humana. A molécula CD4 liga o antígeno MHC classe II no domínio B2, uma região que é similar aos sítios de ligação CD8 nos antígenos classe I. A ligação de CD4 ao antígeno Classe II aumenta a resposta da célula T a antígenos e também a ligação de CD8 a antígenos classe I. Os antígenos CD8 estão presentes no subconjunto de linfócitos T citotóxicos/supressores humanos bem como em um subconjunto de linfócitos exterminadores naturais (NK) e uma maioria de timocitos normais. Os antígenos CD4 e CD8 são co-expressos em timócitos e essas células perdem marcadores à medida que amadurecem em linfócitos-T.

Na análise dos marcadores CD4 e CD8 - vide abaixo - e de uma maioria de amostras de sangue apresentadas na Tabela 2, um padrão de coloração surge o qual apoia a presença de um processo de retrodiferenciação de linfócitosB em células não diferenciadas e a diferenciação subsequente em linfócitos-T.

Células CD4⁺CD8⁺, as quais são células positivas duplas, apareceram sempre após o tratamento de amostras de sangue com anticorpo monoclonal para a região homóloga da cadeia-β e esses tipos de células foram acentuadamente aumentadas no sangue de amostras tratadas de pacientes com B-CLL e que estavam ausentes totalmente em amostras não tratadas (Vide a Tabela 3 e Gráficos 1, 2, 3 e 4) . Nos mesmos espécimes o número relativo de células positivas

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106/176 únicas como células CD8⁺ e CD4⁺ também foi observado como aumentando simultaneamente. Adicionalmente, uma redução no número relativo de células CD4^_CD8~ que, pelo menos no caso de B-CLL corresponde a células B foi observado como caindo acentuadamente em amostras tratadas quando comparado com espécimes não tratados os quais permaneceram no mesmo nível quando medido com o tempo. Contudo, a medição do número relativo de células CD4⁺CD8⁺ como tempo em amostras tratadas mostrou que houve um aumento concomitante no número de células positivas únicas com diminuição no número relativo de células positivas duplas. Este tipo de alteração imunofenotipica é característica de desenvolvimento timico de células progenitoras da linhagem de linfócitos-T no timo (paciente número 2, 3 e 4) . O antigeno CD4 está presente nos subconjuntos de linfócitos-T indutores/auxiliares (CD4⁺CD3⁺) e uma maioria de timócitos normais. Contudo, este antigeno está presente em baixa densidade na superfície da célula de monócitos e no citoplasma de monócitos e macrófagos (CD3~CD4⁺) .

O número relativo de células baixas CD4⁺ foi afetado de forma diferente em amostras de sangue diferentes após tratamento no dispositivo de acordo com a presente invenção. O número relativo deste tipo de célula parece não afetado em amostras de sangue de pacientes com B-CLL após tratamento quando comparado com amostras não tratadas. Tais níveis baixos de expressão CD4 são encontrados em monócitos e timócitos muito prematuros.

O paciente HIV+25 em tratamento mostrou aumento

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107/176 substancial no número de células positivas duplas que expressam CD4 e CD8 simultaneamente. Por outro lado, o paciente 91 no tratamento mostrou redução neste subtipo de células e a observação de tal fenômeno depende do tempo. O número relativo de células CD8⁺ foi observado como aumentando em amostras de sangue não tratadas de pacientes com B-CLL quando medido com o tempo ao passo que o número relativo de CD4⁺ e células baixas CD4⁺ foi observado como diminuindo nos mesmos tempos (Tabela 3 paciente 2, 3 e 4).

PAINEL DR E CD3

Os marcadores DR estão presentes em monócitos, células dendriticas, células-B e linfócitos-T ativados.

Amostras tratadas e não tratadas analisadas com este painel mostraram alterações imunofenotipicas similares em relação àquelas obtidas quando amostras de sangue foram analisadas com os marcadores CD19 e CD3 (vide a Tabela 3) e esses antígenos como mencionado anteriormente são marcadores de células B e T pan, respectivamente.

O tratamento de sangue em um dispositivo de acordo com a presente invenção com anticorpos monoclonais parece afetar o número relativo de linfócitos-B DR⁺ de modo que o nível de células DR+ diminui. Em contraste, o número relativo de células CD3⁺ (células-T) aumenta significativamente (vide a Tabela 4 e Gráfico). Além disso, o número relativo de células T ativadas aumentou na maioria de amostras de sangue tratadas de pacientes com B-CLL e esses tipos de células foram afetados variavelmente em amostras tratadas de pacientes com outras condições.

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Além disso, o número relativo de células positivas elevadas DR apareceu em número significativos em amostras tratadas de pacientes com B-CLL e um bebê com 6 dias de idade com blasts aumentados de DR⁺ CD34⁺ em seu sangue. Contudo, deve ser observado que os blasts que estavam presentes no sangue desse paciente eram negativos para marcadores de células B e T antes e após o tratamento porém se tornaram mais positivos para antigenos de linhagem mielóide após o tratamento. O número relativo de células CD3^_DR~ aumentou na maioria de amostras de sangue tratadas e foi proporcional a aumentos no número relativo de células CD3⁺ (células-T) e foi inversamente proporcional a reduções no número relativo de células DR+ (células-B).

PAINEL CD56&16 E CD3

Os marcadores CD56&CD16 são encontrados em um grupo heterogêneo de células, um subconjunto de linfócitos conhecidos genericamente como linfócitos granulares grandes e linfócitos exterminadores naturais (NK). O antígeno CD16 é expresso virtualmente em todos os linfócitos NK em repouso e é fracamente expresso em alguns linfócitos T CD3⁺ de certos indivíduos. Este antígeno é encontrado em granulócitos em quantidade menor e é associado a linfócitos contendo grânulos azurofilicos grandes. O antígeno CD16 é o receptor FC IgG III.

Um número variável de linfócitos CD16⁺ coexpressam o antígeno CF57 ou antígeno CD8 de baixa densidade ou ambos. Na maioria dos indivíduos, não há virtualmente sobreposição com outros antigenos de linfócito-T como os

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109/176 antígenos CD5, CD4 ou CD3. O antígeno CD56 está presente essencialmente em todos os linfócitos NK CD16⁺ ativados e em repouso e esses subconjuntos de células realizam citotoxicidade restrita de complexo de histocompatibilidade não principal.

Imunofenotipificação de amostras de sangue tratadas e não tratadas de B-CLL e alguns outros pacientes com outras condições mostrou um aumento no número relativo de células que co-expressam os antígenos CD56&CD16 os quais eram intensamente granulados e de tamanho médio (vide a Tabela 5 e Gráficos 1, 2, 3 e 4). Essas observações também foram acompanhadas por um aumento acentuado no número relativo de células que expressam o antígeno CD3 apenas (sem a expressão de marcadores CD56 e CD16) e células que coexpressam juntos os marcadores CD56&CD16 e CD3.

Na Tabela 5, os números de paciente 2, 3 e 4 representam a mesma amostra de sangue porém sendo analisada em 2 horas, 6 horas e 24 horas respectivamente (antes e após o tratamento). Esta amostra mostra que o tratamento de sangue com anticorpo monoclonal para a região homóloga da cadeia-β de antígeno DR parece causar produção espontânea de células CD56⁺ e CD16⁺, células CD3⁺ e células CD56⁺ e CD16⁺CD3⁺ e estas observações foram sempre acompanhadas pelo desaparecimento dos marcadores de células-B (CD19, DR, CD56, CD16-CD3-) .

A análise avançada desta amostra de sangue antes e após o tratamento mostrou os níveis de células CD56⁺ e CD16⁺como diminuindo como tempo e o nível de células CD3⁺ como

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110/176 aumentando com o tempo.

As amostras de sangue do paciente 7 com B-CLL não mostraram nenhuma alteração no número de células que expressam os antigenos CD56, CD16 e CD3 quando comparado com alterações imunofenotipicas observadas em amostras tratadas e não tratadas e isto é porque a quantidade de anticorpo monoclonal adicionado foi extremamente baixa em relação ao número de linfócitos B. Contudo, o tratamento da amostra de sangue deste paciente em uma ocasião separada com uma quantidade apropriada de anticorpo monoclonal mostrou aumentos significativos no número relativo de células CD3⁺, CD56+ & CD16+ e CD56+ e CD16+ CD3⁺.

As amostras de sangue de outros pacientes com outras condições mostraram alterações variáveis no nível dessas células e isto parece depender do número de linfócitos-B presentes no sangue antes do tratamento, duração de tratamento e provavelmente a condição clínica de pacientes.

PAINEL CD45 E CD14

O antígeno CD45 está presente em todos os leucócitos humanos, incluindo linfócitos, monócitos, células polimorfonucleares, eosinófilos, e basófilos em sangue periférico, timo, baço, e tonsila, e progenitores de leucócitos em medula óssea.

O CD14 está presente em 70% a 93% de monócitos de sangue periférico normal, 77% a 90% de fagocitos de fluido peritoneal ou pleural. Este antígeno é fracamente expresso em granulócitos e não existe em linfócitos não estimulados,

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111/176 linfócitos T ativados por mitógeno, eritrócitos ou plaquetas.

O antígeno CD45 representa uma família de fosfatases de tirosina de proteína e esta molécula interage com estímulos externos (antigenos) e efetua transdução de sinais via os membros de familia-Scr levando à regulação de crescimento de células e diferenciação.

O aprisionamento da cadeia-β dos antigenos DR em amostras de sangue tratadas especialmente aquelas obtidas de pacientes com B-CLL sugere que tal tratamento afeta o nível de antigenos CD45 em linfócitos-B. As alterações imunofenotipicas globais que ocorreram na estimulação da cadeia-β do antígeno DR parecem originar diferentes tipos de células que podem ser segregadas com base no nível de expressão de CD14 e CD46 bem como morfologia como determinado por dispersão avançada e dispersão lateral (tamanho e granulosidade respectivamente) e esses resultados são apresentados na Tabela 6 e Gráficos (1, 2, 3 e 4). Vide também a figura 7 que demonstra a aparição de células CD45CD14^- após o tratamento com o anticorpo CR3/43. Essas células não são células hemapoiéticas.

No tratamento no dispositivo de acordo com a presente invenção o número relativo de células baixas CD45 (quando comparado com amostras não tratadas) aumentou significativamente como também o número relativo de células que co-expressam os antigenos CD45 e CD14. Este tipo de alterações imunofenotipicas coincidiu com uma redução no número relativo de células elevadas CD45 (comparado com

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112/176 amostras não tratadas). Contudo, esta população de células mencionada por último pode ser adicionalmente dividida com base em morfologia e o grau de expressão CD45. Um tipo era extremamente grande e tinha níveis extremamente elevados de antígeno CD45 quando comparado com o resto das células presentes nos gráficos (vide os gráficos 1, 2, 3 e 4) . Na análise deste painel após tratamento com tempo (vide a Tabela 6 paciente 2, 3 e 4 e gráfico 1) o número relativo de células CD45⁺ caiu inicialmente acentuadamente com o tempo para originar células baixas CD45. Contudo, a análise de sangue 24 horas após mostrou a situação oposta.

As amostras 5 e 7 revelam alterações imunofenotípicas opostas em relação àquelas obtidas com outras amostras obtidas de outros pacientes com B-CLL e isto é porque as amostras foram analisadas em um tempo de incubação bem mais cedo com o anticorpo monoclonal. Na realidade, a análise seqüencial de amostras de sangue após tratamento parece sugerir que as alterações imunofenotípicas realizadas pelos linfócitos B depende do tempo porque representa um estágio de desenvolvimento e as alterações imunofenotípicas medidas em tempo X não vão ser iguais ao tempo X mais (não é fixo após induzida) . Contudo, esses tipos de alterações devem estar ocorrendo em um modo mais rigoroso no corpo de outro modo resultaria em imunopatologia. O efeito de tratamento de amostras de sangue de outros pacientes sem malignidade de células B mostra alterações variáveis em imunofenótipos de células e isto é porque os ünfócitos-B estão presentes em quantidade

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113/176 menor. Contudo, o tratamento de frações enriquecidas de linfócitos-B obtidos de doadores de sangue saudáveis mostra alterações imunofenotipicas similares em relação àquelas obtidas com B-CLL com contagens elevadas de linfócitos B.

PAINEL CD8 E CD3

O determinante antigênico CD8 interage com as moléculas MHC classe I, resultando em adesão aumentada entre os linfócitos T CD8+ e as células alvo. Este tipo de interação aumenta a ativação de linfócitos em repouso. O antígeno CD8 é acoplado a uma proteína cinase tirosina (p56ick) e por sua vez o complexo CD8/p56ick pode desempenhar um papel na ativação de linfócitos-T.

O tratamento de amostras de sangue no dispositivo de acordo com a presente invenção obtido de pacientes com BCLL com anticorpo monoclonal para a cadeia B causa um aumento significativo no número relativo de células positivas CD3CD8 e CD3 (muito provavelmente CD4CD3) desse modo indicando mais claramente que células positivas duplas geradas inicialmente estão sendo submetidas ao desenvolvimento em linfócitos-T maduros. Este é um processo que pode ser medido diretamente por CD19 e por DR e indiretamente por antigenos CD8^_CD3~. A avaliação em série de amostras de sangue tratadas do mesmo paciente com o tempo parece estar de acordo com um processo que é idêntico ao desenvolvimento de timócitos (Tabela 7, paciente 2, 3 e 4 e Gráfico 1).

O número relativo de células CD8+ aumentou com o tempo em amostras tratadas e não tratadas porém até um ponto

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114/176 mais elevado em amostras não tratadas. Por outro lado, o número relativo de células CD8⁺CD3⁺ diminuiu com o tempo em amostras não tratadas. Contudo, o número relativo de células CD3⁺ aumentou em amostras de sangue tratadas quando medido com o tempo e esses tipos de células correspondem muito a células positivas únicas CD4⁺CD3⁺; uma forma mais madura de timócitos. Além disso, uma vez que essas amostras também foram imunofenotipifiçadas com outros painéis (mencionado acima nas Tabelas 3, 4, 5 e 6) as alterações gerais incriminam extremamente as células B na geração de progênies e progenitores de linfócitos T.

