JPS59174742A - 微小粒子を区分又は選別する方法及びその装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は細胞、細胞内の高分子等の生体粒子又は有機高
分子等の微小粒子を識別（区分又は選別）する方法およ
び該方法を実施する装置に関する。

更に詳しくは連続的に流動している懸濁液中の微小粒子
にレーザー光等の強光線の・ぐル亥光を照射して螢光や
燐光等の励起パルス光を発光せしめ、その強度の時間変
化を迅速かつ自動的に測定、分析して微小粒子の区分を
検出し、微小粒子を、更にその区分に応じて物理的に選
別する方法およびその装置に関する。− 従来技術 細胞学の分野においては、細胞の自動分析および分別の
要求が増大しつつある。現在、細胞材料のスクリーニン
グ、例えばガン細胞又は悪性細胞の発見は主として２種
またはそれ以上の方法によってなされている。先ず最初
に細胞サンプルは視覚的にスクリーニングはれて、異常
細胞を含有していると思われる細胞サンプルが捜し出さ
れる。

これらの細胞サンプルは保管され細胞学技術者又は病理
学者等の専門家によってその細胞が真にがン細胞である
か否かの判断を下す。このような方法は現在のところ適
切に行なわれてはいるが、多くの欠点を有している。す
なわち手間がかかり、非常な熟練を要するために高価な
ものとなり更に異常性の判断の基準は大部分主観的なも
のであるため定量的でない。又、時間と費用のために、
この方法を莫大な数のサンプルに対して適用することは
困難である。

流動システム分析法は、生体微小粒子の分析の場合、フ
ローサイトメトリ（ＦｌｏｗＣｙｔｏｍｅｔ’ｒｙ）と
称されるが、この流動システム分析法と称される方法は
、以上の欠点を幾分でも克服することのできる可能性金
もっている方法である。フローサイトメ｝ＩＪ−は、細
胞懸濁液から光学的、電気的信号を検出し、細胞の性質
、構造を解明する方法である。これに基づくフローザイ
トメーター（ＦｌｏｗＣｙｔｏｍｅｔｅｒ）は、小さな
検出容量内を高速で流れる細胞懸濁液に光を照射し、細
胞からの光学信号や′１気信号を検出し解析する装置で
ある。

これによれば多数の細胞金短時間に観察して正常細胞と
異常細胞を識別することができ、従って自動的な細胞の
スクリーニングを迅速に行なうことができる可能性があ
る。

照射光としては連続のレーザ光が用いられ、細胞を観察
するために使用されるパラメーターは、例えば細胞の大
きさのみのように単一のものでは不十分であることが知
られており、今日ではこの外、細胞の光吸収・螢光・光
散乱あるいはそれらの組合せが・母ラメーターとして用
いられるようになってきている。ここに、ｉ４ラメータ
ーが例えば細胞の大きさであるというのは、正常細胞と
異常細胞とで細胞の大きさが異なる場合に、細胞の大き
さを観察して、正常のものと異常のものと金識別するこ
とをいう。細胞の大きさの比較だけでは正常のものと異
常のものとが識別できないような種類の細胞の場合には
、他の識別できるようなパラメーターが使用されるわけ
である。しかして、多くのパラメーターを１吏用するこ
とによってスクリーニングの精度が上ることとなる。

更に、細胞からの光学信号、電気信号を検出、区分する
にとどまらず、４ｉｔ号解析によシ細胞のグループ分け
、例えば正常細胞のグループと異常細胞のグループへの
グルー．プの分け、のできるように振り分ける機能をも
つ装置もセルンーター（ＣｅｌｌＳｏｒｔｏｒ）と呼ば
れ実用化されている。

以上のフローサイトメトリーおよびセルンーターについ
ては、例えば電子技術総合ゲ［究所ｔ報第４４巻第３号
（１９８０年）に野口によって報告され、セルンークー
については特公昭４６−２７１１８号、特公昭５６−１
３２６６号公報にも記載されている。

フローサイトメーターを用いる流動システム分析法は、
顕微鏡下又は試料セルにおける凱１胞盆析とけ異なり細
胞全流しながら、特定の性質をもつ細胞を、短時間に、
大量に識別でき、従って統計的処理が可能にした点です
ぐれている。しかし、まだ細胞の形態に関する情報、分
子生物学的情報又は分子化〒的情報等の細胞の異常に直
接結びつきうる高価値の情報によって識別するようなパ
ラメーターはなかった。このような高価値の情報は、細
胞の異常の原因に直接係るものであるため、パラメータ
ーの増加に基づくスクリーニングのＮ度向上による臨床
的有用性が増すだけでなく、基礎医学への有用性が生れ
ることとなる。

