JP2005315862A - 子宮頸癌のスクリーニング方法及び子宮頸癌診断薬 - Google Patents

Abstract

【課題】 子宮頸癌の有無だけでなく、扁平上皮癌、腺癌を区別することができる子宮頸癌の診断試薬及び当該試薬を用いた子宮頸癌のスクリーニング方法、特にフローサイトメトリーを利用した高速処理を可能なスクリーニング方法を提供する。
【解決手段】 互いに識別可能な蛍光で標識された、腺系細胞と反応する第１蛍光標識抗体、腺癌細胞と反応する第２蛍光標識抗体、及び子宮頸部扁平上皮系異型細胞と反応する第３蛍光標識抗体を含む。第１標識抗体としてＭＵＣ１抗体、サイトケラチン７抗体、及びサイトケラチン１８抗体からなる群、第２標識抗体としてサイトケラチン８抗体及びＨＩＫ１０８３抗体からなる群、第３標識抗体としてＮＭＰ１７９抗体、ｐ１６^{ＩＮＫ４Ａ}抗体、Ｋｉ−６７抗体、ｐ５３抗体、ｐ２１抗体、ＥＭＡ抗体、ＣＥＡ抗体及びＭＩＢ−1抗体からなる群より選ばれる少なくとも１種を用いることが好ましい。
【選択図】 図１

Description

本発明は、生体から採取された子宮頸部細胞群の検体について、扁平上皮癌及びその前癌状態、腺癌及びその前癌状態の有無を検出できる子宮頸癌診断試薬、及び当該診断試薬を用いた子宮頸癌のスクリーニング方法、並びに腺癌及び扁平上皮癌を自動的に判定する自動診断方法に関する。

子宮頸癌の早期発見のためのスクリーニング法として、健康診断等では、細胞診が有効に利用されている。

ここで、子宮頸癌の細胞診は、子宮頸部表面を綿棒やスクレーバー等で擦過し、擦過した細胞を、直ちにスライドグラス上に塗抹して標本を作り、顕微鏡等で観察することにより診断を行っている。顕微鏡による細胞の形態観察による診断は、細胞検査士が、検体毎に行っているのが実情であり、精度、処理速度の点で、改善が求められている。

近年、細胞検体を自動的に検査して、癌細胞の有無を判断する装置が上市されている。この自動判別装置は、子宮頸部細胞を含む検体をスライドグラスに塗抹して塗抹標本を作製し、標本の細胞核及び細胞質をパパニコウロウ染色で染色し、標本細胞の形態イメージを処理した形態情報から癌細胞の有無を判別している。しかし、この自動細胞判別装置の性能は、正常細胞の除外効率が２５％、処理速度が８〜１０検体／時間程度である。このような精度、処理速度は、健康診断で癌の有無を判別する現場担当者にとって、満足のゆくものではない。

一方、細胞形態観察によらず、癌細胞に特異的なマーカーを検出することにより、癌細胞の有無を判断する細胞診断方法がある。

例えば、特許文献１には、子宮頸癌及びその前癌状態に特異的なマーカーとして、子宮頸癌関連タンパク質及びそれを認識する抗体を用いたイムノアッセイが提案されている。子宮頸癌関連タンパク質を認識する抗体としては、ＮＭＰ１７９抗体が知られている。

特許文献２には、子宮頸部塗抹標本だけでなく、個々に分散された細胞群の検体について、腫瘍細胞及びそれらの前駆細胞の自動検出方法が提案されている。これは、癌細胞における２種以上のマーカーを、マーカーに特異的に反応する抗体又は核酸プローブに蛍光標識した試薬を用いて、前記マーカーと結合した試薬の蛍光シグナルの有無を自動的に測定することにより癌細胞の有無を検出する方法である。マーカーとしては、ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ｐ１６，ｐ５３、ＭＮ、ｍｄｍ−２、ｂｃｌ−２、ＥＧＦレセプター、並びにＨＰＶ６，１１，１６，１８，３０，３１，３３，３４，３５，４５，５１及び５２が挙げられている。

子宮頸癌は、主として、扁平上皮癌と腺癌、さらにこれらの前癌状態に分類され、近年の健康診断にあっては、検出される癌細胞が、扁平上皮癌、腺癌のいずれであるのかを診断できるスクリーニング方法が要望されている。

しかしながら、特許文献２で用いられているマーカーは一般的な癌細胞のマーカーであるため、癌細胞の有無を判断することはできても、子宮頸癌の種類まで判別することはできない。特許文献１に開示されているマーカーは子宮頸癌に特異的なマーカーではあるものの、扁平上皮癌及び腺癌の双方に共通するマーカーであるため、やはり癌の種類までを判別する情報は得られない。

また、ＮＭＰ１７９抗体は、一部の正常細胞と反応することが報告されており（非特許文献１）、性能として満足できるものではない。

Ａｃｔａ Ｃｙｔｏｌｏｇｉｃａ， Ｖｏｌｕｍｅ ４３，Ｎｕｍｂｅｒ ６／Ｎｏｖｅｍｂｅｒ−Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９９９：１０１５−１０２２ 特表２００１−５００６０９号 特開２００２−２９６２７４号

本発明は、以上のような事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、子宮頸癌の有無だけでなく、扁平上皮癌、腺癌を区別することができる子宮頸癌の診断試薬及び当該試薬を用いた子宮頸癌のスクリーニング方法、さらにはフローサイトメトリーを利用することにより高速処理を可能とした子宮頸癌のスクリーニング方法を提供することにある。

本発明の第１の見地による子宮頸癌のスクリーニング方法は、互いに識別可能な標識物質で標識された、腺系細胞と反応する第１標識抗体、腺癌細胞と反応する第２標識抗体、及び子宮頸部扁平上皮系異型細胞と反応する第３標識抗体と、子宮頸部細胞とを反応させて測定用試料を調製し、前記子宮頸部細胞に結合した前記各標識抗体由来の標識をそれぞれ検出し、検出された標識に基づいて、腺癌細胞及び／又は扁平上皮系異型細胞の有無を判別する方法である。前記標識の少なくとも１つが蛍光標識であることが好ましい。

上記スクリーニング方法において、前記判別は、前記測定用試料中の細胞について、第１標識抗体の第１標識を検出する手段により、当該細胞の第１標識抗体に対する反応の陽性又は陰性を判定し、前記第１蛍光標識抗体に対して陽性と判定した細胞について、第２標識抗体の第２標識を検出する手段により、前記測定用試料中の細胞の第２標識抗体に対する反応の陽性又は陰性を判定し、前記第１標識抗体に対して陰性と判定した細胞について、第３標識抗体の第３標識を検出する手段により、当該測定用試料中の細胞の第３標識抗体に対する反応の陽性又は陰性を判定することにより行われることが好ましい。

また、本発明の第２の見地による子宮頸癌のスクリーニング方法は、互いに識別可能な蛍光で標識された、腺系細胞と反応する第１蛍光標識抗体、腺癌細胞と反応する第２蛍光標識抗体、及び子宮頸部扁平上皮系異型細胞と反応する第３蛍光標識抗体と、子宮頸部細胞とを反応させて調製された測定用試料に励起光を照射し、前記測定用試料から発せられた蛍光を検出し、検出された蛍光に基づいて、腺癌細胞及び／又は扁平上皮系異型細胞の有無を判別する方法である。

本発明の第１及び第２の見地による子宮頸癌のスクリーニング方法において、前記第１標識抗体の抗体は、ＭＵＣ１抗体、サイトケラチン７抗体、及びサイトケラチン１８抗体からなる群より選ばれる少なくとも１種であることが好ましく、前記第２標識抗体の抗体は、サイトケラチン８抗体及びＨＩＫ１０８３抗体からなる群より選ばれる少なくとも１種であることが好ましく、前記第３標識抗体の抗体は、ＮＭＰ１７９抗体、ｐ１６^{ＩＮＫ４Ａ}抗体、Ｋｉ−６７抗体、ｐ５３抗体、ｐ２１抗体、ＥＭＡ抗体、ＣＥＡ抗体及びＭＩＢ−１抗体からなる群より選ばれる少なくとも１種であることが好ましい。

第２の見地による子宮頸癌のスクリーニング方法において、前記判別は、前記測定用試料中の細胞から発せられた蛍光について、第１蛍光標識由来の蛍光強度を測定することにより、該細胞の第１蛍光標識抗体に対する反応の陽性又は陰性を判定し、前記第１蛍光標識抗体に対して陽性と判定した細胞から発せられた蛍光について、第２蛍光標識由来の蛍光強度を測定することにより、該細胞の第２蛍光標識抗体に対する反応の陽性又は陰性を判定し、前記第１蛍光標識抗体に対して陰性と判定した該細胞から発せられた蛍光について、第３蛍光標識由来の蛍光強度を測定することにより、該細胞の第３蛍光標識抗体に対する反応の陽性又は陰性を判定することにより行われてもよいし(第１の判別方法）、あるいは前記測定用試料をフローサイトメータのフローセルに流し、フローセルを流れる前記測定用試料中の細胞に励起光を照射し、前記細胞から発せられた蛍光について、第１蛍光標識由来の蛍光パラメータ、第２蛍光標識由来の蛍光パラメータ、及び第３蛍光標識由来の蛍光パラメータをそれぞれ計測し、各蛍光パラメータ値の組合わせによって行われてもよい（第２の判別方法）。

上記第２の判別方法において、前記蛍光パラメータは、蛍光強度、蛍光パルス幅及び蛍光パルス面積からなる群より選択されることが好ましい。さらに前記測定用試料中の細胞についての散乱光パラメータを計測して、腺癌細胞及び／又は扁平上皮系異型細胞の有無を判別してもよい。この場合、前記散乱光パラメータは、前方散乱光強度、前方散乱光パルス幅及び側方散乱光パルス幅からなる群より選ばれることが好ましい。

また、上記第２の判別方法を採用する場合、第１蛍光標識由来の蛍光パラメータ、第２蛍光標識由来の蛍光パラメータ、及び第３蛍光標識由来の蛍光パラメータからなる群より選ばれる１種の蛍光パラメータと、前記散乱光パラメータとを二軸とする二次元分布図を作成して、腺癌細胞及び／又は扁平上皮系異常細胞の有無を判別してもよい。

あるいは、上記第２の判別方法を採用する場合、前記測定用試料中の子宮頸部細胞が、さらに予め核染色可能な蛍光色素で染色されており、子宮頸部細胞の核染色由来の蛍光プロファイルと、該子宮頸部細胞から発光される核染色由来以外の発光プロファイル及び前方散乱光プロファイル及び側方散乱光プロファイルとの比較から、腺癌細胞及び／又は扁平上皮系異型細胞の有無を判別してもよい。

また、上記第２の判別方法を採用する場合、前記フローサイトメータが撮像手段を備え、第３蛍光標識抗体に対する反応が陽性と判定された細胞について、細胞画像を撮像してもよい。

本発明の子宮頸癌のスクリーニング方法は、前記子宮頸部細胞が単細胞に分散された細胞の集合体であってもよいし、第２の判別方法を採用しない場合には、前記子宮頸部細胞が塗抹標本上の細胞であってもよい。

本発明の子宮頸癌診断試薬は、互いに識別可能な蛍光で標識された、腺系細胞と反応する第１蛍光標識抗体、腺癌細胞と反応する第２蛍光標識抗体、及び子宮頸部扁平上皮系異型細胞と反応する第３蛍光標識抗体を含む。前記第１標識抗体の抗体は、ＭＵＣ１抗体、サイトケラチン７抗体、及びサイトケラチン１８抗体からなる群より選ばれる少なくとも１種であり、前記第２標識抗体の抗体は、サイトケラチン８抗体及びＨＩＫ１０８３抗体からなる群より選ばれる少なくとも１種であり、 前記第３標識抗体の抗体は、ＮＭＰ１７９抗体、ｐ１６^{ＩＮＫ４Ａ}抗体、Ｋｉ−６７抗体、ｐ５３抗体、ｐ２１抗体、ＥＭＡ抗体、ＣＥＡ抗体及びＭＩＢ−1抗体からなる群より選ばれる少なくとも１種であることが好ましい。

