KR20130064255A

KR20130064255A - 신규한 혈소판 활성 측정 방법 및 그를 이용한 장치

Info

Publication number: KR20130064255A
Application number: KR1020110130785A
Authority: KR
Inventors: 허대성; 오종현; 김호영; 윤수영; 문경철
Original assignee: 주식회사 나노엔텍
Priority date: 2011-12-08
Filing date: 2011-12-08
Publication date: 2013-06-18
Also published as: WO2013085348A9; WO2013085348A1; KR101424720B1

Abstract

본 발명은 다음의 단계를 포함하는 혈소판 활성의 측정방법에 관한 것이다: (a) 혈액 시료를 수득하는 단계; (b) (i) 혈소판 표면항원-특이적 항체 및 상기 항체에 결합된 검출 가능한 시그널을 발생시키는 표지, 그리고 (ii) 단핵구 표면항원-특이적 항체 및 상기 항체에 결합된 검출가능한 시그널을 발생시키는 표지를 상기 혈액 시료에 접촉시키는 단계; (c) 상기 단계 (b)의 결과물의 이미지를 얻는 단계; 및 (d) 상기 이미지를 분석 하는 단계; 상기 단계 (b), 상기 단계 (c) 또는 상기 단계 (b)와 (c)는 마이크로채널(microchannel)이 구비된 마이크로칩에서 실시되며, 상기 이미지 분석은 상기 마이크로채널에 의해 제공되는 일정 부피에서 상기 혈소판 및 상기 단핵구가 결합된 입자를 계수하여 실시되고, 상기 이미지에서 상기 혈소판 및 상기 단핵구가 서로 결합된 이미지가 관찰되는 경우, 상기 혈액 시료 내 혈소판은 활성화 된 것으로 결정한다. 본 발명의 혈소판 활성 측정 방법은 실행이 간편하며, 빠른 시간 내에, 정확하게 혈소판 활성을 측정할 수 있다. 또한, 데이터의 안정성과 재현성이 우수하며, 별도의 시험과정을 거치지 않고도 활성화된 혈소판의 절대농도(Absolute concentration)를 현장진단으로 즉시 파악할 수 있다.

Description

신규한 혈소판 활성 측정 방법 및 그를 이용한 장치{A Novel Method for Measuring Platelet Activation and Apparatus Using It}

본 발명은 신규한 혈소판 활성 측정 방법 및 그를 이용한 장치에 관한 것이다.

P-셀렉틴(CD62P)은 혈소판의 활성화에 따라 세포질내의 α- 과립(Granule)에서 혈소판의 세포막 표면으로 발현되어 백혈구의 P-셀렉틴 당단백질 리간드-1(P-selectin glycoprotein ligand-1, PSGL-1)과 결합하는 물질로서 혈소판의 활성도를 나타내는 대표적 인자이다(Michelson AD., Pathophysiol Haemost Thromb , 35:67-82(2006)). 하지만, 최근의 연구들에 따르면 죽상경화반의 성장과정과 혈전형성의 첫 단계인 내피세포 및 섬유 덮개의 파열, 그리고 이후 혈소판의 활성화 및 혈전형성에까지 백혈구에 의한 염증반응이 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀지고 있다(Libby P., Nature, 420:868-74(2002)). 특히 혈액응고과정에서는 활성화된 혈소판에 백혈구가 결합한 후 상호작용에 의해 서로를 더욱 활성화시키며, 이러한 백혈구-혈소판의 결합 중 말초혈액 내에서 측정된 혈소판-단핵구 응집체 (Platelet-Monocyte aggregates)는 혈소판의 활성도를 P-셀렉틴보다 더 민감하게 반영하는 것으로 알려져 있다. 급성 심근경색 환자에서 측정된 혈소판-단핵구의 응집도는 대조군에서보다 높게 측정이 되었고, 이는 급성 심근경색의 초기 마커가 될 수 있음이 밝혀졌으며(Mark I. Furman et al., Journal of the American College of Cardiology, 38:4(2001)), 또한 간염 후 간경변증(Post-hepatitic liver cirrhosis) 환자에서도 단핵구-혈소판 응집체가 혈소판의 활성 정도를 측정하는 척도가 될 수 있음이 밝혀진 바 있다(Douaaet al., Thrombosis Research, 125(5):228-233(2010)).

이렇게 백혈구와 혈소판의 결합 및 상호작용이 혈액응고 및 혈전의 형성에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있지만, 구체적으로 어떤 인자들에 의해 서로간의 결합 및 상호작용이 일어나는 지에 대해서는 현재도 연구가 진행 중이다(Zarbock A et al., Blood Rev , 21:99-111(2007)). 상기 혈소판의 P-셀렉틴은 백혈구의 PSGL-1과 결합하여 백혈구를 활성화시키는 것으로 알려져 있고, 이외에도 백혈구의 CD40이 활성화된 혈소판에서 발현되는 CD40 ligand(CD154)와 결합하여 서로를 더욱 활성화시키는 중요한 인자로 알려져 있다(Garlichs CD et al., Stroke , 34:1412-1418(2003)). 최근에는 활성화된 백혈구에서 발현이 증가되며, intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1), ICAM-2 및 fibrinogen, glycosaminoglycan 등에 결합해서 염증반응의 핵심적 역할을 담당하는 macrophage-1 antigen(Mac-1, CD11b/CD18)이 혈소판의 GP1bα에도 결합하여 혈소판과 백혈구의 상호작용에 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다(Wang Y et al., Circulation , 112:2993-3000(2005)).

혈소판 표면의 P-셀렉틴(CD62P)는 혈소판 활성 마커로서, 유세포분석기 (Flow cytometry)에 의해 측정된다. 그러나 이러한 분석기기에 의한 P-셀렉틴(CD62P) 발현 레벨의 측정은 재현성이 매우 떨어지고, 주관적(Subjective)이다. 한편, 상술한 바와 같이 혈소판 표면의 CD62P에 의해 매개되는 혈소판-단핵구 응집체는 이를 대체할 수 있는 신뢰성 있는 혈소판 활성 마커이다. 인비트로에서는 혈소판이 불안정한 상태이므로, 임상 현장(Clinical setting)에서는 적합한 샘플 고정과정과 채혈 후 즉시 측정 가능한 현장진단(Point Of Care Testing, POCT) 기기가 요구된다. 현재까지 혈소판 활성도의 측정은 유세포분석기를 이용한 방법이 사용되어왔지만, 이는 재현성이 떨어지고 유세포분석기 자체의 민감성과 전문적 기술을 요하는 점 때문에 이를 개선하기 위한 방법이 연구되어 왔다. 따라서 본 발명에서는 혈소판 활성 탐지기의 이미징 기술을 기반으로 하여, 현장진단(POCT)이 가능한 혈소판 활성도의 측정방법 및 측정 시스템을 확립하고자 한다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허 문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 신규한 혈소판 활성 측정방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 종래 유세포분석기를 이용한 혈소판 활성 측정방법에 비해 실행이 간편하며, 빠른 시간 내에, 정확하게 혈소판 활성을 측정할 수 있는 방법을 개발하였다. 본 발명의 측정 방법은 유세포분석기에 의한 측정법에 비해 데이터의 안정성과 재현성이 우수하며, 별도의 시험과정을 거치지 않고도 단위 부피당 혈소판-단핵구의 응집체의 수를 알 수 있어 활성화된 혈소판의 절대농도(Absolute concentration)를 현장진단으로 즉시 파악할 수 있다. 또한 본 발명의 방법을 이용한 측정 장치는 마이크로채널(microchannel) 내 부유 세포 수를 최소화하여, 세포의 중첩을 막아 활성화된 혈소판의 수를 정확히 측정할 수 있고, 전문적인 기술 없이도 쉽게 조작이 가능하여 혈소판 활성도의 현장진단을 가능케 함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 신규한 혈소판 활성의 측정방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 신규한 혈소판 활성 측정 장치를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 혈소판 활성의 측정방법을 제공한다:

