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Die
vorliegende Erfindung betrifft das Sachgebiet des Hochdurchsatz-Löslichkeitstests an Compounds
in Durchflusszellenvorrichtungen. Die Erfindung betrifft insbesondere
die automatisierte Analyse von erfassten Daten und selektierten
Proben sowie automatisierte Verfahren zum Neuausrichten eines Probenstroms.
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Das
Durchflusszellensystem zum Testen eines Compound in einer Probenflüssigkeit
gemäß dem Oberbegriff
von Anspruch 1 ist in "Introduction
to Flow Cytometry: A Leaning Guide", BD Biosciences, April 2000, beschrieben.
Diese Broschüre
behandelt die Durchflusszytometrie als eine Technik, bei der mehrere
physische Charakteristiken eines einzelnen Partikels beim Strömen in einem
Fluidstrom durch einen Lichtstrahl gleichzeitig gemessen und dann
analysiert werden. Die optische Bank eines Durchflusszytometers
weist Anregungsoptiken und Sammeloptiken auf. Die Anregungsoptiken
weisen einen Laser und Linsen zum Formen und Fokussieren des Laserstrahls
auf. Die Sammeloptiken weisen eine Sammellinse und ein System aus
optischen Spiegeln und Filtern zum Leiten einer spezifizierten Wellenlänge des
gesammelten Lichts zu vorgesehenen optischen Detektoren auf. Ein
Spannungsimpuls wird erzeugt, wenn ein Partikel in den Laserstrahl
eintritt und beginnt, das Licht zu streuen oder zu fluoreszieren.
Die Spannungsimpulse werden in digitale Werte konvertiert. Jeder
Wert ist einem von mehreren Kanälen
zugeordnet, die in einem Bereich von 0–1.000 mV liegen. Die Kanalnummer
wird an einen Computer übertragen.
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Das
Testen der Löslichkeit
von New Chemical Entities (NCEs) ist ein wichtiger Schritt beim
Feststellen ihres möglichen
Nutzens als pharmazeutische Mittel. Zahlreiche Compounds werden
abgelehnt, weil ihre Wasserlöslich keit
für eine
adäquate
biologische Verfügbarkeit
zu gering, um bei der Arzneimittelentwicklung sinnvoll zu sein.
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Die
Trübungsmessung
ist ein gängiger
Indikator für
die Wasserlöslichkeit
von möglichen
Ausgangs-Compounds. Bei der Arzneimittelentwicklung wird die Trübung am
häufigsten
unter Verwendung von auf Mikrotiterplatten basierenden Nephelometern
bewertet, die die von der Probe bewirkte Lichtstreuung messen, oder
es werden alternativ standardmäßige Labor-Trübungsmesser
verwendet, die die Veränderung
des durchgelassenen Lichts messen. In beiden Fällen wird die Compound-Ablagerung dadurch
detektiert, dass Licht von einer Lichtquelle durch einen bestimmten
Teil der Probe geleitet wird und die Lichtstreuung bewertet wird.
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Bei
Nephelometerie-Plattenlesern ist die Probe ortsfest (in der Mikrotitervertiefung),
wird Licht durch die Platte geführt
und wird außeraxial
vorwärts gestreutes
Licht zum Detektieren der Ablagerung verwendet. Im Gegensatz dazu
wird bei Trübungsmessern
normalerweise ein Teil einer gerührten
Probe (häufig
mehrere Milliliter) durch den Trübungsmesser
geleitet und wird die durch die Streuung bewirkte Reduzierung des
durchgelassenen Lichts gemessen, um einen Trübungsmesswert zu erhalten.
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Bei
niedrigen Partikelkonzentrationen ist die Veränderung von durchgelassenem
Licht in gerader Richtung betrachtet so gering, dass die Reduzierung in
jedem Fall praktisch undetektierbar ist. Bei höheren Konzentrationen wird
die Abschwächung
von durchgelassenem Licht aufgrund von Mehrfachstreuung, die mit
direkter Durchlässigkeit
interferiert, leichter detektierbar.
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Eine
Lösung
der oben beschriebenen Probleme besteht in der Messung des in einem
Winkel zu dem auftreffenden Lichtstrahl gestreuten Lichts und anschließendem Inbeziehungsetzen
des außeraxial
gestreuten Lichts zu der Trübung
der Probe. Die meisten Geräte
dieses Typs messen die 90-Grad-Streuung,
da in diesem Winkel gestreutes Licht als genauer mit der Partikel konzentration
korrelierend betrachtet wird. Diese Gerätetypen werden als Nephelometer
bezeichnet.
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Diese
beiden Techniken sind zum Detektieren mehrerer in einem vorbestimmten
Probenvolumen schwebender Compound-Partikel vorgesehen. Die Anzahl
von in der Flüssigkeit
schwebenden Partikeln, die Größe jedes
Partikels und die Lichtstreueigenschaften der Partikel sind kritische
Faktoren, die die Empfindlichkeit des Trübungsmessers oder eines Nephelometers
beeinflussen. Ferner sind die Intensität und der Fokus der Lichtquelle
und die Empfindlichkeit des Lichtdetektionsmechanismus ebenfalls wichtige
Geräteeigenschaften,
die die Genauigkeit und Empfindlichkeit je nach angewendetem Verfahren
beeinflussen.
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Die
Nephelometrie wird auf dem Sachgebiet in hohem Maße zum Ermitteln
der Löslichkeitsgrenzen
von Test-Compounds angewendet. Siehe beispielsweise Dressman et
al., Pharmaceutical Research, 15(1): 11–22 (1998). Diese Technik dient
zum Hochdurchsatz-Screening in solchem Maße, dass direkt von dem Mikrotiterplatten
abgelesen werden kann. Siehe beispielsweise Bevan and Lloyd, Analytical
Chemistry, 72: 1781–1787
(2000).
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Die
Lichtstreuung ist ebenfalls für
das Testen der Löslichkeit
von Compounds zur Arzneimittelentwicklung angewendet worden (Lipinski
et al., Advanced Drug Delivery Reviews 23:3–25 (1997). Diese Autoren verfolgten
die Erhöhung
des Absorptionsvermögens
aufgrund der Lichtstreuung durch abgelagertes Partikelmaterial mit
einer zu diesem Zweck vorgesehenen Diodenarray-UV-Maschine.
