JP5728196B2 - 試料調製装置および試料調製方法 - Google Patents
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Description
本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであり、生体から採取された生体試料中の分析対象細胞をフィルタによって弁別し、弁別された分析対象細胞にDNA染色処理を行う際に染色対象の細胞同士が互いに凝集しているとスクリーニング精度の低下の虞があるため、DNA染色処理を行う前に凝集した分析対象細胞を自動で分離させることができる試料調製装置および試料調製方法を提供することを目的としている。
前記フィルタによって弁別された前記分析対象細胞を含む試料を収容した測定試料容器を介して前記試料に超音波振動を付与することにより、前記測定試料容器内に収容された前記試料に含まれる凝集した細胞を分離させるための超音波振動部と、
超音波振動の付与により凝集細胞の分離処理が行われた前記試料と細胞のDNAを染色するための試薬とから測定試料を調製する試料調製部と、
超音波振動の付与により凝集細胞の分離処理が行われた前記試料が収容された前記測定試料容器を前記超音波振動部から前記試料調製部へ移送する容器移送部と
を備えたことを特徴としている。
前記容器移送部は、前記測定試料容器を前記液体収容部に収容された液体に漬けた状態で保持可能であり、且つ、
前記超音波振動子は、前記液体を介して前記測定試料容器に収容された試料に超音波振動を付与するものとすることができる。
前記測定試料容器の内面の算術平均粗さが1〜30μmの範囲であるのが好ましい。
前記容器移送部は、前記測定試料容器を超音波振動部から前記液体除去部へ移送し、当該液体除去部から前記試料調製部へ移送するものとすることができる。
前記分析対象細胞は、上皮細胞とすることができる。
前記測定試料は、上皮細胞のがん化判定用の測定試料とすることができる。
前記フィルタによって弁別された前記分析対象細胞を含む試料を収容した測定試料容器を介して前記試料に超音波振動を付与することにより、前記測定試料容器内に収容された前記試料に含まれる凝集した細胞を分離させる工程と、
超音波振動の付与により凝集細胞の分離処理が行われた前記試料と細胞のDNAを染色するための試薬とから測定試料を調製する工程と
を備えたことを特徴としている。
本発明の第3の観点に係る試料調製方法は、生体から採取された生体試料中の分析対象細胞を通過させず、分析対象細胞よりも小さい細胞を通過させるフィルタを用いて分析対象細胞を弁別し、分析対象細胞を含む試料を取得する工程と、
前記フィルタによって弁別された前記分析対象細胞を含む試料を収容した測定試料容器を介して前記試料に超音波振動を付与することにより、前記測定試料容器内に収容された前記試料に含まれる凝集した細胞を分離させる工程と、
超音波振動の付与により凝集細胞の分離処理が行われた前記試料と細胞のDNAを染色するための試薬とから測定試料を調製する工程と
を備えたことを特徴としている。
本発明の試料調製装置は、患者から採取した細胞を分析する細胞分析装置に用いることができる。まず、かかる細胞分析装置について説明する。
図1は、本発明の一実施の形態に係る試料調製装置を備えた細胞分析装置1の斜視図である。
この細胞分析装置1は、患者から採取した細胞を含む測定試料をフローセルに流し、このフローセルを流れる測定試料にレーザ光を照射し、測定試料からの光(前方散乱光、側方蛍光など)を検出してその光信号を分析することで、細胞に癌細胞が含まれているか否かを判断するのに用いられる。
図1に示されるように、細胞分析装置1は、測定試料に対してレーザ光による光学的な測定を行う測定装置2と、被検者から採取された生体試料に洗浄や染色等の前処理を行って、測定装置2に供給する測定試料を作製する試料調製装置3と、測定装置2での測定結果の分析等を行うデータ処理装置4とを備えている。
〔測定装置の内部構成〕
図2は、測定装置2の内部構成を示すブロック図である。
