JPH05215750A - 免疫学的分析方法 - Google Patents
免疫学的分析方法Info
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- JPH05215750A JPH05215750A JP5625092A JP5625092A JPH05215750A JP H05215750 A JPH05215750 A JP H05215750A JP 5625092 A JP5625092 A JP 5625092A JP 5625092 A JP5625092 A JP 5625092A JP H05215750 A JPH05215750 A JP H05215750A
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- cells
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 被検細胞の検出を容易かつ迅速に行なうこと
のできる免疫学的分析方法を提供する。 【構成】 被検細胞３００の表面抗原に対する抗体２０
０を固定した基板１００に、被検細胞３００を含む検体
試料３０１を滴下する（Ｉ）。検体試料を流動させて、
被検細胞３００を抗原−抗体反応により基板上に固定さ
れた抗体２００に捕捉せしめる（ＩＩ）。レーザー光１
９等の計測手段で被検細胞３００の検出を行なう。（Ｉ
ＩＩ）。
のできる免疫学的分析方法を提供する。 【構成】 被検細胞３００の表面抗原に対する抗体２０
０を固定した基板１００に、被検細胞３００を含む検体
試料３０１を滴下する（Ｉ）。検体試料を流動させて、
被検細胞３００を抗原−抗体反応により基板上に固定さ
れた抗体２００に捕捉せしめる（ＩＩ）。レーザー光１
９等の計測手段で被検細胞３００の検出を行なう。（Ｉ
ＩＩ）。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は免疫学的分析方法に関
し、特に、被検細胞の検出を容易かつ迅速に行なうこと
のできる免疫学的分析方法に関する。
し、特に、被検細胞の検出を容易かつ迅速に行なうこと
のできる免疫学的分析方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】免疫不
全症や各種免疫疾患、あるいは悪性腫瘍などの治癒には
早期における診断が必要である。これらの疾患では一般
に、血液細胞や各種構成細胞の数が変化を受けやすいた
め、これらの細胞の絶対数や相対数を測定することは、
診断においてきわめて有効な分析手段を与えることにな
る。そのため、細胞の相対数を迅速かつ安価に測定でき
る測定法の開発が期待されている。
全症や各種免疫疾患、あるいは悪性腫瘍などの治癒には
早期における診断が必要である。これらの疾患では一般
に、血液細胞や各種構成細胞の数が変化を受けやすいた
め、これらの細胞の絶対数や相対数を測定することは、
診断においてきわめて有効な分析手段を与えることにな
る。そのため、細胞の相対数を迅速かつ安価に測定でき
る測定法の開発が期待されている。
【０００３】従来、形態学的に区別が難しい細胞、例え
ばリンパ球（Ｂ細胞，Ｔ細胞，ＮＫ細胞，Ｋ細胞などで
構成されている）の分析方法においては、リンパ球の細
胞膜表面上の抗原決定基によってリンパ球を分類するこ
とができることを利用して、この膜表面抗原に特異的に
結合する特定のモノクローナル抗体を用いて分析を行な
う方法が知られている。
ばリンパ球（Ｂ細胞，Ｔ細胞，ＮＫ細胞，Ｋ細胞などで
構成されている）の分析方法においては、リンパ球の細
胞膜表面上の抗原決定基によってリンパ球を分類するこ
とができることを利用して、この膜表面抗原に特異的に
結合する特定のモノクローナル抗体を用いて分析を行な
う方法が知られている。
【０００４】例えば、Ｔリンパ球の分析方法としては、
次のような方法が知られている。すなわち、抗原決定基
によってヘルパー，サプレッサー，キラーＴ細胞に分類
され、抗原決定基と特異的に反応するヒツジ赤血球との
反応により形成されるロゼットを顕微鏡観察してＴリン
パ球の分析を行なうハドソン等の方法（“Practical Im
munology”“Blackwell Scientific Publications ”オッ
クスフォート゛、 P301〜302, 1980 年に記載）や、特開昭５９
−７２６５号に記載された方法のように、モノクロナー
ル抗体を固定した不溶性担体を用いて形成されるロゼッ
トを顕微鏡観察してＴリンパ球の分析を行なう方法であ
る。しかし、これらの方法は検者の主観が入るため正確
な値を得にくいという問題がある。
次のような方法が知られている。すなわち、抗原決定基
によってヘルパー，サプレッサー，キラーＴ細胞に分類
され、抗原決定基と特異的に反応するヒツジ赤血球との
反応により形成されるロゼットを顕微鏡観察してＴリン
パ球の分析を行なうハドソン等の方法（“Practical Im
