JPS6394156A - 流体中の細胞分析装置 - Google Patents
流体中の細胞分析装置Info
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- JPS6394156A JPS6394156A JP61238827A JP23882786A JPS6394156A JP S6394156 A JPS6394156 A JP S6394156A JP 61238827 A JP61238827 A JP 61238827A JP 23882786 A JP23882786 A JP 23882786A JP S6394156 A JPS6394156 A JP S6394156A
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- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
６、〔発明の詳細な説明〕
（産業上の利用分野）
本発明は、流れの中の血球等の細胞の静止像を捉え、解
析する細胞分析方法および装置に関するものである。
析する細胞分析方法および装置に関するものである。
（従来の技術）
従来から、細胞の検査においては、スライドグラス上に
塗抹染色された細胞を、顕微鏡を通して観察する方法が
行なわれ℃いた。
塗抹染色された細胞を、顕微鏡を通して観察する方法が
行なわれ℃いた。
しかし、この方法には、顕微鏡による観察の前に細胞の
塗抹、固定、染色等の繁雑な標本作成操作が必要である
こと、さらに、血球等の細胞は生体中では血液等の流体
中に存在しているのに対し、細胞を固定した状態でしか
観察できないため、必ずしも本来の細胞の形態を正しく
見ていないこと。
塗抹、固定、染色等の繁雑な標本作成操作が必要である
こと、さらに、血球等の細胞は生体中では血液等の流体
中に存在しているのに対し、細胞を固定した状態でしか
観察できないため、必ずしも本来の細胞の形態を正しく
見ていないこと。
という問題があった。
一方、流れの中の粒子の顕微鏡ｒ象を撮影する試みは、
最近、いくつか行なわれている。たとえば、カツヘル（
Ｋａｃｈｅｌ ）他、「ザ・ジャーナル・オブ・ヒスト
ケミストリー・アンド・サイトケミスト リ −（Ｔｈ
ｅ Ｊ ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ ａｒｘｌＧ’）ｒｔＯｃｈｅｍｉｓｔ
Ｉ’ｙ’ ） Ｊ 、第２７巻第１号、３３５頁。
最近、いくつか行なわれている。たとえば、カツヘル（
Ｋａｃｈｅｌ ）他、「ザ・ジャーナル・オブ・ヒスト
ケミストリー・アンド・サイトケミスト リ −（Ｔｈ
ｅ Ｊ ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ ａｒｘｌＧ’）ｒｔＯｃｈｅｍｉｓｔ
Ｉ’ｙ’ ） Ｊ 、第２７巻第１号、３３５頁。
１９７９年に記載された方法は、懸濁液中の粒子な細孔
へ一列に通過させ、そのときの電気インピーダンスの変
化によって細胞の通過を検知し、その稗間にフラツ／ユ
ランプを点灯させ、同時にカメラで撮影して、粒子の静
止画像を得るものである。
へ一列に通過させ、そのときの電気インピーダンスの変
化によって細胞の通過を検知し、その稗間にフラツ／ユ
ランプを点灯させ、同時にカメラで撮影して、粒子の静
止画像を得るものである。
また、特表昭５７−５０［’］９９５号公報および特開
昭５８−７６７４０号公報に記載された方法は。
昭５８−７６７４０号公報に記載された方法は。
流体試料な流路に通し、作像領域中において一定周期で
ストロボを点灯させ、同時にＣＣＤカメラで撮影するこ
とにより、流体液中の粒子の静止画像を得ろものである
。
ストロボを点灯させ、同時にＣＣＤカメラで撮影するこ
とにより、流体液中の粒子の静止画像を得ろものである
。
（発明が解決しようとする問題点）
流れの中の粒子の顕微鏡像を撮影する試みのうち、前述
のカツヘルの方法においては、抵抗式および光式検出原
理を組み合わせているため、検出器の構造が非常に複雑
で調整もしに（くなっている。
のカツヘルの方法においては、抵抗式および光式検出原
理を組み合わせているため、検出器の構造が非常に複雑
で調整もしに（くなっている。
また、特表昭５７−５００９９５号公報等に記載された
方法においても、作像領域を形成するフローセルの構造
が非常に複雑で試料流れの流し方も複雑になっている。
方法においても、作像領域を形成するフローセルの構造
が非常に複雑で試料流れの流し方も複雑になっている。
これはさらに、フラツ／ユランプまたはストロボライト
を使用しており、照射光のパルス幅が比較的長いため、
いずれにしても、静止画像を得るためには試料の流速を
余り速くできないので処理能力の点で問題があった。
を使用しており、照射光のパルス幅が比較的長いため、
いずれにしても、静止画像を得るためには試料の流速を
余り速くできないので処理能力の点で問題があった。
従前のいずれの方法においても、細胞内部の画像解析お
よびその清報の利用については何ら述べられておらず１
本格的な細胞分析が不可能であるばかりでなくもともと
それを目的としたものではなかった。
よびその清報の利用については何ら述べられておらず１
本格的な細胞分析が不可能であるばかりでなくもともと
それを目的としたものではなかった。
（問題点を解決するための手段）
