FI98765C - Virtaussytometrinen menetelmä ja laite - Google Patents

Description

98765

5 VIRTAUSSYTOMETRINEN MENETELMÄ JA LAITE - FLÖDESCYTOMETRISK METOD OCH ANORDNING

Virtaussytometri on laite, jolla tutkitaan ja lajitellaan soluja. Solut ovat nestesuspensiossa ja tämä suspensio 10 pumpataan ohuen kapillaarisen kyvetin läpi, johon kohdistetaan lasersäde kohtisuoraan virtausta vastaan. Lasersäde voidaan myös kohdistaa vapaassa ilmassa virtaavaan solususpensioon eli ohuesta nestekanavasta tulevaan suihkuun. Kaikissa virtaussytometreissä 15 käytetään solujen hydrodynaamista fokusointia, jolla solut saadaan virtaamaan virtauskanavan keskiakselilla hyvin kapeana jonona.

Virtaussytometriassa soluista mitataan lasersäteen 20 herättämää fluoresenssia ja valon sirontaa, ja näiden parametrien avulla solut luokitellaan niiden ominaisuuksien mukaan. Solut voidaan ennen mittausta käsitellä fluoresoivilla väriaineilla tai fluoresoivilla väriaineilla leimatuilla biospesifisillä reagensseilla 25 kuten esim. vasta-aineilla. Jälkimmäisessä tapauksessa solujen luokittelu tapahtuu niiden immunokemiallisten ominaisuuksien mukaan. Virtaussytometri voi olla tehty solujen analysointia varten tai niiden valikointia varten. Jälkimmäisessä tapauksessa virtaussytometriin on 30 yhdistetty sähköstaattinen poikkeutuslaite, jonka avulla sähköisesti varatut nestepisarat, joissa voi olla eri luokkiin kuuluva solu, saadaan kerätyksi eri kyvetteihin.

*

Virtauksen nopeus virtaussytometrissä on tavallisesti 10-35 100 cm sekunnissa. Tästä seuraa, että jokainen solu viipyy lasersäteen vaikutuksen alaisena noin 10-100 mikrosekunnin ajan. Valoilmaisimeen saadaan fluoresenssin emissiosta syntynyt fotonipulssi ja valoilmaisimesta tullut sähköisen impulssin amplitudi on 98765 suoraan verrannollinen solussa olleeseen fluoresoivan väriaineen määrään.

Sähköiset impulssit analysoidaan ja rekisteröidään 5 elektronisesti ja tulokseksi saadaan diagrammi, joka ilmoittaa solujen lukumäärän niiden fluoresenssin funktxona .

Virtaussytometrillä tehtävien mittauksien tarkkuutta ja K) luotettavuutta heikentävät erilaiset häiriötekijät, joista merkittävimmät ovat epäspesifinen fluoresenssi, solujen autofluoresenssi, svtometrin optiikan fluoresenssi ja ilmaisimissa syntyvä Kohina. Nämä häiriötekijät aiheuttavat variant i ota solujen 15 fluoresenssista saataviin pulsseihin ja sen .’.suksi viedä ylimääräisiä satunnaisia pulsseja. Naista häiriötekijöistä johtuu, ettei tavallisella virtaussytometrillä pystytä erottamaan riittävällä luotettavuudella tutkittavien solujen joukosta hyvin ?o pieniä määriä poikkeavia soluja. Naista häiriöistä johtuu, että solujoukkojen, jotka edustavat pienempää kuin 1/1000-osaa, erottaminen pää j ui; ke s ta ei cd: luotettavaa. Esimerkkejä tällaisista n s. cvnnaisise. soluista ovat verenkierrossa esiintyvä·: irronnec-t 25 syöpäsolut. ja istukan kautta äidin verenkiertoon siirtyneet sikiön solut. Näiden harvinaisten solujen ' luotettavalla ja nopealla dignoosilla on suuri merkitys lääketieteessä.

o Tämän keksinnön tarkoituksena en esi tiaa paremp: menetelmä j a laite virta ussy tometr is ia r.i 1f·; uksi 3 varten . Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä :u taitteella voidaan parantaa olellisesti virtaussytometri!la suoritettavien fluorenssimittausten luotettavuutta ja 35 tarkkuutta. Erityisesti tällä menetelmällä voidaan vähentää edellä mainittuja häiriötekijöitä ja parantaa virtaussytometrin erottelukykyä harvinaisten solujen ana 1 ysoinmssa .

u . · u.t 11· 1 i.t.jt. . . * 98765

Keksinnön tunnusmerkit ilmenevät patenttivaatimuksesta 1.

