JP3049254B2 - 2種類の光源を備えた光学式粒子分析装置 - Google Patents

2種類の光源を備えた光学式粒子分析装置

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JP3049254B2
JP3049254B2 JP2029052A JP2905290A JP3049254B2 JP 3049254 B2 JP3049254 B2 JP 3049254B2 JP 2029052 A JP2029052 A JP 2029052A JP 2905290 A JP2905290 A JP 2905290A JP 3049254 B2 JP3049254 B2 JP 3049254B2
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    • G01N21/47Scattering, i.e. diffuse reflection

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、流体に浮懸した細胞等試料中の粒子の流れ
に光を照射し、個々の粒子から発せられる散乱光や蛍光
等を検出し、細胞の分類及び計数を行う光学式粒子分析
装置、特に、照射光源としてレーザ光源とランプ光源と
を併用した光学式粒子分析装置に関するものである。

〔従来の技術〕

血液中の白血球や網状赤血球等の分類、計数を行うこ
とは臨床検査上重要かつ有効であり、その際自動分析装
置が用いられることは近時の傾向である。こうした分析
装置においては試料吸引部から血液試料を吸引させる
と、装置内で自動的に試料の前処理がなされ検出部に導
入され、検出部で検出された信号を計数、解析すること
により所定の細胞の数や含有量が出力される。フローサ
イトメータはその一例であり、血液試料に希釈、染色処
理を施して試料液としこの試料液をフローセル中央部に
細流にして流す。光源からの細く絞った光を細流部分に
照射することにより検出部を形成し、血球がこの検出部
を1個ずつ通過するたびに発生する散乱光や蛍光の変化
を光検出器で検出する。検出された信号から例えば散乱
光強度と蛍光強度を二軸とした二次元分布図を作成し、
この二次元分布図に分画線を設定することにより各粒子
の分類、計数をなすのである。例えば、網状赤血球を成
熟赤血球や血小板から分画し網状赤血球の数や比率が求
められる。光源としてはアルゴンレーザがしばしば用い
られている。

〔発明が解決しようとする課題〕

従来のフローサイトメータにおいて粒子に対する蛍光
励起用の光源としてはアルゴンレーザが用いられてい
る。これは、蛍光を発生させるためには比較的短波長
の、青色領域の光を励起光として用いる必要があるから
である。しかし、アルゴンレーザは高価でありまたレー
ザ本体自体の占有容積が大きいだけでなく、レーザを駆
動するための所要電源等レーザに付随する周辺装置も大
きいものとなっている。さらに、全体的に電力消費量も
大きいという問題もある。

蛍光励起用として、アルゴンレーザに代る小型で廉価
な光源装置を用いることができれば良いのであるが、現
在のところ特に青色領域の光を発する半導体レーザは市
販されていない。もちろん赤色〜赤外領域の光を発生す
る半導体レーザはあるが、このような波長域の光源では
蛍光を得ることができない。

本発明は、フローサイトメータを用いる光学式粒子分
析装置において、光源装置の改良によりその小型化と低
コスト化を実現することを目的とするものである。

〔課題を解決するための手段〕 本発明の光学式粒子分析装置においては、試料中の粒
子に対する蛍光励起用光源としてアルゴンレーザのよう
な大型で高価な光源は用いず、ハロゲンランプ、水銀ア
ークランプ、タングステンランプ等小型で入手・保守の
たやすいランプ型式の光源装置を用いることにより上記
課題を解決しようとするものであり、そのため本発明の
光学式粒子分析装置は、 フローセルと、上記フローセルに蛍光染色された細胞
等の粒子の流れを細く絞って細流として流す手段と、上
記粒子の細流領域に2種類の光を照射する手段と、上記
細流領域の粒子が発生する散乱光及び蛍光をそれぞれ検
出する手段と、検出された信号を処理、解析する手段
と、 を備え、粒子の分類及び計数を行う粒子分析装置におい
て、 上記粒子の細流領域に照射される2種類の光が、レー
ザ光源から発せられるレーザ光および、ランプ光源から
発せられる光のうちの上記レーザ光よりも波長の短いラ
ンプ光であり、かつ上記レーザ光およびランプ光は上記
粒子の細流領域に交差して照射され、その際上記照射さ
れるレーザ光が上記粒子の流れ方向には上記照射される
ランプ光よりも細く絞られており、さらに、上記粒子の
細流領域において検出された、上記レーザ光による散乱
光信号と上記ランプ光による蛍光信号とを信号処理する
信号処理部が設けられ、該信号処理部において上記蛍光
信号の信号処理を行う際そのタイミング信号として上記
散乱光信号を使用することを特色とするものである。

