JP3815838B2

JP3815838B2 - 粒子測定装置

Info

Publication number: JP3815838B2
Application number: JP05933597A
Authority: JP
Inventors: 文雄久保田; 靖枝川住
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 1997-03-13
Filing date: 1997-03-13
Publication date: 2006-08-30
Anticipated expiration: 2017-03-13
Also published as: JPH10253624A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は粒子測定装置に関し、とくに、異常血球や癌細胞の同定に有用な血球や細胞の大きさに対する核の大きさの比を測定するための粒子測定装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、異常血球や癌細胞を同定するために、血球や細胞の径Ｃに対する核の径Ｎの比（Ｎ／Ｃ）が有用な指標とされている。
そして、細胞の核部分と細胞質部分とを弁別して分析する方法として次のような方法が知られている（例えば、特開平６−５８９２６号公報参照）。
【０００３】
つまり、細胞をスライド上に定着して洗浄した後、特別な染料で染色し、更に洗浄して余分な染料を除去し、これにカバーグラスをかけて細胞標本を作成し、そして、作成した標本に赤外線を照射して、細胞を撮像し、細胞像をデジタル化してコンピュータで分析を行うようにしている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来のこのような分析方法においては、細胞標本の作成に手間を要するばかりでなく、細胞がスライド上で扁平化し、立体的な形状を有する細胞本来の像を撮像することができないため、細胞および核の直径やプロフィールなどの情報を正しく得ることができないという問題点がある。また、細胞数が少ない場合に分析精度が著しく低下するという問題もある。また、上記引例にはＮ／Ｃ比を算出することについては記載されていない。一方、Ｎ／Ｃ比を求めることに関して、フロー粒子に対してスリット状の光を照射し粒子からの光を検出するスリットスキャニングという検出方法が知られている（例えば、レオン・エル・ウィーレス・ジュニア著「スリットスキャニング」フローサイトメトリ・アンド・ソーティング，1990年第２版，P.109-125，参照）。この方式では、アクリジンオレンジなどで染色した細胞の蛍光信号形状を検出し、弱く染色された細胞室と強く染色された核の信号パルス幅の比をＮ／Ｃ比としている。アクリジンオレンジなどは、核酸染色用の染料であり、細胞膜成分の染色度合いは薄い。また核外の細胞質に存在する核酸や封入体なども強く染色されるという問題があり、核、細胞質の両者とも正しく電気信号パルス形状として捉えられない場合がある。また、この方法では、細胞質や核を表す電気信号の閾値の取り方に大きく左右されるため、安定なデータが得られないという問題もある。
【０００５】
この発明は、このような事情を考慮してなされたもので、イメージングフローサイトメータを用いることにより、本来の立体的な形をした細胞の画像と核からの蛍光をそれぞれ得ることが可能で、得られた画像と蛍光強度から精度よく細胞径Ｃと核径Ｎを算出し、Ｎ／Ｃ比を演算することが可能な装置を提供するものである。より具体的には、撮像画像が核の不鮮明な画像の場合にも良好にＮ／Ｃ比を求めることができるようにするものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
この発明は、染色処理した細胞を含む試料液をシース液に包んで試料流に変換するシースフローセルと、試料流に光を照射する第１光源と、第１光源の光をうけた細胞を撮像して画像を得る撮像器と、試料流に光を照射する第２光源と、第２光源の光をうけた細胞の核から生じる蛍光信号を検出する光検出器と、前記画像と蛍光信号を解析する解析部を備え、解析部は、前記画像から細胞の大きさＣを、前記蛍光信号から核の大きさＮを算出して、Ｎ／Ｃの比を演算する演算部と、演算されたＮ／Ｃを出力する出力部からなる粒子測定装置を提供するものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
