JPH0783819A

JPH0783819A - 粒子測定装置

Info

Publication number: JPH0783819A
Application number: JP6124209A
Authority: JP
Inventors: Tatsuya Yamazaki; 達也山▲崎▼
Original assignee: Canon Inc
Current assignee: Canon Inc
Priority date: 1993-07-20
Filing date: 1994-05-13
Publication date: 1995-03-31

Abstract

(57)【要約】【目的】偏光を考慮した粒子分別能力に優れる粒子測
定装置を提供する。【構成】レーザー光源２１の前方には、照射光学系２
２、フローセル２３、直進レーザー光を遮蔽するストッ
パ２４、前方散乱光集光光学系２５、前方散乱光検出器
２６が配列されている。フローセル２３の反射方向に
は、側方散乱光及び蛍光の集光光学系２７、入射角が３
０°に設定されたダイクロイックミラー２８、同様に入
射角が３０°に設定されたダイクロイックミラー２９、
レンズ３０、検出器３１が配列されている。ダイクロイ
ックミラー２８の反射方向には制限開口３２、レンズ３
３、検出器３４が配置され、ダイクロイックミラー２９
の反射方向には偏心のない制限開口３５、レンズ３６、
検出器３７が配置されている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、被検粒子に光を照射し
検体から生ずる散乱光や蛍光を測定する粒子測定装置、
特に細胞などの被検粒子の特性を測定する検体測定装置
に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】図３はＭｉｅ理論による散乱光の偏光強
度分布を示したものであり、横軸は照射光光軸と散乱光
集光系光軸の成す角度、縦軸は散乱光の相対強度を対数
目盛で表したものである。また、Ｐは照射光の偏光方向
と平行な偏光成分を持つ散乱光の強度、Ｖは照射光の偏
光方向と直交する偏光成分を持つ散乱光の強度を表して
いる。

【０００３】この図３から明らかなように、照射光と直
交する方向の散乱光即ち側方散乱光の強度は最小とな
る。これは後に述べるように、散乱光と蛍光を同時に検
出する装置の多くが、側方散乱光と蛍光とを同一の集光
系を用いて検出する理由の１つである。

【０００４】また、照射光が直線偏光であるときには、
側方散乱光は直線偏光に直交する方向の偏光成分を持た
ない。従って、照射光の偏光方向に直交する偏光成分の
側方散乱光はＭｉｅ理論によらない散乱ということがで
きる。これは、一般に散乱光偏光解消と呼ばれる現象で
あり、その原因は散乱光を発生させる被検粒子と散乱光
を取得する光学系の配置とにあると考えられている。

【０００５】被検粒子を原因とする散乱光偏光解消で
は、被検粒子内での多重反射や粒子の外形が、Ｍｉｅ理
論が仮定している球形から外れていることが挙げられ
る。これは被検粒子の特長を解析する上で貴重な情報と
なり得るものであり、狭義の散乱光偏光解消と呼ぶこと
ができる。一方、光学系の配置を原因とするものは、例
えば側方散乱光を取得する集光光学系の開口の大きさが
有限であるために、純粋な９０°側方散乱光のみなら
ず、周辺の散乱光も取得してしまうことが挙げられる。

【０００６】図３では説明されないが、前方散乱光の強
度は被検粒子の径の６乗に比例するので、被検粒子の大
きさを表す変数とされる。また上述のように、側方散乱
光は被検粒子の大きさのみならずその形状にも影響され
るので、被検粒子の形状を表す変数とされる。

【０００７】一方、蛍光の強度分布は等方的強度分布を
示す。また、蛍光の偏光方向は照射光のそれを保存する
とされる。しかしながら蛍光の寿命は有限であり、その
間のブラウン運動や化学変化に対応して蛍光の偏光方向
は変化することがある。これは一般に蛍光偏光解消と呼
ばれ、散乱光の偏光解消と同様に被検粒子の特長を表す
貴重な情報となる。

