WO2010087403A1 - 細胞分散装置及び試料前処理装置 - Google Patents

細胞分散装置及び試料前処理装置 Download PDF

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WO2010087403A1
WO2010087403A1 PCT/JP2010/051143 JP2010051143W WO2010087403A1 WO 2010087403 A1 WO2010087403 A1 WO 2010087403A1 JP 2010051143 W JP2010051143 W JP 2010051143W WO 2010087403 A1 WO2010087403 A1 WO 2010087403A1
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WO
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cell
cells
dispersion
unit
sample
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PCT/JP2010/051143
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正和 福田
幸夫 辻野
康仁 大西
理枝子 後藤
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シスメックス株式会社
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M45/00—Means for pre-treatment of biological substances
    • C12M45/02—Means for pre-treatment of biological substances by mechanical forces; Stirring; Trituration; Comminuting
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/38—Diluting, dispersing or mixing samples
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/1404—Handling flow, e.g. hydrodynamic focusing
    • G—PHYSICS
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    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/40—Concentrating samples
    • G01N1/4077—Concentrating samples by other techniques involving separation of suspended solids
    • G01N2001/4088—Concentrating samples by other techniques involving separation of suspended solids filtration

Definitions

  • the present invention relates to a cell dispersion apparatus and a sample pretreatment apparatus. More specifically, the present invention relates to a cell dispersion apparatus that disperses aggregated cells obtained by aggregating a plurality of cells into a single cell, and a sample pretreatment apparatus including the cell dispersion apparatus.
  • a cell sample obtained by rubbing the cervix with a dedicated brush and stored in a preservative solution mainly composed of alcohol is used as a measurement sample.
  • Cells collected by rubbing the cervix consist of two types of cells, squamous epithelial cells and glandular cells, most of which are squamous epithelial cells, but the uterine body located in the back of the cervix is Since it is mainly composed of glandular cells that secrete mucus, the collected cervical cell group is often in an aggregated state covered with mucus produced in the uterine body.
  • Patent Document 1 it has been proposed to stir the solution containing the cell specimen in order to disperse the aggregated cells.
  • a solution containing cells is immersed in a stirring device having a hollow body provided with a filter at the tip, and the hollow body is rotated to stir the solution containing cells.
  • shearing force is generated in the cell group to disperse the cells.
  • the air inside the hollow body is sucked in a state where the hollow body is immersed in the solution.
  • the filter is formed with a plurality of pores (openings) having a size that allows a single cell to be measured to pass, but allows passage of red blood cells or cell debris having a size smaller than that.
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and provides a cell dispersion apparatus capable of increasing the dispersion efficiency of aggregated cells while suppressing damage to cells, and a sample pretreatment apparatus including the same. It is an object.
  • the cell dispersion device of the present invention is a device for dispersing the aggregated cells in a cell sample solution containing aggregated cells in which a plurality of cells are aggregated into a single cell, A filter member configured to allow passage of the single cell; A dispersion member that is disposed at a predetermined interval from the filter member, and disperses aggregated cells in the interval; And a drive source for driving the dispersion member or the filter member.
  • the sample pretreatment apparatus of the present invention includes the cell dispersion apparatus, An aspiration dispensing unit for aspirating and dispensing a cell sample solution containing cells separated by the cell dispersion device; And a filtration unit for extracting predetermined cells from the cell sample solution dispensed by the suction dispensing unit.
  • the cell dispersion device and the sample pretreatment device of the present invention it is possible to increase the dispersion efficiency of the aggregated cells while suppressing damage to the cells.
  • FIG. 1 is a perspective view of a cell analyzer 1 including a cell dispersion device according to an embodiment of the present invention.
  • the cell analyzer 1 flows a measurement sample containing cells collected from a patient through a flow cell, irradiates the measurement sample flowing through the flow cell with laser light, and emits light (forward scattered light, side fluorescence, etc.) from the measurement sample. By detecting and analyzing the optical signal, it is used to determine whether a cancer cell is contained in the cell. More specifically, the cell analyzer 1 uses cervical epithelial cells as analysis targets and is used for screening cervical cancer. As shown in FIG.
  • a cell analyzer 1 includes a measuring device 2 that performs optical measurement with a laser beam on a measurement sample, and a pretreatment such as washing and staining of a biological sample collected from a subject. And a sample preparation device 3 for producing a measurement sample to be supplied to the measurement device 2, and a data processing device 4 for analyzing a measurement result in the measurement device 2.
  • FIG. 2 is a block diagram showing an internal configuration of the measuring apparatus 2.
  • the measurement apparatus 2 includes a main detection unit 6, a signal processing unit 7, a measurement control unit 8, and an I / O interface 9.
  • the main detection unit 6 detects the measurement target cell and the number and size of the nuclei thereof from the measurement sample.
  • the signal processing unit 7 includes a signal processing circuit that performs signal processing necessary for the output signal from the main detection unit 6.
  • the measurement control unit 8 includes a microprocessor 11 and a storage unit 12, and the storage unit 12 includes a ROM, a RAM, and the like.
  • the ROM of the storage unit 12 stores a control program for controlling the operation of the main detection unit 6 and the signal processing unit 7 and data necessary for executing the control program.
  • the microprocessor 11 stores the control program. Can be loaded into RAM or executed directly from ROM.
  • the microprocessor 11 of the measurement control unit 8 is connected to the data processing device 4 and the microprocessor 19 of the adjustment control unit 16 to be described later via the I / O interface 9. Data necessary for processing can be transmitted and received between the data processing device 4 and the microprocessor 19 of the adjustment processing unit 16.
  • FIG. 3 is a block diagram showing the internal configuration of the sample preparation device 3. As shown in FIG. 3, the sample preparation device 3 automatically performs sub-detection unit 14, signal processing unit 15, preparation control unit 16, I / O interface 17, and component adjustment for a biological sample. And a preparation device unit 18.
  • the sub-detection unit 14 detects the number of cells to be measured included in the biological sample.
  • the sub-detection unit 14 is also shown in FIGS. 5 and 6.
  • the same flow cytometer 10 is employed.
  • the signal processing unit 15 includes a signal processing circuit that performs signal processing necessary for the output signal from the sub-detection unit 14.
  • the preparation control unit 16 includes a microprocessor 19, a storage unit 20, a sensor driver 21, and a drive unit driver 22.
  • the storage unit 20 includes a ROM, a RAM, and the like.
  • the preparation device unit (sample pretreatment device) 18 in the present embodiment includes a sample setting unit 24, a cell dispersion unit 25 as a cell dispersion device, a sample pipette unit 26 as an aspiration dispensing unit, and a sample quantification unit 27. And a reagent determination unit 28 and a discrimination / substitution unit 29 as a filtration unit.
  • the specimen setting unit 24 is for setting a plurality of biological containers 53 and product containers 54 (see FIG. 7) for storing biological samples.
  • the cell dispersion unit 25 forcibly disperses the aggregated cells contained in the biological sample in the biological container 53 into single cells, and details thereof will be described later.
  • the specimen pipette unit 26 takes out a biological sample in which cells are dispersed from the biological container 53 and introduces the biological sample into the fluid circuit of the preparation device unit 18, or returns the prepared product to the product container 54.
  • the specimen quantification unit 27 quantifies the biological sample supplied to the fluid circuit.
  • the reagent quantification unit 28 quantifies a reagent such as a staining solution added to the biological sample
  • the discrimination / substitution unit 29 mixes and replaces the biological sample and the diluent, and also measures the measurement target cell and the other cells. It is for discriminating cells (red blood cells, white blood cells, etc.) and bacteria.
  • the configuration of the fluid circuit (FIG. 7) of the preparation device section 18 having the sections 24 to 29 will be described later.
  • the ROM of the storage unit 20 stores a control program for controlling the operation of the sub-detection unit 14, the signal processing unit 15, the sensor driver 21, and the drive unit driver 22, and data necessary for executing the control program.
  • the microprocessor 19 can load the control program into the RAM or execute it directly from the ROM.
  • the microprocessor 19 of the preparation control unit 16 is connected to the microprocessor 11 of the measurement control unit 8 via the I / O interface 17, thereby allowing the data processed by itself and the data necessary for the processing to be processed. Data can be transmitted to and received from the microprocessor 11 of the measurement processing unit 8.
  • the microprocessor 19 of the preparation control unit 16 is connected to the sensors of the units 24 to 29 of the preparation device unit 18 and the drive motors constituting the drive unit via the sensor driver 21 and the drive unit driver 22.
  • the control program is executed based on the detection signal from the control unit to control the operation of the drive unit.
  • FIG. 4 is a block diagram showing an internal configuration of the data processing device 4.
  • the data processing device 4 includes a personal computer such as a notebook PC (may be a desktop type), and includes a processing main body 31, a display unit 32, and an input unit 33. It is mainly composed.
  • the processing body 31 includes a CPU 34, a ROM 35, a RAM 36, a hard disk 37, a reading device 38, an input / output interface 39, and an image output interface 40. These units are communicably connected via an internal bus. Has been.
  • the CPU 34 can execute a computer program stored in the ROM 35 or a computer program loaded in the RAM 36.
  • the ROM 35 is configured by a mask ROM, PROM, EPROM, EEPROM, or the like, and stores a computer program executed by the CPU 34 and data used for the computer program.
  • the RAM 36 is composed of SRAM, DRAM, or the like, and is used as a work area for the CPU 34 when reading various computer programs recorded in the ROM 35 and the hard disk 37 and executing these computer programs.
  • the hard disk 37 is installed with various computer programs to be executed by the CPU 34 such as an operating system and application programs, and data used for executing the programs.
  • the hard disk 37 is installed with an operating system that provides a graphical user interface environment such as Windows (registered trademark) manufactured and sold by Microsoft Corporation.
  • the hard disk 37 has an operation program for transmitting operation commands to the measurement control unit 8 and the preparation control unit 16, receiving and analyzing the measurement results performed by the measurement apparatus 2, and displaying the processed analysis results. 41 is installed.
  • the operation program 41 operates on the operating system.
  • the reading device 38 is constituted by a flexible disk drive, a CD-ROM drive, a DVD-ROM drive, or the like, and can read a computer program or data recorded on a portable recording medium.
  • the input / output interface 39 includes, for example, a serial interface such as USB, IEEE1394, RS-232C, a parallel interface such as SCSI, IDE, IEEE1284, an analog interface including a D / A converter, an A / D converter, and the like. Has been.
  • An input unit 33 including a keyboard and a mouse is connected to the input / output interface 39, and data can be input to the computer by a user operating it. Further, the input / output interface 39 is also connected to the I / O interface 9 of the measuring device 2, whereby data can be transmitted and received between the measuring device 2 and the data processing device 4.
  • the image output interface 40 is connected to the display unit 32 such as an LCD or a CRT, and causes the display unit 32 to output a video signal corresponding to image data from the CPU 34.
  • FIG. 5 is a functional block diagram of the flow cytometer 10 constituting the main detection unit 6, and FIG. 6 is a side view showing an optical system of the flow cytometer 10.
  • the lens system 43 of the flow cytometer 10 condenses the laser light from the semiconductor laser 44 that is a light source onto the measurement sample that flows through the flow cell 45.
  • the forward scattered light of the cells in the measurement sample is collected on a scattered light detector composed of a photodiode 47.
  • the lens system 43 is illustrated as a single lens, but the lens system 43 is specifically configured as shown in FIG. 6, for example.
  • the lens system 43 in the present embodiment includes, in order from the semiconductor laser 44 side (left side in FIG. 6), a collimator lens 43a, a cylinder lens system (plano-convex cylinder lens 43b + biconcave cylinder lens 43c), and a condenser lens system (condenser). Lens 43d + condenser lens 43e).
  • the side condensing lens 48 condenses the side scattered light and the side fluorescence of the measurement target cell or the nucleus in the cell on the dichroic mirror 49.
  • the dichroic mirror 49 reflects side scattered light to the photomultiplier 50 that is a scattered light detector, and transmits side fluorescent light toward the photomultiplier 51 that is a fluorescence detector. These lights reflect the characteristics of cells and nuclei in the measurement sample.
  • the photodiode 47 and each of the photomultipliers 50 and 51 convert the received optical signal into an electrical signal, and forward scattered light signal (FSC), side scattered light signal (SSC), and side fluorescent signal, respectively. (SFL) is output. These output signals are amplified by the preamplifier and sent to the signal processing unit 7 (see FIG. 2) of the measuring apparatus 2. Each signal FSC, SSC, SFL processed by the signal processing unit 7 of the measuring device 2 is transmitted from the I / O interface 9 to the data processing device 4 by the microprocessor 11.
  • the CPU 34 of the data processing device 4 creates a scattergram for analyzing cells and nuclei from the signals FSC, SSC, SFL by executing the operation program 41, and in the measurement sample based on the scattergram. It is determined whether or not these cells are abnormal, specifically, whether or not they are cancerous cells.
  • a gas laser can be used instead of the semiconductor laser 44.
  • the semiconductor laser 44 it is preferable to employ the semiconductor laser 44 because of its low cost, small size, and low power consumption. The adoption of the laser 44 can reduce the product cost and reduce the size and power consumption of the apparatus.
  • a blue semiconductor laser having a short wavelength that is advantageous for narrowing the beam is used.
  • Blue semiconductor lasers are also effective for fluorescence excitation wavelengths such as PI.
  • a red semiconductor laser that has a low cost and a long life and is stably supplied from the manufacturer may be used.
  • the average size of epithelial cells in the cervix is about 60 ⁇ m, and the size of the nucleus is 5 to 7 ⁇ m.
  • the frequency of cell division increases abnormally, and the nucleus becomes 10-15 ⁇ m in size.
  • This increases the N / C ratio (nucleus size / cell size) compared to normal cells. Therefore, by detecting the size of the cells and nuclei, it can be used as an index for determining whether or not the cells have become cancerous.
  • scattered light from the measurement sample flowing through the flow cell 45 is detected by the photodiode 47, and fluorescence from the measurement sample flowing through the flow cell 45 is detected by the photomultiplier 51.
  • the signal processing unit 7 of the measurement device 2 acquires the pulse width of the scattered light signal, which is a value reflecting the size of the measurement target cell, from the scattered light signal output from the photodiode 47, and from the photomultiplier 51. From the output fluorescence signal, the pulse width of the fluorescence signal, which is a value reflecting the size of the nucleus of the measurement target cell, is acquired.
  • the CPU 34 of the data processing device 4 determines that the measurement target cell is abnormal when the value obtained by dividing the pulse width of the fluorescence signal by the pulse width of the scattered light signal is larger than a predetermined threshold.
  • the sub-detection unit 14 of the sample preparation device 3 detects the number of cells to be measured from the biological sample in the pre-processing step of preparing the sample.
