JP6286455B2 - 細胞分析方法、癌化情報提供方法、細胞分析装置および癌化情報提供装置 - Google Patents

Description

細胞を分析し、細胞の癌化に関する情報を提供する細胞分析方法、癌化情報提供方法、細胞分析装置および癌化情報提供装置に関する。

被検者の細胞を自動的に分析し、当該細胞の癌化に関する情報を提供する分析装置が知られている（たとえば、特許文献１参照）。特許文献１には、被検者から採取した細胞を含む測定試料をフローセルに流し、当該フローセルを流れる測定試料に光を照射することで個々の細胞について散乱光信号を取得し、各散乱光信号の波形を解析することにより特徴パラメータを抽出し、その特徴パラメータを用いて複数の細胞から癌・異型細胞を弁別する装置が開示されている。

国際公開第２００６／１０３９２０号

細胞は測定試料中において凝集することがある。測定試料に含まれる細胞のうち、凝集した細胞を解析対象から除外し、解析対象細胞の解析精度を高めることが望まれている。

本発明の第１の態様は、上皮細胞を含む測定試料に含まれる各細胞から蛍光および散乱光を検出して、蛍光信号および散乱光信号を出力し、出力された蛍光信号の波形の差分総和およびピーク値、並びに、出力された散乱光信号の波形の差分総和およびピーク値に基づいて、複数の上皮細胞が凝集した凝集細胞と、単一の上皮細胞とを弁別し、弁別した単一の上皮細胞のうち、細胞核の大きさを示す第１データおよび細胞の大きさを示す第２データが所定の条件に合致する細胞を計数し、得られた細胞数が閾値未満である場合には、検体が不適検体である旨、又は、細胞の分析が不能である旨を示すメッセージを含む警告情報を出力し、得られた細胞数が閾値以上である場合には、前記警告情報を出力することなく、単一の上皮細胞から得られた蛍光信号に基づいて細胞の癌化に関する情報を出力する、ことを特徴とする細胞分析方法である。

本発明の第２の態様は、細胞の癌化に関する情報を提供する癌化情報提供方法であって、上皮細胞を含む測定試料に含まれる各細胞から蛍光および散乱光を検出して、蛍光信号および散乱光信号を出力し、出力された蛍光信号の波形の差分総和およびピーク値、並びに、出力された散乱光信号の波形の差分総和およびピーク値、の少なくとも一方に基づいて、前記測定試料中の単一の上皮細胞を、複数の上皮細胞が凝集した凝集細胞から弁別し、弁別した単一の上皮細胞のうち、細胞核の大きさを示す第１データおよび細胞の大きさを示す第２データが所定の条件に合致する細胞を計数し、得られた細胞数が閾値以上である場合には、単一の上皮細胞から得られた蛍光信号に基づいて細胞の癌化に関する情報を出力し、得られた細胞数が閾値未満である場合には、細胞の癌化に関する情報の出力を禁止する、ことを特徴とする癌化情報提供方法である。

本発明の第３の態様は、上皮細胞を含む測定試料に光を照射し、前記測定試料に含まれる各細胞から蛍光および散乱光を検出して、蛍光信号および散乱光信号を出力する検出部と、表示部と、前記検出部から出力された蛍光信号の波形の差分総和およびピーク値、並びに、前記検出部から出力された散乱光信号の波形の差分総和およびピーク値に基づいて、複数の上皮細胞が凝集した凝集細胞と、単一の上皮細胞とを弁別し、弁別した単一の上皮細胞のうち、細胞核の大きさを示す第１データおよび細胞の大きさを示す第２データが所定の条件に合致する細胞を計数し、得られた細胞数が閾値未満である場合には、検体が不適検体である旨、又は、細胞の分析が不能である旨を示すメッセージを含む警告情報を前記表示部に表示させ、得られた細胞数が閾値以上である場合には、前記警告情報を前記表示部に表示させることなく、単一の上皮細胞から得られた蛍光信号に基づいて細胞の癌化に関する情報を前記表示部に表示させる制御部と、を備えることを特徴とする細胞分析装置である。