(a) 혈액 시료를 수득하는 단계;

(b) (i) 혈소판 표면항원-특이적 항체 및 상기 항체에 결합된 검출 가능한 시그널을 발생시키는 표지, 그리고 (ii) 단핵구 표면항원-특이적 항체 및 상기 항체에 결합된 검출가능한 시그널을 발생시키는 표지를 상기 혈액 시료에 접촉시키는 단계;

(c) 상기 단계 (b)의 결과물의 이미지를 얻는 단계; 및

(d) 상기 이미지를 분석 하는 단계;

상기 단계 (b), 상기 단계 (c) 또는 상기 단계 (b)와 (c)는 마이크로채널(microchannel)이 구비된 마이크로칩에서 실시되며, 상기 이미지 분석은 상기 마이크로채널에 의해 제공되는 일정 부피에서 상기 혈소판 및 상기 단핵구가 결합된 입자를 계수하여 실시되고, 상기 이미지에서 상기 혈소판 및 상기 단핵구가 서로 결합된 이미지가 관찰되는 경우, 상기 혈액 시료 내 혈소판은 활성화 된 것으로 결정하는 것을 특징으로 하는 방법.

본 발명자들은 신규한 혈소판 활성 측정방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 종래 유세포분석기를 이용한 혈소판 활성 측정방법에 비해 실행이 간편하며, 빠른 시간 내에, 정확하게 혈소판 활성을 측정할 수 있는 방법을 개발하였다. 상기 측정 방법은 유세포분석기에 의한 측정법에 비해 데이터의 안정성과 재현성이 우수하며, 별도의 시험과정을 거치지 않고도 단위 부피당 혈소판-단핵구의 응집체의 수를 알 수 있어 활성화된 혈소판의 절대농도(Absolute concentration)를 현장진단으로 즉시 파악할 수 있다. 또한 본 발명의 방법을 이용한 측정 장치는 마이크로채널(microchannel) 내 부유 세포 수를 최소화함으로써, 세포의 중첩을 막아 활성화된 혈소판의 수를 정확히 측정할 수 있고, 전문적인 기술 없이도 쉽게 조작이 가능하여 혈소판 활성도의 현장진단을 가능케 함을 확인하였다.

상기 혈소판 활성의 측정방법은 혈액시료 내 혈소판-단핵구 응집체의 이미지를 분석하여 혈소판 활성을 측정하는 방법으로서, 본 발명자들은 종래의 혈소판 활성 측정장치인 유세포분석기가 취급에 있어 전문적인 기술을 요하고, 기기자체의 민감성으로 인해 데이터의 재현성 및 안정성이 매우 낮으며, 특히 유세포분석기 자체의 규모 및 조작방법 등의 특징으로 인해 시료의 현장진단(Point Of Care Testing, POCT)이 매우 어려운 점에 착안하여, 이를 개선하기 위한 혈소판 활성 측정방법을 개발하고자 노력하였고, 그 결과 본 발명의 방법이 설계되었다. 본 발명자들은 본 발명의 방법을 IPMA 분석법(Platelet Activation Analysis by I maging P latelet- M onocyte A ggregation)이라 명명하였다.

본 명세서에서, 용어 “혈소판-단핵구 응집체”는 혈소판 및 단핵구의 표면상에 존재하는 단백질(예컨대, 혈소판의 CD62P와 단핵구의 CD162)이 결합하여 형성된 결합체로서, 용어 “혈소판 및 단핵구가 결합된 입자”와 동일한 의미로 사용할 수 있다. 상기 혈소판-단핵구 응집체는 단핵구 하나 당 하나 이상의 혈소판이 결합될 수 있다.

아래에서 이와 같은 본 발명의 방법에 따른 혈소판 활성 측정방법에 대하여 구체적으로 설명한다:

단계 (a): 혈액 시료의 수득

우선 검체로부터 혈액을 채취한다.

본 발명의 방법이 사용될 수 있는 검체는 모든 포유동물을 포함하며, 바람직하게는 인간이다. 혈액시료는 바람직하게는 전혈(Whole blood) 또는 혈소판 분획을 포함하는 혈액시료일 수 있으며, 보다 바람직하게는 전혈이다.

혈액은 채혈 직후부터 혈액응고반응이 일어나므로, 이를 저지하기 위해 혈액응고 저해제가 포함된 용기에 혈액을 수집한다. 혈액응고 저해제는 공지된 다양한 혈액응고 저해제를 포함하며 예컨대, 소듐 시트레이트, EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid), 헤파린을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 소듐 시트레이트가 포함된 용기를 이용한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (a) 이후에 혈액시료의 고정단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 혈소판은 채혈 직후부터 시간이 지남에 따라 활성화되어 혈액응집이 일어나며 이로 인해 계수되는 혈소판-단핵구 응집체는 증가하여 정확한 혈소판 활성도 측정이 불가능하다. 이러한 혈소판 활성도의 오차를 최소화하기 위해 상기 고정단계를 실시한다. 고정단계에서는 혈소판의 활성 증가를 억제하는 공지된 다양한 고정액을 이용할 수 있으며, 예컨대 파라포름알데하이드 및 글리옥살의 혼합용액 또는 파라포름알데하이드, 글리옥살 및 글리신의 혼합용액을 이용할 수 있다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 상기 고정액은 채혈 직후 즉시 혈액 시료에 첨가하여 혈소판-단핵구의 응집도를 고정한다.

단계 (b): 혈소판 및 단핵구 표면항원 -특이적 항체와 혈액 시료의 접촉

상기 단계 (a)에서 수득한 혈액 시료에 시그널 발생 표지가 결합된 적합한 항체를 접촉시킨다. 즉, 혈소판 표면항원-특이적 항체 및 단핵구 표면항원-특이적 항체를 혈액 시료에 첨가하여 각 세포의 표면에 있는 수용체에 결합시킨다. 상기 항체들의 첨가는 동시 또는 이시에 할 수 있으며, 바람직하게는 동시에 첨가하여 반응시킨다.

본 발명의 방법에서 이용할 수 있는 항체는 혈소판 및 단핵구를 탐지하기 위한 것으로서, 혈소판 및 단핵구의 표면에 존재하는 단백질을 항원으로 한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 혈소판 표면항원은 CD154, CD147, CD100, CD63, CD62P, CD61, CD51/CD61(Vitronectin), CD49, CD42, CD43, CD41, CD36, CD31, CD29 및 CD9으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 항원일 수 있으며, 보다 바람직하게는 CD62P 또는 CD41이며, 가장 바람직하게는 CD41이다.

