DE3705876C2 - Verfahren und Vorrichtung für Fließcytometrie - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft Fließcytometrie derjenigen Art, bei welcher ein feststehendes Bild von Zellen wie bei­ spielsweise Hämocyten oder Blutkörperchen in einem Fluß von Flüssigkeit erhalten und analysiert wird. Die Er­ findung betrifft auch eine Vorrichtung zum Durchführen von Fließcytometrie dieser Art.

Ein übliches Verfahren zum Prüfen von Zellen umfaßt das Färben einer Schmiere der Zellen auf einem Glasgleit­ stück und das Beobachten der Zellen unter einem Mikro­ skop. Beim Ausführen dieses Verfahrens werden zwei Pro­ bleme angetroffen. Zuerst ist es, bevor die Zellen unter dem Mikroskop betrachtet werden, erforderlich, daß eine komplizierte Arbeitsweise durchgeführt wird, um die Probe vorzubereiten, und diese Arbeitsweise umfaßt das Verschmieren oder Verstreichen, Festlegen und Färben der Zellen. Zweitens können, wenn Zellen wie Hämocyten in einer fließenden Flüssigkeit wie beispielsweise Blut vorhanden sind, diese Zellen, wenn sie in einem leben­ den Körper vorhanden sind, mit dem bekannten Verfahren nur in stillstehendem Zustand beobachtet oder betrachtet werden, so daß diese Verfahren keine genaue Anzeige der originalen Zellenmorphologie darstellt.

Neuerdings sind verschiedene Versuche unternommen worden, das mikroskopische Bild von Teilchen in einem Fluß zu fotografieren. Beispielsweise ist in der Veröffentlichung "The Journal of Histochemistry and Cytochemistry", Bd. 27, Nr. 1, Seite 335 (1979) von V. Kachel usw. ein Verfahren beschrieben, bei welchem ein stillstehendes Bild von Teil­ chen erhalten wird durch Befördern einer Suspension die­ ser Teilchen durch eine Öffnung, das Feststellen des Be­ förderns der Teilchen durch die Öffnung durch die Änderung einer elektrischen Impedanz bzw. eines elektrischen Wider­ standes zu dem betreffenden Zeitpunkt, das Auslösen einer Blinklampe zum Zeitpunkt des Feststellens der Teilchen, und durch gleichzeitiges Fotografieren der Teilchen. Wei­ terhin ist den Beschreibungen der japanischen Patentver­ öffentlichung Nr. 57-500 995 (Übersetzung der PCT-Schrift WO 81/03 224 A1) und der offengelegten japa­ nischen Patentanmeldung Nr. 58-76 740 ein Verfahren zu entnehmen zum Erhalten eines stillstehenden Bildes von Teilchen in einem Flüssigkeitsfluß, wobei eine Flüssig­ keitsprobe durch einen Durchgang fließen gelassen wird, und ein Strobe oder Strich an einem festen Kreislauf in einem Bildbereich ausgelöst wird und gleichzeitig die Teilchen mit einer CCD-Kamera fotografiert werden.

Diese Versuche, eine mikroskopisches Bild von Teilchen in einem Fluß zu fotografieren, umfassen eine Anzahl von Problemen und Nachteilen. Das Kachel-Verfahren erfordert das Kombinieren von widerstandsbehafteten und optischen Feststell- bzw. Detektionsprinzipien, und es erfordert daher eine Detektorausführung, die strukturell komplex und schwierig einzustellen ist. In ähnlicher Weise be­ ruht das Verfahren gemäß der japanischen Patentveröffent­ lichung 57-500 995 auf einer strukturell komplizierten Fließzelle zum Bilden des Bildbereiches, und zusätzliche Komplikationen werden angetroffen beim Erzeugen des Probenflusses. Weiterhin verwenden beide Verfahren eine Blinklampe bzw. ein Strobelicht (Stroboskop), welches bekannt ist, um einen strahlenden Lichtimpuls vergleichs­ weise großer Impulsbreite zu senden bzw. zu liefern. Um ein stillstehendes Bild zu erhalten, kann daher die Fließ­ geschwindigkeit der die interessierenden Teilchen tragen­ den Probe nicht sehr hoch gemacht werden. Dies führt zu einer Begrenzung der Verarbeitungskapazität oder Behand­ lungskapazität des Systems.

Keines der vorgenannten Verfahren befaßt sich mit Bild­ analyse der inneren Zellenstruktur und mit der Ausnutzung der Informationen, die erhalten werden können. Daher sind diese Verfahren nicht nur nicht in der Lage, echte Cyto­ metrie möglich zu machen, sondern sie sind auch für einen solchen Zweck nicht gestaltet.

