DE69017420T2

DE69017420T2 - Optisches Teilchenanalysegerät mit zwei Arten von Lichtquellen.

Info

Publication number: DE69017420T2
Application number: DE69017420T
Authority: DE
Inventors: Masakazu Fukuda; Hiroyuki Nakamoto; Hiroyuki Seshimo; Hidemichi Tohori
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 1990-02-08
Filing date: 1990-06-21
Publication date: 1995-08-17
Anticipated expiration: 2010-06-22
Also published as: JPH03233344A; EP0442025B1; DE69017420D1; EP0442025A1; CA2018619C; JP3049254B2; US5260764A

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf eine optische Teilchenanalysevorrichtung zum Bestrahlen eines Teilchenstroms in einer Probe, wie etwa in einer Flüssigkeit suspendierte Zellen, mit Licht, Erfassen von von individuellen Teilchen ausgesendetem Streulicht oder Fluoreszenz und Klassifizieren und Abzählen der Zellen. Spezieller bezieht sich die Erfindung auf eine optische Teilchenanalysevorrichtung, welche sowohl eine Laserlichtquelle als auch eine Lampenlichtquelle als die Bestrahlungslichtquellen verwendet.
Die Klassifizierung und Abzählung von Teilchen, wie etwa in Blut enthaltene weiße Blutzellen oder Reticulozyten, ist ein notwendiges und nützliches Werkzeug in klinischer Analyse, und der neueste Trend ist die Verwendung einer automatischen Teilchenanalysevorrichtung für diesen Zweck. In einer Analysevorrichtung dieser Art wird eine Blutprobe von einer Probensaugeinheit aufgezogen, die Probe wird in der Vorrichtung automatisch vorbehandelt und an einen Detektor geliefert, und von dem Detektor erfaßte Signale werden gezählt und analysiert, um eine Ausgabe der Anzahl und des Inhalts vorgeschriebener Zellen zu erhalten. Ein Beispiel solch einer Vorrichtung ist ein Strömungszytometer, in welchem die Blutprobe verdünnt und markiert wird, um eine Probenlösung zu erhalten, die dann durch den zentralen Abschnitt einer Strömungszelle in Form eines feinen Strahls geleitet wird. Eine Erfassungszone wird gebildet durch Bestrahlen eines Teils des feinen Strahls mit einem dünnen Lichtstrahl von einer Lichtquelle, und eine Änderung in Streulicht oder Fluoreszenz, die immer erzeugt wird, wenn individuelle Blutzellen die Erfassungszone passieren, wird von einem Fotodetektor erfaßt. Beispielsweise wird eine zweidimensionale Verteilung von den erfaßten Signalen gebildet, in welcher Streulichtintensität und Fluoreszenzlichtintensität entlang zweier Achsen dargestellt werden, und jedes Teilchen wird durch Einstellen von Demarkationslinien in der zweidimensionalen Verteilung klassifiziert und gezählt. Beispielsweise werden Reticulozyten von reifen roten Blutzellen oder Blutplättchen unterschieden, und das Zahlenverhältnis der Reticulozyten wird erhalten. Häufig wird ein Argonlaser als Lichtquelle verwendet.
In dem herkömmlichen Strömungszytometer wird der Argonlaser als Lichtquelle verwendet, um Teilchen zu Fluoreszenz anzuregen. Der Grund dafür ist, daß Licht im blauen Gebiet mit vergleichsweise kurzer Wellenlänge erforderlich ist, um als Anregungslicht verwendet zu werden, um Fluoreszenz zu erzeugen. Jedoch ist ein Argonlaser teuer, und der Laser belegt nicht nur viel Raum, sondern auch die peripheren Gerätschaften für den Laser, wie etwa die Stromversorgung zum Betreiben des Lasers, sind groß. Ein anderes Problem liegt in dem insgesamt hohen Stromverbrauch.
Obwohl es bevorzugt wird, anstelle eines Lasers für den Zweck des Erzeugens von Fluoreszenz kleines, preiswertes Lichtquellengerät zu verwenden, ist ein Halbleiterlaser, der in der Lage ist, Licht im blauen Gebiet auszusenden, gegenwärtig nicht verfügbar. Natürlich existieren Halbleiterlaser, welche Licht in den roten bis infraroten Gebieten erzeugen, jedoch kann Fluoreszenz mit Lichtquellen, die in diesen Wellenlängenregionen arbeiten, nicht erhalten werden.