本発明者は、流動システム分析法本来の優れた機能に前
記高価値の情鰻によって微小粒子を識別できるような新
たなパラメーターを付加することについて探究を行った
。

他方、レーデの技術分野において、今日短ノやルス列可
同調レーザの技術が確立しつつある。近年色素．溶液を
レーザの媒質とする色素レーザ等の出現によって、紫外
から赤外におよぶ広い範囲にわたり任意の波長に同調ｂ
］能なレーデ光が得られるようになり、更にこの可１［
ｊｊｔＡレーデによって非常に短かい時間軸のパルス光
が得られるようになった。

このような短パルス光ｆｆｉｌる方法としてモード同期
法がある。モード同期を達成させるには種々の方法があ
るが最も広く容易に用いられている方法ハ、シンクロナ
スモード向期法である。この方法では色素レーザを励起
する励起光源として例えばモード同期アルゴンイオソレ
ーザの短パルス光を用い、そのパルス列の周期に対応し
て色素レーザの共撮器長を設定することによって色素レ
ーザの利得を周期的に変調して超短ｉ４ルス列光を発生
させる方法である。

コノモード同期法を用いることにより・９Ｊｌ／スＨτ
が数ナノ秒（１（１−９秒）から数ピコ秒（１１−＋２
秒）のオーダーの高出力、単色性、指向性の可同調短パ
ルス列レーザ光を得ることができる．，その周期はキャ
ビティダンプ法によって数ミリ秒乃至数ナノ秒の範四で
町変にできる。

これらのレーデ光はレーザ共振器内にＪ１ノいられてい
る光学素子がプリュースタ一角で設定きれているために
および励起レーデ光が直線偏光であるために出力も直線
偏光であるのが一般的である。

このような高速で変化する光を物質Ｋ照射して物質を発
光させる甥カ合、その発光の時間変化も相当に高速であ
るから、その発光の時間変化の観測側も高度の時間精度
をもたなければならない。

その変化時間領域がサブナノ秒よ）長い場合には、被測
定光の時間変化をフォトダイオードや光電子増倍管等の
光電検出器で受けて電気的な信号に変換して、その′亀
気パルス信号を必要Ｋ応じ信号処理、例えばオッシロス
コープに入力してブラウン管上に描かせる方法又はフォ
トンカウンティング法のような処理等金行うことができ
る。

しかしピコ秒又はサブピコ秒の超高速時間領域のパルス
光の測定では、これらの光電検出器ではその応答速度ま
たは感度の点で問題となるので流しとシカメラ（ストリ
ークカメラ）が用いられる。

なかでも微弱で繰返しかつ超高速の発光の時間変ｆｌｆ
測定するＫはシンクロスキャンス｝！ｊ−クヵメラ法が
適当である。ストリークカメラは、被測定光の受光面か
らの光１ｈ子を加速、偏向することにより、時間変化が
電子の結像螢光面上の空間位置の変化となるようにした
装置である。

前述の短ノやルス列レーザー励起による過渡的な発光強
度の時間変化の測定がヘモグロビンの錯体等の光化学反
応物質でな延れ、更に生体萬分子への適用が提案され、
その局所構造の解析に有用であることが期待きれている
が゛、まだその有用性をチェックするための試料セル中
の基礎研究にとど１っている。

本発明者は、流動システム分析にこれ全組込み、いわゆ
るオンラインで生体粒子又は有機高分子粒子等の微小粒
子の分子レベルの局所構造１ｔＣまでたちかえってその
違いによって微小粒子の識別すなわち、倣小粒子の区分
の％４出を行うかまたはその区分に応じて微小粒子の選
別を行う可能性について探究金行った。

元明の目的 本発明の目的は、照射用強光線として３４ｙ＋ルス光を
用い、発光強度の時間的変化を測定するという構想にも
とづき、微小粒子の発光による識別を高価値の識別情報
により、大惜のサンプルにつき迅速に高精度に行うこと
のできる方法および装置全実現することにある。

発明の構成 本発明においては、基本的形態として、微小粒子の懸濁
液を実質的に前記粒子全］涸ずつ間隔をもたせて含む粒
子流とし、前記粒子流に強光ｍ＋照射し、次いで強光線
を照射された前記粒子流を液滴となし、強光線照射によ
る粒子の発光の強度によって前記液滴中にある粒子を識
別する方法において、前記強光線として強パルス光を用
い、発光強度の時間変化によって微小粒子を識別する方
法が提供きれる。

本発明においてはまた、流動チャンパー、微小粒子の懸
濁液を前記流動チャンパーに送り込み実質的に該粒子を
１個ずつ間隔をもたせて含む粒子流とする手段、強パル
ス光全発生させる手段、前記流動チャンパーで前記強パ
ルス光を前記粒子流に照射する手段、前記粒子流を液滴
とする手段、前記照射による・粒子流の発光を計測する
手段、および、前記計測により発光強度の時間変化を演
算する手段、を具備する微小粒子を識別するＰｅが提供
される。

本発明による方法においては、前記の従来の流動システ
ム分析の技術、町同調短ノクルス光の技術および高速光
現象の測定技術を新た々罵速実時間データ処理技術によ
って結合し、微小粒子の識別すなわち、微小粒子の区分
の検出又はその区分に応じての粒子の選別を行う。