Aus der DE 31 41 984 A1 ist ein Verfahren zum Untersuchen einer flüssigen Probe auf Teilchen, insbesondere einer Urinprobe, auf darin enthaltene Sedimente bekannt, bei dem die flüssige Probe einem Flüssigkeitsstrom zugeführt wird, der mittels einer Küvette durch den Beobachtungsbereich eines Mikroskopes geführt wird. Der Beobachtungsbereich wird dabei von einer Stroboskoplampe beleuchtet, so daß stehende Bilder der Probe aufgenommen werden können, die nach Umwandlung in elektronische Bilder einer weiteren Verarbeitung unterzogen werden können.

Aus der DE 35 31 969 A1 ist eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Erfassung und Klassifizierung von Teilchen mit Hilfe von Techniken der Durchflußzytometrie bekannt, bei dem ein von einer Mantelflüssigkeit eingehüllter Teilchenstrom von einer Lichtquelle, z. B. einer Laserlichtquelle oder einer Bogenlampe, beleuchtet wird. Der beleuchtete Bereich des Teilchenstroms wird mit geeigneten Detektoren beobachtet, um an den Teilchen gestreutes Licht sowie Fluoreszenzlicht zu erfassen. Die Ausgangssignale der Detektoren werden dann in einer elektronischen Schaltung des Geräts verarbeitet.

Ferner ist aus der DE 34 42 568 A1 ein Verfahren zum kontinuierlichen und automatischen Identifizieren, Sortieren und Zählen von Teilchen kleiner Abmessungen bekannt, bei dem einzelne Proben vorbereitet und auf einen kontinuierlich sich verschiebenden Träger kontinuierlich aufgebracht werden. Anschließend werden von den Proben mittels eines eine Videokamera enthaltenden Mikroskops Bilder aufgenommen, die dann unter Verwendung von Mustererkennungstechniken verarbeitet werden. Das Aufbringen der Probe erfolgt dabei z. B. durch Aufsprühen. Bei diesem bekannten Verfahren, das sich insbesondere für die Suche von Bakterien in Milch und die Suche von Parasiten in Blut eignet, ist eine Vorbereitung, z. B. ein Färben der Probe, erforderlich.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum Analysieren von Zellen in einem Fluß zu schaffen, das einfach durchzuführen ist. Ferner soll eine Vorrichtung zur Durchführung des genannten Verfahrens geschaffen werden, die strukturell einfach und bequem zu warten und einzustellen ist.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1 und durch eine Vorrichtung mit den Merkmalen des Anspruchs 6 gelöst. Vorteilhafte Aus- und Weiterbildungen ergeben sich aus den Unteransprüchen.

Das Licht, das von der fotografischen Impulslichtquelle, die vorzugsweise eine Laserimpulslichtquelle sein kann, ausgesendet wird, hat eine im großen Ausmaß verringerte Impulsbreite, so daß ein stillstehendes Bild der Zellen in dem Fluß erhalten werden kann. Das stillstehende Bild der Zellen wird einer Analyse unterworfen, um Informationen betreffend der Zellengestalt und dem inneren Zustand der Zellen zu erhalten. Diese Informationen werden dazu verwendet, die fotografierten Zellen richtig zu identifizieren und zu analysieren, so daß genaue Zytometrie im On-Line-Verfahren verwirklicht werden kann.

Die Erfindung hat insbesondere folgende Vorteile:

• 1. Insbesondere bei Verwendung einer Laserimpulslichtquelle kann die Impulsbreite sehr klein gemacht werden. Dies macht es einfach, ein stillstehendes Bild von Zellen in einem Fluß zu erhalten.
• 2. Informationen betreffend die Gestalt und den inneren Zustand einer Zelle können durch Analysieren des stillstehenden Bildes erhalten werden.
• 3. Die Morphologie von Zellen, die sich in einem fließenden Zustand befinden, kann direkt beobachtet werden. Die morphologische Information, die auf diese Weise erhalten wird, kann durch mikroskopische Betrachtung von Zellen auf einem Glasträger nicht erhalten werden.
• 4. Die in der Vorrichtung verwendete Fließzelle ist von sehr einfacher prismatischer Gestalt und kann daher bequem hergestellt werden. Wenn der Durchgang von Zellen durch die Fließzelle festgestellt werden soll und das von der Bildaufnahme-Impulslichtquelle ausgesandte Licht gesteuert werden soll, reicht es aus, ein optisches System für Zellenfeststellung über dem bildaufnahme­ optischen System vorzusehen. Die Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung ist daher von sehr einfacher Ausführung und kann bequem hergestellt, gewartet und eingestellt werden.