【０００８】検体に光を照射し、検体から生ずる散乱光
や蛍光を測定する測定装置の一例として、フローサイト
メータ、パーティクルカウンタが従来から知られてお
り、生物学分野、医療分野や半導体工学の分野等で広く
用いられている。

【０００９】このフローサイトメータの典型的な構成
を、図４に示すフローサイトメータについて説明する。
血液等のサンプル液を前処理として、蛍光試薬等で染色
処理し適切な反応時間及び希釈濃度に調整する。そし
て、これをサンプル液容器１に入れ、蒸留水や生理食塩
水等のシース液はシース液容器２に入れる。サンプル液
容器１及びシース液容器２はそれぞれ図示しない加圧機
構により加圧される。

【００１０】そして、シースフロー方式によりフローセ
ル３内のサンプル液がシース液に包まれて細い流れに収
斂され、フローセル３内の流通部のほぼ中央を通過す
る。このとき、サンプル液に包まれる個々の細胞、微生
物、担体粒子等の被検粒子、即ち検体は分離されて１粒
或いは１塊ずつ順次に流れる。この被検粒子の流れに対
して、レーザー光源４から出射されたレーザー光が、母
線方向が流通部方向及び流通部方向とそれぞれ直交した
シリンドリカルレンズ５、６の組によって任意の形状に
収斂され照射される。

【００１１】被検粒子に照射される光ビームの形状は、
一般には流れに対して直交する方向に長径を有する楕円
形状であることが望ましい。これは個々の被検粒子の流
れの位置が流体内で多少変動しても、被検粒子に均一の
強度で光ビームが照射されるようにするためである。同
様に、被検粒子に照射される光ビームの位置が若干変動
しても、被検粒子に均一の強度で光ビームが照射され
る。

【００１２】被検粒子に光ビームが照射されると散乱光
が生ずる。この散乱光の内、光路前方方向に発する前方
散乱光は、集光レンズ６、光検出器７によって測光され
る。なお、照射された光ビームが直接に光検出器７に入
射することを防ぐため、光路中の集光レンズ６の手前に
は光吸収性の微小なストッパ８が設けられ、光源４から
の直接光、及び被検粒子を透過した透過光を除去するよ
うになっている。これにより、被検粒子からの散乱光の
みを測光することができる。

【００１３】また散乱光の内、レーザー光軸及び被検粒
子の流れにそれぞれ直交する測定方向に発する光は集光
レンズ９で集光される。集光された光はダイクロイック
ミラー１０で反射され、散乱光の波長即ちレーザー光の
波長（例えばＡｒ⁺ レーザーでは４８８ｎｍ）を選択的
に透過させるバンドパスフィルタ１１を経て、光検出器
１２において側方散乱光が測光される。また、被検粒子
が蛍光染色されている場合には、散乱光と共に発生する
複数色の蛍光を測光するため、集光レンズ９によって集
光され、ダイクロイックミラー１０を透過した蛍光の
内、ダイクロイックミラー１３で反射された蛍光からは
緑色蛍光波長用（５３０ｎｍ付近）のバンドパスフィル
タ１４、光検出器１５の組によって緑色蛍光が検出さ
れ、またダイクロイックミラー１３を透過した蛍光から
は全反射ミラー１６、赤色蛍光波長用（５７０ｎｍ付
近）のバンドパスフィルタ１７、光検出器１８の組によ
って赤色蛍光が検出される。光検出器７、１２、１５、
１８の信号はそれぞれ演算回路１９に入力され、演算回
路１９において粒子の種類や性質等の解析、或いは抗原
抗体反応の測定等の演算が行われる。

【００１４】一般に上記の装置においては、２方向の散
乱光の強度、即ち照射光の進行方向に散乱する前方散乱
光と、この方向に直交する方向に散乱する側方散乱光と
を測定することで、二次元の散乱光分布図を作成し粒子
の分別を行う。更に、細胞等の粒子に特異的に結合する
各種の蛍光標識を付けて照射光で励起された蛍光を測定
することにより、三次元以上の分布図を作成し粒子の更
なる分別を行う。