本イ１一明による方法においては、微小粒子そのもの又
は、色素を結合した微小粒子の懸濁液を細流とし、その
後更に細流をノズルから噴出させて噴出流としてから液
滴となし、その細流又は噴出流に微小粒子の吸収帯に同
調した強いパルス光を照射し、それによっ”Ｃ発生する
螢光等の光を受光して、予め選択されたｒ＊Ａ光の強度
の時間変化又はその組合せを高速下に検出し、かつ予め
設定された強度の時間変化に関する区分の値と比較し、
核区分の値との隔りの程度の区分に応じた／ｆ’ルス波
形に関する情報の電気信号を発生させ、一方噴出流の液
滴となる瞬間に荷電電極によって帯電され、次いで偏向
板を通過して試料受器に採取され、このとき、前記電気
イＭ号は、パルス光の照射を受けた粒子が通過するとき
に荷電電極又は偏向電場に送られ、前記区分に応じて帯
電又は偏向されて選別される。

本発明による方法においては、従来の流動システム分析
法および装置に比較して、照射光として、強パルス光を
用い、該ノ４ルス光の照射による予め選択された種類の
発光強度の時間変化又はその組合せ全測定することによ
り、微小粒子を識別する。

本発明による方法およびｔ４は下記の事実にその基礎を
おくものである。

まず、微小粒子内に発光成分を有する粒子、例えば発光
する生体構成物質などの粒子、そのもの又は染色用色素
を結合した微小粒子は、その微小粒子に含まれる分子の
吸収帯に同調した時間変化する強い光即ち・やルス光を
受けて励起され、螢光や燐光等の光を発し、失活する。

この／ｆルス光励起により分子から発した光は、その分
子に固有な時間変化をみせる。即ち、受光後発光がピー
クに達するまでの時間（立上り時間）とピークに達した
後の減衰して消光するまでの時間（減衰時間）が各分子
に固有であり、従ってそれ全包含する微小粒子に固有で
ある。

ここに各粒子に固有とは、例えば大部分の正常な細胞の
グループと、ガン糾胞又は悪性細胞等の異常な細胞のグ
ルーグにそれぞれに固有であることを云い、従って細胞
に固有な時間変化？検知することができれば、正常な細
胞と異常なそれとを区分することが可能である。

微小粒子に含まれる分子の吸収帯には、大略、分子骨格
、例えばＤＮＡ塩素の分子骨格、が光吸収する吸収帯と
、色素、例えばアクリジン染料等の色素が光吸収する吸
収帯があり、そのどちらの吸収帯に同調する・ぐルス光
を照射するかによって得られる情報が異なってくる。

第１図（Ａ），（Ｂ）は、光照射に対する。発光および
失活の状況を説明する図であり、縦軸にエネルギレベル
をとる。実線矢印はレーザー光吸収、励起（ｇｘ）を、
屈曲状矢印は螢光（ＦＬ）’ｅ、破線矢印はエネルギー
トラン子ファー（ＴＲ）’ｅそれぞれあらわす。

（Ａ）は色素の吸収帯に同調するパルス光を照射した場
合で仝り、色素の発光の減衰時間が、区分の・母ラメー
ターとなシ、（Ｂ）は分子骨格の吸収帯に同調する・ぐ
ルス光を照射した場合であシ、分子骨格自身からの発光
の減衰時間と、色素からの発光の立上り時間がノやラメ
ーターとなる。

発光の減衰時間が区分のパラメーターになりつるのは励
起された色素自身の失活過程や分子自身の分子内又は色
素へのエネルギー移動によ不失活過程が分子内の相互作
用の違いにより異なるからであり、発光の立上り時間が
パラメーターとな９うるのは、分子骨格と色素との結合
状態、例えば結合距離がものにより異なり、従って受光
した分子骨格から発光する色素へのエネルギー移動が異
なってくるからである。＼ 前者の場合、例えば、細胞のＤＮＡ塩基間にアクリジン
オレンジ等の螢光色素Ｋｌ−Ｒｉ人すると、一般にがん
細胞等の異常細胞は螢光色素の取り込みが正常細胞に比
べて多く、これ忙アルゴンイオンレーザのパルス光を照
射すると、螢光の減衰時間が大きくなることが認められ
る。

後者の場合、分子骨格を含む微小粒子において、その分
子骨格自身に立体構造等の差があって、例えば同種の細
胞のうち異常細胞が正常細胞よりも色素と弱い結合しか
持ちえない場合には、細胞自身が吸収する波長のパルス
光を照射したとき、異常細胞と正常細胞とでは、立上り
時間に差があるはずである。

更に照射するパルス光が直線偏光である場合には、光の
電気ベクトルの方向に遷移モーメントヲもった分子が選
択的に励起される。この分子は熱運動によって回転し、
励起直後の異方性を失い、等方的になっていく。この配
向緩和の様子は励起分子からの螢光等の偏光の時間変化
を観測することによって知ることができる。