Aus Review of Scientific Instruments, Band 55, Nr. 9, September 1984, Seiten 1375 bis 1400, ist ein Strömungszytometer bekannt, welches eine Strömungszelle umfaßt, Einrichtungen zum Leiten von Teilchen, wie etwa mit einem fluoreszierenden Farbstoff markierte Zellen, durch die Strömungszelle in Form eines feinen Teilchenstrahls, Einrichtungen zum Bestrahlen einer Bestrahlungszone in dem feinen Teilchenstrahl in der Zelle. Ferner sind aus diesem Dokument Einrichtungen zum Erfassen von von den Teilchen in der Bestrahlungszone erzeugtem Streulicht und Fluoreszenz bekannt und zum Ausgeben von Streulichtsignalen bzw. Fluoreszenzlichtsignalen.
Aus US 3 824 402 ist ein Strömungszytometer bekannt, welches einen einzelnen Lichttyp zum Messen von auf Licht reagierenden Eigenschaften von geeignet markierten, biologischen Zellen verwendet.
Streulicht und Eluoreszenzlicht werden erfaßt und auf Koinzidenz hin getestet, um sicherzustellen, daß sie von derselben Zelle stammten. Im Fall von Koinzidenz werden die Impulse einer Impulshöhenanalyse oder Signalverarbeitung unterzogen.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine optische Teilchenanalysevorrichtung vorzusehen, welche ein Strömungszytometer verwendet, worin kleinere Abmessungen und niedrigere Kosten durch Verbessern des Lichtquellengerätes erreicht werden können.
In einer optischen Teilchenanalysevorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung wird als die Lichtquelle zum Anregen von Teilchen in einer Probe zu Fluoreszenz keine große, teure Lichtquelle, wie etwa ein Argonlaser, verwendet, sondern es wird von einer kleinen, überall erhältlichen und leicht gewarteten Lichtquellenvorrichtung vom Lampentyp, wie etwa eine Halogenlampe, Quecksilberbogenlampe oder Wolframlampe, Gebrauch gemacht.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird diese Aufgabe gelöst durch eine optische Teilchenanalysevorrichtung zum Klassifizieren und Abzählen von Teilchen, mit
- einer Strömungszelle;
- Einrichtungen zum Leiten von Teilchen, wie etwa mit einem Pluoreszenzfarbstoff markierte Zellen, durch die Strömungszelle in der Form eines feinen Teilchenstrahls;
- Einrichtungen zum Bestrahlen einer Bestrahlungszone in dem feinen Teilchenstrahl in der Strömungszelle mit zwei Typen von Licht;
- Einrichtungen zum Erfassen von jeweiligem, von den Teilchen in der Bestrahlungszone erzeugten Streulicht bzw. Fluoreszenz, und Ausgeben von Streulichtsignalen bzw. Fluoreszenzsignalen,
dadurch gekennzeichnet, daß die zwei Arten von Licht, welche die Bestrahlungszone bestrahlen, ein von einer Laserlichtquelle ausgesendeter Laserlichtstrahl und ein von einer Lampenlichtquelle ausgesendeter Lampenlichtstrahl, welcher eine kürzere Wellenlänge als die des Laserlichtstrahls hat, sind, der Laserlichtstrahl und der Lampenlichtstrahl sich an der Bestrahlungszone schneiden, um dieselbe zu bestrahlen, und in der Bestrahlungszone der bestrahlende Laserlichtstrahl eine kleinere Strahlquerschnittsbreite aufweist als eine Larnpenlichtstrahlquerschnittsbreite in einer Richtung, in welcher die Teilchen strömen; und
worin, wenn das von dem Lampenlichtstrahl resultierende Fluoreszenzsignal von einem Signalprozessor signalverarbeitet wird, das von dem Laserlichtstrahl resultierende Streulichtsignal als ein Zeitgabesignal in der Signalverarbeitung verwendet wird, um das Fluoreszenzsignal an einer Spitze des Streulichtsignals als die Fluoreszenzintensität abzunehmen.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel ist die Laserlichtquelle ein Halbleiterlaser.
Ferner ist die optische Teilchenanalysevorrichtung der vorliegenden Erfindung dadurch gekennzeichnet, daß sich die aus dem Laserlichtstrahl und dem Lampenlichtstrahl gebildeten Bestrahlungslichtstrahlen miteinander in einem Winkel von näherungsweise 90º schneiden, und vorwärts gestreutes Licht und Seitenfluoreszenz, welche von dem Laserlichtstrahl bzw. Lampenlichtstrahl resultieren, und in derselben Richtung ausgesendet werden, nach Unterziehung einer Wellenlängenselektion erfaßt werden.
Die Vorrichtung ist ferner dadurch gekennzeichnet, daß sich die aus dem Laserlichtstrahl und dem Lampenlichtstrahl gebildeten Bestrahlungslichtstrahlen in einem Winkel von ungefähr 90º schneiden, und vorwärtsgestreutes Licht, welches von dem Laserlichtstrahl resultiert und in einer ersten Richtung ausgesendet wird, und seitengestreutes Licht und Rückwärtsfluoreszenz, welche von dem Laserlichtstrahl bzw. dem Lampenlichtstrahl resultieren, und in einer zweiten Richtung ausgesendet werden, erfaßt werden.