本発明の第４の態様は、細胞の癌化に関する情報を提供する癌化情報提供装置であって、上皮細胞を含む測定試料に光を照射し、前記測定試料に含まれる各細胞から蛍光および散乱光を検出して、蛍光信号および散乱光信号を出力する検出部と、表示部と、前記検出部から出力された蛍光信号の波形の差分総和およびピーク値、並びに、前記検出部から出力された散乱光信号の波形の差分総和およびピーク値、の少なくとも一方に基づいて、前記測定試料中の単一の上皮細胞を、複数の上皮細胞が凝集した凝集細胞から弁別し、弁別した単一の上皮細胞のうち、細胞核の大きさを示す第１データおよび細胞の大きさを示す第２データが所定の条件に合致する細胞を計数し、得られた細胞数が閾値以上である場合には、単一の上皮細胞から得られた蛍光信号に基づいて細胞の癌化に関する情報を前記表示部に表示させ、得られた細胞数が閾値未満である場合には、細胞の癌化に関する情報の表示を禁止する制御部と、を備えることを特徴とする癌化情報提供装置である。

以上のとおり、本発明によれば、測定試料に含まれる細胞のうち、凝集した細胞を解析対象から除外し、解析対象細胞の解析精度を高めることができる。

本発明の効果ないし意義は、以下に示す実施の形態の説明により更に明らかとなろう。ただし、以下に示す実施の形態は、あくまでも、本発明を実施化する際の一つの例示であって、本発明は、以下の実施の形態により何ら制限されるものではない。

実施の形態に係る癌化情報提供装置の外観の構成を模式的に示す斜視図である。 実施の形態に係る測定装置の内部の構成を模式的に示す平面図である。 実施の形態に係るフローサイトメータの構成を示す図である。 実施の形態に係る測定装置の構成を示す図である。 実施の形態に係るデータ処理装置の構成を示す図である。 実施の形態に係る癌化情報提供装置の分析動作を示すフローチャートである。 実施の形態に係る前方散乱光信号と側方蛍光信号を説明する図、子宮頸部の上皮細胞の拡大断面を模式的に示す図、およびＮ／Ｃ比と細胞の大きさの関係を示す図である。 実施の形態に係る細胞周期におけるＤＮＡ量と細胞数の関係を示す図および細胞周期ごとに変化するＤＮＡ量を示す図である。 実施の形態に係るデータ処理装置における分析処理を示すフローチャートである。 実施の形態に係る分析処理で生成されるスキャッタグラムとヒストグラムを示す図である。 実施の形態に係る表示部に表示されるダイアログを示す図である。 実施の形態に係る癌の進行度合いが異なる検体のスキャッタグラムを示す図である。 実施の形態に係る癌の進行度合いが異なる検体においてＮ／Ｃ比の高い領域に含まれる細胞群を抽出して作成したヒストグラムである。 実施の形態に係る癌の進行度合いが異なる検体においてＮ／Ｃ比の低い領域に含まれる細胞群を抽出して作成したヒストグラムである。 実施の形態に係る組織診の判定結果と判定１による判定結果との関係を説明する図である。 実施の形態に係る組織診の判定結果と判定２による判定結果との関係を説明する図および組織診の判定結果と最終の判定結果との関係を説明する図である。 実施の形態に係るデータ処理装置における分析処理の変更例を示すフローチャートである。 実施の形態に係るスキャッタグラムとヒストグラムに設定される領域の変更例を示す図である。

以下、本実施の形態に係る癌化情報提供装置１について、図面を参照して説明する。

癌化情報提供装置１は、患者（被検者）から採取した細胞（生体試料）を含む測定試料をフローセルに流し、フローセルを流れる測定試料にレーザ光を照射する。そして、測定試料からの光（前方散乱光、側方散乱光、側方蛍光）を検出してその光信号を分析することにより、細胞に癌化またはその過程にある細胞（以下、これらをまとめて「癌化細胞」ともいう）が含まれているか否かを判定する。具体的には、患者から採取した子宮頸部の上皮細胞を用いて子宮頸癌をスクリーニングする場合に、癌化情報提供装置１が用いられる。