本発明は上述したような従来技術の難点を解決するもの
であって、シース流中の細胞の流れる部分に撮像用レー
ザーパルス光源からの光線の焦点を結ばせる段階と、焦
点領域を通過する細胞を前記光線で照射する段階と、細
胞の静止画像を対物レンズおよびＣＣＤカメラで撮像す
る段階と、得られた画像を処理し、解析ｆる段階と、か
くして解析された細胞の形状と内部状態とに関する情報
から前記細胞を分析する流体中の細胞分析方法を特色と
する。さらに、本発明は、シース流の流れろフローセル
と、撮像用レーザーパルス光源と。
であって、シース流中の細胞の流れる部分に撮像用レー
ザーパルス光源からの光線の焦点を結ばせる段階と、焦
点領域を通過する細胞を前記光線で照射する段階と、細
胞の静止画像を対物レンズおよびＣＣＤカメラで撮像す
る段階と、得られた画像を処理し、解析ｆる段階と、か
くして解析された細胞の形状と内部状態とに関する情報
から前記細胞を分析する流体中の細胞分析方法を特色と
する。さらに、本発明は、シース流の流れろフローセル
と、撮像用レーザーパルス光源と。
撮像用レーザーパルス光源から発せられた光を集光する
集光レンズと、かくして集光された光をシース流中を流
、ｔ″Ｌろ細１１ｍに照射したときの静止画像を撮像す
るための対物レンズおよびＣＣＤカメラと、得られた静
止画像を処理し解析する画像処理部と、によって構成さ
れた流体中の細胞分析装置を特色とする。より具体的に
は、常時点灯されたトリガー用光源と、トリガー用光源
からの光線を細胞が横切ったことを検知して細胞検知信
号な発する細胞検出器と、細胞検知信号を一定時間遅延
せしめて撮像用レーザーパルス光源へ送る遅延回路と、
を備えた流体中Ｑ）細胞分析装置、あるいは、集光レン
ズとフローセルとの間に撮像用レーザーパルス光のコヒ
ーレンスを低下せしめろ部材を配置して成る流体中の細
胞分析装置、ｆｆ特色とするものである。
集光レンズと、かくして集光された光をシース流中を流
、ｔ″Ｌろ細１１ｍに照射したときの静止画像を撮像す
るための対物レンズおよびＣＣＤカメラと、得られた静
止画像を処理し解析する画像処理部と、によって構成さ
れた流体中の細胞分析装置を特色とする。より具体的に
は、常時点灯されたトリガー用光源と、トリガー用光源
からの光線を細胞が横切ったことを検知して細胞検知信
号な発する細胞検出器と、細胞検知信号を一定時間遅延
せしめて撮像用レーザーパルス光源へ送る遅延回路と、
を備えた流体中Ｑ）細胞分析装置、あるいは、集光レン
ズとフローセルとの間に撮像用レーザーパルス光のコヒ
ーレンスを低下せしめろ部材を配置して成る流体中の細
胞分析装置、ｆｆ特色とするものである。
（作 用）
撮像用レーザーパルス）を源２０から発せられる光のパ
ルス幅が極めて縮小されるので、流れσ）中の細胞につ
いてその静止画像ｂ″−得られる。そのうえで、得られ
た細胞の静止画像を解析し、細胞の形状や細胞の内部状
態についての情報を得るとともに、これらの情報を肥り
の正しい識別分析に利用してオンラインで精密な細胞の
分析を実現する。
ルス幅が極めて縮小されるので、流れσ）中の細胞につ
いてその静止画像ｂ″−得られる。そのうえで、得られ
た細胞の静止画像を解析し、細胞の形状や細胞の内部状
態についての情報を得るとともに、これらの情報を肥り
の正しい識別分析に利用してオンラインで精密な細胞の
分析を実現する。
（実施例）
本発明の一実施例を第１図に示された図面に基いて説明
する。
する。
まず、細胞を希釈液または染色液中に浮遊させた液体試
料は、細胞分析装置１ｏにおいて、チャンバー１２の上
部の入口１４から供給される。一方、チャンバー１２の
上方側面部の入口１６からは、生理食塩水または蒸留水
（以下これをシース液と呼ぶ〕が供給される。
料は、細胞分析装置１ｏにおいて、チャンバー１２の上
部の入口１４から供給される。一方、チャンバー１２の
上方側面部の入口１６からは、生理食塩水または蒸留水
（以下これをシース液と呼ぶ〕が供給される。
液体試料とシース液はともにチャンバー１２内を下方へ
流れ、角柱状の７０−セル１８に達する。
流れ、角柱状の７０−セル１８に達する。
フローセル１８中では、液体試料はシース液にさや状に
とり囲まれた形で流れ、いわゆるシース流が形成されて
いる。
とり囲まれた形で流れ、いわゆるシース流が形成されて
いる。
次に１本実施例の光学系について述べる。撮像用レーザ
ーパルス光源２０としては窒素レーザー。
ーパルス光源２０としては窒素レーザー。
半導体レーザーまたはＹＡＧレーザー等を使用する。第
１図において矢印は光線の進行方向を示す。
１図において矢印は光線の進行方向を示す。
撮像用レーザーパルス光源２ｏから発せられた光は、集
光レンズ２２で絞られ、その焦点はフローセル１８中に
おいてシース流の液体試料が流れる位置に結ばれる。こ
の点を以下撮像点３８と呼ぶ。
光レンズ２２で絞られ、その焦点はフローセル１８中に
おいてシース流の液体試料が流れる位置に結ばれる。こ
の点を以下撮像点３８と呼ぶ。
フローセル１８を透過したレーザー光は対物レンズ２４
に達する。
に達する。
レーザーパルス元り′−発せられたとき、液体試料中の
細胞が撮像点６８？：通過すると、その細胞の全体像が
ＣＣＤカメラ２６で撮像される。撮像された細胞の画像
は静止画像入力部２８へ送られ、システム制御・画像解
析部３ｏで画像処理され、解析される。
細胞が撮像点６８？：通過すると、その細胞の全体像が