Die Erfindung wird nachstehend anhand der Zeichnung beispielsweise erläutert.

Fig. 1 ist ein Blockdiagramm einer Ausführungsform einer Vorrichtung zum Ausführen von Fließcytometrie gemäß der Erfindung.

Fig. 2 ist eine Ansicht, die zum Beschreiben eines opti­ schen Systems in einer Ausführungsform nützlich ist, bei welcher ein Halbleiterlaser in der Vorrichtung für Fließcytometrie gemäß der Erfindung verwendet wird.

Fig. 3 ist eine schaubildliche Ansicht eines Lichtstrahl­ musters in einem Zellenfeststellsystem gemäß Fig. 2.

Fig. 4 ist eine Ansicht, die beim Beschreiben eines opti­ schen Vergrößerungssystems auf der Seite einer fotogra­ fischen Lichtquelle gemäß Fig. 2 nützlich ist.

Fig. 5 ist eine Ansicht, die beim Beschreiben eines op­ tischen Systems in einer Ausführungsform nützlich ist, bei der ein N₂-Laser oder dgl. als eine Bildaufnahme- Lichtquelle in der Vorrichtung für Fließcytometrie gemäß der Erfindung verwendet wird.

Fig. 6 ist eine Ansicht, die beim Beschreiben eines op­ tischen Systems nützlich ist, bei welchem die Ausführungs­ form gemäß Fig. 2 zusätzlich vorgesehen ist mit einem System zum Feststellen von Seitenstreulicht.

Fig. 7A bis 7D sind Fotografien von vier Gruppen von weißen Blutzellen, aufgenommen gemäß der Erfindung.

Fig. 8 ist eine Fotografie einer roten Blutzelle, aufge­ nommen gemäß der Erfindung.

Eine Ausführungsform der Erfindung wird nachstehend in Verbindung mit Fig. 1 im einzelnen beschrieben.

Eine Vorrichtung 10 für Fließcytometrie gemäß der Erfin­ dung umfaßt eine Kammer 12, deren oberer Teil einen Ein­ laß 14 zum Zuführen einer flüssigen Probe besitzt, in der Zellen in einem Verdünnungsmittel oder in einer Farblösung frei schweben. Am oberen Teil der Kammer 12 ist weiterhin in deren Seitenwand ein Einlaß 16 vorge­ sehen, über welchen eine physiologische Salzlösung oder destilliertes Wasser zugeführt wird (nachstehend als "Mantellösung" bezeichnet).

Die flüssige Probe und die Mantellösung fließen in der Kammer 12 nach unten und erreichen eine Fließzelle 18 prismatischer Gestalt. In der Fließzelle 18 fließt die flüssige Probe in einem Zustand, in welchem sie von der Mantellösung umhüllt ist. Dies wird als ummantelter Strom oder ummantelter Fluß bezeichnet. Das bei der dar­ gestellten Ausführungsform verwendete optische System umfaßt einen Stickstofflaser, einen Halbleiterlaser oder einen YAG-Laser als eine Bildaufnahme-Laserimpulslicht­ quelle 20. Der Lichtstrahl von der Lichtquelle 20 be­ wegt sich in der durch einen Pfeil angegebenen Richtung vorwärts. Das von der Lichtquelle 20 ausgesendete Licht wird mittels einer Kondensorlinse 22 derart fokussiert, daß der Brennpunkt an einer Stelle an der Fließzelle 18 gebildet wird, durch welche die ummantelte flüssige Probe fließt. Nachstehend wird diese Position als "Bildpunkt" bezeichnet, der mit 38 bezeichnet ist. Das Laserlicht, welches durch die Fließzelle 18 hindurchgeht, trifft auf eine Objektivlinse 24 auf.

Wenn eine Zelle in der flüssigen Probe an dem Bildpunkt 38 vorbeigeht, wird das Gesamtbild der Zelle von einer CCD-Kamera 26 aufgenommen, wenn der Laserimpuls von der Quelle 20 ausgesendet wird. Die CCD-Kamera 26 liefert das Bild der Zelle an eine Eingangseinheit 28 für das stillstehende Bild, welches das Signal an einen System­ kontroller und Bildanalysator 30 als Eingang liefert, wo das Bild verarbeitet und analysiert wird.