Obwohl eine Lampenlichtquelle allgemein klein und kostengünstig ist, kann die Bestrahlungszone in dem Strömungszytometer, durch welches die die suspendierten Teilchen enthaltende Probe strömt, nicht mit Licht von der Lampenlichtquelle bestrahlt werden, das so intensiv ist wie das von einem Argonlaser. Jedoch weist Licht von einer Lampe eine beträchtliche Breite auf, was bedeutet, daß es nicht ein einzelnes Spektrum ist, sondern sich über ein weites Wellenlängengebiet erstreckt. Solches Licht enthält Licht entsprechend einem Gebiet mit einer hohen Absorptionsspektrum-Intensität, welche für Teilchen spezifisch ist. Demzufolge wird Lampenlicht leicht von Teilchen absorbiert, obwohl die Intensität des Lichtes nicht so stark ist wie die von Laserlicht, und Fluoreszenz mit einer Lichtintensität äquivalent derjenigen, die mit Laserlicht erzielt wird, kann selbst dann erhalten werden, wenn Lampenlicht verwendet wird.
Ferner ist es für Lampenlicht schwierig, einen engen Strahl vorzusehen, der frei ist von irregulärer Lichtintensitätsverteilung, wie in der Weise von Laserlicht, und als Ergebnis ist das Fluoreszenzsignal solch einer Lampenlichtquelle ein irreguläres Signal mit großer Breite. Auf der Basis solch eines Signals ist es schwierig, eine von dem Fluoreszenzbetrag abgeleitete, charakteristische Quantität für jedes Teilchen zu erfassen. Beispielsweise ist eine Erfassung der Spitze des Signals und Erhalten ihres Wertes ohne komplizierte Signalverarbeitung unmöglich. Andererseits ist das von dem Laserlicht resultierende Streulichtsignal ein Signal mit einer einzelnen Spitze. In der vorliegenden Erfindung wird ein Signalprozessor verwendete um den Wert des Fluoreszenzsignals in dem Moment zu erfassen, in welchem das Streulichtsignal, welches von dem Laserlicht resultiert, eine Spitze erreicht. Spezieller wird das Streulichtsignal als ein Zeitgebersignal für die Verarbeitung des Fluoreszenzsignals verwendet. Zusätzlich wird der Spitzenwert des Streulichtsignals ebenfalls von dem Signalprozessor erfaßt. Das Streulicht enthält seitengestreutes Licht und vorwärtsgestreutes Licht. Seitengestreutes Licht ist gut geeignet zum Erhalten von Information bezüglich externer Morphologie, wie etwa Teilchengröße, und vorwärtsgestreutes Licht ist zum Erhalten von Information bezüglich interner Morphologie, wie etwa Teilchenkerne, geeignet. In einem Fall, in welchem Teilchen, wie etwa Reticulozyten, unabhängig klassifiziert und quantifiziert werden, mag es ausreichen, ein Vorwärtsstreulichtsignal zu erfassen sowie das Fluoreszenzsignal. Wenn Leukozyten klassifiziert und quantifiziert werden, ist es notwendig, ein Vorwärtsstreulichtsignal, Seitenstreulichtsignal und ein Fluoreszenzsignal zu erfassen.
Andere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung im Zusammenhang mit den begleitenden Zeichnungen, in welchen gleiche Bezugszeichen dieselben oder ähnliche Teile in allen Figuren bezeichnen.
Fig. 1 ist ein Diagramm, welches die grundlegende Konstruktion eines Ausführungsbeispiels einer Teilchenanalysevorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt;
Fig. 2 ist eine schematische Seitenansicht, welche eine Strömungszelle in der Vorrichtung der Fig. 1 zeigt;
Fig. 3 ist ein charakteristisches Bestrahlungsdiagramm;
Fig. 4a zeigt einen Querschnitt einer Laserlichtbestrahlung, und Fig. 4b ist eine Verteilung der Lichtintensität davon;
Fig. 5a zeigt einen Querschnitt einer Lampenlichtbestrahlung, und Fig. 5b ist eine Verteilung der Lichtintensität davon;
Fig. 6 ist ein Spektraleigenschaftsdiagramm von Teilchen- Lichtabsorption und Fluoreszenz;
Fig. 7 ist eine Darstellung zum Beschreiben eines Streulichtsignals und Fluoreszenzsignals;
Fig. 8 ist ein Blockdiagramm, welches ein Beispiel eines Signalprozessors zeigt; und
Fig. 9 ist ein Diagramm, welches die grundlegende Konstruktion eines zweiten Ausführungsbeispiels einer Teilchenanalysevorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt.
