JPS63196854A - リンパ球亜群の測定方法およびその装置 - Google Patents
リンパ球亜群の測定方法およびその装置Info
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- JPS63196854A JPS63196854A JP62028945A JP2894587A JPS63196854A JP S63196854 A JPS63196854 A JP S63196854A JP 62028945 A JP62028945 A JP 62028945A JP 2894587 A JP2894587 A JP 2894587A JP S63196854 A JPS63196854 A JP S63196854A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は：リンパ球亜群の測定及びその定量技術に関す
るものであり、さらに詳しくは、螢光色素で標識され、
す／パ球亜群を認識するモノクローナル抗体を結合され
た血球をフローサイトメトリー法の原理に基づき測定す
る方法及び装置に係わる。
るものであり、さらに詳しくは、螢光色素で標識され、
す／パ球亜群を認識するモノクローナル抗体を結合され
た血球をフローサイトメトリー法の原理に基づき測定す
る方法及び装置に係わる。
（従来の技術）
健常人の末梢血中の白血球には、リンパ球、単球、顆粒
球（好中球、好酸球、好塩基球）の種類があり、その中
のリンパ球はＢ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｋ細胞などの
複数の亜群から構成されている。このリンパ球亜群の中
のＴ細胞は、さらにヘルパー、サプレッサー、キ、Ｆ−
Ｔ細胞等に分類される。これらリンパ球の各亜群や各種
構成細胞の相対数を測定することは、免疫不全症の診断
や各種疾患における免疫機能の状態を知る上において有
用である。また病気の治療経過の観察にも応用される。
球（好中球、好酸球、好塩基球）の種類があり、その中
のリンパ球はＢ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｋ細胞などの
複数の亜群から構成されている。このリンパ球亜群の中
のＴ細胞は、さらにヘルパー、サプレッサー、キ、Ｆ−
Ｔ細胞等に分類される。これらリンパ球の各亜群や各種
構成細胞の相対数を測定することは、免疫不全症の診断
や各種疾患における免疫機能の状態を知る上において有
用である。また病気の治療経過の観察にも応用される。
リンパ球の各亜群は、その亜群に所属する細胞の細胞膜
表面上の抗原決定基により区別される。
表面上の抗原決定基により区別される。
これらの抗原決定基はそれぞれその抗原決定基に特異的
に結合する特定のモノクローナル抗体により識別できる
。例えば、Ｔ細胞を認識するモノクローナル抗体には、
ＣＤ２（ＯＫＴＩＩ、Ｌ＃譬−５）、ＣＤ３ＣＯＫＴ３
、Ｌｇｓ−４）、Ｃｎ５ （。
に結合する特定のモノクローナル抗体により識別できる
。例えば、Ｔ細胞を認識するモノクローナル抗体には、
ＣＤ２（ＯＫＴＩＩ、Ｌ＃譬−５）、ＣＤ３ＣＯＫＴ３
、Ｌｇｓ−４）、Ｃｎ５ （。
ＫＴｌ、Ｌｇｓ−１） などがあり、Ｂ細胞を認識す
るモノクローナル抗体には、ＣＤ２０（Ｂ１）がある。
るモノクローナル抗体には、ＣＤ２０（Ｂ１）がある。
また、ヘルパーＴ細胞を認識するモノクローナル抗体に
は、ＣＤ４（ＯＫＴ４、Ｌｌげ３）がある。
は、ＣＤ４（ＯＫＴ４、Ｌｌげ３）がある。
これらモノクローナル抗体に螢光色素をつけて３き（螢
光標識する）、これな血球と反応させ螢光色素による螢
光を調べれば、特定の亜群に属するリンパ球を検出でき
る。
光標識する）、これな血球と反応させ螢光色素による螢
光を調べれば、特定の亜群に属するリンパ球を検出でき
る。
この螢光標識されたモノクローナル抗体を使用して、フ
ローサイトメトリー法の原理でリンパ球亜群を同定及び
定量する方法としては、たとえば特開昭５６−１６８７
２号公報に記載された方法がある。この方法では、リン
パ球を同定するために％２チャンネルの信号を用いて二
次元の信号強度分布を描き、リンパ球の存在する二次元
の特定領域を判断し囲み込むという信号処理操作を行っ
ている。
ローサイトメトリー法の原理でリンパ球亜群を同定及び
定量する方法としては、たとえば特開昭５６−１６８７
２号公報に記載された方法がある。この方法では、リン
パ球を同定するために％２チャンネルの信号を用いて二
次元の信号強度分布を描き、リンパ球の存在する二次元
の特定領域を判断し囲み込むという信号処理操作を行っ
ている。
（発明が解決しようとする問題点）
上記方法では、リンパ球の存在する二次元の信号強度分
布の中の特定領域を自動的に判断し、囲み込むという信