本発明の子宮頸癌の自動診断方法は、上記本発明の第１及び第２の見地のスクリーニング方法において、腺癌細胞及び／又は扁平上皮系異型細胞の有無を自動的に判定するとともに、腺癌細胞及び／又は扁平上皮系異型細胞と判定された細胞の、測定用試料に含まれる細胞集合体に対する含有割合が所定値以上の場合には、腺癌又は扁平上皮癌であると判断する方法である。

さらに本発明の第３の見地による子宮頸癌のスクリーニング方法は、互いに識別可能な標識で標識された、腺系細胞と反応する抗腺系細胞標識抗体及び子宮頸部扁平上皮系異型細胞と反応する抗扁平上皮系異型細胞抗体と、子宮頸部細胞とを反応させて測定用試料を調製し、前記子宮頸部細胞に結合した前記各標識抗体由来の標識をそれぞれ検出し、検出された標識に基づいて、扁平上皮系異型細胞の有無を判別する方法である。腺系細胞と反応する標識抗体の抗体が、ＭＵＣ１抗体、サイトケラチン７抗体、及びサイトケラチン１８抗体からなる群より選ばれる少なくとも１種であることが好ましく、子宮頸部扁平上皮系異型細胞と反応する標識抗体の抗体が、ＮＭＰ１７９抗体、ｐ１６^{ＩＮＫ４Ａ}抗体、Ｋｉ−６７抗体、ｐ５３抗体、ｐ２１抗体、ＥＭＡ抗体、ＣＥＡ抗体及びＭＩＢ−1抗体からなる群より選ばれる少なくとも１種であることが好ましい。

本発明の子宮頸癌のスクリーニング装置は、互いに識別可能な蛍光物質で標識された、腺系細胞と反応する第１蛍光標識抗体、腺癌細胞と反応する第２蛍光標識抗体、及び子宮頸部扁平上皮系異型細胞と反応する第３蛍光標識抗体と、子宮頸部細胞とを反応させて調製された測定用試料を、導入するためのフローセル；該フローセル内を流れる測定用試料中の細胞に励起光を照射するための光源；励起光を照射された前記細胞より発せられた第１蛍光標識抗体由来の蛍光を検出するための第１の蛍光検出器；励起光を照射された前記細胞より発せられた第２蛍光標識抗体由来の蛍光を検出するための第２の蛍光検出器；励起光を照射された前記細胞より発せられた第３蛍光標識抗体由来の蛍光を検出するための第３の蛍光検出器；及び検出された蛍光が第１蛍光標識抗体、第２標識抗体、第３標識抗体のいずれの由来であるかを判定し、その判定結果に基づいて、腺癌細胞及び／又は扁平上皮系異型細胞の有無を判別する解析部；を備えている。

さらに前記細胞の散乱光を検出するための散乱光検出部を備え、前記解析部は、検出された蛍光及び散乱光を二軸とする二次元分布図を作成し、該分布図に基づいて、腺癌細胞及び／又は扁平上皮系異型細胞の有無の判別手段を備えていてもよい。

さらに撮像手段を備え、前記解析部は、撮像された画像を加味して、腺癌細胞及び／又は扁平上皮系異型細胞の有無を判別してもよい。

本発明の子宮頸癌のスクリーニング方法は、腺細胞及び扁平上皮細胞の個々の特徴に考慮して、各細胞癌に特異的なマーカーに着目し、各抗体に対する反応性の有無を調べることにより、癌細胞と正常細胞の判別はもちろん、腺癌細胞と扁平上皮癌細胞、さらにはこれらの前癌状態も区別して判定することができる。また、フローサイトメトリーを適用することができ、これにより、効率よく子宮頸癌のスクリーニングを行うことができる。

本発明の子宮頸癌のスクリーニング方法は、互いに識別可能な標識物質で標識された、腺系細胞と反応する第１標識抗体、腺癌細胞と反応する第２標識抗体、及び子宮頸部扁平上皮系異型細胞と反応する第３標識抗体と、子宮頸部細胞とを反応させて測定用試料を調製し、前記子宮頸部細胞に結合した前記各標識抗体由来の標識をそれぞれ検出し、検出された標識に基づいて、腺癌細胞及び／又は扁平上皮系異型細胞の有無を判別する方法である。

〔子宮頸癌診断試薬〕
はじめに本発明の子宮頸癌のスクリーニング方法で使用する子宮頸癌診断試薬について説明する。

本発明の子宮頸癌診断試薬は、腺系細胞と反応する第１抗体、腺癌細胞と反応する第２抗体、及び子宮頸部扁平上皮系異型細胞と反応する第３抗体を含み、各抗体は、それぞれ互いに識別可能な標識物質で標識付けされている。

腺系細胞と反応する第１抗体としては、ＭＵＣ１抗体、サイトケラチン７抗体、及びサイトケラチン１８抗体からなる群より選ばれる少なくとも１種が用いられる。

ここで、ＭＵＣ１抗体とは、細胞表面の粘液と反応する抗体である。腺細胞が粘液を産生するのに対し、扁平上皮細胞は粘液を産生しないので、ＭＵＣ１抗体との反応の有無により、細胞内に粘液を含有する腺細胞と粘液を含有しない扁平上皮細胞とを弁別できる。

サイトケラチン７抗体、サイトケラチン１８抗体は、それぞれサイトケラチン７、サイトケラチン１８に対して特異的に反応する抗体である。サイトケラチンとは細胞質内繊維状構造物の一つで、その中の中間径フィラメントを形成するタンパク質群に属する。サイトケラチン７、１８は、腺細胞を含む多様な上皮細胞に存在するが、扁平上皮には少ない。またサイトケラチン７、１８は、腫瘍細胞に対しては良性、悪性にも存在するが、扁平上皮癌には非常に少ない。従って、サイトケラチン７、１８抗体は、腺細胞系の細胞を分別するのに有用である。

腺癌細胞と反応する第２抗体としては、サイトケラチン８抗体及びＨＩＫ１０８３抗体からなる群より選ばれる少なくとも１種を使用する。

サイトケラチン８抗体とは、サイトケラチン８に対して特異的に反応する抗体である。サイトケラチン８は、腺癌細胞の他、扁平上皮癌細胞、正常な腺細胞、扁平上皮細胞にも含まれるが、その含有量は、腺癌細胞が圧倒的に多い。従って、サイトケラチン８抗体は、正常細胞、扁平上皮癌細胞、腺癌細胞の中から、腺癌細胞と優先特異的に結合して、腺癌細胞を検出することができる。

ＨＩＫ１０８３抗体は、胃の腺粘液細胞が産生、分泌するムチンに対して反応する抗体で、この抗体を用いる免疫染色は、子宮頸部腺癌の特に悪性腺種で陽性となることが知られている（Ｉｓｈｉｉ Ｋら、Ｃａｎｃｅｒ １９９９年；８７：２４５−２５３）。

前記第３抗体としては、ＮＭＰ１７９抗体、ｐ１６^{ＩＮＫ４Ａ}抗体、Ｋｉ−６７抗体、ｐ５３抗体、ｐ２１抗体、ＥＭＡ抗体、ＣＥＡ抗体及びＭＩＢ−１抗体からなる群より選ばれる少なくとも１種を使用することが好ましい。

ＮＭＰ１７９抗体とは、子宮頸癌に関連する核マトリックス抗原を認識するモノクローナル抗体で、子宮頸部の前癌状態の扁平上皮内疾患（ｓｑｕａｍｏｕｓ ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｌｅｓｉｏｎｓ）の初期の発見に有用なマーカーで、高度な扁平上皮内疾患（ＨＳＩＬ）及び軽度な扁平上皮内疾患を発見するのに有用である。

ｐ１６^{ＩＮＫ４Ａ}タンパク質は、ＨＰＶのＥ７タンパク質によって発現が誘導されることが知られており、子宮頸癌はヒトパピローマウィルス（ＨＰＶ）の感染によって発症する場合が非常に高いことから、子宮頸癌の細胞診マーカーとしてｐ１６^{ＩＮＫ４Ａ}抗体を用いた研究が数多くなされている（Ｂｉｂｂｏ Ｍら，Ａｃｔａ Ｃｙｔｏｌ．２００２年；４６（１）：２５−２９、Ｋｌａｅｓ Ｒら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、２００１年；９２：２７６−２８４）。

Ｋｉ−６７タンパク質は、増殖中の細胞で発現が亢進することから、Ｋｉ−６７抗体は腫瘍の増殖のモニターに用いられている。子宮頸部細胞診に関する研究においても、Ｋｉ−６７抗体を用いた報告が複数存在する。ＭＩＢ−１抗体は、Ｋｉ−６７抗体のサブタイプの一つである（Ｐｉｒｏｇ ＥＣ．ら，Ａｍ Ｊ Ｓｕｒｇ Ｐａｔｈｏｌ，２００２年，２６（１）：７０−７５、Ｐｅｓｎｉｃｋ Ｍら，Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．１９９６年；２７（３）：２３４−２３９）。

ｐ５３タンパク質は、癌抑制作用を有するが、その構造に変異が生じると癌抑制作用を失う。このため、変異型ｐ５３抗体が癌のマーカーとして広く用いられている。子宮頸癌細胞診に関しても変異型ｐ５３抗体を用いた研究がなされている（Ｍａｅｄａ ＭＹ．ら，Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ，２００１年；９３（３）：１８９−１９５、Ｋｅｒｓｔｅｎｓ ＨＭら，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．２０００年；４８（５）：７０９−７１８）。

ｐ２１，ｐ２７タンパク質は、ｐ５３、ｐ１６^{ＩＮＫ４Ａ}などと同様に細胞周期関連タンパク質であり、癌細胞での発現亢進が様々な癌で認められている。このため、子宮頸癌を含めてｐ２１抗体をマーカーに用いた研究報告が多くなされている（ｖａｎ ｄｅ Ｐｕｔｔｅ Ｇら，Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．２００３；８９（１）：１４０−１４７、Ｇｒａｆｌｕｎｄ Ｍら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ、２００２；１２（３）：２９０−２９８）。

ＥＭＡは腫瘍細胞特異的膜タンパクであるため、子宮頸部腺癌細胞診のマーカーとして用いた研究報告が複数存在する（Ｓｉｎｃｏｃｋ ＡＭら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．１９８３年；３６（５）：５３５−５３８、Ｍｏｎｃｒｉｅｆｆ Ｄら，Ａｃｔａ．Ｃｙｔｏｌ．１９８４年；２８（４）：４０７−４１０）。

ＣＥＡタンパク質は、癌細胞で多く発現していることから、子宮頸癌細胞診のマーカーとしてＣＥＡ抗体を用いた研究報告が複数なされている（Ｂａｍｆｏｒｄ ＰＮ．ら，Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．１９８３年；６１（５）：６０３−６０８）。

本発明で使用する抗体は、いずれも各抗体が反応対象とするマーカーとの結合部位を有する抗体であればよく、Ｆｃフラグメントの構造、Ｆａｂの不変領域などは特に限定せず、市販品を使用することができる。例えば、ＭＵＣ１抗体として、Ｅｘａｐｈａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．のＡｎｔｉ−ＭＵＣ１抗体を使用することができ、サイトケラチン８抗体として、ダコ社から市販されている「抗サイトケラチン８、３５Ｈ１１マウスモノクローナル抗体」を使用することができる。ＮＭＰ１７９抗体はＭａｔｒｉｔｅｃｈ社の製品である。