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In
letzter Zeit hat man sich auf dem Sachgebiet Hochdurchsatz-Durchflusszytometersystemen zur
Lichtstreuung zwecks Verfolgung der abgelagerten Partikel in einer
Probe zugewendet. Siehe beispielsweise Goodwin et al., A New Rapid
Technique for Sensitive Solubility Measurements: A Flow Cytometric
Approach. Veröffentlichte
Präsentationen
von Meetings von The Society for Biomolecular Screening, Edinburgh,
Schottland, September 1999; und AAPS, New Orleans, LA, November
1999.
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Trotz
der erfolgreichen Anwendung der Durchflusszytometrie zum Testen
der Löslichkeit
bleiben doch einige Probleme bestehen. Viele mit Trübungsmessern
und Nephelometern in Zusammenhang stehende Probleme betreffen auch
die derzeit verwendeten Durchflusszellensysteme. Beispielsweise
bewirken Nichtgleichförmigkeit
von Proben aufgrund von Verunreinigungen, Lösungsmittelabsorption und Ablagerung
von Schmutzstoffen eine störende
Lichtstreuung. Ferner kann eine anomale Streuung auf Lösungsmittelstreuung,
gelöste
Verunreinigungen und Schmutzstoffe, wie z.B. Lösungsmittel-Extraktionsprodukte aus Labware, z.B.
Mikrotiterplatten etc., zurückzuführen sein.
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Der
Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes, genaues,
robustes Durchflusszellensystem für das Hochdurchsatz-Screening
einer großen
Anzahl von Compounds bereitzustellen, das abgelagerte Compound-Partikel
anhand der Größenverteilung
von durch Verunreinigungen von Lösungsmitteln,
Lösungsmittel-Extraktionsprodukten
und anderen Verunreinigungen und Schmutzstoffen hervorgerufenen
Zufalls-Hintergrundinterferenz unterscheidet. Ferner sollte das
System zur automatischen Detektion und Korrektur einer Fehlausrichtung
des Probenflüssigkeitsstroms
in der Lage sein.
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Zusammenfassender Überblick über die
Erfindung
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Das
erfindungsgemäße Durchflusszellensystem
ist in Anspruch 1 definiert.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Durchflusszellensystem für einen
Löslichkeitstest
an einem Compound in einer Flüssigkeitsprobe
bereit, wobei das System die folgenden Komponenten aufweist:
- (a) eine Durchflusszelle zum Kanalisieren eines die
Durchflusszelle durchströmenden
Fluid-Mantels, wobei der Fluid-Mantel einen kontinuierlichen oder
intermittierenden Flüssigkeitsprobenstrom leitet,
wobei der Flüssigkeitsprobenstrom
Partikel des für
einen Löslichkeitstest
vorgesehenen Compound aufweist;
- (b) eine Lichtquelle zum Beleuchten des Flüssigkeitsprobenstroms in der
Durchflusszelle und zum Erzeugen von Streulichtblitzen von den Partikeln des
Compound;
- (c) einen Detektor zum Detektieren der Streulichtblitze und
zum Erzeugen eines Elektronikimpuls-Detektionssignals für jeden
Lichtblitz zum Liefern von Proben-Rohdaten, wobei jeder Lichtblitz
eine Lichtintensität
aufweist und jedes Elektronikimpuls-Detektionssignal eine Impulsamplitude
aufweist, die der Intensität
des detektierten Lichtblitzes entspricht;
- (d) eine Einrichtung für
eine Echtzeit-Verarbeitung mehrerer Elektronikimpuls-Detektionssignale, wobei
jedes Signal einem Kanal von einer Abfolge von Kanälen zugeordnet
ist, wobei jeder Kanal Elektronikimpuls-Detektionssignale in einem
voreingestellten Signalamplitudenbereich detektiert, um Mehrkanal-Probendaten zu liefern,
und die Probendaten zum Selektieren einer nachfolgenden Flüssigkeitsprobe
aus mehreren nachfolgenden Flüssigkeitsproben
für einen
Löslichkeitstest ausgibt.
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Die
erfindungsgemäße Durchflusszelle
kann ferner eine Einrichtung zum Speichern und Wiederabrufen der
Rohdaten und/oder der Mehrkanal-Probendaten aufweisen. Für einen
Löslichkeitstest
vorgesehene Proben können
in Vertiefungen einer Mikrotiterplatte aufgenommen sein, die mehrere
Verdünnungen
der für
den Löslichkeitstest
vorgesehenen Probe aufweisen kann.
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Das
erfindungsgemäße Durchflusszellensystem
kann ferner ein Reservoir zum Aufnehmen einer Kontrollsubstanz zum
Feststellen der Ausrichtung des Probenflüssigkeitsstroms in der Durchflusszelle
aufweisen. Bei der Kontrollsubstanz kann es sich um ein Partikel
oder ein Kügelchen
handeln.
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Die
Erfindung schafft ferner ein Verfahren zum Testen eines Compound
in einer Flüssigkeitsprobe,
wobei das Verfahren die Schritte aus Anspruch 10 umfasst.
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Mehrere
für einen
Löslichkeitstest
vorgesehene Probenflüssigkeiten
können
in den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte aufgenommen sein. Nach dem
Durchführen
des Löslichkeitstests
an der ersten Probenflüssigkeit
können
die nachfolgenden Probenflüssigkeiten
eine Reihe von stärkeren
Verdünnungen
des gleichen für
den Löslichkeitstest
vorgesehenen Compound aufweisen, und sie können ferner wahlweise eine
Reihe von Verdünnungen
eines oder mehrerer zusätzlicher
für den
Löslichkeitstest
vorgesehener Compounds aufweisen.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
ist auf ein Durchflusszellensystem anwendbar, das ein Reservoir
zum Aufnehmen einer Kontrollsubstanz zum Feststellen der Ausrichtung
des Probenflüssigkeitsstroms
in der Durchflusszelle aufweist. Alternativ kann die Kontrollsubstanz
in einer oder mehreren Vertiefungen einer Mikrotiterplatte aufgenommen sein.
Die verwendete Kontrollsubstanz kann ein Partikel oder ein Kügelchen
sein.