As amostras de sangue de um paciente com B-CLL (número 2, 3 e 4 Tabelas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7) em alíquotas separadas foram tratadas com nada, com anticorpo monoclonal conjugado PE para a região homóloga da cadeia-β de antígeno DR e forma não conjugada do mesmo anticorpo monoclonal. Na comparação de tratamento conjugado com PE indica claramente que não há alteração no número relativo de células positivas CD3 e marcadores associados como CD4 que foram observados em níveis significativos quando a mesma amostra de sangue foi tratada com forma não conjugada do anticorpo. Contudo, um aumento no número de células positivas CD45 sem antígeno DR sendo expresso em sua superfície foi observado quando medido com o tempo (vide a Tabela 8) . Uma descoberta que era similar àquela observada em amostras não tratadas quando imunofenotipifiçadas com o tempo (Tabela 6). Além disso, o número relativo de células que expressam DR45 low diminuiu com o tempo, um fenômeno que também foi observado nas

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115/176 amostras não tratadas (quando medido com o tempo) do mesmo paciente (vide gráfico IA).

Análise FAC de células derivadas de amostras revestidas buffy humanas

O tratamento de amostras revestidas buffy em um dispositivo de acordo com a presente invenção com anticorpo monoclonal CR3/43 resultou em maior incidência de CD34 (marcador de célula troncoO e menor incidência de CD19 (marcador de linfócito-B) - vide a Tabela 21.

Ensaios de formação de colônia revelaram que nas amostras não tratadas, a colônia predominante era de um tipo eritróide, ao passo que a variação no tipo de colônia nas amostras tratadas foi muito maior com o tipo principal de colônia sendo colônias de células pluripotentes, com granulócitos/macrófagos e megacariócitos juntamente com unidades de formação de colônia de eritróide também sendo observadas.

Estes resultados demonstram que as células tratadas são muito mais capazes de serem aptas a diferenciar ao longo de outras vias linfoematopoiéticas resultando em uma variedade de linhagens de células especializadas.

C. COMPARAÇÃO DO EFEITO DE OUTROS ANTICORPOS MONOCLONAIS COM DIFERENTE ESPECIFICIDADE EM LINFOFOIESIS-T

PAINEL CD19 E CE3

O tratamento de amostras de sangue em um dispositivo de acordo com a presente invenção com anticorpo monoclonal na região homóloga da cadeia-α do antígeno DR e a região homóloga dos antigenos MHC Classe I diminuiu o número

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116/176 de células CD3⁺ e aumentou o número de células CD19⁺. O tratamento do mesmo sangue com anticorpo monoclonal na região homóloga da cadeia-β do antígeno DR diminuiu o número de células CD19⁺ e aumentou o número de células CD3⁺. O tratamento com o anticorpo monoclonal mencionado por último com ciclofosfoamida revelou o mesmo efeito (Tabela 14 paciente 5/6 com B-CLL em 2 h de tratamento).

A análise avançada de células CD19⁺ e CD3⁺ nas mesmas amostras revelou aumentos adicionais no número

relativo	de	células	CD3	⁺ apenas	em sangue	tratado	com
anticorpo	monoclonal	na	região	homóloga	da	cadeia-β	i do
antígeno	DR	(Tabela	14	paciente	5/6 em	24	horas	após
tratamento).	Contudo	, a-	análise	avançada	(24	horas	após

paciente 5/6 Tabela 14) de amostras de sangue tratadas com ciclofosfamida mais anticorpo monoclonal à cadeia-β de antígeno DR mostra inversão no número relativo de células CD19⁺ e CD3⁺ quando comparado com aquele observado em tempo de incubação de 2 horas exatamente sob a mesma condição.

Em geral, o tratamento de amostras de sangue do mesmo paciente com anticorpo monoclonal na região homóloga da cadeia a do antígeno DR ou anticorpo monoclonal ao homólogo da cadeia-α do antígeno classe I mostra um aumento no número relativo de células CD19⁺ (marcador B pan) quando comparado com uma amostra não tratada. O número relativo de células CD19^_CD3~ diminuiu levemente em amostras de sangue tratadas com anticorpo monoclonal para a cadeia-α de antígeno DR ou tratadas com anticorpo monoclonal para os antígenos classe I (vide a Tabela 14 & Gráficos 2, 3 e 4) .

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117/176

O tratamento de amostras de sangue do paciente 09 com anticorpo monoclonal para os antígenos classe I aumentou o número relativo de células CD3⁺ e diminuiu levemente o número relativo de células CD19⁺ e CD19^_CD3~. Contudo, o tratamento de um preparado enriquecido de linfócitos-B obtido de doadores de sangue saudáveis com anticorpo monoclonal para a cadeia-β ou cadeia-α do antígeno DR mostrou alterações imunofenotipicas similares em relação àquelas obtidas com o paciente com B-CLL.

O tratamento de pacientes deficientes em IgA e HIV⁺ com anticorpo monoclonal para a cadeia-β do antígeno DR aumentou o número relativo de células CD3⁺ e diminuiu o número relativo de células CD19⁺. Contudo, o tratamento da mesma amostra de sangue com anticorpo monoclonal na região homóloga do antígeno classe I não produziu o mesmo efeito. O tratamento de amostras de sangue obtidas de pacientes (34/BD e 04/BD) com deficiência de células-B mostrou alterações imunofenotipicas variáveis quando tratadas com anticorpos monoclonais para a cadeia-β do antígeno DR, antígenos classe I e antígeno CD4.

PAINEL CD4 E CD8

As amostras de sangue analisadas utilizando o painel CD19 e CD3 (Tabela 14) também foram imunofenotipadas com o painel CD4 e CD8 (Tabela 15). Os dois painéis parecem estar de acordo e se confirmarem mutuamente. A incubação por 2 horas de amostras de sangue de pacientes com B-CLL (Tabela 15, pacientes 5/6 e 10, Gráficos 2, 3 e 4) com anticorpo monoclonal na região homóloga da cadeia-β do

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118/176 antigeno DR ou com este anticorpo monoclonal mais ciclofosfoamida aumentou o número relativo de células CD8⁺ e CD4⁺ e as células co-expressando os dois marcadores. Por outro lado, o tratamento das mesmas amostras com anticorpos monoclonais na região homóloga da cadeia-α do antigeno DR ou região homóloga da cadeia-α do antigeno classe I não produziu os mesmos efeitos.

A comparação de tendências imunofenotipicas obtidas em períodos de incubação de 2 horas e 24 horas com anticorpo monoclonal para a cadeia-β do antigeno DR mais ciclofosfoamida revelou alterações inversas no número relativo de células positivas CD4 e CD8 (Tabela 15, paciente 5/6 com B-CLL em 2 horas e 24 horas) e tais alterações estavam de acordo com aquelas obtidas com a mesma amostra de sangue analisada com o painel CD19 e CD3 (Tabela 14 o mesmo paciente). As descobertas posteriores indicam que a diferenciação subsequente é reversível visto que as células não diferenciadas podem diferenciar-se em linfócitos-T ou linfócitos-B.

PAINEL DR E CD3

As alterações imunofenotipicas obtidas com painel

DR e CD3 (Tabela 15) confirmam as descobertas obtidas com o

painel CD19	e CD3 e painel CD4 e	CD8 (Tabelas	14	& 15 &
Gráficos	2,	3 e 4)	que	seguiram	o tratamento	das	mesmas
amostras	de	sangue	com	anticorpos	; monoclonais	na	região
homóloga	do	lado beta	- ou	alfa- do	antigeno DR ou anticorpo

monoclonal para os antígenos classe I ou anticorpo monoclonal para a cadeia-β do antigeno DR mais

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119/176 ciclofosfoamida em 2 horas de análise.

Dos resultados, parecería que o anticorpo monoclonal para a região homóloga da cadeia-β do antígeno DR é extremamente capaz de acionar a produção de células positivas CD3 das células DR⁺.

Além disso, os tratamentos como aqueles que envolvem o aprisionamento da cadeia-α de antigenos DR ou aprisionamento do lado-β da molécula em combinação com ciclofosfoamida (tempo prolongado de incubação) promoveu aumentos no número relativo de células CD19⁺ ou células DR⁺.

PAINEL CD56&16 E CD3

O tratamento de amostras de sangue em um dispositivo de acordo com a presente invenção, especialmente daquelas de pacientes com B-CLL com contagens elevadas de linfócitos-B com anticorpo monoclonal para a região homóloga da cadeia-β do antígeno DR aumentou o número relativo de células positivas CD56&16.

Nesses pacientes o número relativo de células CD3+ e CD56+ e CD16+CD3+ também aumentou após o tratamento de amostras de sangue com anticorpo monoclonal para a cadeia-β, confirmando observações anteriores observadas com o mesmo tratamento quando as mesmas amostras de sangue foram analisadas com CD3 e CD19 e painéis CD3 e DR.

PAINEL CD45 E CD14

As amostras de sangue tratadas em um dispositivo de acordo com a presente invenção com anticorpos monoclonais para as cadeias β ou alfa do antígeno DR ou para a cadeia-β mais ciclofosfoamida ou antigenos classe I também foram

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120/176 analisadas com o painel CD45 e CD14 (Tabela 18). A delineação de CD45 baixo, CD45 elevado e CD45 médio é arbitrária. O tratamento da amostra de sangue 5/6 (em 2 horas) com anticorpos monoclonais para a cadeia-β do antígeno DR ou com anticorpo monoclonal mais ciclofosfoamida gerou células CD45+ baixo e aumentou o número relativo de CD45+ médio. Contudo, o tratamento anterior aumentou o número relativo de células CD45+ elevado e o tratamento mencionado por último diminuiu o número relativo de células CD45+ médio e essas alterações pareceram depender do tempo.

As amostras de sangue do paciente 5/6 e 10 (B-CLL_ no tratamento com anticorpo monoclonal para os antigenos classe I mostrou uma redução no número relativo de células CD45+ médio e observações similares foram observadas em amostras de sangue 09 e HIV⁺ após o mesmo tratamento quando comparado com amostras não tratadas. O tratamento de amostras de sangue de pacientes com IgA/D e HIV+ com anticorpo monoclonal para o antígeno classe I aumentou o número relativo de células CD45⁺ baixo quando comparado com amostras não tratadas ou amostras tratadas com anticorpo monoclonal para a cadeia-β do antígeno DR. Contudo, amostras de sangue desses pacientes mostraram uma redução no número relativo de células CD45⁺ médio no tratamento com anticorpo monoclonal para as regiões homólogas da cadeia-β do antígeno DR. As células CD45⁺ médio aumentaram em amostras de sangue de paciente com IgA/D após tratamento com anticorpo monoclonal para o antígeno classe I. Células que eram extremamente grandes, intensamente granulares e

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121/176 expressando níveis intensos de antígeno CD45 foram observadas em amostras de sangue tratadas com anticorpo monoclonal para região homóloga da cadeia-β do antígeno DR de antígenos MHC classe II (vide os Gráficos 1, 2, 3 & 4).

PAINEL CD8 E CD28

O antígeno CD28 está presente aproximadamente em 60% a 80% de linfócitos T de sangue periférico (CD3⁺) , 50% de linfócitos T CD8⁺ e 5% de timócitos CD3- imaturos.

Durante maturação de timócitos, a expressão de antígeno CD28 aumenta de densidade baixa na maioria dos timócitos imaturos CD4⁺CD8⁺ para uma densidade mais elevada virtualmente em todos os timócitos CD3⁺, CD4⁺ ou CD8⁺maduros. A ativação de células aumenta ainda mais a densidade de antígeno CD28. A expressão do CD28 também divide os linfócitos CD8⁺ em dois grupos funcionais. Os linfócitos CD8⁺CD28⁺ mediam citotoxicidade específica de aloantígeno, isto é restrita ao complexo de histocompatibilidade principal (MHC) classe I. A supressão de proliferação de células é mediada pelo subconjunto CD8⁺CD28“. O antígeno CD28 é uma molécula de adesão de células e funciona como um ligando para o antígeno B7/BB-1 que está presente em linfócitos B ativados.

O tratamento de amostras de sangue em um dispositivo de acordo com a presente invenção de pacientes (Tabela 19, pacientes 5/6 e 8) com B-CLL com anticorpo monoclonal para a região homóloga da cadeia-β do antígeno DR aumentou o número relativo de células CD8⁺, CD28⁺ e CD8⁺CD28⁺e todos os outros tipos de tratamento não aumentaram.

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PAINEL CD34 E CD2

O antígeno CD34 está presente em células precursoras hematopoiéticas imaturas e todas as células de formação de colônia hematopoiética em medula óssea, incluindo progenitores unipotentes (CFU-GM, BFU-E) e pluripotentes (CFU-GEMM, CFU-Mix e CFU-blast). O CD34 também é expresso em precursores de células estromais. Precursores de ünfóide-T e B de transferase desoxinucleotidil terminal (TdT)⁺ em osso normal são CD34⁺. O antígeno CD34 está presente em células mielóide prematuras que expressam o antígeno CD33 porém não contêm os antigenos CD14 e CD15 e em células eritróides prematuras que expressam o antígeno CD71 e expressam fracamente o antígeno CD45. O antígeno CD34 também é encontrado em células endoteliais capilares e aproximadamente 1% de timócitos humanos. Linfócitos de sangue periférico normais, monócitos, granulócitos e plaquetas não expressam o antígeno CD34. A densidade de antígeno CD34 é mais elevada em células progenitoras hematopoiéticas prematuras e diminui à medida que as células amadurecem. O antígeno está ausente em células hematopoiéticas totalmente diferenciadas.

Células progenitoras CD34⁺ não comprometidas são CD38^-, DR^- e não têm antigenos específicos de linhagem, como CD71, CD33, CD10 e CD5, enquanto as células CD34+ que são comprometidas com a linhagem expressam o antígeno CD38 em densidade elevada.

A maioria das células CD34⁺ expressam reciprocamente os antigenos CD45RO ou CD45RA.

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Aproximadamente 60% de leucemia linfóide-B aguda e leucemia mielóide aguda expressam o antígeno CD34. O antígeno não é expresso em leucemia linfóide crônica (linhagem B ou T) ou linfomas. O antígeno CD2 está presente em linfócitos T e um subconjunto de linfócitos exterminadores naturais (NK).

Os resultados são mostrados nos Gráficos 2, 3 e 4.