【００１５】また、照射光にレーザー等の直線偏光を用
い、測定光学系中に偏光素子等を設けることで、散乱光
や蛍光の偏光特性を測定する装置もある。また、この装
置において偏光素子の代りに、ブリュースタ角に設置し
たガラス板を用いる装置も知られている。更に、フロー
方式を用いず、静置された測定セル中の検体液中に分散
させたラテックス粒子から生ずる散乱光や蛍光の偏光特
性を測定する装置もある。これらの装置では、上述の各
種の散乱光や蛍光に加えて、散乱光や蛍光の偏光特性を
パラメータにすることで被検粒子の更なる分別を行って
いる。

【００１６】

【発明が解決しようとする課題】一般に、粒子から生ず
る散乱光や蛍光は偏光特性を有する。特に、光源に直線
偏光を有するレーザー光を使用したときには、偏光特性
が顕著に現れる。ところが、一般に上述の装置で分光手
段として使用されているダイクロイックミラーは、それ
自身偏光特性を有し、入射する光の偏光特性によってカ
ットオフ波長等の分光特性が変化する。

【００１７】図５は典型的なダイクロイックミラーの偏
光分光特性を示しており、横軸は波長、縦軸はダイクロ
イックミラーの反射率であり、実線はｐ偏光、破線はｓ
偏光の分光特性を表している。図５から明らかなよう
に、ｐ偏光のカットオフ波長は約６７０ｎｍ、ｓ偏光の
カットオフ波長は約７１０ｎｍであり、ｐ偏光とｓ偏光
のカットオフ波長の差は約４０ｎｍであることが分か
る。

【００１８】従って、波長６９０ｎｍ近傍の光はその偏
光状態によって、このダイクロイックミラーでの反射率
が大きく変化することになる。当然、ダイクロイックミ
ラー以降に設けられた検出器での検出値もまた大きく変
化してしまう。つまり、一般にフローサイトメータでは
細胞に標識した蛍光の強度や波長を測定することで細胞
の特性を求めているが、もし蛍光の強度や波長が変化し
ないにも拘らず偏光状態が変化した場合には、誤った測
定を行ってしまうことになる。

【００１９】一般に、ダイクロイックミラーへの入射角
を小さくすると、分光特性の偏光特性が著しく減少する
ことが知られている。しかしながら、ダイクロイックミ
ラーは入射角を変えると、そのカットオフ波長等の分光
特性も変化してしまう。その様子を表したのが図６であ
り、図５に示したダイクロイックミラーの入射角を３０
°にした時の分光反射率を表している。この図６から明
らかなように、ｐ偏光のカットオフ波長は約７１０ｎ
ｍ、ｓ偏光のカットオフ波長は約７３０ｎｍであり、ｐ
偏光とｓ偏光のカットオフ波長の差は約２０ｎｍになる
ことが分かる。図５と図６を比較して明らかなように、
カットオフ波長の差は４０ｎｍから２０ｎｍに半減して
いるが、ｐ偏光とｓ偏光のカットオフ波長は共に長波長
側に移動している。従って、ダイクロイックミラーの入
射角を単に小さくするたけでは所期の性能が得られない
ことになる。

【００２０】蛍光の光強度は微弱であるので、蛍光を検
出する光学系には集光効率の高い高ＮＡ顕微鏡対物レン
ズ、特に液浸レンズ等が利用されている。また、蛍光に
比べてはるかに強度の強い散乱光との分離を容易にする
ために、蛍光検出光学系は散乱光の強度が最も弱くなる
側方に設け、側方散乱光検出光学系と共通化している。
しかしながら、高ＮＡ顕微鏡対物レンズは集光方向が広
いので、側方散乱光検出光学系で集光された散乱光は、
もはや同一の偏光方向を有しているとは云えない。

【００２１】ブリュースタ角に設置したガラス板の反射
率に偏光特性があることは、ここで詳しく述べるまでも
なく良く知られている。従って、このブリュースタ角に
設置したガラス板等で分光される光の中には、設計者の
予期しない光が混入する危険性がある。これらの光は検
出器でＤＣ成分として検出され、測定のＳ／Ｎ比を悪化
させる原因となる。ガラス板やダイクロイックミラー等
に限らず、一般に光を分光する手段や反射する手段や分
割する手段は偏光特性を有している。