ＣＣＤカメラ２６で撮像される。撮像された細胞の画像
は静止画像入力部２８へ送られ、システム制御・画像解
析部３ｏで画像処理され、解析される。
トリガー用光源３２を常時点灯させておき、フローセル
１８中を細胞が通過したことを細胞検出器６４で検知し
、細胞検知信号を発生させ、遅延回路６６でこの細胞検
知信号を一定時間遅延させたのち、撮像用レーザーパル
ス光源２０を発光させることによっても細胞を撮影する
ことができる。
１８中を細胞が通過したことを細胞検出器６４で検知し
、細胞検知信号を発生させ、遅延回路６６でこの細胞検
知信号を一定時間遅延させたのち、撮像用レーザーパル
ス光源２０を発光させることによっても細胞を撮影する
ことができる。
遅延回路５６は、細胞が細胞検出器５４で検知されてか
ら撮像点５８に達するまでフローセル１８中を流れろ時
間だげ撮像用レーザーパルス光源２゜の発光を遅延させ
るためのものである。また、細胞の大きさによって細胞
検出器５４で検知したパルスのパルス幅が異なるので、
目的とする大きさの細胞を検知したときのみ撮像用レー
ザパルス光源２０を発光させて、液体試料中の細胞を選
択的に撮像することもできる。なお、撮像用レーザーパ
ルス光源２０を一定の周期で連続的に発光させておくと
、液体試料中に存在する細胞の濃度に応じた確率で細胞
？とらえ撮影することができる。
ら撮像点５８に達するまでフローセル１８中を流れろ時
間だげ撮像用レーザーパルス光源２゜の発光を遅延させ
るためのものである。また、細胞の大きさによって細胞
検出器５４で検知したパルスのパルス幅が異なるので、
目的とする大きさの細胞を検知したときのみ撮像用レー
ザパルス光源２０を発光させて、液体試料中の細胞を選
択的に撮像することもできる。なお、撮像用レーザーパ
ルス光源２０を一定の周期で連続的に発光させておくと
、液体試料中に存在する細胞の濃度に応じた確率で細胞
？とらえ撮影することができる。
システム制御・画像解析部６０は、この細胞分析装置１
０の全体の動作を制御する働きもする。
０の全体の動作を制御する働きもする。
次に、トリガー用光源６２と細胞検出器６４を備えた実
施例につい″ｃ第２図に基いて詳細に説明する。
施例につい″ｃ第２図に基いて詳細に説明する。
１８は横断面が長方形をしたフローセルであり、光軸に
直交する最も肉厚の薄い所で約０．５ ａＪＲの肉厚に
なっており、さらにこのセルの内径は一辺が０．１〜０
．５龍、他辺は０．２〜ＩＩＩＬ１１である。これらの
寸法は分析対象の試料に応じて可変である。試料を注入
するノズル１９の内径は０．２〜０．５ｕに作られろ。
直交する最も肉厚の薄い所で約０．５ ａＪＲの肉厚に
なっており、さらにこのセルの内径は一辺が０．１〜０
．５龍、他辺は０．２〜ＩＩＩＬ１１である。これらの
寸法は分析対象の試料に応じて可変である。試料を注入
するノズル１９の内径は０．２〜０．５ｕに作られろ。
４０は可視光を発光する半導体レーザーであり、出力は
２〜２０ｍｗである。
２〜２０ｍｗである。
４２はコリメートレンズであり、光デイスク装置用とし
て市販されているものが利用できる。このレンズ４２は
開口数ＮＡが０．４５〜０．６であり、光ビームの断面
形状が楕円である平行光を出力する。
て市販されているものが利用できる。このレンズ４２は
開口数ＮＡが０．４５〜０．６であり、光ビームの断面
形状が楕円である平行光を出力する。
４４はコンデンサレンズＡであり、そのＦ数は６０より
小さく、焦点距離ｆｌｉｉｏ□以上のものである。この
コンデンサレンズＡ４４は微動位置調整装置（図示せず
）によって、フローセル１８の中心部付近に焦点を結ぶ
ように位置を調整される。
小さく、焦点距離ｆｌｉｉｏ□以上のものである。この
コンデンサレンズＡ４４は微動位置調整装置（図示せず
）によって、フローセル１８の中心部付近に焦点を結ぶ
ように位置を調整される。
４６はシリンダーレンズであり、第３図（ａｌ断面の形
状の放射パターンをｆｂｌ断面のように絞る。第３図ｆ
ｂｌ断面の寸法Ｓは、コンデンサレンズＡ４４（７）
Ｆ数で決まり、寸法ｔは、シリンダレンズ４６による非
点収差の量で決まる。細胞検出用とし℃は、Ｓ＝７〜２
０ 、ａｍ 、 ｔ＝１００−３００．ａｍが適当であ
る。
状の放射パターンをｆｂｌ断面のように絞る。第３図ｆ
ｂｌ断面の寸法Ｓは、コンデンサレンズＡ４４（７）
Ｆ数で決まり、寸法ｔは、シリンダレンズ４６による非
点収差の量で決まる。細胞検出用とし℃は、Ｓ＝７〜２
０ 、ａｍ 、 ｔ＝１００−３００．ａｍが適当であ
る。
上述の半導体レーザー４０．コリメートレンズ４２、：
ＩｆｆンデンサレンズＡ４４．シリンダーレンズ４６は
第１図におけるトリガー胴元源５２を構成している。
ＩｆｆンデンサレンズＡ４４．シリンダーレンズ４６は
第１図におけるトリガー胴元源５２を構成している。
４８ｉｉビームストツパであり５直接光を遮断し。
元軸に対して２度以上の範囲の前方散乱光を透過させる
。このような低角度前方散乱光の強度は細胞の大きさを
反映することが知られている。
。このような低角度前方散乱光の強度は細胞の大きさを
反映することが知られている。
５０はコレクタレンズであり５顕微鏡対物レンズの低倍
率のもの、すなわち４倍〜２０倍のものが使用されろ。
率のもの、すなわち４倍〜２０倍のものが使用されろ。
このコレクタレンズ５０は前方散乱光を後述のピンホー
ル５２の中心に集光する。
ル５２の中心に集光する。