또한, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 단핵구 표면항원은 CD163, CD64, CD40, CD32, CD16, CD14 및 CD4로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 항원일 수 있으며, 보다 바람직하게는 CD14이다.

본 발명에서 이용되는 항체는 전장 항체, Fab 항체, scFv 항체 또는 항원결합부위를 포함한다. 본 발명에서 이용되는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다.

상기 혈소판 표면항원 또는 단핵구 표면항원에 대한 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol . Biol ., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies : A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

상기 항체에는 검출가능한 시그널을 발생시키는 표지가 결합되어 있다. 검출가능한 시그널을 발생시키는 표지는 화학물질(예컨대, 바이오틴), 효소(알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P₄₅₀), 방사능물질((예컨대, C¹⁴, I¹²⁵, P³² 및 S³⁵), 형광물질(예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질( chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 레이블 및 레이블링 방법은 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다. 바람직하게는, 검출가능한 시그널을 발생시키는 표지로서 형광물질이 이용된다.

상기 표지는 발산하는 파장에 따라 각기 다른 형광 시그널이 관찰될 수 있으며, 바람직하게는 상기 표지는 항체에 결합된 형태로 혈소판 또는 단핵구에 결합된다. 상기 표지는 공지된 다양한 형광물질을 포함할 수 있으며 예컨대, 플루오로세인과 그 유도체, 로다민과 그 유도체, 피코에리드린, 루시퍼 엘로우, B-파이토에리쓰린, 9-아크리딘이소티오시아네이트, 루시퍼 엘로우 VS, 4-아세트아미도-4'-이소티오-시아나토스틸벤-2,2'-다이설폰산, 7-다이에틸아미노-3-(4'-이소티오시아토페닐)-4-메틸쿠마린, 석시니미딜-파이렌부티레이트, 4-아세트아미도-4'-이소티오시아나토스틸벤-2,2'-다이설폰산 유도체, LC™-Red 640, LC™-Red 705, PC5, Cy5, Cy5.5, 리사민, 이소티오시아네이트, 에리쓰로신 이소티오시아네이트, 다이에틸렌트리아민 펜타아세테이트, 1-다이메틸아미노나프틸-5-설포네이트, 1-아닐리노-8-나프탈렌 설포네이트, 2-p-토우이디닐-6-나프탈렌설포네이트, 3-페닐-7-이소시아나토쿠마린, 9-이소티오시아나토아크리딘, 아크리딘 오렌지, N-(p-(2-벤족사조일릴)페닐)멜레이미드, 벤족사디아졸, 스틸벤 및 파이렌을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 혈소판 표면항원-특이적 항체에 결합된 표지 및 상기 단핵구 표면항원-특이적 항체에 결합된 표지는 서로 다른 파장을 가지는 형광 시그널을 방출한다. 본 발명의 방법에 따르면, 혈소판 및 단핵구의 표면항원-특이적 항체에 결합된 표지가 방출하는 시그널은 형광 이미지로서 관찰되는바, 양 이미지를 동일한 영역 내에서 머지(Merging)시켰을 때 나타나는 이미지의 중첩현상으로써 혈소판-단핵구의 응집체 형성여부를 확인할 수 있다.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면, 상기 단계 (b) 이후에 적혈구의 오염을 최소화하기 위한 적혈구 용해 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 단계 (b)의 결과물에 적혈구 용해용액을 적정량 첨가하여 혈소판 활성 측정을 방해하는 적혈구를 용해(Lysis)시킨다. 상기 적혈구 용해 용액은 공지된 다양한 적혈구 용해 용액을 사용할 수 있으며, 예컨대 Versalyse^TM (Beckman Coulter USA) 또는 IMMUNOPREP Reagent System (Beckman Coulter USA))를 사용할 수 있다. 또한 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 상기 적혈구 용해 시간에 의존적으로 상기 방법의 전체 반응시간이 단축된다. 따라서 상기 적혈구 용해 용액 중 바람직하게는 적혈구 용해반응 시간이 짧은 시약을 사용한다.

본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 혈소판 활성도 측정에서 유의성 있는 결과를 얻기 위하여 상기 단계 (a) 또는 단계 (b) 이후에 상기 혈액 시료의 농축 단계를 추가적으로 포함할 수 있으며, 본 발명의 혈액 시료의 농축단계에서는 공지된 다양한 농축방법을 이용할 수 있다(예컨대, 원심분리방법).

상기 혈액 시료의 농축은 마이크로칩 내 또는 마이크로칩 외에서 이루어 질 수 있으며, 마이크로칩 내에서 이루어질 경우 바람직하게는 상기 농축은 마이크로칩에 구비된 농축수단에 의해 실시된다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 마이크로칩에 구비된 농축수단은 상기 마이크로칩의 깊이 변화가 있는 마이크로채널에 의해 제공되며, 상기 변화가 있는 깊이는 이미지의 초점을 조절하는 데 이용될 수 있다.

또한 상기 농축은 자기분리(magnetic separation) 기술을 이용하여 실시할 수 있으며, 이를 이용하여 혈액 시료 내에서 목적 단백질인 혈소판 및 단핵구 응집체의 분리작업이 직접적으로 가능하다. 상기 자기분리기술은 단백질 분리 정제에 폭넓게 사용되고 있는 바, 상기 기술을 이용하여 혈소판 및 단핵구 응집체를 분리함으로써 이미지 분석에 필요한 적정 농도의 농축 시료를 수득할 수 있다. 상기 농축에 사용되는 자성입자는 바이오물질 예컨대, DNA, RNA, 단백질 및 세포의 분리용 시약으로서, 분리하고자 하는 바이오물질의 종류에 따라 입도 분포 및 입자 크기가 다양한 자성입자를 이용할 수 있다. 상기 자성입자 표면에는 목적 단백질-특이적 항체 예컨대, 혈소판 표면항원-특이적 항체 및 단핵구 표면항원-특이적 항체가 결합될 수 있으며, 상기 항체는 시료 내의 혈소판, 단핵구 또는 혈소판-단핵구 응집체를 인식하여 결합한다. 상기 자성입자에 목적 단백질을 결합시킨 후, 자력을 이용하여 자성입자만을 분리해 낸 뒤, 분리해 낸 자성입자에서 혈소판, 단핵구 또는 혈소판-단핵구 응집체를 탈착시킨다. 상기 자성입자는 당업계에 공지된 다양한 자성입자를 이용할 수 있으며, 예컨대 실리카 코팅 자성입자를 이용할 수 있다.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면, 상기 혈소판 표면항원-특이적 항체 및 단핵구 표면항원-특이적 항체는 자성입자의 표면에 결합되어 있고 상기 농축은 자성을 상기 마이크로칩에 인가(apply)하여 실시한다.