Virtaussytometriassa käytettävien tavanomaisten 5 orgaanisten fluoresoivien väriaineiden etuna on korkea viritysvalon absorptio ja fluoresenssin kvanttitehokkuus, mutta niiden käyttöä haittaa kuitenkin sironnasta, optisten osien taustafluoresenssista ja solujen autofluoresenssista syntyvä taustasignaali, joka 10 rajoittaa mittausherkkyyttä. Käyttämällä näiden fotoluminoivien leimojen signaalien mittaamisessa konfokaalista optiikkaa ja riittävän hyvää spektrometristä erottelua voidaan mittausherkkyyttä parantaa(5. Nie &al. Science 226 (1994) 1918-1021).

I 5

Oleellista tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä on kuitenkin havainto, että sironnasta ja taustafluoresenssista aiheutuva ongelmaa voidaan vähentää, jos virityksessä käytetään kaksois-'20 f otoni v i r i tystä . Kaksois fotoni viritys voi syntyä, kun voimakkaan viritysvalon kohdennuksella saadaan fotonien tiheys ti iavuusyksikköa ja aikayksikköä sonti ni in suureksi, että kahden fotonin energia asse rbo:tuu samaan kromoforiin. Tällöin myös absorboituva energia on kahden 25 fotonin energia summa. Fluoresoivien aineiden kaksois fotoniviritys on tunnettu mm. spektroskopian ja mikroskopian alalla (U.S Pat. 5.034.613). Yksittäisen fotonin absorptio väriaineeseen on todennäköisyyslaskennan käsitteiden mukaisesti riippumaton '<> tapahtuma ja useiden fotonien absorbs i tum_nen n; joukko yksittäisiä, riippumattomia tapahtumia. Y-.sm. t ta : sen fotonin absorboitumisen todennäköisyyttä vo i due. n kuvata lineaarisella funktiolla, niin kauan kuin viritettävät energiatilat eivät ole kyllästyneet. Kahden fotonin λ 5 absorptio on epälineaarinen prosessi. Kaksois- fotonivirityksessä väriainemolekvylin virittyminen tapahtuu ainoastaan, kun kumpikin fotoni absorboituu samanaikaisesti. Kahden fotonin absorpt i nr. todenna köisvys 98765 on yksittäisten fotonien absorptiotociennäköi syyksien tulo. Kahden fotonin aiheuttama emissio on siis neliöllinen prosessi.

5 Solujen fluoresenssin virittämiseen ta rkoi tetun optisen järjestelmän ominaisuuksia voidaan kuvata järjestelmän vasteella pistemäiseen valolähteeseen. ristemämen valolähde muodostaa diffraktion vaikutuksesta optiselle järjestelmälle ominaisen intensiteettijakauman 10 tarkennuspisteessä (pistevaste). Normalisoituna tämä intensiteettijakauma on todennäköisyysjakauma sille, kuinka pistemäisestä valolähteestä lähteneet fotonit saapuvat tarkennusalueeile. Ka ksoi s fotonitekni i ka 1 la virityksen todennäköisyysiakauma on ensimmäisen fotonin 11 ja to: sen fotonin intensiteettij akaem ; en · ounahsouu tulo. Näin saatu todenna koi syys janauma ·- n 1 -1 ot te i sessa avaruudessa, eritoten syvyyssuunnassa, selväsii yksittäisen fotonin todennäköisyysjakaumaa rajautuneempi. Kaksoisfctonivirityksellä herätetään näin ollen lo ainoastaan se fluoresenssi, joka syntyy valonsäteen tarkennuspisteen selvästi rajatussa 3-uiotteisessa lähi.ympäristössä.

Kun variame viritetään ka ks : '. s : 1..·' ·. ::v_ i 11 y kse 1 ; a , 1.1 vähenee valon sironta kohdennuspis teen ympäristöstä ja optisista komponenteista huomattavasti verrattuna normaaliin viritykseen. Edelleen kaksoisfotonivirltvs vähentää tausta fluoresenssin syntymistä näytteessä kohdennuspisteen ulkopuolella, näytteen ympäristössä ja '<> optiikassa. Koska vii ittavä valonsäde on fokusoitava mahdo 111 s i nunan pieneksi pisteeksi, ka ks:o s foton i vi r i t; ys sopii i parhaiten pienien näytetilavunks i en tai kohteiden analysointiin, mistä en kysymys myös tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä.