号処理操作が非常に複雑であり、リンパ球亜群を自動的
に同定し定量する装置には適さない。
布の中の特定領域を自動的に判断し、囲み込むという信
号処理操作が非常に複雑であり、リンパ球亜群を自動的
に同定し定量する装置には適さない。
ここで、一種類の信号たとえば側方散乱光のみを使用し
て、その強度分布からリンパ球を識別するようにすれば
装置の構成や手順は非常に蘭単になるが、リンパ球と他
の白血球や赤血球のゴーストとの分離が不光分となる。
て、その強度分布からリンパ球を識別するようにすれば
装置の構成や手順は非常に蘭単になるが、リンパ球と他
の白血球や赤血球のゴーストとの分離が不光分となる。
噂ｒ・−慇ＩＪ昭ｇ ｎ −’Ｊ Ａ Ｑ
Ａ ｎ ８／；Ｓ１４ｗ１寸 血球を光で照射した
とき検出される前方散乱光と側方散乱光の測定値を結合
して一次元のパラメータに変換することにより、白血球
中のリンパ球を区別する方法が記載されている。しかし
、この方法では一次元のパラメータに変換するために複
雑で大規模なハードウェアまたはソフトウェアが必要と
なり、また、血球一つずつについて上記変換を行なう必
要があり、一つの血液試料の測定に多大な計算時間を要
する。このため、やはり自動化装置に適用するのには実
用的な方法ではない。
Ａ ｎ ８／；Ｓ１４ｗ１寸 血球を光で照射した
とき検出される前方散乱光と側方散乱光の測定値を結合
して一次元のパラメータに変換することにより、白血球
中のリンパ球を区別する方法が記載されている。しかし
、この方法では一次元のパラメータに変換するために複
雑で大規模なハードウェアまたはソフトウェアが必要と
なり、また、血球一つずつについて上記変換を行なう必
要があり、一つの血液試料の測定に多大な計算時間を要
する。このため、やはり自動化装置に適用するのには実
用的な方法ではない。
本発明は、上記従来の問題点を解決するためになされた
もので、二方向の散乱光をただ一つの検出器で検出し、
一種類の信号を処理するだけで、リンパ球を識別するこ
とを可能とし、その結果、す／パ球亜群の測定の自動化
を多品にするものである。また、リンパ球亜群の同定及
び定量を、試料を供給した後すべて自動的に行なうため
の方法及び装置を提供するものである。
もので、二方向の散乱光をただ一つの検出器で検出し、
一種類の信号を処理するだけで、リンパ球を識別するこ
とを可能とし、その結果、す／パ球亜群の測定の自動化
を多品にするものである。また、リンパ球亜群の同定及
び定量を、試料を供給した後すべて自動的に行なうため
の方法及び装置を提供するものである。
螢光標識されたモノクローナル抗体と血液試料とを混合
し反応させる段階、得られた試料をフロ−サイトメータ
ーの検出部に送給する段階、検出部において試料にレー
ザー光を照射する段階、試料中の各細胞から発せられる
試料の流れの方向とレーザー光の光軸とにほぼ平行な第
１の散乱光及び各細胞から発せられるレーザー光の光軸
と試料の流れの方向″とに垂直な方向の第２の散乱光を
一個の光検出器により検出する段階、試料中の各細胞か
ら発せられるレーザー光の光軸と試料の流れの方向とに
垂直な方向の螢光を検出する段階、検出された第１及び
第２の散乱光の強度信号分布からリンパ球を識別する段
階、リンパ球に対応して検出された螢光の強度信号分布
からリンパ球亜群を同定する段階、上記散乱光及び上記
螢光の強度信号分布を用いてリンパ球亜群の陽性率を算
定する段階によって構成されるリンパ球亜群の測定方法
を特色とする。
し反応させる段階、得られた試料をフロ−サイトメータ
ーの検出部に送給する段階、検出部において試料にレー
ザー光を照射する段階、試料中の各細胞から発せられる
試料の流れの方向とレーザー光の光軸とにほぼ平行な第
１の散乱光及び各細胞から発せられるレーザー光の光軸
と試料の流れの方向″とに垂直な方向の第２の散乱光を
一個の光検出器により検出する段階、試料中の各細胞か
ら発せられるレーザー光の光軸と試料の流れの方向とに
垂直な方向の螢光を検出する段階、検出された第１及び
第２の散乱光の強度信号分布からリンパ球を識別する段
階、リンパ球に対応して検出された螢光の強度信号分布
からリンパ球亜群を同定する段階、上記散乱光及び上記
螢光の強度信号分布を用いてリンパ球亜群の陽性率を算
定する段階によって構成されるリンパ球亜群の測定方法
を特色とする。
また、上記の測定方法を実施するための装置であって、
螢光標識されたモノクローナル抗体と血液試料とを混合
し反応させる０拗染色装置と、得られた試料を受入れる
フローサイトメーターの検出部と、検出部をレーザー光
で照射するためのレーザー光源と、レーザー光の光軸に
ほぼ平行な第１の散乱光及び光軸に垂直な方向の第２の
散乱光を検出するだめの１個の散乱光検出器と、光軸に
垂直な方向の螢光を検出するための１個の螢光検出器と