A análise de amostras de sangue de um paciente com B-CLL (Tabela 20, paciente 5/6 em 2 horas) após tratamento com anticorpos monoclonais para a cadeia-β do antígeno DR ou a cadeia-ado mesmo antígeno revelou aumentos acentuados no número relativo de células CD34⁺ e CD34⁺CD2⁺ após tratamento com o anticorpo anterior. Uma vez que as mesmas amostras de sangue foram imunofenotipadas com os painéis acima mencionados (vide as Tabelas 14 a 19) para outros marcadores o aumento no número relativo de células CD34⁺ e CD34⁺CD2⁺observado aqui parece coincidir com aumentos no número relativo de células positivas únicas (SP) CD4⁺CD8⁺, CD8⁺CD3⁺e CD4⁺CD3⁺. Além disso, essas descobertas que parecem exclusivas para o aprisionamento da cadeia-β do antígeno HLA-DR estão em apoio direto de que o processo está originando linfopoiese-T via regressão de linfócitos B.

Na análise do mesmo tratamento 24 horas após as células CD34⁺ pareciam diminuir em níveis para originar aumento adicional no número relativo de linfócitos Τ. O processo de retrodiferenciação que originou inicialmente linfopoiese-T pode ser invertido para originar linfopoieseB. O fenômeno anterior foi observado em tempo de incubação de 2 horas com anticorpo monoclonal para a cadeia-β do

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124/176 antígeno HLA-DR mais ciclofosfoamida, ao passo que o processo mencionado por último foi observado em tempo de incubação de 24 horas com o mesmo tratamento na mesma amostra (Gráfico 2).

O tratamento de amostras de sangue de paciente HIV⁺ (Tabela 20 paciente HIV+) com anticorpo monoclonal para a cadeia-β do antígeno HLA-DR aumentou acentuadamente o número relativo de células CD34⁺ e CD2⁺CD34⁺ como também o tratamento da mesma amostra de sangue com anticorpo monoclonal para a cadeia-β do antígeno HLA-DR e anticorpo monoclonal para a cadeia-α do mesmo antígeno quando adicionado juntos. Contudo, o tratamento desta amostra de sangue com anticorpo monoclonal para a cadeia-α do antígeno HLA-DR não afetou o nível de células CD34+. O tratamento de amostras de sangue obtidas de um bebê com 6 dias de idade (BB/ST Tabela 20) que foi investigado naquela época em relação à leucemia e que tinha um número muito elevado de células atípicas (blasts) em seu sangue com anticorpo monoclonal para a cadeia-β do antígeno HLA-DR, ou anticorpo monoclonal para a cadeia-α do mesmo antígeno ou os dois anticorpos monoclonais adicionados juntos resultaram nas seguintes alterações imunofenotipicas.

Na análise de amostras de sangue não tratadas o número relativo de células CD34⁺ e DR⁺ foi acentuadamente aumentado e no tratamento com anticorpo monoclonal para a cadeia-β o número relativo de células CD34⁺ aumentou ainda mais porém foram observados diminuírem no tratamento com anticorpo monoclonal para a cadeia-OC do antígeno HLA-DR ou

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125/176 tratamento com anticorpos monoclonais para as cadeias-a e β da molécula quando adicionados juntos. Contudo, o tratamento mencionado por último aumentou o número relativo de células CD34⁺CD2⁺ e o oposto ocorreu quando a mesma amostra de sangue foi tratada com anticorpo monoclonal para a cadeia-β do antígeno HLA-DR individualmente. Na análise de alíquotas de sangue tratada e não tratada do mesmo paciente 24 horas após o número relativo de CD34⁺ diminuiu com todos os tratamentos mencionados acima exceto que foi mantido em um nível muito mais elevado com anticorpo monoclonal para a cadeia-β do tratamento de antígeno HLA-DR. O tratamento mencionado por último continuou a diminuir o número relativo de células CD34⁺CD2⁺ 24 horas após.

Estes resultados indicam que o aprisionamento do antígeno HLA-DR via a cadeia-β promove a produção de mais células CD34⁺ do grupo CD2⁺CD34⁺ ou de tipos mais maduros de células como linfócitos-B de pacientes com B-CLL e esses resultados indicam que este tipo de tratamento promove retrodiferenciação. Contudo, imunofenotipagem de amostras de sangue 24 horas após sugere que esses tipos de células parecem existir em outra linhagem e neste caso parecem existir ou em vez disso se comprometer com a linhagem mielóide que foi observada na análise de amostra de sangue tratada com o painel CD7 e CD13&33.

A morfologia altera as características imunofenotipicas de linfócitos-B de B-CLL e frações enriquecidas de indivíduos saudáveis (utilizando contas CD19) no tratamento com anticorpos monoclonais para regiões

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126/176 homólogas da cadeia-β de antigenos MHC classe II. Esses foram acompanhados por uma alteração na morfologia de linfócitos-B. Linfócitos-B foram observados colonizando lâminas de vidro em esfregaços de sangue não tratados foram substituídos por granulócitos, monócitos, números grandes de células que parecem primitivas e hemácias nucleadas. Nenhuma figura mitótica ou morte significativa de células foi observada em esfregaços de sangue tratado ou não tratado.

Os resultados da Tabela 20 demonstram também uma descoberta importante adicional em que de acordo com o método da presente invenção é possível preparar uma célula não diferenciada pela retrodiferenciação de uma célula não diferenciada mais madura.

D. IMAGENS DE MICROSCÓPIO

Além do teste de antígeno como mencionado acima, o método da presente invenção foi seguido visualmente utilizando um microscópio. O dispositivo da presente invenção pode ser programado para rastrear as alterações automaticamente pelos meios de rastreamento.

A este respeito, a figura 8 é uma imagem de microscópio de células B diferenciadas antes do método da presente invenção. A figura 9 é uma imagem de microscópio de células não diferenciadas formadas pela retrodiferenciação das células B de acordo com a presente invenção onde o agente era um anticorpo monoclonal para as regiões homólogas da cadeia-β de antígeno HLA-DR. As células não diferenciadas são os pedaços de células, de cor

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127/176 escura. A figura 10 é uma imagem de microscópio das mesmas células não diferenciadas porém em uma ampliação menor.

As figuras 8 a 10 demonstram visualmente, portanto, a retrodiferenciação de células B em células tronco não diferenciadas pelo método da presente invenção.

A figura 11 é uma imagem de microscópio de células B diferenciadas antes do método da presente invenção. A figura 12 é uma imagem de microscópio de células não diferenciadas formadas pela retrodiferenciação das células B de acordo com a presente invenção onde o agente utilizado era um anticorpo monoclonal para as regiões homólogas da cadeia-β de antigeno HLA-DR. Novamente, as células não diferenciadas são os pedaços de células, de cor escura. A figura 13 é uma imagem de microscópio da formação de células de granulócito diferenciadas das mesmas células não diferenciadas da figura 12.

As figuras 11 a 13 demonstram, portanto, visualmente a retrodiferenciação de células B em células tronco não diferenciadas pelo método da presente invenção seguido pelo comprometimento das células não diferenciadas com novas células diferenciadas sendo de uma linhagem diferente em relação às células diferenciadas originais.

Estes experimentos de microscopia também foram realizados com sangue de pacientes B-CLL, tratados com o anticorpo monoclonal CD3/43 como descrito acima. Como discutido acima, sangue de células B-CLL é um meio auxiliar útil no estudo do processo de retrodiferenciação porque o sangue contém números mais elevados do que o normal de

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128/176 linfócitos B. Os resultados são mostrados em detalhe nas figuras 14 a 17.

A figura 14 mostra em duas ampliações diferentes, uma amostra de sangue não tratada de um paciente B-CLL. Os linfócitos B não tratados (células azuis) mostram morfologia típica, isto é estrutura de cromatina condensada e citoplasma escasso. As células restantes são eritrócitos (hemácias).

O tratamento de amostras de sangue com CR3/43 de anticorpo leva inicialmente a agrupamento de linfócitos B em agregados (figura 15).

As células B agrupadas perdem gradualmente sua morfologia típica, caracterizada pela formação de áreas de células semelhantes a pedras arredondadas, descondensação de estrutura de cromatina, aparição de nucléolos proeminentes, aumento de volume de células e basofilia citoplásmica típica de células não diferenciadas (figura 16). A estrutura cromatina relaxada (descondensada) é um aspecto importante de células não diferenciadas em comparação com células diferenciadas. Isto se deve provavelmente à necessidade de acesso mais extenso a unidades de transcrição para se determinar alterações em expressão de gene necessária para comprometimento ao longo de uma dada linhagem de células. Em contraste, é bem sabido que células mais diferenciadas têm uma estrutura cromatina mais condensada uma vez que apenas uma pequena quantidade de cromatina necessita estar ativa de forma transcripcional.

A aparição de células não diferenciadas é sempre

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129/176 acompanhada pela aparição de células (17A a 17J) com morfologia diferenciada. De forma importante, essas células poderíam não ter surgido por proliferação, uma vez que (i) o tempo de incubação era demasiadamente curto para ocorrer uma ou mais divisões completas de células (ii) nenhuma figura mitótica é vista e (iii) o número absoluto de leucócitos permaneceu igual antes e após o tratamento. Além disso, uma quantidade menor de progenitores diferenciados foi vista em associação a suas progênies mais diferenciadas (vide o precursor mielóide na figura 17J), indicando que essas células especializadas surgiram por diferenciação.

Micrografias figuras 17A a 17J mostram os tipos de células diferenciadas vistas após o tratamento de linfócitos B-CLL com anticorpos monoclonais CR3/43: plaquetas (Pl) figura 17A, Neutrófilos (Ne) - figura 17B, eosinófilos (Eso_ - figura 17C, megacariócitos (Meg) - figura 17D, basófilos (Ba) - figura 17G, linfócitos (Ly) - figura 17H, monócitos (Mo) - figura 171 e progenitores mielóide (Mp) - figura 17J. Também foram vistos progenitores de eritróide e macrófagos (dados não mostrados).

Desse modo, em resumo, esses resultados de microscopia mostram alterações em morfologia de células B em amostras de pacientes com B-CLL, que têm níveis elevados de linfócitos B maduros. As imagens de microscopia mostram alterações na morfologia dos linfócitos B, que inicialmente se agrupam, seguido pela aparição de diversas células com uma faixa graduada de morfologias de células progenitoras a células diferenciadas (neutrófilos, basófilos, eosinófilos,

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130/176 megacariócitos, plaquetas, linfócitos, macrófagos, granulócitos, granulócitos de bastão e células semelhantes a estromal).

Além disso, e muito importante, a presença de progenitores mielóide e eritróide é vista (figura 17J - dados não mostrados). O progenitor mielóide é evidentemente distinguível morfologicamente das outras células, sendo maior e com uma morfologia nuclear distinta bem como contendo grânulos citoplásmicos.

Os dados de microscopia apoiam portanto morf ologicamente o que os dados de citometria de fluxo indicam em termos de marcadores de superfície de células. Esses dados permitem a uma pessoa concluir que o tratamento de linfócitos B com um anticorpo para cadeia β HMC HLA-DR resulta em redução nos números de linfócitos B e aumento no número de células de outras linhagens hemapoiéticas incluindo células precursoras imaturas.

A retrodiferenciação de células T tratadas com um anticorpo para uma cadeia-α MHC classe II (anticorpo monoclonal TAL.1B5) em células tronco não diferenciadas pelo método da presente invenção seguido por comprometimento das células não diferenciadas com novas células diferenciadas sendo de uma linhagem diferente em relação às células diferenciadas originais, também foi seguido por microscopia (dados não mostrados).

E. ANÁLISE DE REARRANJOS DE RECOMBINAÇÃO VDJ EM LINFÓCITOS RETRODIFERENCIADOS

Como antecedente, as células diferenciadas

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131/176 utilizadas nesses experimentos (linfócitos B ou células com certas propriedades de linfócitos T) têm genes que já foram submetidos ao rearranjo para codificar um Ig maduro ou um TCR, respectivamente. No processo ou rearranjo, porções intermediárias de DNA que não fazem parte do gene Ig ou TCR expresso, final, principalmente DNA que está entre o segmento que codifica região variável (V) e o segmento que codifica região constante (C) desses receptores, são cortados do genoma. Esses fragmentos cortados são retidos na célula na forma de DNA extra-cromossômico. Para as células verdadeiramente retrodiferenciarem, o DNA cortado seria reinserido no genoma, colocando as células em um estado similar àquele que precede a sua diferenciação original. Devido a isto, espera-se que uma sonda complementar a uma seqüência no gene rearranjado hibridize em um fragmento de restrição de DNA maior quando o DNA retornou ao seu estado de linha de germe ou não rearranjado em comparação com o DNA rearranjado que caracteriza o estado diferenciado.

1. Rearranjo de genes TCR em células Daudi

No experimento que resulta na mancha do Sul mostrada na figura 18, uma linhagem de células bem conhecida, Daudi, um linfoma de células-B com um gene TCR rearranjado (e o outro deletado) foi utilizado. DNA genômico foi preparado de células Daudi e digerido com EcoRI, submetido à eletroforese de gel e sondado com uma sonda DNA de cadeia-β TCR rotulado. Células Daudi foram utilizadas em vez de linfócitos B purificados de pacientes

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132/176 humanos porque essas células são relacionadas clonalmente e formam uma população de células homogênea com os mesmos rearranjos de gene que podem ser claramente vistos por mancha do Sul de DNA genômico digerido. Em uma amostra de sangue normal, células diferentes têm rearranjos diferentes e assim uma mancha do Sul aparecería como um esfregaço.

Um gene funcional que codifica a cadeia-β TCR é montado em linfócitos por uma série de rearranjos somáticos que ocorrem durante maturação de linfócitos para unir um segmento V, um segmento D e um segmento J. Uma explicação muito clara desses processos de rearranjos é fornecida em Genes VI, Lewin, Oxford University Press, 1997 (páginas 1994-1023) - um livro de estudante padrão. Páginas especificas são citadas abaixo.

Primeiramente, um segmento D é unido por um processo de recombinação a um de vários segmentos J em uma reação de junção D-J. A seguir, um dos muitos segmentos V possíveis (<60) é unido ao segmento DJ resultante (junção VD) para formar um gene de cadeia-β TCR completo. O gene de região constante é imediatamente a jusante do segmento VDJ rearranjado, embora possam haver segmentos J intermediários os quais são cortados durante processamento de DNA para colocar o exon de gene constante em proximidade com o segmento de gene VDJ rearranjado (Lewin, p998).