  • the sub-detection unit 14 is illustrated in FIGS. 5 and 6.
  • the flow cytometer 10 having the same configuration as that of the first embodiment is employed.
  • the sample preparation device 3 in the present embodiment preliminarily measures the concentration of the measurement target cell before the main measurement by the measurement device 2, the sub-detection unit 14 counts the number of cells. It is enough to output a signal for this purpose.
  • the forward scattered light signal (FSC) forward scattered light signal
  • SSC side scattered light signal
  • SFL side fluorescent signal
  • the optical signal received by the photodiode 47 of the sub-detection unit 14 is converted into an electric signal, amplified, and sent to the signal processing unit 15 (see FIG. 3) of the sample preparation device 3.
  • the signal FSC processed by the signal processing unit 15 of the sample preparation device 3 is sent to the preparation control unit 16.
  • the microprocessor 19 of the preparation control unit 16 counts the number of cells to be measured based on the signal FSC. Further, the microprocessor 19 obtains the volume of the biological sample preliminarily collected by the sample pipette unit 26 for concentration measurement from the flow sensor provided in the pipette unit 26, and the cell obtained from the signal FSC. The concentration of the biological sample is calculated by dividing the number by its volume.
  • the concentration information generated by the microprocessor 19 of the preparation control unit 16 may include other concentrations substantially equivalent to this concentration as well as the concentration of the biological sample. Then, the microprocessor 19 of the preparation control unit 16 controls a preparation operation (an operation such as quantification of the biological sample or reagent) performed by the preparation device unit 18 on the biological sample based on the concentration information generated by itself. A control command is issued to The specific contents of this control will be described later.
  • FIG. 7 is a fluid circuit diagram of the preparation device unit 18.
  • the specimen setting unit 24 includes a circular rotary table 24A and a drive unit 24B that rotationally drives the rotary table 24A, and a biological container that contains a biological sample at the outer peripheral edge of the rotary table 24A. 53 and a holding part capable of setting a product container (microtube) 54 for storing a product after preparing a biological sample is provided.
  • a product container microtube
  • the cell dispersion unit 25 includes a filter 101 that is a filter member, a rotor 102 that is a dispersion member disposed at a predetermined interval from the filter 101, and a motor 103 that is a drive source that rotationally drives the rotor 102.
  • the rotor 102 is rotationally driven through a rotating shaft 104 connected to the output shaft of the motor 103.
  • a pipe 105 which is a guide cylinder, is provided outside the filter 101 and the rotor 102. By inserting them into the biological container 53 and rotating the rotor 102, the biological sample in the biological container 53 is obtained. By stirring, the aggregated cells contained in the biological sample are dispersed into single cells. Details including the specific configuration of the cell dispersion unit 25 will be described later.
  • the sample pipette unit 26 sucks the biological sample in the biological container 53 and the measurement sample in the product container 54 and supplies the sample to the sample quantitative unit 27 and the preparation device unit 18. And a second pipette 26 ⁇ / b> B for returning the product after the predetermined treatment to the product container 54.
  • the second pipette 26B is connected to an accommodation container 57 of the discrimination / substitution unit 29, which will be described later, by a pipe line, and the liquid in which the measurement target cells are discriminated by the discrimination / substitution unit 29 is obtained by the second pipette unit 26B. 54.
  • the sample quantification unit 27 includes a quantification cylinder 27A and a drive unit 27B that moves up and down a quantification piston inserted through the cylinder 27A.
  • the metering cylinder 27A is connected to the first pipette 26A by a pipe line via the direction switching valve V1.
  • the biological sample sucked from the biological container 53 by the first pipette 26A is introduced into the quantitative cylinder 27A through the direction switching valve V1.
  • the introduced biological sample is sent to the next discrimination / substitution unit 29 through the direction switching valve V1 by the movement of the fixed amount piston by the drive unit 27B.
  • the quantification cylinder 27A of the sample quantification unit 27 is also connected to a dilution liquid unit 55 that prepares a dilution liquid for the biological sample by a pipe line.
  • the reagent quantification unit 28 includes a pair of quantification cylinders 28A and 28B, and a drive unit 28C that vertically moves a quantification piston inserted into each of the cylinders 28A and 28B.
  • Each fixed quantity cylinder 28A, 28B is connected with the 2nd pipette 26B by the pipe line via supply switching valve V2, V3, respectively.
  • the reagent in the reagent container is supplied to each quantitative cylinder 28A, 28B.
  • the supplied reagent is quantified by a predetermined amount by the movement of the quantification piston by the drive unit 28C, and the quantified reagent is sent to the second pipette 26B through the supply switching valves V2 and V3.
  • a plurality of types of predetermined amounts of reagent determined by the reagent quantitative unit 28 can be mixed with the sample that has been discriminated to be returned to the product container 54 of the sample setting unit 24.
  • the reagent weighed with one quantitative cylinder 28A and added to the biological sample is a dye solution for performing PI staining
  • the reagent weighed with the other quantitative cylinder 28B and added to the biological sample is treated with RNA.
  • RNase for performing PI staining is performed with propidium iodide (PI), which is a fluorescent staining solution containing a dye.
  • PI staining the nucleus is selectively stained, so that fluorescence from the nucleus can be detected.
  • the RNA treatment is a treatment for dissolving RNA in cells. Since the dye solution stains both RNA and DNA of the epithelial cells, the RNA treatment dissolves the RNA and does not stain with the dye solution, so that the DNA of the cell nucleus can be accurately measured.
  • the discriminating / replacement unit 29 includes an upper-opening storage container 57, a filtration cylinder 58 provided in the storage container 57 so as to be movable up and down, and a drive for moving the filtration cylinder 58 up and down in the storage container 57. Part 59.
  • the container 57 is connected to the quantitative cylinder 27A of the sample quantitative unit 27 through a direction switching valve V1, V7, V4. For this reason, the biological sample quantified by the specimen quantification unit 27 is supplied to the storage container 57 through the direction switching valves V1, V7, and V4, and can be temporarily held in the container 57.
  • the container 57 is connected to the second pipette 26B via a direction switching valve V4 through a conduit, and the biological sample in the container 57 that has been discriminated is sent from the direction switching valve V4 to the second pipette 26B. It is done.
  • the flow cell 45 of the sub-detecting unit 14 is interposed in the pipe line portion between the direction switching valve V4 and the second pipette 26B. For this reason, the sub-detection unit 14 can count the number of cells with respect to the distinguished biological sample discharged from the storage container 57.
  • the filtration cylinder 58 is formed of a hollow cylinder having a filter 60 at a lower portion thereof that does not allow measurement target cells (epithelial cells) to pass therethrough and allows cells having smaller diameters (red blood cells, white blood cells, etc.) to pass therethrough. Is connected to the diluent unit 55 via a switching valve V5.
  • the diluent of the diluent unit 55 can be supplied to the inside of the filtration cylinder 58 by opening the switching valve V5.
  • the drive unit 59 of the discrimination / substitution unit 29 moves the filtration cylinder 58 downward with respect to the storage container 57 containing the mixture of the biological sample and the diluent, and the filter 60 of the filtration cylinder 58 is placed in the storage container 57. Move downward in the mixed liquid.
  • the liquid containing only the measurement target cells remains as a residual liquid below the filter 60, and the liquid containing other cells and impurities remains as a filtrate above the filter 60 (inside the filtration cylinder 58).
  • the filtration cylinder 58 is connected to the filtrate disposal unit 61 via a switching valve V6 through a pipe line. For this reason, the filtrate filtered by the lowering of the filtration cylinder 58 is discarded outside through the switching valve V6.
  • the residual liquid in the filtration cylinder 58 is sent to the flow cell 45 of the sub-detecting section 14 through the direction switching valve V4 after the filtrate is discarded, and then sent to the second pipette 26B of the sample pipette section 26.
  • the residual liquid after filtration is for measuring the concentration of a biological sample
  • it is discharged from the second pipette 26B, and when the residual liquid is for preparing a measurement sample, the second pipette 26B is returned to the product container 54.
  • the quantification cylinder 27A of the sample quantification unit 27 is also connected to the main detection unit 6 of the measurement apparatus 2 via a direction switching valve V1, V7.
  • the measurement sample in the product container 54 is quantified by the sample quantification unit 27 via the first pipette 26A and supplied to the main detection unit 6 of the measurement device 2 through the valves V1 and V7.
  • the operation control for the drive units and switching valves (electromagnetic valves) V1 to V7 shown in FIG. 7 is performed based on a control command from the preparation control unit 16 (microprocessor 19). The pretreatment process performed by the preparation control unit 16 will be described later.
  • FIG. 8 is a perspective explanatory view showing a more specific configuration of the cell dispersion portion 25, and FIG. 9 is a cross-sectional explanatory view of the tip portion of the cell dispersion portion 25.
  • the cell dispersion unit 25 according to the present embodiment includes a filter 101, a rotor 102 disposed at a predetermined interval from the filter 101, and rotationally drives the rotor 102.
  • a motor 103 is provided, and a pipe 105 having a function of guiding the flow of the biological sample is disposed outside the filter 101 and the rotor 102.
  • the filter 101 is made of stainless steel in consideration of chemical resistance, strength, and the like, and is formed of a circular film-like body having a thickness of about 100 ⁇ m as shown in FIG.
  • the filter 101 is provided with a large number of holes 101A having a size through which a single cell can pass, except for the peripheral edge 101B. Since the measurement target cells in this embodiment are epithelial cells of the cervix (usually about 20 to 80 ⁇ m, most of which are about 60 ⁇ m), the pore diameter of the hole 101A of the filter 101 is Is 100 ⁇ m, and the aperture ratio is 40%.
  • the filter 101 is fixed to a predetermined location on the inner peripheral surface of the pipe 105 by laser spot welding.
  • the reason why the hole diameter of the hole 101A of the filter 101 is set to 80 to 120 ⁇ m is that if it is less than 80 ⁇ m, the single cell to be measured cannot pass through the filter 101 and the single cell may be damaged by shearing force. When the thickness exceeds 120 ⁇ m, the aggregated cells may pass through the filter 101, and the cell dispersion efficiency of the aggregated cells may be lowered.
  • the hole diameter of the hole 101A is more preferably around 100 ⁇ m.
  • the rotor 102 is made of stainless steel in consideration of chemical resistance and strength.
  • the cylinder has a diameter of about 7 mm and a thickness (height) of about 5 mm. It is made up of.
  • a hole 102 ⁇ / b> A is formed at the center of the rotor 102, and the other end of the rotating shaft 104 whose one end is connected to the output shaft 103 ⁇ / b> A of the motor 103 is press-fitted into the hole 102 ⁇ / b> A.
  • four flow paths 102D penetrating from the upper surface 102B (the upper surface in FIGS. 8 to 9) of the rotor 102 to the lower surface 102C are formed at equal intervals in the circumferential direction.
  • the hole diameter of the flow path composed of the through holes is about 2 mm.
  • Fins 106 are provided on the upper surface 102B of the rotor 102 so as to correspond to the respective flow paths 102D.
  • Each fin 106 is a member formed by bending a flat plate halfway, and a short side portion 106A thereof is press-fitted into a groove 107 formed in the upper surface 102B of the rotor 102.
  • the groove 107 is formed outward in the radial direction around the hole 102A.
  • the long side portion 106B of the fin 106 forms a surface inclined with respect to the upper surface 102B of the rotor 102, and a part of the long side portion 106B desires an opening portion of the flow channel 102D, or an opening portion of the flow channel 102D.
  • the position of the groove is set so as to cover.
  • the biological sample that hits the lower surface 106B1 of the long side portion 106B of the fin 106 is introduced into the flow path 102D, and the flow of the biological sample is formed.
  • the corner portion 106B2 of the long side portion 106B is subjected to curved surface processing or chamfering processing in order to reduce damage to cells.
  • a protrusion 108 formed of a cross-shaped protrusion 108 ⁇ / b> A is formed on the lower surface 102 ⁇ / b> C of the rotor 102.
  • Each flow path 102D opens between adjacent protrusions 108A.
  • the protruding height of the protruding portion 108A varies depending on the size of the aggregated cells to be dispersed, but is usually in the range of 100 to 300 ⁇ m.
  • the corner of the protruding portion 108A is also subjected to curved surface processing or chamfering processing in order to reduce damage to the cells, like the corner portion 106B2 of the long side portion 106B.
  • An interval (clearance) CL1 of 30 to 80 ⁇ m is provided between the tip surface 108A1 (the lower surface in FIGS. 8 to 9) of the protrusion 108A formed on the lower surface 102C of the rotor 102 and the upper surface of the filter 101.
  • CL1 shearing force or dispersion force can be effectively applied to the aggregated cells. That is, the size of the cervical epithelial cells to be measured in this embodiment is 60 ⁇ m on average, and when this aggregates, the size exceeds 120 ⁇ m.
  • the hole diameter of the filter 101 in this Embodiment is 100 micrometers.
  • the aggregated cell In the case of a single epithelial cell, it can pass through the hole 101A of the filter 101, but the aggregated cell cannot pass through and is captured by the hole 101A of the filter 101. At this time, if the interval CL1 is a value smaller than the size of the aggregated cells, the aggregated cells captured in the holes 101A are surely given a shearing force or a dispersing force to reliably disperse the aggregated cells. be able to.
  • the interval CL1 is set to 30 to 80 ⁇ m, if it is less than 30 ⁇ m, the cells may be crushed, and if it exceeds 80 ⁇ m, the dispersion force applied to the aggregated cells may be reduced.
  • the interval CL1 is more preferably around 50 ⁇ m.
  • the motor 103 is fixed to the upper member 109A of the support bracket 109, and its output shaft 103A projects downward from a hole formed in the upper member 109A.
  • One end of the rotating shaft 104 is connected to the output shaft 103A, and the other end of the rotating shaft 104 is connected to the rotor 102. Thereby, the rotor 102 can be rotated by rotating the motor 103.
  • the pipe 105 is a stainless steel circular pipe having an outer diameter of about 10 mm and a wall thickness of about 1.5 mm, and one end thereof is connected to a hollow body 110 provided on the lower surface of the lower member 109B of the support bracket 109. Has been. At the other end (end side end portion) of the pipe 105, a tapered portion 105A having a sectional area gradually decreasing toward the tip is formed. The hole diameter of the hole 105B at the tip of the tapered portion 105A is about 2.5 mm.
  • the rotor 102 is disposed such that its outer peripheral surface 102E is close to the inner peripheral surface 105D of the pipe 105, and the interval CL2 between the outer peripheral surface 102E and the inner peripheral surface 105D is set to about 100 ⁇ m.
  • Two elongated openings 105C are formed in the pipe peripheral wall slightly above the position where the rotor 102 is disposed.