上記レーザ光源は半導体レーザであることが好まし
い。さらに、本発明による粒子分析装置は上記レーザ光
と上記ランプ光の照射光どうしの交差角を約90度とし、
同一方向に発せられたレーザー光による前方散乱光とラ
ンプ光による側方蛍光とを波長選別して検出することも
特色とする。

また、レーザ光とランプ光の照射光どうしの交差角を
約90度とし、第1の方向に発せられたレーザ光による前
方散乱光、第2の方向に発せられたレーザ光による側方
散乱光、およびランプ光による後方蛍光を検出すること
をも特色とするものである。

〔作 用〕

ランプ光源は一般的に小型で安価であるが、粒子等を
浮懸した試料のフローサイトメータ中の細流領域に対し
てアルゴンレーザほどには強力な光を照射することはで
きない。しかし、ランプ光は単一スペクトルではなく波
長域に広がりすなわち幅を有しており、粒子に特有の吸
収スペクトル強度の大きい領域に対応した光も含有して
いる。このため、ランプ光はその光強度がレーザ光ほど
強くなくても粒子によく吸収されることになり、ランプ
光を用いた場合でもレーザ光の場合と同程度の光強度の
蛍光が得ることができるのである。

また、ランプ光は、レーザ光のように光強度分布にが
たつきのない細いビームを得ることは難しく、その結果
こうしたランプ光起源の蛍光信号は幅の広い、凹凸のあ
る信号となる。このような信号に基いて、蛍光光量から
導出される粒子ごとの特徴量を検出することは難しい。
例えば、信号のピークを検出してその値を求めることは
複雑な信号処理なくしては不可能である。一方レーザ光
による散乱光信号は単一ピークの信号となる。本発明に
あっては、信号処理部でレーザ光による散乱光信号がピ
ークとなる時点における蛍光信号の値を検出するように
している。すなわち、散乱光信号を蛍光信号処理のタイ
ミング信号として用いる。これとともに、信号処理部で
は散乱光信号のピーク値も検出する。散乱光信号のうち
前方散乱光信号は粒子の大きさ等の外部形態情報を得る
のに好適であり、また側方散乱光は粒子の核等の内部形
態情報を得るのに好適である。粒子を例えば独立して網
状赤血球の分類、計数を行う場合には、前方散乱光信号
と蛍光信号の検出を行えばよい。白血球の分類、計数を
行う場合には、前方散乱光信号、側方散乱光信号、蛍光
信号の検出が必要である。

〔実施例〕

第1図は本発明による光学式粒子分析装置の一実施例
の基本構成図であり、第2図はフローセル部分の概略側
面図である。この装置は様々な試料例えば血液中の各種
細胞、例えば網状赤血球を分別し計数することができ
る。血液試料に、オーラミンOを含有する試薬を混合す
ることにより網状赤血球中のRNAを蛍光染色することが
できる。このことは特開昭61−280565号公報、特開昭62
−34058号公報、特開昭64−35366号公報に詳しく記載さ
れている。この蛍光染色された血液試料は、ノズル24か
ら一定流量で吐出される。さらにノズル24の周囲にシー
ス液を流すことによりシースフローが形成され、血球は
フローセル22中央部の狭い領域を(第1図では紙面の裏
から表に向かって、第2図では下から上に向かって)整
列して流れる。光源10は波長、例えば670nmの赤色光を
出射する小型の半導体レーザ光源である。光は近赤外光
でもよい。26はハロゲンランプ等のランプ光源である。
レーザ光は照射光学系12により集光され、またランプ光
は照射光学系28により波長選択及び集光されてフローセ
ル22の試料細流領域に照射される。この実施例では、レ
ーザ光はフローセル22の正面から照射され、ランプ光は
フローセル22の側面から照射され、これら2つの照射光
はシースフローの試料細流領域で直交している。蛍光染
色された血球がその交叉した照射領域を通過することに
より、散乱光及び蛍光が発せられる。本実施例では、レ
ーザ光照射光軸14に対して5〜15度の狭い角度で発せら
れた、レーザ光を照射光とする前方散乱光と、ランプ光
照射光軸30に対して約90度の角度で発せられた、ランプ
光を励起光とする側方蛍光とを受光光学系40により波長
選択しそれぞれ受光素子58,54で検出するようにしてい
る。