Em células humanas, há dois segmentos de gene de região constante de cadeia-β TCR diferentes, indicados ΰβΐ e ΰβ2, presentes em dois locais diferentes, cada um dos quais é precedido por um grupo de seis ou sete segmentos de gene

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133/176 de região de junção (υβ) (υβΐ e υβ2) e um segmento D (ϋβΐ e ϋβ2) (vide a figura 1, Toyonaga e outros, 1985, Proc. Natl.

Acad. Sei. USA 82: 8624-8628 e Lewin, pág. 1017).

Os eventos de recombinação que levam os segmentos V, D e J-C a serem colocados em proximidade são catalisados por uma quantidade de proteínas, incluindo RAG-1 e RAG-2 que reconhecem seqüências de heptâmero e nonâmero presentes nas extremidades de recombinação das seqüências de gene V, D e J-C. Dependendo da orientação dessas seqüências de nonâmero/ heptâmero, a recombinação resulta em uma inversão ou deleção. Os dois tipos de eventos resultarão em uma mudança no padrão de fragmento de enzima de restrição do DNA genômico. Além disso, um evento de deleção não resulta necessariamente em perda total do fragmento cortado. Em vez disso, as extremidades do fragmento cortado são unidas novamente para produzir um círculo de DNA que permanece na célula (Okazaki e outros, 1987, Cell 49: 477-85; Davis e outros, 1991, J. Exp. Med. 173: 743-6; Livak e Schatz, 1996, Mol. Cell. Biol. 16: 609-18; Harriman e outros, 1993, Annu Rev Immunol. 11:361-84). Cada segmento de gene, evidentemente, tem dois alelos uma vez que as células possuem um complemento de cromossomo diplóide.

No estado de linha de germe normal, os genes υβΐ e C$2 são dispostos como mostrado na figura 1, Toyonaga e outros, 1985. Um digesto de restrição de DNA genômico com EcoRI gerará duas faixas relevantes detectáveis pela sonda utilizada no experimento (a sonda é um fragmento de DNA rotulado derivado de υβΐ que também hibridiza em C&2 devido

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134/176 a um alto grau de homologia de seqüência) : (i) uma faixa de 12 kb contendo seqüência Οβί; e (ii) uma faixa de 4 kb contendo seqüência ϋβ2. Esta configuração de linha de germe é vista em células imaturas não diferenciadas (faixa A da figura 18) . Esta configuração de linha de germe também é perfeitamente ilustrada pela faixa 3 (2 horas com anticorpo C3/43) da figura 18, fornecendo um padrão idêntico àquele da faixa A.

No estado diferenciado, os dois alelos de genes ϋβΐ e ϋβ2 são rearranjados de tal modo que não há mais um fragmento de 12 kb no local ϋβΐ ou um fragmento de 4 kb no local ϋβ2. Na realidade, nenhum fragmento de hibridização derivado do local ϋβΐ está presente no gel (isto é devido à deleção da seqüência de hibridização dos dois alelos ϋβΐ como resultado de recombinação). Com relação ao local ΰβ2, há na realidade agora duas faixas principais que correspondem a diferentes alelos resultando de rearranjos nos dois cromossomos. A faixa mais larga, que é menor do que 4 kb, corresponde a um fragmento de um dos dois alelos rearranjados. A faixa mais baixa é um fragmento do outro alelo rearranjado. A faixa menor intermediária é provavelmente derivada de um subclone de células Daudi com um rearranjo diferente - consequentemente sua presença em uma quantidade submolar para qualquer alelo. Não obstante, o estado rearranjado é mostrado muito claramente na faixa 1 onde as duas faixas principais são claramente visíveis.

horas com o anticorpo de controle negativo (TAL.1B5) que se liga à cadeia-OC de MHC-DR resultam

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135/176 efetivamente na perda da faixa superior, ao passo que a faixa mais baixa tem uma intensidade similar às células não tratadas na faixa 1 (vide a faixa 2). Uma possível explicação para isto é que as células estão diferenciando, resultando adicionalmente em um evento de recombinação adicional no local ϋβ2 de um alelo, que leva à perda de seqüências ϋβ2. Isto é totalmente compatível com fenômenos conhecidos.

horas com o anticorpo de controle negativo parece restaurar as três faixas vistas nas células não tratadas (vide a faixa 4). Contudo, as faixas migram, efetivamente, em uma posição mais baixa do que as faixas vistas na faixa 2. Não está bem claro como isto surgiu. Uma possível explicação é que a reintegração de seqüências deletadas ocorreu, compatível com o modelo de looping-outexcisão-reintegração (Malissen e outros, 1986, Nature 319:28-32). Não obstante, nenhum resultado visto com o anticorpo TAL.1B5 em 2 horas ou 24 horas é indicativo de um rearranjo para o padrão de linha de germe. As faixas 2 e 4 representam efetivamente um controle negativo - o anticorpo para a cadeia-α não resulta em restauração das seqüências de linha de germe.

Em contraste, os resultados obtidos com um anticorpo monoclonal (CR3/43) para a cadeia-β de MHC-DR após duas horas mostram um padrão de faixas que correspondem à configuração de linha de germe, a saber uma faixa de 12 kb e uma faixa de 4 kb (comparar a faixa 3 com a faixa A) . Em outras palavras, esses resultados mostram que o padrão de

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136/176 restrição de linha de germe nos locais ϋβΐ e ϋβ2 foi

restaurado para	todos os	alelos.
Desses resultados concluímos	que o	padrão	de
faixas visto	na	faixa 3	é indicativo de	um rearranjo do	DNA
genômico das	células	diferenciadas	para regenerar	a
configuração	de	linha de	germe.
A	importância	desta descoberta não	deve	ser
subestimada.		Um rearranjo genômico,	incluindo	deleções,
pode ser invertido para	restaurar o genoma para o	estado	no

qual existia antes de ocorrer o processo de diferenciação. A explicação mais provável é que a inversão causada pelo rearranjo dos alelos ϋβ2 durante diferenciação foi invertido, e a deleção da seqüência ϋβΐ que causou perda das faixas de 12 kb também foi invertida. A fonte da seqüência ϋβΐ ausente provavelmente é DNA circular epissomal presente no núcleo do evento de deleção original. A existência deste DNA circular foi catalogado no estado da técnica (vide as referências citadas acima). Não obstante, o mecanismo preciso pelo qual esta restauração do genoma de linha de germe ocorreu não é importante. O que é importante é que ocorreu.

Uma incubação continua com o anticorpo monoclonal (CR3/43) para a cadeia-β de MHC-DR por 24 horas no dispositivo de acordo com a presente invenção resulta em um padrão de formação de faixa mais completo (faixa 5). Contudo, estas faixas não representam as mesmas faixas do controle não tratado. Em particular, fragmentos de aproximadamente 12 kb que hibridizam com a sonda ainda estão

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137/176 presentes (alelos ϋβ2) . Além disso, é importante apreciar que as faixas marcadas alelos ϋβ2 não correspondem à faixa menor do que 4 kb vista no controle não tratado (faixa 1) . A explicação mais provável para os resultados vistos na faixa 5 é que um processo de rearranjo secundário ocorreu uma vez que o padrão de hibridização lembra aquele das células-T em que é caracterizado por um gene TCR rearranjado (esta explicação é compatível com os dados de citometria de fluxo que mostram um aumento em células tendo marcadores de células característicos de células T). Não obstante, independente da explicação molecular precisa, os resultados vistos na faixa 5 em 24 horas de exposição ao anticorpo CR3/43 apoiam os resultados obtidos em 2 horas de exposição na faixa 3.

2. Rearranjo de gene Ig em células B-CLL

A mancha do Sul mostrada na figura 19B foi obtida utilizando células de sangue periférico de pacientes com leucemia linfocitica crônica (B-CLL). DNA genômico foi preparado dessas células B amplamente monoclonais e digerido com BamHI e HindIII, submetido à eletroforese de gel e sondado com uma sonda DNA TCR rotulada. Essas células B-CLL foram tratadas por 24 horas com o CR3/43 (cadeia anti classe II MHC de HLA-DR, DP e DQ) que foi descrito acima. As manchas foram sondadas com uma sonda de região Ig J radiorrotulada. As duas faixas obtidas das células não tratadas na faixa A, representam os dois alelos Ig rearranjados (paternal e maternal). Essas faixas não aparecem na faixa B que mostra o padrão 24 horas após o

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138/176 tratamento de anticorpo de células. Em seu lugar aparecería uma faixa de 5,4 kb característica do gene Ig de linha de germe.

Em outro experimento, mostrado na figura 19A, células foram deixadas não tratadas ou tratadas para os tempos indicados com o anticorpo de cadeia-β anti-classe II MHC. A região VDJ Ig foi amplificada por PCR nas células BCLL tratadas com anticorpo e diferenciadas (controle) (deixaram metade do gel). Isto gerou um produto de amplificação VDJ das células não tratadas. Contudo, não foi observada nenhuma faixa nas células tratadas com anticorpo porque, como resultado da inserção do DNA genômico cortado, esta configuração de DNA de linha de germe não era suscetível à amplificação PCR utilizando os preparados específicos para VDJ. Um experimento similar (lado direito de gel) permitiu-me visualizar o comportamento de um gene de controle, de administração interna, codificando actina-β. Não houve diferença no produto de amplificação PCR de actina-β, independente do tratamento. Desse modo, este gene de controle não pareceu ser afetado pelo processo de retrodiferenciação que causou profundas alterações no gene Ig das mesmas células sob as mesmas condições.

Os resultados apresentados acima mostram que o tratamento de células com um agente que prende um receptor de superfície de célula apropriado induz retrodiferenciação destas células que é comprovado no nível molecular (e monitorado) pela observação da retrogressão dos rearranjos de DNA cromossômico que caracterizam o estado diferenciado.

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139/176

Desse modo, conclui-se com base na evidência morfológica e genética molecular que células da linhagem de linfócito B, tratadas com um agente (mAb) que prende a cadeia-β MHC classe II, são submetidas à retrodiferenciação. Em contraste, as mesmas células tratadas com anticorpos que prendem cadeia-α classe II não são similarmente induzidas a retrodiferenciarem. Caso haja, elas parecem diferenciar (para frente) ao longo da via de célula B.

F. ESTUDOS ADICIONAIS SOBRE RETRODIFERENCIAÇÃO DE LINFÓCITOS B

Células BCLL purificadas por FACsVantage (95% de células B puras) de pacientes BCLL foram tratadas com o anticorpo CR3/43 em um dispositivo de acordo com a presente invenção como descrito acima e as células processadas por citometria de fluxo. Os resultados mostrados abaixo na Tabela A confirmam adicionalmente os resultados obtidos acima. Um aumento significativo no número de células CD34⁺foi obtido juntamente com uma grande redução no número de células tendo marcadores de superfície de células característicos da linhagem de linfócitos B (CD19, CD20 e CD22). Um ponto importante de se observar da Tabela A é que também mostra um aumento no número de células que são tanto negativas de CD34 como negativas de linhagem. Essas células não diferenciadas não são comprometidas com a linhagem hematopoiética e precedem as células tronco CD34⁺ em diferenciação. Além disso, o exame de amostras por microscopia de luz mostrou uma gama de tipos de células aderentes tendo características morfológicas de células não

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140/176 hematopoiéticas.

TABELA A

Marcador	0 h	2 h	24 h
CD20	73	67	16
CD14	0	3	23
CD34	0	1	23
CD7	0	2	0
CD16	8	3	2
CD19	95	71	1
CD22	5	3	2
CD33	0	0	0
CD3	0	0	0

A perda de marcadores de superfície de células

CD19 acompanhada pelo aparecimento de marcadores de superfícies de células CD34 na mesma célula também demonstrou e registrou em vídeo em tempo real utilizando microscopia confocal. Linfócitos-B antes da adição de mab CR3/43 foram coloridos de verde com um anticorpo monoclonal conjugado de FITC com CD19. Após a adição de mab CR3/43, as células perderam sua fluorescência verde e começaram a ficar da cor vermelha com um anticorpo monoclonal conjugado com PE/Cy5 (ou quantum red) com CD34 porém não verde (vide a figura 23 que mostra duas imagens paradas do video de tempo). Os resultados confirmam claramente que durante a retrodiferenciação de linfócitos B, marcadores específicos de linhagem como CD19 são perdidos enquanto um marcador de

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141/176 células tronco como CD34 é expresso novamente.

G. OUTROS AGENTES QUE INDUZEM RETRODIFERENCIAÇÃO DE LINFÓCITOS B EM CÉLULAS TRONCO HEMATOPOIÉTICAS

Estudos iniciais identificaram na realidade três agentes - granulócito/monócito-fator de estimulação de colônia (GM-CSF), eritropoietina e mAb CR3/43. Um preparado de linfócitos B normais, purificados e enriquecidos foi tratado em um dispositivo de acordo com a presente invenção com um desses três agentes em um modo similar àquele descrito para CR3/43 e TAL.1B5 acima e as amostras tratadas examinadas por citometria de fluxo como descrito acima. Comparado com o controle negativo, todas as três amostras tratadas com GM-CSF, eritropoietina ou mAb CR3/43 mostraram alterações compatíveis com retrodiferenciação. E particular, todos os três agentes aumentaram o número relativo de células CD34⁺ na população de células (vide a figura 20). O maior efeito, contudo, foi visto com CR3/43 e consequentemente este agente foi selecionado para uso nos estudos mais detalhados aqui apresentados.

H. PROPRIEDADES DE CÉLULAS TRONCO HEMATOPOIÉTICAS PRODUZIDAS PELO PROCESSO DE RETRODIFERENCIAÇÃO

Ensaios de formação de colônia

Para confirmar que as células CD34⁺ observadas por citometria de fluxo e as células não diferenciadas identificadas por microscopia tinham as propriedades de células hematopoiéticas não diferenciadas, amostras de sangue tratadas com um anticorpo para a cadeia-β MHC classe II (CR3/43 - vide acima) foram submetidas a ensaios de

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142/176 formação de colônia - um método padrão conhecido no estado da técnica para avaliar as capacidades de células hematopoiéticas primitivas. Os ensaios de formação de colônia podem ser conduzidas automaticamente no dispositivo de acordo com a presente invenção como parte do mecanismo de rastreamento.

Ensaios clonais in vitro para célula tronco hematopoiética permitem a quantificação de células progenitoras primitivas que possuem a capacidade de proliferar, diferenciar e desenvolver em células mielóide e/ou eritróide fenotipica e funcionalmente maduras. Por exemplo na presença de fatores de crescimento células tronco quando semeadas/imobilizadas em matriz de gel mole in vitro são capazes de crescimento clonal (proliferação) e diferenciação.