この配向緩和に要する時間（配向緩和時間）も各分子に
固有であり、分子の大きさ、それを取り囲む溶媒や他分
子との相互作用の程度により異なシ、螢光等の／４’ル
スの配向緩和を測定することができれば粒子の区分が可
能となる。この場合には、分子骨格又は色素のいずれに
同調するパルス光を照射しても、配向緩和時間が粒子区
分のノソラメーターとなりうる。例えば細胞膜は異方性
に敏感であるため、細胞膜に関する細胞の区分に゛この
ノヤラメーターは有効である。

なお励起ノ４ルス光の偏光角に対し、並行方向（０°）
と直角方向（９０゜）に生ずるそれぞれの発光強度をＩ
（０）．Ｉ（９０）とすると、発光偏光度ＰはＰ＝−ム
更：」工男υ一、異方性ＡけＡ＝侶嵜モ昌そ謹丁Ｉ（０
）＋Ｉ（９０） で定義される。これらの時間変化を粒子区分のパラメー
ターとすることができる。

以下余白 実施例 本発明の方法および装置を、正常細胞と異常細胞を識別
（区分又は選別）することを一態様として、以下に更に
詳しく説明する。

第２図は、本発明の一実施例としての微小粒子の識別（
区分又は選別）を行う装置の全体的な構成を示す図であ
る。第３図および第４図は第２図装置における流動チャ
ンパーの構造の例を示す図である〇 細胞サンプルは必要ならばまず適切な螢光色素によシ染
色される。適切な色素とは、細胞と結合してノヤルス光
の吸収帯をもつような、そして好しくけ異常細胞の異常
部位に選択的に結合するようなものである。例えばフォ
イルグン染料やアクリジン染料などが用いられる。また
モノクローナル抗体と称し、特定細胞の特定部位にしか
つかない抗体を細胞につけ、その抗体に色素を吸着させ
るようなことも選択的な結合に有用である。

そして細胞サンプル又は適切な螢光色素によシ染色され
た細胞サンプルは生理食塩水の如き液に懸濁させ水性懸
濁液とし、Ｆ過して大きなくずやかたまシを除去して試
料容器２に入れられる。試料容器から懸濁液は、加圧さ
れて、管５を通じて流動チャンパー６に送られる。加圧
の手段の一例は第２図の管３２に示されるような空気等
の気体による加圧である。又他の例は脈動のない又は脈
動の消去されたポンプ加圧である。流動チャン・ぐ一６
に送られた懸濁液は、そのチャンパー内で細流となる。

細流は、流動チャンバー内で、細流中の細胞が装置の中
心軸にくるようにするため、又細胞の区分又は選別が可
能な間隔をとるためＫ包囲鞘としての役割をするシース
液６３、例えば生理食塩水に同心円的に包囲されて流動
チャンバー６の出口ノズル６２から噴出流として噴出さ
れる。

シース液は、容器１から加圧され管４を通って流動チャ
ンパー内の出口ノズルを同軸的Ｋ包囲するシース管に送
られる。シース液と懸濁液との圧力調整は、細胞が実質
的に１個ずつ出口ノズルを通過できるようになされる。

流動チャンパーの型式Ｋは、第３図の細流の段階でノ母
ルス光の照射を受けるように光源の投射口と観測口を有
し、出口，ノズルを有する液中測定型のものがある。ま
た第４レ１のように流動チャンバーは噴出流そ調製する
ものであらで、出口ノズルを出たあとのけ出流がパルス
光の照射を受けーるような空中測定型めものがある。本
発明では、このいずれの型でも適用できる。そしていず
れにしても液滴となシ落下する。

流動チャンパーの上部には流れ出てくる液体噴出流を規
則的に振動させることによって均一な液滴を生ぜしめる
ために機械的に拐続された振動手段６１，例えば圧電型
結晶が設りられる。全ての液滴に細胞を含むとは限らず
、又を）る液滴には複数個の細胞を・含むこともあるが
、統計的には大部分の細胞は、一つの液澗に一個に単離
されることが理想的であるが、功，実には、数個の液滴
に細胞が１個という風に若干希釈される。

これらの調Ｔ；ｉは細胞懸濁液とシース液の加圧の程度
と、圧電型結晶に印加されるル：１波数と電圧、通常で
は周波数４０〜５０ｋＨｚ，電圧．１５ｖを制御するこ
とによってなされる。

前述のように細流又は噴出流と々クた細胞流は、パルス
光の照射を営ける。光源は、例えば、モード同期によシ
パルス光．となる機構を備えたアルゴン・イオンレーザ
１０と波長変換およびパルス幅の極小化を行なう色素レ
ーザ】１およびｉｆル２数のコントロールを行々うキャ
ビティｆンｚ＋−１２によシ構成される。