Eine Triggerlichtquelle 32 kann die Fließzelle 18 dauernd anleuchten, so daß der Durchgang einer Zelle durch die Fließzelle 18 von einem Zellensensor 34 fest­ gestellt werden kann, wobei der letztere beim Feststel­ len einer Zelle ein Impulssignal erzeugt. Ein Verzöge­ rungsstromkreis 36 verzögert das Impulssignal um eine bestimmte Zeitperiode, während welcher die Zelle durch Aussenden des Laserimpulses von der Laserimpulslicht­ quelle 20 fotografiert werden kann. Der Zweck des Ver­ zögerungsstromkreises 36 besteht darin, das Aussenden des Laserimpulses von der Laserimpulslichtquelle 20 für eine Zeit zu verzögern entsprechend der Geschwindig­ keit des Fließens durch die Fließzelle, d. h. für eine Zeitperiode von dem Feststellen der Zelle durch den Zellensensor 34 bis zu dem Zeitpunkt, zu welchem die Zelle den Bildpunkt 38 erreicht. Da die Impulsbreite des von dem Zellensensor 34 ausgesendeten Signals sich in Abhängigkeit von der Größe der festgestellten Zelle ändert, können die in dem Fluß der flüssigen Probe ent­ haltenen Zellen wahlweise festgestellt werden, indem die Lichtquelle 20 einen Laserimpuls nur dann sendet, wenn Zellen festgestellt werden, deren Größe von Interesse ist. Es ist zu bemerken, daß, wenn die Licht­ quelle 20 Laserlicht kontinuierlich in einem festen Kreis­ lauf aussenden kann, die Wahrscheinlichkeit, daß Zellen fotografiert werden, der Konzentration der in dem Fluß der flüssigen Probe vorhandenen Zellen entspricht. Der Systemkontroller und Bildanalysator 30 kann das Arbeiten der Vorrichtung 10 insgesamt steuern.

Nachstehend werden die Triggerlichtquelle 32 und der Zellensensor 34 in Verbindung mit Fig. 2 im einzelnen erläutert.

Bei einer in Fig. 2 dargestellten bevorzugten Ausführungs­ form hat die Fließzelle 18 einen rechteckigen Querschnitt, eine Dicke von etwa 0,3 mm am dünnsten Teil rechtwinklig zur optischen Achse, und einen Durchmesser von 0,1 bis 0,5 mm auf einer Seite und von 0,2 bis 1,0 mm auf der anderen Seite. Diese Abmessungen können in Abhängigkeit von der zu analysierenden Probe geändert werden. Die Fließzelle 18 umfaßt eine Düse 19 zum Injizieren der Probe. Die Düse 19 hat einen Innendurchmesser von 0,2 bis 0,5 mm.

Mit dem Bezugszeichen 40 ist ein Halbleiterlaser zum Aussenden sichtbaren Lichtes bezeichnet, und die Ener­ gie des Lasers beträgt 2 bis 20 mW. Der Halbleiterlaser 40 ist mit einer Kollimatorlinse 42 versehen, die von einer Art sein kann, die auf dem Markt verfügbar ist zur Verwendung in Vorrichtungen mit optischen Scheiben. Die Linse 42 hat eine numerische Öffnung NA von 0,45 bis 0,6 und sie liefert paralleles Licht, dessen Strahl­ querschnitt elliptische Gestalt hat. Eine Kondensorlinse 44 hat eine Blendenzahl von kleiner als 30 und eine Brennlänge f von mehr als 10 mm. Die Kondensorlinse 44 ist mit einer Feineinstelleinrichtung (nicht dargestellt) versehen, mittels welcher die Position der Linse derart eingestellt wird, daß ihr Brennpunkt nahe dem Zentrum der Fließzelle 18 gebildet wird. Eine Zylinderlinse 46 wirkt dahingehend, ein Lichtstrahlmuster mit einer Querschnittsgestalt,wie sie in Fig. 3 bei (a) dargestellt ist, zu einem Muster zu überführen oder umzuwandeln mit einem Querschnitt, wie er in Fig. 3 bei (b) dargestellt ist. Die S-Abmessung des Querschnittes bei (b) in Fig. 3 wird bestimmt durch die Brennweite der Kondensorlinse 44, und die l-Abmessung wird bestimmt durch das Ausmaß an Astigmatismus, welches der Zylinderlinse 46 zugeordnet werden kann. Geeignete Werte für Zellenfeststellung sind S = 7-20 µm, und l = 10-300 µm. Der Halbleiterlaser 40, die Kollimatorlinse 42, die Kondensorlinse 44 und die Zylinderlinse 46 stellen die obengenannte Trigger­ lichtquelle 32 dar, die in Fig. 1 wiedergegeben ist.