A figura 21 é um ensaio de colônias de células tronco produzidas de acordo com os métodos da invenção, utilizando microscopia de campo brilhante invertida. Nesse ensaio células B obtidas de revestimento buffy de doadores de sangue saudáveis foram tratadas com CR3/43 mab e a seguir submetidas a ensaios de colônia como descrito na seção de materiais e métodos.

Os painéis (a) a (e) na figura 21 mostram:

a) microscopia de campo brilhante de prato de cultura visualizado em ampliação x 3 mostrando colônias de eritróide, mielóide e misturadas (consistindo em células de eritróide e mielóide maduras) que podem ser prontamente vistas mesmo a

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143/176 olho nu. Cada colônia surgiu de uma única célula tronco hematopoiética por proliferação e subsequente diferenciação.

b) MIX-CFC esta colônia surgiu de uma única célula tronco hematopoiética multi-potente (células tronco capazes de dar origem a células de linhagens de eritróide e mielóide.

c) M-CFC esta colônia consiste em macrófagos.

d) GM-CFC esta colônia consiste na linhagem de mielóide incluindo macrófagos, granulócitos e megacariócitos.

e) BFU-E esta colônia consiste em células que pertencem à linhagem de eritróide como normoblastos e células vermelhas não nucleadas. A coloração vermelha de células mostras que elas são bem hemogloblinizadas. O tamanho grande desta colônia indica que surgiu de uma célula tronco extremamente primitiva.

Os mesmos resultados foram obtidos com células BCLL (dados não mostrados). Células B não tratadas não deram origem a colônias hematopoiéticas (dados não mostrados). Esses resultados demonstram portanto a presença de células tronco hematopoiéticas viáveis em amostras de sangue tratadas com CR3/43 de anticorpo monoclonal para a cadeia-β MHC classe II porém não em amostras de sangue não tratadas.

Cultura a longo prazo

O ensaio a longo prazo examina o potencial de auto-renovação de células tronco hematopoiéticas. Nesta

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144/176 cultura a maioria dos componentes de hematopoiese de medula óssea é reproduzida in vitro. O aspecto importante desta cultura é hematopoiese mantida, que ocorre na ausência de fatores de crescimento adicionados. Neste ensaio o processo de hematopoiese é absolutamente dependente do estabelecimento de uma camada aderente de células estromais derivados de medula óssea. Células estromais (consistindo em uma variedade de células não hematopoiéticas por exemplo, fibroblasto, células gat e incluindo todos os tipos de células que pertencem ao sistema mesenquimal) suportam hematopoiese pela provisão do ambiente apropriado (secreção de fatores de crescimento e síntese de matriz extracelular) para promover a sobrevivência, auto-renovação, proliferação e diferenciação das células tronco.

Neste ensaio, o tratamento de células B obtidas de revestimentos buffy de doadores de sangue saudáveis (os mesmos resultados foram obtidos com células B-CLL) com CR3/43 mab deu origem à formação de uma camada de células aderentes em horas da adição do anticorpo que também aumentou com o tempo.

A camada aderente consistiu em células estromais (células de coberta, consistindo principalmente em fibroblasto/células do tipo mesenquimal/células grandes refringentes de luz quando vistas com microscopia de campo brilhante invertido - vide a figura 22) que suportou o crescimento e desenvolvimento de células hematopoiéticas até 12 semanas e por mais tempo (essas células mostram contato intimo com células hematopoiéticas). São também visíveis na

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145/176 camada aderente grupos de células hematopoiéticas primitivas (também conhecidas como áreas de pedras arredondadas/grupos de células de aparência escura) que são a origem de produção prolongada de células hematopoiéticas.

As camadas não aderentes que estão no topo da camada estromal (grupos de células de aparência brilhante) consistindo em pequenas células redondas que formam grupos de focos hematopoiéticos. Esta camada contém células tronco e também progenitores mais comprometidos do sistema hematopoiético. A camada não aderente foi capaz de dar origem a MIX-CFC, GM-CFC, M-CFC, BFU-E (como determinado utilizando o ensaio clonal) e CFU-F (unidade de formação de colônia-fibroblasto) (quando sub-cultivado com meio de cultura a longo prazo).

I. RT-PCR DE CÉLULAS TRATADAS COM UM ANTICORPO PARA A CADEIA-β DE HLA-DR.

A transcrição de gene foi medida em células Ramos (linfoma B) e K562 (leucemia de eritróide) tratadas com o CR3/43 mab para o CD34, c-kit (ligando de fator de célula tronco), ε-hemoglobina (forma embriônica de hemoglobina) e genes de actina-β.

Métodos mRNA foi extraído antes e após o tratamento com CR3/43 mab utilizando RNAZOL (CINA BIOTECH). mRNA foi submetido à transcrição inversa de preparação de hexâmero por incubação em temperatura ambiente por 5 min. com 4 μΐ de tampão padrão, 2 μΐ dNTPs, 1 μΐ RNASIN, 1 μΐ preparado inverso (preparado de hexâmero aleatório) e 1 μΐ de enzima

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146/176 de transcriptase inversa MMLV. Esta mistura foi adicionalmente incubada por 1 h a 38°C. Misturas foram a seguir submetidas a PCR sob condições padrão utilizando preparados designados para amplificar CD34, c-kit, εhemoglobina e seqüências de actina-β. Os preparados foram sintetizados no Randell Institute Kings College de acordo com dados publicados.

Resultados

Os resultados obtidos mostram que ao passo que os níveis de mRNA actina-β não mudaram, os níveis de CD34, ckit e ε-hemaglobina mRNA todos aumentaram significativamente após o tratamento com o CR3/43 mAb. Os resultados para CD34 e c-kit fornecem ainda suporte para os dados detalhados acima que demonstram a retrodiferenciação de linfócitos B para produzir células tronco hematopoiéticas.

Os resultados obtidos para a ε-hemaglobina são ainda mais interessantes uma vez que ε-hemaglobina é normalmente apenas expressa em células embriônicas. Portanto é possível que o tratamento com CR3/43 mAb não apenas dá origem a células tronco hematopoiéticas porém também até mesmo a células não diferenciadas mais primitivas como células tronco embriônicas.

J. SUMÁRIO

Em resumo, o dispositivo de acordo com a presente invenção pode ser utilizado na retrodiferenciação de células diferenciadas em células tronco. Os exemplos descrevem experimentos in vitro que revelam descobertas seminais, extremamente interessantes com relação a ontogenia e

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147/176 desenvolvimento de linfócitos T e B os quais podem ser utilizados na geração de células tronco para afetar linfoematopoiese em amostras de sangue periférico em uma questão de horas.

O tratamento de amostras de sangue periférico obtidas de pacientes com leucemia linfocitica crônica de célula-B (B-CLL) com elevadas contagens de linfócitos de B, com anticorpo monoclonal para a região homóloga da cadeia-β de antigenos classe-II deu origem a um aumento acentuado no número relativo de linfócitos T positivos únicos (SP) e seus progenitores que eram positivos duplos para os antigenos CD4 e CD8 de marcadores de timócitos e estes foram co-expressos simultaneamente. Contudo, esses fenômenos foram sempre acompanhados por uma redução significativa no número relativo de linfócitos-B. Essas observações não foram observadas quando as mesmas amostras de sangue foram tratadas com anticorpos monoclonais para a região homóloga da cadeia-α de antigenos classe-II ou para a região homóloga de antigenos classe I.

O tratamento de sangue integral obtido de pacientes com leucemia linfocitica crônica de células B (CLL) em um dispositivo de acordo com a presente invenção com anticorpo monoclonal para a região homóloga da cadeia B do antígeno HLA-DR pareceu originar linfopoiese-T. Este evento foi marcado pela aparição de células positivas duplas co-expressando os marcadores CD4 e CD8, a aparição de células que expressam CD34 e o aumento concomitante no número de linfócitos CD4⁺ CD3⁺ e CD8⁺ CD3⁺ positivos

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148/176 únicos. Além disso, as alterações imunofenotipicas que ocorreram na geração de tais células foram idênticos aqueles citados para desenvolvimento de timócitos, especialmente quando medido com o tempo.

As percentagens de células positivas duplas (DP) geradas em tempo de incubação de 2 horas de sangue integral com anticorpo monoclonal para a região homóloga da cadeia-β do antígeno DR, diminuíram com o tempo e esses eventos foram acompanhados pelo aumento nas percentagens de células CD4⁺CD3⁺ e CD8⁺ CD3 positivas únicas simultaneamente e em momentos posteriores também. Cadeias α e β TCR também foram expressas nesses tipos de células.

Linfócitos-B foram constantemente observados como perdendo marcadores como CD19, CD21, CD23, IgM e DR e isto coincidiu com o aparecimento de células CD34⁺ CD2⁺, aumentos em células CD7⁺, aumentos em células CD8⁺ CD28⁺ e CD28⁺, aumentos em células CD25⁺, o aparecimento de células CD10⁺ e CD34⁺ e células CD34⁺ e CD19⁺ aumentos em células CD5⁺, e células que expressam baixos níveis de antígeno CD45. Estas alterações foram devidas ao tratamento de sangue com anticorpo monoclonal para a região homóloga da cadeia-β de antígeno HLA-DR.

As alterações imunofenotipicas associadas a tal tratamento são compatíveis com retrodiferenciação e comprometimento subsequente (isto é recomprometimento) de linfócitos B, porque a maioria dos leucócitos no sangue de pacientes com B-CLL antes do tratamento eram linfócitos B. Além disso, linfócitos B de pacientes com B-CLL que foram

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149/176 induzidos a se tornar linfócitos-T após tratamento com ciclofosfamida e anticorpo monoclonal para a cadeia-β do antígeno HLA-DR, foram capazes de reverter a linfócitos B após incubação prolongada com este tratamento.

Na análise de amostras tratadas com anticorpo monoclonal para a cadeia-β de antígeno HLA-DR, com painéis CD16&56 e CD3 e CD8 e CD3, o número relativo de células que expressam esses marcadores aumenta constantemente em incrementos compatíveis com aqueles determinados com painéis como CD19 e CD3 e DR e CD3. A investigação do sobrenadante de amostras tratadas e não tratadas de pacientes com infecção por HIV utilizando neflometria e imunoeletroforese revela níveis aumentados de IgG que indicam que as células-B devem ter passado através do estágio de células de plasma. O aumento no número relativo de todas as células acima mencionadas também foi acompanhado pelo aparecimento de células intensamente granuladas de tamanho médio que expressam os antígenos CD56&16 em quantidades extremamente elevadas. Outras células que eram extremamente grandes e intensamente granuladas foram observadas transientemente e estas eram positivas para CD34 e positivas duplas para marcadores CD4 CD8. Outras células transientes também foram observadas e estas eram grandes e granulares e positivas para os receptores CD3 e CD19. CD25 que estava presente na maioria de linfócitos-B foi perdido e se tornou expresso por linfócitos T recentemente formados que sempre foram observados aumentarem em número.

Células CD28⁺CD8⁺ e CD28⁺ apareceram após

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150/176 tratamento de sangue integral de pacientes com B-CLL com anticorpo monoclonal para a região homóloga da cadeia B do antígeno DR. Essas descobertas foram devido ao tratamento de sangue com anticorpo monoclonal para a região homóloga da cadeia-β de antígeno HLA-DR.

T-linfopoiese gerado desse modo também foi observado em sangue periférico de doadores de sangue saudáveis, sangue de cordão, medula óssea, pacientes com diversas infecções incluindo indivíduos HIV⁺ e pacientes com AIDS, frações enriquecidas para linfócitos B obtidos de amostras de sangue de doadores de sangue saudáveis, pacientes com deficiência de IgA e outros pacientes com várias outras condições. Além disso, a análise de marcadores de mielóide em amostras tratadas de dois pacientes com B-CLL com anticorpo monoclonal para a região homóloga da cadeia-β do antígeno HLA-DR mostrou um aumento significativo no número relativo de células que expressam os marcadores de mielóide como CD13 e CD33.

Esses marcadores foram co-expressos com os antigenos CD56 & 16 ou CD7. Contudo, o número relativo de células CD7⁺ com marcadores de linfócitos-T e sem antigenos de mielóide foi observado em uma população separada de células. Essas observações especificas não foram vistas em amostras não tratadas ou em amostras tratadas com anticorpos monoclonais para os antigenos da classe I ou a região homóloga da cadeia-α de antígeno HLA-DR (vide Gráficos 2 & 3). Esses resultados finais sugerem que linfócitos-B após serem acionados via cadeia-β do antígeno HLA-DR não são

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151/176 apenas capazes de regredirem em células progenitoras de linfócito T porém também são capazes de existirem nas linhagens de eritróide e mielóide.

Desse modo em resumo, os dados apresentados no presente pedido demonstram que em um dispositivo de acordo com a presente invenção (i) é possível converter células saudáveis de uma linhagem em células tendo os marcadores de superfície de célula e características morfológicas de células de várias outras linhagens e (ii) é possível obterse células tendo os marcadores de superfície de células e características morfológicas de células precursoras primitivas (por exemplo células troncoO de linfócitos T e linfócitos B diferenciados.

Deve ser observado que diversos experimentos foram realizados com células BCLL. Células BCLL são linfócitos B maduros que são incapazes de diferenciar-se do estágio diferenciado terminalmente, final de uma célula de plasma. Em vez disso, devido a um defeito de cromossomo, apresentam níveis elevados de proliferação, consequentemente os grandes números de linfócitos B no sangue de pacientes BCLL. Em contraste com um número de células de tumor descritas no estado da técnica, células BCLL não foram submetidas a nenhuma forma de diferenciação inversa limitada antes do uso nos métodos da invenção. Além disso, não apresentam nenhuma característica de células não diferenciadas em termos de estrutura genômica, marcadores de célula ou morfologia de células. São em todos os aspectos linfócitos B maduros.

Desse modo ao passo que algumas células malignas

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152/176 podem ter até um ponto limitado algumas características de células não diferenciadas, este não é o caso para as células BCLL, que são um sistema experimental perfeitamente aceitável para estudar linfócitos B. Na realidade, células Daudi e BCLL não são suficientemente distinguidas de células normais em quaisquer aspectos relevantes para esses experimentos. Realmente, a adequação de células BCLL como um sistema modelo confirmado por Martensson e outros, 1989, Eur. J. Immunol. 19:1625-1629 (vide a página 1625 rhs. I^opará.).