、散乱光検出器及び螢光検出器の検出信号を受入れて処
理するデータ処理装置と、データ処理装置によって同定
されたリンパ球亜群のデータを表示する表示装置と、に
よって構成されたことを特徴とするリンパ群亜群の測定
装置を特色とする。
螢光標識されたモノクローナル抗体と血液試料とを混合
し反応させる０拗染色装置と、得られた試料を受入れる
フローサイトメーターの検出部と、検出部をレーザー光
で照射するためのレーザー光源と、レーザー光の光軸に
ほぼ平行な第１の散乱光及び光軸に垂直な方向の第２の
散乱光を検出するだめの１個の散乱光検出器と、光軸に
垂直な方向の螢光を検出するための１個の螢光検出器と
、散乱光検出器及び螢光検出器の検出信号を受入れて処
理するデータ処理装置と、データ処理装置によって同定
されたリンパ球亜群のデータを表示する表示装置と、に
よって構成されたことを特徴とするリンパ群亜群の測定
装置を特色とする。
この装置の上記自動染色装置部が、複数個の混合反応部
を備えたインキュベート部と、複数種類のモノクローナ
ル抗体を別個に収納してなる抗体格納部とを有するリン
パ球亜群の測定装置であることも特色となっている。
を備えたインキュベート部と、複数種類のモノクローナ
ル抗体を別個に収納してなる抗体格納部とを有するリン
パ球亜群の測定装置であることも特色となっている。
（実施例）
以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、
本発明は何らそれらに限定されるものではない。
本発明は何らそれらに限定されるものではない。
本実施例に使用される試料は、抗凝固剤の入った全血ま
たは単核球分離されたサンプルまたはリンパ球のみ分離
されたサンプルである。単核球分離の方法には、例えば
、フィコール・ハイパツク（Ｆｉｃｏｌ ｌ”Ｈｙｐａ
ｑｓａ）法がある。この方法は、バフィーコートにＰＢ
Ｓ （リン酸緩衝液）を加え、フィコール・ハイパツク
液に重層し遠心分離後、中間の白い帯状のリングの層を
取り出すという方法であり、リンパ球と単球を分取する
ことができる。リンパ球のみの試料を得るには、この単
核球分離試料をファイバーカラムに通し、単球をファイ
バーに吸着させれば良い。
たは単核球分離されたサンプルまたはリンパ球のみ分離
されたサンプルである。単核球分離の方法には、例えば
、フィコール・ハイパツク（Ｆｉｃｏｌ ｌ”Ｈｙｐａ
ｑｓａ）法がある。この方法は、バフィーコートにＰＢ
Ｓ （リン酸緩衝液）を加え、フィコール・ハイパツク
液に重層し遠心分離後、中間の白い帯状のリングの層を
取り出すという方法であり、リンパ球と単球を分取する
ことができる。リンパ球のみの試料を得るには、この単
核球分離試料をファイバーカラムに通し、単球をファイ
バーに吸着させれば良い。
試料の染色及び溶血処理は、第１図に示す自動染色装置
部１０で行なわれる。
部１０で行なわれる。
まず、シリンジ１２が所定位置まで下降し、ピペット１
４によって試料容器１６から血液試料が吸引される。次
に、ピペット１４は、インキュベート部１８のＡの位置
（Ａ部）まで回転移動し、続いて、シリンジ１２が所定
の位置まで上昇し、一定量の試料がＡ部に吐出される。
４によって試料容器１６から血液試料が吸引される。次
に、ピペット１４は、インキュベート部１８のＡの位置
（Ａ部）まで回転移動し、続いて、シリンジ１２が所定
の位置まで上昇し、一定量の試料がＡ部に吐出される。
このとき同時に、リン酸緩衝液タンク２０から供給され
る配管４２に満たされているＰＲＥも吐出され、これら
はＡ部で撹拌される。
る配管４２に満たされているＰＲＥも吐出され、これら
はＡ部で撹拌される。
ピペット１４は試料の吐出が終ると、洗浄槽２２まで回
転移動し、ピペットの内部及び外部が洗浄される。その
後、ピペット１４は第１図に示される位置に戻り、次の
試料の吸引に備える。
転移動し、ピペットの内部及び外部が洗浄される。その
後、ピペット１４は第１図に示される位置に戻り、次の
試料の吸引に備える。
モノクローナル抗体格納部２４は、数種類の特定リンパ
球亜群を認識する螢光標識′されたモノクローナル抗体
を格納している。モノクローナル抗体格納部２４は、回
転することにより、格納されたモノクローナル抗体のう
ちの１つを、Ｅの位置に移動させる。ピペット２６はＥ
の位置に下降し、続いて、シリンジ２８が所定の位置ま
で下降することによってモノクローナル抗体が一定貴吸
引される。次に、ピペット２６は、インキュベート部１
８のＡの位置まで回転移動し、続いて、シリンジ２８が
所定の位置まで上昇し、一定量のモノクローナル抗体が
配管４４に満たされていたＰＥＳと一緒に吐出される。
球亜群を認識する螢光標識′されたモノクローナル抗体
を格納している。モノクローナル抗体格納部２４は、回
転することにより、格納されたモノクローナル抗体のう