munology”“Blackwell Scientific Publications ”オッ
クスフォート゛、 P301〜302, 1980 年に記載）や、特開昭５９
−７２６５号に記載された方法のように、モノクロナー
ル抗体を固定した不溶性担体を用いて形成されるロゼッ
トを顕微鏡観察してＴリンパ球の分析を行なう方法であ
る。しかし、これらの方法は検者の主観が入るため正確
な値を得にくいという問題がある。
【０００５】また、モノクローナル抗体を蛍光物質で標
識したものを細胞と反応させ蛍光顕微鏡下で直接観察す
る膜蛍光法も知られている。しかし、膜蛍光法において
は、検出精度は向上するものの、検者の主観が入るため
正確な値を得にくいという問題の他に、測定時間が長
く、そのため蛍光信号が小さくなっていくなどの欠点が
ある。
識したものを細胞と反応させ蛍光顕微鏡下で直接観察す
る膜蛍光法も知られている。しかし、膜蛍光法において
は、検出精度は向上するものの、検者の主観が入るため
正確な値を得にくいという問題の他に、測定時間が長
く、そのため蛍光信号が小さくなっていくなどの欠点が
ある。
【０００６】近年においては、特開昭63-196854 号に記
載の方法のように、蛍光色素からの蛍光量をフローサイ
トメトリーの原理を用いて検出し分類する方法が一般的
に採用されている。この方法は図４に示すように、被検
細胞３００を含む検体試料３０１に、蛍光標識抗体液２
０１を滴下し被検細胞３００に蛍光標識抗体２０２を結
合させた後、これをフローセル４００に導いて光（ｈ
ｖ）５００を当てて蛍光 標識物からの信号を検出器６
００で検出して、被検細胞３００の計数を行なう方法で
ある。しかし、リンパ球測定の場合、被検細胞に比べて
他の細胞数が圧倒的に多く、これらの他の細胞が被検細
胞の検出を妨害するため、他の細胞を予め分離したり、
溶血等の前処理を行なうことが必要であり、操作が煩雑
になり測定時間も長くなる。また、凝集した細胞群によ
るフローセルの目詰まりが生じることも実用上問題であ
る。
載の方法のように、蛍光色素からの蛍光量をフローサイ
トメトリーの原理を用いて検出し分類する方法が一般的
に採用されている。この方法は図４に示すように、被検
細胞３００を含む検体試料３０１に、蛍光標識抗体液２
０１を滴下し被検細胞３００に蛍光標識抗体２０２を結
合させた後、これをフローセル４００に導いて光（ｈ
ｖ）５００を当てて蛍光 標識物からの信号を検出器６
００で検出して、被検細胞３００の計数を行なう方法で
ある。しかし、リンパ球測定の場合、被検細胞に比べて
他の細胞数が圧倒的に多く、これらの他の細胞が被検細
胞の検出を妨害するため、他の細胞を予め分離したり、
溶血等の前処理を行なうことが必要であり、操作が煩雑
になり測定時間も長くなる。また、凝集した細胞群によ
るフローセルの目詰まりが生じることも実用上問題であ
る。
【０００７】一方、抗体を固定した基板を用い抗原抗体
反応により被検試料中の成分を分析する方法として、特
開昭５６−１５１３５７号記載の方法がある。しかし、
この方法は、細胞のような大きいものを捕捉するもので
なく、被検対象物として１μｍ以下のものを対象として
いるため、試料中の被検成分を捕捉する工程と、１μｍ
以下の被検対象物を可視化する標識工程の二つの反応工
程が必要となり、操作が煩雑で測定時間が長くなるとい
う問題がある。
反応により被検試料中の成分を分析する方法として、特
開昭５６−１５１３５７号記載の方法がある。しかし、
この方法は、細胞のような大きいものを捕捉するもので
なく、被検対象物として１μｍ以下のものを対象として
いるため、試料中の被検成分を捕捉する工程と、１μｍ
以下の被検対象物を可視化する標識工程の二つの反応工
程が必要となり、操作が煩雑で測定時間が長くなるとい
う問題がある。
【０００８】本発明は上述した事情にかんがみてなされ
たもので、被検細胞の検出を容易かつ迅速に行なうこと
のできる免疫学的分析方法の提供を目的とする。
たもので、被検細胞の検出を容易かつ迅速に行なうこと
のできる免疫学的分析方法の提供を目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に、本発明の免疫学的分析方法は、基板に被検細胞の表
面抗原に対する抗体を固定し、かつ、上記基板上に固定
された抗体に被検細胞を含む検体試料を接触させて、被
検細胞を抗原−抗体反応により基板上に固定された抗体
に捕捉せしめた後、被検細胞の検出を行なうようにして
あり、好ましくは、被検細胞を血球又はリンパ球とし、
基板上に固定された抗体に、被検細胞を含む検体試料を
接触させる方法を、検体試料を基板上に滴下後検体試料
を基板上で流動させる方法、検体試料を基板上に滴下後
基板を回転させて基板上に検体試料を展開する方法、あ
るいは基板上の抗体固定部分に検体試料を直接滴下する
方法のうちから選ばれるいずれか一つとしてある。ま
た、本発明の免疫学的分析方法は、必要に応じ、被検細
胞の検出方法が、直接又は間接的に被検細胞を観察し
て、被検細胞の定性もしくは定量を行なうようにし、あ