단계 (c): 혈소판-단핵구 응집체의 이미지 수득

이어, 광원 및 이미징 수단을 이용하여 상기 단계 (b)의 결과물의 이미지를 얻는다. 상기 광원 및 이미징 수단에 대한 상세한 설명은 아래에 기재되어 있다.

단계 (d): 이미지 분석

상기 단계 (c)에서 수득한 이미지로부터 혈소판 및 단핵구의 결합된 이미지가 관찰되는 경우, 상기 혈액 시료 내 혈소판은 활성화 된 것으로 결정한다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 상기 이미지로부터 소정영역을 분획하여 각 영역의 혈소판-단핵구 응집체의 수를 계수한 후, 각 영역의 혈소판-단핵구 응집체의 수를 합산함으로써, 혈액 시료내 혈소판-단핵구 응집체의 전체 수를 계수할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 단계 (d)의 이미지 분석은 상기 단계 (c)에서 수득한 이미지로부터 상기 혈액 시료내에서 상기 활성화 된 혈소판의 절대 농도 값을 분석한다. 특히, 상기 시료를 분주한 마이크로채널의 깊이 및 면적을 알고 있는 경우에는 상기 소정영역의 부피를 계산할 수 있다. 따라서 상기 시료의 전체 부피 및 혈소판-단핵구 응집체의 전체 개수로부터, 상기 혈소판-단핵구 응집체의 절대 농도(즉, 단위 부피당 혈소판-단핵구 응집체의 개수)를 계산할 수 있다.

본 발명의 특징 중 하나는, 상기 단계 (c)에서 수득한 상기 혈소판에 대한 이미지 및 상기 단핵구에 대한 이미지를 머징(merging) 하여 이미지 분석을 실시하는 것이다. 상기 혈소판 및 상기 단핵구는 서로 다른 시그널을 방출하므로, 양 이미지를 머징시킨 경우 혈소판 및 단핵구의 응집체 형성여부를 즉각 확인 할 수 있다.

혈소판은 지혈(hemostasis), 혈전증(thrombosis), 죽상동백경화증(atherosclerosis), 알레르기 천식(allergic asthma), 신장질환(renal disease), 면역(immunity) 및 암전이(cancer metastasis) 등의 여러 병리적 기전에 관여한다(Bambace NM et al., J Thromb Haemost . 9(2):237-49(2011)). 상기 다양한 기전에 있어 혈소판의 활성 여부는 중요한 인자이며, 본 발명의 방법에 따른 혈소판 활성 측정 방법은 혈소판 활성과 연관된 질병, 예컨대 심혈관계 질환, 감염성 질환, 패혈증, 혈전증, 종양전이 및 임신 중독증의 위험도(risk evaluation) 측정 또는 상기 질병의 치료제인 항혈소판제(anti-platelet agent)의 효능 평가에 이용될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 혈액 시료 내에서 보존된 혈소판의 유닛(unit)을 모니터링하는데 이용할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 혈액 시료 내 혈소판 활성 측정 장치를 제공한다:

(a) 혈액 시료를 수용하기 위한 마이크로채널(microchannel)이 구비된 마이크로칩;

(b) 상기 마이크로칩 내 혈액 시료에 광을 조사하기 위한 광원;

(c) 상기 광원에 의해 생성된 상기 혈액 시료의 이미지를 촬상하기 위한 이미징 수단;

(d) 상기 이미징 수단에 의해 얻은 이미지로부터 상기 마이크로채널에 의해 제공되는 일정 부피 내 혈소판 및 단핵구가 결합된 입자를 계수하고, 상기 혈액 시료 내의 혈소판 및 단핵구가 서로 결합된 이미지 정보를 처리하여 상기 혈액 시료 내 혈소판의 활성화 여부를 결정하는 이미지 프로세서.

본 발명의 방법을 이용한 측정 장치는 마이크로채널(microchannel) 내 부유 세포 수를 최소화함으로써, 세포의 중첩을 막아 활성화된 혈소판의 수를 정확히 측정할 수 있고, 전문적인 기술 없이도 쉽게 조작이 가능하여 혈소판 활성도의 현장진단이 가능하다. 본 발명의 혈소판 활성 측정 장치는 상술한 본 발명의 혈소판 활성 측정방법을 이용한 것으로서, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 장치를 각각의 구성 별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:

구성 (a): 마이크로채널( microchannel )이 구비된 마이크로칩

상기 혈소판 활성 측정 장치에는 혈액 시료를 수용하기 위한 마이크로칩이 포함된다. 상기 마이크로칩 내에는 혈액 시료를 수용하기 위한 마이크로채널이 구비되어 있으며, 상기 마이크로채널은 다양한 깊이(Depth)를 가질 수 있다. 상기 마이크로채널의 깊이는 세포입자 간의 이미지 중첩을 막아 정확한 혈소판-단핵구 응집체의 수를 계수하기 위해 최적의 설계가 요구된다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 마이크로채널의 깊이는 20-200 ㎛이다.

혈액 시료를 수용할 수 있는 상기 마이크로칩은 이미징 수단(예컨대 CCD 카메라)에 의해 촬상된 영역의 인접한 영역이 광원의 입사 위치에 오도록, 상기 마이크로칩을 일정거리 이동시킬 수 있는 마이크로칩 이동부를 추가적으로 포함할 수 있다. 따라서 상기 마이크로칩 상에서 임의로 분할된 각각의 영역을 빠짐없이 순차적으로 촬영할 수 있다.

상술한 본 발명의 방법을 이용한 상기 측정 장치는 시료의 고정, 항체와의 반응 및 적혈구 용해반응 등을 각각의 단계로서 실시하는 것으로 표현되어 있으나, 이는 기재의 편의를 위한 것이며, 본 발명의 혈소판 활성 측정 장치는 수득한 시료를 마이크로칩에 분주하는 것만으로 혈소판 활성도를 측정할 수 있다. 따라서 상기 마이크로칩은, 바람직하게는 상기 혈소판 활성 측정 방법에서 사용되는 고정시약, 시그널 발산 표지가 결합된 단일클론항체 및 적혈구 용해시약이 포함되어 있으며, 마이크로채널 내에 혈액 시료를 떨어뜨린 후 상기 마이크로칩을 본 발명에 따른 장치에 장착하면, 자동적으로 혈소판-단핵구 응집체의 수가 계수되도록 제작된다. 따라서 사용이 편리하고 현장진단에 적합하므로, 전문가뿐만 아니라 일반인들도 용이하게 사용할 수 있다.

또한 본 발명의 장치는, 상기 마이크로칩을 통과한 빛 중에서 특정 영역의 파장대의 빛만을 통과시키는 광여과기를 마이크로칩과 이미징 수단 사이에 추가적으로 포함할 수 있다. 따라서, 상기 시료 내 혈소판 또는 단핵구에서 발하는 특정 파장대의 빛만을 선택적으로 통과시켜 이미징 수단으로 촬영함으로써 상기 혈소판-단핵구 응집체의 수를 측정할 수 있다. 또한, 본 발명의 측정장치는 시료의 상을 확대하기 위한 대물렌즈를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 대물렌즈는 혈액 시료 내에서 수득된 이미지를 확대하여 이미징 수단(예컨대, CCD 카메라)에 의한 촬상이 가능하게 하므로, 바람직하게는 시료를 수용한 상기 마이크로칩과 접하여 위치하는 것이 바람직하다.