ちの１つを、Ｅの位置に移動させる。ピペット２６はＥ
の位置に下降し、続いて、シリンジ２８が所定の位置ま
で下降することによってモノクローナル抗体が一定貴吸
引される。次に、ピペット２６は、インキュベート部１
８のＡの位置まで回転移動し、続いて、シリンジ２８が
所定の位置まで上昇し、一定量のモノクローナル抗体が
配管４４に満たされていたＰＥＳと一緒に吐出される。
Ａ部の試料は再度撹拌される。吐出を終ると、ピペット
２６は洗浄槽３ｏで洗浄され、第１図に示される位置に
戻る。
２６は洗浄槽３ｏで洗浄され、第１図に示される位置に
戻る。
上記の後、Ａ部の試料は、モノクローナル抗体と、それ
が認識するり／パ球亜群特足抗原との間の抗原抗体反応
が充分進行するまでインキュベートされる。
が認識するり／パ球亜群特足抗原との間の抗原抗体反応
が充分進行するまでインキュベートされる。
上記イン芥ユベーションが終了すると、インキュベート
部１８は回転し、Ａの位置にあった試料はＢの位置に移
動する。次に、溶血剤タンク３２から供給される溶血剤
は吐出管３４から吐出される。この後、Ｂ部の試料は再
度撹拌される。これで、試料中の赤血球は溶血される。
部１８は回転し、Ａの位置にあった試料はＢの位置に移
動する。次に、溶血剤タンク３２から供給される溶血剤
は吐出管３４から吐出される。この後、Ｂ部の試料は再
度撹拌される。これで、試料中の赤血球は溶血される。
一定時間経過後、インキュベート部１８が回転し、Ｂの
位置にあった試料はＣの位置に移動する。
位置にあった試料はＣの位置に移動する。
続いて、０部ヘビペット３６が下降し、試料が吸引され
る。この試料は、検出部ＣＦＣＭ）へ送られる。吸引が
終ると、ピペット３６は上昇し、洗浄槽３８で洗浄され
、第１図に示される位置に戻る。
る。この試料は、検出部ＣＦＣＭ）へ送られる。吸引が
終ると、ピペット３６は上昇し、洗浄槽３８で洗浄され
、第１図に示される位置に戻る。
以上の工程で洗浄等に使われた後の廃液は、廃液タンク
４０に集められる。
４０に集められる。
上記各処理は、定められた時間スケジュールに従って順
次行なわれる。次々に異なる試料を測定するときは、一
つの試料の一連の処理が全て終了してから次の試料を測
定しても、もちろん良いが、装置の処理能力を向上させ
るため、一つの試料の処理の途中セ次の試料の吸引を開
始しても良い。
次行なわれる。次々に異なる試料を測定するときは、一
つの試料の一連の処理が全て終了してから次の試料を測
定しても、もちろん良いが、装置の処理能力を向上させ
るため、一つの試料の処理の途中セ次の試料の吸引を開
始しても良い。
たとえばインキュベート部１８のＡ部でインキュベート
中に、インキュベート部ＩＦ３を一段階回転させ、図の
Ｄ部をＡの位置に移動させた後、次の試料をピペット１
４で吸引しＤ部（このときは第１図のＡの位置にある）
に吐出することは好ましい例である。このように、複数
の試料を一定の時間間隔で同時併行的にインキュベート
して行くことが出来る。
中に、インキュベート部ＩＦ３を一段階回転させ、図の
Ｄ部をＡの位置に移動させた後、次の試料をピペット１
４で吸引しＤ部（このときは第１図のＡの位置にある）
に吐出することは好ましい例である。このように、複数
の試料を一定の時間間隔で同時併行的にインキュベート
して行くことが出来る。
次に、本装置の検出部について第２図に基づいて説明す
る。
る。
アルゴンイオンレーザ−４６から発せられた光は、コン
デンサーレンズ４８によって集束され、自動染色装置部
１０から供給されフローセル５０内を流れる試料液に照
射される。試料液はリン酸緩衝液（ＰＲＥ）のシース液
に包まれた形でフローセル５０内を細い流れとなって流
れる。試料液中の細胞は１個ずつレーザー光の照射され
ている検出領域を通過する。
デンサーレンズ４８によって集束され、自動染色装置部
１０から供給されフローセル５０内を流れる試料液に照
射される。試料液はリン酸緩衝液（ＰＲＥ）のシース液
に包まれた形でフローセル５０内を細い流れとなって流
れる。試料液中の細胞は１個ずつレーザー光の照射され
ている検出領域を通過する。
細胞が検出領域を通過する際に発生する散乱光のうち、
照射光に平行な方向から一定角度範囲内ノ元ハ、コレク
ターレンズ５２によって集光される。レーザー光源から
の直接光は、ビームストッパ５４により止められるので
、コレクタレンズ５２には入射しない。コレクターレン
ズ５２によって集められた散乱光は、光量調節器５６を
経た後、光ファイバー５８に導ひかれて散乱光検出器６
０に入る。
照射光に平行な方向から一定角度範囲内ノ元ハ、コレク
ターレンズ５２によって集光される。レーザー光源から
の直接光は、ビームストッパ５４により止められるので
、コレクタレンズ５２には入射しない。コレクターレン
ズ５２によって集められた散乱光は、光量調節器５６を