図１は、癌化情報提供装置１の外観の構成を模式的に示す斜視図である。

癌化情報提供装置１は、患者から採取した生体試料の測定等を行う測定装置２と、この測定装置２に接続され、測定結果の分析や表示（出力）等を行うデータ処理装置３とを備えている。測定装置２の前面には、メタノールを主成分とする保存液と患者から採取した生体試料との混合液（試料）を収容する生体容器４（図２参照）を複数セットするための検体セット部２ａが設置されている。データ処理装置３は、入力部３１と表示部３２を備えている。

図２は、測定装置２の内部の構成を模式的に示す平面図である。

検体セット部２ａは、生体容器４が複数セットされたラック４ａを、検体ピペット部１１による試料の吸引位置まで順次搬送する。

検体ピペット部１１は、生体容器４内の試料を第１分散部１２に移送する。また、検体ピペット部１１は、第１分散部１２内の試料を、副検出部１３と弁別・置換部１４に移送する。また、検体ピペット部１１は、弁別・置換部１４において濃縮された濃縮液を測定試料容器５に供給する。検体ピペット部１１は、第１分散部１２の試料収容部１２ａと、副検出部１３の試料取込部１３ａと、弁別・置換部１４と、試料受渡部１１ｂに位置付けられた測定試料容器５の上方位置へ移動可能に構成されている。

また、検体ピペット部１１は、試料の吸引および吐出を行うピペット１１ａを有し、図示しない検体定量部（定量シリンダ、定量シリンダ内のピストンを駆動するモータ等）により試料を定量して所定量の試料を上記した各部に供給することが可能なように構成されている。

第１分散部１２は、試料に含まれる凝集細胞を分散させるための第１分散処理を試料に実行する。具体的には、第１分散処理は、凝集細胞にせん断力を付与して分散するせん断力付与処理である。第１分散部１２は、試料を収容可能な試料収容部１２ａを含み、試料収容部１２ａに供給された試料中の凝集細胞に対して機械的にせん断力を付与するように構成されている。

副検出部１３は、主検出部２２による本測定の前に試料の濃度測定を行うものである。なお、副検出部１３は、後述する主検出部２２とほぼ同じ構成のフローサイトメータ４０（図３（ａ）参照）を採用している。

弁別・置換部１４は、第１分散部１２による第１分散処理後の試料を受け入れ、試料に含まれるメタノールを主成分とする保存液を、希釈液に置換する。また、弁別・置換部１４は、試料に含まれる測定対象細胞（子宮頸部の上皮細胞、腺細胞）と、それ以外の細胞（赤血球、白血球、細菌など）や夾雑物とを弁別する。また、弁別・置換部１４は、主検出部２２による測定に必要な細胞測定数を得るために、試料に含有される測定対象細胞の濃縮を行う。なお、弁別・置換部１４は、処理の効率化のために２つ設けられている。

容器移送部１５は、反応部１８にセットされた測定試料容器５を、はさみ状の把持部１５ａにより把持して、試料受渡部１１ｂと、第２分散部１６と、液体除去部１７と、反応部１８に移送する。容器移送部１５は、所定の円周状軌跡に沿って把持部１５ａを移動させるように構成されている。また、容器移送部１５は、把持部１５ａを上下方向に移動させることが可能に構成されている。なお、試料受渡部１１ｂと、第２分散部１６と、液体除去部１７と、反応部１８は、この円周状軌跡上に配置されている。これにより、反応部１８にセットされた測定試料容器５を、容器移送部１５の把持部１５ａにより把持して、円周状軌跡上の各部に移送することが可能となる。

第２分散部１６は、第１分散部１２による第１分散処理が実行された試料に対して、第１分散処理とは異なる第２分散処理を実行する。具体的には、第２分散部１６は、第１分散部１２による第１分散処理が実行され、弁別・置換部１４において濃縮された（測定対象細胞の濃度が高められた）試料に超音波振動を付与するように構成されている。第２分散部１６により、第１分散処理の後に残存する凝集細胞が単一細胞に分散される。