Ein Strahlstopper 48 wirkt dahingehend, direktes Licht zu blockieren und Vorwärtsstreulicht über einen Bereich von zwei Grad oder mehr mit Bezug zur optischen Achse zu übertragen. Es ist bekannt, daß die Intensität von Vor­ wärtsstreulicht über einen solch kleinen Winkel die Zel­ lengröße reflektiert. Eine Sammellinse 50 empfängt das Licht von dem Strahlstopper 48 und sie umfaßt eine Linse, welche die geringe Vergrößerung einer Mikroskopobjektiv­ linse hat, nämlich eine Vergrößerung von 4 bis 20. Die Sammellinse 50 dient dazu, das Vorwärtsstreulicht zum Zentrum eines Stiftloches 52 zu fokussieren. Das letztere hat einen Durchmesser, der zwischen 0,2 und 2,0 mm aus­ gewählt ist in Abhängigkeit von der Vergrößerung und der Dicke der Fotozelle 18. Die Sammellinse 50 und das Stift­ loch 52 sind in ihrer Position durch Feineinstellein­ richtungen (nicht dargestellt) eingestellt. Der Abstand von der Sammellinse 50 zum Stiftloch 52 beträgt etwa 150 mm, wenn eine Objektivlinse für ein biologisches Mikroskop als Sammellinse 50 verwendet wird, und er be­ trägt etwa 200 mm, wenn eine Objektivlinse für ein metallurgisches Mikroskop als Sammellinse 50 verwendet wird. Der Abstand zwischen der Sammellinse 50 und dem Stiftloch 52 wird eingestellt in Abhängigkeit von dem Ab­ stand zwischen der Fließzelle 18 und der Sammellinse 50.

Mit 54 ist eine Fotodiode oder eine Stift- oder Nadel­ fotodiode bezeichnet. Eine umgekehrte Vorspannung wird der Fotodiode oder Stift- bzw. Nadelfotodiode 54 aufge­ drückt, um ihre Sperrkapazität zu verringern, wodurch die Geschwindigkeit des Ansprechens des Elementes erhöht wird. Wenn die Ansprechgeschwindigkeit des Elementes nicht in dieser Weise erhöht wird, kann die Laserimpuls­ lichtquelle einen Lichtimpuls nicht zu dem Zeitpunkt aus­ senden, zu welchem eine Zelle den Bildpunkt 38 erreicht, nachdem ihr Durchgang durch die Position der Trigger­ lichtquelle 32 festgestellt worden ist.

Die Sammellinse 50, das Stiftloch 52 und die Fotodiode 54 entsprechen einem Teil des Zellensensors 34 gemäß Fig. 1.

Mit 56 ist ein Impulsdiodenlaser bezeichnet. Beispiele solcher Impulsdiodenlaser, die verwendet werden können, weisen eine Wellenlänge von 890 nm und einer Energie von 10 W oder eine Wellenlänge von 870 bis 904 nm und eine Energie von 12 W auf. Eine Kondensorlinse 58 bildet ein optisches Vergrößerungssystem auf der Seite der Bild­ aufnahme-Lichtquelle. Wie in Fig. 4 dargestellt, liegt der Brennpunkt F der Kondensorlinse 58 etwas weiter ent­ fernt als das Zentrum der Fließzelle 18, gesehen von dem Impulsdiodenlaser 56 aus. Insbesondere ist der Brenn­ punkt F derart eingestellt, daß, wenn eine CCD-Kamera 64 ein Bild aufnimmt, ein Zellenbild ausreichender Größe innerhalb des Schirmes erhalten wird. Der Abstand q von der Kondensorlinse 58 zum Brennpunkt F, und der Abstand p von dem Impulsdiodenlaser 56 zur Kondensorlinse 58 stehen vorzugsweise in einem Verhältnis zueinander, wiedergege­ ben durch die Ungleichung q/p » 10.