ｐ１６^{ＩＮＫ４Ａ}抗体、Ｋｉ−６７抗体、ｐ５３抗体、ｐ２１抗体、ｐ２７抗体、ＣＥＡ抗体はいずれもダコ社から製品が販売されている。ＭＩＢ−１抗体はＩｍｍｕｎｏｔｅｃｈ社から入手できる。

本発明の診断試薬は、上記第１抗体、第２抗体、第３抗体が、生理食塩水、リン酸系もしくはトリス系緩衝液、界面活性剤等を溶媒として含有されることが好ましく、具体的には、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）とＴｗｅｅｎ系又はＴｒｉｔｏｎ系界面活性剤の混合液が溶媒として用いられる。

〔抗体の標識について〕
診断試薬に含まれる第１抗体、第２抗体、第３抗体は、それぞれ識別可能な標識物質で標識される。標識は、各抗体に直接、標識化合物を結合させることによって行っても良いし（直接法）、上記抗体を非標識の一次抗体として、この一次抗体にそれぞれ特異的な標識二次抗体と結合させることにより間接的に標識付けしてもよい（間接法）。

上記各抗体が、同種の動物由来の場合には、交差反応による誤判定を回避するために、直接法により標識することが好ましい。交差反応が起こりにくい別種動物由来の抗体を用いる場合には、二次抗体による間接法で標識してもよい。

本発明で用いることができる標識化合物は、特に限定しないが、Ｃｙ３（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ社の登録商標）等のシアニン系色素、フルオレセインイソチアシネート（ＦＩＴＣ）、アロフィコシアニン、ローダミン、量子ドットなどの蛍光物質；金粒子などの光散乱物質；フェライトなどの吸光物質；^１２５Ｉ等の放射性物質；ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素など従来より公知の標識化合物を用いることができる。これらのうち、本発明で使用する３種類の抗体（第１抗体、第２抗体、第３抗体）の標識の区別を簡易に行えるという点から、発光する蛍光波長の異なる蛍光色素で各抗体を標識することが好ましい。例えば、第１抗体を赤色（例えばＰＥ−Ｃｙ５）、第２抗体を緑色（例えばＡｌｅｘａ４８８，ＦＩＴＣ）、第３抗体をオレンジ色（例えばＰＩ，ＡＰＣ，Ｒ−ＰＥ）に発光する染料で標識するといったような３カラーによる識別が好ましく用いられる。

〔測定用試料の調製〕
本発明のスクリーニング方法に提供する測定用試料は、以下のようにして調製する。
まず、スクリーニングしようとする子宮頸部細胞に、第１標識抗体、第２標識抗体、及び第３標識抗体を含む本発明の子宮頸癌診断試薬を添加し、所定時間反応させて測定用試料を調製する。

子宮頸部細胞としては、単細胞に分散された細胞の集合体であってもよいし、塗抹標本上の細胞であってもよい。処理速度が優れているフローサイトメトリーに適用するためには、単細胞に分散された細胞の集合体を用いることが好ましい。

測定用試料の調製に供する子宮頸部細胞は、子宮頸部表面を綿棒やスクレーバー等で擦過した場合に採取された子宮頸部細胞群そのまま用いてもよいし、予め粘液除去処理を行った後、本発明の子宮頸癌診断試薬と反応させたものであってもよい。子宮頸部表面を綿棒やスクレーバー等で擦過した場合に採取された子宮頸部細胞群には、粘液を分泌する腺細胞が含まれるため、粘液により、試薬に含有されている抗体との反応が十分に行われない場合があり、これを防止できるからである。特にフローサイトメトリーに適用する場合、粘液で凝集した状態の細胞塊ではフローサイトメトリーを適用できないので、粘液を除去することが好ましい。

粘液除去方法としては、特に限定しないが、例えば、本発明者が提案しているシステイン系化合物で処理することが好ましい。システイン化合物としては、メチルシステイン、アセチルシステイン、Ｌ−システインなどを用いることができる。

フローサイトメトリーを適用する場合、粘液除去後に、個々の細胞に分散させるために、さらに分散処理を行うことが好ましい。前記粘液除去処理だけでは、完全に個々に細胞を分散させることが困難な場合があるからである。本発明のスクリーニング方法において、後述する細胞画像の撮像を行う場合、細胞形態を破壊しないで、分散処理を行う必要がある。細胞形態を破壊しないで、分散処理を行う方法としては、例えば、本発明者が特願２００３−３５９３３６号で提案しているように、アルデヒド化合物で細胞安定化処理を行った後、タンパク質分解酵素で処理することが好ましい。安定化処理を行わずにタンパク質分解酵素で処理すると、細胞自体が破壊され得るからである。アルデヒド化合物としては、パラホルムアルデヒド、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、またはこれらの混合物を用いることができる。

細胞分散に用いるタンパク質分解酵素としては、トリプシン、プロナーゼ、ペプシン、エラスターゼ、コラゲナーゼなどが挙げられ、これらのうちコラゲナーゼが好ましく用いられる。消化力が弱い酵素では、分散化に必要な時間を比較的広い範囲内で決めることができるため、検体個々人の差異による適切な消化時間の差異が問題にならずに済むからである。

子宮頸癌細胞と診断試薬との反応条件は、特に限定しないが、室温にて１〜３０分間くらいで行うことが好ましく、反応効率を高めるために、振とう等を行うことが好ましい。

尚、診断試薬との反応に先立って、検体の非特異タンパクをブロックしておくことが好ましい。ブロック試薬としては、ウシアルブミン、コントロール血清やカゼインなどを、生理食塩水等で希釈したものが好ましく用いられる。

測定用試料の調製については、ブロッキング反応後、診断試薬との反応後、二次抗体と反応させた場合には二次抗体反応後、適宜洗浄を行うことが好ましい。

〔子宮頸癌スクリーニング方法の原理〕
本発明のスクリーニング方法は、上記で調製した測定用試料を用いて、腺癌細胞及び／又は扁平上皮系異型細胞の有無を判別する方法である。その方法の原理は、第１抗体、第２抗体、第３抗体それぞれに対する反応の有無に基づく。すなわち、測定用試料が対象とする抗体と反応する場合を陽性（＋）、反応しない場合を陰性（−）として、第１抗体、第２抗体、第３抗体の陽性及び／又は陰性を判定し、その組合わせから、表１に示すように、分類される。第１抗体、第２抗体、第３抗体の全てに対して陽性を示す細胞は、グループＩ（腺癌細胞）に分類され、第１抗体及び第３抗体に対しては陽性であるが第２抗体に対しては陰性である細胞はグループＩＩ（扁平上皮化生細胞、腺細胞）に分類され、第１抗体及び第２抗体に対してはいずれも陰性であるが第３抗体に対しては陽性を示す細胞はグループＩＩＩ（異型細胞、扁平上皮癌細胞、基底細胞層の扁平上皮細胞）に分類され、第１抗体、第２抗体、第３抗体の全てに対して陰性である細胞はグループＩＶ（表層、中層の扁平上皮細胞）に分類される。

本発明のスクリーニング方法は、第１標識抗体、第２標識抗体、第３標識抗体と子宮頸部細胞とを反応させて調製した測定用試料について、各抗体の標識に基づく各抗体に対する反応の有無を調べ、上記表１に示す分類のいずれに属するかを判定してもよいし、図１に示すようなフローチャートに基づいて判定することもできる。

すなわち、まず第１抗体に対する反応の有無を判別し（ステップ＃１）、陽性であれば第２抗体に対する反応性の有無を判別し（ステップ＃２）、第１抗体に対して陰性であれば第３抗体に対する反応性の有無を判別する（ステップ＃３）。このような順序に従ってＩ〜ＩＶのいずれのグループに分類される細胞が含まれているかを判定してもよい。

反応の有無は、各抗体に結合した標識に基づいて判定する。例えば、蛍光標識を用いた場合には、測定用試料に励起光を照射し、測定用試料から発せられた蛍光が、いずれの蛍光標識に基づくものであるかを検出すればよい。例えば、顕微鏡で、発せられた蛍光カラーを観察することにより、各抗体に対する陽性又は陰性を判定してもよいし、発せられた蛍光の周波数スペクトルにより、いずれの標識に基づく蛍光が発せられているかを調べてもよい。さらに、特定のバンドパスフィルター等を通して、フィルターを通過した蛍光の強度を測定することにより、いずれの標識抗体由来の蛍光が発光されたかを調べても良い。

〔フローサイトメトリーの適用〕
測定に供する子宮頸部細胞として、単細胞に分散された細胞の集合体を用いた場合、フローサイトメトリーを利用して、スクリーニングを行うことができる。フローサイトメーターを用いてスクリーニングを行う場合、各抗体の標識としては、蛍光物質を用いることが好ましい。

例えば、図２に示すような構成を有するフローサイトメーターを用いることにより、フローセルを通過する細胞がいずれの蛍光標識抗体と反応しているかを知ることができる。

図２に示す装置３０において、まず４８８ｎｍの発振波長を持つ青色レーザー（Ａｒイオンレーザー）と６３５ｎｍの発振波長を有する赤色レーザー（半導体レーザー）がビームコンバイナー１で混合され、励起光が生成される。生成された励起光は、集光レンズ２を経ることにより、短径１０μｍ、長軸が１００μｍ程度の扁平なビームプロファイルを持つように整えられ、フローセルに照射される。集光レンズ２から出射された励起光は、フローセルを経てビームストッパ３に結像し、一次光はここで遮られる。細胞で散乱された光はフィルタ４（中心波長４８８ｎｍ、通過波長１０ｎｍの干渉フィルタ）で細胞の発する蛍光がカットされ、前方散乱光の検出器１１（ＦＳＣダイオード）からみて数度の立体角の散乱光が集められ、前方散乱光の検出器１１で検出される。

一方、細胞から発せられた蛍光は、フローセルの側方に配置された高い開口数（ＮＡ）をもつ集光レンズ５で集められる。集光レンズ５を出射した光は、まず５６０ｎｍより短い波長の光を通す性質をもったダイクロイックミラー（ＤＭ５６０ＳＰ）に通される。このミラーを通過した光は、９０：１０の分割比をもったビームスプリッタで分割され、１０％の分割比を持つ光は、中心波長５３０ｎｍ、通過波長３０ｎｍの干渉フィルタ６を経て、ＦＬ１の検出器１２（光電子増倍管：ＰＭＴ）に入射され、そこで緑蛍光が検出される。一方、９０％の分割比を持つ光は、中心波長４８８ｎｍ、通過波長１０ｎｍの干渉フィルタ７を経てＳＳＣの検出器１３（光電子増倍管：ＰＭＴ）に入射され、そこで側方散乱光が検出される。次にダイクロイックミラー（ＤＭ５６０ＳＰ）で反射した光は、６４０ｎｍより長い波長を有する光を通す性質を持ったダイクロイックミラー（ＤＭ６４０ＬＰ）に通される。５６０ｎｍ以上、６４０ｎｍ未満の波長を持つ蛍光は、このミラーで反射され、中心波長５８５ｎｍ、通過波長４２ｎｍの干渉フィルタ８を経てＦＬ２の検出器１４（光電子増倍管：ＰＭＴ）に入射され、そこで橙蛍光が検出される。６４０ｎｍ以上の波長を持つ蛍光は、ハーフミラーで５０：５０に分割され、一方は中心波長６６１ｎｍ、通過波長１６ｎｍの干渉フィルタ９を経て、ＦＬ４の検出器１５（光電子増倍管：ＰＭＴ）に入射され、そこで赤蛍光が検出される。他方は、６７０ｎｍ以上の通過波長を持つ干渉フィルタ１０を経て、ＦＬ３の検出器１６（光電子増倍管：ＰＭＴ）に入射され、そこで長赤蛍光が検出される。本発明では、前記４つの蛍光のうち、少なくとも３つを使用すればよい。