経た後、光ファイバー５８に導ひかれて散乱光検出器６
０に入る。
細胞がフローサイトメータの検出領域を通過する際に発
生する散乱光のうち、上記レーザー光の光軸と上記試料
の流れの方向に垂直な方向の散乱光ハ、コレクターレン
ズ６２によって一定角度範囲内のものが集められる。コ
レクターレンズ６２によって集められた散乱光は、ピン
ホール６４を通り、ダイクロイックミラー６６により反
射され、フィルター６８を通り、光量調節器７０を経て
、散乱光検出器６０に入る。ダイクロイックミラー６６
とフィルター６８は、散乱光のみを選択して散乱光検出
器６０へ入射させる為のものである。
生する散乱光のうち、上記レーザー光の光軸と上記試料
の流れの方向に垂直な方向の散乱光ハ、コレクターレン
ズ６２によって一定角度範囲内のものが集められる。コ
レクターレンズ６２によって集められた散乱光は、ピン
ホール６４を通り、ダイクロイックミラー６６により反
射され、フィルター６８を通り、光量調節器７０を経て
、散乱光検出器６０に入る。ダイクロイックミラー６６
とフィルター６８は、散乱光のみを選択して散乱光検出
器６０へ入射させる為のものである。
以上、２つの方向の散乱光は、光量調節器５６．７０に
よつぞ、その両方、あるいは、一方のみが光量を調節さ
れ、いずれも、一つの散乱光検出器６０に入る。
よつぞ、その両方、あるいは、一方のみが光量を調節さ
れ、いずれも、一つの散乱光検出器６０に入る。
細胞がフローサイトメータの検出領域を通過するときに
、モノクローナル抗体につけられた螢光色素から発せら
れる螢光のうち、照射元方向および試料の流れの方向に
垂直な方向のものも前記散乱光ト同じくコレクターレン
ズ６２によって集め −られる。
、モノクローナル抗体につけられた螢光色素から発せら
れる螢光のうち、照射元方向および試料の流れの方向に
垂直な方向のものも前記散乱光ト同じくコレクターレン
ズ６２によって集め −られる。
集められた螢光は、全反射ミラー７２で反射され、フィ
ルター７４を通過して特定波長域の螢光のみがとり出さ
れた後、螢光検出器７６に入射される。
ルター７４を通過して特定波長域の螢光のみがとり出さ
れた後、螢光検出器７６に入射される。
なお、第２図中の矢印は、光の進行方向を示す。
散乱光検出器６０および螢光検出器７６は具体的に光電
子増倍管であり、入射された光信号はいずれもこれによ
って電気パルス信号に変換される。
子増倍管であり、入射された光信号はいずれもこれによ
って電気パルス信号に変換される。
電気パルス信号は、増幅器７８．８０によって増幅され
た後、Ａ／Ｄ変換器８２．８４に送られ、信号の波高値
がデジタルデータに変換される。
た後、Ａ／Ｄ変換器８２．８４に送られ、信号の波高値
がデジタルデータに変換される。
データ処理′装置８６は、Ａ ／ Ｄ変換器８２から送
られてくる散乱光データの値が、あらかじめ設定された
ノイズレベルの値よりも大きいとき、検出領域を細胞が
通過したものと判断し、Ａ／Ｄ変換器８２からのデータ
を散乱光強度記憶装置８８に、また、Ａ／’Ｄ変換器８
４からのデータを螢光強度記憶装置９０に格納する。こ
のとき、記憶装置８８．９０には、同時に格納された散
乱光と螢光のデータが後で対応できるように記憶されて
いる。
られてくる散乱光データの値が、あらかじめ設定された
ノイズレベルの値よりも大きいとき、検出領域を細胞が
通過したものと判断し、Ａ／Ｄ変換器８２からのデータ
を散乱光強度記憶装置８８に、また、Ａ／’Ｄ変換器８
４からのデータを螢光強度記憶装置９０に格納する。こ
のとき、記憶装置８８．９０には、同時に格納された散
乱光と螢光のデータが後で対応できるように記憶されて
いる。
データ処理装置８６は、自動染色装置部１０から送られ
てくる一つずつの試料について、一定時間、上記の記憶
処理を行う。この結果、通常、一つの試料について数百
ないし数万個の細胞のデータが記憶される。
てくる一つずつの試料について、一定時間、上記の記憶
処理を行う。この結果、通常、一つの試料について数百
ないし数万個の細胞のデータが記憶される。
一つの試料の記憶処理が終ると、データ処理装置８６は
、散乱光強度記憶装置８８に記憶されたデータについて
第３図に示すような散乱光強度分布のヒストグラムを算
出する。第３図において、領域■は溶血した赤血球のゴ
ーストであり、領域■はリンパ球であり、領域■は単球
であり、領域■は顆粒球である。このことは、各領域に
属する細胞の数と、電気抵抗式の血球計数装置により各
細胞数を計数した結果とを比較することにより確認され
た。また、リンパ球のみを分取した試料を測定すると領
域Ｈのみにヒストグラムが得られ、リンパ球と単球のみ
を分取した試料を測定すると領域■と■のみにヒストグ
ラムが得られることからも裏付けられた。
、散乱光強度記憶装置８８に記憶されたデータについて