るいは、基板を回転可能なディスク状基板とし、基板の
半径方向に移動可能な光学ヘッドを有する分析装置によ
り、基板を回転させながら被検細胞の定性もしくは定量
を行なうようにしてある。
に、本発明の免疫学的分析方法は、基板に被検細胞の表
面抗原に対する抗体を固定し、かつ、上記基板上に固定
された抗体に被検細胞を含む検体試料を接触させて、被
検細胞を抗原−抗体反応により基板上に固定された抗体
に捕捉せしめた後、被検細胞の検出を行なうようにして
あり、好ましくは、被検細胞を血球又はリンパ球とし、
基板上に固定された抗体に、被検細胞を含む検体試料を
接触させる方法を、検体試料を基板上に滴下後検体試料
を基板上で流動させる方法、検体試料を基板上に滴下後
基板を回転させて基板上に検体試料を展開する方法、あ
るいは基板上の抗体固定部分に検体試料を直接滴下する
方法のうちから選ばれるいずれか一つとしてある。ま
た、本発明の免疫学的分析方法は、必要に応じ、被検細
胞の検出方法が、直接又は間接的に被検細胞を観察し
て、被検細胞の定性もしくは定量を行なうようにし、あ
るいは、基板を回転可能なディスク状基板とし、基板の
半径方向に移動可能な光学ヘッドを有する分析装置によ
り、基板を回転させながら被検細胞の定性もしくは定量
を行なうようにしてある。
【００１０】以下、本発明を図面を参照しつつ詳細に説
明する。図１は本発明の免疫学的分析方法の手順を示す
説明図である。本発明の免疫学的分析方法においては、
被検細胞の表面抗原に対する抗体２００を固定した基板
１００（以下、抗体固定基板という）を使用する（図１
(I) ）。
明する。図１は本発明の免疫学的分析方法の手順を示す
説明図である。本発明の免疫学的分析方法においては、
被検細胞の表面抗原に対する抗体２００を固定した基板
１００（以下、抗体固定基板という）を使用する（図１
(I) ）。
【００１１】ここで、基板１００の大きさ，厚さ，形状
等は適宜選択され特に制限されないが、試料の展開及び
レーザー光等による分析に適するように、透明な回転可
能なものであることが好ましく、このような観点からす
ると円板状（ディスク状）であることが好ましい。ま
た、図２に示すように、基板１００上にシリコン樹脂等
で多数の突条１００ａを放射状に設けて多数の試料展開
面（流路）１００ｂを形成するとともに、試料展開面に
抗体２００を固定した反応部１００ｃを設けると、多数
の試料の分析を同時に行なえる。さらに、各試料展開面
１００ｂの異なる部位に異なる種類の抗体を固定した反
応部１００ｃを複数設けることによって、種類の異なる
被検細胞を同時に分析できる。また、各試料展開面ごと
に異なる種類の抗体を固定した反応部１００ｃを設ける
ことによっても、種類の異なる被検細胞を同時に分析す
ることができる。
等は適宜選択され特に制限されないが、試料の展開及び
レーザー光等による分析に適するように、透明な回転可
能なものであることが好ましく、このような観点からす
ると円板状（ディスク状）であることが好ましい。ま
た、図２に示すように、基板１００上にシリコン樹脂等
で多数の突条１００ａを放射状に設けて多数の試料展開
面（流路）１００ｂを形成するとともに、試料展開面に
抗体２００を固定した反応部１００ｃを設けると、多数
の試料の分析を同時に行なえる。さらに、各試料展開面
１００ｂの異なる部位に異なる種類の抗体を固定した反
応部１００ｃを複数設けることによって、種類の異なる
被検細胞を同時に分析できる。また、各試料展開面ごと
に異なる種類の抗体を固定した反応部１００ｃを設ける
ことによっても、種類の異なる被検細胞を同時に分析す
ることができる。
【００１２】基板１００の形成材料としては、ポリカー
ボネート，ポリメチルメタクリレート，ポリスチレン，
ポリ塩化ビニル，ポリ酢酸ビニル，ポリウレタン，エポ
キシ樹脂等のプラスチック材料やガラス等の透明材料が
挙げられるが、好ましくは、ポリカーボネート，ポリメ
チルメタクリレートあるいはガラスである。このように
基板を透明材料で形成するのは、顕微鏡等による透過光
分析やレーザー等による光学的分析を可能とするためで
ある。
ボネート，ポリメチルメタクリレート，ポリスチレン，
ポリ塩化ビニル，ポリ酢酸ビニル，ポリウレタン，エポ
キシ樹脂等のプラスチック材料やガラス等の透明材料が
挙げられるが、好ましくは、ポリカーボネート，ポリメ
チルメタクリレートあるいはガラスである。このように
基板を透明材料で形成するのは、顕微鏡等による透過光
分析やレーザー等による光学的分析を可能とするためで
ある。
【００１３】基板１００に固定される抗体２００は、被
検細胞の表面抗原に対し特異的に反応するモノクローナ
ル抗体などが挙げられる。例えば、リンパ球のＴ細胞を
認識するモノクローナル抗体には、ＣＤ２（ＯＫＴ１
１、Ｌｅｕ−５ｂ）、ＣＤ３（ＯＫＴ３、Ｌｅｕ−
４）、ＣＤ５（ＯＫＴ１、Ｌｅｕ−１）などがあり、リ
ンパ球のＢ細胞を認識するモノクローナル抗体には、Ｃ
Ｄ１９（Ｂ４）、ＣＤ２０（Ｂ１）がある。また、Ｔ細