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Eine
weitere Ausgestaltung der oben beschriebenen Verfahren umfasst die
folgenden Schritte zum Selektieren der nachfolgenden Probenflüssigkeit:
es wird entweder eine der Reihen mit höheren Konzentrationen des Compound
selektiert, wenn die Mehrkanal-Probendaten das Nichtvorhandensein oder
niedrige Pegel von Partikeln des Compound anzeigen; oder es wird
eine der Reihen mit steigender Konzentration des zweiten für den Löslichkeitstest vorgesehenen
Compound selektiert, wenn die Mehrkanal-Probendaten das Vorhandensein
eines beträchtlichen
Pegels der Partikel des Compound anzeigen.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ferner eine Einrichtung zur Echtzeit-Verarbeitung mehrerer
Elektronikimpuls-Detektionssignale von einem Durchflusszytometer
für einen
Löslichkeitstest
bereit, wobei jedes Signal einem Kanal von einer Abfolge von Kanälen zugeordnet
ist, wobei jeder Kanal Elektronikimpuls-Detektionssignale in einem
voreingestellten Signalamplitudenbereich detektiert, um Mehrkanal-Probendaten
zu liefern, und die Probendaten zum Selektieren einer nachfolgenden
Flüssigkeitsprobe
aus mehreren nachfolgenden Flüssigkeitsproben
für einen
Löslichkeitstest
ausgibt.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ferner eine Einrichtung zur Echtzeit-Verarbeitung mehrerer
Elektronikimpuls-Detektionssignale von einem Durchflusszytometer
für einen
Löslichkeitstest
bereit, wobei jedes Signal einem Kanal von einer Abfolge von Kanälen zugeordnet
ist, wobei jeder Kanal Elektronikimpuls-Detektionssignale in einem
voreingestellten Signalamplitudenbereich detektiert, um Mehrkanal-Kontrollsubstanzdaten
zu liefern und dadurch zu bestimmen, ob der Probenflüssigkeitsstrom
ausgerichtet oder fehlausgerichtet ist, und ein Ausführungssignal
auszugeben, wenn der Flüssigkeitsstrom fehlausgerichtet
ist, und bei Empfang des Ausführungssignals
einen korrigierenden Neuausrichtprozess zu initiieren.
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Kurzbeschreibung
der Figuren
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1A–1C zeigen
die bei dem Ausführungsbeispiel
anhand der Löslichkeitsbestimmungen von
Pyren (F12), Trifluralin (F13) und Danazol (F18) erfassten Lichtstreudaten.
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Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
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Ein
typisches erfindungsgemäßes Durchflusszellensystem
weist eine Durchflusszelle, eine Probenselektionsvorrichtung, eine
Lichtquelle und einen oder mehrere Detektoren zum Detektieren von Streulicht
und zum Erzeugen eines Elektronikimpulssignals, das jedem detektiertem
Streulichtblitz entspricht, auf. Ferner weist das System eine Computer- oder
Mikroprozessorvorrichtung zum Empfangen der Elektronikimpulssignale
von dem Detektor oder den Detektoren und zum Zuweisen jedes Signals
anhand der Elektroniksignalamplitude, die der Intensität des Lichtblitzes
entspricht, zu einem vorbestimmten Kanal auf. Die Computer- oder
Mikroprozessorvorrichtung verarbeitet ferner die Signaldaten in
mehrere voreingestellte Kanalbereiche und vergleicht die Daten von
jedem der mehreren Kanalbereiche. Die Computer- oder Mikroprozessorvorrichtung
stellt dadurch fest, ob die nächste
selektierte Probe eine weitere Verdünnung desselben Compound sein
soll oder ob eine Abfolge von Verdünnungen eines nachfolgenden
Proben-Compound beginnen soll. Wenn das System detektiert, dass
der Probenfluidstrom fehlausgerichtet ist, unterbricht die Computer-
oder Mikroprozessorvorrichtung die Abfolge von Probentests und initiiert
eine Durchflusszellen-Reinigungsroutine vor der Wiederaufnahme des
Probentests.
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Eine
Analyse von Ablagerungen, die sich in Lösungen der Test-Compounds bilden,
durch eine Durchflusszytometrie bietet den Vorteil, dass bei diesem
System Detektion, Erfassung und Analyse von Daten von einzelnen
Ablagerungsereignissen erfolgen. Durch ein hydrodynamisches Fokussieren
der Probe in der Durchflusszelle wird der Probenstrom derart verengt,
dass die einzelnen Partikel gekennzeichnet werden können. Bei
dieser Vorgehensweise ist nicht nur die Empfindlichkeit signifikant
größer als bei
den Trübungsmessungs-
oder Nephelometrietechniken, sondern es werden auch die Genauigkeit und
Robustheit der Löslichkeitsbestimmung
erhöht, und
sie kann an eine Echtzeitverarbeitung einer großen Anzahl von Proben für ein Hochdurchsatz-Löslichkeits-Screening
angepasst werden.
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Wie
hier verwendet, bezieht sich der Ausdruck "Probenflüssigkeit" auf die in der Durchflusszelle durch
Abtasten mit einem Lichtstrahl auf das Vorhandensein von Partikeln
getestete Flüssigkeit. Die
Probenflüssigkeit
kann eine beliebige Flüssigkeit sein,
die einem Löslichkeitstest
eines darin gelösten Test-Compound
zu unterziehen ist. Vorzugsweise ist die Probenflüssigkeit
eine wässrige
Probenflüssigkeit.
Die Probenflüssigkeit
kann zwischen ungefähr 0,01
% und ungefähr
5 % eines nichtwässrigen
Lösungsmittels
enthalten. Vorzugsweise enthält
die Probenflüssigkeit
zwischen ungefähr
0,02 % und ungefähr
2 % nichtwässriges
Lösungsmittel.
Im optimalen Fall enthält
die Probenflüssigkeit
ungefähr
1 % des nichtwässrigen
Lösungsmittels.
Bevorzugte nichtwässrige
Lösungsmittel,
die dazu geeignet sind, das Compound einem Löslichkeitstest zu unterziehen,
sind mit Wasser mischbar.
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Anfangs
kann das einem Löslichkeitstest
zu unterziehende Test-Compound als Lösung in dem nichtwässrigen,
mit Wasser mischbaren Lösungsmittel
bereitgestellt werden. Das Test-Compound kann in einer beliebigen
Konzentration bereitgestellt werden, üblicherweise zwischen ungefähr 1 mM
und 100 mM, wobei eine Konzentration von ungefähr 10 mM bevorzugt wird. Das
mit Wasser mischbare nichtwässrige
Lösungsmittel
kann ein beliebiges mit Wasser mischbares nichtwässriges Lösungsmittel sein, wie zum Beispiel
Dimethylsulfoxid (DMSO), Methanol, Ethanol, oder Lösungsmittel,
wie z.B. Acetonitril, wie zur Elution bei HPLC- (Hochleistungsflüssigkeitschromatografie-)
Systemen verwendet.