第３図に示すような散乱光強度分布のヒストグラムを算
出する。第３図において、領域■は溶血した赤血球のゴ
ーストであり、領域■はリンパ球であり、領域■は単球
であり、領域■は顆粒球である。このことは、各領域に
属する細胞の数と、電気抵抗式の血球計数装置により各
細胞数を計数した結果とを比較することにより確認され
た。また、リンパ球のみを分取した試料を測定すると領
域Ｈのみにヒストグラムが得られ、リンパ球と単球のみ
を分取した試料を測定すると領域■と■のみにヒストグ
ラムが得られることからも裏付けられた。
データ処理装置８６は、第３図の散乱光強度分布ヒスト
グラムから、リンパ球領域（領域…）を自動的に設定し
、この領域に属する散乱光データと同時に記憶された、
対応する螢光データを螢光強度記憶装置９０からとり出
し、第４図に示すような強度分布を算出し、表示装置９
２に表示する。
グラムから、リンパ球領域（領域…）を自動的に設定し
、この領域に属する散乱光データと同時に記憶された、
対応する螢光データを螢光強度記憶装置９０からとり出
し、第４図に示すような強度分布を算出し、表示装置９
２に表示する。
さらに、データ処理装置８６は、第４図のヒストグラム
において、強度分布の谷を検出し、この谷の位置よりも
螢光強度の強い側のヒストグラムに含まれる検出細胞数
を算出し、全リンパ球数に対する比率を求め、陽性率と
して表示装置９２に表示する。
において、強度分布の谷を検出し、この谷の位置よりも
螢光強度の強い側のヒストグラムに含まれる検出細胞数
を算出し、全リンパ球数に対する比率を求め、陽性率と
して表示装置９２に表示する。
以下に、本実施例の装置で測定したときの測定例を示す
。
。
前述の第３図、第４図は、全血を試料としたときの測定
例であり、第３図は散乱光の、第４図は螢光のヒストグ
ラムを示す。この場合の測定対象であるリンパ球亜群の
陽性率は６４，５％であった。
例であり、第３図は散乱光の、第４図は螢光のヒストグ
ラムを示す。この場合の測定対象であるリンパ球亜群の
陽性率は６４，５％であった。
第５図、第６図も全血を試料としたときの別の検体の測
定例であり、第５図は散乱光、第６図は螢光のヒストグ
ラムを示す。第６図は、第５図の下線部Ｘに含まれる細
胞（リンパ球）についての螢光強度分布を示したもので
あり、第６図の下線部Ｙに含まれる測定対象であるリン
パ球亜群の陽性率は４０．２％であった。
定例であり、第５図は散乱光、第６図は螢光のヒストグ
ラムを示す。第６図は、第５図の下線部Ｘに含まれる細
胞（リンパ球）についての螢光強度分布を示したもので
あり、第６図の下線部Ｙに含まれる測定対象であるリン
パ球亜群の陽性率は４０．２％であった。
第７図、第８図は、単核球分離したものを試料とし、第
９図、第１０図は、リンパ球のみ分離したものを試料と
した場合の測定結果であり、第７図と第９図は散乱光の
ヒストグラムを、第８図と第１０図はリンパ球の螢光の
ヒストグラムを示す。
９図、第１０図は、リンパ球のみ分離したものを試料と
した場合の測定結果であり、第７図と第９図は散乱光の
ヒストグラムを、第８図と第１０図はリンパ球の螢光の
ヒストグラムを示す。
な３、本実施例では、一つの試料に一種類のモノクロー
ナル抗体を添加する場合を示したが、一つの試料に対し
て複数のモノクローナル抗体を添加することは、自動染
色装置部１０の処理手順を若干変更することにより容易
に行い得ることである。この場合、畏光強度信号を取り
扱うチャンネルを複数にし、データ処理装置８６の処理
手順を一部変更すれば、複数の螢光強度信号を取り扱う
ことが出来る様になり、複数の測定対象であるリンパ球
亜群の陽性率を測定することができる。
ナル抗体を添加する場合を示したが、一つの試料に対し
て複数のモノクローナル抗体を添加することは、自動染
色装置部１０の処理手順を若干変更することにより容易
に行い得ることである。この場合、畏光強度信号を取り
扱うチャンネルを複数にし、データ処理装置８６の処理
手順を一部変更すれば、複数の螢光強度信号を取り扱う
ことが出来る様になり、複数の測定対象であるリンパ球
亜群の陽性率を測定することができる。
（発明の効果）
この発明によれば、以下に述べる様な効果が得られる。
（１）二方向の散乱光が、ただ一つの検出器で検出され
、一種類の信号を処理するだけで、リンパ球を識別する
ことができるので、測定装置の構成が簡単になり、また
、処理速度が格段に向上する。
、一種類の信号を処理するだけで、リンパ球を識別する
ことができるので、測定装置の構成が簡単になり、また
、処理速度が格段に向上する。
このため、装置の全自動化が容易となる。
（２）複数の試料を一定の時間間隔で同時併行的にイン
キュベートとして行くことも可能となり、処理速度が一
段と向上する。
キュベートとして行くことも可能となり、処理速度が一