Fig. 1 ist ein Diagramm, welches die grundlegende Konstruktion eines Ausführungsbeispiels einer Teilchenanalysevorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt, und Fig. 2 ist eine schematische Seitenansicht, welche eine Strömungszelle in der Vorrichtung der Fig. 1 zeigt. Die Vorrichtung ist in der Lage, verschiedene Zellen, wie etwa Reticulozyten, in verschiedenen Proben, wie etwa Blut, zu klassifizieren und zu zählen. Durch Mischen der Blutprobe mit einem Oramin-O enthaltenden Reagens kann die RNA in den Reticulozyten fluoreszenzmarkiert werden. Dieses wird detailliert in den japanischen Offenlegungsschriften (KOKAI) Nr. 61-280565, 62-34058 und 64-35366 beschrieben. Die fluoreszenzmarkierte Blutprobe kann von einer Düse 24 mit konstanter Strömungsrate abgegeben werden. Ein ummantelter Strom wird erzeugt durch Leiten einer Mantel lösung über die Peripherie der Düse 24, und die Blutzellen werden in geordneter Strömung durch eine enge Bestrahlungszone am Mittelabschnitt der Strömungszelle 22 (die Strömung geht von hinten nach vorne auf der Seite in Fig. 1 und von unten nach oben in Fig. 2) geleitet. Eine Lichtquelle 10 ist ein kleiner Halbleiterlaser, welcher rotes Licht mit einer Wellenlänge von 670 nm als Beispiel aussendet. Das verwendete Licht kann, falls gewünscht, nahezu infrarotes Licht sein. Ziffer 26 bezeichnet eine Lampenlichtquelle, wie etwa eine Halogenlampe. Das Laserlicht von dem Laser 10 wird von einem optischen Bestrahlungssystem 12 kondensiert, und das Licht von der Lampe 26 wird im Hinblick auf eine ausgewählte Wellenlänge davon durch ein optisches Bestrahlungssystem 28 kondensiert. Somit wird die Probenbestrahlungszone der Strömungszelle 22 mit dem kondensierten Laserlicht und dem kondensierten Lampenlicht bestrahlt. In diesem Ausführungsbeispiel wird die Strömungszelle 22 mit dem Laserlicht von der Vorderseite der Zelle bestrahlt und mit dem Lampenlicht von einer Seite der Zelle. Diese beiden Bestrahlungslichtstrahlen schneiden sich rechtwinklig an der ummantelten Strömungsbestrahlungszone. Streulicht und Fluoreszenz werden erzeugt durch Leiten der fluoreszenzmarkierten Blutzellen durch die Bestrahlungszone, wo sich die Lichtstrahlen schneiden. In diesem Ausführungsbeispiel wird vorwärtsgestreutes Licht, welches erhalten wird durch Verwenden des Laserlichts als das Bestrahlungslicht, über einen engen Winkel von 5 bis 15º bezüglich einer optischen Achse 14 der Laserbestrahlung ausgesendet, Seitenfluoreszenz, die erhalten wird durch Verwenden des Lampenlichts als Anregungslicht, wird in einem Winkel von ungefähr 90ºbezüglich einer optischen Achse 30 der Lampenlichtbestrahlung ausgesendet, das vorwärtsgestreute Licht und die Seitenfluoreszenz durchlaufen Wellenlängenselektion, die von einem optischen Lichtempfangssystem 40 durchgeführt wird, und diese werden dann von jeweiligen Lichtempfangselementen 58, 54 erfaßt.
Fig. 3 ist ein Diagramm, welches typische Eigenschaften von Bestrahlungslicht zeigt, in welchem die Ziffern 60, 62 bzw. 64 charakteristische Kurven von Anregungslicht (Lampenlicht), Fluoreszenz und Bestrahlungslicht (Laserlicht) in der Reihenfolge, beginnend von den kürzeren Wellenlängen, bezeichnen.
Das optische System 12 des Laserlichts umfaßt eine Kollimatorlinse 16 und Sammellinsen 18, 20, und das optische System 28 des Lampenlichts umfaßt eine Sammellinse 32, ein Nadelloch 34, einen Filter 36 und eine Sammellinse 38.