第3図は各照射光の代表的な特性を示す図である。波
長の短い方から順に60,62,64は、それぞれ励起光(ラン
プ光)、蛍光、照射光(レーザ光)の特性曲線である。

レーザ光の照射光学系12はコリメータレンズ16,コン
デンサレンズ18,20からなり、ランプ光の照射光学系28
はコンデンサレンズ32,ピンホール34,フィルタ36,コン
デンサレンズ38からなる。第4a図、第5a図はそれぞれレ
ーザ光照射光軸14の下流側、ランプ光照射光軸30の下流
側から見た試料細流領域における各照射光の断面を示し
ている。矢印は試料の流れ方向を示している。第4a図に
示すように、レーザ光66のひろがりは試料の流れ方向に
は血球粒子径と同程度の、例えば10μm前後と狭く、試
料の流れ方向及び照射光軸方向と直交する方向のひろが
りは血球粒子径より充分広く、例えば150〜300μm程度
であり、楕円状に絞られている。そして、その光強度分
布68は、第4b図に示すように、単一ピークを有するガウ
ス分布となっている。一方、シースフローへの照射領域
におけるランプ光70は、第5a図に示すように、レーザ光
66のように細く絞ることは難しく、また、光強度分布72
も第5b図に示すように凹凸している。これらの光が交叉
する照射領域を蛍光染色された血球粒子が通過するごと
に、この粒子から散乱光及び蛍光が発せられる。これら
の光を検出し解析することにより血球粒子個々について
その大きさ、RNA含有量等の情報が得られる。

以下、本実施例の説明において、特別の記載のない限
り、「前方散乱光」はレーザ光による前方散乱光を意味
し、「側方散乱光」はランプ光による側方散乱光を意味
し、「側方蛍光」はランプ光による側方蛍光を意味す
る。

血球粒子から発せられた光、すなわち、レーザ光によ
る前方散乱光、ランプ光による側方散乱光及び側方蛍光
は、受光光学系40により波長選別されて前方散乱光と側
方蛍光とが受光素子58,54でそれぞれ検出される。この
場合、受光光学系40は第1図に明らかなように、ビーム
ストッパ44,コレクタレンズ46,ピンホール48,ダイクロ
イックミラー50,バンドパスフィルタ52,コレクタレンズ
56からなる。ダイクロイックミラー50は受光光軸42に対
して45度の角度で配置されている。このダイクロイック
ミラー50は受光した光のうち短波長光を80〜90%透過
(つまり、10〜20%反射)させ、長波長光を99%以上反
射(つまり、1%以下透過)させる特性を有している。
このため、レーザ光による前方散乱光は99%以上反射さ
れて、受光素子58に入射する。ダイクロイックミラー50
を透過する前方散乱光は1%以下である。中波長、短波
長の光はダイクロイックミラー50を減衰率1〜2割で透
過し、さらに、バンドパスフィルタ52により中波長の
光、すなわちランプ光による側方蛍光が選択的に透過さ
れて受光素子54に入射する。短波長の光、すなわち、ラ
ンプ光による側方散乱光はレーザ光による前方散乱光と
比べて数百分の1以下の強度であり、バンドパスフィル
タ52により充分に減衰させられる。ダイクロイックミラ
ー50を透過したわずかな前方散乱光も、さらにバンドパ
スフィルタ52で充分に減衰させられる。このようにし
て、前方散乱光、側方散乱光の影響を受けることなく、
側方蛍光が受光素子54で検出できる。一方、中、短波長
の側方散乱光、側方蛍光はその1〜2割がダイクロイッ
クミラー50により反射されてから残りが受光素子58に入
射するが、これらの光は前方散乱光と比べて微弱である
ので、前方散乱光の検出に影響を与えることはない。受
光素子58,54としては、それぞれフォトダイオード、フ
ォトマルチプライヤが適当である。

ところで、蛍光励起用にランプ光を用いた場合には、
アルゴンレーザ光のような強力な光は得られない。しか
し、その光は、第3図に示すように、単一波長ではな
く、アルゴンレーザ光よりも短波長の成分も有してい
る。