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Die
Lösung
des Compound in dem mit Wasser mischbaren nichtwässrigen Lösungsmittel wird in einem geeignetem
wässrigen
Puffer verdünnt
und gemischt, bevor die Proben in vorbestimmten Intervallen einer
Lichtstreuanalyse in dem erfindungsgemäßen Durchflusszytometer unterzogen
werden. Es hat sich herausgestellt, dass bei bevorzugten Ausführungsformen
der erfindungsgemäßen Verfahren Löslichkeitsbestimmungen
auf optimale Weise nach 15 Minuten, 120 Minuten und 24 Stunden nach
einer hundertfachen Verdün nung
in einen wässrigen
Puffer aus der Lösung
in einem nichtwässrigen
Lösungsmittel,
vorzugsweise 100 %-iges DMSO, erfolgen.
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Wie
hier verwendet, bezieht sich der Ausdruck "Fluid-Mantel" auf die zwischen den Wänden der
Durchflusszelle und der Probenflüssigkeit
strömende
Flüssigkeit.
Geeignete Fluid-Mantelflüssigkeiten
umfassen beliebige Flüssigkeiten,
die den Abtastlichtstrahl durchlassen und mit der Probenflüssigkeit
kompatibel sind. Eine bevorzugte Fluid-Mantelflüssigkeit ist FACSflowTM (Becton Dickinson Immunocytometry Systems,
San Jose, CA).
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Geeignete
Puffer zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Durchflusszellensystemen
können
bei einem beliebigen geeigneten pH-Wert gepuffert werden. Bei einer
Ausführungsform
kann der Puffer auf einen beliebigen pH-Wert von ungefähr pH 1 bis
ungefähr
pH 8 eingestellt sein. Bei einer bevorzugen Ausführungsform kann der Puffer
nahe dem neutralen pH-Wert eingestellt sein, wie z.B. bei einem pH-Wert
von ungefähr
7,4.
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Wie
hier verwendet, bezieht sich der Ausdruck "Probenflüssigkeitsstrom" auf den Strom von Probenflüssigkeit,
der durch die Durchflusszelle kanalisiert und von dem Fluid-Mantel
begrenzt wird. Der Probenflüssigkeitsstrom
kann ein kontinuierlicher Strom oder intermittierend sein, wobei
Probenflüssigkeitstropfen
in dem Fluid-Mantel gebildet werden. Die Probenflüssigkeit
wird vorzugsweise bei einem speziellen pH-Wert gepuffert, üblicherweise
zwischen ungefähr
pH 1 und ungefähr
pH 8. Die gewählten Puffer-pH-Pegel
können
beliebige in diesem Bereich liegende pH-Pegel sein. Ganzzahlige
pH-Puffer sind zweckmäßig. Von
den Proben bei ganzzahligen pH-Pegeln erhaltene Daten können zum
Interpolieren auf Zwischen-pH-Werte verwendet werden, um Löslichkeitsprofile über eine
pH-Bereich zu liefern.
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Wie
hier verwendet, bezieht sich der Ausdruck "Durchflusszelle" auf den Behälter, durch den der Fluid-Mantel
und der Probenflüssigkeitsstrom
bei Abtastung durch den von der Lichtquelle kommenden Lichtstrahl
laufen. Die Durchflusszelle ist in ein Durchflusszytometergerät eingebaut,
wie zum Beispiel den BD FACScan-Zytometer oder den BD FACScount-Zytometer
(Becton Dickinson Biosciences, San Jose, CA). Die Lichtquelle kann
eine beliebige Hochintensitäts-Lichtquelle,
wie z.B. eine Laserlichtquelle oder eine Halogenquelle oder eine
andere derartige Lichtquelle, sein.
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Lichtblitze,
die von den einzelnen Partikeln in dem Probenflüssigkeitsstrom gestreut werden,
werden von einer Detektionsvorrichtung, wie z.B. einer Photomultiplier-Röhre, einer
lichtempfindlichen Diode, einem ladungsgekoppelten Detektor (CCD)
oder einer anderen derartigen Detektionsvorrichtung, registriert.
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Licht
wird in der Durchflusszelle von der akkurat und unbeweglich positionierten
Lichtstrahl durchlaufenden Partikeln gestreut. Die Partikel umfassen
Partikel des zu testenden Compound, die sich in dem wässrigen
Puffer abgelagert haben. Wenn diese Partikel die Durchflusszelle
durchlaufen, durchlaufen sie die Position des Lichtstrahls und bewirken ein
Streuen von Lichtblitzen, wenn die Partikel den Lichtstrahl durchlaufen.
Die Intensität
der Streulichtblitze ist eine Funktion der Größe und Körnigkeit (Struktur) des Partikels.
Somit erzeugt jedes den Lichtstrahl durchlaufende Partikel einen
Signaturblitz mit einer auf die Größe des Partikels bezogenen
Intensität.
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Diese
einzelnen Partikelstreuinformationen, wie sie von dem erfindungsgemäßen Durchflusszellensystem
erfasst werden, ermöglichen
eine selektive Unterscheidung zwischen Partikelstreuung von Hintergrundstreuung.
Die Hintergrundstreuung umfasst sämtliche Quellen von Zufalls-Lichtstreuereignissen,
einschließlich
sämtlicher
Quellen strömungstechnisch
bedingter Störung.
Die strömungstechnisch
bedingte Störung
umfasst Lichtstreustörung von
dem Probenstrom und dem Fluid-Mantelstrom. Das erfindungsgemäße System
und die erfindungsgemäßen Verfahren
ermöglichen
die selektive Unterscheidung zwischen Partikelstreuung und Streuinterferenz.
Eine solche Streuinterferenz umfasst Lichtstreuung von dem nichtwässrigen
Lösungsmittel und von
von dem nichtwässrigen
Lösungsmittel
eluierten Extraktionsprodukten. Beispielsweise sollten, wenn Proben-Compounds
in DMSO-Polystyrolpolypropylen angesetzt werden, Mikrotiterplatten
vermieden werden, da sich herausgestellt hat, dass extrahierbare
Verunreinigungen, die zu der Lichtstreuung beitragen, aus diesen
Platten austreten.
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Ferner
ermöglicht
das System eine Unterscheidung anderer Verunreinigungen, wie z.B.
verschmutzender copurifizierter chemischer Nebenreaktionsprodukte,
die vorhanden sein können,
sowie zufällig
vorhandener Schwebstoffe, durch Analyse der Ablagerungsgrößenverteilung
in der Probe.