Fig. 4a und 5a sind Querschnitte von Bestrahlungslicht in der Probenbestrahlungszone, gesehen von der stromabwärtigen Seite der optischen Laserlichtachse 14 bzw. der stromabwärtigen Seite der optischen Lampenlichtachse 30. Die Pfeile bezeichnen die Richtung des Probenstroms. Wie in Fig. 4a gezeigt, wird die Ausdehnung eines Laserstrahls 66 in der Richtung des Probenstroms auf einen Wert verengt, der näherungsweise äquivalent dem Teilchendurchmesser der Blutzelle ist, beispielsweise ungefähr 10 um. Die Ausdehnung in der Richtung rechtwinklig zur Probenströmungsrichtung und der Richtung der optischen Bestrahlungsachse wird ausreichend größer gemacht als der Blutzellenteilchendurchmesser, beispielsweise 150 bis 300 um. Somit hat der Querschnitt des Laserstrahls 66 eine elliptische Gestalt. Wie in Fig. 4b gezeigt, ist die Lichtintensitätsverteilung 68 dieses Laserstrahls eine Gauss-Verteilung mit einer einzelnen Spitze. Wie in Fig. 5a gezeigt, ist es schwierig, den Querschnitt eines Lampenlichtstrahls 70 in der Bestrahlungszone der ummantelten Strömung in der Weise des Laserstrahls 66 zu verengen, und die Lichtintensitätsverteilung 72 des Lampenlichtstrahls ist irregulär, wie in Fig. 5b gezeigt. Immer wenn ein fluoreszenzmarkiertes Blutzellenteilchen die Bestrahlungszone am Schnittpunkt dieser Lichtstrahlen Passiert, sendet das Teilchenstreulicht Fluoreszenz aus. Durch Erfassen und Analysieren des Streulichts und der Fluoreszenz kann Information, wie etwa Teilchengröße und RNA-Gehalt im Hinblick auf jedes individuelle Blutzellenteilchen erhalten werden.
In der Beschreibung dieses Ausführungsbeispiels, soweit nicht anders spezifiziert, bedeutet "Vorwärtsstreulicht" vorwärtsgestreutes Licht, das von dem Laserlicht resultiert, "Seitenstreulicht" bedeutet zur Seite gestreutes Licht, das von dem Lampenlicht resultiert, und "Seitenfluoreszenz" bedeutet Seitenfluoreszenz, die von dem Lampenlicht resultiert.
Das von den Blutzellenteilchen emittierte Licht, nämlich das von dem Laserlicht resultierende Vorwärtsstreulicht, und das von dem Lampenlicht resultierende Seitenstreulicht und die Seitenfluoreszenz unterläuft Wellenlängenselektion, die von dem optischen Lichtempfangssystem 40 durchgeführt wird, und das Vorwärtsstreulicht und die Seitenfluoreszenz werden von den Lichtempfangselementen 58 bzw. 54 erfaßt. In diesem Fall, wie in Fig. 1 gezeigt, umfaßt das optische Lichtempfangssystem 40 eine Kollektorlinse 46, ein Nadelloch 48, einen dichroischen Spiegel 50, ein Bandpaßfilter 52 und eine Kollektorlinse 56. Der dichroische Spiegel 50 ist mit einem Winkel von 45º bezüglich der optischen Lichtempfangsachse 42 angeordnet und hat eine Charakteristik, gemäß welcher 80 bis 90% von kurzwelligem Licht durchgelassen wird (d.h. 10 bis 20% reflektiert wird), und mehr als 99% von langwelligem Licht reflektiert wird (d.h. weniger als 1% durchgelassen wird), im Hinblick auf das von dem Spiegel empfangene Licht. Demzufolge wird mehr als 99% des vorwärtsgestreuten Lichts, das von dem Laserlicht resultiert, reflektiert, um auf das Lichtempfangselement 58 zu treffen. Das Vorwärtsstreulicht, das von dem dichroischen Spiegel 50 durchgelassen wird, ist weniger als 1%. Mittel- und kurzwelliges Licht wird von dem dichroischen Spiegel 50 mit einem Dämpfungsfaktor von 10 bis 20% durchgelassen. Das Licht mit mittlerer Wellenlänge, nämlich die von dem Lampenlicht resultierende Seitenfluoreszenz, wird selektiv von dem Bandpaßfilter 42 durchgelassen, um auf das Lichtempfangselement 54 aufzutreffen. Das kurzwellige Licht, nämlich das von dem Lampenlicht resultierende Seitenstreulicht, hat eine Intensität, welche weniger als 1% von derjenigen des von dem Laserlicht resultierenden Vorwärtsstreulichtes ist. Dieses kurzwellige Licht wird von dem Bandpaßfilter 52 ausreichend abgeschwächt. Der geringe Betrag von von dem dichroischen Spiegel 50 durchgelassenem Vorwärtsstreulicht wird ebenfalls von dem Eandpaßfilter 52 ausreichend abgeschwächt. Somit kann die Seitenfluoreszenz von dem Lichtempfangselement 54 erfaßt werden, ohne von dem Vorwärtsstreulicht und dem Seitenstreulicht beeinflußt zu werden. Andererseits wird 10 bis 20% des mittel- und kurzwelligen Seitenstreulichtes und der Seitenfluoreszenz reflektiert, wonach das verbleibende Licht auf das Lichtempfangselement 58 trifft. Weil jedoch dieses Licht im Vergleich mit dem Vorwärtsstreulicht sehr schwach ist, hat es keine Auswirkung auf die Erfassung des Vorwärtsstreulichtes. Eine Fotodiode und ein Fotovervielfacher sind als die Lichtempfangselemente 58 bzw. 54 geeignet.