Der Impulsdiodenlaser 56 und die Kondensorlinse 58 sind der Bildaufnahme-Laserimpulslichtquelle 20 bzw. der Kondensorlinse 22 gemäß Fig. 1 im wesentlichen äquivalent. Mit 60 ist eine Einrichtung zum Verringern von Kohärenz bezeichnet, wie beispielsweise mattes Glas oder ein Bün­ del von optischen Fasern. Eine Bildaufnahmelinse 62 verwendet eine Mikroskopobjektivlinse mit einer Vergrö­ ßerung von 20 bis 40 und sie entspricht der Objektiv­ linse 24 gemäß Fig. 1. Die Bildaufnahmelinse 62 wird ebenfalls durch eine nicht dargestellte Feineinstell­ einrichtung in ihrer Position eingestellt. Mit 64 ist die vorgenannte CCD-Kamera bezeichnet.

Fig. 5 zeigt eine Ausführung, bei welcher der Dioden­ laser 56 gemäß Fig. 2 durch eine Lichtquelle ersetzt ist, die einen N₂-Laser, einen YAG-Laser, einen N₂/Farb-Laser oder eine Kombination eines YAG-Lasers und eines Hoch­ frequenzoszillators aufweist. Da das Licht von dem Laser 66 parallel verläuft, kann die Kondensorlinse 58 gemäß Fig. 2 fortgelassen werden, und das Laserlicht trifft dann direkt auf die Fließzelle 18 auf.

Fig. 6 zeigt eine Ausführungsform, bei welcher Seiten­ streulicht zusätzlich zu Vorwärtsstreulicht festgestellt wird, um eine Zelle festzustellen. Hierfür ist eine Sammellinse 68 zum Feststellen von Seitenstreulicht vor­ gesehen. Dadurch, daß die Ausführung so getroffen ist, daß sowohl Vorwärtsstreulicht als auch Seitenstreulicht festgestellt wird, werden Zellen mit größerer Zuverlässig­ keit festgestellt. Ein anderer Vorteil ist die größere Anwendbarkeit. Der Grund dafür besteht darin, daß, da Seitenstreulicht (side-scattered light) sowohl die Zel­ lengröße als auch den Zustand der Zellenoberfläche oder des Inneren der Zelle reflektiert oder wiedergibt, ein größeres Ausmaß an Informationen erhalten wird im Ver­ gleich zu dem Fall, in welchem lediglich Vorwärtsstreu­ licht (forward-scattered light) festgestellt wird, wel­ ches hauptsächlich die Zellengröße wiedergibt. Dies macht es auch möglich, den Durchgang von Zellen zuver­ lässiger festzustellen. Weiterhin ist festzustellen, daß, wenn gewisse Zelltypen nicht ausschließlich anhand der Größe der Zellen identifiziert werden können, die Tat­ sache, daß Informationen betreffend die Zellenoberfläche oder das Innere der Zelle erhalten werden können, es möglich macht, die Zellenart oder den Zellentyp genau zu bestimmen. Dies macht es weiterhin möglich, eine interessierende Zelle nur dann zu fotografieren, wenn diese Zelle durch die Fließzelle 18 hindurchgeht.

Nachstehend wird ein Stickstofflaser beschrieben mit Be­ zug auf die optische Auflösung der Vorrichtung 10 und eine Begrenzung der Fließgeschwindigkeit des ummantelten Flusses für den Zweck, ein stillstehendes Bild einer Zelle zu erhalten.

Ein Stickstofflaser ist in der Lage, einen starken Laser­ impuls (Spitzenenergie: 100 kW oder mehr) zu erzeugen mit einer Wellenlänge von 337,1 nm und einer Impulsbrei­ te von etwa 10 nS. Hochenergielicht mit einer so kleinen Impulsbreite, wie sie angegeben wurde, kann lediglich von einem Laser erhalten werden. Zusätzlich wird, da ein Stickstofflaser Ultraviolettlicht erzeugt, ausgezeichne­ te Auflösung erhalten, wie es nachstehend erläutert wird.

Die Auflösung δ wird bestimmt durch die numerische Öff­ nung NA der Objektivlinse und der Wellenlänge λ des Lichtes, ausgedrückt durch die nachstehende Gleichung:

δ = λ/NA

Bei der vorliegenden Ausführungsform beträgt die Öff­ nungszahl NA der Objektivlinse 24 0,85, so daß die Auf­ lösung δ etwa 0,4 µm beträgt, was sich ergibt aus δ = λ/NA = 337,1/0,85 = 396,6 nm.