第6図は血球粒子の光吸収・蛍光スペクトルを示す。
アルゴンレーザ光の波長488nmが吸収スペクトル74の右
すそに位置している場合、その波長域における吸収スペ
クトル強度は小さいので、強い蛍光を得るためにはそれ
に応じて強力な光を照射する必要がある。しかし、488n
mよりも短波長の光は吸収スペクトル74強度が大きいの
で、よく吸収され弱い光でも強い蛍光が発せられる。こ
のようにして、ランプ光においては比較的弱い光であっ
てもアルゴンレーザの使用時なみの蛍光が得られるから
蛍光検出に支障をきたすことはない。76は血球粒子の光
吸収に対応する蛍光スペクトルである。

レーザ光は、第4a図、第4b図に示すように、血球粒子
の流れ方向には細く絞ることができ、その光強度分布も
ガウス分布をしている。従って、血球粒子がその照射領
域を通過すれば、第7図に示すように単一ピークのパル
ス状の前方散乱光信号78が得られる。この散乱光信号78
の波高値は照射領域を通過した粒子の大きさに対応して
いる。一方、ランプ光は第5a図、第5b図に示すように光
スペクトル幅が広く分布しており、しかもその分布はむ
らの多い不規則なものである。このため、得られる蛍光
信号80も、第7図に示すように幅の広い、凹凸のある信
号となる。このような信号から蛍光強度を抽出すること
は難しい。そこで、本発明においては、信号処理におい
て前方散乱光信号78を側方蛍光信号のトリガー信号とし
ても用いている。つまり、散乱光信号のピーク時におけ
る蛍光信号の波高値Pを蛍光強度として検出するのであ
る。

第8図は信号処理部82の一例のブロック図である。こ
の図において、前方散乱光は受光素子58で光電変換さ
れ、増幅回路84で増幅される。この増幅された信号はピ
ーク検出回路86において、信号の立ち上がりからピーク
までが検出される。ピーク検出回路は例えば微分回路と
比較回路を用いて容易に構成することができる。また、
上記増幅された信号は移相補償回路90に送られ、所定時
間遅延される。また、判定回路88において、ピーク検出
回路86からの検出信号は血球信号かノイズかの判定がな
される。これは、散乱光信号の幅の広さで判別できる。
92はピークホールド回路,94はA/D変換回路である。血球
信号と判定されればピークホールド回路92にセット信号
93が送られそのピーク値が保持される。そして、A/D変
換器94にA/D変換スタート信号が送られてA/D変換され、
血球粒子の前方散乱光信号のピーク波高値はディジタル
化される。

次に、側方蛍光は受光素子54で光電変換され、増幅回
路96、移相補償回路98を経て、ピークホールド回路10
0、A/D変換回路102において散乱光信号と同じタイミン
グでそれぞれピークホールド、A/D変換がなされる。散
乱光信号のピークの波高値、散乱光信号がピークとなる
ときの蛍光信号の波高値は、データ解析部104へ送られ
この蛍光強度の値等に基いて各種解析がされる。

第9図は本発明の他の実施例の基本構成図である。こ
の構成では、レーザ光源110からのレーザ光によって照
射領域の粒子が発する前方散乱光は受光素子158で、ま
たその側方散乱光は受光素子166で検出し、ランプ光源1
26からのランプ光によって粒子が発する後方蛍光は受光
素子170で検出している。ここでは側方散乱光も検出す
るようにしているため、さらに、高精度の粒子の解析を
行うことができる。例えば、血球粒子中の白血球の分類
及び計数に適している。

ランプ光源126から発せられた光は、レンズ132,ピン
ホール134,ダイクロイックミラー136,レンズ138からな
る照射光学系により短波長の光のみフローセル122の試
料細流領域に照射される。レーザ光源110から発せられ
たレーザ光は、レンズ116,118,120からなる照射光学系
により照射され、その前方散乱光はビームストッパ144,
レンズ146,ピンホール148からなる受光光学系140により
集められ受光素子158で検出される。また、レーザ光に
よる側方散乱光並びにランプ光による後方散乱光及び後
方蛍光は、レンズ138,ダイクロイックミラー136,ピンホ
ール160,ダイクロイックミラー162,フィルタ164,168か
らなる受光光学系により波長選択されて、レーザ光によ
る側方散乱光、ランプ光による後方蛍光がそれぞれ受光
素子166,170にて検出される。