  • the two openings 105C are formed at positions facing each other with the core of the pipe 105 as the center. As will be described later, the biological sample outside the pipe 105 is introduced into the pipe 105 through the opening 105C.
  • the operation of the cell dispersion unit 25 having the above configuration will be described.
  • the motor 103 When the motor 103 is rotated with the pipe 105 immersed in the biological sample in the biological container 53, the rotor 102 connected to the output shaft 103A of the motor 103 via the rotation shaft 104 rotates.
  • the number of rotations of the motor 103 is not particularly limited in the present invention, but is approximately 2000 to 20000 rpm.
  • the preferred number of rotations varies depending on the biological sample and the shape of the rotor 102, but if the number of rotations is too small, the aggregated cells cannot be sufficiently dispersed. On the other hand, if the number of rotations is too large, the cells may be crushed. is there.
  • the rotation time of the motor 103 required for one processing operation varies depending on the type and amount of the biological sample, the number of rotations, etc., but is usually 20 to 300 seconds. Further, it is preferable to periodically rotate the motor 103 in order to stir the aggregated cells stagnating in the corners or to release the aggregated cells entangled with the fins 106 and the like. Specifically, in this embodiment in which cervical epithelial cells are measured, for example, by repeating a cycle of 18 seconds for normal rotation and 2 seconds for inversion, the aggregated cells can be sufficiently dispersed. .
  • the fin 106 provided integrally with the rotor 102 also rotates. As shown in FIG. 11, since the long side portion 106B of the fin 106 is inclined in the normal rotation direction of the rotor 102, the biological sample is introduced into the flow path 102D of the rotor 102 by the rotation of the fin 106. .
  • the biological sample introduced into the channel 102D is ejected toward the filter 101 from the lower opening of the channel 102D.
  • the ejected biological sample includes a single epithelial cell and an aggregated cell obtained by aggregating a plurality of single epithelial cells.
  • the single cell passes through the hole 101 of the filter 101 and is piped. It is ejected to the outside of the pipe 105 from the hole 105B at the tip of 105.
  • the tip portion of the pipe 105 is a tapered portion 105A whose diameter is reduced toward the tip, the biological sample that has passed through the filter 101 is accelerated by the taper portion 105A to be the tip of the pipe 105. Is ejected from the outside.
  • the aggregated cells are trapped in the hole 101A of the filter 101 and cannot pass through the filter 101.
  • the flow of the biological sample caused by the rotation of the rotor 102, and the rotor 102
  • a dispersion force is applied to disperse into single cells.
  • the dispersed single cells pass through the hole 101 of the filter 101 and are ejected to the outside of the pipe 105 from the hole 105B at the tip of the pipe 105.
  • the flow from the rotor 102 toward the filter 101 is formed by the fins 106 provided integrally with the rotor 102.
  • a pipe 105 having an opening in its peripheral wall is disposed outside the rotor 102 and the filter 101 to form a closed space between the rotor 102 and the filter 101.
  • the flow of the biological sample formed by the fin 106 includes the flow path 102D of the rotor 102, the filter 101, the hole 105B at the tip of the pipe 105, the outside of the pipe 105, the opening 105C of the pipe 105, and the flow of the rotor 102.
  • the cells collected from the cervix of the subject were dispersed using the cell dispersion part 25 described above, and the dispersion effect was confirmed.
  • a mixture of 0.3 ml of a sample (PreservCyt (CYTYC) stock sample) and 0.3 ml of the diluted trypan blue staining solution was subjected to a dispersion treatment for 60 seconds using the cell dispersion unit 25 described above.
  • the number of revolutions of the motor was 10,000 rpm, and the cycle was repeated 3 cycles, with 18 seconds for forward rotation and 2 seconds for reverse rotation as one cycle.
  • the number of single cells is increased by performing the dispersion process.
  • FIG. 13 is an enlarged cross-sectional view showing a more specific configuration of the discrimination / substitution unit 29, and FIG. 14 is an explanatory diagram showing its filtering action.
  • the discrimination / substitution unit 29 in the present embodiment does not allow the container 57 that can contain the liquid L containing the biological sample and the first cell C ⁇ b> 1 in the biological sample to pass through the first container C.
  • a filter 60 that allows the second cells C2 having a smaller diameter than the cells C1 to pass therethrough.
  • the discrimination / substitution unit 29 separates the liquid L into the first liquid L1 containing the first cells C1 and the second liquid L2 containing the second cells C2 by allowing the liquid L to pass through the filter 60.
  • a filtration cylinder 58 that functions as a liquid separator is provided.
  • the container 57 integrally includes a hollow body portion 57A having an axial center that is directed in the vertical direction, and a bottom portion 57B that is connected to a lower portion of the body portion 57A and has an inner surface with a central portion recessed downward. ing.
  • the filtration cylinder 58 is provided so as to close the hollow cylindrical cylinder 63 provided in the storage container 57 so as to be movable up and down via the seal member 62 and the lower end opening of the cylinder 63.
  • the filter 60 is provided.
  • cervical epithelial cells are assumed as the first cells C1, and the size of the epithelial cells is approximately 20 to 80 ⁇ m (average is about 60 ⁇ m).
  • the size of red blood cells, which are the second cells C2, smaller than the first cells C1, is approximately 7 to 10 ⁇ m, and the size of white blood cells, which are also the second cells C2, is approximately 8 to 15 ⁇ m.
  • the size of contaminants such as bacteria which are the second cells C2 is approximately 1 to several ⁇ m.
  • a metal CVD (Chemical Vapor Deposition) filter having a through hole with a diameter of 10 to 20 ⁇ m is employed as the filter 60.
  • a metal CVD filter has the advantage that even if it is made of a resin or a metal filter, the deformation of the through-hole is less than that of a mesh filter and the aperture ratio can be increased.
  • the pore size of the filter 60 is set to 10 to 20 ⁇ m, and if it is less than 10 ⁇ m, there are many phenomena in which cells and contaminants are clogged early in the through-hole, and if it exceeds 20 ⁇ m, epithelial cells pass through. This is because there are many things.
  • the pore diameter of the filter 60 is more preferably around 15 ⁇ m.
  • the bottom 57B of the container 57 is connected with a residual liquid pipe 64 for discharging and obtaining the quantified biological sample and discharging the residual liquid L1 after filtration to the outside.
  • a switching valve V4 is provided. Therefore, the remaining liquid pipe 64 and the direction switching valve V4 constitute a liquid acquisition unit for acquiring the first liquid L1 separated by the filtration cylinder 58 which is a liquid separation unit.
  • a dilution liquid pipe 65 communicating with the dilution liquid unit 55 is connected to the upper wall of the cylinder 63, and the switching valve V ⁇ b> 5 is provided in the middle of the pipe 65.
  • a filtrate pipe line 66 leading to the discarding part 61 for discarding the filtrate L2 after filtration to the outside is connected to the upper wall part of the cylinder 63, and the switching valve V6 is provided in this pipe line 66. ing. Therefore, the filtrate pipe line 66 and the switching valve V6 constitute a liquid discharge part for discharging the second liquid C2 separated by the filtration cylinder 58, which is a liquid separation part, to the outside.
  • a moving mechanism portion 67 Connected to the upper end portion of the cylinder 63 is a moving mechanism portion 67 that converts the rotational movement of the driving portion 59 made of a motor or the like into vertical movement of the cylinder 63.
  • the drive unit 59 of the moving mechanism unit 67 drives the filtration cylinder 58 in accordance with a control command from the preparation control unit 16 (microprocessor 19). For example, as shown in FIG. 9A, the preparation control unit 16 moves the filter 60 from above the liquid level of the liquid L (mixed liquid of biological sample and diluent) in the container 57 toward the liquid.
  • the filtration cylinder 58 is lowered so as to move downward.
  • the preparation control unit 16 controls the drive unit 59 of the moving mechanism unit 65 so that the filter 60 that has moved into the liquid L returns upward by a predetermined distance.
  • the preparation control unit 16 lowers the filter cylinder 58 until the filter 60 reaches the lower limit set at or near the bottom 57B, and then moves the filter 60 so that the filter 60 returns upward by a predetermined distance. By controlling the portion 67 and returning upward, the first cells C1 attached to the lower surface of the filter 60 can be detached from the filter 60. Then, the preparation control unit 16 first opens the switching valve V6 to discharge the filtrate L2 to the outside prior to the residual liquid L1, as shown in FIG. 9C, and thereafter, the residual liquid L1 In order to acquire the direction switch valve V4.
  • FIGS. 15 and 16 are flowcharts showing processing performed by the control units 8, 16, and 31 of the cell analyzer 1.
  • the processing flow performed by the control unit (processing body) 31 of the data processing device 4 is shown in the right column, and the processing flow performed by the control unit 8 of the measuring device 2 is shown in the left column.
  • the processing flow performed by the control unit 16 of the sample preparation device 3 is shown in a row, but this processing flow is connected to the processing flow of FIG. 15 at points A, B, and C shown in the figure.
  • FIGS. 15 and 16 the processing content performed by the cell analyzer 1 will be described with reference to FIGS. 15 and 16.
  • the control unit 31 of the data processing device 4 displays a menu screen on the display unit 32 (step S1). Thereafter, when a measurement start instruction according to the menu screen is received from the input unit 33 (step S2), the control unit 31 of the data processing device 4 transmits a measurement start signal to the measurement device 2 (step S3). When receiving the measurement start signal (step S4), the control unit 8 of the measurement device 2 transmits a preparation start signal to the sample preparation device 3 (step S5 and point A).
  • the control unit 16 of the sample preparation device 3 When receiving the preparation start signal (step S6), the control unit 16 of the sample preparation device 3 sucks a reagent (staining solution, RNase) used for preparation of the measurement sample into the flow path in the device, Then, the biological sample in the biological container 53 containing the alcohol main component storage solution is dispersed by the cell dispersion unit 25 (steps S7 and S8).
  • the biological sample is dispersed in the cell dispersion unit 25 according to the embodiment described with reference to FIGS. 8 to 12 as follows. That is, when the motor 103 is driven to rotate by the control unit 16, the rotor 102 and the fin 106 provided integrally with the rotor 102 are rotated by the rotation of the motor 103.
  • the biological sample is introduced into the flow path 102D of the rotor 102 by the rotation of the fin 106, and is ejected toward the filter 101 from the lower opening of the flow path 102D.
  • the single cells in the ejected biological sample pass through the hole 101 of the filter 101 and are ejected from the hole 105B at the tip of the pipe 105 to the outside of the pipe 105.
  • the aggregated cells are trapped in the hole 101A of the filter 101 and cannot pass through the filter 101.
  • the cell dispersion unit 25 disperses the aggregated cells in the biological sample into single cells.
  • control unit 16 of the sample preparation device 3 sucks the dispersed biological sample from the biological container 53 into the flow path in the device by a predetermined amount (step S9) and sends it to the storage container 57 of the discrimination / substitution unit 29. Then, the discrimination / substitution unit 29 is caused to perform discrimination / substitution processing on the biological sample (step S10).
  • FIG. 17 is a flowchart showing the discrimination / substitution process. As shown in FIG. 17, first, the control unit 16 of the sample preparation device 3 mixes the diluent in the container 57 containing the biological sample (step T1), and lowers the cylinder 63 to its lower limit position ( Step T2).
  • the liquid L in the container 57 is discriminated into a predetermined amount of residual liquid L1 containing the first cell C1 to be measured and filtrate L2 containing other cells C2. Is done. Thereafter, the control unit 16 of the sample preparation device 3 raises the cylinder 63 by a predetermined distance when the lower limit position of the cylinder 63 is reached (step T3), and thereby the first cells attached to the lower surface of the filter 60 ( Epithelial cells) C1 are suspended in the concentrate L1 below the filter 60.
  • the ascending movement of the cylinder 63 in this process may be a speed and stroke that can physically remove the first cell C1 from the filter 60, and the number of movements may be multiple.
  • the control unit 16 of the sample preparation device 3 discharges the filtrate L2 above the filter 60 to the outside (step T4), and then raises the cylinder 63 to the initial position (step T5). It is determined whether or not the descent is the second time (step T6).
  • the control unit 16 of the sample preparation device 3 repeats the filtration again from the mixing of the diluent, and if this is the second time, the processing routine of the discrimination / substitution process is ended. To do.
  • This discrimination / replacement operation is not limited to two times, and may be performed more than twice.
  • the control unit 16 of the sample preparation device 3 adds the concentrated liquid (residual liquid L ⁇ b> 1 that is mostly epithelial cells) to the flow cell 45 of the sub-detection unit 14. (Step S11), and using this sub-detecting unit 14, pre-measurement of the concentrated liquid L1 is performed by the flow cytometry method (Step S12).
  • This pre-measurement is for obtaining concentration information reflecting the concentration of the measurement target cell (epithelial cell) C1 contained in the biological sample before the main measurement performed by the measurement device 2 for cancer determination. This is performed by detecting the number of cells C1 contained in the concentrate L1.
  • control unit 16 of the sample preparation device 3 discharges the concentrate L1 out of the fluid circuit (step S13), calculates the concentration of the biological sample (step S14), and based on this concentration information, A sample suction amount of the biological sample for preparing a measurement sample for measurement is determined (step S15).
  • the number of significant cells necessary for detection of cancer cells in this measurement is, for example, 100,000
  • control unit 16 of the sample preparation device 3 sucks the biological sample from the biological container 53 by the necessary amount (step S16), and performs the discrimination / substitution process described above again on the biological sample (step S16). S17).
  • control unit 16 of the sample preparation device 3 determines and determines the amount of the biological sample for preparation of the measurement sample used for the main measurement based on the concentration information of the cell C1 generated by itself.
  • the preparation device unit 18 of the sample preparation apparatus 3 is controlled so as to acquire an amount of biological sample.
  • the control unit 16 of the sample preparation device 3 determines a larger amount of the biological sample used for preparing the measurement sample as the concentration of the cell C1 in the biological sample is lower, and the concentration of the cell C1 in the biological sample. The higher the value, the smaller the amount of biological sample used to prepare the measurement sample.
  • the number of cells C1 detected by the main detection unit 34 is not limited to the 100,000 cells that are the number of significant cells for cancer detection.
  • the amount of the biological sample used for preparing the measurement sample may be determined so as to be within a predetermined range of 100,000 to 150,000.
  • control unit 16 of the sample preparation device 3 determines not only the amount of the biological sample but also the amount of the reagent for preparing the measurement sample based on the concentration information of the cell C1 generated by itself. It is also possible to control the preparation device unit 18 of the sample preparation device 3 so as to obtain a sufficient amount of reagent. Further, in the control unit 16 of the sample preparation device 3, the ratio between the number of cells C1 in the biological sample and the amount of reagent (for example, staining solution) is within a predetermined range based on the concentration information of the cells C1 generated by itself. It is also possible to determine the amount of at least one of the biological sample and the reagent so that the preparation device unit 18 of the sample preparation apparatus 3 is controlled so as to acquire the determined amount of the biological sample or reagent. .