光源としてはいずれも・やルス光を使用するが、使用す
る光ビームとしては、アルゴンイオンレーザの発振波長
、主として４８８ｎｍまたは５１４、５ｎｍが強くその
他紫外領域の波長、および：色素レーザよシ出てくる波
長、例えば色素としてローダミン６Ｇを用いた場合は６
００ｎｍ前後の波長、の両者を使用する。これら両者の
波長を用いると、ダブルビームの光源となシ、細胞への
渚適励起波長の選択が容易となる。

このｉ４ルス光のレーザビーム、例えばパルス幅として
５Ｑ：ＰＳｅＣ〜５０ｎｓｅｃのレーザヒームヲ、Ｓ／
ＩＶ比を向上させるために、そのウエストＩイントが細
胞流の部分にくるように集光して、細胞流にはぼ直角に
照射する。

．照射光の細胞流をつきぬけた側に、照射光源に向けた
フォトダイオード１６２は、細胞が検出範囲に入った事
を検知し、例えばストリークカメラ２０のシャッターを
開閉するための侶号を取シ出すために使用される。吸収
光は通常パルス動作をしているが、細胞がパルス光に入
ってくると吸収が起シ信号に変化が起きるのでこれをシ
ャッター開信号とする。

細胞が・やルス光を横切らないときには、螢光は発せら
れないのでストリークカメラ２０からはペースノイズＶ
外の信号は出力されないが、このペースノイズを消去す
るためにフォトダイオード１６２の出力信号をストリー
クカメラ２０に入力して、細胞がパルス光をさ′えぎら
ないときには、ストリークカメラ２０の加速電圧を０と
．シ、チャンネルプレートの操作電圧をＯとするような
シャッター同期信号を発せしめる。シャッターを開いて
加速電圧およびチャンネルプレート如動作開始した後シ
ャッターを閉じる信号は、例えばパルスが１００個通過
してのち、又は、１μＢ経過後に発せられる。

パルス光と細胞流が交わる点に細胞が流れてくると、そ
こで細胞内の生体高分子又はそれに結合した色素が励起
され、パルス状の螢光が発せられる。この螢光の列は、
細胞流と・やルス光の照射方向の双方にほぼ直交する方
向にて、できるだけ広角で集光レンズ１５３で集め、ス
トリ〜クカメラ２０および／または光電子増倍管やフォ
トダイオード１５３，’１６４Ｋ送られ、必要ならば、
これらの検知手段の前には偏光板１７１〜１７４が置か
れる。

但し、第１図装置における流動チャンパーが第３図、第
４図に例示したものでなく、細胞流が入射光軸に平行し
て流れるタイプのもの、又は斜めに入射されるタイプの
ものの場合には、螢光の検知は、゜前記細胞流とノ｛ル
ス光の照射方向の双方に直交する必要はなぐ入射光の影
響を受けないように螢光が検知されればよい。

光電子増倍管やフォトダイオードは、応答時定数が遅い
ため、その時定数よシ短いノ｛ルス光は、検知できない
。逆にス｝ＩＪ−クヵメラの時定数は長くできない場合
が多い。従って、検知手段として両者を選択使用すれば
よいこととなる。なお例ｔ９ｖ又丸の えばカ酊ヴ７１幅が０．１・ｎｓｅｃでくシ返し間隔が
１０．ｎＳｅｃとすると、細胞が・冫ルス光を通過する
間に受けるパルスの数は、細胞流速によるが１ｏｏ〜ｉ
，ｏｏｏ個となる。

ストリークカメラ２０の動作が第５図を参照しつつ説明
される。全党パルスはまず光電面２０】に入射して、そ
の刻々の光の強さ（Ｉ）に応じ、光電子を放出する。そ
の刻々の光電子は、加速電極２０２で初速度を揃えて加
速されてチャンネルプレート２０４に向う一方、電子ビ
ームの進行方向に垂直な、偏向電極２０３による偏向電
場で上下方向に偏向される。

この偏向電研２０３には、シンクロスキャン方式を用い
て、ほぼ発光ノ４ルスに同期する高速掃引電圧が印加さ
れておシ、従って遅れて発生する光電子は例えばチャン
ネルプレートの下方に入射することとなシ、その後電子
増倍されて螢光面に射突し、再び光に変換される。結局
この螢光面には、時間を縦軸とし、螢光ノｆルスの強度
が輝度（Ｌ）として表わされた像が与えられる。この光
像は、光電子ビームが螢光パルス毎に発生し、高速掃引
されるけれども、螢光面の残像効果のために、・ぞルス
の累積されたもの、すなもち、細胞毎の像である。

以下余白 この光像は、出力リレーレンズ、オグティカルファイバ
ー等２ｌを通して撮像管又はダイオードアレイ等の受光
素子２２Ｋ結像する。この結果、受光素子を掃引して得
られる電気信号は、励起発光パルスの強度の時間変化を
示すものとなる。