５２はピンホールであり、ピンホール径は倍率やフロー
セル１８の厚さに応じてψ０．２〜ψ２ＩＬＭの間に選
ばれる。コレクタレンズ５０、および。
セル１８の厚さに応じてψ０．２〜ψ２ＩＬＭの間に選
ばれる。コレクタレンズ５０、および。
ピンホール５２は、ともに、微動位置調整装置（図示せ
ず）によって、その位置を調整されろ。コレクタレンズ
５０とピンホール５２０間の距離は、コレクタレンズ５
０に生物顕微鏡用対物レンズな使用する場合には約１５
０ジに、金属顕微鏡用対物レンズを使用する場合には約
２［］０朋にする。
ず）によって、その位置を調整されろ。コレクタレンズ
５０とピンホール５２０間の距離は、コレクタレンズ５
０に生物顕微鏡用対物レンズな使用する場合には約１５
０ジに、金属顕微鏡用対物レンズを使用する場合には約
２［］０朋にする。
マタフローセル１８とコレクタレンズ５００間の距離に
応じて、コレクタレンズ５０とピンホール５２の間の距
離は調整されろ。
応じて、コレクタレンズ５０とピンホール５２の間の距
離は調整されろ。
５４はフォトダイオードまたはピンフォトダイオードで
ある。このフォトダイオードまたはピンフォトダイオー
ド５４には逆バイアス電圧をかけ、接合容量を減少させ
ることにより素子の応等速度を上げている。このように
素子の応答速度を上げないと、細胞の通過が検知されて
から細胞が撮像点６８に達するまでにレーザーパルス光
源を発光させることｂ″−出来なくなることｂ″−ある
へ以上のコレクタレンズ５０．ピンホール５２、フォト
ダイオード５４が第１図におけろ細胞検出器５４の１部
に相当する、 ５６はパルスダイオードレーザ−であり、これにはたと
えば、浜松ホトニクス製Ｌ２３７６ （波長８９０ｎｍ
、出力１０Ｗ）また１ｆＳＡＮＤＥＲ８製ＧＡＡＰ−１
２（波長８７０〜９０４ｎｍ、出力１２Ｗ）を使用する
。
ある。このフォトダイオードまたはピンフォトダイオー
ド５４には逆バイアス電圧をかけ、接合容量を減少させ
ることにより素子の応等速度を上げている。このように
素子の応答速度を上げないと、細胞の通過が検知されて
から細胞が撮像点６８に達するまでにレーザーパルス光
源を発光させることｂ″−出来なくなることｂ″−ある
へ以上のコレクタレンズ５０．ピンホール５２、フォト
ダイオード５４が第１図におけろ細胞検出器５４の１部
に相当する、 ５６はパルスダイオードレーザ−であり、これにはたと
えば、浜松ホトニクス製Ｌ２３７６ （波長８９０ｎｍ
、出力１０Ｗ）また１ｆＳＡＮＤＥＲ８製ＧＡＡＰ−１
２（波長８７０〜９０４ｎｍ、出力１２Ｗ）を使用する
。
５８はコンデンサレンズＢであり、撮像用光源側の拡大
光学系を構成するものである。このコンデンサレンズＢ
５８の焦点位置Ｆは、第４図に示すように、パルスダイ
オードレーザ−５６から見てフローセル１８の中心位置
よりもやや遠方にある。すなわち、この焦点位［Ｆは、
ＣＣＤカメラ６４で撮像したとき、画面内に充分な大き
さで細胞の１象が得られるように設定される。また、コ
ンデンサレンズＢ５８と焦点位ｉＦとの間の距離ｑと、
パルスダイオードレーザ−５６とコンデンサレンズＢ５
８との間の距離Ｐとの間にはｑ／ｐ＞１０の関係がある
ことが望ましい。
光学系を構成するものである。このコンデンサレンズＢ
５８の焦点位置Ｆは、第４図に示すように、パルスダイ
オードレーザ−５６から見てフローセル１８の中心位置
よりもやや遠方にある。すなわち、この焦点位［Ｆは、
ＣＣＤカメラ６４で撮像したとき、画面内に充分な大き
さで細胞の１象が得られるように設定される。また、コ
ンデンサレンズＢ５８と焦点位ｉＦとの間の距離ｑと、
パルスダイオードレーザ−５６とコンデンサレンズＢ５
８との間の距離Ｐとの間にはｑ／ｐ＞１０の関係がある
ことが望ましい。
パルスダイオードレーザ−５６とコンデンサレンズＢ５
８はそれぞれ、第１図の撮像用レーザーパルス光源２０
および集光レンズ２２にはｙ相当する。
８はそれぞれ、第１図の撮像用レーザーパルス光源２０
および集光レンズ２２にはｙ相当する。
６０はコヒーレンシー低下用部品であり、たとえば、ス
リガラス、また（ま１元ファイバーの東が使用されろ。
リガラス、また（ま１元ファイバーの東が使用されろ。
６２は撮像用レンズであり１倍率２０倍〜４０倍の顕微
鏡用対物レンズが使用され、第１図の対物レンズ２４に
相当するものである。この撮像用レンズ６２も微動位置
調整装置（図示せず）によって、その位置を調整される
。
鏡用対物レンズが使用され、第１図の対物レンズ２４に
相当するものである。この撮像用レンズ６２も微動位置
調整装置（図示せず）によって、その位置を調整される
。
６４はＣＣＤカメラである。
次に、第２図におけるパルスダイオードレーザ−５６の
かわりに光源としてＮ２レーザー、ＹＡＧレーザ−、Ｎ
２／Ｄｙｅ ｖ−ザー、および、ＹＡＧレーザーと高調
波発振器との組合せ等を用いた場合の例′ｆ！Ｏ′第５
図に示す。この場合には、レーザー６６からの光が平行
であ石）ため第２図のコンデンサレンズＢ５８は必要と
せす、レーザー元をそのまま７０−セル１８へ投射する
。
かわりに光源としてＮ２レーザー、ＹＡＧレーザ−、Ｎ
２／Ｄｙｅ ｖ−ザー、および、ＹＡＧレーザーと高調
波発振器との組合せ等を用いた場合の例′ｆ！Ｏ′第５
図に示す。この場合には、レーザー６６からの光が平行
であ石）ため第２図のコンデンサレンズＢ５８は必要と
せす、レーザー元をそのまま７０−セル１８へ投射する