上記で検出された前方散乱光、側方散乱光、緑蛍光、橙蛍光、赤蛍光、及び長赤蛍光の各信号は、解析部２０に送られ、入力された各信号について、以下に述べるような種々の所望の解析を行ない、結果を表示部２１に表示する。

このようなマルチカラー解析可能なフローサイトメータのフローセルに、各抗体が蛍光標識された診断試薬を用いて調製した測定用試料を流し、フローセルを通過する１個１個の細胞に数百μｍ×数μｍ程度の扁平な強度プロファイルを有する励起光（例えば、図２の装置ではレーザー光源から青色及び／又は赤色レーザー）を照射し、その感知領域を通過する細胞から発せられた蛍光について、第１蛍光標識由来の蛍光パラメータ、第２蛍光標識由来の蛍光パラメータ、及び第３蛍光標識由来の蛍光パラメータをそれぞれ計測する。図２の装置では、蛍光の種類により、ＦＬ１〜ＦＬ４のいずれかで、各標識抗体に由来する蛍光を検出することができ、所期の蛍光パラメータ値を算出することが可能となる。

ここで、蛍光パラメータとしては、蛍光強度、蛍光パルス幅及び蛍光パルス面積からなる群より選択されるパラメータの１種又はこれらの組合わせを用いることが好ましい。蛍光強度とは細胞の蛍光プロファイルの最大値である。蛍光パルス面積とは蛍光プロファイルを積分した値である。蛍光パルス幅とは、蛍光パルスが所定の閾値を越えている時間をいう。

フローサイトメータによれば、フローセルを流れている個々の細胞の蛍光を検出し、横軸に時間、縦軸に蛍光強度等の蛍光パラメータとした蛍光プロファイルを作成することによって、個々の細胞について、第１抗体、第２抗体、第３抗体に対する反応性の有無を判定することができる。その判定結果に基づいて、表１又は図１に示すフローに従って、個々の細胞がグループＩ〜ＩＶのいずれに属するかを判定することができる。さらに、測定用試料に含まれる細胞集団について、各標識抗体に対する各蛍光パラメータ値について細胞数をカウントしたヒストグラムを作成することによって、測定用試料に含まれる細胞集団として、すなわち１検体において、腺癌細胞（グループＩ）、扁平上皮癌細胞（グループＩＩＩ）に含まれる細胞がどの程度存在するのかということを判定することができる。

またさらに、第１標識抗体、第２標識抗体、第３標識抗体の個々の蛍光標識について順次判断するだけでなく、例えば、第１蛍光標識抗体に基づく蛍光パラメータをＸ軸、第２蛍光標識抗体に基づく蛍光パラメータをＹ軸、第３蛍光標識抗体に基づく蛍光パラメータをＺ軸とした三次元座標に、計測した第１、第２、第３蛍光標識抗体についての蛍光パラメータ値に相当する位置にプロットし、図３（ａ）〜（ｄ）に示す３次元空間のいずれの部分にプロットされるかによって、グループＩ〜ＩＶのいずれに属するかを一度で判別することができる。この場合、測定用試料に含まれる細胞集団全体、すなわち１検体についてドットプロットし、図３（ａ）〜（ｄ）に示す３次元空間のいずれの部分でプロット密度が高いかを判別することにより、細胞集団としての検体中に腺癌細胞（グループＩ）及び／又は扁平上皮癌細胞（グループＩＩＩ）に含まれる細胞がどの程度存在するのかという解析結果を得ることもできる。

このように、フローサイトメトリーの適用により、個々の細胞について、第１抗体、第２抗体、第３抗体それぞれに対する陽性又は陰性を判別することによって、測定用試料中に、腺癌細胞及び／又は扁平上皮系異型細胞が含まれているかを判断することができる。また、個々の検体に該当する１つの測定用試料に含まれている全ての細胞の蛍光パラメータ値の分布状態を調べることにより、グループＩ〜ＩＶに属する細胞がどの程度、存在しているかを知ることができる。

尚、フローサイトメトリーに供する１つの検体に該当する１つの測定用試料の測定結果の解析については、蛍光パラメータと細胞数の関係を表した頻度ヒストグラムや図３の三次元座標プロットの他、事象頻度の同じ要素を等高線で結んだ二次元の等高プロット、Ｚ軸を使った等積プロット、さらには複数のパラメータを用いたダイヤモンド表示など、公知のプログラムによる種々の表示方法、解析方法を適用することが可能である。また、プロットに際しては、適宜、ゲーティング、ウィンドウによる処理を行っても良い。

〔散乱光パラメータを計測する場合のスクリーニング方法〕
本発明のスクリーニング方法をフローサイトメトリーに適用する場合において、標識に基づく蛍光だけではなく、フローセル中の感知領域を通過する細胞から生じる散乱光も併せて計測することが好ましい。図２に示す装置では、ＦＳＣダイオードにより前方散乱光、ＳＳＣ検出器により側方散乱光を検出することができる。

フローセルを通過する細胞について、蛍光パラメータと散乱光パラメータを計測することにより、当該細胞について、さらに詳しい情報を得ることができ、細胞残渣による偽陽性反応を除外することができる。細胞残渣は、第３抗体に対して陽性である場合があるため、蛍光パラメータのみの判別では、グループＩＩＩに分類されてしまう。測定用試料、すなわち細胞の集合体についての散布図を作成した場合に、細胞残渣によりグループＩＩＩのプロット数が増えると、扁平上皮癌細胞との誤診判断を招来し得るので、細胞残渣に基づく偽陽性反応の除外は、本発明のスクリーニング方法及び後述する本発明の子宮頸癌の自動診断方法において有意義である。

散乱光パラメータとしては、細胞の大きさを反映するパラメータである前方散乱光強度（ＦＳＣＰ）、前方散乱光パルス幅（ＦＳＣＷ）、及び側方散乱光パルス幅（ＳＳＣＷ）からなる群より選ばれる少なくとも１種を用いることができる。また、細胞内の構造の複雑さを反映するパラメータとして、側方散乱光パルス高さ（ＳＳＣＰ）を用いることもできる。

ここで、パルス幅とは、単一の細胞がフローセル中の感知領域を流れている間の計測値について、横軸に通過時間、縦軸に散乱光（前方散乱、側方散乱）強度とする散乱光のプロファイルを作成したときのパルスが表れている部分の時間、すなわち１つの細胞の通過時間に相当する。

図４は、細胞の大きさを反映する散乱光パラメータ及び蛍光パラメータを計測し、測定用試料に含まれる細胞残渣を除外する本発明のスクリーニング方法の一実施態様を示している。

図４に示す態様では、フローセルを流れる細胞について蛍光パラメータ及び細胞の大きさを反映する散乱光パラメータを計測し、ステップ＃１で第１標識抗体に対する反応の有無を判定し、第１標識抗体について陽性と判定した細胞については第２標識抗体に対する反応の有無を判定する（ステップ＃２）。一方、第１標識抗体に対して陰性と判定した細胞については、第３標識抗体に対する反応の有無を判定し（ステップ＃３）、第３標識抗体に対して陽性と判定した細胞について、ステップ＃４で、蛍光パラメータと散乱光パラメータを二軸とする二次元分布図を作成し、このときのプロット位置から細胞残渣か否かを判定する。第３抗体に対する蛍光強度は高いが、散乱光パラメータ値が細胞サイズから離れていると判断した場合（図４中、「−」で示す）、細胞残渣と判定し、その他の場合（図４中、「＋」で示す）には、グループＩＩＩに分類される細胞であると判定する。

従って、図２のスクリーニング装置で、蛍光パラメータだけでなく、散乱光パラメータを計測する場合、解析部２０は、蛍光パラメータと散乱光パラメータを二軸とする二次元分布図を作成し、該分布図に基づいて解析する手段も備え、分布図に基づく判定結果を加味解析した結果を表示部２１に表示する。

また、散乱光パラメータとして、細胞内の構造の複雑さを反映するパラメータである側方散乱光パルス高さ（ＳＳＣＰ）を計測し、側方散乱光パルス高さ（ＳＳＣＰ）と蛍光パラメータとの二次元分布図を作成することにより、異型細胞の出現頻度を知ることができる。すなわち、ガン化が進むと細胞が小さくなって、細胞内の構造が複雑になることから、細胞の大きさに関するパラメータ（ＳＳＣＷ）に対する細胞内の複雑度に関するパラメータ（ＳＳＣＰ）が高い場合には異型細胞と考えられる。従って、上記二次元分布図で異型細胞と考えられる部分のプロット密度が高い場合には、第３抗体による蛍光パラメータに正に補正を加えることにより、後述の子宮頸癌の自動診断方法で、癌らしさを判定する際に、重み付けを行って、診断精度を高めることができる。

〔細胞の画像判断工程を含むスクリーニング方法〕
撮像手段を備えたフローサイトメータに適用する場合、必要に応じて細胞画像を作成し、細胞形態から具体的に判断してもよい。

図５は、撮像手段を備えたフローサイトメータを用いた場合のスクリーニング方法の一実施態様を示している。このフローチャートによれば、第３抗体について陽性を示す細胞が、実は細胞残渣であった場合には、ステップ＃４で除外し、細胞残渣でない場合には、その細胞について細胞画像を作成する（ステップ＃５）。

第３抗体陽性と判定される細胞は、扁平上皮癌細胞、その前癌状態にある扁平上皮系の異型細胞である。基底細胞層にある正常な扁平上皮細胞が含まれている場合、この基底細胞層の扁平上皮細胞も第３標識抗体に対して陽性を示す。しかしながら、正常な扁平上皮細胞は、扁平上皮癌細胞、扁平上皮系異型細胞と比べて、形態、核細胞質比などが異なっているので、細胞形態を観察すれば見分けることができる。ステップ＃１で陰性と判断され、ステップ＃３で陽性と判断された細胞についてのみ、細胞画像を作成するだけであるから、処理速度に対する影響は少なくて済む。

また、画像によれば、細胞の凝集の有無を知ることができる。例えば、白血球のように、扁平上皮癌とは無関係な細胞であっても、第３抗体と反応する細胞が、正常扁平上皮細胞と凝集している場合、正常扁平上皮細胞（グループＩＶ）と分類されるべきであるはずの細胞が、第３抗体に対する陽性細胞となってグループＩＩＩに分類され、扁平上皮癌と誤診される原因となる。このような場合であっても、ステップ＃５で画像を作成することにより、凝集細胞であるか否かを知ることができ、さらには凝集している細胞が白血球であるか否かを判定することができる。これにより、フローセルを通過した細胞が凝集細胞であることが判明したときには、当該凝集細胞を解析対象から除外する。これにより、正常扁平上皮細胞であるにもかかわらず、第３抗体陽性と判定されたために、グループＩＩＩに分類されることを防止でき、ひいては、細胞集団である１つの検体としての解析結果をヒストグラム等で表示した場合の誤差を低減することができる。

尚、撮像手段を備えたフローサイトメータとしては、例えば、図６に示すような構成を有する装置を用いることができる。この装置１４０では、フローセルを通過した細胞からの蛍光をＦＬ１〜ＦＬ３で検出するとともに、ＦＳＣで前方散乱光、ＳＳＣで側方散乱光を検出するとともに、カメラで細胞画像を撮像している。