  • the control unit 16 of the sample preparation device 3 supplies the concentrate L1 obtained by the second discrimination / substitution process to the product container (microtube) 54 (step S18) and stores it in the device.
  • the staining solution and RNase thus prepared are supplied from the reagent quantification unit 28 to the product container 54 (step S19), and DNA staining and RNA treatment are performed in the product container 54 to prepare a measurement sample (step S20).
  • control unit 16 of the sample preparation device 3 sends the obtained measurement sample to the main detection unit 6 of the measurement device 2 (step S21 and point B). Note that the control unit 16 of the sample preparation device 3 always determines whether or not the shutdown signal from the measurement device 2 has been received (step S22 and point C). Returning to step S6 for determining whether or not a preparation start signal has been received, if the signal is received, shutdown is performed and the sample preparation process is terminated (step S23).
  • the control unit 8 of the measurement device 2 after transmitting the preparation start signal, the control unit 8 of the measurement device 2 always determines whether or not the measurement sample is supplied from the sample preparation device 3 (step S ⁇ b> 24). Therefore, when the measurement sample is fed from the sample preparation device 3 (point B), the control unit 8 of the measurement device 2 sends the measurement sample to the flow cell 45 of the main measurement unit 14, and the measurement sample with respect to the cell C1 is measured. The actual measurement is performed (step S25), and the measurement data is transmitted to the data processing device 4 (step S26).
  • the control unit 31 of the data processing device 4 always determines whether or not measurement data has been received from the measurement device 2 (step S27).
  • the control unit 31 of the data processing device 4 analyzes the cells and nuclei using the measurement data and determines whether or not the cells in the measurement sample are cancerous. (Step S28).
  • the control unit 31 of the data processing device 4 displays the analysis result on the display unit 32 (step S29), and determines whether there is a shutdown instruction by a user input (step S30). When there is the shutdown instruction, the control unit 31 of the data processing device 4 transmits a shutdown signal to the measuring device 2 (step S31).
  • the control unit 8 of the measuring device 2 always determines whether or not the shutdown signal from the data processing device 4 has been received (step S32). If the signal has not been received, the measurement start signal Returning to step S4 for determining whether or not to receive the signal, if the signal is received, the shutdown signal is transferred to the sample preparation device 3 (step S33), and the shutdown is executed to complete the measurement process (step S34). .
  • the sample preparation device 3 performs the pre-measurement on the biological sample, and includes the concentration adjustment of the measurement target cell C1 based on the measurement result. Since the processing step is performed, a measurement sample suitable for analysis of the measurement target cell C1 can be well prepared even if the concentration of the measurement target cell C1 varies greatly between biological samples. In addition, since the main measurement of the measurement target cell C1 is performed using the measurement sample with the concentration adjusted of the measurement target cell C1 obtained by the concentration adjustment, the concentration of the measurement target cell C1 varies greatly for each biological sample. Even if there is, the measurement target cell C1 in the biological sample can be analyzed with high accuracy.
  • the flow path 102D parallel to the axial direction of the rotor 102 made of a cylindrical body is formed, and this flow path has one end face (upper end face) as shown in FIG.
  • An inclined flow path 202D in which the position of the opening 202D1 in FIG. 5 and the position of the opening 202D2 in the other end face (lower end face) are shifted from each other in the circumferential direction can also be used.
  • the biological sample can be smoothly introduced into the inclined channel 202D when the rotor 202 is rotated in the direction of arrow N in FIG.
  • the circulation flow of the biological sample is generated by the fin 106 provided integrally with the rotor 102.
  • a pump mechanism is disposed in the biological container 53, and this pump mechanism is driven.
  • convection can be generated in the biological sample.
  • a pump mechanism can be disposed outside the biological container 53.
  • the biological sample is discharged into the biological container 53 using tubes connected to the discharge port and the suction port of the pump mechanism.
  • a flow of the biological sample can be created by inhaling from the biological container 53.
  • the circulation flow of the biological sample is generated by the fins 106 provided integrally with the rotor 102.
  • the circulation flow of the biological sample is generated by the fins 106 provided integrally with the rotor 102.
  • the fins 106 provided integrally with the rotor 102.
  • the flow of the circulating flow can be made stronger.
  • the filter 101 is disposed below the rotor 102.
  • the filter 101 may be disposed above the rotor 102.
  • the filter 101 is provided with a hole through which the rotary shaft 104 for rotating the rotor 102 is driven, and the fin 106 is the rotor so that the biological sample flows from the rotor 102 toward the filter 101, that is, from below to above. 102 is provided on the lower end surface.
  • the rotor 102 which is a dispersion member, is rotated.
  • a dispersion member 302 made of a ring body having a cross-shaped flat plate portion 302A as shown in FIG.
  • the aggregated cells can be dispersed by rotating the filter.
  • the filter is fixed so as to form a predetermined distance from the dispersion member 302 on the lower surface of the cylindrical body (no protrusion is formed) in FIGS.
  • the rotor functions not as a dispersion member but as a support for supporting the filter.
  • the hole 105B is formed at the tip of the pipe 105, but a side hole can be formed in the tapered portion 105A.
  • the biological sample is discharged from the pipe 105 through the side hole, so that the stagnation of the biological sample in the biological container 53 can be reduced.
  • the filter member is a filter made of a film-like body in which a large number of micropores are formed.
  • nylon can be used as long as it can pass a single cell to be measured. It is also possible to use a mesh body knitted with synthetic resin fibers.
  • a disc body in which slits having a size (for example, 1 mm) considerably larger than the size of a single cell can be used as a filter member.
  • the material of the filter 101 is not limited to stainless steel, and synthetic resin such as polycarbonate can be used, for example.
  • the cervical epithelial cell C1 is used as a measurement target cell.
  • the prepared measurement sample is measured with a flow cytometer.