胞のサブ群であるヘルパーＴ細胞を認識するモノクロー
ナル抗体には、ＣＤ４（ＯＫＴ４、Ｌｅｕ−３ａ）があ
る。
検細胞の表面抗原に対し特異的に反応するモノクローナ
ル抗体などが挙げられる。例えば、リンパ球のＴ細胞を
認識するモノクローナル抗体には、ＣＤ２（ＯＫＴ１
１、Ｌｅｕ−５ｂ）、ＣＤ３（ＯＫＴ３、Ｌｅｕ−
４）、ＣＤ５（ＯＫＴ１、Ｌｅｕ−１）などがあり、リ
ンパ球のＢ細胞を認識するモノクローナル抗体には、Ｃ
Ｄ１９（Ｂ４）、ＣＤ２０（Ｂ１）がある。また、Ｔ細
胞のサブ群であるヘルパーＴ細胞を認識するモノクロー
ナル抗体には、ＣＤ４（ＯＫＴ４、Ｌｅｕ−３ａ）があ
る。
【００１４】抗体２００を基板１００に固定するには、
例えば、モノクローナル抗体の緩衝溶液（緩衝液組成は
抗体の種類に依存、抗体濃度は０．１〜１００μｇ／ｍ
ｌ）を基板上に滴下し、２０〜４０℃で１〜３時間ある
いは４℃の温度下で一昼夜放置して、抗体２００を基板
１００上に物理的に吸着させればよい。この場合、基板
表面にスルホン基，アミノ基，カルボキシル基またはそ
の誘導体等の官能基を有する基板を用いることにより、
抗体を基板上に化学結合させることもできる（P.Tijsse
n 著、石川栄治監訳“生化学実験法１１エンザイムノア
ッセイ”東京化学同人刊、岩崎辰夫，安東民衛著“単ク
ローン抗体ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ”講談社刊参
照）。
例えば、モノクローナル抗体の緩衝溶液（緩衝液組成は
抗体の種類に依存、抗体濃度は０．１〜１００μｇ／ｍ
ｌ）を基板上に滴下し、２０〜４０℃で１〜３時間ある
いは４℃の温度下で一昼夜放置して、抗体２００を基板
１００上に物理的に吸着させればよい。この場合、基板
表面にスルホン基，アミノ基，カルボキシル基またはそ
の誘導体等の官能基を有する基板を用いることにより、
抗体を基板上に化学結合させることもできる（P.Tijsse
n 著、石川栄治監訳“生化学実験法１１エンザイムノア
ッセイ”東京化学同人刊、岩崎辰夫，安東民衛著“単ク
ローン抗体ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ”講談社刊参
照）。
【００１５】本発明方法においては、上記抗体固定基板
１００上で、検体試料中の抗原３００を抗原−抗体反応
により捕捉せしめる（図１(II)）。ここで、分析対象と
される被検細胞を含む検体試料の調製は、例えば、被検
者から採血した新鮮な血液、または抗凝固剤の入った全
血に同量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を混合して
行なう。
１００上で、検体試料中の抗原３００を抗原−抗体反応
により捕捉せしめる（図１(II)）。ここで、分析対象と
される被検細胞を含む検体試料の調製は、例えば、被検
者から採血した新鮮な血液、または抗凝固剤の入った全
血に同量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を混合して
行なう。
【００１６】基板１００上で抗原−抗体反応を行なわせ
るには、例えば、抗体固定基板上に分析対象物である被
検細胞３００を含んだ検体試料３０１を適量（例えば１
０〜５０μｌ程度）滴下し、抗体固定部分に検体試料を
流動させるか、あるいは基板１００を回転して遠心力に
よって検体試料を基板１００上に薄膜状に展開する。こ
れによって、基板１００上に固定された抗体２００と検
体試料中の被検細胞の表面３００との間において効率よ
く抗原−抗体反応を行なわせることができる。また、被
検試料３０１を基板上の抗体固定部分に直接滴下して抗
原−抗体反応を行なわせることもできる。抗原−抗体反
応の時間は１秒〜３０分程度、好ましくは１０分以上で
ある。
るには、例えば、抗体固定基板上に分析対象物である被
検細胞３００を含んだ検体試料３０１を適量（例えば１
０〜５０μｌ程度）滴下し、抗体固定部分に検体試料を
流動させるか、あるいは基板１００を回転して遠心力に
よって検体試料を基板１００上に薄膜状に展開する。こ
れによって、基板１００上に固定された抗体２００と検
体試料中の被検細胞の表面３００との間において効率よ
く抗原−抗体反応を行なわせることができる。また、被
検試料３０１を基板上の抗体固定部分に直接滴下して抗
原−抗体反応を行なわせることもできる。抗原−抗体反
応の時間は１秒〜３０分程度、好ましくは１０分以上で
ある。
【００１７】上記抗原−抗体反応後、捕捉された被検細
胞３００以外の残余の検体試料は、基板の回転による遠
心力等で除去するか、あるいはアスピレーター等によっ
て吸引除去する。
胞３００以外の残余の検体試料は、基板の回転による遠
心力等で除去するか、あるいはアスピレーター等によっ
て吸引除去する。
【００１８】次いで、ｔｗｅｅｎ−２０（ポリサイエン
ス社製）あるいはトライトンＸ−１００（和光純薬社
製）等の界面活性剤を含む緩衝生理食塩水、例えば、リ