さらに詳述すると、まず４８８ｎｍの発振波長を持つ青色レーザー（Ａｒイオンレーザー）がレンズ１０１を経ることにより、短径１０μｍ、長軸１００μｍ程度の扁平なビームプロファイルを持つように整えられて、フローセルに照射される。
レンズ１０１から出射された励起光が、フローセルを経てビームストッパ１０２に結像し、一次光はここで遮られる。細胞からの蛍光／散乱光は対物レンズ１０３で集められ、５３０ｎｍ以上の波長の光が通過する性質を持ったダイクロイックミラー１０４を経て、１０度前後の立体角の蛍光が検出器１０５（光電子増倍管：ＰＭＴ）に入射され、そこで前方蛍光（ＦＦＬ）が検出される。５３０ｎｍ以下の波長を持つ光は、同様に１０度前後の立体角の散乱光が検出器１０６（フォトダイオード：ＰＤ）に入射され、そこで前方散乱光（ＦＳＣ）が検出される。

一方、細胞から発せられた蛍光／散乱光は、フローセルの側方に配置された高い開口数（ＮＡ）をもつ対物レンズ１０７で集められる。対物レンズ１０７を出射した光は、まず７４０ｎｍより短い波長の光を反射する性質を持ったダイクロイックミラー１０８に通される。このミラー１０８を反射した側方蛍光／散乱光は、まず５００ｎｍ以下の波長をもつ光を反射する性質を持ったダイクロイックミラー１０９を経て、さらに中心波長４７４ｎｍ、通過波長４９ｎｍの干渉フィルタ１１０を経てＳＳＣの検出器１１１（光電子増倍管：ＰＭＴ）に入射され、そこで側方散乱光が検出される。このダイクロイックミラー１０９を通過した光は、５５０ｎｍ以下の波長を持つ光を反射する性質を持ったダイクロイックミラー１１２を経て、中心波長５３４ｎｍ、通過波長２６ｎｍの干渉フィルタ１１３を経てＦＬ１の検出器１１４（光電子増倍管：ＰＭＴ）に入射され、そこで緑蛍光が検出される。

ダイクロイックミラー１１２を通過した光は、ダイクロイックミラー１１５で６３０ｎｍ以下と６３０ｎｍ以上の光に分けられる。分けられた一方の光は、中心波長５９７ｎｍ、通過波長４９ｎｍの干渉フィルタ１１６を経てＦＬ２の検出器１１７（光電子増倍管：ＰＭＴ）に入射され、そこで橙蛍光が検出され、他方の光は、中心波長６８９ｎｍ、通過波長４６ｎｍの干渉フィルタ１１８を経て、ＦＬ３の検出器１１９（光電子増倍管：ＰＭＴ）に入射され、そこで赤蛍光が検出される。本発明においては、前方蛍光（ＦＦＬ）は必ずしも検出する必要はない。

捕捉された前方散乱光（ＦＳＣ）、前方蛍光（ＦＦＬ）、側方散乱光（ＳＳＣ）、緑蛍光（ＦＬ１）、橙蛍光（ＦＬ２）、赤蛍光（ＦＬ３）はＡ／Ｄ変換後、解析部１３０に入力される。そこでリアルタイムで信号処理され、これらの信号がある特徴を持っていれば、解析部１３０からトリガー信号を送り、７８０ｎｍの発振波長を持つ近赤外のパルスレーザ１２０を発光させる。このパルスレーザ１２０は透過照明光として働き、フローセルから出射した光は、一番目のダイクロイックミラー１０８を通過し、カメラ１２１にて結像し、撮像データが解析部１３０に送られる。このようにして任意の散乱、蛍光の特徴を持つ細胞の静止画が捕捉可能となる。

解析部１３０においては、図２に示した装置３０の解析部２０が行なった種々の所望の解析の他、更に撮像された画像を加味して判定し、結果を表示部１３１に表示する。

〔核染色を行った測定用試料を使用するスクリーニング方法〕
図７は、予め核染色を行った測定用試料を使用してフローサイトメトリーに適用した場合のスクリーニング方法の一実施態様を示している。

核染色は、測定用試料に含まれる全ての細胞の核について、蛍光染料を用いて行う。核染色に用いる蛍光染料は、第１抗体、第２抗体、第３抗体の標識に用いた蛍光とは識別可能な蛍光染料を使用し、４カラー解析とする。例えば、図２に示すように、ＦＬ１〜ＦＬ４の４種類の蛍光検出器を備えたフローサイトメーターを用いることによって、測定可能である。

図７に示すフローチャートでは、細胞残渣を除いた第３抗体陽性細胞について、ステップ＃６で、核染色由来のパラメータ、さらには散乱光パラメータを併せて解析することにより、時間がかかる細胞画像を作成しなくても、細胞凝集体の有無やフローセルを通過した細胞が癌細胞であるか否かを判定することができる。

例えば、細胞が感知領域を通過する時間と当該細胞の核染色に由来する蛍光強度を二軸とする蛍光プロファイル及び散乱光プロファイルを作成し、両者のプロファイルを比較する。２個の細胞が凝集していた場合には、核染色に由来する蛍光プロファイルは、例えば図８（ａ）に示すような発光プロファイルが得られる。一方、同じ感知領域を通過する時間に対する側方散乱光プロファイルは、図８（ｂ）のようになり、前方散乱光プロファイルでは図８（ｃ）のようになる。散乱光プロファイル図８（ｂ）又は（ｃ）では、パルスが明確に分離されていないため、単一の細胞と判断する可能性が高いが、核染色蛍光プロファイル図８（ａ）では明確に２つに分離されたパルスが表れるので、これにより、単位時間あたりに２つの細胞核が通過したこと、すなわち２個の細胞凝集体が通過したものであると判定できる。従って、細胞を撮像しなくても、散乱光プロファイルに加えて、核染色プロファイルを判定することにより、細胞凝集体を検知し、解析対象から除外することが可能となる。

尚、ステップ＃６では、フローセルを通過する細胞の散乱光プロファイルと蛍光プロファイルを比較して、単一細胞か凝集細胞であるかを判定してもよいし、予め単一の細胞がフローセルを通過する時間と当該細胞の核染色に由来する蛍光強度の基本的蛍光プロファイルをデータベースファイルとして保存しておき、計測により得られる核蛍光プロファイルと基本プロファイルのデータとを比較し、パターンが異なる場合に細胞凝集であると判断するようにしてもよい。

また、核染色由来の蛍光プロファイルから細胞核のサイズ（Ｎ）を求め、該当細胞の側方散乱光パルス幅（ＳＳＣＷ）から細胞質のサイズ（Ｃ）を求め、細胞質に対する細胞核の比率（Ｎ／Ｃ）を求める。具体的には、図９（ａ）に示すＳＳＣプロファイルにおいて、表れるパルスの幅Ｃが細胞質サイズＣとなり、図９（ｂ）に示す細胞核蛍光プロファイルにおける蛍光プロファイルの半値幅等が核サイズＮとなる。癌細胞は、Ｎ／Ｃが大きいことから、算出したＮ／Ｃが所定値以上の場合には、癌細胞らしさが高いと判断することができる。

このように、核染色由来の蛍光プロファイル、さらには散乱光プロファイルを解析することにより、細胞画像を作成しなくても、細胞凝集体を見つけ出して偽陽性と判定された正常扁平上皮細胞がグループＩＩＩに分類されることを防止したり、あるいは第３抗体に対して陽性の細胞（グループＩＩＩ）から、正常な扁平上皮細胞である基底細胞層扁平上皮細胞と扁平上皮癌細胞とを分別することができるので、扁平上皮系異型細胞のスクリーニング精度をさらに高めることが可能となる。

〔子宮頸癌細胞の自動診断方法〕
本発明の子宮頸癌細胞の自動診断方法は、上記本発明の子宮頸癌のスクリーニング方法に従って、腺癌細胞及び／又は扁平上皮系異型細胞の有無を自動的に判定するとともに、腺癌細胞及び／又は扁平上皮系異型細胞と判定された細胞の、測定用試料に含まれる細胞集合体に対する含有割合が所定値以上の場合には、腺癌又は扁平上皮癌であると判断する方法である。

スクリーニング方法としてフローサイトメトリーを適用した場合、１つの検体についての解析結果として蛍光パラメータに対する細胞数のヒストグラムや、図３に示すような各抗体に対する蛍光パラメータの三次元座標に、測定用試料に含まれる全ての細胞についてプロットした散布図、あるいは各抗体の蛍光パラメータと散乱光パラメータの二次元座標に、測定用試料に含まれる全ての細胞についてプロットした散布図を作成して、個々の細胞に該当するドットの分散状態から診断することができる。

例えば、グループＩ、グループＩＩＩに相当する部分のプロット密度が所定割合を超えるときには、子宮頸癌であると診断することができる。

自動診断の判定においては、例えば、散乱光パラメータとして、側方散乱光パルス高さ（ＳＳＣＰ）を計測し、蛍光パラメータとの二次元分布図を作成することにより、あるエリアを区切り、エリアごとの異型細胞の出願頻度を調べ、異型細胞が多く出現する場合には、判定基準とする割合を補正してもよい。

〔扁平上皮系異型細胞のスクリーニング方法〕
本発明は、腺癌細胞及び／又は扁平上皮系異型細胞の有無を判別するだけでなく、腺癌上皮系異型細胞の有無を判別するスクリーニング方法にも適用できる。

すなわち、互いに識別可能な標識で標識された腺系細胞と反応する抗腺系細胞標識抗体及び子宮頸部扁平上皮系異型細胞と反応する抗扁平上皮系異型細胞標識抗体と、子宮頸部細胞とを反応させて測定用試料を調製し、前記子宮頸部細胞に結合した前記各標識抗体由来の標識をそれぞれ検出し、検出された標識に基づいて、扁平上皮系異型細胞の有無を判別する子宮頸癌のスクリーニング方法である。

腺系細胞と反応する標識抗体の抗体は、ＭＵＣ１抗体、サイトケラチン７抗体、及びサイトケラチン１８抗体からなる群より選ばれる少なくとも１種であることが好ましく、子宮頸部扁平上皮系異型細胞と反応する標識抗体の抗体が、ＮＭＰ１７９抗体、ｐ１６^{ＩＮＫ４Ａ}抗体、Ｋｉ−６７抗体、ｐ５３抗体、ｐ２１抗体、ＥＭＡ抗体、ＣＥＡ抗体及びＭＩＢ−1抗体からなる群より選ばれる少なくとも１種であることが好ましい。つまり、扁平上皮系異型細胞の有無を判別するスクリーニング方法に使用する診断試薬は、上記子宮頸癌のスクリーニング方法で使用した第１標識抗体及び／又は第２標識抗体と、第３標識抗体との混合物であり、上記子宮頸癌のスクリーニング方法で用いられる診断試薬と同一の試薬を用いることもできるし、子宮頸癌診断試薬から第１標識抗体又は第２標識抗体を除いたものを使用してもよい。

判別は、腺系細胞と反応する抗腺系細胞標識抗体に対して陰性で、且つ子宮頸部扁平上皮系異型細胞と反応する抗扁平上皮系異型細胞標識抗体に対して陽性であれば、扁平上皮系異型細胞が存在すると判断することになるが、細胞残渣や、僅かではあるが検体に混入する正常な細胞基底層の扁平上皮系異型細胞と扁平上皮系異型細胞とを区別するために、図４のステップ＃４で行ったような細胞の大きさを反映する散乱光パラメータと蛍光標識パラメータの二次元分布図を作成したり、図５の態様のステップ＃５で行ったような細胞画像を作成したり、図７の態様で行ったシグナル解析を行えばよい。