前記発光パルスに同期する偏向電極２０３の高速掃引電
圧は、同期源としては、照射パルス光の一部をフォトダ
イオード１６１を受けた後の出力として用い掃引同期回
路Ｋよって得られる。

第１図（Ｂ）のような・臂ターンの発光の場合のように
分子骨格例えばＤＮＡの分子骨格からの発光と、色素か
らの発光の区別がつかないと解析の意義がなくなる場合
には、解析に必要なそれぞれの発光波長に対応するバン
ド／４’スフィルターをストリークカメラの入射前に設
ければよい。

配向緩和時間は次のようにしてス｝ＩＪ−クカメラによ
って検知できる。即ち、発光パルスを０８および９０°
の２つの偏光板１７１，１７２を通る光路に分け、それ
ぞれを各々のス｝ＩＪ−クカメラで検知する方法や、偏
光板を通した偏光角ｏ０および９０°の２つの偏光螢光
パルスをそれぞれ１台のストリークカメラの左半分およ
び右半分に別けて入光し、チャンネルプレートの後の螢
光面の左右Ｋ別けてそれぞれの光像を描かせ、別々にそ
れぞれの光像の電気信号を得る方法である。

前記したように、励起ノ４ルス光がレーザパルスである
場合にはパルス光も直線偏光であることが一般的である
が、この場合、発光ノ９ルスについて偏光の効果を除い
て、発光の減衰時間を測定するには、偏光角がマジック
アングルと呼ばれる５４．７°に設定された偏光板を通
して観測すればよい。

光電子増倍管やフォトダイオード１６３，１６４を発光
パルスの検知手段に使用する場合は、１つの細胞につい
て数多く発せられる螢光パルスの１つを検知して、直接
に、発光の立上シ時間、減衰時間や、配向緩和時間を検
知することができる。

高感度を得るために数個のパルスの平均値をとってもよ
い。

ストリークカメラ又は、光電子増倍管やフォトダイオー
ドからの電気信号は、後記される時定数計時回路によっ
て発光の立上シ時間、減孝時間又は配向緩和時間が演算
される。

第１図装置・における信号処理部７の構成が第６図に示
される。

時定数計時回路７００ｍ，７００ｂの演算出力である発
光の立上シ時間、減衰時間、配向緩和時間はデータマル
チプレクサ７１及びソーティングマルチプレクサ７２に
送ら几る。

データマルチプレクサは、中央処理ユニット（ＣＰＵ）
７４の指令に基づき、各センサーの−信号を順次切換え
てメモリ７３に書き込む。メモリ７３に書き込まれ友信
号は、微小粒子の区分の表示として、ＣＰＵ７４の指令
によ！）ＣＲＴ等のディスプレイ８１上に測定値あるい
はグラフ等のデータとして表示し、また、印字装置にそ
れらのデータを印字し、ハードコピーを作成する。

一方、ソーティングマルチゾレクサ７２は、選別（ソー
ティング）すべき要素、例えば立上シ時間、減衰時間、
配向緩和時間等の要素が設定されると、ＣＰＵ７４から
の指令によシーつ又は複数の要素の信号が選択され、一
つ又は複数の上限あるいは下限比較器７１７６Ｋ送られ
る。ここであらかじめ設定された値と測定値が比較され
、所定の範囲（例えば上限以下でかつ下限以上）にある
ときは、荷電パルス発生回路８２は一定の遅延時間、例
えば５００〜１，０００μＳ程度をもたせて偏向信号を
出力する。

このようにして１個の細胞の螢光の立上シ時間、減衰時
間又は配向緩和時間が正常な細胞のもつこれらの基準値
（前記設定値）と比較され、その基準値との隔シに応じ
て識別され偏向信号ハ細胞のソーティングのために出力
されることとなる。

細胞流が液滴を形成する所に、細胞流をはさんで荷電電
極２３が設けられており、荷電電極には、前記偏向信号
を受けて、パルス幅５０〜２００μｓ１電圧±５０〜３
００ｖのパルスが荷電パルス発生回路から印加されてい
る。セして液滴が形成される瞬間に液滴はその荷電・母
ルスに応じて荷電される。この荷電パルスは、前記のよ
うに細胞がパルス光の照射を受けて、螢光等を検知され
、比較演算されたのち遅延されているので、その細胞が
丁度荷電電極を通過するときには、比較演算の結果とし
ての荷電を受けるようにされている。

次いで液滴は、液滴流をはさむ形で２〜５ｍの間隔で対
向しておかれている２枚の偏向板２４の間を通過する。

偏向板には±１５００〜２０００Ｖの電圧が加えられて
おシ、荷電された液滴は、静電気力によシ偏向され偏向
板の４〜５鋸下方の細胞受器２５に集められる。荷電さ
れていない液滴はそのまま偏向されずに落下する。