。
さらに、細胞検出のために第２図のように前方散乱光を
検出することに加えて側方散乱光も検出する様にした場
合を第３図に示す。この場合、６８はコレクタレンズで
あり、側方散乱光を検出する。
検出することに加えて側方散乱光も検出する様にした場
合を第３図に示す。この場合、６８はコレクタレンズで
あり、側方散乱光を検出する。
前方散乱光に合わせて側方散乱光を検出する様にしたこ
とにより、細胞検出をより確実に、かつ。
とにより、細胞検出をより確実に、かつ。
多用途に実施できる。なぜならば、側方散乱光は細胞の
大きさと細胞の表面または内部状態を反映するため、細
胞の大きさを主として反映する前方散乱光のみを検出す
る場合よりも情報量ｂ″−−増大細胞の通過をより確実
に検知できるものとなる。
大きさと細胞の表面または内部状態を反映するため、細
胞の大きさを主として反映する前方散乱光のみを検出す
る場合よりも情報量ｂ″−−増大細胞の通過をより確実
に検知できるものとなる。
さらに、細胞の表面または内部状態を反映した情報が得
られろため、細胞の大きさだけでは識別できなかった細
胞の種類を正確に判定できるようになり、必要とする種
類の細胞の通過時のみ撮像することも可能となる。
られろため、細胞の大きさだけでは識別できなかった細
胞の種類を正確に判定できるようになり、必要とする種
類の細胞の通過時のみ撮像することも可能となる。
次に、本実施例の細胞分析装置１０の光学分解能と、細
胞が静止画像として捉えられるためのシース流の流速の
限界に関して窒素レーザーを使用した場合について述べ
る。
胞が静止画像として捉えられるためのシース流の流速の
限界に関して窒素レーザーを使用した場合について述べ
る。
窒素レーザーは波長５５７．１ｎｍ、パルス幅約１（］
ｎＳの強力な（ピーク出カニ１［］［］ＫＷ以上のもの
がある）パルス発振が得られるものである。
ｎＳの強力な（ピーク出カニ１［］［］ＫＷ以上のもの
がある）パルス発振が得られるものである。
レーザー光以外では、このように短いパルス幅でしかも
強力な元を発することはできない。また、窒素レーザー
は紫外光であるため、以下に述べろ様に分解能に優れて
いる。
強力な元を発することはできない。また、窒素レーザー
は紫外光であるため、以下に述べろ様に分解能に優れて
いる。
分解能δは、対物レンズの開口数ＮＡと 光の波長λと
で決り、 δ＝λ／ＮＡ の式が成り立つ。本実施例では、対物レンズ２４の開口
数ＮＡは０．８５であったので、分解能δはδ＝λ／Ｎ
Ａ＝５５７．１１０．８５＝５９６．６Ｃｎｍｌとなり
、約［１，４，ａｍである。
で決り、 δ＝λ／ＮＡ の式が成り立つ。本実施例では、対物レンズ２４の開口
数ＮＡは０．８５であったので、分解能δはδ＝λ／Ｎ
Ａ＝５５７．１１０．８５＝５９６．６Ｃｎｍｌとなり
、約［１，４，ａｍである。
−万、窒素レーザーのパルス幅へｘ％！約１０ｎｓであ
り、分解能が約Ｑ、４．ａｍであるから、細胞が静止画
像として見られるための７−ス流の最高流速Ｖは、 ■＝δ／４Ｘ ＝ ０．４０ Ｘ １０＝／１０ＸＩ
Ｏｏ−９＝４０（／Ｓ）となる。すなわち、約６ｍ７ｓ
以下の速度で細胞を流せば、静止画像を得ることができ
る。
り、分解能が約Ｑ、４．ａｍであるから、細胞が静止画
像として見られるための７−ス流の最高流速Ｖは、 ■＝δ／４Ｘ ＝ ０．４０ Ｘ １０＝／１０ＸＩ
Ｏｏ−９＝４０（／Ｓ）となる。すなわち、約６ｍ７ｓ
以下の速度で細胞を流せば、静止画像を得ることができ
る。
しかし、余り流速を速（［７すぎるとシース流が乱れる
ので、実際には流速は約６ｍ７ｓ以下としなければなら
ない。
ので、実際には流速は約６ｍ７ｓ以下としなければなら
ない。
次に、本実施例の細胞分析装置１０を使用して健常人の
白血球を撮像し、得られた画像から白血球ラグループ分
けした例を示す。
白血球を撮像し、得られた画像から白血球ラグループ分
けした例を示す。
まず、細胞内の顆粒等の状態を良く認識できろように白
血球を染色する。ここでの染色方法は、塗抹方式では乾
燥された血液に染色するのに対し。
血球を染色する。ここでの染色方法は、塗抹方式では乾
燥された血液に染色するのに対し。
採血した血液を生きたままの状態で染色することに特色
がある。
がある。
細胞の染色および希釈方法は以下のとおりである。
ａ、蒸留水ＩＣＨに対し、ギムザ染色液１滴を加えてギ
ムザ希釈液を作る。
ムザ希釈液を作る。
ｂ、ギムザ希釈液と血液原液を４対１の割合で混合し、
時々攪拌しなり−ら５０分程度染色する。
時々攪拌しなり−ら５０分程度染色する。
上記の方法（この方法を以下、超生体染色法と呼ぶ）で
作成された試料は細胞分析装置１０へ入口１４から流し
込まれる。撮像点５８を通過中の細胞、のｒ象はＣＣＤ
カメラ２６により捉えられ、静止画像入力部２８を介し
てシステム制御・画像処理部５０へ送られる。得られた
画像には、ちらつきや雑音の除去のための処理が施され
る。
作成された試料は細胞分析装置１０へ入口１４から流し
込まれる。撮像点５８を通過中の細胞、のｒ象はＣＣＤ
カメラ２６により捉えられ、静止画像入力部２８を介し
てシステム制御・画像処理部５０へ送られる。得られた
画像には、ちらつきや雑音の除去のための処理が施され
る。
上記の様にして得られた白血球画像は、４つのグループ
に分けられる。表１は各グループの特徴と出現率を示し
たものである。第７図ａｍｄは、各グループの画像を示