ン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝生理食塩水、炭酸緩衝
生理食塩水等を１００〜２０００μｌ用いて基板上を洗
浄する。洗浄後、緩衝生理食塩水を基板の回転による遠
心力等で除去するか、あるいは、アスピレーター等によ
って吸収除去する。
ス社製）あるいはトライトンＸ−１００（和光純薬社
製）等の界面活性剤を含む緩衝生理食塩水、例えば、リ
ン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝生理食塩水、炭酸緩衝
生理食塩水等を１００〜２０００μｌ用いて基板上を洗
浄する。洗浄後、緩衝生理食塩水を基板の回転による遠
心力等で除去するか、あるいは、アスピレーター等によ
って吸収除去する。
【００１９】緩衝生理食塩水の除去後、基板を自然乾燥
などで乾燥させる。このようにしてサンプル基板が作製
される。なお、上記サンプル基板は、非特異性吸着防止
のため、ブロッキング剤でその表面を覆い、ブロッキン
グ処理を行なうことが好ましい。ここで、ブロッキング
剤としては、ウシ血清アルブミン，カゼイン，スキムミ
ルク等が挙げられる。
などで乾燥させる。このようにしてサンプル基板が作製
される。なお、上記サンプル基板は、非特異性吸着防止
のため、ブロッキング剤でその表面を覆い、ブロッキン
グ処理を行なうことが好ましい。ここで、ブロッキング
剤としては、ウシ血清アルブミン，カゼイン，スキムミ
ルク等が挙げられる。
【００２０】次に、上記サンプル基板上に固定された抗
体によって捕捉された被検細胞の検出を行なう（図１(I
II) ）。被検細胞の検出手段としては、例えば、 光学顕微鏡またはレーザー顕微鏡等による目視検出
（定性及び定量）、 画像解析装置を接続した顕微鏡による計数（定量）、 光学的検出手段を具備した分析装置による計数（定
量）等が挙げられる。
体によって捕捉された被検細胞の検出を行なう（図１(I
II) ）。被検細胞の検出手段としては、例えば、 光学顕微鏡またはレーザー顕微鏡等による目視検出
（定性及び定量）、 画像解析装置を接続した顕微鏡による計数（定量）、 光学的検出手段を具備した分析装置による計数（定
量）等が挙げられる。
【００２１】光学的測定手段を具備した分析装置として
は、例えば、特開平２−２６９９３８号で本出願人が開
示した図３に示すような装置が使用される。同図におい
て、１００は基板であり、回転テーブル２上に装着され
ている。基板１００の下部外周には、基板１００から落
ちる試料を受けるための受け皿６が配置され、回収タン
ク７に回収されるようになっている。モータ８は基板１
００を回転させるためのものであり、駆動制御回路９は
モータ８の駆動を制御するものである。ノズル１１は、
試料送り装置１２から送られる試料を基板１００上に滴
下する。光学式測定ヘッド１４は、基板半径方向に延び
る送りねじ軸１５に沿って往復移動する。モータ１６は
ヘッド１４を駆動するためのものであり、駆動制御回路
１７はモータ１６の駆動を制御する。
は、例えば、特開平２−２６９９３８号で本出願人が開
示した図３に示すような装置が使用される。同図におい
て、１００は基板であり、回転テーブル２上に装着され
ている。基板１００の下部外周には、基板１００から落
ちる試料を受けるための受け皿６が配置され、回収タン
ク７に回収されるようになっている。モータ８は基板１
００を回転させるためのものであり、駆動制御回路９は
モータ８の駆動を制御するものである。ノズル１１は、
試料送り装置１２から送られる試料を基板１００上に滴
下する。光学式測定ヘッド１４は、基板半径方向に延び
る送りねじ軸１５に沿って往復移動する。モータ１６は
ヘッド１４を駆動するためのものであり、駆動制御回路
１７はモータ１６の駆動を制御する。
【００２２】光学式測定ヘッド１４はレーザー光の投光
部と受光部を有し、投光部からの照射光はハーフミラ
ー，レンズを経て収束光として試料展開面１００ｂ上の
試料に照射され、試料から反射された反射光は受光部で
受けられるようになっている。なお、使用されるレーザ
ー光源は、一般に使用されているＨｅ−Ｎｅレーザー等
を使用できる。また、基板の裏面側から投射光を照射す
るようにしてもよく、さらに、反射光でなく、図１(II
I) に示すように、レーザー光１９等の透過光によって
分析を行なうようにしてもよい。これらの場合には回転
テーブルを透明材料で形成するか、あるいは回転テーブ
ルを取り払う。
部と受光部を有し、投光部からの照射光はハーフミラ
ー，レンズを経て収束光として試料展開面１００ｂ上の
試料に照射され、試料から反射された反射光は受光部で
受けられるようになっている。なお、使用されるレーザ
ー光源は、一般に使用されているＨｅ−Ｎｅレーザー等
を使用できる。また、基板の裏面側から投射光を照射す
るようにしてもよく、さらに、反射光でなく、図１(II
I) に示すように、レーザー光１９等の透過光によって
分析を行なうようにしてもよい。これらの場合には回転
テーブルを透明材料で形成するか、あるいは回転テーブ
ルを取り払う。