なお偏向信号を荷電パルス発生回路に入力する代シに、
荷電電極では一定の荷電状態として、偏向板の電場を駆
動する回路に入力して、偏向電場の強さを偏向信号に応
じて変化させるようにしてもよい。

第１図装置における粒子流、照射するパルス光、発生す
る発光ノヤルス、ストリークカメラのシャッター用ｒ一
ト、ストリークカメラの掃引な圧、液滴にかける荷藏電
場、相互間の時間的関係がｍ７図の波形図を参照しつつ
説明される。

第７図の（１）は微粒子がパルス光を横切るときをＨレ
ベル、ヤうでないときをＬレ勺レとして粒子流の状態を
示したものである。第７図の（２）は照射するパルス光
を示し、第７図の（３）は発生する発光パルスを示して
いる。．第７図の（４）および（５）はそれぞれストリ
ークカメラのシャッター用ダートと、ストリークカメラ
の掃引電圧を示し、第７図の（６）は荷電電極にかける
電圧を２つのレベルで示している。第７図の（２）から
（３）の間は、発光の立上シ時間だけ少し遅れ、ピーク
に達したあと、緩やかに減衰する。

第７図の（５）の周期は、発光源からストリークカメラ
までの光の到達時間だけの遅れを生じるが、図では無視
した。第７図の（６）は、微小粒子が７臂ルス光の照射
を受けてから、荷電電場に至る時間差だけ遅れる。光の
遅れを問題とする第７図の（２）〜（５）の遅れに比べ
れば比較にならない程の遅れとなるが、便宜上図では若
干大きく画くことにとどめた。

第６図回路における時定数計時回路の構成が第８図およ
び第９図に示される。時定数計時回路が発光パルスの立
上シ時間、又は減衰時間を演算する場合の時定数計時回
路７００ｇ，７００ｂは第８図のように構成される。

第８図回路において、発光の立上シ時間の測定は、光像
を変換｛７た電気信号（偏光の無い、又は所定の偏光角
例えば５４．７°の電気信号）Ｓ（ＯＰＴ）をまず前置
増幅し、スムーゾング等の前処理を行なったのち、第１
比較器７０３によシ立上シの基準レベルを定め、これを
信号Ｓ（７０３）とする。信号Ｓ（７０３）とする立上
シの基準レベルは、しきい値設定器により任意の値に設
定８（７０２）できるものとする。このしきい値は、発
光信号の無信号時からの変化点、光学系あるいはこの回
路に入る迄の！気系のノイズ等を勘案して決められる。

立上シ時間の測定上信号がピーク値に到達した時の信号
が必要となるが、これには第２比較器７０５によシ作成
される信号Ｓ（７０５）を用いる。

即ち発光信号とそのピークホールド回路の信号を第２比
較器で比較し、発光信号の方が小さくなるときのピーク
点の信号を得る。このＳ（７０３）．Ｓ（７０５）の２
つの信号発生時点の時間差を立上シ時間計時回路にて計
測する事によシ発光の立上シ時間を測定できる。

発光の減衰時間の測定は、まず第２比較器７０５によシ
前記ピーク点となるべき時間をとらえる。

それには発光信号とぎークホールド回路を通った信号を
比較すれば発光信号の方が小さくなった所で第２比較器
７０５の出力が逆転するので、これを信号Ｓ（７０５）
として時間測定回路の時間計測開始の信号として使用す
る。

減衰時間とは、通常、信号ピーク値からの値が１／ｅ（
６３Ｌ）になるまでの時間を採用すればよいがこのｌ／
ｅ又はその他の値を減衰比設定器に設定し、これと発光
信号を第３比較器７０８に入れ、大きさの逆転する時出
力信号Ｓ（７０８）が得られる。減衰時間の測定は、こ
の信号Ｓ（７０５），Ｓ（７０８）を用い、減衰時間測
定回路によシ計測される。ＳＴＴは計時開始を、ＳＴＰ
は計時停止を、それぞれあらわす。

立下υ時間計時回路の計時終了信号゛σ岬Ｌによシ、ピ
ークホールド回路および２つの計時回路をリセッ｝ＲＡ
Ｔする。このようにして第８図回路によシ立上シ時間計
時信号Ｓ（７０７）、立下シ時間計時信号Ｓ（７０９）
が得られる。

時定数計時回路が配向緩和時間をｙ／Ｉ戸する場合の時
定数計時回路は、第９図のように構成される。

第９図回路Ｋおいて、光像検市器よりの偏光角ｏ０およ
び９０°の電気信号Ｓ（ＯＰＴ）を前置増幅を行なった
のち、前記偏光を示す換算値、例えば発光偏光度を演算
させる。その回路よシの出力を前記減衰時間計時と同様
に処理するものである。このようにして第９図回路によ
シ配向緩和時間計時信号８（７１６）が得られる。