  • the cell dispersion device of the present invention can be preferably used. According to the present invention, a measurement sample having a uniform concentration of cells to be measured can be prepared, so that a smear suitable for analysis can be easily produced.
  • the sub detection part is provided.
  • such a sub-detection unit can be omitted when the density variation is relatively small and the measurement accuracy is not substantially affected.
  • the various dimensions for example, the diameter of the pipe 105, the thickness and the aperture ratio of the filter 101), the number (for example, the number of the flow paths 102D), and the like in the above embodiment are merely examples, and the amount of the biological sample. It can be appropriately changed depending on the measurement target cell and the like.

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Abstract

　複数の細胞が凝集した凝集細胞を含む細胞試料液中の当該凝集細胞を単一細胞に分散する装置。前記単一細胞が通過可能に構成されたフィルター部材（１０１）と、このフィルター部材（１０１）と所定の間隔をあけて配設され、当該間隔内の凝集細胞を分散する分散部材（１０２）と、この分散部材（１０２）又は前記フィルター部材（１０１）を駆動させる駆動源（１０３）とを備えている。

Description

細胞分散装置及び試料前処理装置
　本発明は細胞分散装置及び試料前処理装置に関する。さらに詳しくは、複数の細胞が凝集した凝集細胞を単一細胞に分散する細胞分散装置、及びこの細胞分散装置を備えた試料前処理装置に関する。
　フローサイトメータを用いた子宮頸癌スクリーニングでは、測定試料として、専用ブラシで子宮頸部を擦過して採取した細胞をアルコールを主体とした保存液で保存したものが用いられる。子宮頸部の擦過により採取される細胞は、扁平上皮系細胞と腺系細胞の２種類からなり、その大部分は扁平上皮系細胞であるが、子宮頸部の奥に位置する子宮体部は主に粘液を分泌する腺細胞から構成されていることから、採取された子宮頸部の細胞群は子宮体部で産出された粘液に覆われて凝集した状態にあることが多い。
　フローサイトメータで細胞を分析する場合、一列に整列された測定試料中の細胞にレーザ光を照射し細胞からの散乱光や蛍光を利用して各細胞の大きさや形状を測定するという原理上、細胞凝集の検体を測定することは難しく単一細胞であることが必要である。また、細胞凝集している中に存在している異型細胞や癌細胞を見落とさないためにも凝集している細胞群を分散して、単一細胞にすることが重要である。更に、凝集した細胞は５００μｍを超える大きさに達することがあり、この場合、凝集細胞が装置内に詰まって測定ができなくなることがある。
　そこで、凝集細胞を分散するために細胞検体を含む溶液を攪拌することが提案されている（例えば、特許文献１参照）。特許文献１に記載されている方法では、細胞検体を含む溶液中に、先端にフィルターが設けられた中空体を備えた攪拌装置を浸し、この中空体を回転させることで細胞を含む溶液を攪拌し、これにより細胞群にせん断力を生じさせて細胞を分散させている。次に中空体を溶液中に浸した状態で中空体内部のエアーを吸引する。前記フィルターは、測定対象とする単一細胞は通過できないが、それ以下の大きさの赤血球や細胞片などを通過させることができるサイズの孔（開口）が複数形成されたものであるので、前記吸引によって、赤血球や細胞片を含む溶液がフィルターを通過して中空体内に吸引されるとともに、フィルターを通過することができない細胞がフィルター面に吸着される。そして、中空体内部に吸引された溶液を排出した後に前記細胞が吸着されたフィルター面をスライドガラスに接触させることで、フィルター面に吸着された細胞をスライドガラス上に分布させる。
特開平４－２３２８３４号公報
　しかしながら、特許文献１に記載された方法では、凝集細胞と凝集細胞から分散された細胞とが混在した状態で、中空体の攪拌によるせん断力が加えられる。すなわち、凝集細胞及び分散された細胞の双方にせん断力が作用することになる。このため、分散された細胞にダメージを与える恐れがあった。また、分散された細胞にダメージを与えない程度のせん断力を作用させた場合、凝集細胞の細胞分散効率が下がるという問題点があった。
　本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであり、細胞に与えるダメージを抑えつつ凝集細胞の分散効率を高めることができる細胞分散装置及びこれを備えた試料前処理装置を提供することを目的としている。
　本発明の細胞分散装置は、複数の細胞が凝集した凝集細胞を含む細胞試料液中の当該凝集細胞を単一細胞に分散する装置であって、
　前記単一細胞が通過可能に構成されたフィルター部材と、
　このフィルター部材と所定の間隔をあけて配設され、当該間隔内の凝集細胞を分散する分散部材と、
　この分散部材又は前記フィルター部材を駆動させる駆動源と
　を備えたことを特徴としている。
　また、本発明の試料前処理装置は、前記細胞分散装置と、
　この細胞分散装置で分離された細胞を含む細胞試料液を吸引分注するための吸引分注部と、
　この吸引分注部により分注された細胞試料液から所定の細胞を抽出するためのろ過部と
　を備えたことを特徴としている。
　本発明の細胞分散装置及び試料前処理装置によれば、細胞に与えるダメージを抑えつつ凝集細胞の分散効率を高めることができる。
本発明の一実施の形態に係る細胞分散装置を備えた細胞分析装置の斜視図である。 測定装置の内部構成を示すブロック図である。 試料調製装置の内部構成を示すブロック図である。 データ処理装置の内部構成を示すブロック図である。 主検出部を構成するフローサイトメータの機能ブロック図である。 フローサイトメータの光学系を示す側面図である。 調製デバイス部の流体回路図である。 本発明の細胞分散装置の一実施の形態の斜視説明図である。 図８に示される細胞分散装置の先端部分の断面説明図である。 フィルター部材の平面図である。 分散部材であるローターを上方からみた斜視図である。 分散部材であるローターを下方からみた斜視図である。 弁別・置換部の拡大断面図である。 弁別・置換部のろ過作用を示す説明図である。 細胞分析装置の各制御部が行う処理を示すフローチャートである。 細胞分析装置の各制御部が行う処理を示すフローチャートである。 弁別・置換処理を示すフローチャートである。 （ａ）はローターの他の例の平面説明図であり、（ｂ）は同斜視図である。 分散部材の他の例の斜視図である。
　以下、添付図面を参照しつつ、本発明の細胞分散装置及び試料前処理装置の実施の形態を詳細に説明する。
　〔細胞分析装置の全体構成〕
　まず、本発明の一実施の形態に係る細胞分散装置を備えた細胞分析装置の全体構成について説明し、ついでこの細胞分析装置を構成する各装置ないしは各部について説明する。
　図１は、本発明の一実施の形態に係る細胞分散装置を備えた細胞分析装置１の斜視図である。この細胞分析装置１は、患者から採取した細胞を含む測定試料をフローセルに流し、このフローセルを流れる測定試料にレーザ光を照射し、測定試料からの光（前方散乱光、側方蛍光など）を検出してその光信号を分析することで、細胞に癌細胞が含まれているか否かを判断するのに用いられる。より具体的には、細胞分析装置１は、子宮頸部の上皮細胞を分析対象としており、子宮頸癌をスクリーニングするのに用いられるものである。
　図１に示されるように、細胞分析装置１は、測定試料に対してレーザ光による光学的な測定を行う測定装置２と、被検者から採取された生体試料に洗浄や染色などの前処理を行って、測定装置２に供給する測定試料を作製する試料調製装置３と、測定装置２での測定結果の分析などを行うデータ処理装置４とを備えている。
　〔測定装置の内部構成〕
　図２は、測定装置２の内部構成を示すブロック図である。
　図２に示されるように、この測定装置２は、主検出部６と、信号処理部７と、測定制御部８と、Ｉ／Ｏインタフェース９とを備えている。
　このうち、主検出部６は、測定試料から測定対象細胞やその核の数及びサイズなどを検出するものであり、本実施の形態では、後述する図５及び図６に示されるフローサイトメータ１０が採用されている。
　信号処理部７は、主検出部６からの出力信号に必要な信号処理を行う信号処理回路からなる。また、測定制御部８は、マイクロプロセッサ１１と記憶部１２とを含んでおり、記憶部１２は、ＲＯＭ、ＲＡＭなどからなる。
　記憶部１２のＲＯＭには、主検出部６や信号処理部７の動作制御を行う制御プログラムと、この制御プログラムの実行に必要なデータとが格納されており、マイクロプロセッサ１１は、当該制御プログラムをＲＡＭにロードして、又は、ＲＯＭから直接実行することが可能である。
　測定制御部８のマイクロプロセッサ１１は、Ｉ／Ｏインタフェース９を介して、データ処理装置４と後述する調整制御部１６のマイクロプロセッサ１９に繋がっており、これにより、自身が処理したデータや自身の処理に必要なデータを、データ処理装置４及び調整処理部１６のマイクロプロセッサ１９との間で送受信できるようになっている。
　〔試料調製装置の内部構成〕
　図３は、試料調製装置３の内部構成を示すブロック図である。
　図３に示されるように、この試料調製装置３は、副検出部１４と、信号処理部１５と、調製制御部１６と、Ｉ／Ｏインタフェース１７と、生体試料に対する成分調整を自動的に行うための調製デバイス部１８とを備えている。
　このうち、副検出部１４は、生体試料に含まれる測定対象細胞の細胞数を検出するものであり、本実施の形態では、この副検出部１４についても、図５及び図６に示されるものとほぼ同様のフローサイトメータ１０を採用している。
　信号処理部１５は、副検出部１４からの出力信号に必要な信号処理を行う信号処理回路からなる。調製制御部１６は、マイクロプロセッサ１９と、記憶部２０と、センサドライバ２１と、駆動部ドライバ２２とを含んでおり、記憶部２０は、ＲＯＭ、ＲＡＭなどからなる。
　本実施の形態における調製デバイス部（試料前処理装置）１８は、検体セット部２４と、細胞分散装置としての細胞分散部２５と、吸引分注部としての検体ピペット部２６と、検体定量部２７と、試薬定量部２８と、ろ過部としての弁別・置換部２９とから構成されている。
　このうち、検体セット部２４は、生体試料を収容する複数の生体容器５３や生成物容器５４（図７参照）をセットするためのものである。また、細胞分散部２５は、生体容器５３内の生体試料に含まれる凝集細胞を強制的に分散させて単一細胞にするものであり、その詳細については後述する。
　また、検体ピペット部２６は、細胞が分散された生体試料を生体容器５３から取り出して調製デバイス部１８の流体回路に導入したり、調製された生成物を生成物容器５４に戻したり当該生成物容器５４から取り出したりするものであり、検体定量部２７は、流体回路に供給される生体試料を定量するものである。
　更に、試薬定量部２８は、生体試料に加える染色液などの試薬を定量するものであり、弁別・置換部２９は、生体試料と希釈液とを混合置換するとともに、測定対象細胞とそれ以外の細胞（赤血球、白血球など）や細菌などとを弁別するためのものである。なお、前記各部２４～２９を有する調製デバイス部１８の流体回路の構成（図７）については、後述する。
　記憶部２０のＲＯＭには、副検出部１４、信号処理部１５、センサドライバ２１及び駆動部ドライバ２２の動作制御を行う制御プログラムと、この制御プログラムの実行に必要なデータとが格納されており、マイクロプロセッサ１９は、当該制御プログラムをＲＡＭにロードして、又は、ＲＯＭから直接実行することが可能である。
　調製制御部１６のマイクロプロセッサ１９は、Ｉ／Ｏインタフェース１７を介して前記測定制御部８のマイクロプロセッサ１１に繋がっており、これにより、自身が処理したデータや自身の処理に必要なデータを、測定処理部８のマイクロプロセッサ１１との間で送受信できるようになっている。
　また、調製制御部１６のマイクロプロセッサ１９は、センサドライバ２１と駆動部ドライバ２２を介して、調製デバイス部１８の各部２４～２９のセンサ類や駆動部を構成する駆動モータと繋がっており、センサからの検知信号に基づいて制御プログラムを実行し、駆動部の動作を制御する。
　〔データ処理装置の内部構成〕
　図４は、データ処理装置４の内部構成を示すブロック図である。
　図４に示されるように、本実施の形態におけるデータ処理装置４は、例えばノートＰＣ（デスクトップ型でもよい）などのパーソナルコンピュータからなり、処理本体３１と、表示部３２と、入力部３３とから主に構成されている。
　処理本体３１は、ＣＰＵ３４と、ＲＯＭ３５と、ＲＡＭ３６と、ハードディスク３７と、読出装置３８と、入出力インタフェース３９と、画像出力インタフェース４０とを備えており、これらの各部は内部バスによって通信可能に接続されている。
　ＣＰＵ３４は、ＲＯＭ３５に記憶されているコンピュータプログラムやＲＡＭ３６にロードされたコンピュータプログラムを実行することが可能である。
　ＲＯＭ３５は、マスクＲＯＭ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭなどによって構成され、ＣＰＵ３４に実行されるコンピュータプログラム及びこれに用いるデータなどが格納されている。
　ＲＡＭ３６は、ＳＲＡＭ又はＤＲＡＭなどで構成され、ＲＯＭ３５及びハードディスク３７に記録されている各種のコンピュータプログラムの読み出しや、それらのコンピュータプログラムを実行するときのＣＰＵ３４の作業領域として利用される。
　前記ハードディスク３７には、オペレーティングシステム及びアプリケーションプログラムなど、ＣＰＵ３４に実行させるための種々のコンピュータプログラム及びそのプログラムの実行に用いるデータがインストールされている。
　また、ハードディスク３７には、例えば、米国マイクロソフト社が製造販売するWindows（登録商標）などのグラフィカルユーザインターフェース環境を提供する、オペレーティングシステムがインストールされている。
　更に、ハードディスク３７には、測定制御部８及び調製制御部１６への動作命令の送信、測定装置２で行った測定結果の受信及び分析処理、並びに、処理した分析結果の表示などを行う操作プログラム４１がインストールされている。この操作プログラム４１は、当該オペレーティングシステム上で動作する。
　読出装置３８は、フレキシブルディスクドライブ、ＣＤ－ＲＯＭドライブ、又はＤＶＤ－ＲＯＭドライブなどで構成され、可搬型記録媒体に記録されたコンピュータプログラム又はデータを読み出すことができる。
　入出力インタフェース３９は、例えば、ＵＳＢ、ＩＥＥＥ１３９４、ＲＳ－２３２Ｃなどのシリアルインタフェース、ＳＣＳＩ、ＩＤＥ、ＩＥＥＥ１２８４などのパラレルインタフェース、及びＤ／Ａ変換器、Ａ／Ｄ変換器などからなるアナログインタフェースなどから構成されている。
　入出力インタフェース３９には、キーボード及びマウスからなる入力部３３が接続され、これをユーザが操作することでコンピュータへのデータ入力が可能となっている。
　また、入出力インタフェース３９は、測定装置２のＩ／Ｏインタフェース９とも接続されており、これにより、測定装置２とデータ処理装置４との間でデータの送受信を行うことができる。
　画像出力インタフェース４０は、ＬＣＤ又はＣＲＴなどからなる前記表示部３２に接続されており、ＣＰＵ３４からの画像データに応じた映像信号を表示部３２に出力させるものである。