【００２２】本発明の目的は、比較的簡便な光学系を用
いながら、散乱光及び（又は）蛍光の分光解析及び偏光
解析を精度良く行うことで、粒子分別能力に優れる粒子
測定装置を提供することにある。

【００２３】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
の第１発明に係る粒子測定装置は、光源と、該光源から
の光を被検粒子に照射する照射手段と、該被検粒子より
生ずる散乱光及び（又は）蛍光から成る信号光を集光す
る集光手段と、該信号光を分光分割する分割手段と、該
信号光を検知する検出手段とを具備する粒子測定装置に
おいて、前記分割手段に入射する前記信号光の入射角
を、前記分割手段が有する偏光特性が入射角が４５°の
ときの偏光特性よりも小さくなる角度に設定したことを
特徴とする。

【００２４】また、第２発明に係る粒子測定装置は、光
源と、該光源からの光を被検粒子に照射する照射手段
と、該被検粒子より生ずる散乱光及び（又は）蛍光から
成る信号光を集光する集光手段と、前記光源からの光及
び（又は）前記信号光を反射する反射手段と、前記信号
光を検知する検知手段とを具備する粒子測定装置におい
て、前記反射手段に入射する前記光源からの光及び（又
は）前記信号光の入射角を、前記反射手段が有する偏光
特性が入射角が４５°のときの偏光特性よりも小さくな
る角度に設定したことを特徴とする。

【００２５】

【作用】上述の第１発明の粒子測定装置は、分割手段に
入射する前記信号光の入射角を、前記分割手段が有する
偏光特性が入射角が４５°のときの偏光特性よりも小さ
くなる角度に設定する。

【００２６】また第２発明の粒子測定装置は、反射手段
に入射する前記光源からの光及び（又は）前記信号光の
入射角を、前記反射手段が有する偏光特性が入射角が４
５°のときの偏光特性よりも小さくなる角度に設定す
る。

【００２７】

【実施例】本発明を図１、図２に図示の実施例に基づい
て詳細に説明する。図１は本発明をフローサイトメータ
に適用した第１の実施例を示している。レーザー光源２
１の前方には、照射光学系２２、フローセル２３、直進
レーザー光を遮光するストッパ２４、前方散乱光集光光
学系２５、前方散乱光検出器２６が配列されている。フ
ローセル２３の反射方向には、側方散乱光及び蛍光の集
光光学系２７、入射角が４５°よりも小さな３０°に設
定されたダイクロイックミラー２８、同様に入射角が４
５°よりも小さな３０°に設定されたダイクロイックミ
ラー２９、レンズ３０、検出器３１が配列されている。
ダイクロイックミラー２８の反射方向には、制限開口３
２、レンズ３３、検出器３４が配置され、ダイクロイッ
クミラー２９の反射方向には制限開口３５、レンズ３
６、検出器３７が配置されている。

【００２８】レーザー光源２１から出射したレーザー光
は、フローセル２３の流れ方向と平行な方向に直線偏光
しており、照射光学系２２によりフローセル２３の中央
部の図示されていない照射領域を微小スポットで照射す
る。フローセル２３内には被検粒子である細胞が流れて
おり、照射領域でレーザー光に照射された散乱光及び蛍
光を発する。照射領域で発生した散乱光のうち、レーザ
ー光の進行方向にほぼ一致する方向に散乱した前方散乱
光は、前方散乱光集光光学系２５を経て前方散乱光検出
器２６で検出される。このとき、直進したレーザー光は
ストッパ２４で遮光されるので、前方散乱光検出器２６
には到達することはない。

【００２９】一方、レーザー光の方向及び細胞の流れに
略平行光に変換される。この側方散乱光及び蛍光はダイ
クロイックミラー２８、２９で分光され、それぞれ側方
散乱光検出器３４、蛍光検出器３１、３７で検出され
る。