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Ferner
kann die von dem erfindungsgemäßen System
und den erfindungsgemäßen Verfahren ermöglichte
Analyse der einzelnen Partikel Informationen über die Reinheit oder die Identität des einem Löslichkeitstest
zu unterziehenden Compound liefern. Dies wird durch die Möglichkeit
zum Erfassen und Analysieren von Streuinformationen einzelner Partikel
ermöglicht,
anhand derer mehrere unterschiedliche Partikelgrößenbereiche gleichzeitig unterschieden
werden können.
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Diese
Zufallsereignisse können
unterschiedlich auf die verschiedenen von dem erfindungsgemäßen System
detektierten Kanalbereiche aufgeteilt sein und können dadurch durch Analysieren
nur derjenigen Kanalbereiche, die am wenigsten von solchen Störungen durch
Schmutzstoffe sowie Hintergrund- und
Lösungsmittelstörungen beeinflusst
sind, von der Löslichkeitsanalyse
des zu testenden Compound ausgeschlossen werden. Diese Vorgehensweise
ermöglicht
auf automatisierte Weise eine akkuratere Detektion und Unterscheidung
einer Partikelablagerung in Echtzeit.
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Das
Streulicht kann aus jeder Richtung gesammelt werden. Vorzugsweise
wird das Streulicht aus einer von zwei Richtungen gesammelt: Vorwärtsstreuung
und Seitenstreuung. Bei der am stärksten bevorzugten Variante
wird das seitlich gestreute Licht detektiert, da dies der empfindlichste
Pa rameter für niedrige
Intensitäten
ist. Um neunzig Grad gestreutes Licht ist optimal und bietet die
größte Empfindlichkeit.
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Licht
(oder Fluoreszenz von den Partikeln), das relativ zu dem einfallenden
Lichtstrahl um neunzig Grad gestreut ist, wird von einem oder mehreren einer
Abfolge von Detektoren (Photomultiplier-Röhren – PMTs) gesammelt. Es kann
eine beliebige Anzahl von PMTs verwendet werden, Bei einer Ausführungsform
weist die erfindungsgemäße Durchflusszelle
drei PMTs auf, bei anderen Durchflusszellensystemen können jedoch
mehr PMTs verwendet werden.
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Bei
einem speziellen Gerät
gemäß der vorliegenden
Erfindung wird eine PMT für
die Löslichkeitsprüfung verwendet,
das Streulicht bei der Wellenlänge
eines 3 Milliwatt- (mW-) Diodenlasers (636 nm +/– 10 nm) zur Erreichung einer
hohen Empfindlichkeit und Stabilität sammelt. Eine zweite PMT
kann bei den kommerziellen Versionen des Geräts zum Detektieren von Licht,
das leicht über
der Wellenlänge des
Lasers liegt, zwecks Aufnehmens von Compounds, die von dem Laserlicht
angeregt worden sind und Fluoreszenzlicht emittieren, verwendet
werden.
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Wenn
das Licht in die PMT eintritt, wird es in ein elektronisches Signal
konvertiert und festgehalten und ausgewertet, wenn es bestimmten
Kriterien entspricht (Grad der Helligkeit im Vergleich zu einem Schwellenwert).
Wenn das Streulicht den voreingestellten Schwellenwert überschreitet,
wird es (durch logarithmische oder lineare Verstärker) verarbeitet und in einer
Datei (die als FCS oder Listmode-Datei bezeichnet ist), welche die
Rohdaten enthält,
gesichert.
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Die
Probenanalyse wird über
einen zweckmäßigen voreingestellten
Zeitraum (wie zum Beispiel einen 5-sekündigen Zeitraum) oder eine
Anzahl von Blitz"ereignissen" (wie zum Beispiel
50.000 Ereignissen) fortgesetzt, und sämtliche Informationen über diese
spezielle Probe werden in der Rohdaten- Datei gesichert. Die Listmode-Datei
enthält
sämtliche
Rohdaten von einer vorbestimmten Probe, einschließlich sämtlicher
Informationen, die in jedem Detektor (PMT oder Diodendetektor) für jedes
einzelne Ereignis erfasst worden sind.
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Alternativ
kann das System derart ausgeführt
sein, dass die Probenaufnahme- und -analyse-Software so eingestellt
sein kann, dass sie entweder eine feste Anzahl von Ereignissen oder
in einem voreingestellten Zeitintervall auftretende Ereignisse zählt, je
nachdem, was früher
eintritt. Generell werden voreingestellte Zeiten bevorzugt, da Proben
mit einer niedrigen Anzahl von Partikeln die Durchflusszellenvorrichtung über unnötig lange
Zeiträume
okkupieren würde.
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Die
Lichtstreu-Ereignisse werden gemäß der Intensität jedes
Ereignisses in separate Intensitätsgruppierungen,
die als "Kanalbereiche" bezeichnet werden,
kategorisiert. Die Einstellungen der Kanalbereiche kann gemäß den Anforderungen
oder der Auswahl des Benutzers des erfindungsgemäßen Durchflusszellensystems
vorselektiert werden. Alternativ können die "Kanalbereiche" nach der Erfassung während der
Analyse der Roh-Streu-Dateien anhand der Verteilung der Partikel-
und der Störstreuung
in den Proben ermittelt werden. Dies erfolgt vorzugsweise durch
automatisierte Computeranalyse der Streuprofile. Bei einer alternativen
Ausführungsform können die
Intensität
der einzelnen Partikelblitze und die Anzahl von Blitzen in speziellen
Kanälen
zum Segregieren von Partikeln von der Störstreuung und zum Liefern von
Informationen über
die Menge und Qualität
der gebildeten Ablagerung verwendet werden. Diese Informationen
werden dann für
jedes in einer vorbestimmten Probe detektierte Ereignis automatisch
in einer Rohdaten-Datei gespeichert. Bei speziellen Ausführungsformen
weist der Detektor entweder 256 Kanäle (für Systeme mit niedriger Auflösung) oder
1024 Kanäle
(hohe Auflösung)
auf, von denen jeder gegenüber
unterschiedlichen Intensitätsgraden
des detektierten Blitz-Ereignisses in der Reihenfolge steigender
Intensität
empfindlich ist.
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Das
erfindungsgemäße Durchflusszellensystem
weist ferner eine Verarbeitungseinrichtung zum Ausführen eines
softwarekodierten oder hardwarekodierten Programms für eine Echtzeitverarbeitung
der in jedem der mehreren Kanalbereiche erfassten Signaldaten auf.