この発明における細胞とは、細胞質と核とを含有する全ての細胞を含むものであり、例えば、末梢血液細胞や尿中細胞が挙げられる。
また、この発明における染色処理とは、少なくとも核を蛍光励起可能な第２色素で染色する処理であり、好ましくは、それに加えて細胞を第２色素の励起波長とは重複しない近赤外領域に吸収波長を持つ第１色素でさらに染色する処理である。
【０００８】
なお、第１色素としては、例えばＨＩＴＣアイオダイドやＩＲ−１２５のようなシアニン色素が、また第２色素としては、プロピジウムアイオダイド（ＰＩ）やエチジウムブロマイド（ＥＢ）のような色素が挙げられる。
【０００９】
また、この発明のシースフローセルは、細胞を含む試料をシース液で包んで流すことにより流体力学的効果によって細い試料流の流れを形成させることのできるフローセルであり、これには従来公知のものを用いることができる。
【００１０】
細胞を撮像するについて、細胞を照明する光の波長が短いと、光が細胞表面において散乱による減光が大きくなり、細胞を画像化しにくくなる。また、第２色素の蛍光励起波長と重複し蛍光励起光が正しく検出されない。
【００１１】
逆に光の波長が長いと、▲１▼細胞による減光が少なくなる（透過性が大きくなる）。▲２▼水の吸光度が増大する。▲３▼画像分解能が低下する。これらのことにより良好な画像が得られにくくなる。
【００１２】
また、細胞を撮像するための照明光の波長と蛍光励起光や蛍光の波長とがオーバーラップしていると細胞からの信号が検出しにくいので、細胞を撮像するために第１光源としては、波長が７２０〜１５００ｎｍの範囲にある近赤外光を試料流に照明するものであることが好ましい。具体的には、近赤外パルス半導体レーザ（７２０〜９８０ｎｍ）、カラーセンターレーザ（６００〜９００ｎｍ）、色素レーザ（６００〜１２００ｎｍ）、ＹＡＧレーザ（１．０６４μｍ）、ＹＬＦレーザ（１．０４８μ）、又はＴｉサファイアレーザー（モードロックタイプでキャビテイダンパー付）などにより構成される。
【００１３】
また、細胞が予め近赤外領域に吸収波長を持つ色素で染色されている場合には、第１光源は上記の近赤外波長範囲の光源であることが、当然好ましい。
【００１４】
細胞を撮像する撮像器には、一般的な２次元画像を撮像するビデオカメラを使用してもよいが、その場合には微弱な光を増幅するイメージインテンシファイアを備えたものを用いることが好ましい。さらに、そのイメージインテンシファイアにはシャッター手段を備えてもよい。
【００１５】
第２光源には、例えば、４００〜７００ｎｍの波長の光を出射する可視光源を用いることができ、光検出器には、フォトダイオードや光電子増倍管を用いることができる。
【００１６】
解析部は、ＣＰＵ、ＲＯＭおよびＲＡＭからなるマイクロコンピュータやパーソナルコンピュータによって構成することができる。
【００１７】
【実施例】
この発明の実施例における光学系を図１に示す。この実施例では、細胞含有試料液が角形のシースフローセル３に供給される。
この細胞含有試料液は、予め次のようにして細胞質が近赤外光領域に吸収波長を有する第１色素で、核が蛍光励起可能な第２色素で染色処理されている。
【００１８】
測定用の試料を次のように作製した。
第１染色液
第１色素としてのプロピジウムアイオダイドを250μｇ/ml 含有するPBS溶液
第２染色液
第２色素としてのHITCアイオダイドを4mg/ml含有するメタノール溶液
希釈液
Tris-HCl 20mM
NaHCO₃ 60mM
NaCl 60mM
を含む１リットルの水溶液（pH 8.5）
をそれぞれ準備し、試験管に希釈液１ｍｌを入れ、その中に血液１０μｌ、第２染色液１５μｌ、第１染色液５０μｌを加え、遮光して室温にて３０分間染色する。
【００１９】
また、測定用の試料は次のように作製してもよい。
第１染色液
オーラミンＯ 2.6%
エチレングリコール 95.9%
第２染色液
HITCアイオダイドを10mg/ml含有するメタノール溶液