Kaksoisfotonivirityksen etu on myös siinä, että esim. uitraviolettialueella tai sinisellä alueella tapahtuvaan viritykseen voidaan käyttää näkyvät tai lah-1n f rapuna- *5 9876,5 alueen (NIR) valoa. Samoin voidaan näkyvällä alueella tapahtuva viritys tehdä NIR-alueella olevalla valonsäteellä. Koska valolähteen aallonpituus on huomattavasti pidempi kuin väriaineen emission 5 aallonpituus, voidaan valolähteen aallonpituudella ja sen ympäristössä syntyvä sironta ja mahdollinen autofluoresenssi vaimentaa alipäästösuodattimia käyttämällä tehokkaasti (vähintään 10 kertalukua) ja estää pääsemästä fluoresenssiemission ilmaisimelle.

K)

Useimmiten kaksoisfotoniviritys vaatii korkeatehoisten ultralyhyitä pulsseja tuottavien laserlaitteiden käyttöä. On kuitenkin todettu, että myös jatkuvalla laservalolla voidaan havaita kaksois foton lvi r i t yksi ä ;Γ.Έ- 15 pa tenttihaKemus P 44 14 0940.9-42 ja P. Hänninen lal, Proceedings ror Three-Dimensional Microscopy, SPIK -The International Society for Optical Engineering, 1994, Voi. 2184, tc-71). Suorittamissamme kokeissa olemme havainneet, että kaksoisfotonivirityksellä ja h) lyhytikäisillä fluoresoivilla leimoilla voidaan saavuttaa erittäin hyvä signaali-tausta-suhde ja herkkyys. Esimerkkeinä lyhytikäisistä kaksois fotoniviritykseen sopivista fluoresoivista väriaineista voidaan mainita coumariinm ja rodami min johdannaiset.

2.1 Tälle keksinnölle on myös luonteenomaista, että tässä • esitetty mikrofotometrinen mittausjärjestelmä pystyy optisesti erottamaan soluista lähtevän valoemission solu]en ympäristössä olevasta liuoksesta lähtevästä '<) va loemissios ta. Tämä erottelukyky perustuu siihen, että kun solususpensiota laimennetaan huomattavasti, son·: fotoni -ilmaisimen fokusalueeseen kerrallaan vain yksi solu ja liuoksessa olevien vapaiden leimattujen reagenssien aiheuttama taustasignaali on vahainen.

15 Kaksoisfotonivir!tystä käytettäessä virityksen tehokkuus on verrannollinen viritysvalon tehon neliöön ja sen vuoksi kaksoisfctoniabsorption epälineaarisuutta voidaan käyttää hyväksi virityksen kohdentamisessa paljon ♦ 98765 rajoitetummalle kuin yksöisfotonivirityksensä. Tämä kaksoisfotonivirityksen ominaisuus vahvistaa oleellisesti soluista lähtevän valoemission erottelua solujen ympäristössä olevasta liuoksesta ja optisista osista 5 lähtevästä valoemissiosta.

Tälle keksinnölle on myös luonteenomaista se, että normaalisti virtaussytometreissä käytettävän kalliin argon-ioni-laserin tai muiden vastaavien kaasuiasereiden H) sijasta voitaisiin käyttää halvempaa ja pitkäikäisempää NIR-alueen kiinteän olomuodon laseria. Kysymykseen voivat tulla myös puolijohdelaserit. Tämän keksinnön mukainen menetelmä ja siihen tarvittava laitteisto voidaan toteuttaa käytännössä monella eri tavalla. Keksinnössä on 15 kuitenkin oleellista se, e: -ä tavanorna i sen yksitotönivirityksen sijasta käytetään oaksois foton ίο: ri kysta. Alan ammattimiehelle on selvää, että keksinnön erilaiset sovellutusmuodot voivat vaihdella jäljempänä esitettävien patenttivaatimusten puitteissa.

(; i Utit a«n l ii ti ...

Claims (4)

98765

1. Virtaussytometrinen menetelmä biologisissa näytteissä esiintyvien partikkeleiden analysointiin, tunnettu siitä, että partikkeli käsitellään sille spesifisellä fluoresoivalla väriaineella ja fluoresenssin viritys 5 suoritetaan kaksoisfotonivirityksenä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että sen avulla tunnistetaan biologisissa näytteissä erittäin harvinaisina esiintyviä partikkeleita.

3. Virtaussytometri, joka on tarkoitettu 10 patenttivaatimuksen 1 mukaiseen menetelmään tunnettu siitä, että se on varustettu fluoresenssin kaksoisfotoni-viritykseen soveltuvalla optisella järjestelmällä.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen virtaussytometri tunnettu siitä, että optinen järjestelmä on konfokaalinen. 98765