Além disso, o tratamento de amostras de sangue revestidas buffy humanas de doadores saudáveis com anticorpo monoclonal CR3/43 resultou em maior incidência de CD34 (marcador de célula tronco) e uma incidência mais baixa de CD19 (marcador de linfócito-B).

Deve ser observado que as células tronco que são produzidas pelo método da presente invenção podem ser células tronco de qualquer tecido e não são necessariamente limitadas a células progenitoras linfoematopoiéticas.

Outras modificações da presente invenção serão evidentes para aqueles versados no estado da técnica.

Como será facilmente evidente para aqueles versados no estado da técnica, o dispositivo da presente invenção não é necessariamente limitado ao uso com uma população de células que inclui células comprometidas e/ou um agente como aqui revelado, e é adequado para uso com qualquer procedimento que requer a mistura e incubação de um fluido com um agente.

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Todas as publicações mencionadas na especificação acima são aqui incorporadas como referência. Várias modificações e variações dos métodos e sistemas descritos da invenção serão evidentes para aqueles versados no estado da técnica sem se afastar do âmbito e espirito da invenção.

Embora a invenção tenha sido descrita com relação a modalidades preferidas especificas, deve ser entendido que a invenção como reivindicada não deve ser limitada indevidamente a tais modalidades especificas. Realmente, 10 várias modificações dos modos descritos para realizar a invenção que são óbvias para aqueles versados em biologia molecular ou campos relacionados pretendem estar abrangidas no âmbito das reivindicações que se seguem.

TABELA 1

DIAGNÓSTICO CLÍNICO DE PACIENTES E CONDIÇÕES EXPERIMENTAIS

DE AMOSTRAS DE SANGUE INCLUINDO CONTAGENS COULTER (WBC) APÓS E ANTES DO TRATAMENTO DE ESPÉCIMES DE SANGUE COM VÁRIOS

ANTICORPOS MONOCLONAIS E OUTROS AGENTES

ID DE PACIENTE	DIAGNÓSTICO	EXPT COND	WBC/L X 10-9 B A	$ LYMPH B A	# LYMPH/L 10X-9 B A	AGENTE ML/mL
1	B-CLL	12HR a 22C	100 ND	86,1 ND	86,1 ND	ANTI-B 50
2	B-CLL	24HR a 22C 2 HR a 22C	39,1 9,6 39,1 37,7	74,4 63,3 74,4 75,1	29,9 6,1 29,9 28,3	ANTI-B 50 ANTI-B PE 50
3	B-CLL	6 HR a 22C 6 HR a 22C	39,5 9,3 39,5 37,7	71,9 67,2 71,9 72,5	28,3 6,2 28,3 27,4	ANTI-B 50 ANTI-B PE 50

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4	B-CLL	24 HR a 22C 24 HR a 22C	39 9,3 39 36,2	73 66,5 73 70,4	28,4 6,2 28,4 25,5	ANTI-B 50 ANTI-B PE 50
5	B-CLL	2 HR a 22C				ANTI-B 50 ANTI-A 50 ANTI-I 50 ANTI-B &AGENTE TOXICO 25+25
6	B-CLL	24 HR a 22C				ANTI-B 50
7	B-CLL	24 HR a 22C	170 128 178 130	94,5 91,1 94,2 90, 4	16,9 11,6 16.8 11.9	ANTI-B 10 ANTI-I 10 ANTI-B &AGENTE TÓXICO 10 + 20
8	B-CLL	24 HR a 22C	16 7	81,9 51,2	14 3,0	ANTI-B 20
9	B-CLL	12 HR a 22C	+++ 89,5 +++ +++ 95,4	87 85,1 8,54 89, 4 84, 9	+++ 76,2 +++ +++	ANTI-B 30 ANTI-I 30 ANTI-4 30 ANTI- I+II+4 10+10+10
10	B-CLL	24 HR a 22C	19,3 ND	86 ND	16,7 ND	ANTI-B 30 ANTI-I 30
92	PACIENTE EXTERNO	2 HR a 22C	5,4 ND	74,5 ND	ND	ANTI-B 20
87	PACIENTE EXTERNO	2 HR a 22C	4,8 ND	59,3 ND	ND	ANTI-B 20

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91	PACIENTE EXTERNO	2 HR a 22C	4,2 ND	54,0 ND	ND	ANTI-B 20
21	PACIENTE EXTERNO	2 HR a 22C	3,9 ND	47,4 ND	ND	ANTI-B 20
34	PACIENTE EXTERNO	2 HR a 22C	7,2 ND	20,0 ND	ND	ANTI-B
36	CMV bebê	4 HR a 22C	13,4 ND	7,3 ND	ND	ANTI-B 20
93	HIV+ bebê	4 HR a 22C	5,6 ND	43,4 ND	ND	ANTI-B 20
BB/ST	40% blast no sangue 6 dias de idade	2 HR a 22C	60,5 ND	20,2 ND	12,2 ND	ANTI-B 50 ANTI-A 50 ANTI-AB 25+25
HIV25	AIDS	2 HR a 22C	7,5 ND	34,8 ND	2,6 ND	ANTI-B 50 ANTI-A 50 ANTI- AB25+25
43/BD	DEFICINTE EM CÉLULA B	4 HR a 22C				ANTI-B 20 ANTI-I 20 ANTI-4 20
OB/BD	DEFICIENTE EM CÉLULA B	4 HR a 22C				ANTI-B 20 ANTI-I 20 ANTI-4 20
HIV+	AIDS	6 HR a 22C				ANTI-B 20 ANTI-I
IgA-D	IgA DEFICIENTE	6 HR a 22C				ANTI-B 20 ANTI-I 20

EXPT COND: condições experimentais

B: antes

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156/176

A: após

ANTI-B:	anticorpo monoclonal para	a	região	homóloga	da
	cadeia-β de antigeno HLA-DR
ΑΝΤΙ-A:	anticorpo monoclonal para	a	região	homóloga	da
	cadeia-α de antigeno HLA-DR
ANTI-I:	anticorpo monoclonal para	a	região	homóloga	de

Antígenos Classe I

ANTI-AB: tanto ANTI-B como ANTI-A adicionados juntos

ANTI-4: anticorpo monoclonal para o antigeno CD4

ΑΝΤΙ—I+II+4: ANTI-I e ANTI-B e ANTI-4 adicionados juntos

Agente citotóxico: ciclofosfamida

ML/ml: micro litro por ml

L: litro

TABELA 2

IMUNOFENOTIPAGEM DE PACIENTES COM B-CLL E OUTRAS CONDIÇÕES

ANTES E APÓS TRATAMENTO DE AMOSTRAS DE SANGUE COM ANTICORPO

MONOCLONAL PARA A REGIÃO HOMÓLOGA DA CADEIA B DO HLA-DR COM

ANTICORPOS MONOCLONAIS CD19 E CD3.

Paciente		g, o		g, o	g, o	CD19+CD3+	g, o	g, o	CD19+HG
		CD19 +		CD3 +			CD3-CD19-		CD3-FC+
	B	A	B	A	B	A	Β A	B	A
1	88	40	5	19	1	2	6 26	0	12
2	73	15	10	33	2	7	15 41	0	5
3	73	11	11	33	2	2	14 52	0	2

Petição 870180128284, de 10/09/2018, pág. 183/202

157/176

4	71	13	11	37	2	2	16	47	0	2
5	85	40	5	16	1	1	6	26	3	18
6	85	43	5	18	1	1	6	27	3	10
7	90	72	2	4	0	2	7	8	0	14
8	62	25	7	13	0	1	29	55	2	6
9	90	85	2	3	0	0	2	1	1	4
10	78	50	7	14	0	0	14	26	0	8
92	12	10	38	49	0	1	49	40	0	0
91	7	3	35	29	0	1	59	67	0	0
87	5	3	32	38	1	1	63	58	0	0
21	1	1	27	29	1	0	71	70	0	0
34	1	1	13	13	0	2	86	84	0	0
39	10	6	23	25	0	0	67	69	0	0
93	6	3	26	27	1	1	68	70	0	0
BB/ST	1	1	12	13	0	0	87	86	0	0
HIV25	7	2	26	27	0	0	68	87	0	0
43/BD	0	0	40	42	0	1	58	54	0	0

04/BD	0	0	49	41	0	3	43	41	0	0
HIV+	1	1	10	14	0	0	89	87	0	0
IgA/D	10	1	21	25	2	3	67	71	0	0

B: antes do tratamento

A: após o tratamento

Petição 870180128284, de 10/09/2018, pág. 184/202

159/176

TABELA 3

IMUNOFENOTIPAGEM DE PACIENTES COM B-CLL E OUTRAS CONDIÇÕES

ANTES E APÓS TRATAMENTO DE AMOSTRAS DE SANGUE COM ANTICORPO

MONOCLONAL PARA A CADEIA B DA REGIÃO HOMÓLOGA DO HLA-DR COM

ANTICORPOS MONOCLONAIS PARA CD4 E CD8.

Paciente	O, o CD8 +	O, o CD4 +	% CD4+CD8+	O, o CD4-CD8-	% CD4+LOW
	B	A	B	A	B	A	B	A	B	A
1	2, 8	16	2,9	11,4	0	3,2	93,1	67, 6	0	0
2	6,2	13,2	9,1	24,3	0	9,4	78, 7	46	5, 8	6,3
3	7,2	13,1	7,4	23, 9	0	8,2	78, 8	48,1	6,3	6,6
4	10,1	24,2	7,6	24, 9	0,3	2, 8	77,5	42	4,6	5
5	2,9	16,2	1, 8	7,6	0	2	95	62,3	0	0
6	ND	12	ND	8,1	ND	1, 7	ND	75, 7	ND	0
7	1, 9	2, 6	1, 9	2, 8	0	0	95, 8	94,3	0	0
8	3,2	7	3,9	6,9	0,1	2	87,3	79, 8	4,3	6
9	2, 8	2,9	3	3	0	0	94	94,1	0	0
10	5,7	9,4	4,7	9,1	0, 6	0, 8	88, 7	79,2	0	0
92	21	19	21, 6	21	0, 8	1,9	50,5	52,5	5,3	4,8
91	15, 4	18,1	13, 6	17, 9	6,2	2, 6	57	57,3	7,3	3,5
87	16,8	21, 8	13, 4	20, 4	2,9	2, 6	59,5	48, 9	7	5, 6
21	16	24,1	9,1	15,2	1	2, 6	69, 6	53,2	3,7	4,2
34	9,4	11,9	5,7	4,9	2	3,3	67, 6	65,3	14, 4	14,5
39	12,1	12, 6	13,1	14, 6	0,4	1,3	62,3	66,7	11,9	4,3
93	18, 9	20,3	9,7	10,3	1, 8	1, 4	65,5	65, 9	3,4	1, 8
BB/ST	6,3	13	5,7	7,3	2,2	1,1	34, 7	70,3	50,3	7,6
HIV25	24,1	24, 9	0, 8	1,1	1,3	5	70,2	69,3	2,9	3, 8

TABELA 4

Petição 870180128284, de 10/09/2018, pág. 185/202

160/176

IMUNOFENOTIPAGEM DE PACIENTES COM B-CLL E OUTRAS CONDIÇÕES

ANTES E APÓS O TRATAMENTO DE AMOSTRAS COM ANTICORPO

MONOCLONAL PARA A CADEIA B DO HLA-DR COM ANTICORPOS MONOCLONAIS PARA CD3 E DR

Paciente	DR+	CD+	CD+DR+	DR-CD3-	DR+HCD3-
	B	A	B	A	B	A	B	A	B	A
1	87	45,5	3,5	20, 8	2,5	4,2	6,9	21, 6	0	7,6
2	76,2	19, 4	9,6	29,2	3,9	8,7	10,3	36,8	0	5,5
3	77, 7	18,3	8,4	29, 4	4,1	8, 8	9,6	38,1	0	4,7
4	76,8	19,2	7,6	29,5	6,2	10,5	9,1	37,2	0	3,3
5	ND	47,1	ND	11,5	ND	9,9	ND	22, 4	ND	7,3
6	ND
7	91, 4	85, 8	2,4	2,5	0,7	0,7	5,1	4,2	0	6,3
8	61, 8	28, 9	6,5	11,2	2	3,3	28, 6	54, 6	0	1,5
9	ND
10	82, 6	44, 7	4,3	9,8	3,3	5	9,8	22,2	0	17, 9
92	23, 8	14,1	39,3	41, 9	4,5	3,5	32, 4	40,5	0	0
91	13,3	7,9	29, 6	32,5	3,4	2,9	53, 4	56,5	0	0
87	14, 8	12,2	28, 4	34,1	5,5	6,6	51,1	46,5	0	0
21	ND
34	11,9	12, 9	10, 4	13, 7	0, 8	0, 6	76,7	72, 8	0	0
39	25, 6	13, 7	24, 6	25,2	3	2, 8	46,5	25,2	0	0
93	13,3	8,9	18, 4	18, 9	9,9	10,1	58,2	61, 7	0	0
BB/ST	44,2	32,5	11,7	12,2	0, 8	0, 8	43	49, 4	0	4,6

TABELA 5

IMUNOFENOTIPAGEM DE PACIENTES COM B-CLL E OUTRAS CONDIÇÕES

Petição 870180128284, de 10/09/2018, pág. 186/202

161/176

ANTES E APÓS TRATAMENTO DE AMOSTRAS DE SANGUE COM ANTICORPO

MONOCLONAL PARA A REGIÃO HOMÓLOGA DA CADEIA B DO HLA-DR COM

ANTICORPOS MONOCLONAIS PARA CD16+56 E CD3.