段と向上する。
（３） 一つの試料に対して複数のモノクローナル抗
体を添加し、混合、反応させることが容易に出来る様に
なり、複数のリンパ球測定対象亜群の陽性率を一度に簡
単に測定することができる。
体を添加し、混合、反応させることが容易に出来る様に
なり、複数のリンパ球測定対象亜群の陽性率を一度に簡
単に測定することができる。
第１図は、本発明に使用される測定方法及び装置の一実
施例を示す基本構成図、 第２図は、本発明による測定装置に８ける検出部の一実
施例を示す基本構成図、 第３図ないし第６図は、全血を試料としたときの測定例
であり、第３図と第５図は散乱光強度信号の、第４図と
第６図は螢光強度信号のヒストグラム。 第７図、第８図は、単核球分離したものを試料とした場
合の測定結果を、また第９図、第１０図は、リンパ球の
み分離したものを試料とした場合の測定結果であり、第
７図と第９図は散乱光強度信号のヒストグラムを、第８
図と第１０図は螢光強度信号のヒストグラムを示す。 １０・・・自動染色装置部 １２．２８・・・シリンジ １４．２６．３６・・・ピペット １６・・・試料容器 １８・・・インキュベート部 ２０・・・リン酸緩衝液タンク ２２．３０．３８・・・洗浄槽 ２４・・・抗体格納部 ３２・・・溶血剤タンク ３４・・・吐出管 ４０・・・廃液タンク ４２．４４・・・配管 ４６・・・レーザー光源 ４８・・・コンデンサーレンズ ５０・・・フローセル ５２・・・コレクターレンズ ５４・・・ビームストツノマ ５６．７０・・・光量調節器 ５８・・・元ファイバー ６０・・・散乱光検出器 ６２・・・コレクターレンズ ６４・・・ピンホール ６６・・・ダイクロイックミラー ６８．７４・・・フィルター ７２・・・全反射ミラー ７６・・・螢光検出器 ７８．８０・・・増幅器 ８２．８４・・・Ａ／Ｄ変換器 ８６・・・データ処理装置 ８８・・・散乱光強度記憶装置 ９０・・・螢光強度記憶装置 ９２・・・表示装置。 特許出願人 東亜医用電子株式会社 （外５名） 第３図 散乱光相対強度 第４図 蛍光泪対強度 第５図 第６図 第７図 散乱光相対強度 第８図 蛍光相対強度 第９図 散乱光相対強度 蛍光相対強度 手 続 補 正 書 １、事件の表示 昭和６２年特許願第２８９４５ 号 ２、発明の名称 リンパ球亜群の測定方法およびその装置事件との関係
特許出願人 ５、補正の対象 明細書の〔発明の詳細な説明〕の橢 ６補正の内容 明細書第７頁３行「方向と」を「方向に垂直で」に、同
頁４行「光軸と」を「光軸」に補正する。 以 上
施例を示す基本構成図、 第２図は、本発明による測定装置に８ける検出部の一実
施例を示す基本構成図、 第３図ないし第６図は、全血を試料としたときの測定例
であり、第３図と第５図は散乱光強度信号の、第４図と
第６図は螢光強度信号のヒストグラム。 第７図、第８図は、単核球分離したものを試料とした場
合の測定結果を、また第９図、第１０図は、リンパ球の
み分離したものを試料とした場合の測定結果であり、第
７図と第９図は散乱光強度信号のヒストグラムを、第８
図と第１０図は螢光強度信号のヒストグラムを示す。 １０・・・自動染色装置部 １２．２８・・・シリンジ １４．２６．３６・・・ピペット １６・・・試料容器 １８・・・インキュベート部 ２０・・・リン酸緩衝液タンク ２２．３０．３８・・・洗浄槽 ２４・・・抗体格納部 ３２・・・溶血剤タンク ３４・・・吐出管 ４０・・・廃液タンク ４２．４４・・・配管 ４６・・・レーザー光源 ４８・・・コンデンサーレンズ ５０・・・フローセル ５２・・・コレクターレンズ ５４・・・ビームストツノマ ５６．７０・・・光量調節器 ５８・・・元ファイバー ６０・・・散乱光検出器 ６２・・・コレクターレンズ ６４・・・ピンホール ６６・・・ダイクロイックミラー ６８．７４・・・フィルター ７２・・・全反射ミラー ７６・・・螢光検出器 ７８．８０・・・増幅器 ８２．８４・・・Ａ／Ｄ変換器 ８６・・・データ処理装置 ８８・・・散乱光強度記憶装置 ９０・・・螢光強度記憶装置 ９２・・・表示装置。 特許出願人 東亜医用電子株式会社 （外５名） 第３図 散乱光相対強度 第４図 蛍光泪対強度 第５図 第６図 第７図 散乱光相対強度 第８図 蛍光相対強度 第９図 散乱光相対強度 蛍光相対強度 手 続 補 正 書 １、事件の表示 昭和６２年特許願第２８９４５ 号 ２、発明の名称 リンパ球亜群の測定方法およびその装置事件との関係
特許出願人 ５、補正の対象 明細書の〔発明の詳細な説明〕の橢 ６補正の内容 明細書第７頁３行「方向と」を「方向に垂直で」に、同
頁４行「光軸と」を「光軸」に補正する。 以 上
Claims (3)
- （１）螢光標識されたモノクローナル抗体と血液試料と
を混合し反応させる段階、得られた試料をフローサイト
メーターの検出部に送給する段階、上記検出部において