In einem Fall, daß Lampenlicht zum Anregen von Fluoreszenz verwendet wird, wird Licht, das so stark ist wie das Licht von einem Argonlaser, nicht erhalten. Jedoch hat das Licht, wie in Fig. 3 gezeigt, nicht nur eine Wellenlänge und weist kürzere Wellenlängenkomponenten, wie die eines Argonlasers, auf.
Fig. 6 stellt ein Lichtabsorptions-/Fluoreszenzspektrum für Blutzellenteilchen dar. Wenn eine Argonlaserwellenlänge von 488 nm auf dem rechten Rand eines Absorptionsspektrums 74 liegt, ist die Intensität des Absorptionsspektrums in diesem Wellenlängengebiet niedrig. Um starke Fluoreszenz zu erhalten, ist deshalb eine Bestrahlung mit entsprechend starkem Licht erforderlich. Weil jedoch das Absorptionsspektrum 74 eine hohe Intensität aufweist, wird Licht mit einer kürzeren Wellenlänge als 488 nm leicht absorbiert, und starke Fluoreszenz wird selbst mit schwachem Licht erzeugt. Somit wird Fluoreszenz näherungsweise äquivalent derjenigen, die mit einem Argonlaser erreichbar ist, selbst mit dem vergleichsweise schwachen Licht von dem Lampenlicht erhalten. Demgemäß ergeben sich für die Erfassung von Fluoreszenz keine Behinderungen. Ziffer 76 bezeichnet ein Fluoreszenzspektrum entsprechend der Lichtabsorption durch Blutzellenteilchen.
Wie in den Fig. 4a und 4b gezeigt, kann der Laserlichtstrahl in der Richtung des Teilchenstroms verengt werden, und die Lichtintensitätsverteilung davon ist eine Gauss-Verteilung. Demgemäß wird ein pulsförmiges Vorwärtsstreulichtsignal 78 mit einer einzelnen Spitze erhalten, wenn die Blutzellenteilchen die Bestrahlungszone passieren. Der Spitzenwert dieses Streulichtsignals entspricht der Größe des Teilchens, welches durch die Bestrahlungszone verlaufen ist.
Andererseits, wie in den Fig. 5a und 5b gezeigt, weist der Lampenlichtstrahl eine Lichtspektrumsbreite beträchtlicher Größe auf, und die Verteilung ist sehr irregulär. Demzufolge ist das erhaltene Fluoreszenzsignal 80 ebenfalls breit und irregulär, wie in Fig. 7 dargestellt. Es ist schwierig, die Fluoreszenzintensität aus solch einem Signal zu extrahieren. Demgemäß wird in der vorliegenden Erfindung das Vorwärtsstreulichtsignal 78 als Triggersignal des Seitenfluoreszenzsignals bei der Signalverarbeitung verwendet. Mit anderen Worten, wird ein Spitzenwert P des Fluoreszenzsignals in dem Moment, in dem das Streulichtsignal seinen Spitzenwert erreicht, als die Fluoreszenzintensität erfaßt.
Fig. 8 ist ein Blickdiagramm, welches ein Beispiel eines Signalprozessors 82 zeigt. Vorwärtsstreulicht wird fotoelektrischer Umwandlung durch das Lichtempfangselement 85 unterworfen, dessen Ausgabe von einem Verstärkerschaltkreis 84 verstärkt wird. Das verstärkte Signal wird von der Vorderflanke bis zur Spitze davon von einem Spitzenerfassungsschaltkreis 86 erfaßt. Letzterer kann mit Leichtigkeit konstruiert werden unter Verwendung eines differenzierenden Schaltkreises und eines Komparators als Beispiel. Das verstärkte Signal von dem Verstärkerschaltkreis 84 wird in einen Phasenkompensationsschaltkreis 90 gegeben, wo dem Signal eine vorbestimmte Zeitverzögerung verliehen wird. Ein Diskriminierungsschaltkreis 88 bestimmt, ob das Erfassungssignal von dem Spitzenerfassungsschaltkreis 86 ein Signal von einer Blutzelle oder Rauschen ist. Dieses kann von der Breite des Streulichtsignals beurteilt werden. Die Ausgabe des Phasenkompensationsschaltkreises 90 wird an einen Spitzenhalteschaltkreis 92 gegeben, dessen Ausgabe an einen A/D-Wandlerschaltkreis 94 geliefert wird. Wenn das Signal von dem Spitzenerfassungsschaltkreis 86 befunden wird, ein Blutzellensignal zu sein, sendet der Diskriminierungsschaltkreis 88 ein Einstellsignal 93 an den Spitzenhalteschaltkreis 92, welcher reagiert durch Halten des Spitzenwertes des Blutzellensignals. Zusätzlich sendet der Diskriminierungsschaltkreis 88 ein A/D-Umwandlungsstartsignal an den A/D-Wandler 94, welcher mit der Durchführung einer A/D-Wandlung reagiert. Als Ergebnis wird der Spitzenwert des Vorwärtsstreulichtsignals von einem Blutzellenteilchen von einer analogen in eine digitale Quantität umgewandelt.