したものである。画像の一辺は、グループＡ、グループ
Ｃ，グループＤ ６−約５０、”’＋グループＢｂ−約
１５μｍであ；ｂ。
に分けられる。表１は各グループの特徴と出現率を示し
たものである。第７図ａｍｄは、各グループの画像を示
したものである。画像の一辺は、グループＡ、グループ
Ｃ，グループＤ ６−約５０、”’＋グループＢｂ−約
１５μｍであ；ｂ。
表 １ フロ一方式で得られた白血球画像の特徴これ
らの白血球画像につき、メイ・ギムザ複合染色を施した
塗抹標本や超生体染色を施した血液をスライドグラスに
採りカバーガラスで封じて作成した標本の顕微鏡観察に
よる白血球画イ象と比較した結果、グループＡは好中球
、グループＢはリンパ球、グループＣは単球、グループ
Ｄは好酸球および好塩基球であると同定された。
らの白血球画像につき、メイ・ギムザ複合染色を施した
塗抹標本や超生体染色を施した血液をスライドグラスに
採りカバーガラスで封じて作成した標本の顕微鏡観察に
よる白血球画イ象と比較した結果、グループＡは好中球
、グループＢはリンパ球、グループＣは単球、グループ
Ｄは好酸球および好塩基球であると同定された。
したがって、本実施例の装置により、白血球細胞を撮像
し、さらに、得られた白血球の画像を解析し、この白血
球の大きさと顆粒の状態を認識することにより１表１に
示す特徴に基いて白血球を各種細胞へ分類・同定するこ
とができる。
し、さらに、得られた白血球の画像を解析し、この白血
球の大きさと顆粒の状態を認識することにより１表１に
示す特徴に基いて白血球を各種細胞へ分類・同定するこ
とができる。
次に、本実施例装置におけろフローセルの流れの中の赤
血球を撮像した例を第８図に示す。図中の周辺のリング
伏の縞は、赤血球による回折縞である。この回折縞が赤
血球の画像解析にとって妨げとなる場合（ては、レーザ
ー光のコヒーレンスを低下させて回折現象を弱めてやれ
ばよい。そのためには１例えば、集光レンズ２２と７０
−セル１８の間にすりガラスを配置することが適当であ
る。
血球を撮像した例を第８図に示す。図中の周辺のリング
伏の縞は、赤血球による回折縞である。この回折縞が赤
血球の画像解析にとって妨げとなる場合（ては、レーザ
ー光のコヒーレンスを低下させて回折現象を弱めてやれ
ばよい。そのためには１例えば、集光レンズ２２と７０
−セル１８の間にすりガラスを配置することが適当であ
る。
（発明の効果）
本発明によれば以下に述べる様な特有の効果が得られる
。
。
（１）レーザーパルス光源を使用しているため、パルス
幅が極めて短くなり、この結果流れの中の細胞の静止画
像が容易に得られろ。
幅が極めて短くなり、この結果流れの中の細胞の静止画
像が容易に得られろ。
（２） この静止画像を解析することにより、細胞の
形状や内部状態につい℃の情報を得ろことｂ−できる。
形状や内部状態につい℃の情報を得ろことｂ−できる。
（３） スライドグラス上の細胞の顕微鏡観察では得
られなかった流れの中に存在するときの細胞の形態が直
接に観察できろ。
られなかった流れの中に存在するときの細胞の形態が直
接に観察できろ。
（４）装置に使用されたフローセルが製作しやすい角柱
状の極めて単純な形状のものである。また細胞通過の検
出を行い撮像用レーザーパルス光源の発光を制御する場
合にも、撮像胴元学系の上部に細胞検出用光学系を備え
ろだけでよいので、本発明による装置（家構造が非常に
簡単であり、製造ｂ１窃易であるとともにその保守およ
び調整がしやすい。
状の極めて単純な形状のものである。また細胞通過の検
出を行い撮像用レーザーパルス光源の発光を制御する場
合にも、撮像胴元学系の上部に細胞検出用光学系を備え
ろだけでよいので、本発明による装置（家構造が非常に
簡単であり、製造ｂ１窃易であるとともにその保守およ
び調整がしやすい。
第１図は、本発明による細胞分析方法を実施する装置の
一実施例を示す概略図。 第２図は、本発明による細胞分析装置において半導体レ
ーザーを使用した一実施例の光学系の説明図、 第３図は、第２図の実施例の細胞検出系における光放射
パターンを示す説明図、 第４図は、第２図の実施例の撮像用光源側の拡大光学系
を示す説明図、 第５図は１本発明による細胞分析装置において、撮像用
光源としてＮ２レーザー等を使用した一実施例の光学系
の部分説明図、 第３図は、第２図の実施例に側方散乱光検出系を加えた
場合の光学系の部分説明図、 第７図＋ａｌな（・しｆｄｌは白血球細胞の４つのグル
ープの撮像写真、 第８図は赤血球Ｑ）撮像写真を示すものである。 図中： １０・・・細胞分析装置、 １２・・・チャンバー。 １４・・・試料入口、 １６・・・シース液入口、１８
・・・フローセル、 ２０・・・描像用レーザーパルス
光源、 ２２・・・集光レンズ、２４・・・対物レンズ
。 ２６・・・ＣＣＤカメラ、２８・・・静止画像入力部、
５０・・・システム制菌・画像解析部、 ６２・・・
トリガー用光源、 ３４・・・細胞検出器、 ６６・・
・遅延回路、 ろ８・・・撮像点。 第１図 第２図 第４図 図面の浄書（内容に変更なし） 第 ７ 図 ＜ａ） グループＡ （ｂン ′Ｐ′ループ′ Ｂ 図面の浄１１１（内容に変更なし） ′Ｊ！−，７凹 （Ｃ） ゲル〜ブＣ （ｄ； ゲループＤ 図面の浄書（内容に変更なし） 妻ア８ 図 手続補正書（方式） ％式％ 流体中の細胞分析方法および装置 ６、補正をする者 事件との関係 出 願 人 住所 名 称 東亜医用電子株式会社 ４、代理人 ５補正命令の日付 昭和６２年 １月２７日（発送日