　〔主検出部（フローサイトメータ）の構成〕
　図５は、主検出部６を構成するフローサイトメータ１０の機能ブロック図であり、図６は、そのフローサイトメータ１０の光学系を示す側面図である。
　図５に示されるように、フローサイトメータ１０のレンズ系４３は、光源である半導体レーザ４４からのレーザ光を、フローセル４５を流れる測定試料に集光するものであり、集光レンズ４６は、測定試料中の細胞の前方散乱光をフォトダイオード４７からなる散乱光検出器に集光するものである。
　図５では、分かり易くするためにレンズ系４３を単一レンズで図示してあるが、このレンズ系４３は、具体的には、例えば図６に示されるような構成になっている。
　すなわち、本実施の形態におけるレンズ系４３は、半導体レーザ４４側（図６の左側）から順に、コリメータレンズ４３ａ、シリンダレンズ系（平凸シリンダレンズ４３ｂ＋両凹シリンダレンズ４３ｃ）及びコンデンサレンズ系（コンデンサレンズ４３ｄ＋コンデンサレンズ４３ｅ）から構成されている。
　図５に戻って、側方用の集光レンズ４８は、測定対象細胞又はこの細胞中の核の側方散乱光と側方蛍光をダイクロイックミラー４９に集光する。このダイクロイックミラー４９は、側方散乱光を散乱光検出器であるフォトマルチプライヤ５０へ反射させ、側方蛍光を蛍光検出器であるフォトマルチプライヤ５１の方へ透過させる。これらの光は、測定試料中の細胞や核の特徴を反映したものとなっている。
　そして、フォトダイオード４７及び各フォトマルチプライヤ５０、５１は、受光した光信号を電気信号に変換して、それぞれ、前方散乱光信号（ＦＳＣ）、側方散乱光信号（ＳＳＣ）及び側方蛍光信号（ＳＦＬ）を出力する。これらの出力信号はプリアンプにより増幅され、測定装置２の信号処理部７（図２参照）に送られる。
　測定装置２の信号処理部７で処理された各信号ＦＳＣ、ＳＳＣ、ＳＦＬは、それぞれ、マイクロプロセッサ１１によってＩ／Ｏインタフェース９からデータ処理装置４に送信される。
　データ処理装置４のＣＰＵ３４は、前記操作プログラム４１を実行することにより、各信号ＦＳＣ、ＳＳＣ、ＳＦＬから細胞や核を分析するためのスキャッタグラムを作成し、このスキャッタグラムに基づいて、測定試料中の細胞が異常であるか否か、具体的には癌化した細胞であるか否かを判定する。
　なお、フローサイトメータ１０の光源としては、半導体レーザ４４の代わりにガスレーザを用いることもできるが、低コスト、小型、且つ低消費電力である点より半導体レーザ４４を採用するのが好ましく、かかる半導体レーザ４４の採用によって製品コストを低減させるとともに、装置の小型化及び省電力化を図ることができる。
　また、本実施の形態では、ビームを狭く絞ることに有利な波長の短い青色半導体レーザを用いている。青色半導体レーザは、ＰＩなどの蛍光励起波長に対しても有効である。なお、半導体レーザのうち、低コスト且つ長寿命であり、メーカーからの供給が安定している赤色半導体レーザを用いてもよい。
　ところで、子宮頸部の上皮細胞の大きさは平均で約６０μｍであり、また核の大きさは５～７μｍである。この細胞が癌化すると細胞分裂の頻度が異常に多くなり、核は１０～１５μｍの大きさとなる。これにより、Ｎ／Ｃ比（核の大きさ／細胞の大きさ）が正常な細胞に比べて大きくなる。
　従って、細胞と核の大きさを検出することによって、細胞が癌化したか否かの判断指標とすることができる。
　そこで、本実施の形態では、フローセル４５を流れる測定試料からの散乱光をフォトダイオード４７で検出するとともに、フローセル４５を流れる測定試料からの蛍光をフォトマルチプライヤ５１で検出する。　測定装置２の信号処理部７は、フォトダイオード４７から出力された散乱光信号から、測定対象細胞の大きさを反映した値である散乱光信号のパルス幅を取得するとともに、フォトマルチプライヤ５１から出力された蛍光信号から、測定対象細胞の核の大きさを反映した値である蛍光信号のパルス幅を取得する。
　そして、前記信号処理部７で得た測定対象細胞の大きさを反映した値と、測定対象細胞の核の大きさを反映した値とに基づいて、当該測定対象細胞が異常であるか否かを、分析部を構成するデータ処理装置４のＣＰＵ３４が判定するようになっている。
　具体的には、データ処理装置４のＣＰＵ３４は、蛍光信号のパルス幅を散乱光信号のパルス幅で除した値が所定の閾値より大きい場合に、測定対象細胞が異常であると判定する。
　〔副検出部の構成〕
　試料調製装置３の副検出部１４は、試料調製を行う前処理工程において、生体試料から測定対象細胞の数を検出するものであり、本実施の形態では、図５及び図６に例示したものとほぼ同じ構成のフローサイトメータ１０を採用している。
　もっとも、本実施の形態における試料調製装置３は、測定装置２による本測定の前に測定対象細胞の濃度測定を予備的に行うものであるので、副検出部１４では、その細胞数を計数するための信号を出力できれば足りる。
　このため、副検出部１４を構成するフローサイトメータ１０の場合には、前方散乱光信号（ＦＳＣ）を取得できれば足りるので、側方散乱光信号（ＳＳＣ）や側方蛍光信号（ＳＦＬ）を取得するためのフォトマルチプライヤ５０、５１がなく、ＦＳＣを取得するためのフォトダイオード４７のみを有している。
　そして、かかる副検出部１４のフォトダイオード４７が受光した光信号は、電気信号に変換されて増幅され、試料調製装置３の信号処理部１５（図３参照）に送られる。
　試料調製装置３の信号処理部１５で処理された信号ＦＳＣは、調製制御部１６に送られる。この調製制御部１６のマイクロプロセッサ１９は、信号ＦＳＣに基づいて測定対象細胞の数をカウントする。
　また、マイクロプロセッサ１９は、濃度測定のために検体ピペット部２６で予備的に採取した生体試料の容積を、当該ピペット部２６に設けられた流量センサから取得しており、信号ＦＳＣから得た細胞数をその容積で割ることにより、生体試料の濃度を算出する。
　もっとも、必ずしも生体試料の濃度自体を算出する必要はなく、生体試料の採取量を常に一定に保持する場合には、細胞数自体が当該濃度を反映した情報になる。すなわち、調製制御部１６のマイクロプロセッサ１９が生成する濃度情報は、生体試料の濃度が含まれるのは勿論、この濃度と実質的に等価の他の情報であってもよい。
　そして、調製制御部１６のマイクロプロセッサ１９は、自身が生成した前記濃度情報に基づいて、前記調製デバイス部１８が生体試料に対して行う調製動作（生体試料や試薬の定量などの動作）を制御するための制御指令を発する。なお、この制御の具体的な内容については後述する。
　〔調製デバイス部の流体回路〕
　図７は、前記調製デバイス部１８の流体回路図である。
　図７に示されるように、検体セット部２４は、円形の回転テーブル２４Ａと、これを回転駆動する駆動部２４Ｂとを備え、回転テーブル２４Ａの外周縁部には、生体試料を収容する生体容器５３と、生体試料を調製した後の生成物を収容する生成物容器（マイクロチューブ）５４とをセット可能な保持部が設けられている。
　細胞分散部２５は、フィルター部材であるフィルター１０１と、このフィルター１０１と所定の間隔をあけて配設された分散部材であるローター１０２と、このローター１０２を回転駆動させる駆動源であるモータ１０３とを備えており、モータ１０３の出力軸に連結された回転軸１０４を介して前記ローター１０２が回転駆動される。前記フィルター１０１及びローター１０２の外側にはガイド用筒体であるパイプ１０５が設けられており、これらを生体容器５３内に挿入してローター１０２を回転させることにより、生体容器５３内の生体試料が攪拌されて、当該生体試料に含まれる凝集細胞が単一細胞に分散される。なお、この細胞分散部２５の具体的構成を含む詳細については後述する。
　検体ピペット部２６は、生体容器５３内の生体試料や生成物容器５４内の測定試料を吸引して、その試料を検体定量部２７に供給するための第１ピペット２６Ａと、調製デバイス部１８において所定の処理を行った後の生成物を生成物容器５４に戻すための第２ピペット２６Ｂとを備えている。
　第２ピペット２６Ｂは、後述する弁別・置換部２９の収容容器５７と管路で繋がっており、弁別・置換部２９で測定対象細胞が弁別された液体を、第２ピペット部２６Ｂによって生成物容器５４に戻すことができる。
　検体定量部２７は、定量シリンダ２７Ａと、このシリンダ２７Ａに挿し通された定量ピストンを上下動させる駆動部２７Ｂとを備えている。定量シリンダ２７Ａは、方向切替バルブＶ１を介して第１ピペット２６Ａと管路で繋がっている。
　第１ピペット２６Ａで生体容器５３から吸引された生体試料は、方向切替バルブＶ１を通じて定量シリンダ２７Ａに導入される。この導入された生体試料は、駆動部２７Ｂによる定量ピストンの移動によって方向切替バルブＶ１を通じて次の弁別・置換部２９に送られる。
　なお、本実施の形態では、検体定量部２７の定量シリンダ２７Ａは、生体試料に対する希釈液を調製する希釈液ユニット５５とも管路で繋がっている。
　試薬定量部２８は、一対の定量シリンダ２８Ａ、２８Ｂと、この各シリンダ２８Ａ、２８Ｂにそれぞれ挿し通された定量ピストンを上下動させる駆動部２８Ｃとを備えている。各定量シリンダ２８Ａ、２８Ｂは、それぞれ供給切替バルブＶ２、Ｖ３を介して第２ピペット２６Ｂと管路で繋がっている。
　試薬容器内の試薬は、各定量シリンダ２８Ａ、２８Ｂに供給される。供給された試薬は、駆動部２８Ｃによる定量ピストンの移動によって所定分量だけ定量され、定量された試薬は、供給切替バルブＶ２、Ｖ３を通じて第２ピペット２６Ｂに送られる。
　このため、検体セット部２４の生成物容器５４に戻される弁別済みの試料に対して、試薬定量部２８が定量した複数種類の所定分量の試薬を、それぞれ混合できるようになっている。
　本実施形の形態では、試薬定量部２８の各定量シリンダ２８Ａ、２８Ｂで定量される試薬は２種類ある。このうち、一方の定量シリンダ２８Ａで計量して生体試料に加える試薬は、ＰＩ染色を行うための染料液であり、他方の定量シリンダ２８Ｂで計量して生体試料に加える試薬は、細胞にＲＮＡ処理を行うためのＲＮａｓｅである。ＰＩ染色は、色素を含んでいる蛍光染色液であるヨウ化プロピジウム（ＰＩ）により行われる。ＰＩ染色では核に選択的に染色が施されるため、核からの蛍光が検出可能となる。また、ＲＮＡ処理とは、細胞中のＲＮＡを溶かすための処理である。染料液は、上皮細胞のＲＮＡとＤＮＡの両方を染色してしまうので、前記ＲＮＡ処理を行うことでＲＮＡが溶け染料液によって染まらなくなるので、細胞核のＤＮＡを正確に測定することが可能となる。
　弁別・置換部２９は、上方開口状の収容容器５７と、この収容容器５７に上下動自在に可動可能に設けられた濾過シリンダ５８と、この濾過シリンダ５８を収容容器５７内で上下動させる駆動部５９とを備えている。
　収容容器５７は、方向切替バルブＶ１、Ｖ７、Ｖ４を介して検体定量部２７の定量シリンダ２７Ａと管路で繋がっている。このため、検体定量部２７で定量された生体試料は、方向切替バルブＶ１、Ｖ７、Ｖ４を通じて収容容器５７に供給され、この容器５７の内部にいったん保持することができる。
　また、収容容器５７は、方向切替バルブＶ４を介して前記第２ピペット２６Ｂと管路で繋がっており、弁別済みの収容容器５７内の生体試料は、方向切替バルブＶ４から第２ピペット２６Ｂに送られる。
　更に、方向切替バルブＶ４と第２ピペット２６Ｂまでの管路部分には、前記副検出部１４のフローセル４５が介在されている。このため、副検出部１４は、収容容器５７から排出される弁別済みの生体試料に対して、細胞数の計数を行うことができる。
　濾過シリンダ５８は、測定対象細胞（上皮細胞）は通過させず、且つ、それより小径の細胞（赤血球、白血球など）は通過させるフィルター６０を下部に備えた中空筒体からなり、この濾過シリンダ５８は、切替バルブＶ５を介して希釈液ユニット５５に管路で繋がっている。
　このため、希釈液ユニット５５の希釈液は、切替バルブＶ５を開放することで濾過シリンダ５８の内部に供給することができる。
　弁別・置換部２９の駆動部５９は、生体試料と希釈液の混合液が入った収容容器５７に対して、前記濾過シリンダ５８を下方に移動させ、濾過シリンダ５８のフィルター６０が収容容器５７内の混合液体中を下方に移動する。これにより、測定対象細胞のみを含む液体が残液としてフィルター６０の下方に残るとともに、その他の細胞や夾雑物を含む液体が濾液としてフィルター６０の上方（濾過シリンダ５８の内部）に残る。
　また、濾過シリンダ５８は、切替バルブＶ６介して濾液の廃棄部６１に管路で繋がっている。このため、濾過シリンダ５８の下降で濾過された濾液は、切替バルブＶ６を通じて外部に廃棄される。
　一方、濾過シリンダ５８内の残液は、前記濾液の廃棄が済んだ後に、方向切替バルブＶ４を通じて副検出部１４のフローセル４５に送られ、検体ピペット部２６の第２ピペット２６Ｂに送られる。
　なお、濾過後の残液が生体試料の濃度測定用のものである場合は、第２ピペット２６Ｂから外部に排出され、同残液が測定試料の調製用のものである場合は、第２ピペット２６Ｂから生成物容器５４に戻される。
　図７に示されるように、検体定量部２７の定量シリンダ２７Ａは、方向切替バルブＶ１、Ｖ７を介して測定装置２の主検出部６にも管路で繋がっている。
　そして、生成物容器５４内の測定試料については、第１ピペット２６Ａを介して検体定量部２７で定量され、前記バルブＶ１、Ｖ７を通じて測定装置２の主検出部６に供給されるようになっている。
　なお、図７に示される各部の駆動部や切替弁（電磁弁）Ｖ１～Ｖ７に対する動作制御は、前記調製制御部１６（マイクロプロセッサ１９）からの制御指令に基づいて行われる。また、この調製制御部１６が行う前処理工程については後述する。
　〔細胞分散部の具体的構成〕
　図８は、細胞分散部２５のより具体的な構成を示す斜視説明図であり、図９は、この細胞分散部２５の先端部分の断面説明図である。
　図８～９に示されるように、本実施の形態における細胞分散部２５は、フィルター１０１と、このフィルター１０１と所定の間隔をあけて配設されたローター１０２と、このローター１０２を回転駆動させるモータ１０３とを備えており、前記フィルター１０１とローター１０２の外側には、生体試料の流れをガイドする機能を有するパイプ１０５が配設されている。
　フィルター１０１は耐薬品性や強度などを考慮してステンレスで作製されており、図１０に示されるように厚さ１００μｍ程度の円形の膜状体からなっている。フィルター１０１は、単一細胞が通過可能な大きさの孔１０１Ａが、その周縁部１０１Ｂを除いて多数穿設されている。本実施の形態における測定対象細胞は子宮頸部の上皮細胞（通常、２０～８０μｍ程度の大きさであり、大部分は６０μｍ程度の大きさである）であるので、フィルター１０１の孔１０１Ａの孔径は１００μｍにされており、また開口率は４０％にされている。このフィルター１０１は、レーザスポット溶接によって前記パイプ１０５の内周面の所定箇所に固着されている。
フィルター１０１の孔１０１Ａの孔径を８０～１２０μｍに設定したのは、８０μｍ未満であれば、測定対象の単一細胞がフィルター１０１を通過できず、単一細胞がせん断力によりダメージを受けることがあり、１２０μｍを超えると凝集細胞がフィルター１０１を通過し、凝集細胞の細胞分散効率を下げることがある。なお、孔１０１Ａの孔径は、１００μｍ前後がより好ましい。
　ローター１０２も前記フィルター１０１と同じく耐薬品性や強度などを考慮してステンレスで作製されており、図１１～１２に示されるように、直径約７ｍｍ、厚さ（高さ）約５ｍｍの円筒体からなっている。ローター１０２の中心には穴部１０２Ａが形成されており、この穴部１０２Ａに、一端が前記モータ１０３の出力軸１０３Ａに連結された回転軸１０４の他端が圧入されている。また、前記穴部１０２Ａの周りには、ローター１０２の上面１０２Ｂ（図８～９において上側の面）から下面１０２Ｃへ貫通する４つの流路１０２Ｄが周方向において等間隔で形成されている。貫通孔からなる流路の孔径は２ｍｍ程度である。
　ローター１０２の上面１０２Ｂには、各流路１０２Ｄに対応してフィン１０６が設けられている。それぞれのフィン１０６は、平板体を途中で折り曲げた形状の部材であり、その短辺部１０６Ａはローター１０２の上面１０２Ｂに形成された溝１０７内に圧入されている。溝１０７は、前記穴部１０２Ａを中心として半径方向外向きに形成されている。フィン１０６の長辺部１０６Ｂはローター１０２の上面１０２Ｂに対して傾斜した面を構成しており、また、その一部が流路１０２Ｄの開口部を望むように、ないしは流路１０２Ｄの開口部を覆うように前記溝の位置が設定されている。これにより、ローター１０２が回転したときに、フィン１０６の長辺部１０６Ｂの下面１０６Ｂ１に当たった生体試料が流路１０２Ｄ内に導入されて、当該生体試料の流れが形成されるようになっている。長辺部１０６Ｂの角部１０６Ｂ２は、細胞に与えるダメージを小さくするために曲面加工又は面取り加工が施されている。