Die Seitenfluoreszenz wird durch das Lichtempfangselement 54 einer fotoelektrischen Umwandlung unterzogen. Das resultierende Signal wird von einem Verstärkerschaltkreis 96 verstärkt, und das verstärkte Signal wird an einen Phasenkomensationsschaltkreis 98 geliefert. Dieses Signal wird einer Spitzenhalte- und A/D-Umwandlungsverarbeitung durch einen Spitzenhalteschaltkreis 100 bzw. einen A/D- Umwandlerschaltkreis 102 unterworfen, mit einer identischen Zeitsteuerung wie die des Fluoreszenzsignals. Der Spitzenwert des Streulichtsignals und der Spitzenwert des Fluoreszenzsignals, welches fortdauert, wenn das Streulichtsignal einen Spitzenwert hat, werden an eine Datenanalysiereinheit 104 geliefert, wo eine Analyse verschiedener Arten auf der Grundlage des Fluoreszenzintensitätswertes usw. durchgeführt wird.
Fig. 9 ist ein Diagramm, welches die grundlegende Konstruktion eines anderen Ausführungsbeispiels der vorliegenden Erfindung zeigt. In dieser Anordnung wird von Teilchen in der Bestrahlungszone aufgrund einer Bestrahlung mit Laserlicht von einer Laserlichtquelle 110 ausgestrahltes Vorwärtsstreulicht von einem Lichtempfangselement 158 erfaßt, Seitenstreulicht, welches in gleicher Weise ausgesendet wird, wird von einem Lichtempfangselement 166 erfaßt, und von Teilchen aufgrund einer Bestrahlung mit Lampenlicht von einer Lampenlichtquelle 126 ausgesendete Rückwärtsfluoreszenz wird von einem Lichtempfangselement 170 erfaßt. Weil eine Anordnung getroffen ist, ebenfalls das Seitenstreulicht zu erfassen, kann ebenfalls eine hochpräzise Teilchenanalyse durchgeführt werden. Beispielsweise ist diese Anordnung geeignet zum Klassifizieren und Zählen von in Blutzellenteilchen enthaltenen Leukozyten.
Aufgrund der Wirkung eines eine Linse 132, ein Nadelloch 134, einen dichroischen Spiegel 136 und eine Linse 138 umfassenden optischen Bestrahlungssystems wird die Probenbestrahlungszone einer Strömungszelle 122 allein mit dem kurzwelligen Licht des von der Lampenlichtquelle 176 ausgesendeten Lichtes bestrahlt. Die Probenbestrahlungszone wird mit Laserlicht, das von einer Laserlichtquelle 110 ausgesendet wird, mittels eines optischen Bestrahlungssystems mit Linsen 116, 118, 120, bestrahlt. Das resultierende Vorwärtsstreulicht wird von einem optischen Lichtempfangssystem 140 mit einem Strahlteiler 144, einer Linse 146 und einem Nadelloch 148 gesammelt, und das gesammelte Licht wird von dem Lichtempfangselement 158 erfaßt. Zusätzlich durchläuft das von dem Laserlicht resultierende Seitenstreulicht ebenso wie das Rückwärtsstreulicht und die von dem Lampenlicht resultierende Rückwärtsfluoreszenz eine von einem optischen Lichtempfangssystem mit einer Linse 138, einem dichroischen Spiegel 136, einem Nadelloch 160, einem dichroischen Spiegel 162 und Filtern 164, 168 durchgeführte Wellenlängenselektion, und das von dem Laserlicht resultierende Seitenstreulicht und die von dem Lampenlicht resultierende Rückwärtsfluoreszenz werden von Lichtempfangselementen 166 bzw. 170 erfaßt.
Somit verwendet die optische Teilchenanalysevorrichtung der vorliegenden Erfindung Lampenlicht zum Anregen von probenteilchen zu Fluoreszenz, verwendet einen Halbleiterlaser für Streulichtbeleuchtung und ist so angeordnet, daß der Laserlichtstrahl und Lampenlichtstrahl von kompakten, kostengünstigen Lichtquellen einander an der Bestrahlungszone eines feinen Teilchenstroms einer Strömungszelle, um die Teilchen zu bestrahlen, schneiden. Als Ergebnis kann das Streulicht und die Fluoreszenz von einem Teilchen an demselben Ort und mit derselben Zeitgabe erfaßt werden. Weil das Laserlicht ferner fein gebündelt werden kann und eine einzelne Spitze besitzt, ist auch das Streulichtsignal ein Signal mit einer einzelnen Spitze. Weil das Streulichtsignal als Zeitgabesignal verwendet wird, um den Wert des Fluoreszenzsignals zu erfassen, ist es möglich, das Fluoreszenzsignal zu erfassen, welches mit dem Fluoreszenzbetrag, der von dem Teilchen ausgesendet wird, korreliert ist, selbst wenn die Verteilung der Lampenlichtintensität irregulär ist.