Da die Impulsbreite Δx eines Stickstofflasers etwa 10 nS und die Auflösung etwa 0,4 µm beträgt, wird die maximale Geschwindigkeit v des ummantelten Flusses, bei welcher ein stillstehendes Bild einer Zelle erhalten werden kann, wie folgt bestimmt:

v = δ/Δx = 0,40 × 10^-6/10 × 10^-9 = 40 m/s

Auf diese Weise kann ein stillstehendes Bild einer Zelle erhalten werden, wenn die Zellen durch die Fließzelle mit einer Geschwindigkeit fließen, die nicht höher als etwa 40 m/s ist. Da jedoch der ummantelte Fluß eine Stö­ rung entwickelt, wenn die Fließgeschwindigkeit zu hoch ist, muß in der Praxis die Geschwindigkeit auf unter etwa 6 m/s gehalten werden.

Nachstehend wird ein Beispiel beschrieben, bei welchem die Vorrichtung 10 gemäß der Erfindung verwendet wird, um weiße Blutzellen eines gesunden Individuums zu foto­ grafieren und die weißen Blutiellen in Gruppen zu unter­ teilen, und zwar auf der Basis des erhaltenen Bildes.

Zunächst werden die weißen Blutzellen derart gefärbt, daß der Zustand der Körnung innerhalb der Zellen bequem identifiziert werden kann. Dieses Färbeverfahren ist da­ durch gekennzeichnet, daß das gesammelte Blut gefärbt wird, während es noch lebt, was im Gegensatz steht zu einem Verfahren, bei welchem getrocknetes Blut gefärbt wird.

Das Färben der Zellen und die Arbeitsweise des Verdünnens sind wie folgt:

• a. Ein Giemsa-Verdünnungsmittel wird hergestellt, indem ein Tropfen von Giemsa-Farbe 1 cm³ destilliertem Wasser zugegeben wird.
• b. Das Giemsa-Verdünnungsmittel und unverdünntes Blut werden in einem Verhältnis von 4 : 1 gemischt und das Fär­ ben wird ausgeführt während 30 min bei gelegentlichem Umrühren.

Eine durch die obengenannte Arbeitsweise hergestellte Probe (nachstehend als "Supravitalfärbung" bezeichnet) wird am Einlaß 14 in die Vorrichtung 10 fließen gelassen. Das Bild der Blutzellen während ihres Durchganges an dem Bildpunkt 38 wird von der CCD-Kamera 26 aufgenommen und zur Systemsteuerungs- und Bildverarbeitungseinheit 30 übertragen über die Eingangseinheit 28 für das still­ stehende Bild. Die Verarbeitungseinheit 30 verarbeitet das stillstehende Bild, um Flackern oder Flimmern und Rauschen zu entfernen.

Bilder von weißen Blutzellen, die in der oben beschrie­ benen Weise erhalten wurden, wurden in vier Gruppen un­ terteilt. Die nachstehende Tabelle I zeigt die Charakte­ ristiken und das Ausmaß des Auftretens jeder Gruppe, und in den Fig. 7A bis 7D sind Bilder der vier Gruppen darge­ stellt. Die Gruppen A, C und D haben eine Abmessung von ungefähr 30 µm auf einer Seite des Bildes, während die ähnliche Abmessung bei der Gruppe B etwa 15 µm beträgt.

Tabelle I

Charakteristiken von Bildern von weißen Blutzellen, erhalten durch das Fließverfahren

Die Bilder der weißen Blutzellen wurden durch mikroskopi­ sche Betrachtung verglichen mit Proben, die mit einer zusammengesetzten May-Giemsa-Farbe gefärbt wurden, bzw. mit Proben, die dadurch hergestellt wurden, daß Blut, welches mit Supravitalfärbung gefärbt worden war, auf Glasschiebern angeordnet wurde, die dann mit Abdeck­ gläsern versehen wurden. Als Ergebnis dieser Betrach­ tungen wurde festgestellt, daß die Gruppe A dadurch iden­ tifiziert war, daß sie aus Neutrophilen zusammengesetzt war, die Gruppe B aus Lymphocyten, die Gruppe C aus Monocyten und die Gruppe D aus Eosinophilen und Baso­ philen.

Demgemäß wurden mit der Vorrichtung für Fließcytometrie gemäß der dargestellten Ausführungsform weiße Blutzellen fotografiert und die erhaltenen Bilder weißer Blutzellen wurden analysiert, um die Größe und die Körnung(granulation) der weißen Blutzellen festzustellen, wodurch es ermög­ licht war, diese weißen Blutzellen nach ihrem Typ zu klassifizieren und zu identifizieren auf der Basis der Charakteristiken in Tabelle I.