【００２３】信号処理装置２３は、ヘッド１４に信号を
送り光源を点灯させる機能と、ヘッド１４で受光された
光信号を処理し、分析する機能を有する。ディスプレイ
装置２４は分析結果を画面表示し、記録装置２５は分析
結果をプリントアウトして出力する。ＣＰＵ（中央処理
装置）２７は、試料送り装置１２、駆動制御回路９及び
１７、信号処理装置２３等の制御を行ない、これをプロ
グラム通り作動させる。また、ＣＰＵ２７は、プログラ
ムの操作装置２８と、プログラムの記憶装置２９を有し
ている。
送り光源を点灯させる機能と、ヘッド１４で受光された
光信号を処理し、分析する機能を有する。ディスプレイ
装置２４は分析結果を画面表示し、記録装置２５は分析
結果をプリントアウトして出力する。ＣＰＵ（中央処理
装置）２７は、試料送り装置１２、駆動制御回路９及び
１７、信号処理装置２３等の制御を行ない、これをプロ
グラム通り作動させる。また、ＣＰＵ２７は、プログラ
ムの操作装置２８と、プログラムの記憶装置２９を有し
ている。
【００２４】上記構成からなる分析装置によれば、免疫
学的分析の全ての工程を基板上で行なうことができ、ま
た、分析の全自動化を図ることができる。
学的分析の全ての工程を基板上で行なうことができ、ま
た、分析の全自動化を図ることができる。
【００２５】
【実施例】以下、実施例にもとづき本発明をさらに詳細
に説明する。実施例１ （１）抗体固定基板の作製 図２に示すように、シリコン樹脂で流路を作製した直径
１３０ｍｍの回転可能なポリカーボネート製ディスク基
板の半径４０ｍｍの位置に、市販の二種のモノクローナ
ル抗体の水溶液（濃度１０-5ｇ／ｍｌ）５０μｌを滴下
し３０ｍｍ2 に均一に広げた。ここで、市販の二種のモ
ノクローナル抗体としては、米国イムノテック社製（Ｉ
ＯＴ４）ＢＬ４、及び（ＩＯＴ８）Ｂ９．２を使用し
た。（ＩＯＴ４）ＢＬ４はヘルパー−インデューサーＴ
リンパ球に特異的な抗体であり、（ＩＯＴ８）Ｂ９．２
はサプレッサーＴリンパ球に特異的な抗体である。な
お、それぞれの抗体の滴下は、異なった流路に行なっ
た。このディスク基板を３０℃、９５％の恒温恒湿槽内
に２時間放置した後、アスピレーターで抗体溶液を吸引
除去し、蒸留水２００μｌで３回洗浄した。続いてブロ
ックエース（雪印社製）の１％水溶液５０μｌを抗体固
定部分に滴下し４℃で２０時間放置した後、アスピレー
ターでブロックエースを吸引除去、ｔｗｅｅｎ−２０
（ポリサイエンス社製）を０．１％含有する蒸留水２０
０μｌで３回洗浄した。
に説明する。実施例１ （１）抗体固定基板の作製 図２に示すように、シリコン樹脂で流路を作製した直径
１３０ｍｍの回転可能なポリカーボネート製ディスク基
板の半径４０ｍｍの位置に、市販の二種のモノクローナ
ル抗体の水溶液（濃度１０-5ｇ／ｍｌ）５０μｌを滴下
し３０ｍｍ2 に均一に広げた。ここで、市販の二種のモ
ノクローナル抗体としては、米国イムノテック社製（Ｉ
ＯＴ４）ＢＬ４、及び（ＩＯＴ８）Ｂ９．２を使用し
た。（ＩＯＴ４）ＢＬ４はヘルパー−インデューサーＴ
リンパ球に特異的な抗体であり、（ＩＯＴ８）Ｂ９．２
はサプレッサーＴリンパ球に特異的な抗体である。な
お、それぞれの抗体の滴下は、異なった流路に行なっ
た。このディスク基板を３０℃、９５％の恒温恒湿槽内
に２時間放置した後、アスピレーターで抗体溶液を吸引
除去し、蒸留水２００μｌで３回洗浄した。続いてブロ
ックエース（雪印社製）の１％水溶液５０μｌを抗体固
定部分に滴下し４℃で２０時間放置した後、アスピレー
ターでブロックエースを吸引除去、ｔｗｅｅｎ−２０
（ポリサイエンス社製）を０．１％含有する蒸留水２０
０μｌで３回洗浄した。
【００２６】（２）検体試料の調製 ５名の被検者より採血した新鮮な血液にリン酸緩衝生理
食塩水（ＰＢＳ）を同量混合して被検細胞を含む検体試
料（検体番号１〜５）とした。
食塩水（ＰＢＳ）を同量混合して被検細胞を含む検体試
料（検体番号１〜５）とした。
【００２７】（３）抗原−抗体反応による被検細胞の捕
捉 上記検体試料５０μｌを基板上の抗体位置に滴下し、室
温で１０分放置して抗原抗体反応を行なわせた。検体試
料をアスピレーターで吸引除去した後、ｔｗｅｅｎ−２
０を０．１％含有する蒸留水２００μｌで３回洗浄し、
乾燥させた。
捉 上記検体試料５０μｌを基板上の抗体位置に滴下し、室
温で１０分放置して抗原抗体反応を行なわせた。検体試
料をアスピレーターで吸引除去した後、ｔｗｅｅｎ−２
０を０．１％含有する蒸留水２００μｌで３回洗浄し、
乾燥させた。
【００２８】（４）被検細胞の検出 レーザー顕微鏡にて（対物：×２０倍、接眼：×２０
倍）上記基板を観察し、付属の画像解析装置で１０ｍｍ
2 当たりのＣＤ４抗体で捕捉された白血球数とＣＤ８抗
体で捕捉された白血球数の計数をした。あらかじめヘル
パーＴ細胞数及びサプレッサーＴ細胞数が既知の標準試
料を測定したときの１０ｍｍ2 あたりに捕捉されるヘル
パーＴ細胞数またはサプレッサーＴ細胞数をプロットし
た検量線に基づいて検体試料中のヘルパーＴ細胞数とサ