Die Verarbeitungseinrichtung vergleicht dadurch die Signale in jedem
dieser mehreren Kanalbereiche mit den Signalen von nur gepufferten
Kontrollproben und ermittelt, welcher der mehreren Kanalbereiche
die signifikantesten Daten zum Vergleich mit den von den Pufferkontrollen
erhaltenen Daten liefert.
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In
einigen Fällen
wäre dies
der Kanalbereich, der den größten Bereich
von Kanälen
aufweist, in anderen Fällen
kann der signifikanteste Bereich ein engerer Bereich sein, bei dem
zufällige
Störsignale
von Schmutzstoffen ausgeschlossen sind. Diese Schmutzstoffen können Verunreinigungen
oder aus dem Lösungsmittel
extrahierte Compounds und andere Partikel umfassen, die vorhanden
sein können und
nicht von dem einem Löslichkeitstest
unterzogenen Compound abgeleitet sind.
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Lichtstreubestimmungen
werden generell an mehreren Konzentrationen eines Test-Compound durchgeführt. Bei
Bestimmung einer konzentrationsabhängigen Steigerung von Lichtstreu-Ereignissen
in einem speziellen selektierten Mehrkanalbereich kann die Löslichkeitsgrenze
eines speziellen Compound bestimmt werden, und ein Löslichkeitstest
weiterer Konzentrationen dieses Compound ist unnötig. Die oben beschriebene
erfindungsgemäße Echtzeitverarbeitungseinrichtung
kann derart programmiert sein, dass sie ein Signal zum Bewirken
einer Selektion einer Verdünnung
eines zweiten Proben-Compound für einen
Löslichkeitstest
ausgibt, wobei weitere Proben mit anderen Konzentrationen des anfangs
getesteten Compound wegfallen.
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Eine
Echtzeitverarbeitung der in jedem der mehreren Kanalbereiche erfassten
Signaldaten, die von einer Kontrollsubstanz abgeleitet sind, wie
z.B. einem Partikel- oder Kügelchenpräparat, ist
auch für die
Bewertung der Aus richtung des Probenflüssigkeitsstroms in der Durchflusszelle
sinnvoll. Proben-Compound-Flüssigkeiten
für einen
Löslichkeitstest
können
regelmäßig unter
Verwendung einer Kontrollsubstanz untersucht werden. Die Kontrollsubstanz
sollte eine bekannte Konzentration und eine gleichförmige Partikelgröße aufweisen,
so dass jede Untersuchung eine Standardanzahl von Streuereignissen
liefert und Signalintensitäten
in einem engen Band erzeugt. Diese Signale sollten alle in einen
engen Kanalbereich fallen. Eine Beobachtung einer Standardanzahl
von Streuereignissen innerhalb des erwarteten engen Kanalbereichs
bestätigt
daher, dass die Durchflusszelle korrekt ausgerichtet ist.
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Im
Gegensatz dazu ist, wenn die Anzahl von Ereignissen unter der Standardanzahl
liegt oder wenn die Signale außerhalb
des standardmäßigen engen
Kanalbereichs liegen, die Durchflusszelle fehlausgerichtet, und
ein Reinigungszyklus ist zum Neuausrichten des Probenflüssigkeitsstroms
erforderlich. Die Neuausrichtung wird vorzugsweise von einem von
der Verarbeitungseinrichtung in Echtzeit kommenden Signal zum Bewirken
eines Reinigungszyklus initiiert. Die Reinigung kann eine beliebige
Routine sein, bei der der Probenflüssigkeitsstrom neuausgerichtet
wird, wie beispielsweise ein Rückspülen der Durchflusszelle
mit einem Mantel-Fluid; Entleeren und Neubefüllen der Durchflusszelle oder
Spülen
der Durchflusszelle mit einem Reinigungsmittel, wie z.B. einer Bleichlösung.
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Kügelchen
als Kontrollsubstanzen der vorliegenden Erfindung können beliebige
kleine Kügelchen
sein, die mit der Durchflusszelle größenkompatibel sind und Lichtstreueigenschaften
aufweisen, die eine empfindliche und akkurate Detektion durch den für das spezielle
Durchflusszellensystem gewählten Detektor
ermöglichen.
Besonders bevorzugte Kügelchen
umfassen Nile Red-Polystyrol-Latex-Mikrokugeln
mit einem Durchmesser von 2,49 μ von
Molecular Probes Inc., Eugene, OR.
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Wenn
Kügelchen
als Kontrollsubstanz verwendet werden und Streulicht oder Fluoreszenz
mit einer speziellen Intensität
detektiert und als Able sewert gespeichert wird, gäbe es keinen
Unterschied zwischen diesem Detektionsmodus und dem Probendatenerfassungsmodus.
Wenn jedoch die Probenstromausrichtungsüberwachung einen Mechanismus
umfasst, der von dem Lichtstrahl und der Systemoptik unabhängig ist,
würden
sich die Proben- und Kontrollsubstanz-Detektionssysteme voneinander
unterscheiden. Im letzteren Fall gäbe es keine "Kanaltrennung" beim Ausrichtungsüberwachungsprozess.
Beispielsweise können
bei dem Ausrichtungsüberwachungssystem
ein Farbstoffeinspritzsystem und eine Abtastung mit dem Laserstrahl
verwendet werden, woraufhin ein Überwachen
des Farbstoffs durch Lichtabsorption folgt. Die Absorption kann
mit einer beliebigen Einrichtung verfolgt werden, wie beispielsweise
mit einem beliebigen anpassungsfähigen
photoempfindlichen Gerät,
wie z.B. einer Kamera, CCD oder dergleichen.
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Ein
bevorzugtes Verfahren zum Einstellen und Prüfen der Systemausrichtung für den Strom
in der Durchflusszelle ist die Verwendung von Kügelchen als Kontrollsubstanz.
Bei diesem Verfahren wird nicht nur die Position des Probenstroms
verifiziert, sondern auch die anderen Variablen, die die Probenqualität beeinflussen
können.
Solche Faktoren, die die Probenqualität beeinflussen können, umfassen zum
Beispiel Probendurchflussrate, Laserintensität, optische Variablen, Ausrichtung,
Verstopfungen oder andere Schmutzstoffe und dergleichen. Diese Faktoren
können
die Anzahl von aufgrund der Genauigkeit der Kügelchenposition in der Strömung detektierten Kügelchen
beeinflussen.