液体除去部１７は、第２分散部１６による第２分散処理の後、測定試料容器５の外表面に付着した液分を除去（水切り）する。第２分散処理は、測定試料容器５が液体中に漬けられた状態で実行される。液体除去部１７は、測定試料容器５の外表面に空気流を供給することにより、測定試料容器５の外表面に付着した水滴を除去するように構成されている。これにより、測定試料容器５が反応部１８などの各部にセットされたときに、液体が各部に付着するのが防止される。

反応部１８は、測定試料容器５内の試料と第１試薬添加部１９と第２試薬添加部２０により添加される試薬との反応を促進させる。反応部１８は、図示しない駆動部により回転可能に構成された円形の回転テーブル１８ａを備えている。回転テーブル１８ａの外周縁部には、測定試料容器５をセット可能な複数の保持部１８ｂが設けられている。この保持部１８ｂに、測定試料容器５がセットされる。また、回転テーブル１８ａの回転による保持部１８ｂの軌跡と、容器移送部１５の把持部１５ａの円周状軌跡とは所定位置で交差しており、この交差位置で容器移送部１５が測定試料容器５を保持部１８ｂにセットすることが可能なように構成されている。また、反応部１８は、保持部１８ｂにセットされた測定試料容器５を所定温度（約３７度）に加温して、試料と試薬との反応を促進させる。

第１試薬添加部１９と第２試薬添加部２０は、保持部１８ｂにセットされた測定試料容器５内に試薬を供給する。第１試薬添加部１９と第２試薬添加部２０は、回転テーブル１８ａの周縁部近傍の位置に設置され、それぞれ、回転テーブル１８ａにセットされた測定試料容器５の上方の位置Ｐ１、Ｐ２まで移動可能な供給部１９ａ、２０ａを有する。これにより、回転テーブル１８ａにより位置Ｐ１、Ｐ２に測定試料容器５が搬送されたときに、測定試料容器５内に供給部１９ａ、２０ａから所定量の試薬が添加することが可能となる。

第１試薬添加部１９により添加される試薬は、細胞にＲＮＡ除去処理を行うためのＲＮａｓｅであり、第２試薬添加部２０により添加される試薬は、細胞にＤＮＡ染色処理を行うための染色液である。ＲＮＡ除去処理により、細胞中のＲＮＡが分解され、細胞核のＤＮＡのみを測定することが可能となる。ＤＮＡ染色処理は、色素を含む蛍光染色液であるヨウ化プロピジウム（ＰＩ）により行われ、ＤＮＡ染色処理により、細胞内の核に選択的に染色が施される。これにより、核からの蛍光が検出可能となる。

試料吸引部２１は、保持部１８ｂにセットされた測定試料容器５内の試料（測定試料）を吸引して、吸引した測定試料を主検出部２２に移送する。試料吸引部２１は、回転テーブル１８ａの周縁部近傍の位置に設置され、回転テーブル１８ａにセットされた測定試料容器５の上方の位置Ｐ３まで移動可能なピペット２１ａを有する。これにより、回転テーブル１８ａにより位置Ｐ３に測定試料容器５が搬送されたときに、測定試料容器５内の測定試料を吸引することが可能となる。また、試料吸引部２１は、図示しない流路を介して、主検出部２２のフローセル４３（図３（ａ）参照）に接続されており、ピペット２１ａにより吸引された測定試料を主検出部２２のフローセル４３に供給することが可能となるよう構成されている。

主検出部２２は、測定試料からの光（前方散乱光、側方散乱光、側方蛍光）を検出するためのフローサイトメータ４０を備えており、各光に基づく信号を後段の回路に出力する。なお、フローサイトメータ４０については、追って、図３（ａ）、（ｂ）を参照して説明する。