）６補正の対象 明細書の図面の簡単な説明の欄 （１１明細書第２１頁９行目「の撮像写真」を［の細胞
粒子の構造の撮像写真ｊと訂正する。 ２）明細書第２１頁１０行目「の撮像写真」を１の細胞
粒子の構造の撮像写真」と訂正する。
一実施例を示す概略図。 第２図は、本発明による細胞分析装置において半導体レ
ーザーを使用した一実施例の光学系の説明図、 第３図は、第２図の実施例の細胞検出系における光放射
パターンを示す説明図、 第４図は、第２図の実施例の撮像用光源側の拡大光学系
を示す説明図、 第５図は１本発明による細胞分析装置において、撮像用
光源としてＮ２レーザー等を使用した一実施例の光学系
の部分説明図、 第３図は、第２図の実施例に側方散乱光検出系を加えた
場合の光学系の部分説明図、 第７図＋ａｌな（・しｆｄｌは白血球細胞の４つのグル
ープの撮像写真、 第８図は赤血球Ｑ）撮像写真を示すものである。 図中： １０・・・細胞分析装置、 １２・・・チャンバー。 １４・・・試料入口、 １６・・・シース液入口、１８
・・・フローセル、 ２０・・・描像用レーザーパルス
光源、 ２２・・・集光レンズ、２４・・・対物レンズ
。 ２６・・・ＣＣＤカメラ、２８・・・静止画像入力部、
５０・・・システム制菌・画像解析部、 ６２・・・
トリガー用光源、 ３４・・・細胞検出器、 ６６・・
・遅延回路、 ろ８・・・撮像点。 第１図 第２図 第４図 図面の浄書（内容に変更なし） 第 ７ 図 ＜ａ） グループＡ （ｂン ′Ｐ′ループ′ Ｂ 図面の浄１１１（内容に変更なし） ′Ｊ！−，７凹 （Ｃ） ゲル〜ブＣ （ｄ； ゲループＤ 図面の浄書（内容に変更なし） 妻ア８ 図 手続補正書（方式） ％式％ 流体中の細胞分析方法および装置 ６、補正をする者 事件との関係 出 願 人 住所 名 称 東亜医用電子株式会社 ４、代理人 ５補正命令の日付 昭和６２年 １月２７日（発送日
）６補正の対象 明細書の図面の簡単な説明の欄 （１１明細書第２１頁９行目「の撮像写真」を［の細胞
粒子の構造の撮像写真ｊと訂正する。 ２）明細書第２１頁１０行目「の撮像写真」を１の細胞
粒子の構造の撮像写真」と訂正する。
Claims (4)
- （１）シース流中の細胞の流れる部分に撮像用レーザー
パルス光源からの光線の焦点を結ばせる段階と、該焦点
領域を通過する細胞を前記光線で照射する段階と、前記
細胞の静止画像を対物レンズおよびＣＣＤカメラで撮像
する段階と、得られた画像を処理し、解析する段階と、
かくして解析された前記細胞の形状および内部状態とに
関する情報から前記細胞を分析することを特徴とする流
体中の細胞分析方法。 - （２）シース流の流れるフローセルと、撮像用レーザー
パルス光源と、該撮像用レーザーパルス光源から発せら
れた光を集光する集光レンズと、かくして集光された光
を前記シース流中を流れる細胞に照射したときの静止画
像を撮像するための対物レンズおよびＣＣＤカメラと、
得られた静止画像を処理し解析する画像処理部と、によ
つて構成されたことを特徴とする流体中の細胞分析装置
。 - （３）常時点灯されたトリガー用光源と、該トリガー用
光源からの光線を細胞が横切つたことを検知して細胞検
知信号を発する細胞検出器と、前記細胞検知信号を一定
時間遅延せしめて撮像用レーザーパルス光源へ送る遅延
回路と、を備えたことを特徴とする特許請求の範囲第２
項記載の流体中の細胞分析装置。 - （４）前記集光レンズと前記フローセルとの間に前記撮
像用レーザーパルス光のコヒーレンスを低下せしめる部
材を配置して成ることを特徴とする特許請求の範囲第２
項または第３項記載の流体中の細胞分析装置。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61238827A JPH073419B2 (ja) | 1986-10-07 | 1986-10-07 | 流体中の細胞分析方法および装置 |
| DE3705876A DE3705876C2 (de) | 1986-10-07 | 1987-02-24 | Verfahren und Vorrichtung für Fließcytometrie |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61238827A JPH073419B2 (ja) | 1986-10-07 | 1986-10-07 | 流体中の細胞分析方法および装置 |
Related Child Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6079137A Division JP2835692B2 (ja) | 1994-03-10 | 1994-03-10 | 流体中の粒子分析装置 |
| JP7354790A Division JP2869422B2 (ja) | 1995-12-28 | 1995-12-28 | 流体中の粒子分析装置 |
| JP7354791A Division JP2869423B2 (ja) | 1995-12-28 | 1995-12-28 | 流体中の粒子分析装置 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6394156A true JPS6394156A (ja) | 1988-04-25 |