プレッサーＴ細胞数を算出し、これからヘルパーＴ細胞
／サプレッサーＴ細胞比（ＣＤ４／ＣＤ８比）を算出し
た。算出結果を表１に示す。
倍）上記基板を観察し、付属の画像解析装置で１０ｍｍ
2 当たりのＣＤ４抗体で捕捉された白血球数とＣＤ８抗
体で捕捉された白血球数の計数をした。あらかじめヘル
パーＴ細胞数及びサプレッサーＴ細胞数が既知の標準試
料を測定したときの１０ｍｍ2 あたりに捕捉されるヘル
パーＴ細胞数またはサプレッサーＴ細胞数をプロットし
た検量線に基づいて検体試料中のヘルパーＴ細胞数とサ
プレッサーＴ細胞数を算出し、これからヘルパーＴ細胞
／サプレッサーＴ細胞比（ＣＤ４／ＣＤ８比）を算出し
た。算出結果を表１に示す。
【００２９】実施例２ 被検細胞の検出を図３に示す光学的検出手段を具備した
分析装置を用いて行なったこと以外は、実施例１と同様
にして、基板上の１０ｍｍ2 当たりのＣＤ４抗体で捕捉
された白血球数とＣＤ８抗体で捕捉された白血球数を計
数し、実施例１と同様に検量線からヘルパーＴ細胞数と
サプレッサーＴ細胞数を算出し、これからヘルパーＴ細
胞／サプレッサーＴ細胞比（ＣＤ４／ＣＤ８比）を算出
した。算出結果を表１に示す。
分析装置を用いて行なったこと以外は、実施例１と同様
にして、基板上の１０ｍｍ2 当たりのＣＤ４抗体で捕捉
された白血球数とＣＤ８抗体で捕捉された白血球数を計
数し、実施例１と同様に検量線からヘルパーＴ細胞数と
サプレッサーＴ細胞数を算出し、これからヘルパーＴ細
胞／サプレッサーＴ細胞比（ＣＤ４／ＣＤ８比）を算出
した。算出結果を表１に示す。
【００３０】参考例 実施例１と同様にして検体試料を調製した後、被検細胞
の検出を図４に示すフローサイトメトリーを用いて行な
い、ＣＤ４抗体で捕捉された白血球数とＣＤ８抗体で捕
捉された白血球数を計数し、計数結果からヘルパーＴ細
胞／サプレッサーＴ細胞比（ＣＤ４／ＣＤ８比）を算出
した。算出結果を表１に示す。
の検出を図４に示すフローサイトメトリーを用いて行な
い、ＣＤ４抗体で捕捉された白血球数とＣＤ８抗体で捕
捉された白血球数を計数し、計数結果からヘルパーＴ細
胞／サプレッサーＴ細胞比（ＣＤ４／ＣＤ８比）を算出
した。算出結果を表１に示す。
【００３１】 表１ ──────────────────────────── 検体番号 ＣＤ４／ＣＤ８比 ──────────────────────────── 実施例１ 実施例２ 参考例* ──────────────────────────── １ １．７５ １．７０ １．７８ ２ １．５０ １．５２ １．５１ ３ １．８０ １．８５ １．８８ ４ １．６５ １．７１ １．７４ ５ １．３０ １．２７ １．４０ ──────────────────────────── ＊：フローサイトメトリー法
【００３２】表１から明らかなように、本発明の分析方
法（実施例１及び２）は、従来法であるフローサイトメ
トリー法（参考例１）と同様、正確に被検細胞の定量を
行なうことができることがわかる。また、検体試料の調
製等を含めた全体の分析時間の比較をしたところ従来法
の半分以下の１５分であった。
法（実施例１及び２）は、従来法であるフローサイトメ
トリー法（参考例１）と同様、正確に被検細胞の定量を
行なうことができることがわかる。また、検体試料の調
製等を含めた全体の分析時間の比較をしたところ従来法
の半分以下の１５分であった。
【００３３】
【発明の効果】以上説明したように本発明の免疫学的分
析方法によれば、被検細胞の検出を容易かつ迅速に行な
うことができる。
析方法によれば、被検細胞の検出を容易かつ迅速に行な
うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の免疫学的分析方法の手順を示す説明図
である。
である。
【図２】複数に区画された基板を示す平面図である。
【図３】分析装置の一例を示す構成図である。
【図４】従来のフローサイトメトリー法による分析手順
を示す説明図である。
を示す説明図である。
１００…基板 ２００…抗体 ３００…被検細胞 ３０１…検体試料
Claims (6)
- 【請求項１】 基板に被検細胞の表面抗原に対する抗体
を固定し、かつ上記基板上に固定された抗体に被検細胞
を含む検体試料を接触させて、被検細胞を抗原−抗体反
応により基板上に固定された抗体に捕捉せしめた後、被
検細胞の検出を行なうことを特徴とする免疫学的分析方
法。 - 【請求項２】 被検細胞が血球である請求項１記載の免
疫学的分析方法。 - 【請求項３】 被検細胞がリンパ球である請求項１記載
の免疫学的分析方法。 - 【請求項４】 基板上に固定された抗体に、被検細胞を
含む検体試料を接触させる方法が、検体試料を基板上に
滴下した後検体試料を基板上で流動させる方法、検体試
料を基板上に滴下した後基板を回転させて基板上に検体
試料を展開する方法、あるいは基板上の抗体固定部分に
検体試料を直接滴下する方法のうちから選ばれるいずれ
か一つである請求項１，２又は３記載の免疫学的分析方