구성 (b): 광원

본 발명의 혈소판 활성 측정 장치에 있어서, 상기 광원은 계수하려는 세포의 특성에 따라 할로겐 램프, 제논 램프, 머큐리 램프, 발광 다이오드 또는 레이저로 구성된 군에서 선택하여 사용할 수 있다. 예컨대, 적혈구를 계수하는 경우에는 자외선-가시광선을 발하는 램프 또는 발광 다이오드를 광원으로서 사용하는 것이 바람직하며, 세포핵이 포함되어 있는 백혈구 또는 체세포를 계수하려는 경우에는 레이저를 광원으로서 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 장치는 광원으로부터 발한 빛의 양과 초점거리를 조절하여 마이크로칩 상으로 조사시키는 입사광조절렌즈를 상기 광원의 전면에 추가적으로 더 포함할 수 있다.

본 발명의 장치는, 복수개의 레이저를 구비할 수 있으며, 각 레이저의 파장대에 따른 광여과기를 복수개 구비하고 있는 광여과기 교환부를 더 포함할 수 있다. 상기 복수의 광여과기 중 특정 영역의 파장대의 빛만을 통과시키는 특정의 광여과기를 선택하여 사용할 수 있기 때문에, 목적하는 시그널을 용이하게 이미징할 수 있다.

구성 (c): 이미징 수단

본 발명의 장치에 포함되는 상기 이미징 수단은 상기 광원에 의해 생성된 상기 혈액 시료의 이미지를 촬상하기 위한 장치로서, 예컨대 혈소판 또는 단핵구의 표면에서 발산되는 형광 시그널을 감지하는 모든 장치를 이용할 수 있으며, 바람직하게는 형광현미경 또는 CCD 카메라를 이용할 수 있다.

구성 (d): 이미징 프로세서

본 발명의 장치에 포함되는 이미지 프로세서는 상기 이미징 수단에 의해 얻은 이미지로부터 상기 혈액 시료 내의 혈소판 및 단핵구가 서로 결합된 이미지 정보를 처리하여 상기 혈액 시료 내 혈소판의 활성화 여부를 결정하는 장치이다.

상기 이미징 수단 예컨대, CCD 카메라에서 촬상한 영상은 컴퓨터로 전송된 후, 상기 컴퓨터에 구비되어 있는 이미지 프로세서에서 이미지 검출 관련 프로그램을 구동함으로써 혈소판-단핵구 응집체의 수를 계수할 수 있다.

본 발명에 따른 이미지 프로세서를 사용함으로써, 혈액 시료내의 혈소판, 단핵구 및 혈소판-단핵구 응집체의 개수를 자동으로 계수할 수 있다. 특히 혈액 시료를 수용할 수 있는 상기 마이크로칩은 상기 이미징 수단, 예컨대 CCD 카메라에 의해 촬상된 영역의 인접한 영역이 상기 광원의 입사 위치에 오도록 상기 마이크로칩을 일정거리 이동시킬 수 있으며, 따라서 상기 마이크로칩상에서 임의로 분할된 각각의 영역이 순차적으로 촬영된다. 상기 이미지 프로세서는 순차적으로 촬영된 각 영역의 혈소판-단핵구 응집체를 계수한 후, 이를 합산하여 상기 혈액 시료내의 혈소판-단핵구 응집체의 전체 수를 계수한다. 이러한 방법을 이용하여 혈액 시료내의 혈소판-단핵구 응집체의 수를 정확하고 신속하게 측정할 수 있다.

상기 이미지 프로세서는 순차적으로 촬상되는 마이크로칩 상의 각 영역의 혈소판-단핵구 응집체를 계수한 후, 이를 합산함으로써, 혈액 시료내의 전체 혈소판-단핵구 응집체 수를 계수할 수 있다. 예컨대, 혈액 시료가 충전되어 있는 마이크로칩의 깊이 및 이미징 수단에 의해 촬상되는 영역의 면적을 알고 있는 경우에는 상기 촬상영역의 부피를 알 수 있으므로 혈소판-단핵구 응집체가 포함된 시료의 부피를 계산할 수 있다. 따라서 상기 시료의 전체 부피 및 혈소판-단핵구 응집체의 전체 개수로부터 상기 혈소판-단핵구 응집체의 절대 농도(즉, 단위 부피당 혈소판-단핵구 응집체의 개수)를 계산할 수 있다. 이와 같이, 본 발명에 따른 혈소판 활성 측정 장치는 마이크로칩을 소정영역 별로 촬상하고, 활성화된 혈소판을 계수하기 때문에 계수의 정밀도를 높일 수 있다. 또한, 혈소판-단핵구 응집체가 마이크로채널 내에 편재되어 분산되더라도, 시료의 전 영역에 대하여 계수하기 때문에 오차가 발생하지 않는다.

상기 이미지 프로세서는 혈소판, 단핵구 및 혈소판 및 단핵구가 결합된 입자를 순차적으로 계수하거나 또는 혈소판, 단핵구 및 혈소판 및 단핵구가 결합된 입자를 동시에 계수할 수 있다. 동시에 혈소판, 단핵구 및 혈소판 및 단핵구가 결합된 입자를 계수함으로써, 전체 혈소판 중 활성화된 혈소판의 개수를 알 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 이미지 프로세서는 혈소판, 단핵구 및 혈소판 및 단핵구가 결합된 입자를 동시에 계수한다.

본 발명의 측정장치는 혈소판의 활성도를 측정하는 데 매우 편리하다. 본 발명의 측정장치에서 레이저를 광원으로 사용하고, 형광염료가 도포되어 있는 마이크로칩상에 혈액을 떨어뜨려 검사하는 경우, 혈소판 또는 단핵구는 형광염료에 염색되어 있어 특정 파장의 빛만을 발하게 되므로, 특정 영역의 파장대의 빛만이 이미징 장치에 의해 촬상됨으로써, 상기 혈소판-단핵구 응집체 수를 계수할 수 있다. 따라서 상기 측정 장치를 사용함으로써, 혈액 내의 적혈구 또는 백혈구 등과 같은 각종 구성성분 뿐만 아니라, 체액 중의 체세포 및 기타 일반적인 미세입자를 즉시 계수할 수 있다. 또한, 전체 단핵구 개수 중 혈소판과 응집체를 형성한 특정 단핵구 개수의 비를 즉시 계산함으로써, 신속하게 질병 경과 등을 보고할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 신규한 혈소판 활성 측정방법 및 그를 이용한 혈소판 활성 측정장치에 관한 것이다.

(b) 본 발명의 혈소판 활성 측정방법은 종래 유세포분석기를 이용한 혈소판 활성 측정방법에 비해 실행이 간편하며, 빠른 시간 내에, 정확하게 혈소판 활성을 측정할 수 있다.

(c) 또한, 유세포분석기에 의한 측정법에 비해 데이터의 안정성과 재현성이 우수하며, 별도의 시험과정을 거치지 않고도 단위 부피당 혈소판-단핵구의 응집체의 수를 알 수 있어 활성화된 혈소판의 절대농도(Absolute concentration)를 현장진단으로 즉시 파악할 수 있다.