図2に示されるように、この測定装置2は、検出部6と、信号処理部7と、測定制御部8と、I/Oインタフェース9とを備えている。
図3は、試料調製装置3の内部構成を示すブロック図である。
図3に示されるように、この試料調製装置3は、調製制御部16と、I/Oインタフェース17と、生体試料に対する成分調整を自動的に行うための調製デバイス部18とを備えている。
本実施の形態の調製デバイス部18は、検体セット部150と、細胞分散部25と、検体ピペット部26と、検体定量部27と、試薬定量部28と、弁別・置換部29と、超音波振動部100と、容器移送部110と、液体除去部120と、反応部24とから構成されている。
容器移送部110は、反応部24に設置されている測定試料容器54(図4参照)を把持して当該測定試料容器54を、反応部24、容器載置部130、超音波振動部110及び液体除去部120の間で移送するためのものである。
なお、前記各部24〜29、100、110、120、150を有する調製デバイス部18の流体回路の構成(図11〜12)については、後述する。
チャンバ108には、前記吸引源107A、管路161及び管路163とともに、吸引源107Aによってチャンバ108内に導かれた液体103を装置外に排出する排出管165が接続されている。
超音波振動子102により付与される超音波振動の振動数は、本発明において特に限定されるものではないが、20kHz以上であることが好ましく、さらに、20〜75kHzであることが好ましい。
まず、容器移送部110を回動させて、前記把持部111の両把持片111a、111bと測定試料容器54の上端部に形成された環状の鍔部54aとを係合させる。このとき、前記把持部111は、バネ112の付勢力により測定試料容器54を把持している。
一方、図6に示されるように、吸気部123は、収容凹部124の底部に設けられており、吸引源123Aに接続されている。
図8は、データ処理装置4の内部構成を示すブロック図である。
図8に示されるように、本実施の形態のデータ処理装置4は、例えばノートPC(デスクトップ型でもよい。)等のパーソナルコンピュータよりなり、処理本体31と、表示部32と、入力部33とから主に構成されている。
CPU34は、ROM35に記憶されているコンピュータプログラムやRAM36にロードされたコンピュータプログラムを実行することが可能である。
また、I/Oインタフェース39は、測定装置2のI/Oインタフェース9とも接続されており、これにより、測定装置2とデータ処理装置4との間でデータの送受信を行うことができる。
図9は、前記検出部6を構成するフローサイトメータ10の機能ブロック図であり、図10は、そのフローサイトメータ10の光学系を示す側面図である。
図9に示されるように、フローサイトメータ10のレンズ系43は、光源である半導体レーザ44からのレーザ光を、フローセル45を流れる測定試料に集光するものであり、集光レンズ46は、測定試料中の細胞の前方散乱光をフォトダイオード47よりなる散乱光検出器に集光するものである。
すなわち、本実施の形態のレンズ系43は、半導体レーザ44側(図10の左側)から順に、コリメータレンズ43a、シリンダレンズ系(平凸シリンダレンズ43b+両凹シリンダレンズ43c)及びコンデンサレンズ系(コンデンサレンズ43d+コンデンサレンズ43e)から構成されている。
そこで、本実施の形態では、フローセル45を流れる測定試料からの散乱光をフォトダイオード47で検出するとともに、フローセル45を流れる測定試料からの蛍光をフォトマルチプライヤ51で検出する。
具体的には、データ処理装置4のCPU34は、測定対象細胞のピーク、核径、面積の値が所定の閾値より大きい場合に、測定対象細胞が異常であると判定する。
図11は、調製デバイス部18の検体セット部150、細胞分散部25、検体ピペット部26、検体定量部27、試薬定量部28、超音波振動部100、液体除去部120、反応部24の流体回路図であり、図12は、調製デバイス部18の弁別・置換部29の流体回路図である。