第３染色液
第１染色液と第２染色液を５：１の割合で混合し、第３染色液とする。
そして、前記希釈液1950μｌ，血液10μｌ，第３染色液40μｌを混合し３０秒ないし５分反応させた後、フローセルに導き、測定する。
【００２０】
さて、図１に示すようにシースフローセル３に対して散乱光や蛍光を検出するための連続発光光源１と、細胞像を撮像するためのパルス光源２との２つの光源を設けている。光源１は可視光源、光源２は近赤外光源である。光源１には、中心波長が４８８ｎｍの可視光を発するＡｒレーザーを使用し、光源２には、中心波長が７８０ｎｍで、スペクトル幅が７ｎｍのスペクトル特性を備えた近赤外光を発するパルスレーザダイオードを使用している。
【００２１】
この２つの光源１、２からの連続可視光Ｌ１とパルス近赤外光Ｌ２は、シースフローセル３（図１では紙面に垂直方向に試料流が流れる）に対して互いに直交するように照射している。
【００２２】
この照射領域に細胞が流れてくると、その細胞による前方散乱光が集光レンズ５によって集められ、バンドパスフィルター６を介してフォトダイオードからなる第１光検出器７で受光され信号Ｓ１として出力される（ビームストッパは図示しない）。蛍光染色された核から生じる側方蛍光は、コリメートレンズ８、ダイクロイックミラー９およびコンデンサレンズ１０を介して光電子増倍管からなる第２光検出器１１で受光、増倍され信号Ｓ２として出力される。
【００２３】
図２はこの実施形態の信号処理系の構成を示し、第１および第２光検出器７、１１によってそれぞれ出力された信号Ｓ１、Ｓ２の内、側方蛍光強度信号Ｓ２は、解析部１００の粒子分析部１００ａに入力され、検出信号パルスの高さ情報がＡ／Ｄ変換され演算部１００ｄにおいて換算係数を用いて核径Ｎに換算される。
【００２４】
撮像制御部１００ｃは第１検出器から信号Ｓ１が解析部１００に入力されると同時又は所定時間後に細胞を撮像するための発光トリガ信号Ｔｓをパルス光源２に対して供給する。
【００２５】
パルス光源２は、発光トリガ信号Ｔｓによって一瞬だけ（２５ナノ秒程度）発光するタイプの光源であり、試料流の流速が数ｍ／秒と高速であっても、流れる粒子をブレ無く撮像することができる。
【００２６】
パルス光Ｌ２は図１に示すように、コヒーレンス低下手段の一例であるカライドスコープ（マルチモード光ファイバーでも可能である）２ａによってコリメートレンズ１２へ導かれ、コールドミラー１３を通過してコンデンサレンズ１４によって細く絞られて試料流に照射される。
【００２７】
光ファイバー２ａを介して照射することにより、パルス光Ｌ２のコヒーレンシーが落ち、細胞の像をコントラスト良く撮像することができる。なお、光ファイバー２ａには、コア−径８００μｍ、長さ２ｍ（住友電工株式会社製ＭＫＨ−８００）のものを用いている。
【００２８】
試料流を透過したパルス光は、コリメートレンズ８によって平行光に変換されダイクロイックミラー９に反射されて、バンドパスフィルター１６とコンデンサレンズ１５を介してビデオカメラ１７の受光面に結像され、細胞全体のモノクロの透過光像が撮像される。
【００２９】
得られたモノクロ画像では細胞は比較的良好に写っているが、核は必ずしも良好には写っていない。そこで、ビデオカメラ１７からの画像信号Ｖｓは図２に示す画像処理部１００ｂに渡される。画像処理部１００ｂでは、細胞画像を切出し、２値化してディジタル画像として記憶する。演算部１００ｄは、２値化された細胞画像の面積から円相当径を細胞径Ｃとして算出し、既に算出した核径ＮによりＮ／Ｃ比を演算する。
本実施例の場合、核の画像が不鮮明であっても蛍光信号強度から核の大きさを算出することができる。
【００３０】
なお、図２に示す入力部２００はキーボードやマウスからなり、解析部１００に対して各種の指令や条件の設定などを行う。
また、出力部１００ｅはＣＲＴやプリンタからなり演算部１００ｄで得られた演算結果などを出力する。
【００３１】
ここで、波長４８８ｎｍの光で励起され波長５００〜７００ｎｍの光として核から発せられる側方蛍光を検出するために、５００〜７００ｎｍの波長の光を透過させ７００ｎｍ以上の波長の光を反射するダイクロイックミラー９を使用している。そして、波長７８０ｎｍ以上の近赤外光画像を得るために、７８０ｎｍの波長の光を透過させるバンドパスフィルター１６を使用している。