(d) 따라서 본 발명의 혈소판 활성 측정 방법 및 측정 장치는 전문적인 기술 없이도 쉽게 실행 가능하여 혈소판 활성도의 현장진단을 가능케 하고, 전문가뿐만 아니라 일반인들도 용이하게 사용할 수 있다.

도 1a는 CD41-FITC, CD14-PE, CD45-PC5의 형광염료를 이용한 유세포분석 결과를 나타낸 것이다. FSC/CD45-PC5 dot plot에서 호중구(파란색), 단핵구(연두색), 림프구(노란색)를 게이팅(Gating)하여 CD14-PE/CD45-PC5 dot plot에서 단핵구만을 게이팅한다. 전체 백혈구 중에 단핵구가 차지하는 비율은 5.9%이다. CD14-PE/CD45-PC5에서 게이팅한 단핵구를 CD14-PE/CD41-FITC dot plot에서 혈소판이 응집된 단핵구와 응집 되지 않은 단핵구를 분리하여 확인 할 수 있는데, 현재 혈소판이 응집된 단핵구의 비율은 전체 단핵구의 31.5%이다.
도 1b는 시간에 따른 혈소판-단핵구 응집도를 나타낸 것이고,
도 1c는 고정액 첨가한 후 시간에 따른 혈소판-단핵구 응집도를 측정한 결과이고,
도 1d는 형광시약 농도에 따른 혈소판-단핵구의 응집도를 유세포 분석기로 측정한 결과를 나타낸 것이고,
도 2는 시료에 따른 유세포분석기와 형광현미경 혈소판-단핵구 응집도를 비교한 것이고,
도 3a는 IPMA 분석 장비에서 한 프레임(Frame)에 해당되는 브라이트(Bright) 이미지, CD41-FITC 이미지, CD14-PE 이미지를 프로그램 상 하나로 합성한 이미지로 혈소판(연두색)이 단핵구(적색)와 응집된 모습 또는 혈소판이 가까이 있지만 단핵구와 응집되지 않은 모습을 확인 할 수 있는데, IPMA 분석 프로그램 상 이것을 구분 하는 모습을 보여주는 이미지를 나타낸 것이다(배율: 10 X).
도 3b 및 도 3c는 적혈구 용해용액 교체 전(도 3b) 후(도 3c)의 단핵구 측정율을 비교한 것이고,
도 4는 유세포분석기와 IPMA 분석법의 혈소판 활성도 결과의 상관관계를 나타낸 것이며,
도 5a 및 도 5b는 마이크로칩 채널의 깊이에 따른 세포 검출 민감도를 나타낸 것이다. 도 5a는 채널 깊이 100 ㎛이며, 도 5b는 20 ㎛이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: IPMA ( Imaging Platelet - Monocyte Aggregation ) 분석법을 이용한 혈소판 활성도 측정

유세포분석기(Flow Cytometry Cytomics FC 500, Beckman Coulter USA) 및 IPMA 분석법을 이용하여 혈소판의 활성도를 측정하였다. 혈소판은 CD41-FITC (Beckman Coulter USA)로 염색하였으며, 활성화된 혈소판 표면에서만 관찰되는 P-셀렉틴은 CD62P-PE(Beckman coulter USA)로 염색하였다. 혈소판의 총 개수는 CD41-FITC로 염색된 세포의 수로, 활성화된 혈소판의 수는 CD62P-PE로 염색된 세포의 수로 카운팅하였다. 그 결과, 유세포분석기 및 IPMA 분석법으로 측정하는 경우 모두 직경이 2~3 ㎛인 혈소판을 측정하는데 어려움이 있었으며, 또한 IPMA 분석법으로 측정 시 20 ㎛ 깊이의 마이크로칩에 혈소판을 주입하였으나 측정하는 과정의 초점 조절이 불가능하였다(데이터 미기재). 상기 결과로서 혈소판 활성도를 측정하는 IPMA 분석법에 적합한 새로운 면역세포 표면 마커(CD marker)의 필요성을 인지하여 본 발명에 착수하였다. 본 발명자들은 혈소판이 활성화되면 단핵구와 응집하는 현상을 이용하여, 전체 단핵구의 수 대비 혈소판-단핵구 응집체(Platelet-Monocyte Aggregates)의 수를 형광현미경으로 확인함으로써 혈소판 활성도를 정량화하였다(하기 실시예 참조).

실시예 2: 혈소판 활성도 정량화를 위한 유세포 분석 측정 조건의 확립

2-1. 혈소판-단핵구 응집체의 염색 조건 확립

IPMA 분석법의 참고치로서, 혈소판 활성도를 정량화할 수 있는 유세포 분석 측정 조건을 확립하기 위하여 아래의 시험을 실시하였다.

본 발명에서 이용한 혈액 시료는 고려대학교 안산병원 진단검사의학과 외래 검사실에 의뢰한 환자의 혈액시료를 이용하였으며, 15명의 환자가 무작위로 선정되었다. 채혈 직후 혈액의 응고를 막기 위하여, 모든 혈액은 3.2% 소듐 시트레이트를 포함한 튜브(BD Vacutainer USA)에 채취하였다.

채혈된 혈액 500uL에 10% 파라포름 알데하이드와 5% 글리옥살용액을 각각 10 ㎕씩 첨가하여 고정한 후 10분간 실온에서 반응시켰다. 이 후 상기 반응액 60 ㎕에 0.2% 글리신 540 ㎕를 첨가하여 알데하이드 반응을 끝내고 희석시켰다. 상기 반응액 중 200 ㎕에 단일클론항체인 CD45-PC5 (BecKman Culuter USA)를 첨가하여 30분간 실온 암소에서 반응시켰다. 이후 상기 반응액에 600 ㎕의 적혈구 용해용액을 첨가, 실온 암소에서 15분간 반응 시킨 후, 유세포분석기로 혈소판-단핵구 응집도를 측정하였다. CD45-PC5가 양성인 부분을 게이팅(Gating)하여 이중에서 호중구, 단핵구, 림프구의 백혈구 내 비율을 측정하였다. CD14-PE가 양성인 부분을 게이팅하여 이 중에서 CD41-FITC에 양성인 부분을 혈소판-단핵구 응집체로 측정하였다.

전체 단핵구 중에서 혈소판이 응집된 단핵구를 다시 한번 게이팅하여 혈소판의 활성도를 측정하였으며, CD41-FITC 양성률(%)은 음성대조 설정을 위하여 IgG-FITC를 사용하였으며 음성대조 혈소판의 99% 이상이 음성에 포함되도록 하였다.

2-2. 채혈 후 시간 경과에 따른 혈소판 활성도 확인

혈소판은 시간이 지남에 따라 활성화되어 응집이 일어나며 이로 인해 계수되는 혈소판-단핵구 응집체는 증가하여 정확한 혈소판 활성도 측정이 불가능하다. 이러한 혈소판 활성도의 오차를 최소화하기 위해 혈소판-단핵구 응집도 측정적정시간을 평가하고 혈소판 활성화를 억제하기 위한 고정을 실시하여 적정검체조건을 확립하였다.