本実施の形態における弁別・置換部29の構成について、図13を用いて説明する。図13は、本実施の形態における図12の弁別・置換部29における置換容器57の底部付近の断面説明図である。
図13に示されるように、本実施の形態の弁別・置換部29は、置換容器57と、前記置換容器57内で上下方向に移動可能な円筒体からなるピストン58と、円筒体からなるピストン58の下端面に配設された、測定対象細胞を選別するためのフィルタ60と、測定対象細胞を含む液体の液面を検知する液面検知センサ82と、を備えている。
本実施の形態では、フィルタ60の下面よりも上方約2.0mmの位置にセンサ部82aを配設し、前記表面張力の影響及び第2液体の吸引速度をも考慮して、センサ部82aからの検知信号を受信していから所定時間経過後に、ピストン58内の第2液体の吸引を停止するようにしている。また、ピン状のセンサ部82aを斜め上方に配置することにより、液切れを良くして液面検知の精度を上げることができる。このとき、配置する角度としては、水平面に対して、概ね5〜90度の範囲である。
まず図14(a)に示すように、フィルタ60が、置換容器57内の生体試料と保存液との混合液の液面上方から、その液中に向かって下方に移動するように、ピストン58を下降させる。
その後、図14(c)に示すように、ピストン58の内部に残っている第2液体を外部に排出させる。このとき、ピストン58の内部に陰圧をかけて第2液体を吸引するため、第1液体中に含まれる測定対象細胞(C1)の一部は、フィルタ60の下方に付着する。
つぎに前述した細胞分析装置1の処理動作について説明する。
図15及び図16は、細胞分析装置1の各制御部8、16、31が行う処理を示すフローチャートである。
なお、図15では、データ処理装置4の制御部(処理本体)31が行う処理フローを右列に示し、測定装置2の制御部8が行う処理フローを左列に示している。また、図16では、試料調製装置3の制御部16が行う処理フローを一列に示しているが、この処理フローは、図示のA、B及びC点において図15の処理フローと繋がっている。以下、この図15及び図16を参照しつつ、細胞分析装置1が行う処理内容を説明する。
測定装置2の制御部8は、前記測定開始信号を受信すると(ステップS4)、調製開始信号を試料調製装置3に送信する(ステップS5及びA点)。
図17〜18は、前記弁別・置換処理(ステップS10)を示すフローチャートである。
図17に示されるように、まず、試料調製装置3の調製制御部16は、検体ピペット部26を細胞分散部25に移動させ(ステップT1)、第1ピペット26Aに分散済みの混合液を分散容器から所定量だけ吸引させる(ステップT2)。
ついで、置換容器57内に希釈液ユニット55からバルブV6を通して希釈液(置換液)が投入される(ステップT5)。
試料調製装置3の調製制御部16は、ピストン58の最下死点への移動が2回目でない場合には、置換スピッツへ希釈液の投入(ステップT5)から再度ろ過を繰り返し、2回目である場合には、ステップT16に進む。
図16に戻り、試料調製装置3の調製制御部16は、検体ピペット部26を置換容器57に移動させ、第1ピペット26Aに濃縮試料収容室80から濃縮液を吸引し、さらに検体ピペット部26を容器載置部130へ移動させ、容器移送部110によって予め反応部24から当該容器載置部130に移送されている測定試料容器54に前記濃縮液を供給する(ステップS11)。
〔凝集細胞の分離処理の内容〕
図19は、前記凝集細胞の分離処理(ステップS12)を示すフローチャートである。
図19に示されるように、まず、試料調製装置3の調製制御部16は、容器移送部110によって前記測定試料容器54を容器載置部130から超音波振動部100における所定の位置(図5に示される位置)まで移動させ、その一部(下部)を液体収容部101内の液体(水溶液)中に漬ける(ステップS121)。
ついで、試料調製装置3の調製制御部16は、吸引源107Aを駆動させて所定時間だけ液体収容部101の凹部104から液体103を吸引し、当該液体103の深さd(測定試料容器54を漬けた状態での液体の深さ)になるように調整する(ステップS123)。こうすることで、超音波振動を効果的に発生させることができる。