第６図回路における時定数計時回路の各個としては、第
８図回路、第９図回路の両者を用いることができる。ま
た、状況に応じて、第８図回路、第９図回路のー・方の
みを用いることができる。また、第８図回路が用いられ
る場合においては，、信号Ｓ（７０７）、信号Ｓ（７０
９）の一方を省略することが可能である。

第２図装置においては、微小粒子の区分、選別のパラメ
ーターは、微小粒子の分子レベルの局所構造の違いに基
づくものである。具体的には、生体微小粒子について言
えば、分子生物学的又は分子化学的な細胞レベル、染色
体レベル更Ｋは生体分子レベルＫまでたちかえったもの
である。更に具体的には、まず第１に各構成分子、部位
の接近度、例えば核酸一塙基被アの距離、染色用色素分
子一分子骨格の距離等であり、第２に核酸、タン／４’
ク質などの粒子の大きさや型であシ、第３Ｋ分子の構造
に関し、例えば２重らせんのピッチ、分子の内部振動、
ブラウン運転、鎧のペンディング、分子の局部的な回転
運動等の情報である。

第４に光化学反応を含む生化学反応の過渡中間生成物の
検出であシ、第５に細胞の豐域の情報であって、例えば
、細胞膜とタン・セク質との結合状態や膜の厚さである
。第６に細胞の融合状躬、表面レクチオンリセゾターの
分布、クロメーション接近などの生体微小粒子のその他
の性質に関する情報である。

これらは、生体微小粒子の異常因子に直接係わる高価値
の情報である。第２図装置においては、これらの高価値
の情報によって生体微小粒子を区分、選別でき、しかも
それを大量のサンプルを短時間でオンラインで行なうこ
とが可能である。このことは、第２図装置の医学分野に
おける臨床的有用性と、その基礎医学への有用性を意味
し、またその他の微小粒子の区分、選別への有用性をも
意味する。

本発明の実施にあたっては、前述の実施例のほか、種々
の変形形態をとることが可能である。また、本発明の方
法および装置には、前記特公昭５６−１３２６６号公報
に記載されたようなコウルターオリスイスを使用する容
量検知システムやパルス光照射による粒子からのパルス
状の螢光や散乱光を連続光としてならしてその強弱を検
知し、それらを粒子の区分、選別の／４’ラメーターと
すること、即ち、従来の流動システム分析の手法を併用
することは勿論可能である。

発明の効果 本発明によれば、微小粒子の発光による識別を高価値の
職別情報によシ、大量のザンプルにつき迅速に高精度に
行うことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、光照射に対する粒子の発光および失活の状況
を説明する図、第２図は、本発明の一実施例としての微
小粒子の識別（区分又は選別）を行う装置の全体的な構
成を示す図、第３図および第４図は流動チャンパーの構
造例を示す図、第５図はストリークカメラの動作を説明
する図、第６図は第１図装置における信号処理部の構成
を示す図、第７図は、第１図装置における各部の信号の
時間的関係を示す波形図、第８図および第９図は、第６
図回路における時足数計時回路の構成を示す図である。 １・・・シース液容器、２・・・試料容器、４．５・・
・管、６・・・流動チャンパー、７・・・信号処理部、
１０・・・アルゴンイオンレーザ、１１・・・色素レー
ザ、１２・・・キャビティダン／”−、１８・・・スリ
，｝、．２０・・・ストリークカメラ、２３・・・荷電
電極、２４・・・偏向板ご２５・・・細胞受器、３２・
・・管、６１・・・振動手段、６２・・・出口ノズル、
６３・・・シース液、８１・・・ディスプレイ部、８２
・・・荷電ノ々ルス発生部、８３・・・掃引同期回路、
８４・・・シャッター同期回路、１３１〜１３６・・・
ハーフミラー、１４１〜１４３・・・全反射ミラー、１
５１〜１５８・・・レンズ、１６１〜１６４・・・フォ
トダイオード、１７１〜１７４・・・偏光板・ −３１１− −３１２一 −３１３− −３１４一

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. １．倣小粒子の懸濁液を実質的に前記粒子ｆ：１個ずつ
   間隔をもたせて含む粒子流とし、前記粒子流に強光線を
   照射し、次いで強光線を照射された前記粒子流を液滴と
   なし、強光線照射による粒子の発光の強度によって前記
   液滴中にある粒子を識別する方法において、前記強光線
   として強パルス光を用い、発光強度の時間変化によって
   微小粒子を識別する方法。
2. ２．流動チャンパー、 ｆｖ．ｌＪ＼粒子の縣濁液を前記流動チャンバーに送り
   込み実質的に核粒子を１個ずつ間隔をもたせて含む粒子
   流とする手段、 強パルス光を発生はせる手段、 前記流動チャンパーで前記強・やルス光を前記粒子流に
   照射する手段、 前記粒子流を液滴とする手段・ｈ＞ｖ 前．、射よよ．粒子流。発光ヶ計ＩＩＩ？手と±まｔヒ
   前記計測により発光強度の時間変化を演算する手段、 を具備する微小粒子を識別する装置。