〔発明の効果〕

本発明の光学式粒子分析装置は、試料粒子の蛍光励起
用としてランプ光を用い散乱光照明用として半導体レー
ザを用い、これら小型化し低コストの光源からのレーザ
光とランプ光とがフローセルの粒子細流領域で交差して
照射されるように構成されているので、一つの粒子の散
乱光と蛍光を同一場所、同一タイミングで検出すること
ができる。また、レーザ光は細く絞られ単一ピークを有
するので、散乱光信号もピーク信号になる。この散乱光
信号をタイミング信号として用いて、蛍光信号の値を検
出しているので、ランプ光の強度分布にむらがあって
も、粒子から発せられる蛍光量と相関のとれた蛍光信号
を検出することができる。

レーザ光による前方散乱光とランプ光による蛍光とを
同一方向で検出する場合には、網状赤血球の分類、計数
が簡素な光学系で行うことができる。

第1の方向に発せられたレーザ光による前方散乱光、
第2の方向に発せられたレーザ光による側方散乱光とラ
ンプ光による後方蛍光を検出することにより、さらに高
精度な分析が可能となり、白血球の分類、計数に好適で
ある。

【図面の簡単な説明】

第1図は本発明の粒子分析装置の一実施例の基本構成
図、第2図は第1図におけるフローセル部分の概略側面
図である。第3図は照射の特性図である。第4a図はレー
ザ光の照射断面、第4b図はその光強度分布図、第5a図は
ランプ光の照射断面、第5b図はその光強度分布図であ
る。第6図は、粒子の吸収及び蛍光スペクトル特性図で
ある。第7図は散乱光信号及び蛍光信号の説明図であ
る。第8図は信号処理部の一例のブロック図である。第
9図は本発明の粒子分析装置の他の実施例の基本構成で
ある。 図中符号: 10,110……レーザ光源、26,126……ランプ光源 22,122……フローセル、12,28,112……照射光学系 40,140……受光光学系、54,58,158,166……受光素子 104……信号解析手段。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 瀬下 博之 兵庫県神戸市兵庫区大開通6丁目3番17 号 東亜医用電子株式会社内 (72)発明者 砥堀 秀道 兵庫県神戸市兵庫区大開通6丁目3番17 号 東亜医用電子株式会社内 (56)参考文献 実開 昭63−84554(JP,U)

Claims (3)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】フローセルと、上記フローセルに蛍光染色
    された細胞等の粒子の流れを細く絞って細流として流す
    手段と、上記粒子の細流領域に2種類の光を照射する手
    段と、上記細流領域に粒子が発生する散乱光及び蛍光を
    それぞれ検出する手段と、検出された信号を処理、解析
    する信号解析手段と、を備え、粒子の分類及び計数を行
    う粒子分析装置において、 上記粒子の細流領域に照射される2種類の光が、レーザ
    光源から発せられるレーザ光および、ランプ光源から発
    せられる光のうちの上記レーザ光よりも波長の短いラン
    プ光であり、かつ上記レーザ光およびランプ光は上記粒
    子の細流領域に交差して照射され、その際上記照射され
    るレーザ光が上記粒子の流れ方向には上記照射されるラ
    ンプ光よりも細くしぼられて、ランプ光が照射される細
    流領域に照射され、さらに、上記粒子の細流領域におい
    て検出された、上記レーザ光による散乱光信号と上記ラ
    ンプ光による蛍光信号とを信号処理するとき、上記粒子
    の散乱光信号のピークを検出し、該散乱光信号のピーク
    時における蛍光信号の波高値を蛍光強度として検出する
    信号処理部を有すること、を特徴とする2種類の光源を
    備えた光学式粒子分析装置。
  2. 【請求項2】上記レーザ光と上記ランプ光はその照射光
    の交差角を約90度とし、かつ同一方向に発せられた上記
    レーザー光による前方散乱光と上記ランプ光による側方
    蛍光とを波長選別して検出すること、を特徴とする請求
    項1記載の光学式粒子分析装置。
  3. 【請求項3】上記レーザ光と上記ランプ光とはその照射
    光の交差角を約90度とし、第1の方向に発せられた上記
    レーザ光による前方散乱光、第2の方向に発せられた上
    記光による側方散乱光および上記ランプ光による後方蛍
    光を検出すること、を特徴とする請求項1記載の光学式
    粒子分析装置。
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