Paciente	CD56+&16	CD3 +	CD56+&16+ CD3 +	CD56+&16- CD3-
	B	A	B	A	B	A	B	A
1	2	4,3	5,7	19, 7	0,7	1, 7	91,3	73
2	11,5	38, 9	12, 4	32, 6	1	6,6	74,5	21
3	12	36,2	12,1	34,5	0,7	6	75,5	23
4	12,2	32, 6	12, 4	39, 6	0,5	5	74, 7	22,2
5	ND	13,1	ND	9,4	ND	2, 6	ND	73,5
6	ND
7	0, 8	0, 8	2, 8	2,4	0,3	0,2	96,2	96,4
8	24, 8	52	5,4	12, 4	0,9	4,1	68,3	31,1
9	ND
10	1,1	1,3	6,1	13, 7	2,1	2,5	90,5	82, 4
92	23, 8	34,5	44,3	44, 8	2	1,5	29,2	18, 6
91	4,6	3,9	28, 8	29, 4	3	3,2	63,3	63,3
87	47, 9	46,4	28, 8	36,5	5, 8	3,7	16,9	13
21	9,4	9,4	19, 7	23, 6	4,2	6,7	66	59,5
34	21,5	12, 8	11,4	13, 7	1,8	0, 6	64, 6	72, 8
39	7	2,7	23, 4	26,1	1,1	0,1	68,2	71
93	55, 8	54, 9	26,2	26,3	1, 7	2	16,1	16,8
BB/ST	28, 8	29, 9	12	14,3	0, 8	1, 8	49, 4	53, 6

TABELA 6

IMUNOFENOTIPAGEM DE PACIENTES COM B-CLL E OUTRAS CONDIÇÕES

ANTES E APÓS O TRATAMENTO DE SANGUE COM ANTICORPO MONOCLONAL

Petição 870180128284, de 10/09/2018, pág. 187/202

162/176

PARA A REGIÃO HOMÓLOGA DA CADEIA B DE HLA-DR COM ANTICORPOS

MONOCLONAIS PARA CD45 E CD14.

Paciente	CD45+H	CD45+L	CD45+CD14+
	B	A	B	A	B	A
1	90,5	70,1	7,5	21, 9	0, 8	3,3
2	85, 8	52,2	8, 8	38,3	5,3	9,5
3	84,3	52,2	9,9	33, 8	5,1	13,2
4	91,5	79,2	2,1	7	5,7	10, 8
5	63,1	84, 6	34, 9	9,4	0,5	3, 6
6	ND
7	52, 8	85,2	45, 6	13, 9	0,5	0, 6
8	71,1	55	71,1	34,5	5,3	8,7
9	SEE
10	79, 7	47,3	16,3	48	2,1	1,9
92	61, 7	64, 7	27, 4	26,6	5,9	3, 6
91	49, 4	49,2	40, 4	44,3	6,5	3,2
87	52, 4	61,5	36,1	28, 7	7	6,5
21	45, 8	43,3	44,3	47, 6	6,2	3,3
34	24, 4	24, 6	54, 8	59, 6	13,3	9,7
39	48, 7	46,3	30,5	42,1	14,5	8, 8
93	SEE
HIV+	22, 6	26,9	66,8	63,5	6,8	6,7
IgA/D	47, 4	59, 8	41, 9	33,3	5,9	4,1

TABELA 7

IMUNOFENOTIPAGEM DE PACIENTE COM B-CLL E OUTRAS CONDIÇÕES

ANTES E APÓS TRATAMENTO DE SANGUE COM ANTICORPOS MONOCLONAIS

PARA A REGIÃO HOMÓLOGA DA CADEIA-B DO HLA-DR COM ANTICORPOS

Petição 870180128284, de 10/09/2018, pág. 188/202

163/176

MONOCLONAIS PARA CD8 E CD3.

Paciente	CD8 +	CD3 +	CD8+CD3+	CD8-CD3-
	B	A	B	A	B	A	B	A
2	0, 6	1,3	7,5	19,3	4,2	19,3	87, 7	63, 8
3	1,1	1, 4	8,3	20,3	5, 6	18, 4	84, 8	59, 8
4	3,5	2,9	8,3	27	3,9	16,6	84,2	53,1
92	3,5	1,9	27, 6	25,2	18, 4	19	50,3	52, 8
91	4	3,1	18,2	19	14,1	12, 6	63, 6	65,3
87	5,7	3,9	19, 9	23, 6	15, 4	17, 4	58, 8	55
21	4,8	7,4	16,3	17,3	13, 7	13	65,2	62
34	3	3, 6	5,2	6,7	7,6	7,5	84,1	82,3

TABELA 8

IMUNOFENOTIPAGEM DE UM PACIENTE COM B-CLL COM TEMPO APÓS

TRATAMENTO DE SANGUE COM ANTICORPO MONOCLONAL CONJUGADO PE

PARA A REGIÃO HOMÓLOGA DA CADEIA-B DO HLA-DR MEDIDO COM

ANTICORPOS MONOCLONAIS PARA CD45 E CD14.

Tempo	DR+CD45+CD14+	CD45+L	CD45+H
2 h	81, 7	8,2	8,2
6 h	80, 7	8,1	10, 6
24 h	79	1,1	18, 4

TABELA 9

IMUNOFENOTIPAGEM DE UM PACIENTE COM B-CLL COM TEMPO APÓS

TRATAMENTO DE SANGUE COM ANTICORPO MONOCLONAL CONJUGADO PE

PARA A REGIÃO HOMÓLOGA DA CADEIA-B DO HLA-DR MEDIDO COM

Petição 870180128284, de 10/09/2018, pág. 189/202

164/176

ANTICORPOS MONOCLONAIS PARA CD19 E CD3.

Tempo	CD19+DR+r	CD3 +	CD3+DR+	CD19-CD3-DR-
2 h	87, 4	10,1	1, 8	10, 7
6 h	75,5	10, 4	3,1	10, 7
24 h	74	11,7	2,9	11

TABELA 10

IMUNOFENOTIPAGEM DE UM PACIENTE COM B-CLL COM TEMPO APÓS

TRATAMENTO DE SANGUE COM ANTICORPO MONOCLONAL CONJUGADO PE

PARA A REGIÃO HOMÓLOGA DA CADEIA-B DO HLA-DR MEDIDO COM

ANTICORPOS MONOCLONAIS PARA CD4 E CD8.

Tempo	CD8+ DR+r	CD4 +	CD4+&CD8+&CDDR+r	CD4+DR+	CD4-CD8-DR-
2 h	77, 6	6,8	5,4	1,3	8, 8
6 h	75, 8	6,7	6,4	1, 8	9,3
24 h	77	6,4	4,8	1, 9	11

TABELA 11

IMUNOFENOTIPAGEM DE UM PACIENTE COM B-CLL COM TEMPO APÓS

TRATAMENTO DE SANGUE COM ANTICORPO MONOCLONAL CONJUGADO PE

PARA A REGIÃO HOMÓLOGA DA CADEIA-B DO HLA-DR MEDIDO COM

ANTICORPOS MONOCLONAIS PARA CD3 E DR.

Tempo	DR+	CD3 +	CD3+DR+	CD3+DR-
2 h	75	9,5	4,2	10, 9
6 h	74, 8	8, 8	4,8	10, 9
24 h	ND	ND	ND	ND

TABELA 12

IMUNOFENOTIPAGEM DE UM PACIENTE COM B-CLL COM TEMPO APÓS

TRATAMENTO DE SANGUE COM ANTICORPO MONOCLONAL CONJUGADO PE

PARA A REGIÃO HOMÓLOGA DA CADEIA-B DO HLA-DR MEDIDO COM

Petição 870180128284, de 10/09/2018, pág. 190/202

165/176

ANTICORPOS MONOCLONAIS PARA CD16&56 E CD3.

Tempo	CD56+&16+DR+r	CD3 +	CD56+CD16+&CD3+DR+r	CD56-CD16-&CD16- DR-
2 h	82,5	9,5	4,1	3,5
6 h	84,3	7,5	4,1	3,3
24 h	ND	ND	ND	ND

TABELA 13

IMUNOFENOTIPAGEM DE UM PACIENTE COM B-CLL COM TEMPO APÓS

TRATAMENTO DE SANGUE COM ANTICORPO MONOCLONAL CONJUGADO PE

PARA A REGIÃO HOMÓLOGA DA CADEIA-B DO HLA-DR MEDIDO COM

ANTICORPOS MONOCLONAIS PARA CD8 E CD3.

Tempo	CD8+DR+	CD3 +	CD8+CD+3&DR+r	CD8-CD3-DR-
2 h	76,2	6,6	6,7	10, 6
6 h	76,5	6,2	6,2	10,3

TABELA 14

IMUNOFENOTIPAGEM DE PACIENTES COM B-CLL ANTES E APÓS

TRATAMENTO DE SANGUE COM ANTICORPOS MONOCLONAIS PARA A

REGIÃO HOMÓLOGA DA CADEIA-A DO HLA-DR, A REGIÃO HOMÓLOGA DA

CADEIA-B DO HLA-DR, OS DOIS MONOCLONAIS JUNTOS, MONOCLONAL

PARA A REGIÃO HOMÓLOGA DA CADEIA-B MAIS CICLOFOSFOAMIDA E A

REGIÃO HOMÓLOGA DE ANTIGENOS CLASSE I MEDIDOS COM O TEMPO.

	CD19 +	CD3 +	CD19+CD3+	CD19-CD3-
TD	B A AB A Al	B A AB A Al	B A AB A Al	B A AB A Al
	A BC	A BC	A BC	A BC
5/6

Petição 870180128284, de 10/09/2018, pág. 191/202

166/176

2h	86	91	54	40	89	5	4	16	23	5	1	1	3	2	1	6	4	27	33	5
24	N	88	51	60	86	N	4	18	10	4	N	2	1	2	3	N	4	29	28	7
10
2h	77	N	59	N	80	7	N	13	N	7	1	N	1	N	0	14	N	26	N	12
09
24	8	N	N	N	6	32	N	N	N	38	1	N	N	N	1	59	N	N	N	56
43/
BD
6h	0	N	0	0	0	40	N	42	43	49	0	N	1	0	1	58	N	54	54	47
04/
BD
6h	0	N	0	0	0	49	N	41	45	46	0	N	3	1	3	43	N	42	44	41
HIV
+
6h	1	N	0	N	1	10	N	14	N	12	0	N	0	N	0	89	N	86	N	87
IgA
/D
6h	10	N	1	N	12	21	N	25	N	20	2	N	1	N	3	67	N	71	N	68

Β = antes; A = após; AB = após adição ao anticorpo à cadeia beta; AA = após adição de anticorpo à cadeia alfa; ABC = após adição de anticorpo à cadeia alfa ou beta e ciclofosfoamida; Al = após adição de anticorpo à classe I.

Petição 870180128284, de 10/09/2018, pág. 192/202

167/176

TABELA 15

CD8 e CD4

	CD8 +	CD4 +	CD4+CD8+	CD4-CD8-
ID	B	A	AB	A	Al	B	A	AB	A	Al	B	A	AB	A	Al	B	A	AB	A	Al
		A		BC			A		BC			A		BC			A		BC
5/6
2h	3	2	14	10	4	2	2	8	8	3	0	0	3	2	1	95	94	74	79	93
24	N	3	9	4	4	N	3	8	4	3	N	0	2	2	0	N	94	81	90	93
10
2h	3	N	7	N	4	4	N	7	N	3	1	N	2	N	1	91	N	83	N	92
09
24	10	N	N	N	15	21	N	N	N	38	2	N	N	N	2	61	N	N	N	53

TABELA 16

CD3 e DR

DR+

CD3 +

CD3+DR+

CD3-DR-

ID

B

A

AB

A

Al

B

A

AB

A

Al

B

A

AB

A

Al

B

A

AB

A

Al

A

BC

A

BC

A

BC

A

BC

5/6

24

N

90

54

N

87

N

4

12

N

4

N

2

10

N

3

N

5

22

N

5

10

2h

83

N

63

N

81

4

N

8

N

4

N

7

N

4

9

N

23

N

12

09

24

14

N

13

30

N

36

3

N

3

51

N

47

Petição 870180128284, de 10/09/2018, pág. 193/202

168/176

TABELA 17

CD16&56 e CD3

CD56+&16+

CD3 +

CD56+&16+CD3

CD56-

&16

-CD3-

ID

B

A

AB

A

Al

B

A

AB

A

Al

B

A

AB

A

Al

B

A

AB

A Al

A

BC

A

BC

A

BC

A

BC

5/6

2h

N

0

13

N

4

N

5

9

N

5

N

1

3

N

1

N

94

74

N 90

10

2h

0

N

1

N

1

6

N

14

N

6

1

N

2

N

1

92

N

65

N 92

09

24

42

N

41

36

N

38

2

N

2

20

N

N 19

TABELA 18

CD45 e CD14

	CD45+L	CD45+M	CD45+H	CD45+CD14+
ID	B	A	AB	A	Al	B	A	AB	A	Al	B	A	AB	A	Al	B	A	AB	A	Al
		A		BC			A		BC			A		BC			A		BC
5/6
2h	0	0	5	10	0	44	43	50	50	32	55	43	50	31	67	1	1	1	2	0
10
2h	0	N	0	N	0	43	N	54	N	35	54	N	42	N	62	1	N	1	N	0
09
24	2	N	N	N	1	18	N	N	N	16	71	N	N	N	76	7	N	N	N	5
HIV
+
6h	4	N	3	N	6	63	N	61	N	41	23	N	27	N	40	7	N	7	N	7
IgA
/D
6h	2	N	2	N	4	40	N	31	N	44	47	N	60	N	44	6	N	4	N	6

Petição 870180128284, de 10/09/2018, pág. 194/202

169/176

TABELA 19

CD8 e CD28

CD8 +

CD28 +

CD8+CD28+

CD8

-CD28-

ID

B

A

AB

A

Al

B

A

AB

A

Al

B

A

AB

A

Al

B

A

AB

A

Al

A

BC

A

BC

A

BC

A

BC

5/6

2h

N

3

6

N

3

N

1

4

N

2

N

1

4

N

1

N

95

86

N

94

8

2h

4

N

6

N

3

N

5

N

1

N

3

N

92

N

86

N

TABELA 20

CD34 e CD2

Petição 870180128284, de 10/09/2018, pág. 195/202

170/176

TABELA 21

Análise FACs utilizando células derivadas de revestimento buffy humano

		2 h Análise	2 h Análise	2 h Análise	2 h Análise	2 h Análise	2 h Análise
Marcador	Análise	Células	Células	Células	Células	Células	Células
CD	Inicial	nâo	tratadas	nâo	tratadas	nâo	tratadas
		tratadas		tratadas		tratadas
CD45
CD38	54, 9	55, 6	30,1	51, 8	52, 8	13, 0	5,4
CD34	0, 6	0,5	11,5	9,7	8, 0	0,4	25,1
CD10	0,2	0, 0	0,9	1,9	1,8	0, 0	0,2
CD19	13,2	0, 0	15,1	11,1	2,3	8,7	0,7
CD34	1, 8	13,1	0,4	13, 0	9,1	0,4	25, 8
CD3	56,3	62, 6	29, 7	46,9	69,2	79, 8	63, 4
CD117	0,3	0, 6	0, 0	1,3	0, 8	0,2	0,1
CD34	1, 8	0, 6	7,4	6,4	6,0	0,2	24, 6
CD71	1,5	0,4	0, 0	4,8	3,9	0,2	42, 9
GLYCA	5,4	2,3	10,1	3, 6	2, 8	3, 8	1, 8
CD34	1,3	0, 6	14,3	12,5	8,9	0,4	24,3
CD90	18, 4	12, 6	0, 0	9,3	5, 0	0,1	0,3
AC133	0,1	0, 0	2, 0	0,3	0,4	0, 0	0,1
CD34	1,5	0, 6	11,9	10, 8	7,7	0, 0	13,2