〔診断試薬の調製〕
（１）第１標識抗体含有試薬
第１標識抗体としてサイトケラチン７抗体を使用し、以下のようにして標識して、第１標識抗体含有試薬を調製した。
サイトケラチン７抗体が１μｇ／ｍｌとなるように１％ヤギ血清を含むＰＢＳで希釈した一次抗体液に、標識となる二次抗体（Ａｌｅｘａ４８８（緑色蛍光色素）を結合したマウスＩｇＧ Ｆ(ａｂ)_２）２μｇ／ｍｌを添加混合し、５分間反応させた。次にマウスＩｇＧの終濃度が１０μｇ／ｍｌとなるように添加し、５分間攪拌して、過剰な二次抗体を吸収した。尚、二次抗体の希釈液としては、１％ヤギ血清を含むＰＢＳを用いた。

（２）第２標識抗体含有試薬
第２標識抗体としてサイトケラチン８抗体を使用し、以下のようにして標識して、第２標識抗体含有試薬を調製した。
サイトケラチン８抗体が１μｇ／ｍｌとなるように１％ヤギ血清を含むＰＢＳで希釈した一次抗体液に、標識となる二次抗体（Ｒ−ＰＥ（オレンジ蛍光色素）を結合したマウスＩｇＧ Ｆ(ａｂ)_２）２μｇ／ｍｌを添加混合し、５分間反応させた。次にマウスＩｇＧの終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるように添加し、５分間攪拌して、過剰な二次抗体を吸収した。尚、二次抗体の希釈液としては、１％ヤギ血清を含むＰＢＳを用いた。

（３）第３標識抗体含有試薬
第３標識抗体としてＮＭＰ１７９抗体を使用し、以下のようにして標識して、第３標識抗体含有試薬を調製した。

ＮＭＰ１７９抗体が７．４μｇ／ｍｌとなるように１％ヤギ血清を含むＰＢＳで希釈した一次抗体液に、標識となる二次抗体（Ａｌｅｘａ４８８（緑色蛍光色素）を結合したマウスＩｇＧ Ｆ(ａｂ)_２）１０μｇ／ｍｌを添加混合し、５分間反応させた。次にマウスＩｇＧの終濃度が２５０μｇ／ｍｌとなるように添加し、５分間攪拌して、過剰な二次抗体を吸収した。尚、二次抗体の希釈液としては、１％ヤギ血清を含むＰＢＳを用いた。

〔使用した細胞〕
腺癌細胞のサンプルとして、子宮頸部腺癌の培養細胞であるＨｅＬａ細胞を用いた。扁平上皮癌細胞のサンプルとして、子宮頸部扁平上皮癌の培養細胞であるＣ３３Ａ細胞を用いた。正常腺細胞及び正常扁平上皮細胞として、それぞれ腺細胞が多い正常な臨床検体１（以下、単に「正常腺細胞」という）及び扁平上皮細胞が多い正常な臨床検体２（以下、単に「正常扁平上皮細胞」という）を用いた。

〔細胞の反応性〕
実施例１
４本のチューブを準備し、各チューブにそれぞれＨｅＬａ細胞、Ｃ３３Ａ細胞、臨床献体１、２を、約１×１０^６個づついれた。Ｃｙｔｙｃ社のＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ液で細胞を固定した後、１００００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を除去した。次に、５％Ｎ−アセチル−Ｌ−システインを添加し、攪拌した後、１００００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を除去した。細胞をＰＢＳで洗浄した後、１００００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を除去した。１％ヤギ血清を含むＰＢＳ又はＰＢＳ−Ｔ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）１ｍｌを添加し、攪拌後、１０分間ブロッキング反応を行った。

ブロッキング後、１００００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を除去した。上記で調製した第１標識抗体含有試薬を添加し、３０分間室温で攪拌反応させた。
抗体反応後、１００００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を除去し、ペレットをＰＢＳ又はＰＢＳ−Ｔでピぺッティングすることにより、洗浄した。その後、１００００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を除去し、再度ＰＢＳ又はＰＢＳ−Ｔ１ｍｌで洗浄した後、１００００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を除去した。ＰＢＳで懸濁した後、蛍光顕微鏡で観察するとともに、フローサイトメータＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＦＳＣ；Ｅ００ １．００，ＳＳＣ３０４ｖ ＦＬ１；３４０ｖ ＦＬ２；２８２ｖ）で測定し、各蛍光標識に対する細胞数をカウントしてヒストグラムを作成した。

ＨｅＬａ細胞、Ｃ３３Ａ細胞、正常腺細胞、正常扁平上皮細胞との反応結果を示す各顕微鏡写真を図１０に示す。また、各細胞についての、蛍光標識Ａｌｅｘａ４８８に由来する緑色蛍光強度と細胞数との関係を示したヒストグラムを図１１〜図１４に示す。

第１標識抗体含有試薬に代えて、第２標識抗体含有試薬、第３標識抗体含有試薬を用いて、同様の操作を行った。但し、第３標識抗体含有試薬については、Ｃ３３Ａ細胞及び正常扁平上皮細胞についてだけ行った。

第２標識抗体含有試薬との反応結果を示す各細胞の顕微鏡写真を図１５に、Ｒ−ＰＥに由来するオレンジ色の蛍光強度と細胞数との関係を示したヒストグラムを図１６〜図１９に示す。また、第３標識抗体含有試薬との反応結果を示すＣ３３Ａ細胞及び正常扁平上皮細胞の顕微鏡写真を、それぞれ図２０に、蛍光標識Ａｌｅｘａ４８８に由来する緑色蛍光強度と細胞数との関係を示したヒストグラムを図２１に示す。図２１中、（ａ）は正常扁平上皮細胞、（ｂ）は扁平上皮癌細胞のヒストグラムである。

〔細胞の染色結果〕
図１０〜２１から、いずれについても顕微鏡写真で蛍光が観察されるものについては、ヒストグラムで１０^２程度の強度でピークが認められ、相関関係があることが確認できた。そして、図１０〜１４から、第１標識抗体含有試薬を用いた場合、ＨｅＬａ細胞及び正常腺細胞と反応を示し、Ｃ３３Ａ及び正常扁平上皮細胞と反応しなかったことが確認できた。

また、図１５〜１９から、第２標識抗体含有試薬を用いた場合、ＨｅＬａ細胞との反応は陽性であったが、正常腺細胞、正常扁平上皮細胞、Ｃ３３Ａ細胞との反応は陰性であることが確認できた。

さらに、図２０，２１から、第３標識抗体含有試薬を用いた場合、Ｃ３３Ａ細胞との反応は陽性であるが、正常扁平上皮細胞との反応は陰性であることが確認できた。
従って、第１標識抗体、第２標識抗体、第３標識抗体との各反応性を判定することにより、腺癌細胞及び／又は扁平上皮癌細胞をスクリーニングできることがわかる。

〔核染色による扁平上皮系癌細胞の判別〕
実施例２
チューブに、口腔粘膜の上皮細胞を約１×１０^６個入れ、ＲＮＡによる非特異染色を防止するために、ＰＢＳで希釈したリボヌクレアーゼＡ（シグマ社＃Ｒ−４６１２）３００μｇ／ｍｌを１００μｌ添加した。５分間室温で攪拌した後、１００００ｒｐｍで１分間遠心分離して上清を取り除いた。次いで、核染色用溶液として、ＰＩ（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ）１０μＭを５００μｌを添加し、３０分間室温で攪拌した。１００００ｒｐｍで１分間遠心分離して、上清を除去した後、０．０５％ＰＢＳＴを５００μｌ添加し、１００００ｒｐｍで１分間遠心分離した。適当量のＰＢＳで溶液置換をした後、図６に示す構成を有するフローサイトメータにかけた。

４８８ｎｍのアルゴンイオンレーザーで励起し、核染色に由来するオレンジ色の蛍光プロファイル、及び側方散乱光プロファイルを記録するとともに、フローセルを通過する細胞画像を作成した。核染色プロファイル及び側方散乱光プロファイルを図２２に示す。

図２２において、実線は核染色由来の蛍光プロファイルであり、破線は散乱光プロファイルである。側方散乱光プロファイルから求められる細胞の大きさ（Ｃ）は細胞画像から計測された細胞の大きさとほぼ一致していた。また、細胞画像から求められる核の位置は、図２２に示すプロファイルの核パルスの位置と相関関係があることが確認でき、さらに、細胞核の大きさ（Ｎ）は核蛍光パルス（半値幅）と対応していることが確認できた。

扁平上皮癌細胞及び扁平上皮系正常細胞を混合した試料を調製し、フローサイトメータにかけた。フローセルを通過した個々の細胞について、図２２に相当するプロファイルを作成し、これから求められる細胞の大きさ（Ｃ）及び細胞核の大きさ（Ｎ）からＮ／Ｃを算出した。測定用試料（細胞集団）について算出したＮ、Ｃ、及びＮ／ＣをそれぞれＸ軸、Ｙ軸、Ｚ軸とする３次元座標にドットプロットしたところ、図２３のようになった。図２３中、扁平上皮細胞癌細胞は黒丸「●」でプロットされ、正常扁平上皮細胞は白丸「○」でプロットされている。扁平上皮細胞癌細胞は一般に高いＮ／Ｃを示すことから、図２３に示す３次元座標では、扁平上皮細胞癌細胞と正常扁平上皮細胞のプロット位置が分別されていることがわかる。従って、細胞画像による判断を行わなくても、図７に示すフローチャートに従って、核染色プロファイル及び側方散乱光プロファイルから細胞の大きさと細胞核の大きさの比（Ｎ／Ｃ）を算出し、この値が一定値以上の場合には癌細胞であるとの判定を行うことにより、扁平上皮癌細胞のスクリーニング精度をより高めることができる。

〔モデル検体を用いたスクリーニング方法の検証〕
実施例３
子宮頸部正常扁平上皮細胞の代用として口腔粘膜上皮細胞、子宮頸部腺癌細胞としてＨｅＬａ細胞、子宮頸部扁平上皮癌細胞としてＣ３３Ａ細胞を用いた、下記（Ａ）〜（Ｃ）のモデル検体を用いて、本発明の子宮頸癌のスクリーニング方法を検証した。

（Ａ）正常検体のモデル検体
保存液ＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ（Ｃｙｔｙｃ； Ｃａｔ＃０２３４００４）中に約２×１０^５細胞／ｔｕｂｅの口腔粘膜上皮細胞を保存したものである。
（Ｂ）子宮頸部腺癌細胞を含む検体のモデル検体
ＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ中に約２×１０^５細胞／ｔｕｂｅのＨｅＬａ細胞を保存したものと、（Ａ）のモデル検体とを、約１×１０^５細胞ずつ混合し、総細胞数約２×１０^５細胞／ｔｕｂｅに調製したものである。
（Ｃ）子宮頸部扁平上皮癌細胞を含む検体のモデル検体
ＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ中に約２×１０^５細胞／ｔｕｂｅのＣ３３Ａ細胞を保存したものと、（Ａ）のモデル検体とを、約１×１０^５細胞ずつ混合し、総細胞数約２×１０^５細胞／ｔｕｂｅに調製したものである。

（１）測定用試料の調製
（１−１：粘液除去処理）
（Ａ）〜（Ｃ）の各モデル検体を、１．５ｍｌの遠心チューブに入れ、１０，０００ｒｐｍで１分間遠心し、上清を除去した。次に、ＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０入りＰＢＳ）で一回洗浄した後、再び１０，０００ｒｐｍで１分間遠心し、上清を除去して、各検体に含まれる細胞ペレットを調製した。

細胞ペレットの入ったチューブにＰＢＳ４００μｌを添加した後、粘液除去液として、１０％Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（シグマ社のＣａｔ＃Ａ７２５０）ＰＢＳ溶液を４００μｌ添加し、軽くＶｏｌｔｅｘミキサーにて撹拌後、さらにＰＢＳＴ４００μｌを添加した。次に、１０，０００ｒｐｍで１分間遠心し、上清を除去した。ペレットをＰＢＳＴ６００μｌで洗浄、１０，０００ｒｐｍで１分間遠心後、上清を除去した。再度ＰＢＳＴ６００μｌで洗浄、１０，０００ｒｐｍで１分間遠心後、上清を除去して、粘液除去されたペレットを得た。