法。 - 【請求項５】 被検細胞の検出方法が、直接又は間接的
に被検細胞を観察して、被検細胞の定性もしくは定量を
行なう方法である請求項１，２，３又は４記載の免疫学
的分析方法。 - 【請求項６】 基板を回転可能なディスク状基板とし、
基板の半径方向に移動可能な光学ヘッドを有する分析装
置により、基板を回転させながら被検細胞の定性もしく
は定量を行なうことを特徴とする請求項１，２，３，又
は４記載の免疫学的分析方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5625092A JPH05215750A (ja) | 1992-02-06 | 1992-02-06 | 免疫学的分析方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5625092A JPH05215750A (ja) | 1992-02-06 | 1992-02-06 | 免疫学的分析方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05215750A true JPH05215750A (ja) | 1993-08-24 |
Family
ID=13021842
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5625092A Pending JPH05215750A (ja) | 1992-02-06 | 1992-02-06 | 免疫学的分析方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05215750A (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001011362A1 (en) * | 1999-05-28 | 2001-02-15 | The National Blood Authority | Cell counting method and kit |
| JP2005502369A (ja) * | 2001-09-12 | 2005-01-27 | バースタイン テクノロジーズ，インコーポレイティド | 分画細胞計数方法ならびにそれを実行するための関連する装置およびソフトウェア |
| JP2005509865A (ja) * | 2001-11-19 | 2005-04-14 | バースタイン テクノロジーズ，インコーポレイティド | 光バイオディスクを用いた血液タイピング（ｂｌｏｏｄｔｙｐｉｎｇ）の方法および装置 |
| JP2006516743A (ja) * | 2003-02-05 | 2006-07-06 | ザ ジェネラル ホスピタル コーポレーション | Ｈｉｖ診断関連用途のためのマイクロチップをベースとしたシステム |
| JP2008224524A (ja) * | 2007-03-14 | 2008-09-25 | Toshiba Corp | 光導波路型抗体チップ |
| JP4796265B2 (ja) * | 2000-06-12 | 2011-10-19 | シスメックス株式会社 | 免疫測定方法及び免疫測定装置 |
-
1992
- 1992-02-06 JP JP5625092A patent/JPH05215750A/ja active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001011362A1 (en) * | 1999-05-28 | 2001-02-15 | The National Blood Authority | Cell counting method and kit |
| JP4796265B2 (ja) * | 2000-06-12 | 2011-10-19 | シスメックス株式会社 | 免疫測定方法及び免疫測定装置 |
| JP2005502369A (ja) * | 2001-09-12 | 2005-01-27 | バースタイン テクノロジーズ，インコーポレイティド | 分画細胞計数方法ならびにそれを実行するための関連する装置およびソフトウェア |
| JP2005509865A (ja) * | 2001-11-19 | 2005-04-14 | バースタイン テクノロジーズ，インコーポレイティド | 光バイオディスクを用いた血液タイピング（ｂｌｏｏｄｔｙｐｉｎｇ）の方法および装置 |
| JP2006516743A (ja) * | 2003-02-05 | 2006-07-06 | ザ ジェネラル ホスピタル コーポレーション | Ｈｉｖ診断関連用途のためのマイクロチップをベースとしたシステム |
| JP2008224524A (ja) * | 2007-03-14 | 2008-09-25 | Toshiba Corp | 光導波路型抗体チップ |
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