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Zum
Testen vorgesehene Proben-Compounds sind vorzugsweise in Vertiefungen
einer Mikrotiterplatte angeordnet, obwohl eine beliebige Mehrfachprobenzuführeinrichtung
bei dem erfindungsgemäßen System
vorgesehen sein kann. Die Mikrotiterplatte kann eine beliebige Anzahl
von Vertiefungen aufweisen; Platten mit 96 Vertiefungen und 384
Vertiefungen werden normalerweise verwendet und bevorzugt, andere
geeignete Plattengrößen mit unterschiedlichen
Probengruppierungen sind jedoch auch erhältlich. Das erfin dungsgemäße System
kann zum Selektieren aus Mikrotiterplatten mit beliebiger Größe vorgesehen
sein.
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Lichtstreuereignisse
werden vorzugsweise in mehr als einem Zeitintervall nach Mischen
der Probenflüssigkeit
durch schrittweises Verdünnen
einer konzentrierten Stammlösung
in nichtwässrigem
Lösungsmittel
(üblicherweise
DMSO) ermittelt. Es hat sich herausgestellt, dass Bestimmungen der
Lichtstreuung durch verdünnte
Compound-Lösungen
für eine
Löslichkeitsanalyse
in der erfindungsgemäßen Durchflusszelle
optimale Ergebnisse nach ungefähr 15
Minuten, 120 Minuten und 24 Stunden nach dem Mischen erbringen.
Es hat sich herausgestellt, dass dreißig Mikroliter Proben für ein Hochdurchsatz-Screening zweckmäßig und
für akkurate
Ablesewerte bei hoher Empfindlichkeit geeignet sind.
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Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
erfolgt eine automatisierte Ausrichtungs-Kügelcheneinspritz-Routine zwischen
Testprobenuntersuchungen bei der Analyse von Proben von einer Mikrotiterplatte.
Dies ermöglicht
ein häufiges
Prüfen
und Bestätigen
der Ausrichtung des Probenflüssigkeitsstroms. Der
Probenflüssigkeitsstrom
kann durch Hindernisse im normalen Strom des Mantel-Fluids leicht
vom Weg des Lichtstrahls abgelenkt werden, wodurch eine Umleitung
der Probenflüssigkeit
beispielsweise durch Blasen oder Schmutzstoffaufbau an den Wänden der
Durchflusszelle bewirkt wird. Zum Beibehalten der Anzahl von Vertiefungen
für zum
Löslichkeitstest
vorgesehene Proben können
die Kügelchen
aus einem separaten Reservoir zugeführt werden.
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Alternativ
kann das System in vorbestimmten Intervallen (wie zum Beispiel nach
Beendigung des Testens von Proben aller drei Spalten der Mikrotiterplatte)
derart programmiert werden, dass es zu einer Vertiefung zurückkehrt,
die auf der Mikrotiterplatte befindliche Kügelchen enthält, um eine
Ausrichtungsprüfung
des Probenfluidstroms zu wiederholen. Die Vertiefungen von Spalte
1 einer Mikrotiterplatte können
für Kügelchen-
und Pufferkontrollen reserviert sein.
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Bei
einer weiteren alternative Ausführungsform
können
die Kügelchen-Pufferkontrollen
aus separaten Reservoirs kommen, so dass mehr Vertiefungen für Proben-Compounds
frei bleiben. Ein Selektieren und Vergleichen von Kügelchen-
und Pufferkontrollproben ermöglichen
eine Verifikation, dass Kügelchen
in einem bestimmten Intensitätsbereich (z.B.
in einem erwarteten, wie beispielsweise 10-Kanal-Bereich aus insgesamt
256 Kanälen,
was einem engen Intensitätsbereich
von Streulicht entspricht) festgestellt worden sind. Dieser Vergleich
wird vorzugsweise automatisch von einer in dem System eingebauten
Programmsoftware durchgeführt,
so dass die Informationen in Echtzeit zurückgeführt werden können, um
ein Selektieren einer nachfolgenden Probe oder ein Initiieren einer
Reinigungsroutine zu bewirken.
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Das
erfindungsgemäße Durchflusszellensystem
sichert Lichtstreudaten von Proben auf eine einzigartige Weise,
die die Datenverarbeitungsmöglichkeiten
des Systems verbessert. Die Gesamtanzahl von Ereignissen für jede der
mehreren unterschiedlichen Lichtstreukanalregionen wird gleichzeitig
erfasst und gespeichert. Bei einer bevorzugten Ausführungsform
werden Ereignisse für
jede der drei unterschiedlichen Lichtstreukanalregionen erfasst und
gespeichert. Diese Regionen entsprechen: einem "Alle"-Kanalbereich,
der sämtlichen
oder im Wesentlichen sämtlichen
verfügbaren
Kanälen
entspricht; einem "M1"-Kanalbereich, der
einer im Wesentlichen gleichen Kanalgruppierung entspricht, mit der
Ausnahme, dass eine Anzahl von Kanälen an dem Ende mit niedriger
Intensität
des Kanalbereichs wegfällt;
und einem "M2"Kanalbereich, bei
dem eine weitere Anzahl von Kanälen
an dem Ende mit niedriger Intensität des Kanalbereichs wegfällt. Beispielsweise
entspricht bei einer Ausführungsform
in einem 256-Kanal-Detektorsystem der "Alle"-Kanalbereich den
Kanälen
0-256; "M1" entspricht den Kanälen 50-256;
und "M2" entspricht den Kanälen 90-256.
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Optimalerweise
wird die Anzahl von Ereignissen bei verschiedenen Intensitäten der
Lichtstreuung gleichzeitig gemessen und akkumuliert. Da sich Compounds
ablagern, verändert
sich die Partikelgröße auf zeitabhängige Weise.
Es ist möglich,
diese Veränderungen
in einem Kanalbereich zu detektieren und trotzdem keinen Unterschied
festzustellen, wenn ein anderer Kanalbereich gewählt wird. Das Default-Verfahren
dient zum Ermitteln der in dem breitesten Kanalbereich (der als "Alle" aufgeführt ist)
detektierten Lichtstreudaten. Häufig
erfolgt eine Interferenz von dem nichtwässrigen Lösungsmittel, das zum Herstellen
der Verdünnungen
des Test-Compunds verwendet wird. Zum Bespiel können, wenn Compound-Proben
aus 10 mM-Lösungen
in DMSO hergestellt werden, Verunreinigungen auftreten, die dazu
führen,
dass die "Alle"-Bereich-Daten unzuverlässig werden,
während
M1 oder M2 bei Vergleich der Anzahl von Blitzen in dem Kanalbereich
relativ zu der Konzentration des getesteten Compound jeweils eine
glatte Kurve bilden.