【００３０】一般に、ダイクロイックミラーは前述のよ
うに、その分光特性に偏光特性を有する。しかしながら
従来の蛍光偏光解析装置では、ダイクロイックミラーの
一般的使用法である入射角４５°に拘泥していたので、
正確な測定は不可能であるので、この問題点を補正する
ための手段を必要としている。本実施例はダイクロイッ
クミラーへの入射角を４５°よりも小さくすることによ
り、このような問題点を解消している。

【００３１】本実施例では、ダイクロイックミラー２
８、２９への入射角を予め３０°に設定し、ダイクロイ
ックミラー２８、２９の膜を入射角３０°用に設計製造
することで、入射角が４５°でないにも拘らず、所期の
分光特性を得られるようにしている。また、入射角を４
５°よりも小さくすることにより、偏光特性が著しく減
少し、このため被検粒子である細胞が発する散乱光や蛍
光の偏光特性が変化しても、この変化に影響されずにそ
の分光特性を正確に測定することが可能となる。

【００３２】つまり、分光特性を得る装置において、分
光手段への入射角を４５°よりも小さくすることにより
高精度の測定を実現できる。なお、入射角が小さいほど
偏光特性は減少するが、バンドパスフィルタや検出器の
配列を考慮すると、入射角は２０°から３０°が好適で
ある。また、ダイクロイックミラーへの入射角を小さく
することで、装置の小型化等の利点を得ることもでき
る。

【００３３】本実施例の構成は、散乱光や蛍光の偏光解
析を行う粒子測定装置にも有効である。特に、偏光手段
をダイクロイックミラーよりも後方側に設ける場合は、
測定値はダイクロイックミラーの偏光特性の影響を受け
難いので、より正確な測定を行うことができる。例え
ば、通常の粒子解析装置の付加機能として、偏光解析を
行えるように装置を改造する場合には、より正確で改造
が小規模で済むと同時に、その他の測定光学系への影響
を最小限にできるという利点がある。

【００３４】図２は第２の実施例の構成図であり、図１
と共通の要素及び機能の説明は省略する。図２におい
て、前方散乱光集光光学系２５と前方散乱光検出器２６
との間に光路を折り曲げるアルミニウム反射ミラー４０
が介在されている。図示しない照射領域で発生した散乱
光の内、レーザー光の進行方向にほぼ一致する方向に散
乱した前方散乱光は、前方散乱光集光光学系２５を経て
アルミニウム反射ミラー４０で反射され、前方散乱光検
出器２６で検出される。

【００３５】図２に示したように、装置の配置上、光路
を折り曲げる必要がある場合には、一般にガラス基板上
にアルミニウムを蒸着したアルミニウム反射ミラーが多
く用いられる。ところが、このアルミニウム反射ミラー
も分光反射率に偏光特性を有しており、特性改善のため
蒸着したアルミニウム上に誘電体膜を何層か加えても、
その偏光特性を完全に消去することは困難である。この
ため、前方散乱光検出器２６で検出される前方散乱光強
度は散乱光の偏光状態によって変化し、被検粒子である
細胞の大きさを正確に測定できなくなってしまう。

【００３６】ここでも第１の実施例と同様に、反射手段
即ちアルミニウム反射ミラー４０への入射角を小さく設
定することが、分光反射率の偏光特性を減少させる上で
極めて有効である。ダイクロイックミラーと同様にアル
ミニウム反射ミラー４０も、入射角を小さくすることで
分光反射率の偏光特性が著しく減少するからである。こ
の構成を被検粒子が発する散乱光や蛍光の偏光特性を測
定する粒子測定装置に応用すれば、アルミニウム反射ミ
ラー４０等の反射手段を介した後に偏光手段を設けて
も、測定の正確性を保つことができる。また、所望の位
置で光路を折り曲げられるので装置の小型化にも寄与す
る。