【００３２】
従って、ビデオカメラ１７には、可視光Ｌ１（４８８ｎｍ）によって細胞から生じた側方の光は入射しないので、ビデオカメラ１７は光源１からの光の影響を受けない良好な細胞画像を得ることができる。
【００３３】
同様に、第２検出器１１にはダイクロイックミラー９の作用により、可視光Ｌ１によって生じた側方蛍光のみが入射するので、第２検出器１１は、光源２からの光の影響を受けない良好な粒子信号を得ることができる。
【００３４】
また、バンドパスフィルター６には、４８８ｎｍの波長の光を透過させるものを使用しているので、第１光検出器７には、可視光Ｌ１によって生じた前方散乱光のみが入射し、近赤外光Ｌ２によって生じる側方の光は全く入射しないので、第１光検出器は光源２からの光の影響を受けない良好な粒子信号を得ることができる。
【００３５】
また、近赤外線光源を、波長帯域の広い赤外線ランプと、波長幅を制限する狭帯域フィルターとで代用することも可能である。
【００３６】
この実施例では、図１に示すように、レンズ１２とレンズ１４との間の光のコリメート領域には、赤外光を透過し可視光を反射するコールドミラー１３が設けられている。従って、可視光Ｌ１によって照射された細胞から生じる側方散乱光や側方蛍光の内、レンズ１４側に入射したものは、コールドミラー１３で反射されて第２光検出器１へ導かれる。これによって、検出される光の強度が増大し、とくに第２光検出器１１の収集効率が向上する。
【００３７】
なお、このようなコールドミラーをシースフローセル３とレンズ１４の間に設置することも可能であるが、この場合には、コールドミラーを凹面ミラーとする必要がある上、その位置の設定が容易でない。
【００３８】
これに対して、この実施例におけるコールドミラー１３は光路コリメート領域に設けられているので、平面ミラーを用いることができると共に、その位置設定が容易である。
【００３９】
【発明の効果】
この発明によれば、イメージングフローサイトメータを用いて細胞を含有する試料流に光を照射して、撮像した細胞画像から細胞の大きさを算出し、検出した核の蛍光信号から核の大きさを算出するようにしているので、細胞の大きさに対する核の大きさの比を能率的に精度よく算出することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の実施例の光学系を示す構成図である。
【図２】この発明の実施例の信号処理系を示す構成図である。
【符号の説明】
１連続発光光源
２パルス光源
２ａ光ファイバー
３シースフローセル
４コンデンサレンズ
５集光レンズ
６バンドパスフィルター
７第１検出器
８コリメートレンズ
９ダイクロイックミラー
１０コンデンサレンズ１０
１１第２光検出器
１２コリメートレンズ
１３コールドミラー
１４コンデンサレンズ
１５コンデンサレンズ
１６バンドパスフィルター
１７ビデオカメラ

Claims

染色処理した細胞を含む試料液をシース液に包んで試料流に変換するシースフローセルと、試料流に光を照射する第１光源と、第１光源の光をうけた細胞を撮像して画像を得る撮像器と、試料流に光を照射する第２光源と、第２光源の光をうけた細胞の核から生じた蛍光を検出する第１検出器と、第２光源の光をうけた細胞からの光を検出する第２検出器と、前記第２検出器から出力された信号に基づいて前記第１光源を発光させるための発光トリガ信号を出力する撮像制御部と、前記発光トリガ信号に基づく前記第１光源の発光によって前記撮像器で得られた画像と前記第１検出器から出力された蛍光信号を解析する解析部を備え、解析部は、前記画像から細胞の大きさＣを、前記蛍光信号から核の大きさNを算出して、Ｎ／Ｃの比を演算する演算部と、演算されたＮ／Ｃの比を出力する出力部からなる粒子測定装置。
染色処理が、近赤外領域に吸収波長を有する第１色素で細胞材料を染色し、蛍光励起可能な第２色素で核材料を染色する処理である請求項１記載の粒子測定装置。
第１光源が７２０〜１５００ｎｍの波長を有する近赤外光源からなり、第２光源が４００〜７００ｎｍの波長を有する可視光源からなる請求項２記載の粒子測定装置。