凝集細胞の分散効果を上げるためには、超音波振動の出力を上げる、及び/又は、超音波振動を付与する時間を長くすればよいが、測定試料容器54内の濃縮液に対し超音波振動を付与すると、濃縮液に含まれる凝集細胞が分散される一方において液体の振動に起因して濃縮液の温度が上昇する。
前記処理が終わると、得られた測定試料は第1ピペット26Aを介して、検体定量部27で定量され、定量後に測定装置2の検出部6に供給される(ステップS16及びB点)。
図15に戻り、測定装置2の制御部8は、調製開始信号を送信したあと、試料調製装置3から測定試料の供給があるか否かを常時判定している(ステップS19)。
そこで、試料調製装置3から測定試料が送液されると(B点)、測定装置2の制御部8は、その測定試料を測定部14のフローセル45に送り、測定試料の細胞に対する前記測定を行い(ステップS20)、その測定データをデータ処理装置4に送信する(ステップS21)。
測定装置2から前記測定データを受信すると、データ処理装置4の制御部31は、その測定データを用いて細胞や核を分析し、測定試料中の細胞が癌化しているか否か等を判定する(ステップS23)。
前記シャットダウン指示がある場合には、データ処理装置4の制御部31は、測定装置2にシャットダウン信号を送信する(ステップS26)。
表2は、超音波振動部による超音波処理を行わなかった場合(コントロール)、測定試料容器にポリプロピレンを用いて超音波処理を行った場合(実施例1)、及び測定試料容器にステンレスを用いて超音波処理を行った場合(比較例1)における、凝集上皮細胞率<凝集上皮細胞率=凝集上皮細胞数/(単一上皮細胞数+凝集上皮細胞数)>を表したものである。ここでは、液体収容部に収容されている液体として水を用いている。
なお、以上開示された実施の形態は、本発明の例示であって制限的なものではない。本発明の範囲は、前記実施の形態ではなく特許請求の範囲によって示され、さらに特許請求の範囲の構成と均等なすべての変更が含まれる。
図19に示されるように、この測定装置200は、反応部24、細胞分散部25、検体ピペット部26、検体定量部27、試薬定量部28、弁別・置換部29、超音波分散部100、容器移送部110、液体除去部120、検体セット部150、検出部6、信号処理部7、制御部140、及びI/Oインターフェース160を備えている。
測定装置200の制御部150は、前記実施の形態に係る図2の測定制御部8と図3の調製制御部16との両方の機能を有している。また、制御部150は、I/Oインターフェース160を介して、データ処理装置4と繋がっており、制御部150が処理したデータや、制御部150の処理で必要なデータをデータ処理装置4との間で送受信することができる。
2 測定装置
3 試料調製装置
4 データ処理装置
6 検出部
16 調製制御部
18 調製デバイス部
24 反応部
25 細胞分散部
26 検体ピペット部
27 検体定量部
28 試薬定量部
29 弁別・置換部
31 処理本体
32 表示部
53 生体容器
54 測定試料容器
57 置換容器
58 ピストン
59 駆動部
60 フィルタ
68 収容室
69 磁石
70 駆動モータ
72 回転子
75 磁石
80 濃縮試料収容室
82 液面検知センサ
100 超音波振動部
101 液体収容部
102 超音波振動子
103 液体
104 凹部
106 供給孔
107 排出孔
110 容器移送部
111 把持部
112 溝
120 液体除去部
121 本体部
122 給気口
123 吸気部
124 収容凹部
129 給気口
130 容器載置部
Claims (16)
- 生体から採取された生体試料中の分析対象細胞を通過させず、分析対象細胞よりも小さい細胞を通過させるフィルタを用いて分析対象細胞を弁別し、分析対象細胞を含む試料を取得する弁別部と、
前記フィルタによって弁別された前記分析対象細胞を含む試料を収容した測定試料容器を介して前記試料に超音波振動を付与することにより、前記測定試料容器内に収容された前記試料に含まれる凝集した細胞を分離させるための超音波振動部と、