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Die
Ausrichtungsdaten von Kügelchen
können
jedoch unterschiedlich verarbeitet werden: bei jeder Prüfung der
Ausrichtung wird die Kügelchenposition
des Systems verifiziert, und wenn das voreingestellte Kügelchenkriterium
(Anzahl von in einem definierten Kanalbereich gezählten Kügelchen)
eingehalten ist, sichert das System die Gesamtanzahl von gezählten Kügelchen.
Diese Informationen können
in der Probenergebnis-Datei gesichert und ausgedruckt werden, wenn
die Probengruppierung (wie zum Beispiel die Proben in einer Mikrotiterplatte)
beendet ist. Rohdaten-Dateien können
sowohl für
Proben- als auch Ausrichtungsprüfungen
erzeugt werden, jedoch nur temporär von dem Durchflusszellensystem
gesichert werden, bis Proben von der nächsten Mikrotiterplatte bewertet
werden.
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Bei
einer weiteren alternativen Ausführungsform
des Durchflusszellensystems wird ein Farbstoff in den Probenstrom
eingespritzt, und die Position des Probenstroms kann dann durch
Analyse eines Bildes von einer Kamera, wie z.B. einer CCD-Kamera,
verifiziert werden. Die Software des Durchflusszellensystems kann
zum Detektieren von Veränderungen
in dem Probenstrom vorgesehen sein. Das System kann dann diese Informationen
ausgeben, wie zum Beispiel zum Warnen des Bedieners des Systems oder
zum Initiieren einer oder mehrerer Routinen zum automatischen Korrigieren
der Ausrichtung vorzugsweise in Echtzeit.
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Bei
einer weiteren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist das Detektionsverfahren von dem Brechungsindexunterschied
zwischen dem Mantel-Fluid und dem Probenstrom abhängig. Die Brechungsindexunterschiede
können
zum Verfolgen des Probenflüssigkeitsstroms
verwendet werden, wenn das Mantel-Fluid einen anderen Brechungsindex
hat als der Probenflüssigkeitsstrom.
Die Brechungsindexdetektion kann durch Anwendung eines beliebigen
Verfahrens erfolgen, z.B. durch Anwendung der Phasenkontrastdetektion.
Eine Einschränkung
bei dieser Vorgehensweise besteht darin, dass, wenn der Mantel und
der Probenpuffer die gleichen oder sehr ähnliche Brechungsindexe aufweisen,
dieses Verfahren nicht anwendbar ist.
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BEISPIEL
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Handelsübliche Compounds
von Sigma (Pyren, Trifluralin und Danazol) wurden in Pulverform
erworben und anschließend
in DMSO gelöst
(die Konzentration war auf 25 mM eingestellt). In Mikrotiterplatten
mit 96 Vertiefungen wurden Stamm-Compounds nacheinander weiter in
DMSO verdünnt
(1- bis 2,5-Fach),
um eine Abfolge von DMSO-Stammlösungsmitteln
für jedes
Compound herzustellen (bei variierender Compound-Konzentration).
Schließlich wurden
die verdünnten
Compound-Stammlösungen dreifach
in eine zweite Mikrotiterplatte, die einen wässrigen Puffer (pH-Wert 7,4,
Verdünnung
1 bis 100) enthielt, transferiert.
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Lichtstreudaten
wurden in einem erfindungsgemäßen System
durch Ablesen der Platte ungefähr 30
Minuten nach dem Einmischen in die wässrige Phase ermittelt. Steigende
Lichtstreuereignisse korrelieren mit abnehmender Lös lichkeit.
Compounds mit niedriger Löslichkeit
zeigen signifikante Lichtstreuereignisse oberhalb des Hintergrunds
bei niedrigen Compound-Konzentrationen.
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Bei
der vorliegenden Erfindung korrelierten die erhaltenen Ergebnisse,
die in 1A, 1B und 1C gezeigt
sind, gut mit der erwarteten Löslichkeit
der drei Compounds. Von einem überlappenden,
jedoch engeren Kanalbereich (M2-Streuereignisse)
erfasste Lichtstreuereignisse bestätigten die in dem Originalbereich
beobachteten Ablagerungsmuster. Kanalbereiche, bei denen kleinere
Partikel ausgeschlossen waren (wie z.B. bei dem hier gezeigten M2-Bereich)
werden häufig
zum Ausfiltern von (schwachen und variablen) Stör-Streuereignissen (Daten nicht
dargestellt) verwendet.
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Es
kann eine Softwareanalyse zum Analysieren von DMSO (oder eines anderen
nichtwässrigen
Lösungsmittels)
und Nur-Puffer-Kontrollen relativ zu den Compound-Proben angewendet
werden. Es können
unterschiedliche Cutoff Rules zum Feststellen, wann das von einer
Compound-Vertiefung gestreute Licht signifikant über dem von der Kontroll-Vertiefung
gestreuten liegt, verwendet werden. Kurz gesagt, werden die Gesamtdaten
von den Kontrollen mit den Gesamtdaten von den Proben (und denen
für die
anderen Regionen) verglichen. Die Cutoff Significance Rules sind
für jede
Region unterschiedlich, da die höhere
Anzahl von Ereignissen in den Regionen mehr Lichtstreuereignisse
von Lösungsmittel-
oder Schmutzstoffpartikeln umfassen kann. Letztere können häufig durch
Größenverteilung
von Ereignissen von abgelagerten Partikel des Test-Compound getrennt
werden. Dies erfolgt, wenn es eine signifikante Korrelation zwischen
der Anzahl von Ereignissen und der Konzentration des Proben-Compound
in einem Kanalbereich, jedoch in keinem weiteren Kanalbereich gibt.
Eine Softwareverarbeitung der Daten kann gemäß dieser Analyse zum Ermitteln,
welcher der Kanalbereiche die Ablagerung des Test-Compound von der
gesättigten
wässrigen Lösung des
Probenfluids genau und empfindlich widerspiegelt, angewendet werden.
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Das
erfindungsgemäße Durchflusszellen-Löslichkeitstest-System
ist insbesondere zum Hochdurchsatz-Löslichkeitstesten geeignet,
das zum Beispiel beim Löslichkeitstesten
von chemischen Bibliotheken, wie z.B. Bibliotheken für kombinatorische oder
andere synthetische chemische Compounds, benötigt wird. Die hier dargestellten
Ausführungsformen
und Beispiele dienen der Erläuterung
und dürfen nicht
als Einschränkung
des Schutzumfangs der Erfindung angesehen werden. Fachleute erkennen
sofort den vollen Umfang und die Anwendungen der vorliegenden Erfindung.