上記試料にレーザー光を照射する段階、上記試料中の各
細胞から発せられる上記試料の流れの方向に垂直で上記
レーザー光の光軸にほぼ平行な第１の散乱光及び上記各
細胞から発せられる上記レーザー元の光軸と上記試料の
流れの方向とに垂直な方向の第２の散乱光を一個の光検
出器により検出する段階、上記試料中の各細胞から発せ
られる上記レーザー光の光軸と上記試料の流れの方向と
に垂直な方向の螢光を検出する段階、検出された上記第
１及び第２の散乱光の強度信号分布からリンパ球を識別
する段階、上記リンパ球に対応して検出された上記螢光
の強度信号分布からリンパ球亜群を同定する段階、上記
散乱光及び上記螢光の強度信号分布を用いてリンパ球亜
群の陽性率を算定する段階によつて構成されたことを特
徴とするリンパ球亜群の測定方法。 - （２）特許請求の範囲第１項記載の測定方法を実施する
ための装置であつて、螢光標識されたモノクローナル抗
体と血液試料とを混合し反応させる自動染色装置部と、
得られた試料を受入れるフローサイトメーターの検出部
と、上記検出部を、レーザー光で照射するためのレーザ
ー光源と、上記レーザー光の光軸にほぼ平行な第１の散
乱光及び上記光軸に垂直な方向の第２の散乱光を検出す
るための１個の散乱光検出器と、上記光軸に垂直な方向
の螢光を検出するための１個の螢光検出器と、上記散乱
光検出器及び上記螢光検出器の検出信号を受入れて処理
するデータ処理装置と、上記データ処理装置によつて同
定されたリンパ球亜群のデータを表示する表示装置と、
によつて構成されたことを特徴とするリンパ群亜群の測
定装置。 - （３）特許請求の範囲第２項記載の装置において、上記
自動染色装置部が、複数個の混合反応部を備えたインキ
ュベート部と、複数種類のモノクローナル抗体を別個に
収納してなる抗体格納部とを有することを特徴とするリ
ンパ球亜群の測定装置。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62028945A JPS63196854A (ja) | 1987-02-10 | 1987-02-10 | リンパ球亜群の測定方法およびその装置 |
| US07/095,894 US4983359A (en) | 1987-02-10 | 1987-09-14 | Apparatus for measuring lymphocyte subclasses |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62028945A JPS63196854A (ja) | 1987-02-10 | 1987-02-10 | リンパ球亜群の測定方法およびその装置 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63196854A true JPS63196854A (ja) | 1988-08-15 |
Family
ID=12262544
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62028945A Pending JPS63196854A (ja) | 1987-02-10 | 1987-02-10 | リンパ球亜群の測定方法およびその装置 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4983359A (ja) |
| JP (1) | JPS63196854A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02170053A (ja) * | 1988-12-23 | 1990-06-29 | Meiji Seika Kaisha Ltd | 微生物の検出方法及び装置 |
| JP2009522556A (ja) * | 2005-12-29 | 2009-06-11 | ハネウェル・インターナショナル・インコーポレーテッド | マイクロ流体フォーマットにおけるアッセイ実装 |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5167926A (en) * | 1989-09-13 | 1992-12-01 | Kabushiki Kaisha Tiyoda Seisakusho | Apparatus for pretreating cells for flow cytometry |
| JPH03291567A (ja) * | 1990-04-10 | 1991-12-20 | Olympus Optical Co Ltd | ウイルス感染検査装置およびウイルス感染検査方法 |
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