容器洗浄部２３は、試料吸引部２１により測定試料が主検出部２２に供給された後の測定試料容器５の内部を洗浄する。容器洗浄部２３は、回転テーブル１８ａの保持部１８ｂに保持された測定試料容器５内に洗浄液を吐出することにより、測定試料容器５の内部を洗浄するように構成されている。これにより、その後の測定処理において同じ測定試料容器５を用いた場合に、他の試料とのコンタミネーションを抑制することが可能となる。

図３（ａ）は、主検出部２２のフローサイトメータ４０の構成を示す図である。

半導体レーザ４１から出射されたレーザ光は、複数のレンズを含むレンズ系４２によりフローセル４３を流れる測定試料に集光される。フローセル４３には、上述したように、試料吸引部２１のピペット２１ａにより吸引された試料が供給される。

レンズ系４２は、図３（ｂ）に示すように、半導体レーザ４１側（図３（ａ）、（ｂ）の左側）から順に、コリメータレンズ４２ａと、シリンダレンズ系（平凸シリンダレンズ４２ｂ＋両凹シリンダレンズ４２ｃ）と、コンデンサレンズ系（コンデンサレンズ４２ｄ＋コンデンサレンズ４２ｅ）から構成されている。

集光レンズ４４は、測定試料中の細胞の前方散乱光を、フォトダイオード４５からなる散乱光検出器に集光する。側方用の集光レンズ４６は、測定対象細胞およびこの細胞中の核の側方散乱光と側方蛍光とを集光し、ダイクロイックミラー４７へと導く。ダイクロイックミラー４７は、側方散乱光をフォトマルチプライヤ（光電子増倍管）４８へ反射させるとともに、側方蛍光をフォトマルチプライヤ（光電子増倍管）４９の方へ透過させる。こうして、側方散乱光はフォトマルチプライヤ４８に集光され、側方蛍光はフォトマルチプライヤ４９に集光される。これらの光は、測定試料中の細胞や核の特徴を反映したものとなっている。

フォトダイオード４５とフォトマルチプライヤ４８、４９は、受光した光信号を電気信号に変換して、それぞれ、前方散乱光信号（ＦＳＣ）と、側方散乱光信号（ＳＳＣ）と、側方蛍光信号（ＳＦＬ）を出力する。これらの出力信号は図示しないプリアンプにより増幅され、測定装置２の信号処理部２４（図４参照）に出力される。

図４は、測定装置２の構成を示す図である。

測定装置２は、図２に示した主検出部２２と、副検出部１３と、上述したように試料に対する成分調整を自動的に行うための各部を含む調製デバイス部２９を備えている。また、測定装置２は、信号処理部２４と、測定制御部２５と、Ｉ／Ｏインターフェース２６と、信号処理部２７と、調製制御部２８と、を備えている。

主検出部２２は、上述したように、図３（ａ）に示したフローサイトメータ４０を備えており、測定試料から前方散乱光信号（ＦＳＣ）と、側方散乱光信号（ＳＳＣ）と、側方蛍光信号（ＳＦＬ）を出力する。信号処理部２４は、主検出部２２からの出力信号に対して必要な信号処理を行う信号処理回路からなり、主検出部２２から出力された各信号ＦＳＣ、ＳＳＣ、ＳＦＬを処理し、測定制御部２５に出力する。

測定制御部２５は、マイクロプロセッサ２５１と記憶部２５２を含んでいる。マイクロプロセッサ２５１は、Ｉ／Ｏインターフェース２６を介して、データ処理装置３と、調製制御部２８のマイクロプロセッサ２８１に接続されている。これにより、マイクロプロセッサ２５１は、データ処理装置３と、調製制御部２８のマイクロプロセッサ２８１との間で各種データを送受信することが可能となる。記憶部２５２は、主検出部２２などの制御プログラムやデータを格納するＲＯＭ、および、ＲＡＭなどからなる。

測定装置２の信号処理部２４で処理された各信号ＦＳＣ、ＳＳＣ、ＳＦＬは、マイクロプロセッサ２５１によって、Ｉ／Ｏインターフェース２６からデータ処理装置３に送信される。