　ローター１０２の下面１０２Ｃには、十字状の突出部１０８Ａからなる突部１０８が形成されている。各流路１０２Ｄは隣接する突出部１０８Ａ間に開口している。この突出部１０８Ａの突出高さは、分散させる凝集細胞の大きさにより異なるが、通常、１００～３００μｍの範囲である。かかる突部１０８を形成することにより凝集細胞を確実に分散させることができる。また、図示していないが、突出部１０８Ａの角部も前記長辺部１０６Ｂの角部１０６Ｂ２と同様、細胞に与えるダメージを小さくするために曲面加工又は面取り加工が施されている。
　ローター１０２の下面１０２Ｃに形成された突出部１０８Ａの先端面１０８Ａ１（図８～９において下面）と、フィルター１０１の上面との間には３０～８０μｍの間隔（クリアランス）ＣＬ１が設けられている。この間隔ＣＬ１を設けることによって、凝集細胞に効果的にせん断力又は分散力を与えることができる。すなわち、本実施の形態において測定対象とする子宮頸部の上皮細胞の大きさは平均６０μｍであり、これが凝集すると１２０μｍを超える大きさになる。また、本実施の形態におけるフィルター１０１の孔径は１００μｍである。単一の上皮細胞の場合はフィルター１０１の孔１０１Ａを通過することができるが、凝集細胞は通過することができず当該フィルター１０１の孔１０１Ａに捕捉される。このとき、前記間隔ＣＬ１が、凝集細胞の大きさよりも小さい値であると、孔１０１Ａに捕捉されている凝集細胞に対して確実にせん断力又は分散力を与えて、凝集細胞を確実に分散させることができる。
　間隔ＣＬ１を３０～８０μｍに設定したのは、３０μｍ未満であれば、細胞が破砕されることがあり、８０μｍを超えると凝集細胞に与える分散力が低下してしまうことがある。なお、間隔ＣＬ１は、５０μｍ前後がより好ましい。
　モータ１０３は支持ブラケット１０９の上部部材１０９Ａに固定されており、その出力軸１０３Ａが上部部材１０９Ａに形成された孔より下方に突出している。そして、この出力軸１０３Ａに前記回転軸１０４の一端が連結され、また、回転軸１０４の他端が前記ローター１０２に連結されている。これにより、モータ１０３を回転駆動させることで、ローター１０２を回転させることができる。
　パイプ１０５は、外径が１０ｍｍ程度であり、肉厚が１．５ｍｍ程度のステンレス製の円形パイプからなり、その一端が前記支持ブラケット１０９の下部部材１０９Ｂの下面に設けられた中空体１１０に接続されている。パイプ１０５の他端（先端側端部）には、先端に向かって断面積が徐々に減少するテーパ部１０５Ａが形成されている。このテーパ部１０５Ａの先端の孔１０５Ｂの孔径は約２．５ｍｍである。前記ローター１０２は、その外周面１０２Ｅがパイプ１０５の内周面１０５Ｄに近接するように配設されており、外周面１０２Ｅと内周面１０５Ｄとの間隔ＣＬ２は約１００μｍにされている。
　前記ローター１０２が配置される位置よりもやや上方のパイプ周壁には長孔形状の開口部１０５Ｃが２つ形成されている。この２つの開口部１０５Ｃは、パイプ１０５の芯を中心として対向する位置に形成されている。後述するように、パイプ１０５外部の生体試料は、この開口部１０５Ｃを通ってパイプ１０５内に導入される。
　次に前記構成を備えた細胞分散部２５の作用について説明する。
　パイプ１０５を生体容器５３内の生体試料に浸した状態でモータ１０３を回転させると、このモータ１０３の出力軸１０３Ａに回転軸１０４を介して接続されているローター１０２が回転する。モータ１０３の回転数は、本発明において特に限定されるものではないが、概ね２０００～２００００ｒｐｍである。生体試料やローター１０２の形状などにより好適な回転数は異なるが、回転数が小さすぎると凝集細胞を十分に分散させることができず、一方、回転数が大きすぎると細胞が破砕されることがある。また、１回の処理操作（分散操作）に必要なモータ１０３の回転時間は生体試料の種類や量、回転数などにより異なるが、通常、２０～３００秒である。更に、隅部によどんでいる凝集細胞を攪拌したり、又は、フィン１０６などに絡み付いている凝集細胞を開放したりするために、定期的にモータ１０３に逆転動作をさせるのが好ましい。具体的に、子宮頸部の上皮細胞を測定対象とする本実施の形態では、例えば、正転１８秒、反転２秒というサイクルを３サイクル繰り返すことで、凝集細胞を十分に分散させることができる。
　ローター１０２が回転すると、このローター１０２と一体的に設けられているフィン１０６も回転する。フィン１０６は、図１１に示されるように、ローター１０２の正転方向に長辺部１０６Ｂが傾斜しているので、当該フィン１０６の回転によって生体試料がローター１０２の流路１０２Ｄ内に導入される。
　流路１０２Ｄ内に導入された生体試料は、当該流路１０２Ｄの下部開口部よりフィルター１０１に向けて噴出される。噴出された生体試料には、単一の上皮細胞と、複数の単一上皮細胞が凝集した凝集細胞が含まれているが、このうち単一細胞はフィルター１０１の孔１０１を通過して、パイプ１０５の先端の孔１０５Ｂから当該パイプ１０５の外側に噴出される。その際、本実施の形態では、パイプ１０５の先端部が先端に向かって縮径されたテーパ部１０５Ａであるので、フィルター１０１を通過した生体試料は当該テーパ部１０５Ａで加速されてパイプ１０５の先端から外部に噴出される。
　一方、凝集細胞はフィルター１０１の孔１０１Ａに捕捉されるのでフィルター１０１を通過することができず、当該フィルター１０１とローター１０２との間において、ローター１０２の回転により生じる生体試料の流れ、及びローター１０２の下面に形成された突部１０８との接触によって、分散力を付与されて単一細胞に分散する。そして、分散された単一細胞はフィルター１０１の孔１０１を通過して、パイプ１０５の先端の孔１０５Ｂからパイプ１０５の外側に噴出される。
　本実施の形態では、ローター１０２と一体的に設けられたフィン１０６によって、ローター１０２からフィルター１０１へ向かう流れを形成している。これにより、ローター１０２とフィルター１０１との間で凝集細胞から分散された単一細胞をより効率的にフィルター１０１の下方へ排出することができる。
　さらに、本実施の形態では、ローター１０２とフィルター１０１の外側に、その周壁に開口を有するパイプ１０５を配設して、ローター１０２とフィルター１０１との間に閉鎖的な空間を形成している。このため、前記フィン１０６により形成された生体試料の流れは、ローター１０２の流路１０２Ｄ、フィルター１０１、パイプ１０５先端の孔１０５Ｂ、パイプ１０５の外部、パイプ１０５の開口部１０５Ｃ、そしてローター１０２の流路１０２Ｄへと戻る循環流となり、このような生体試料の流れを形成することによって、生体容器５３内の生体試料中の凝集細胞を効率よく分散させることができる。
　以上の細胞分散部２５を用いて被験者の子宮頸部から採取した細胞の分散処理を行い、その分散効果を確認した。
　細胞を染色する染料として、ナカライテスク株式会社製の０．５％－トリパンブルー染色液（商品コード：２９８５３－３４）を用い、この染色液をＰＢＳ液で希釈した（ＰＢＳ液：０．５％－トリパンブルー染色液＝１：４）。
　試料（ＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ（ＣＹＴＹＣ）保存検体原液）０．３ｍｌと、前記希釈したトリパンブルー染色液０．３ｍｌとを混合したものに、前述した細胞分散部２５を用いて６０秒間分散処理を行った。モータの回転数は１００００ｒｐｍであり、正転１８秒、逆転２秒を１サイクルとして、３サイクル繰り返した。
　分散処理後、ＭＰＣ－２００（商品名。松浪硝子工業株式会社製のプランクトン計算盤）に試料３００μｌを添加して１０分間室温にて静置した後、顕微鏡下で２００マス（０．０５ｍｌ相当）にある細胞の数（単一細胞として分類されたもの）を計数した。
　以上の操作を３回繰り返した（検体１～３）。また、分散処理を施さなかった試料についても同様にして単一細胞の数を計数した。結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１より分かるように、分散処理を行うことにより単一細胞の数が増加している。
　〔弁別・置換部の具体的構成〕
　図１３は、弁別・置換部２９のより具体的な構成を示す拡大断面図であり、図１４は、その濾過作用を示す説明図である。
　図１３に示されるように、本実施の形態における弁別・置換部２９は、生体試料を含む液体Ｌを収容可能な収容容器５７と、生体試料中の第１細胞Ｃ１を通過させず且つ第１細胞Ｃ１よりも小径の第２細胞Ｃ２を通過させるフィルター６０とを備えている。
　また、弁別・置換部２９は、前記フィルター６０に液体Ｌを通過させることにより、第１細胞Ｃ１を含む第１液体Ｌ１と、第２細胞Ｃ２を含む第２液体Ｌ２とに液体Ｌを分離する液体分離部として機能する濾過シリンダ５８を備えている。
　収容容器５７は、上下方向に向く軸心を有する中空の胴体部５７Ａと、この胴体部５７Ａの下部に連結され、且つ、中央部が下方に凹んだ内面を有する底部５７Ｂとを一体に有している。
　一方、濾過シリンダ５８は、収容容器５７内にシール部材６２を介して上下動自在に可動可能に設けられた中空筒状のシリンダ６３と、このシリンダ６３の下端開口を閉塞するように設けられた前記フィルター６０とを備えている。
　本実施の形態では、第１細胞Ｃ１として子宮頸部の上皮細胞を想定しており、この上皮細胞の大きさは概ね２０～８０μｍ（平均は６０μｍ程度）である。また、第１細胞Ｃ１より小さい第２細胞Ｃ２である赤血球の大きさは、概ね７～１０μｍであり、同じく第２細胞Ｃ２である白血球の大きさは、概ね８～１５μｍである。更に、第２細胞Ｃ２である細菌などの夾雑物の大きさは、概ね１～数μｍ程度である。
　そこで、本実施の形態では、前記フィルター６０として、１０～２０μｍの径の通孔を有する金属製のＣＶＤ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｖａｐｏｒ Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ：化学気相成長法）フィルターを採用している。かかる金属製のＣＶＤフィルターは、その他の樹脂製のフィルターや、金属製であってもメッシュ製のものに比べて通孔の変形が少なく、開口率を高められるという利点がある。
　また、フィルター６０の孔径を１０～２０μｍに設定したのは、１０μｍ未満であれば、細胞や夾雑物が通孔に早期に詰まる現象が多く見られ、２０μｍを超えると上皮細胞が通過してしまうことが多くなるからである。なお、フィルター６０の孔径は、１５μｍ前後がより好ましい。
　収容容器５７の底部５７Ｂには、定量済みの生体試料の導入と濾過後の残液Ｌ１を外部に排出して取得するための残液管路６４が接続され、この管路６４には前記方向切替バルブＶ４が設けられている。従って、この残液管路６４と方向切替バルブＶ４は、液体分離部である濾過シリンダ５８によって分離された第１液体Ｌ１を取得するための液体取得部を構成している。
　また、シリンダ６３の上壁部には、希釈液ユニット５５に通じる希釈液管路６５が接続され、この管路６５の中途部に前記切替バルブＶ５が設けられている。
　更に、シリンダ６３の上壁部には、濾過後の濾液Ｌ２を外部に廃棄するための、廃棄部６１に通じる濾液管路６６が接続され、この管路６６には前記切替バルブＶ６が設けられている。従って、この濾液管路６６と切替バルブＶ６は、液体分離部である濾過シリンダ５８によって分離された第２液体Ｃ２を外部に排出するための液体排出部を構成している。
　シリンダ６３の上端部には、モータなどからなる前記駆動部５９の回転運動をシリンダ６３の上下方向移動に変換する移動機構部６７が接続されている。
　この移動機構部６７の駆動部５９は、調製制御部１６（マイクロプロセッサ１９）からの制御指令に従って濾過シリンダ５８を駆動する。
　例えば、調製制御部１６は、図９（ａ）に示されるように、フィルター６０が収容容器５７内の液体Ｌ（生体試料と希釈液の混合液）の液面上方からその液中に向かって下方に移動するように、濾過シリンダ５８を下降させる。
　すると、図９（ｂ）に示されるように、内部に含まれる細胞の殆どが第１細胞（上皮細胞）Ｃ１である液体が、残液Ｌ１として収容容器５７内のフィルター６０の下方に残り、その他の第２細胞Ｃ２（赤血球、白血球及び細菌等の夾雑物）を含む液体が、濾液Ｌ２としてフィルター６０の上方（濾過シリンダ５８の内部）に残る。
　そこで、調製制御部１６は、液体Ｌ内に向かって移動済みのフィルター６０が所定距離だけ上方に戻るように移動機構部６５の駆動部５９を制御する。
　具体的には、調製制御部１６は、フィルター６０が底部５７Ｂ又はその近傍に設定された下降限度に至るまで濾過シリンダ５８を下降させてから、フィルター６０が所定距離だけ上方に戻るように移動機構部６７を制御し、この上方への戻りにより、フィルター６０の下面に付着した第１細胞Ｃ１をフィルター６０から離脱させることができる。
　そして、調製制御部１６は、先に切替バルブＶ６を開放することで、図９（ｃ）に示されるように、残液Ｌ１より先に濾液Ｌ２を外部に排出させ、その後に、残液Ｌ１を取得するために方向切替バルブＶ４を開放させる。
　〔分析処理の内容〕
　図１５及び図１６は、細胞分析装置１の各制御部８、１６、３１が行う処理を示すフローチャートである。
　なお、図１５では、データ処理装置４の制御部（処理本体）３１が行う処理フローを右列に示し、測定装置２の制御部８が行う処理フローを左列に示している。また、図１６では、試料調製装置３の制御部１６が行う処理フローを一列に示しているが、この処理フローは、図示のＡ、Ｂ及びＣ点において図１５の処理フローと繋がっている。以下、この図１５及び図１６を参照しつつ、細胞分析装置１が行う処理内容を説明する。
　まず、最初に、データ処理装置４の制御部３１は、前記表示部３２にメニュー画面を表示させる（ステップＳ１）。その後、このメニュー画面に従った測定開始指示を入力部３３から受け付けると（ステップＳ２）、データ処理装置４の制御部３１は、測定開始信号を測定装置２に送信する（ステップＳ３）。
　測定装置２の制御部８は、前記測定開始信号を受信すると（ステップＳ４）、調製開始信号を試料調製装置３に送信する（ステップＳ５及びＡ点）。
　試料調製装置３の制御部１６は、前記調製開始信号を受信すると（ステップＳ６）、測定試料の調製に用いられる試薬（染色液、ＲＮａｓｅ）を装置内の流路に吸引するとともに、生体試料と、アルコール主成分の保存液とが収容された生体容器５３内の生体試料を細胞分散部２５で分散させる（ステップＳ７、Ｓ８）。この生体試料の分散は、図８～１２を用いて説明をした実施の形態に係る細胞分散部２５では、次のようにして行なわれる。すなわち、制御部１６によりモータ１０３を回転駆動させると、このモータ１０３の回転によってローター１０２及びこのローター１０２と一体的に設けられているフィン１０６が回転する。フィン１０６の回転によって生体試料がローター１０２の流路１０２Ｄ内に導入され、流路１０２Ｄの下部開口部よりフィルター１０１に向けて噴出される。そして、噴出された生体試料中の単一細胞はフィルター１０１の孔１０１を通過して、パイプ１０５の先端の孔１０５Ｂからパイプ１０５の外側に噴出される。一方、凝集細胞はフィルター１０１の孔１０１Ａに捕捉されるのでフィルター１０１を通過することができず、当該フィルター１０１とローター１０２との間において、ローター１０２の回転により生じる生体試料の流れ、及びローター１０２の下面に形成された突部１０８との接触によって、分散力を付与されて単一細胞に分散する。そして、分散された単一細胞はフィルター１０１の孔１０１を通過して、パイプ１０５の先端の孔１０５Ｂからパイプ１０５の外側に噴出される。以上の操作が所定時間行なわれることで、細胞分散部２５において生体試料中の凝集細胞が単一細胞に分散処理される。
　その後、試料調製装置３の制御部１６は、分散済みの生体試料を生体容器５３から装置内の流路に所定量だけ吸引させて（ステップＳ９）、弁別・置換部２９の収容容器５７に送り、その弁別・置換部２９に、生体試料に対する弁別・置換処理を行わせる（ステップＳ１０）。
　〔弁別・置換処理の内容〕
　図１７は、前記弁別・置換処理を示すフローチャートである。
　図１７に示されるように、まず、試料調製装置３の制御部１６は、生体試料が入っている収容容器５７に希釈液を混合させ（ステップＴ１）、シリンダ６３をその下限位置まで下降させる（ステップＴ２）。