In einem Fall, daß das von dem Laserlicht resultierende Vorwärtsstreulicht und die von dem Lampenlicht resultierende Fluoreszenz in einer identischen Richtung erfaßt werden, kann mit einem einfachen optischen System eine Klassifizierung und Abzählung von Reticulozyten durchgeführt werden.
Eine Analyse mit noch größerer Präzision wird möglich durch Erfassen von Vorwärtsstreulicht, welches von dem Laserlicht resultiert, und in einer ersten Richtung ausgesendet wird, ebenso wie Seitenstreulicht und Rückwärtsfluoreszenz, welche von dem Laserlicht bzw. dem Lampenlicht resultieren, und in einer zweiten Richtung ausgesendet werden. Solch eine Anordnung ist geeignet für die Klassifizierung und Abzählung von Leukozyten.
Weil viele anscheinend weit verschiedene Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung gemacht werden können, ohne vom Umfang derselben abzuweichen, versteht sich, daß die Erfindung nicht auf die spezifischen Ausführungsbeispiele davon beschränkt ist, außer wie in den folgenden Ansprüchen definiert.

Claims

1. Optische Teilchenanalysevorrichtung zum Klassifizieren und Abzählen von Teilchen, mit

- einer Strömungszelle (22, 122);

- Einrichtungen (24) zum Leiten von Teilchen, wie etwa mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierte Zellen, durch die Strömungszelle (22, 122) in der Form eines feinen Teilchenstrahls;

- Einrichtungen (10, 26, 110, 126) zum Bestrahlen einer Bestrahlungszone in dem feinen Teilchenstrahl in der Strömungszelle (22, 122) mit zwei Typen von Licht;

- Einrichtungen (54, 58, 158, 166, 170) zum Erfassen von jeweiligem, von den Teilchen in der Bestrahlungszone erzeugten Streulicht bzw. Fluoreszenz, und Ausgeben von Streulichtsignalen bzw. Fluoreszenzsignalen,

dadurch gekennzeichnet, daß die zwei Arten von Licht, welche die Bestrahlungszone bestrahlen, ein von einer Laserlichtquelle (10, 110) ausgesendeter Laserlichtstrahl (14) und ein von einer Lampenlichtquelle (26, 126) ausgesendeter Lampenlichtstrahl (30), welcher eine kürzere Wellenlänge als die des Laserlichtstrahls hat, sind, der Laserlichtstrahl (14) und der Lampenlichtstrahl (30) sich an der Bestrahlungszone schneiden, um dieselbe zu bestrahlen, und in der Bestrahlungszone der bestrahlende Laserlichtstrahl eine kleinere Strahlquerschnittsbreite als eine Lampenlichtstrahl-Querschnittsbreite in einer Richtung, in welcher die Teilchen strömen, aufweist; und

worin, wenn das von dem Lampenlichtstrahl resultierende Fluoreszenzsignal von einem Signalprozessor (82) signalverarbeitet wird, das von dem Laserlichtstrahl resultierende Streulichtsignal als ein Zeitgabesignal in der Signalverarbeitung verwendet wird, um das Fluoreszenzsignal an einer Spitze des Streulichtsignals als die Fluoreszenzintensität abzunehmen.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Laserlichtquelle ein Halbleiterlaser ist.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die aus dem Laserlichtstrahl und dem Lampenlichtstrahl gebildeten Bestrahlungslichtstrahlen sich einander mit einem Winkel von näherungsweise 90º schneiden, und vorwärtsgestreutes Licht und Seitenfluoreszenz, welche von dem Laserlichtstrahl bzw. dem Lampenlichtstrahl resultieren, und in derselben Richtung ausgesendet werden, nach Durchlaufen einer Wellenlängenselektion erfaßt werden.

4. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die aus dem Laserlichtstrahl und dem Lampenlichtstrahl gebildeten Bestrahlungslichtstrahlen sich einander mit einem Winkel von näherungsweise 90º schneiden, und vorwärtsgestreutes Licht, welches von dem Laserlichtstrahl resultiert und in einer ersten Richtung ausgesendet wird, ebenso wie seitengestreutes Licht und Rückwärtsfluoreszenz, welche von dem Laserlichtstrahl bzw. dem Lampenlichtstrahl resultieren, und in einer zweiten Richtung ausgesendet werden, erfaßt wird.