副検出部１３は、主検出部２２とほぼ同じ構成のフローサイトメータ４０を採用しているので、構成については説明を省略する。副検出部１３は、主検出部２２による本測定の前に試料の濃度測定を行うものであるので、副検出部１３は、その細胞数を計数するための信号を出力できれば足りる。すなわち、副検出部１３は、前方散乱光信号（ＦＳＣ）を取得できれば足りる。信号処理部２７は、副検出部１３からの出力信号に対して必要な信号処理を行う信号処理回路からなり、副検出部１３から出力された前方散乱信号ＦＳＣを処理し、調製制御部２８に出力する。

調製制御部２８は、マイクロプロセッサ２８１と、記憶部２８２と、センサドライバ２８３と、駆動部ドライバ２８４を含んでいる。マイクロプロセッサ２８１は、Ｉ／Ｏインターフェース２６を介して測定制御部２５のマイクロプロセッサ２５１に接続されている。これにより、マイクロプロセッサ２８１は、測定制御部２５のマイクロプロセッサ２５１との間で各種データを送受信することが可能となる。

記憶部２８２は、副検出部１３や調製デバイス部２９などを制御するための制御プログラムなどを格納するＲＯＭ、および、ＲＡＭなどからなる。調整デバイス部２９は、図２に示した検体セット部２ａと、検体ピペット部１１と、第１分散部１２と、弁別・置換部１４と、容器移送部１５と、第２分散部１６と、液体除去部１７と、反応部１８と、第１試薬添加部１９と、第２試薬添加部２０と、試料吸引部２１と、容器洗浄部２３を含んでいる。

また、マイクロプロセッサ２８１は、センサドライバ２８３または駆動部ドライバ２８４を介して、調製デバイス部２９の各部のセンサ類や駆動モータと接続されている。これにより、マイクロプロセッサ２８１は、センサからの検知信号に基づいて制御プログラムを実行し、駆動モータの動作を制御する。

図５は、データ処理装置３の構成を示す図である。

データ処理装置３は、パーソナルコンピュータからなり、本体３０と、入力部３１と、表示部３２から構成されている。本体３０は、ＣＰＵ３０１と、ＲＯＭ３０２と、ＲＡＭ３０３と、ハードディスク３０４と、読出装置３０５と、入出力インターフェース３０６と、画像出力インターフェース３０７と、通信インターフェース３０８を有する。

ＣＰＵ３０１は、ＲＯＭ３０２に記憶されているコンピュータプログラムおよびＲＡＭ３０３にロードされたコンピュータプログラムを実行する。ＲＡＭ３０３は、ＲＯＭ３０２およびハードディスク３０４に記録されているコンピュータプログラムの読み出しに用いられる。また、ＲＡＭ３０３は、これらのコンピュータプログラムを実行するときに、ＣＰＵ３０１の作業領域としても利用される。

ハードディスク３０４には、オペレーティングシステムおよびアプリケーションプログラムなど、ＣＰＵ３０１に実行させるための種々のコンピュータプログラムおよびコンピュータプログラムの実行に用いるデータがインストールされている。具体的に、ハードディスク３０４には、測定装置２から送信された測定結果を分析して、生成した分析結果に基づいて表示部３２に表示を行うプログラム等がインストールされている。

ＣＰＵ３０１は、ハードディスク３０４にインストールされたプログラムを実行することにより、各信号ＦＳＣ、ＳＳＣ、ＳＦＬに基づいて、前方散乱光強度、側方蛍光強度等の特徴パラメータを取得し、これらの特徴パラメータに基づいて、細胞や核を分析するための頻度分布データを作成する。そして、ＣＰＵ３０１は、この頻度分布データに基づいて、測定試料中の粒子の弁別処理を行い、測定対象細胞（上皮細胞）が異常であるか否か、具体的には癌化した細胞（異型細胞）であるか否かを判定する。なお、このようなＣＰＵ３０１による判定については、追って図９を参照して説明する。