（１−２：細胞分散処理）
上記の粘液除去されたペレットの入ったチューブにＺａｍｂｏｎｉ固定溶液［０．２１％２，４，６−トリニトロフェノール（ＷＡＫＯのＣａｔ＃２０５−０８６７２）、２％パラホルムアルデヒド（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅのＣａｔ＃ＥＭＳ−８０）］を４００μｌ添加した。軽くＶｏｌｔｅｘミキサーにて撹拌し、ローテーターで１０分間反応させた後、ＰＢＳＴ４００μｌ添加し、１０，０００ｒｐｍで１分間遠心後、上清を除去した。次いで、ＰＢＳＴ６００μｌで洗浄、１０，０００ｒｐｍで１分間遠心後、上清を除去した。再度、ＰＢＳＴ６００μｌで洗浄、１０，０００ｒｐｍで１分間遠心後、上清を除去した。洗浄したペレットにＰＢＳ３００μｌを添加して、３７℃で約５分間プレインキュベートした後、酵素反応液３００μｌ（２５％コラゲナーゼ タイプＩ（ＷａｒｔｈｉｎｇｔｏｎのＣａｔ＃４１９６）２．４μｌ（終濃度 ０．２％）、２５％コラゲナーゼ タイプＩＩ（ＷａｒｔｈｉｎｇｔｏｎのＣａｔ＃４１７６）２．４μｌ（終濃度 ０．２％）、１２．５％プロテアーゼ（シグマ社のＣａｔ＃Ｐ−５０２７）２．４μｌ（終濃度 ０．１％）、及びＰＢＳ２９２．８μｌ）を添加し、３７℃で反応させた。２．５分間後、反応停止液として、氷上で冷やした１％ＰＩ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｔｏｐ ｂｕｆｆｅｒ（プロテアーゼインヒビター（シグマ社のＣａｔ＃Ｐ８３４０）１０μｌと、ＰＢＳ１ｍｌとの混合液）６００μｌを添加し、１０，０００ｒｐｍで１分間遠心後、上清を除去した。ペレットをＰＢＳＴ６００μｌで洗浄、１０，０００ｒｐｍで１分間遠心後、上清を除去した。

さらに、ＰＢＳＴ３００μｌ添加して懸濁し、直径１００μｍのフィルターを通すことにより細胞凝集物を除去した。ＰＢＳＴ３００μｌでフィルターを洗浄し、洗浄液は回収した。得られた濾液を、１０，０００ｒｐｍで１分間遠心後、上清を除去し、測定用試料となる細胞群を得た。

（１−３：診断試薬（抗体含有試薬）の調製）
第１標識抗体としてサイトケラチン７抗体を使用し、以下のようにして標識して第１標識抗体含有試薬を調製した。
すなわちＰＢＳＴで希釈したＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ ７（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ社のＣａｔ＃Ｍ７０１８）（終濃度２．６ｕｇ／ｍｌ）と、Ａｌｅｘａ６４７−ＲＰＥが結合したヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社のＣａｔ＃Ａ２０９９０）（終濃度７．８ｕｇ／ｍｌ）とを混合し、遮光して５分間ローテーターにて回転させながら反応させた後、マウスＩｇＧを終濃度が１２８．８μｇ／ｍｌとなるように添加し、５分間攪拌して、第１標識抗体含有試薬を得た。

第２標識抗体としてサイトケラチン８抗体を使用し、以下のようにして標識して第２標識抗体含有試薬を調製した。
すなわち、ＰＢＳＴで希釈したＡｎｔｉ−Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ（ＣＡＭ５．２）（ＢＥＣＴＯＮ ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ社のＣａｔ＃３４９２０５）（終濃度２．５μｇ／ｍｌ）と、Ｒ−ＰＥ（オレンジ蛍光色素）が結合したＦ（ａｂ’）_２ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ社のＣａｔ＃Ｒ０４８０）（終濃度６．２５μｇ／ｍｌ）とを混合し、遮光して５分間ローテーターにて回転させながら反応させた後、マウスＩｇＧを終濃度が１５１．２μｇ／ｍｌとなるように添加し、５分間攪拌して、第２標識抗体含有試薬を調製した。

第３標識抗体としてＮＭＰ１７９抗体を使用し、以下のようにして標識して第３標識抗体含有試薬を調製した。
すなわち、ＰＢＳＴで希釈したＮＭＰ１７９抗体（終濃度４．８９μｇ／ｍｌ）と、Ａｌｅｘａ４８８（緑色蛍光色素）を結合したヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）_２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社のＣａｔ＃Ａ１１０１７）（終濃度１０μｇ／ｍｌ）とを混合し、遮光して５分間ローテーターにて回転させながら反応させた後、マウスＩｇＧを終濃度が２４６．４μｇ／ｍｌとなるように添加し、５分間攪拌して、第３標識抗体含有液を調製した。

上記で調製した第１標識抗体含有液、第２標識抗体含有液及び第３標識抗体含有液を、等量づつ混合して、抗体含有試薬を調製した。

（２）抗体反応
（１−２）で調製した細胞群が入ったチューブに、１％ヤギ血清（Ｃｅｄａｒｌａｎｅｌａｂｓ Ｃａｔ＃ＣＬ１２００）を含有するＰＢＳＴ溶液６００μｌを添加し、１０分間攪拌して、ブロッキング反応を行なった。１０，０００ｒｐｍで１分間遠心後、上清を除去した。このペレットに、（１−３）で調製した抗体含有試薬２００μｌを添加し、遮光して３０分間攪拌して、抗体反応をさせた。反応後、１０，０００ｒｐｍで１分間遠心後、上清を除去し、次いでＰＢＳＴ６００μｌで洗浄し、１０，０００ｒｐｍで１分間遠心後、上清を除去した。再度、ＰＢＳＴ６００μｌで洗浄し、１０，０００ｒｐｍで１分間遠心後、上清を除去した。

（３）フローサイトメータによる測定
抗体反応後の細胞群が入ったチューブにＲＥＴ−ＳＨＥＡＴＨ（シスメックス社のＣａｔ＃ＲＳＥ−９００Ａ）２００μｌを添加して細胞を懸濁し、図６に示したような光学系を有する撮像機能つきフローサイトメータで前方散乱光及び蛍光を測定した。

（４）スクリーニング方法の検証
（Ｂ）子宮頸部腺癌細胞を含む検体のモデル検体の測定結果を図２４〜２６に示す。図２４は第１標識抗体由来の標識を検出した測定結果であり、図２５は第２標識抗体由来の標識を検出した測定結果であり、図２６は第３標識抗体由来の標識を検出した測定結果である。図２４〜２６中、縦軸は前方散乱光パルス幅、横軸は各標識に対応する蛍光強度を示す。また、点線で囲んだ領域内は、癌あるいは異型細胞の候補領域（以下、「異型細胞候補領域」と称す）を示す。図２４〜図２６の異型細胞候補領域内に細胞集団が認められ、このモデル検体が、表１のグループＩに属する細胞を含むことが確認できた。

（Ｃ）子宮頸部扁平上皮癌細胞を含む検体のモデル検体の測定結果を図２７〜２９に示す。図２７は第１標識抗体由来の標識を検出した測定結果であり、図２８は第２標識抗体由来の標識を検出した測定結果であり、図２９は第３標識抗体由来の標識を検出した測定結果である。図２７〜２９中、縦軸は前方散乱光パルス幅、横軸は各標識に対応する蛍光強度を示す。また、点線で囲んだ領域内は、異型細胞候補領域である。図２７及び図２８の異型細胞候補領域内に細胞集団は認められないが、図２９の異型細胞領域内に細胞集団が認められ、このモデル検体が、表１のグループＩＩＩに属する細胞を含むことが確認できた。

（Ａ）正常検体のモデル検体の測定結果を図３０〜３２に示す。図３０は第１標識抗体由来の標識を検出した測定結果であり、図３１は第２標識抗体由来の標識を検出した測定結果であり、図３２は第３標識抗体由来の標識を検出した測定結果である。図３０〜３２中、縦軸は前方散乱光パルス幅、横軸は各標識に対応する蛍光強度を示す。また、点線で囲んだ領域内は、異型細胞候補領域である。図３０〜３２の異型細胞候補領域内に細胞集団は認められず、いずれも異型細胞候補領域外のみに細胞集団が認められた。従って、このモデル検体が、表１のグループＩＶに属する細胞を含むことが確認できた。

以上から、本発明のスクリーニング方法によれば、子宮頸部腺癌細胞あるいは子宮扁平上皮癌細胞の有無を、フローサイトメータで自動的に判別できることがわかる。

本発明の子宮頸癌のスクリーニング方法は、高精度且つ高効率で、子宮腺癌及び／扁平上皮癌の有無をスクリーニングすることができるので、大量の検体を処理しなければならない健康診断等で行われる子宮頸癌の細胞診断に有用である。さらに、本発明の子宮頸癌のスクリーニング方法では、子宮腺癌と扁平上皮癌を区別してスクリーニングすることができるので、子宮頸癌の種類の判断が必要な診断に有効に利用できる。

本発明のスクリーニング方法の一実施態様を説明するためのフロー図である。 本発明のスクリーニング方法を適用することができるフローサイトメータの一例の構成を示すブロック図である。 本発明のスクリーニング方法の原理となる蛍光パラメータ分布を説明するための図である。 本発明のスクリーニング方法の他の実施態様を説明するためのフロー図である。 本発明のスクリーニング方法において細胞画像を撮像する場合の実施態様を説明するためのフロー図である。 撮像手段を備えたフローサイトメータの構成の一例を示すブロック図である。 本発明のスクリーニング方法において核染色する場合の実施態様を説明するためのフロー図である。 本発明のスクリーニング方法において、散乱光パラメータを計測する場合の応用例を説明するための蛍光プロファイル（ａ）、側方散乱光プロファイル（ｂ）及び前方散乱光プロファイル（ｃ）である。 本発明のスクリーニング方法において、核染色した場合の応用例を説明するための側方散乱光プロファイル（ａ）及び蛍光プロファイル（ｂ）である。 第１標識抗体含有試薬とＨｅＬａ細胞、Ｃ３３Ａ細胞、又は臨床検体１、２との反応結果を示す蛍光顕微鏡写真である（４００倍）。 ＨｅＬａ細胞と第１標識抗体含有試薬をフローサイトメータに適用した場合に得られるヒストグラムである。 Ｃ３３Ａ細胞と第１標識抗体含有試薬をフローサイトメータに適用した場合に得られるヒストグラムである。 正常腺細胞と第１標識抗体含有試薬をフローサイトメータに適用した場合に得られるヒストグラムである。 正常扁平上皮細胞と第１標識抗体含有試薬をフローサイトメータに適用した場合に得られるヒストグラムである。 第２標識抗体含有試薬とＨｅＬａ細胞、Ｃ３３Ａ細胞、又は臨床検体１、２との反応結果を示す蛍光顕微鏡写真である（４００倍）。 ＨｅＬａ細胞と第２標識抗体含有試薬をフローサイトメータに適用した場合に得られるヒストグラムである。 Ｃ３３Ａ細胞と第２標識抗体含有試薬をフローサイトメータに適用した場合に得られるヒストグラムである。 正常腺細胞と第２標識抗体含有試薬をフローサイトメータに適用した場合に得られるヒストグラムである。 正常扁平上皮細胞と第２標識抗体含有試薬をフローサイトメータに適用した場合に得られるヒストグラムである。 第３標識抗体含有試薬とＣ３３Ａ細胞又は正常線細胞との反応結果を示す蛍光顕微鏡写真である（４００倍）。 （ａ）正常腺細胞、（ｂ）Ｃ３３Ａ細胞と第３標識抗体含有試薬をフローサイトメータに適用した場合に得られるヒストグラムである。 実施例２の態様で得られた核染色蛍光プロファイル及び側方散乱光プロファイルの合成プロファイルである。 実施例２の態様で得られるＮ／Ｃの分布状態を示す散布図である。 （Ｂ）のモデル検体における第１標識抗体由来の標識を検出した測定結果である。 （Ｂ）のモデル検体における第２標識抗体由来の標識を検出した測定結果である。 （Ｂ）のモデル検体における第３標識抗体由来の標識を検出した測定結果である。 （Ｃ）のモデル検体における第１標識抗体由来の標識を検出した測定結果である。 （Ｃ）のモデル検体における第２標識抗体由来の標識を検出した測定結果である。 （Ｃ）のモデル検体における第３標識抗体由来の標識を検出した測定結果である。 （Ａ）のモデル検体における第１標識抗体由来の標識を検出した測定結果である。 （Ａ）のモデル検体における第２標識抗体由来の標識を検出した測定結果である。 （Ａ）のモデル検体における第３標識抗体由来の標識を検出した測定結果である。