【００３７】この第２の実施例では、反射手段としてア
ルミニウム反射ミラー４０を用いたが、これは本発明の
範囲を限定するものではない。反射手段がプリズム等の
ガラスの表面反射を利用する素子であっても、また金、
銀、銅等の金属の表面反射を利用する素子であっても応
用が容易である。更に、反射手段は照射光学系や側方散
乱光集光光学系に設けても同様の効果が得られる。反射
手段を照射光学系に入れた場合には、照射する光束の偏
光方向を正確に制御できるので、被検粒子の特性を正確
に測定することが可能である。

【００３８】以上説明した粒子解析装置で測定する被検
粒子は、細胞やラテックス粒子であったが、これも本発
明の範囲を限定するものではない。被検粒子として蛋白
質やペブタイドや低分子のハブテンなど、分子レベルの
微粒子であっても応用が容易である。

【００３９】

【発明の効果】以上説明したように第１発明に係る粒子
測定装置は、光路中に設けた分割手段への入射角を４５
°より小さくして分光手段の偏光特性を低減させること
で、被検粒子の発する散乱光や蛍光の偏光状態に依存せ
ずに被検粒子の特性を正確に測定することが可能であ
る。

【００４０】また、第２発明に係る粒子測定装置は、光
路中に設けた反射手段への入射角を４５°よりも小さく
することで、被検粒子が発する散乱光や蛍光の偏光状態
に依存せずに、被検粒子の特性を正確に測定することが
可能である。

【図面の簡単な説明】

【図１】第１の実施例の構成図である。

【図２】第２の実施例の構成図である。

【図３】Ｍｉｅ散乱の説明面である。

【図４】従来例の構成図である。

【図５】ダイクロイックミラーの偏光分光特性の入射角
依存性の特性図である。

【図６】ダイクロイックミラーの偏光分光特性の入射角
依存性の特性図である。

【符号の説明】

２１レーザー光源２２照射光学系２３フローセル２５、２７集光光学系２６、３１、３４、３７検出器２８、２９ダイクロイックミラー４０アルミニウム反射ミラー

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】光源と、該光源からの光を被検粒子に照
射する照射手段と、該被検粒子より生ずる散乱光及び
（又は）蛍光から成る信号光を集光する集光手段と、該
信号光を分光分割する分割手段と、該信号光を検知する
検出手段とを具備する粒子測定装置において、前記分割
手段に入射する前記信号光の入射角を、前記分割手段が
有する偏光特性が入射角が４５°のときの偏光特性より
も小さくなる角度に設定したことを特徴とする粒子測定
装置。
【請求項２】前記分割手段への入射角は４５°よりも
小さい請求項１に記載の粒子測定装置。
【請求項３】前記分割手段への入射角は２０〜３０°
とした請求項１に記載の粒子測定装置。
【請求項４】前記分割手段はダイクロイックミラーと
した請求項１に記載の粒子測定装置。
【請求項５】前記被検粒子は流路中を流れる粒子とし
た請求項１に記載の粒子測定装置。
【請求項６】前記被検粒子は細胞とした請求項１に記
載の粒子測定装置。
【請求項７】前記光源はレーザー光源とした請求項１
に記載の粒子測定装置。
【請求項８】前記被検粒子を照射する光は直線偏光光
とした請求項１に記載の粒子測定装置。
【請求項９】光源と、該光源からの光を被検粒子に照
射する照射手段と、該被検粒子より生ずる散乱光及び
（又は）蛍光から成る信号光を集光する集光手段と、前
記光源からの光及び（又は）前記信号光を反射する反射
手段と、前記信号光を検知する検知手段とを具備する粒
子測定装置において、前記反射手段に入射する前記光源
からの光及び（又は）前記信号光の入射角を、前記反射
手段が有する偏光特性が入射角が４５°のときの偏光特
性よりも小さくなる角度に設定したことを特徴とする粒
子測定装置。
【請求項１０】前記粒子測定装置は前記信号光の偏光
特性を測定する請求項９に記載の粒子測定装置。
【請求項１１】前記反射手段への入射角は４５°より
も小さい請求項９に記載の粒子測定装置。