読出装置３０５は、ＣＤドライブまたはＤＶＤドライブ等によって構成されており、記録媒体に記録されたコンピュータプログラムおよびデータを読み出すことができる。入出力インターフェース３０６には、キーボード等からなる入力部３１が接続されており、操作者が入力部３１を使用することにより、データ処理装置３に指示およびデータが入力される。画像出力インターフェース３０７は、ディスプレイ等で構成された表示部３２に接続されており、画像データに応じた映像信号を、表示部３２に出力する。

表示部３２は、入力された映像信号をもとに、画像を表示する。表示部３２には、各種プログラム画面が表示される。また、通信インターフェース３０８により、測定装置２に対してデータの送受信が可能となる。

図６は、癌化情報提供装置１の分析動作を示すフローチャートである。

測定装置２の主検出部２２と信号処理部２４の動作制御は、測定制御部２５のマイクロプロセッサ２５１により実行される。また、測定装置２の副検出部１３と、信号処理部２７と、調製デバイス部２９の動作制御は、調製制御部２８のマイクロプロセッサ２８１により実行される。また、データ処理装置３の制御は、ＣＰＵ３０１により実行される。

癌化情報提供装置１による分析に際して、生体試料と、メタノールを主成分とする保存液とが収容された生体容器４が操作者により検体セット部２ａ（図２参照）にセットされ、癌化情報提供装置１による分析が開始される。

測定が開始されると、第１分散部１２により試料中の凝集細胞の分散処理（第１分散処理）が行われる（Ｓ１１）。具体的には、検体セット部２ａにセットされた生体容器４内の試料が、検体ピペット部１１によって吸引され、試料収容部１２ａ内に供給される。試料収容部１２ａに供給された試料は、その後、第１分散部１２で分散される。

第１分散処理が終了すると、検体ピペット部１１により、分散済みの試料が副検出部１３の試料取込部１３ａに供給され、図３（ａ）のフローセル４３と同様の副検出部１３のフローセルに、分散済みの試料が所定量だけ流される。そして、この副検出部１３において、フローサイトメトリー法によって試料に含まれる細胞数の検出（プレ測定）が行われる（Ｓ１２）。プレ測定により得られた細胞数と、副検出部１３に供給された試料の体積から、この試料の濃度が算出される。

続いて、算出された濃度に基づいて、マイクロプロセッサ２８１により、本測定に用いる測定試料を調製するための試料の吸引量が決定される（Ｓ１３）。すなわち、プレ測定に用いた試料の濃度（単位体積あたりの細胞の数）と、本測定における癌細胞検出のために必要な有意細胞数とに基づき、この有意細胞数が確保される程度に本測定を行うために必要な試料の液量が演算される。本実施の形態では、たとえば、主検出部２２のフローセル４３に供給する単一上皮細胞の数（有意細胞数）が２万個程度であることが想定されている。この場合、弁別・置換部１４に供給する試料に１０万個程度の細胞が含まれる必要があり、このため、約１０万個の細胞が弁別・置換部１４に供給されるよう、Ｓ１３における試料の液量が演算される。

なお、プレ測定で得られる細胞数には、測定対象細胞（上皮細胞）の単一細胞と凝集細胞が混在しており、さらに、測定対象細胞以外に白血球等も含まれる。このため、得られる細胞数は、測定対象細胞の数を正確に示すものではない。しかしながら、プレ測定で得られる細胞数に基づけば、本測定で必要となる有意細胞数をある程度で確保することが可能となる。

次に、演算された液量の試料について弁別・置換処理が実行される（Ｓ１４）。すなわち、調製制御部２８により検体ピペット部１１が駆動され、演算された液量だけ第１分散部１２の試料収容部１２ａから、第１分散処理後の試料が吸引される。吸引された試料が弁別・置換部１４に供給されることにより、弁別・置換処理が開始される。