Fig. 8 zeigt ein Bild einer roten Blutzelle, die während ihres Fließens durch die Fließzelle fotografiert wurde, die in der Vorrichtung der dargestellten Ausführungsform verwendet wird. Die die rote Blutzelle gemäß Fig. 8 um­ gebenden ringförmigen Streifen sind Diffraktionsringe, die von der roten Blutzelle hervorgerufen sind. Wenn die Diffraktionsringe ein Hindernis bei der Bildanalyse der roten Blutzellen darstellen, sollte die Kohärenz des Laserlichtes verringert werden, um die Diffraktions­ erscheinung zu schwächen. Ein geeignetes Mittel, um dies zu erreichen, besteht darin, eine Glasplatte zwischen der Kondensorlinse 22 und der Fließzelle 18 anzuordnen.

Claims (11)

1. Verfahren zum Analysieren von Zellen, bei dem

• - ein Lichtstrahl, der von einer Bildaufnahme- Impulslichtquelle ausgesendet wird, in einen Teil eines ummantelten Flusses gerichtet wird, in dem Zellen fließen,
• - die Zellen, die durch den Bereich des Lichtstrahls fließen, von diesem angestrahlt werden,
• - ein stillstehendes Bild der Zellen aufgenommen wird,
• - das erhaltene stillstehende Bild verarbeitet und analysiert wird, und
• - die Zellen analysiert werden auf der Basis von Informationen betreffend die Gestalt und den inneren Zustand der Zellen, deren stillstehendes Bild analysiert worden ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Lichtstrahl in einen Brennpunkt an einem Teil des ummantelten Flusses fokussiert wird, in dem Zellen fließen.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß

• - Triggerlicht dauernd auf einen Teil des ummantelten Flusses, in dem Zellen fließen, ausgesendet wird,
• - Zellen festgestellt werden, in dem von den mit dem Triggerlicht beleuchteten Zellen kommendes Licht festgestellt wird, und
• - ein Bildaufnahme-Impulslicht aufgrund der Feststellung der Zellen ausgesandt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß

• - auf der Grundlage von Unterschieden in festgestellten Signalen ausgewählte Zellen festgestellt werden, und
• - das Bildaufnahme-Impulslicht nur dann ausgesendet wird, wenn ausgewählte Zellen mittels Signalen vorbestimmter Größe festgestellt werden.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Impulslichtquelle eine Laserimpulslichtquelle verwendet wird.

6. Vorrichtung für Fließcytometrie, insbesondere zur Durchführung des Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche, mit

• - einer Fließzelle (18), durch welche ein ummantelter, Zellen enthaltender Fluß führbar ist,
• - einer Bildaufnahme-Impulslichtquelle (20),
• - einer Kondensorlinse (22), mit der von der Bildaufnahme-Impulslichtquelle ausgesendetes Licht fokussierbar ist,
• - einer Objektivlinse (24) und Bildaufnahmemitteln (26), womit ein stillstehendes Bild von den Zellen, die in dem ummantelten Fluß fließen, aufnehmbar ist, wenn die Zellen mit dem durch die Kondensorlinse (22) fokussierten Licht angestrahlt werden, und
• - einem Bildprozessor (30), mit dem das erhaltene stillstehende Bild verarbeitbar und analysierbar ist.

7. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß als

• - Bildaufnahmemittel eine CCD-Camera (26) vorgesehen ist.

8. Vorrichtung nach Anspruch 6 oder 7, weiter gekennzeichnet durch

• - eine Triggerlichtquelle (32), die dauernd Licht aussendet,
• - einen Zellensensor (34), der ein Zellenfeststellsignal erzeugt, wenn eine Zelle den Lichtstrahl der Triggerlichtquelle (32) durchquert hat, und
• - einen Verzögerungsstromkreis (36), mit dem das Zellenfeststellsignal nach einer Verzögerung um eine bestimmte Zeitperiode zur Bildaufnahme- Impulslichtquelle (20) übertragbar ist.

9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß

• - der Zellensensor einen Sensor (34) zum Feststellen von Vorwärtsstreulicht und einen Sensor (68) zum Feststellen von Seitenstreulicht umfaßt, und
• - interessierende Zellen unter Benutzung der Ausgangssignale der beiden Sensoren (34, 68) feststellbar sind.

10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß als Impulslichtquelle eine Laserimpulslichtquelle (20) vorgesehen ist.

11. Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß

• - eine zwischen der Kondensorlinse (22) und der Fließzelle (18) angeordnete Einrichtung vorgesehen ist, mit der die Koherenz des Laserlichtes von der Bildaufnahme-Impulslichtquelle (20) verringerbar ist.