도 1b에서 볼 수 있는 바와 같이 혈소판은 채혈 30분 후부터 급격히 활성화 되었으며, 채혈 후 부터 유세포 측정까지 시간이 지남에 따라 혈소판-단핵구 응집도는 높아지는 경향을 보였다.

2-3. 고정방법을 이용한 혈소판-단핵구 응집체의 혈소판 활성도 확인

상기 결과와 같이 혈소판은 채혈 30분 후부터 급격히 활성화되므로, 혈액 시료의 고정(Fixation)이 반드시 필요하다. 혈소판-단핵구 응집도를 고정시키기 위하여, 채혈 직후 10% 파라포름알데하이드(Yukari Japan), 5% 글리옥살(Sigma USA) 및 0.2% 글리신(Sigma USA)을 포함하는 고정액을 시료에 첨가하였다. 상기 고정액 첨가 후, 유세포분석기를 이용하여 시간에 따른 혈소판-단핵구 응집도를 측정하였다(도 1c). 그 결과 고정액이 첨가되지 않은 시료와 비교하여 혈소판-단핵구 응집도가 낮게 유지되는 것을 확인하였다.

실제 임상시험 현장에서 유세포 분석기를 이용해 채혈 후 1시간 이내에 측정한다는 것은 기존의 임상 검사로 불가능하므로 POCT (Point of care testing: 현장검사) 개념의 혈소판 활성도 측정 장치의 개발이 필요하다. 본 발명의 혈소판 활성도 측정 방법인 IPMA 분석법의 경우 CD14와 CD41의 동시 염색과 CD41의 cutt-off 위한 음성대조 (Isotypic control)가 필수이며 고정액을 사용하여 혈소판 활성도를 고정시키는 것이 중요하다.

2-4. CD41 - FITC , CD14 - PE , CD45 - PC5 의 동시 염색 시 각 형광염료의 적정 농도 확인

상기 고정단계 후, CD41-FITC, CD14-PE, CD45-PC5를 동시에 혈액 시료에 첨가하여 형광염료의 농도에 따른 혈소판-단핵구 응집도를 유세포분석기로 측정하였다. 그 결과, 혈소판-단핵구 응집도는 전혈 50 ㎕당 2 ㎕의 형광염료를 첨가한 경우보다 5 ㎕의 형광염료를 첨가한 시료에서 비특이적으로 높게 측정되었다(도 1d). 전혈 50 ㎕당 5 ㎕의 형광염료가 혈소판-단핵구 응집도를 더욱 활성화하여, 정확한 혈소판 활성도 분석을 방해하는 것으로 판단되어 전혈 50 ㎕당 2 ㎕ 형광염료의 사용을 적정농도로 선택하였다.

실시예 3: 유세포 분석기와 형광현미경을 이용한 혈소판-단핵구 응집도 측정 결과 비교

IPMA 분석법의 적정 측정 조건을 확립하기 위하여 유세포 분석기를 이용한 혈소판-단핵구 응집도 측정결과와 IPMA 분석법을 이용한 측정 결과를 비교하였다. 측정에 사용되는 혈액시료의 부피를 100 ㎕에서 200 ㎕로 두 배 높임으로써 단핵구의 수를 두 배로 늘려주고, 형광염료의 적정농도는 혈액시료 50 ㎕ 당 각각의 단일클론 항체를 2 ㎕씩 첨가하였다. 유세포 분석기와 IPMA 분석법을 통한 측정 결과, 유의한 상관관계를 나타내었다(r=0.9885, 도 2).

실시예 4: IPMA 분석법의 혈소판 활성도 측정 조건 확립

4-1. IPAM 분석법을 이용한 혈소판-단핵구 응집체 측정

상기 실시예 2와 동일한 혈액 시료를 이용하여 혈소판 활성도를 측정하였다. 혈액은 채혈 직후 혈액의 응고를 막기 위하여, 3.2% 소듐 시트레이트 튜브에 채취하였다. 또한 혈소판-단핵구 응집도의 증가를 막기 위하여, 채혈 직후 10% 파라포름알데하이드(Yukari Japan) 및 5% 글리옥살(Sigma USA)의 고정액을 첨가하였다. 상기 고정과정을 거친 후, 단일클론항체인 CD45-PC5 (Beckman Coulter USA), CD14-PE (Beckman Coulter USA) 및 CD41-FITC (Beckman Coulter USA)를 첨가하여 15분간 실온에서 반응시켰다. 상기 반응물에 적혈구 용해용액(Versalyse^TM, Beckman Coulter USA)을 첨가하여 실온에서 10분간 반응시킨 후, 형광현미경을 이용하여 혈소판-단핵구 응집체의 이미지를 수득하였다(데이터 미기재). 하기 계산식 1은 IPMA 분석법에 따른 혈소판 활성도의 계산법이다.

계산식 1

혈소판 활성도 = 혈소판-단핵구 응집체 수 / 부피(Volume)

4-2. 형광시약 교체를 통한 혈소판-단핵구 응집체 측정

상기 실시예 4-1에서는 단핵구를 염색한 CD14-PE의 형광시약의 감도가 약하여 전체 단핵구의 20%를 관찰할 수 없었으므로, Beckman Coulter 사의 단일클론항체를 CD14-PE (Becton Dickinson USA), CD41a-FITC (Bection Dickinson USA)로 교체하여 재분석하였다.

그 결과, Becton Dickinson 사의 단일클론항체을 이용한 경우 단핵구의 측정감도가 높아진 것을 확인할 수 있었다(도 3a).

4-3. 적혈구 용해용액 교체

상기 단일클론항체의 교체와 함께, 혈소판 활성도 측정에 영향을 주는 주요 원인인 시료준비시간을 최소화하기 위해 적혈구 용해용액을 교체하였다. 기존에 사용하던 적혈구 용해용액(Versalyse^TM, Beckman Coulter USA)은 적혈구 용해시간이 최소 10분인 반면, 교체된 적혈구 용해용액(IMMUNOPREP Reagent System, Beckman Coulter USA)은 적혈구 용해시간이 30초로서 매우 단축되었다.

또한, 상기 적혈구 용해용액에 따른 단핵구 측정율을 비교한 결과, 적혈구 용해용액의 교체 후 단핵구 측정율이 유지되었으며 적색형광(PE) 감도가 떨어진 단핵구 수가 현저히 감소함을 확인할 수 있었다(도 3b 및 도 3c).

실시예 5: 환자 검체 검사를 통한 IPMA 분석법 측정결과의 재현성 및 직선성 확인

5-1. IPMA 분석법의 재현성 CV 값 확인

2011년 9월 이후 고려대학교 진단검사의학과에 검사가 의뢰된 환자를 대상으로 혈소판 활성도 검사를 실시하였으며, 그 중 11명의 환자를 무작위로 선정하였다. IPMA 분석법으로 동일 환자 검체의 혈소판-단핵구 응집도를 3차에 걸쳐 측정하였으며, 각 검체결과의 재현성, CV값을 확인하였다(표 1). 표 1에서 보는 바와 같이, CV값은 10% 내로 확인되어 IPMA 분석법의 재현성을 확인할 수 있었다.