超音波振動の付与により凝集細胞の分離処理が行われた前記試料と細胞のDNAを染色するための試薬とから測定試料を調製する試料調製部と、
超音波振動の付与により凝集細胞の分離処理が行われた前記試料が収容された前記測定試料容器を前記超音波振動部から前記試料調製部へ移送する容器移送部と
を備えたことを特徴とする試料調製装置。 - 前記超音波振動部は、液体を収容する液体収容部と、超音波振動を発生する超音波振動子とを備えており、
前記容器移送部は、前記測定試料容器を前記液体収容部に収容された液体に漬けた状態で保持可能であり、且つ、
前記超音波振動子は、前記液体を介して前記測定試料容器に収容された試料に超音波振動を付与する請求項1に記載の試料調製装置。 - 前記液体収容部に液体を供給する液体供給部と、当該液体収容部から液体を排出する液体排出部とを備えている請求項2に記載の試料調製装置。
- 前記液体が水であり、且つ、前記測定試料容器が合成樹脂で作製されている請求項1〜3のいずれかに記載の試料調製装置。
- 前記測定試料容器の内面の算術平均粗さが1〜30μmの範囲である請求項1〜4のいずれかに記載の試料調製装置。
- 前記液体収容部が円筒体形状を呈しており、前記超音波振動子が円柱体形状を呈しており、且つ、液体収容部の内径が超音波振動子の径よりも大きい請求項1〜5のいずれかに記載の試料調製装置。
- 前記測定試料容器に付着した液体を除去する液体除去部をさらに備えており、
前記容器移送部は、前記測定試料容器を超音波振動部から前記液体除去部へ移送し、当該液体除去部から前記試料調製部へ移送する請求項1〜6のいずれかに記載の試料調製装置。 - 前記試料調製部はRNaseを含む試薬で前記試料を処理する請求項1〜7のいずれかに記載の試料調製装置。
- 前記分析対象細胞が上皮細胞である請求項1〜8のいずれかに記載の試料調製装置。
- 前記測定試料が上皮細胞のがん化判定用の測定試料である請求項1〜9のいずれかに記載の試料調製装置。
- 生体から採取された生体試料中の分析対象細胞を通過させず、分析対象細胞よりも小さい細胞を通過させるフィルタを用いて分析対象細胞を弁別し、分析対象細胞を含む試料を取得する弁別部と、
前記フィルタによって弁別された前記分析対象細胞を含む試料を収容した測定試料容器を介して前記試料に超音波振動を付与することにより、前記測定試料容器内に収容された前記試料に含まれる凝集した細胞を分離させるための超音波振動部と、
超音波振動の付与により凝集細胞の分離処理が行われた前記試料と細胞のDNAを染色するための試薬とから測定試料を調製する試料調製部と、
前記超音波振動部に配置された前記測定試料容器内の超音波振動の付与により凝集細胞の分離処理が行われた前記試料を前記試料調製部へ移送する試料移送部と
を備えたことを特徴とする試料調製装置。 - 前記試料移送部がピペットを備えており、前記ピペットによって前記測定試料容器内の前記試料を前記試料調製部に移送する請求項11に記載の試料調製装置。
- 生体から採取された生体試料中の分析対象細胞を通過させず、分析対象細胞よりも小さい細胞を通過させるフィルタを用いて分析対象細胞を弁別し、分析対象細胞を含む試料を取得する工程と、
前記フィルタによって弁別された前記分析対象細胞を含む試料を収容した測定試料容器を介して前記試料に超音波振動を付与することにより、前記測定試料容器内に収容された前記試料に含まれる凝集した細胞を分離させる工程と、
超音波振動の付与により凝集細胞の分離処理が行われた前記試料と細胞のDNAを染色するための試薬とから測定試料を調製する工程と
を備えたことを特徴とする試料調製方法。 - 前記測定試料を調製する工程において、RNaseを含む試薬で前記試料を処理する請求項13に記載の試料調製方法。
- 前記分析対象細胞が上皮細胞である請求項13または請求項14に記載の試料調製方法。
- 前記測定試料が上皮細胞のがん化判定用の測定試料である請求項13〜15のいずれかに記載の試料調製方法。
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