Claims (26)

1. 互いに識別可能な標識物質で標識された、腺系細胞と反応する第１標識抗体、腺癌細胞と反応する第２標識抗体、及び子宮頸部扁平上皮系異型細胞と反応する第３標識抗体と、子宮頸部細胞とを反応させて測定用試料を調製し、
   前記子宮頸部細胞に結合した前記各標識抗体由来の標識をそれぞれ検出し、
   検出された標識に基づいて、腺癌細胞及び／又は扁平上皮系異型細胞の有無を判別する子宮頸癌のスクリーニング方法。
2. 前記標識の少なくとも１つが蛍光標識である請求項１に記載の子宮頸癌のスクリーニング方法。
3. 前記判別は、
   前記測定用試料中の細胞について、第１標識抗体の第１標識を検出する手段により、当該細胞の第１標識抗体に対する反応の陽性又は陰性を判定し、
   前記第１蛍光標識抗体に対して陽性と判定した細胞について、第２標識抗体の第２標識を検出する手段により、前記測定用試料中の細胞の第２標識抗体に対する反応の陽性又は陰性を判定し、
   前記第１標識抗体に対して陰性と判定した細胞について、第３標識抗体の第３標識を検出する手段により、当該測定用試料中の細胞の第３標識抗体に対する反応の陽性又は陰性を判定することにより行われる請求項１又は２に記載の子宮頸癌のスクリーニング方法。
4. 互いに識別可能な蛍光で標識された、腺系細胞と反応する第１蛍光標識抗体、腺癌細胞と反応する第２蛍光標識抗体、及び子宮頸部扁平上皮系異型細胞と反応する第３蛍光標識抗体と、子宮頸部細胞とを反応させて調製された測定用試料に励起光を照射し、前記測定用試料から発せられた蛍光を検出し、
   検出された蛍光に基づいて、腺癌細胞及び／又は扁平上皮系異型細胞の有無を判別する子宮頸癌のスクリーニング方法。
5. 前記第１標識抗体の抗体は、ＭＵＣ１抗体、サイトケラチン７抗体、及びサイトケラチン１８抗体からなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項１〜４のいずれかに記載の子宮頸癌のスクリーニング方法。
6. 前記第２標識抗体の抗体は、サイトケラチン８抗体及びＨＩＫ１０８３抗体からなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項１〜５のいずれかに記載の子宮頸癌のスクリーニング方法。
7. 前記第３標識抗体の抗体は、ＮＭＰ１７９抗体、ｐ１６^{ＩＮＫ４Ａ}抗体、Ｋｉ−６７抗体、ｐ５３抗体、ｐ２１抗体、ＥＭＡ抗体、ＣＥＡ抗体及びＭＩＢ−１抗体からなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項１〜６のいずれかに記載の子宮頸癌のスクリーニング方法。
8. 前記判別は、
   前記測定用試料中の細胞から発せられた蛍光について、第１蛍光標識由来の蛍光強度を測定することにより、該細胞の第１蛍光標識抗体に対する反応の陽性又は陰性を判定し、
   前記第１蛍光標識抗体に対して陽性と判定した細胞から発せられた蛍光について、第２蛍光標識由来の蛍光強度を測定することにより、該細胞の第２蛍光標識抗体に対する反応の陽性又は陰性を判定し、
   前記第１蛍光標識抗体に対して陰性と判定した該細胞から発せられた蛍光について、第３蛍光標識由来の蛍光強度を測定することにより、該細胞の第３蛍光標識抗体に対する反応の陽性又は陰性を判定することにより行われる請求項４〜７のいずれかに記載の子宮頸癌のスクリーニング方法。
9. 前記判別は、
   前記測定用試料をフローサイトメータのフローセルに流し、フローセルを流れる前記測定用試料中の細胞に励起光を照射し、前記細胞から発せられた蛍光について、第１蛍光標識由来の蛍光パラメータ、第２蛍光標識由来の蛍光パラメータ、及び第３蛍光標識由来の蛍光パラメータをそれぞれ計測し、各蛍光パラメータ値の組合わせによって行われる請求項４〜７のいずれかに記載の子宮頸癌のスクリーニング方法。
10. 前記蛍光パラメータは、蛍光強度、蛍光パルス幅及び蛍光パルス面積からなる群より選択される請求項９に記載の子宮頸癌のスクリーニング方法。
11. さらに前記測定用試料中の細胞についての散乱光パラメータを計測して、腺癌細胞及び／又は扁平上皮系異型細胞の有無を判別する請求項９又は１０に記載の子宮頸癌のスクリーニング方法。
12. 前記散乱光パラメータが、前方散乱光強度、前方散乱光パルス幅及び側方散乱光パルス幅からなる群より選ばれる請求項１１に記載の子宮頸癌のスクリーニング方法。
13. 第１蛍光標識由来の蛍光パラメータ、第２蛍光標識由来の蛍光パラメータ、及び第３蛍光標識由来の蛍光パラメータからなる群より選ばれる１種の蛍光パラメータと、前記散乱光パラメータとを二軸とする二次元分布図を作成して、腺癌細胞及び／又は扁平上皮系異常細胞の有無を判別する請求項１１又は１２に記載の子宮頸癌のスクリーニング方法。
14. 前記測定用試料中の子宮頸部細胞が、さらに予め核染色可能な蛍光色素で染色されており、
    子宮頸部細胞の核染色由来の蛍光プロファイルと、該子宮頸部細胞から発光される核染色由来以外の発光プロファイル及び前方散乱光プロファイル及び側方散乱光プロファイルとの比較から、腺癌細胞及び／又は扁平上皮系異型細胞の有無を判別する請求項９〜１３のいずれかに記載の子宮頸癌のスクリーニング方法。
15. 前記フローサイトメータが撮像手段を備え、第３蛍光標識抗体に対する反応が陽性と判定された細胞について、細胞画像を撮像する請求項９〜１４に記載の子宮頸癌のスクリーニング方法。
16. 前記子宮頸部細胞は、単細胞に分散された細胞の集合体である請求項１〜１５のいずれかに記載の子宮頸癌のスクリーニング方法。
17. 前記子宮頸部細胞は、塗抹標本上の細胞である請求項１〜８のいずれかに記載の子宮頸癌のスクリーニング方法。
18. 互いに識別可能な蛍光で標識された、腺系細胞と反応する第１蛍光標識抗体、腺癌細胞と反応する第２蛍光標識抗体、及び子宮頸部扁平上皮系異型細胞と反応する第３蛍光標識抗体を含む子宮頸癌診断試薬。
19. 前記第１標識抗体の抗体は、ＭＵＣ１抗体、サイトケラチン７抗体、及びサイトケラチン１８抗体からなる群より選ばれる少なくとも１種であり、
    前記第２標識抗体の抗体は、サイトケラチン８抗体及びＨＩＫ１０８３抗体からなる群より選ばれる少なくとも１種であり、
    前記第３標識抗体の抗体は、ＮＭＰ１７９抗体、ｐ１６^{ＩＮＫ４Ａ}抗体、Ｋｉ−６７抗体、ｐ５３抗体、ｐ２１抗体、ＥＭＡ抗体、ＣＥＡ抗体及びＭＩＢ−1抗体からなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項１８に記載の診断薬。
20. 請求項１〜１７に記載のスクリーニング方法において、
    腺癌細胞及び／又は扁平上皮系異型細胞の有無を自動的に判定するとともに、
    腺癌細胞及び／又は扁平上皮系異型細胞と判定された細胞の、測定用試料に含まれる細胞集合体に対する含有割合が所定値以上の場合には、腺癌又は扁平上皮癌であると判断する子宮頸癌の自動診断方法。
21. 互いに識別可能な標識で標識された、腺系細胞と反応する抗腺系細胞標識抗体及び子宮頸部扁平上皮系異型細胞と反応する抗扁平上皮系異型細胞抗体と、子宮頸部細胞とを反応させて測定用試料を調製し、
    前記子宮頸部細胞に結合した前記各標識抗体由来の標識をそれぞれ検出し、
    検出された標識に基づいて、扁平上皮系異型細胞の有無を判別する子宮頸癌のスクリーニング方法。
22. 腺系細胞と反応する標識抗体の抗体が、ＭＵＣ１抗体、サイトケラチン７抗体、及びサイトケラチン１８抗体からなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項２１に記載の子宮頸癌のスクリーニング方法。
23. 子宮頸部扁平上皮系異型細胞と反応する標識抗体の抗体が、ＮＭＰ１７９抗体、ｐ１６^{ＩＮＫ４Ａ}抗体、Ｋｉ−６７抗体、ｐ５３抗体、ｐ２１抗体、ＥＭＡ抗体、ＣＥＡ抗体及びＭＩＢ−1抗体からなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項２１又は２２に記載の子宮頸癌のスクリーニング方法。
24. 互いに識別可能な蛍光物質で標識された、腺系細胞と反応する第１蛍光標識抗体、腺癌細胞と反応する第２蛍光標識抗体、及び子宮頸部扁平上皮系異型細胞と反応する第３蛍光標識抗体と、子宮頸部細胞とを反応させて調製された測定用試料を、導入するためのフローセル；
    該フローセル内を流れる測定用試料中の細胞に励起光を照射するための光源；
    励起光を照射された前記細胞より発せられた第１蛍光標識抗体由来の蛍光を検出するための第１の蛍光検出器；
    励起光を照射された前記細胞より発せられた第２蛍光標識抗体由来の蛍光を検出するための第２の蛍光検出器；
    励起光を照射された前記細胞より発せられた第３蛍光標識抗体由来の蛍光を検出するための第３の蛍光検出器；及び
    検出された蛍光が第１蛍光標識抗体、第２標識抗体、第３標識抗体のいずれの由来であるかを判定し、その判定結果に基づいて、腺癌細胞及び／又は扁平上皮系異型細胞の有無を判別する解析部；
    を備えた子宮頸癌のスクリーニング装置。
25. さらに前記細胞の散乱光を検出するための散乱光検出部を備え、
    前記解析部は、検出された蛍光及び散乱光を二軸とする二次元分布図を作成し、該分布図に基づいて、腺癌細胞及び／又は扁平上皮系異型細胞の有無の判別手段を備えている請求項２４に記載のスクリーニング装置。
26. さらに撮像手段を備え、
    前記解析部は、撮像された画像を加味して、腺癌細胞及び／又は扁平上皮系異型細胞の有無を判別する請求項２４又は２５に記載のスクリーニング装置。