　このシリンダ６３の下降により、前述した通り、収容容器５７内の液体Ｌが、測定対象である第１細胞Ｃ１を含む所定量の残液Ｌ１と、これ以外の細胞Ｃ２を含む濾液Ｌ２とに弁別される。
　その後、試料調製装置３の制御部１６は、シリンダ６３の下限位置の到達時点に、シリンダ６３を所定距離だけ上昇させ（ステップＴ３）、これによってフィルター６０の下面に付着している第１細胞（上皮細胞）Ｃ１を、当該フィルター６０の下方の濃縮液Ｌ１に浮遊させる。
　従って、この処理（ステップＴ３）におけるシリンダ６３の上昇移動は、第１細胞Ｃ１をフィルター６０から物理的に離脱できる程度の速度及びストロークであればよく、その移動回数は複数回であってもよい。
　前記処理の後、試料調製装置３の制御部１６は、フィルター６０の上方にある濾液Ｌ２を外部に排出させてから（ステップＴ４）、シリンダ６３を初期位置まで上昇させ（ステップＴ５）、シリンダ６３の下降が２回目か否かを判定する（ステップＴ６）。
　試料調製装置３の制御部１６は、シリンダ６３の下降が２回目でない場合には、希釈液の混合から再度濾過を繰り返し、２回目である場合には、当該弁別・置換処理の処理ルーチンを終了する。なお、この弁別・置換動作は２回に限られず、２回より多い回数行われてもよい。
　図１６に戻って、前記弁別・置換処理（ステップＳ１０）が終了すると、試料調製装置３の制御部１６は、副検出部１４のフローセル４５に濃縮液（殆どが上皮細胞である残液Ｌ１）を送液し（ステップＳ１１）、この副検出部１４を用いて、フローサイトメトリー法によって濃縮液Ｌ１のプレ測定を行う（ステップＳ１２）。
　このプレ測定は、癌判定ために測定装置２が行う本測定の前に、生体試料に含まれる測定対象細胞（上皮細胞）Ｃ１の濃度を反映した濃度情報を得るためのものであり、例えば、濃縮液Ｌ１に含まれる細胞Ｃ１の細胞数を検出することによって行われる。
　〔濃度情報の利用〕
　次に、試料調製装置３の制御部１６は、濃縮液Ｌ１を流体回路外に排出して（ステップＳ１３）、生体試料の濃度を算出するとともに（ステップＳ１４）、この濃度情報に基づいて、本測定のための測定試料を調製するための、生体試料の試料吸引量を決定する（ステップＳ１５）。
　例えば、プレ測定に用いた生体試料の吸引量が２００μｌであり、プレ測定の結果で判明した細胞Ｃ１の個数が１万個であるとすると、生体試料の濃度は、１００００個／２００μｌ＝５０（個／μｌ）＝５００００（個／ｍｌ）となる。
　一方、本測定における癌細胞検出のために必要な有意細胞数が、例えば、１０万個であるとすると、この有意細胞数が確保される程度に本測定を行うために必要な生体試料の採取料は、１０万個／５００００（個／ｍｌ）＝２ｍｌとして演算することができる。
　そこで、試料調製装置３の制御部１６は、前記の必要量だけ生体容器５３から生体試料を吸引し（ステップＳ１６）、この生体試料に対して、前記した弁別・置換処理を再度実施する（ステップＳ１７）。
　このように、試料調製装置３の制御部１６は、自身が生成した細胞Ｃ１の濃度情報に基づいて、本測定に使用する測定試料の調製のための生体試料の量を決定し、決定された量の生体試料を取得するように試料調製装置３の調製デバイス部１８を制御する。
　この場合、試料調製装置３の制御部１６は、生体試料中の細胞Ｃ１の濃度が低いほど、測定試料の調製に用いられる生体試料の量を多めに決定し、生体試料中の細胞Ｃ１の濃度が高いほど、測定試料の調製に用いられる生体試料の量を少なめに決定することになる。
　なお、試料調製装置３の制御部１６において、主検出部３４により検出される細胞Ｃ１の数は、癌検出のための有意細胞数である前記１０万個に限定されるものではなく、例えば、１０万個～１５万個といった所定範囲内に収まるように、測定試料の調製に用いる生体試料の量を決定することにしてもよい。
　更に、試料調製装置３の制御部１６において、自身で生成した細胞Ｃ１の濃度情報に基づいて、生体試料の量だけでなく、測定試料の調製のための試薬の量も決定し、その決定された量の試薬を取得するように試料調製装置３の調製デバイス部１８を制御することもできる。
　また、試料調製装置３の制御部１６において、自身で生成した細胞Ｃ１の濃度情報に基づいて、生体試料中の細胞Ｃ１の数と試薬（例えば、染色液）の量との比率が所定範囲内となるように、生体試料及び試薬のうちの少なくとも一方の量を決定し、その決定された量の生体試料又は試薬を取得するように試料調製装置３の調製デバイス部１８を制御することもできる。
　〔測定試料の調製〕
　次に、試料調製装置３の制御部１６は、前記２回目の弁別・置換処理で得られた濃縮液Ｌ１を生成物容器（マイクロチューブ）５４に供給するとともに（ステップＳ１８）、装置内に貯留されていた染色液とＲＮａｓｅとを、試薬定量部２８から生成物容器５４に供給し（ステップＳ１９）、この生成物容器５４内においてＤＮＡ染色とＲＮＡ処理を行わせて測定試料を作製する（ステップＳ２０）。
　前記処理が終わると、試料調製装置３の制御部１６は、得られた測定試料を測定装置２の主検出部６に送液する（ステップＳ２１及びＢ点）。
　なお、試料調製装置３の制御部１６は、測定装置２からのシャットダウン信号を受信したか否かを常時判定しており（ステップＳ２２及びＣ点）、その信号を受信していない場合には、調製開始信号の受信如何を判定するステップＳ６に戻り、その信号を受信した場合には、シャットダウンを実行して試料調製処理を終了する（ステップＳ２３）。
　〔測定装置による本測定とそのデータ分析〕
　図１５に戻って、測定装置２の制御部８は、調製開始信号を送信した後、試料調製装置３から測定試料の供給があるか否かを常時判定している（ステップＳ２４）。
　そこで、試料調製装置３から測定試料が送液されると（Ｂ点）、測定装置２の制御部８は、その測定試料を本測定部１４のフローセル４５に送り、測定試料の細胞Ｃ１に対する前記本測定を行い（ステップＳ２５）、その測定データをデータ処理装置４に送信する（ステップＳ２６）。
　一方、データ処理装置４の制御部３１は、測定開始信号を送信した後、測定装置２から測定データを受信したか否かを常時判定している（ステップＳ２７）。
　測定装置２から前記測定データを受信すると、データ処理装置４の制御部３１は、その測定データを用いて細胞や核を分析し、測定試料中の細胞が癌化しているか否かなどを判定する（ステップＳ２８）。
　また、データ処理装置４の制御部３１は、前記分析結果を表示部３２に表示させ（ステップＳ２９）、ユーザ入力によるシャットダウン指示があるか否かを判定する（ステップＳ３０）。
　前記シャットダウン指示がある場合には、データ処理装置４の制御部３１は、測定装置２にシャットダウン信号を送信する（ステップＳ３１）。
　測定装置２の制御部８は、データ処理装置４からの前記シャットダウン信号を受信したか否かを常時判定しており（ステップＳ３２）、その信号を受信していない場合には、測定開始信号の受信如何を判定するステップＳ４に戻り、その信号を受信した場合には、試料調製装置３に前記シャットダウン信号を転送するとともに（ステップＳ３３）、シャットダウンを実行して測定処理を終了する（ステップＳ３４）。
　以上の通り、本実施の形態の細胞分析装置１によれば、試料調製装置３で生体試料に対してプレ測定を実施して、この測定結果に基づいて測定対象細胞Ｃ１の濃度調整を含む前処理工程を行っているので、生体試料ごとに測定対象細胞Ｃ１の濃度に大きなばらつきがあっても、測定対象細胞Ｃ１の分析に適した測定試料を良好に調製することができる。また、その濃度調整によって得られた測定対象細胞Ｃ１の濃度調整済みの測定試料を用いて測定対象細胞Ｃ１の本測定を行うようにしたので、生体試料ごとに測定対象細胞Ｃ１の濃度に大きなばらつきがあっても、生体試料中の測定対象細胞Ｃ１を精度よく分析することができる。
　〔その他の変形例〕
　なお、前述した実施の形態は、本発明の例示であって制限的なものではない。本発明の範囲は、前記実施の形態ではなく請求の範囲によって示され、さらに請求の範囲の構成と均等なすべての変更が含まれる。
　例えば、前記実施の形態では、円筒体からなるローター１０２の軸方向に平行な流路１０２Ｄを形成しているが、この流路は、図１８に示されるように、一方の端面（上端面）における開口２０２Ｄ１の位置と、他方の端面（下端面）における開口２０２Ｄ２の位置とが周方向において互いにずれている傾斜流路２０２Ｄとすることもできる。このような傾斜流路２０２Ｄの場合、図１８において、矢印Ｎ方向にローター２０２を回転させたときに生体試料をスムーズに傾斜流路２０２Ｄ内に導入することができる。
　また、前記実施の形態では、ローター１０２と一体的に設けられたフィン１０６によって生体試料の循環流を発生させているが、生体容器５３内にポンプ機構を配設し、このポンプ機構を駆動させることで生体試料に対流を生じさせることもできる。更に、かかるポンプ機構は生体容器５３の外部に配設することもでき、この場合は、このポンプ機構の吐出口及び吸入口にそれぞれ接続されたチューブを用いて生体試料を生体容器５３内に吐出し、且つ、生体容器５３から吸入することで生体試料の流れを作ることができる。
　また、前記実施の形態では、ローター１０２と一体的に設けられたフィン１０６によって生体試料の循環流を発生させているが、円筒体からなるローター１０２の側面にらせん状の溝を形成することで、前記循環流の流れをより強くすることができる。
　また、前記実施の形態では、ローター１０２の下方にフィルター１０１を配設しているが、ローター１０２の上方にフィルター１０１を配設することもできる。この場合は、フィルター１０１にローター１０２を回転駆動させる回転軸１０４が貫通する孔が設けられ、また、ローター１０２からフィルター１０１の方向へ、すなわち下方から上方へ生体試料が流れるようにフィン１０６がローター１０２下端面に設けられる。
　また、前記実施の形態では、分散部材であるローター１０２の方を回転させているが、図１９に示されるような十字状の平板部３０２Ａを有するリング体からなる分散部材３０２を採用し、この分散部材３０２をパイプの先端付近、例えば図９においてフィルター１０１が配設されている位置に固定する場合、フィルターの方を回転させることで凝集細胞を分散させることができる。この場合、フィルターは、図８～９における円筒体（突部は形成されていない）の下面に分散部材３０２と所定の間隔を形成するように固定される。そして、ローターは分散部材としてではなく、フィルターを支持する支持体として機能する。
　また、前記実施の形態では、パイプ１０５の先端に孔１０５Ｂを形成しているが、テーパ部１０５Ａに側孔を形成することもできる。生体試料の流量がある程度確保できるような場合、かかる側孔からも生体試料をパイプ１０５の外部に排出することで、生体容器５３内における生体試料のよどみを少なくすることができる。
　また、前記実施の形態では、フィルター部材として、多数の微細孔が形成された膜状体からなるフィルターを用いているが、測定対象の単一細胞を通過させることが可能であれば、例えばナイロンなどの合成樹脂繊維を編んだメッシュ体を用いることもできる。更には、単一細胞のサイズよりはかなり大きなサイズ（例えば、１ｍｍ）のスリットが形成された円板体をフィルター部材として用いることができる。また、フィルター１０１の材質は、ステンレスに限定されるものではなく、例えばポリカーボネートなどの合成樹脂を用いることもできる。
　また、前記実施の形態では、子宮頸部の上皮細胞Ｃ１を測定対象細胞としているが、口腔細胞、膀胱や咽頭など他の上皮細胞、さらには臓器の上皮細胞についても、癌化判定を行うことができる。
　また、前記実施の形態では、調製された測定試料をフローサイトメータで測定しているが、調製された測定試料をスライドガラスに塗抹して塗抹標本を作製し、この塗抹標本を観察する場合においても本発明の細胞分散装置を好適に用いることができる。本発明によれば、測定対象細胞の濃度が均一な測定試料を調製できるので、分析に適した塗抹標本を容易に作製することができる。
　また、前記実施の形態では、生体試料ごとに測定対象細胞の濃度に大きなばらつきがあっても、測定対象細胞の分析に適した測定試料を良好に調製するために、副検出部を設けているが、濃度のばらつきが比較的小さく測定精度への実質的な影響がない場合などは、このような副検出部を省略することもできる。
　なお、前記実施の形態における各種寸法(例えば、パイプ１０５の直径、フィルター１０１の厚さや開口率など)や個数（例えば、流路１０２Ｄの数）などは、あくまでも例示に過ぎず、生体試料の量や測定対象細胞などに応じて、適宜変更可能である。
　　１　　　細胞分析装置
　　２　　　測定装置
　　３　　　試料調製装置
　　４　　　データ処理装置
　　６　　　主検出部
　　８　　　測定制御部
　１０　　　フローサイトメータ
　１４　　　副検出部
　１６　　　調製制御部
　１８　　　調製デバイス部
　２４　　　検体セット部
　２５　　　細胞分散部
　２６　　　検体ピペット部
　２７　　　検体定量部
　２８　　　試薬定量部
　２９　　　弁別・置換部
　３１　　　処理本体
　４４　　　半導体レーザ
　４５　　　フローセル
　４７　　　フォトダイオード
１０１　　　フィルター
１０２　　　ローター
１０２Ｄ　　流路
１０３　　　モータ
１０５　　　パイプ
１０５Ａ　　テーパ部
１０５Ｃ　　開口部
１０６　　　フィン
１０８　　　突部
ＣＬ１　　　間隔（クリアランス）

Claims (13)

  1. 　複数の細胞が凝集した凝集細胞を含む細胞試料液中の当該凝集細胞を単一細胞に分散する装置であって、
    　前記単一細胞が通過可能に構成されたフィルター部材と、
    　このフィルター部材と所定の間隔をあけて配設され、当該間隔内の凝集細胞を分散する分散部材と、
    　この分散部材又は前記フィルター部材を駆動させる駆動源と
    　を備えたことを特徴とする細胞分散装置。
  2. 　前記分散部材から前記フィルター部材の方向に前記細胞試料液の流れを形成する対流形成手段を更に備えた請求項１に記載の細胞分散装置。
  3. 　前記フィルター部材及び前記分散部材の外側に配設され、その周壁に開口部を有するガイド用筒体を更に備えており、
    　このガイド用筒体の先端開口及び前記開口部の一方を流入口とし、他方を流出口としたときに、前記細胞試料液が流入口から、ガイド用筒体内側、流出口、ガイド用筒体外側、流入口へと循環する循環流が形成される請求項２に記載の細胞分散装置。
  4. 　前記フィルター部材及び前記分散部材の外側に配設されるガイド用筒体を更に備えており、
    　このガイド用筒体の先端開口及び上端開口の一方を流入口とし、他方を流出口としたときに、前記細胞試料液が流入口から、ガイド用筒体内側、流出口、ガイド用筒体外側、流入口へと循環する循環流が形成される請求項２に記載の細胞分散装置。
  5. 　前記対流形成手段が前記分散部材に一体的に設けられており、前記駆動源によって当該分散部材が駆動されることで前記細胞試料液の流れが形成される請求項２に記載の細胞分散装置。
  6. 　前記分散部材が円筒体からなり、この円筒体は、一方の端面から他方の端面へ貫通する少なくとも１つの流路を有している請求項１に記載の細胞分散装置。
  7. 　前記対流形成手段が、前記円筒体の端面上に傾斜して設けられたフィンからなり、このフィンは、前記流路の開口近傍において細胞試料液を当該開口内に導入し得るように設けられている請求項６に記載の細胞分散装置。
  8. 　前記ガイド用筒体の先端部には、先端に向かって断面積が徐々に減少するテーパ部が形成されている請求項３に記載の細胞分散装置。
  9. 　前記分散部材は、前記フィルター部材と対向する面に凸部を有する請求項１に記載の細胞分散装置。
  10. 　前記フィルター部材は、前記凝集細胞を捕捉し得る大きさの複数の開口を有する膜状体又はメッシュ体からなる請求項１に記載の細胞分散装置。
  11. 　前記対流形成手段は、さらに、前記フィルター部材から前記分散部材の方向に前記細胞試料液の流れを形成する請求項２に記載の細胞分散装置。
  12. 　前記細胞試料液が子宮頸部から採取された細胞を含む試料液である請求項１に記載の細胞分散装置。
  13. 　請求項１記載の細胞分散装置と、
    　この細胞分散装置で分離された細胞を含む細胞試料液を吸引分注するための吸引分注部と、
    　この吸引分注部により分注された細胞試料液から所定の細胞を抽出するためのろ過部と
    　を備えたことを特徴とする、細胞試料を調製するための試料前処理装置。
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