Os valores são expressos como a percentagem de células que expressam marcadores

Petição 870180128284, de 10/09/2018, pág. 196/202

171/176

GRÁFICO 1

ALTERAÇÕES IMUNOFENOTÍPICAS DE AMOSTRA DE SANGUE NÃO TRATADA
E TRATADA	DE PACIENTE (2,	3 & 4)	COM	ANTICORPO	MONOCLONAL
PARA A	REGIÃO HOMÓLOGA DA CADEIA-β DE ANTÍGENO HLA- MEDIDO COM O TEMPO	DR
SEM	COM	FL1		FL2	TEMPO
NOTHING001	WITH002	CD45		CD14	2	H
NO001	WE002	CD45		CD14	6	H
001001	002002	CD45		CD14	24	H
NOTHING002	WITH004	CD3		CD19	2	H
NO003	WE004	CD3		CD19	6	H
001003	002004	CD3		CD19	24	H
NOTHING004	WITH005	CD4		CD8	2	H
NO004	WE005	CD4		CD8	6	H
001004	002005	CD4		CD8	24	H
NOTHING005	WITH006	CD3		DR	2	H
NO005	WE006	CD3		DR	6	H
001005	002006	CD3		DR	24	H
NOTHING006	WITH007	CD3		CD56&16	2	H
NO006	WE007	CD3		CD56&16	6	H
001006	002007	CD3		CD56&16	24	H
N003	W004	CD3		CD8	2	H
NO00 7	WE008	CD3		CD8	6	H
001007	002008	CD3		CD8	24	H

Petição 870180128284, de 10/09/2018, pág. 197/202

172/176

GRÁFICO ΙΑ

ALTERAÇÕES IMUNOFENOTÍPICAS DE AMOSTRA DE SANGUE NÃO TRATADA

E TRATADA DE PACIENTE (2, 3 & 4) COM ANTICORPO MONOCLONAL PARA A REGIÃO HOMÓLOGA DA CADEIA-β DE ANTÍGENO HLA-DR CONJUGADO COM PE MEDIDO COM O TEMPO

ID	FL1	FL2	TEMPO
WL003	CD45	CD14	2 H
WEL003	CD45	CD14	6 H
003003	CD45	CD14	24 H
WL005	CD3	CD19	2 H
WEL005	CD3	CD19	6 H
003005	CD3	CD19	24 H
WL006	CD4	CD8	2 H
WEL006	CD4	CD8	6 H
003006	CD4	CD8	24 H
WL007	CD3	DR	2 H
WEL007	CD3	DR	6 H
WL008	CD3	CD56&16	2 H
WEL008	CD3	CD56&16	6 H
WL005	CD3	CD8	2 H
WEL009	CD3	CD8	6 H

Petição 870180128284, de 10/09/2018, pág. 198/202

173/176

GRÁFICO 2

ALTERAÇÕES IMUNOFENOTÍPICAS DE AMOSTRA DE SANGUE NÃO TRATADA

E TRATADA DE PACIENTE (1) COM ANTICORPO MONOCLONAL PARA A REGIÃO HOMÓLOGA DA CADEIA-β DE ANTÍGENO HLA-DR, ESTE ANTICORPO E CICLOFOSFAMIDA, ANTICORPO MONOCLONAL PARA A REGIÃO HOMÓLOGA DA CADEIA-α DE ANTÍGENO HLA-DR E ANTICORPO

MONOCLONAL PARA A REGIÃO HOMÓLOGA DE ANTÍGENO CLASSE I

	MEDIDO COM O TEMPO
COM	SEM	FL1	FL2	TEMPO
	NA001	CD45	CD14	2	H
A2B001: AB		CD45	CD14	2	H
A2A: AA		CD45	CD14	2	H
DNAA001:ABC		CD45	CD14	2	H
A1001: Al		CD45	CD14	2	H
	NC001	CD3	CD19	2	H
C2B001: AB		CD3	CD19	2	H
C2A001: AA		CD3	CD19	2	H
DNAC001: ABC		CD3	CD19	2	H
C1001: Al		CD3	CD19	2	H
A124H001: Al		CD3	CD19	24	H
A2B24H001: AB		CD3	CD19	24	H
A2A24H001: AA		CD3	CD19	24	H
A2BX24H001: ABC		CD3	CD19	24	H
	ND001	CD4	CD8	2	H
D2B001: AB		CD4	CD8	2	H
D2A001: AA		CD4	CD8	2	H
DNAD001: ABC		CD4	CD8	2	H
D1001: Al		CD4	CD8	2	H

Petição 870180128284, de 10/09/2018, pág. 199/202

174/176

D124H001: Al	CD4	CD8	24 H
D2BX24H001: ABC	CD4	CD8	24 H
D2B001: AB	CD4	CD8	24 H
D2A001: AA	CD4	CD8	24 H
E1001: Al	CD3	DR	2 H
E2B001: AB	CD3	DR	2 H
E2A001: AA	CD3	DR	2 H
F1001: Al	CD3	CD56&16	2 H
F2B001: AB	CD3	CD56&16	2 H
F2A001: AA	CD3	CD56&16	2 H
G1001: Al	CD28	CD8	2 H
G2A001: AA	CD28	CD8	2 H
G2B001: AB	CD28	CD8	2 H
H1001: Al	CD7	CD33&13	2 H
H2A001: AA	CD7	CD33&13	2 H
H2B001: AB	CD7	CD33&13	2 H
I2A001: AA	CD21	CD5	2 H
I2B001: AB	CD21	CD5	2 H
J2A001: AA	CD34	CD2	2 H
J2B001: AB	CD34	CD2	2 H
B2A24H001: AA	CD34	CD2	24 H
B2B24H001: AB	CD34	CD2	24 H
Β2ΒΧ24Η001:ABC	CD34	CD2	24 H
K2B001:AB	CD10	CD25	2 H
K2A001: AA	CD10	CD25	2 H

Petição 870180128284, de 10/09/2018, pág. 200/202

175/176

GRÁFICO 3

ALTERAÇÕES IMUNOFENOTÍPICAS DE AMOSTRA DE SANGUE NÃO TRATADA

E TRATADA DE PACIENTE (8) COM ANTICORPO MONOCLONAL PARA A

REGIÃO	HOMÓLOGA	DA CADEIA-β	DE ANTÍGENO	HLA-DR
COM	SEM	FL1	FL2	TEMPO
	NA001	CD45	CD14	2 H
A2001		CD45	CD14	2 H
	CN001	CD3	CD19	2 H
C2001		CD3	CD19	2 H
	DN001	CD4	CD8	2 H
D2001		CD4	CD8	2 H
	EN001	CD3	DR	2 H
E2001		CD3	DR	2 H
	FN001	CD3	CD56&16	2 H
F2001		CD3	CD56&16	2 H
	GN001	CD28	CD8	2 H
G2001		CD28	CD8	2 H
	HN001	CD7	CD5	2 H
H2001		CD7	CD5	2 H
	IN001	CD13	CD20	2 H
12001		CD13	CD20	2 H
	JN001	CD45RA	CD25	2 H
J2001		CD45RA	CD25	2 H
	KN001	CD57	CD23	2 H
K2001		CD57	CD23	2 H

Petição 870180128284, de 10/09/2018, pág. 201/202

176/176

GRÁFICO 4

	ALTERAÇÕES	IMUNOFENOTÍPICAS DE AMOSTRA DE SANGUE NÃO TRATADA
5	E TRATADA DE PACIENTE (10) COM ANTICORPO MONOCLONAL PARA A REGIÃO HOMÓLOGA DA CADEIA-β DE ANTÍGENO HLA-DR E ANTICORPO MONOCLONAL PARA A REGIÃO HOMÓLOGA DE ANTIGENOS CLASSE I
	COM		SEM	FL1	FL2	TEMPO
			CLL0001	CD45	CD14		2	H
	CLL1001			CD45	CD14		2	H
	CLL2001			CD45	CD14		2	H
			CLL0003	CD3	CD19		2	H
				CD3	CD19		2	H
	CLL1003			CD3	CD19		2	H
	CLL2003			CD3	CD19		2	H
			CLL0004	CD4	CD8		2	H
	CLL1004			CD4	CD8		2	H
	CLL2004			CD4	CD8		2	H
			CLL005	CD3	DR		2	H
	CLL1005			CD3	DR		2	H
	CLL2005			CD3	DR		2	H
			CLL0006	CD3	CD56&16		2	H
	CLL1006			CD3	CD56&16		2	H
	CLL2006			CD3	CD56&16		2	H

Petição 870180128284, de 10/09/2018, pág. 202/202

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Dispositivo para formação e/ou aumento do número relativo de células não diferenciadas em uma população de células incluindo células comprometidas caracterizado pelo fato de compreender (i) uma câmara, (ii) um recipiente estocador de entrada compreendendo uma população de células incluindo células comprometidas, (iii) meios para introdução na dita câmara de uma população de células incluindo células comprometidas, (iv) meios para transferência contínua de células entre o recipiente estocador de entrada e a câmara, (v) meios para introdução na dita câmara de um agente selecionado do grupo consistindo em (a) um anticorpo que se liga a antígenos do

MHC, (b) eritropoietina e (c)GM-CSF, ( :vi) meios de transferência adicionais para transferir um volume do agente para a câmara, onde o meio de transferência

adicional compreende um volume do agente, (vii) meios para incubação das ditas células comprometidas na presença do referido agente, (viii) meios para misturar o agente e a população de células na câmara e (ix) meios para remover da câmara dentro de um recipiente estocador de saída uma amostra de células compreendendo células não diferenciadas, onde o meio de transferência adicional e o recipiente estocador de saída são descartáveis, (x) meios de medição para medição de volume da dita população de células; (xi)
2/6 meios para condução de contagens de células e para medição de concentração de células da dita população de células; (xii) meios calculadores para cálculo de volume de agente a ser adicionado à câmara; (xiii) meios de controle de dióxido de carbono para controlar a concentração de dióxido de carbono na dita câmara; (xiv) meios de controle de temperatura para controle de temperatura na dita câmara; (xv) meios de cronometragem para cronometrar o período de incubação; (xvi) meios mostradores para mostrar ao usuário o período de tempo restante do período de incubação; (xvii) meios de alarme para alertar o usuário de término do período de incubação; (xviii) meios de colheita para colheita de células da câmara; (xix) meios de remoção para remover uma amostra de células, compreendendo células não diferenciadas, a partir da câmara em um recipiente de estocagem; (xx) meios de selagem para selar um recipiente de estocagem compreendendo uma população de células compreendendo células não diferenciadas; (xxi) meios de comunicação para o dispositivo comunicar remotamente ordens e/ou confirmar operações que estejam sendo ou foram feitas corretamente, onde o meio de transferência é configurável para transferir quantidade pré-determinada da população de células do recipiente estocador para a câmara; e onde o meio de introdução do agente na câmara compreende o meio de
3/6 transferência adicional para transferir um volume do agente à câmara e/ou transferir o volume calculado à câmara.

2. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o meio para condução de contagens de células é um contador de relha.

3. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o meio para condução de contagens de células é um citômetro.
4. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o meio de transferência é configurável para transferir um volume do agente para a câmara e compreende uma seringa controlada por um motor.
5. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o meio de transferência é configurável para transferir um volume calculado do agente para a câmara e compreende uma seringa controlada por um motor.
6. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os meios de colheita colhem as células não diferenciadas da câmara.
7. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o meio de comunicação compreende um microprocessador para coletar e/ou estocar dados pertencentes a(os) agente(s) aumentando o número relativo de células não diferenciadas em uma população e/ou

4/6 ordenando um suprimento das mesmas e/ou operações de modem para transmitir tais dados.
8. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as células comprometidas são células não cancerígenas.
9. Dispositivo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que as células comprometidas são células diferenciadas.
10. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as células comprometidas são selecionadas de células CFC-T, células CFC-B, células CFCeosina, células CFC-Bas, células CFC-GM, células CFC-MEG, células CFC-E, células T e células B.
11. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as células não diferenciadas são células tronco pluripotentes.
12. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as células não diferenciadas são compreendidas por uma ou mais das seguintes designações de marcadores de superfície de célula: CD34 ⁺ , HLA-DR-, CD38-, CD117, AC133, CD90 e/ou CD451ow.
13. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as células não diferenciadas são células MHC classe I⁺ e/ou MHC classe II⁺.

5/6
14. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o receptor é um antígeno MHC classe I ou um antígeno MHC classe II.
15. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o antígeno classe I é um receptor HLA-A, um receptor HLA-B, um receptor HLA-C, um receptor HLA-E, um receptor HLA-F ou um receptor HLA-G e o dito antígeno classe II é um receptor HLA-DM, um receptor HLA-DP, um receptor HLA-DQ e/ou receptor HLA-DR.
16. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o receptor é um receptor HLA-DR.
17. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o receptor compreende uma cadeia-β tendo regiões homólogas.
18. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o receptor compreende pelo menos as regiões homólogas da cadeia-β de HLA-DR.
19. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente é um anticorpo monoclonal para o antígeno MHC.
20. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é selecionado do grupo consistindo em anticorpo monoclonal CR3/43 e o anticorpo monoclonal TAL1B5.

6/6
21. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente modula expressão de gene MHC.
22. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o agente modula expressão de MHC classe I⁺ e/ou MHC classe II⁺.
23. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a população de células incluindo células comprometidas é uma amostra de uma fração de sangue compreendendo leucócitos e plaquetas ou é de uma amostra de uma fração de sangue compreendendo leucócitos e plaquetas.