| JPH073419B2 JPH073419B2 (ja) | 1995-01-18 |
Family
ID=17035858
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61238827A Expired - Lifetime JPH073419B2 (ja) | 1986-10-07 | 1986-10-07 | 流体中の細胞分析方法および装置 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH073419B2 (ja) |
| DE (1) | DE3705876C2 (ja) |
Cited By (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0255953A (ja) * | 1988-08-19 | 1990-02-26 | Toa Medical Electronics Co Ltd | 粒子の自動識別処理装置 |
| DE4437758A1 (de) * | 1993-10-21 | 1995-04-27 | Hitachi Ltd | Bildanalyseverfahren und -vorrichtung für Strömungspartikel |
| EP0556971A3 (en) * | 1992-02-18 | 1995-08-09 | Hitachi Ltd | An apparatus for investigating particles in a fluid, and a method of operation thereof |
| EP0679889A3 (en) * | 1994-04-25 | 1996-03-06 | Hitachi Ltd | Method and device for analyzing particle images. |
| US5521699A (en) * | 1993-07-26 | 1996-05-28 | Toa Medical Electronics Co., Ltd. | Imaging flow cytometer and imaging method having plural optical paths of different magnification power |
| US5561517A (en) * | 1993-09-17 | 1996-10-01 | Hitachi, Ltd. | Method and apparatus for flow type particle image analysis using a pulse light emitted at any of an odd and even image field reading-out period |
| US5585469A (en) * | 1993-10-08 | 1996-12-17 | Hitachi, Ltd. | Dyeing agent having at least two dyes for staining a biological sample and staining method employing the dyeing agent |
| US5768412A (en) * | 1994-09-19 | 1998-06-16 | Hitachi, Ltd. | Region segmentation method for particle images and apparatus thereof |
| US5824269A (en) * | 1994-12-26 | 1998-10-20 | Toa Medical Electronics Co., Ltd. | Flow cytometer |
| US5878160A (en) * | 1995-02-01 | 1999-03-02 | Hitachi, Ltd. | Flow type particle image analyzing method and apparatus for displaying particle images by classifying them based on their configurational features |
| US5911002A (en) * | 1995-09-27 | 1999-06-08 | Hitachi, Ltd. | Pattern recognition system |
| US6365106B1 (en) * | 1999-01-21 | 2002-04-02 | Sysmex Corporation | Sheath flow cell and blood analyzer using the same |
| US6549661B1 (en) | 1996-12-25 | 2003-04-15 | Hitachi, Ltd. | Pattern recognition apparatus and pattern recognition method |
| JP2010151523A (ja) * | 2008-12-24 | 2010-07-08 | Hitachi High-Technologies Corp | 粒子画像解析方法および装置 |
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