IPMA 분석법에 의한 CV값

-	IPMA 분석법	CV
검체 1	7.69	4.34
검체 2	54.47	1.54
검체 3	51.40	2.84
검체 4	22.22	8.54
검체 5	37.21	2.35
검체 6	25.00	7.30
검체 7	43.24	4.33
검체 8	51.18	3.44
검체 9	39.58	1.99
검체 10	35.42	9.95
검체 11	60.38	4.20

5-2. IPMA 분석법의 직선성 r값 확인

유세포 분석기를 이용한 혈소판 활성도 측정결과와 IPMA 분석법에 의한 측정결과를 비교하여 상관관계 r값을 확인하였다. IPMA 분석법을 이용하는 경우, 원심세척을 통한 시료 농축방법으로써 측정되는 총 단핵구 수를 늘려주고 적정농도의 형광시약을 사용한 결과 유세포 분석 결과와 유의한 상관관계를 나타내었다(도 4, r=0.919).

실시예 6: IPMA 분석법의 기술적 보완을 통한 세포검출 민감도 향상

기존 마이크로칩의 채널 깊이(channel depth)를 200 ㎛ (r-slide)에서 100 ㎛ (2ch chip) 또는 20 ㎛로 바꾸어 칩 깊이 변화에 따른 이미지(background)를 확인한 결과, 깊이가 얕을수록 염색된 세포의 검출효율을 향상 시켰다(도 5a 및 도 5b).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

다음의 단계를 포함하는 혈소판 활성의 측정방법:
(a) 혈액 시료를 수득하는 단계;
(b) (i) 혈소판 표면항원-특이적 항체 및 상기 항체에 결합된 검출 가능한 시그널을 발생시키는 표지, 그리고 (ii) 단핵구 표면항원-특이적 항체 및 상기 항체에 결합된 검출가능한 시그널을 발생시키는 표지를 상기 혈액 시료에 접촉시키는 단계;
(c) 상기 단계 (b)의 결과물의 이미지를 얻는 단계; 및
(d) 상기 이미지를 분석 하는 단계;
상기 단계 (b), 상기 단계 (c) 또는 상기 단계 (b)와 (c)는 마이크로채널(microchannel)이 구비된 마이크로칩에서 실시되며, 상기 이미지 분석은 상기 마이크로채널에 의해 제공되는 일정 부피에서 상기 혈소판 및 상기 단핵구가 결합된 입자를 계수하여 실시되고, 상기 이미지에서 상기 혈소판 및 상기 단핵구가 서로 결합된 이미지가 관찰되는 경우, 상기 혈액 시료 내 혈소판은 활성화 된 것으로 결정하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 혈소판 표면항원은 CD154, CD147, CD100, CD63, CD62P, CD61, CD51/CD61(Vitronectin), CD49, CD42, CD43, CD41, CD36, CD31, CD29, 또는 CD9인 것을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서, 상기 혈소판 표면항원은 CD62P 또는 CD41인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단핵구 표면항원은 CD163, CD64, CD40, CD32, CD16, CD14 또는 CD4인 것을 특징으로 하는 방법.
제 4 항에 있어서, 상기 단핵구 표면항원은 CD14인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 검출가능한 시그널을 발생시키는 표지는 형광 표지인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 혈소판 표면항원-특이적 항체에 결합된 표지 및 상기 단핵구 표면항원-특이적 항체에 결합된 표지는 서로 다른 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (d)의 이미지 분석은 상기 이미지로부터 상기 혈액 시료 내에서 상기 활성화 된 혈소판의 절대 농도 값을 분석하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a) 이후에 혈액 시료의 고정 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 9 항에 있어서, 상기 고정은 파라포름알데하이드 및 글리옥살의 혼합용액을 혈액 시료에 첨가하여 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b) 이후에 적혈구 용해 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 11 항에 있어서, 상기 방법은 상기 적혈구 용해 시간에 의존적으로 상기 방법의 전체 반응시간이 단축되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a) 또는 단계 (b) 이후에 혈액 시료의 농축 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 13 항에 있어서, 상기 농축은 상기 마이크로칩에 구비된 농축수단에 의해 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 14 항에 있어서, 상기 농축수단은 상기 마이크로칩의 깊이(depth) 변화가 있는 마이크로채널에 의해 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 13 항에 있어서, 상기 혈소판 표면항원-특이적 항체 및 단핵구 표면항원-특이적 항체는 자성입자의 표면에 결합되어 있고 상기 농축은 자성을 상기 마이크로칩에 인가(apply)하여 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 마이크로칩의 마이크로채널은 변화가 있는 깊이를 가지며 상기 변화가 있는 깊이는 상기 이미지의 초점을 조절하는 데 이용되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (d)의 이미지 분석은 상기 혈소판에 대한 이미지 및 상기 단핵구에 대한 이미지를 머징(merging) 하여 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
다음을 포함하는 혈액 시료 내 혈소판 활성 측정 장치:
(a) 혈액 시료를 수용하기 위한 마이크로채널(microchannel)이 구비된 마이크로칩;
(b) 상기 마이크로칩 내 혈액 시료에 광을 조사하기 위한 광원;
(c) 상기 광원에 의해 생성된 상기 혈액 시료의 이미지를 촬상하기 위한 이미징 수단;
(d) 상기 이미징 수단에 의해 얻은 이미지로부터 상기 마이크로채널에 의해 제공되는 일정 부피 내 혈소판 및 단핵구가 결합된 입자를 계수하고, 상기 혈액 시료 내의 혈소판 및 단핵구가 서로 결합된 이미지 정보를 처리하여 상기 혈액 시료 내 혈소판의 활성화 여부를 결정하는 이미지 프로세서.
제 19 항에 있어서, 상기 마이크로칩은 농축수단이 구비된 것을 특징으로 하는 장치.
제 20 항에 있어서, 상기 농축수단은 상기 마이크로칩의 깊이 변화가 있는 마이크로채널에 의해 제공되는 것을 특징으로 하는 장치.
제 21 항에 있어서 상기 마이크로 채널은 깊이가 20-200 ㎛인 것을 특징으로 하는 장치.
제 20 항에 있어서, 상기 마이크로칩은 혈소판 및 단핵구 특이적 항체가 결합된 자성입자를 포함하고, 상기 농축은 자성을 상기 마이크로칩에 인가(apply)하여 실시하는 것을 특징으로 하는 장치.
제 19 항에 있어서, 상기 마이크로칩의 마이크로채널은 변화가 있는 깊이를 가지며 상기 변화가 있는 깊이에 의해 상기 이미지의 초점을 조절하는 것을 특징으로 하는 장치.
제 19 항에 있어서, 상기 이미지 프로세서는 상기 혈소판에 대한 이미지 및 상기 단핵구에 대한 이미지를 머징(merging) 하여 이미지 정보를 처리하는 것을 특징으로 하는 장치.
제 19 항에 있어서, 상기 이미지 프로세서는 혈소판, 단핵구 및 혈소판 및 단핵구가 결합된 입자를 동시에 계수하는 것을 특징으로 하는 장치.