次に、第２分散部１６により試料中の凝集細胞の分散処理（第２分散処理）が行われる（Ｓ１５）。具体的には、容器移送部１５が反応部１８の保持部１８ｂにセットされた測定試料容器５を把持して取り出し、試料受渡部１１ｂに位置付ける。そして、弁別・置換部１４から検体ピペット部１１によって吸引された試料が、試料受渡部１１ｂに位置付けられた測定試料容器５に供給される。その後、この測定試料容器５が容器移送部１５により第２分散部１６に移送され、第２分散処理が実行される。

第２分散処理後の試料を含む測定試料容器５が反応部１８の保持部１８ｂにセットされると、第１試薬添加部１９により試薬（ＲＮａｓｅ）が添加され、反応部１８により加温され、測定試料容器５内の測定対象細胞のＲＮＡ除去処理が行われる（Ｓ１６）。ＲＮＡ除去処理の後、第２試薬添加部２０により試薬（染色液）が添加され、反応部１８により加温され、測定試料容器５内の測定対象細胞のＤＮＡ染色処理が行われる（Ｓ１７）。

次に、ＤＮＡ染色処理済みの測定試料が、試料吸引部２１により吸引される。吸引された測定試料は、主検出部２２のフローセル４３（図３（ａ）参照）に送られ、測定試料中の細胞に対する本測定が行われる（Ｓ１８）。

本測定後、得られた測定データが測定装置２の測定制御部２５からデータ処理装置３に送信される（Ｓ１９）。具体的には、測定試料中の各細胞について得られた前方散乱光信号（ＦＳＣ）と、側方散乱光信号（ＳＳＣ）と、側方蛍光信号（ＳＦＬ）が、データ処理装置３に送信される。データ処理装置３のＣＰＵ３０１は、測定装置２から測定データを受信したか否かを常時判定している。測定装置２から測定データを受信すると、データ処理装置３のＣＰＵ３０１により、その測定データに基づいて分析処理が行われる（Ｓ２０）。なお、Ｓ２０の分析処理の詳細については、追って図９を参照して説明する。

次に、本実施の形態における癌化情報の取得手順について説明する。

図７（ａ）は、本測定（図６のＳ１８）において得られる前方散乱光信号（ＦＳＣ）と側方蛍光信号（ＳＦＬ）を説明する図である。

図７（ａ）には、細胞核を含む細胞の模式図と、当該細胞から得られる前方散乱光信号の波形と側方蛍光信号の波形が示されている。縦軸は光の強度を表している。前方散乱光強度の波形の幅は、細胞の幅を示す数値（細胞の大きさＣ）を表しており、側方蛍光強度の波形の幅は、細胞核の幅を示す数値（細胞核の大きさＮ）を表している。また、斜線で示すように、側方蛍光強度の波形と所定のベースラインにより決められる領域の面積は、細胞のＤＮＡ量を表している。

図７（ｂ）は、子宮頸部の上皮細胞の拡大断面を模式的に示す図である。

子宮頸部においては、基底膜側から順に、基底細胞により形成される層（基底層）と、傍基底細胞により形成される層（傍基底層）と、中層細胞により形成される層（中層）と、表層細胞により形成される層（表層）が形成されている。基底膜付近の基底細胞が傍基底細胞、傍基底細胞が中層細胞、中層細胞が表層細胞へと分化する。

これら上皮細胞のうち癌化に関連する細胞は、子宮頸部の上皮細胞では基底細胞である。癌にいたる過程において、基底細胞は異形成を獲得し異型細胞となる。異型細胞は増殖能を獲得し、基底層側から表層側を占めるようになる。このため、癌にいたる初期段階においては、子宮頸部の上皮細胞では、基底層と、傍基底層と、中層に存在する細胞に、癌化細胞が多く存在する。逆に、癌にいたる初期段階においては、子宮頸部の上皮細胞の表層側に存在する細胞には、癌化細胞が極めて少ない。

また、上皮細胞では、表層側の層から基底膜側の層に向かうにしたがい、細胞の大きさは順次小さくなるが、細胞核の大きさは順次大きくなることが分かっている。したがって、細胞の大きさ（Ｃ）に対する細胞核の大きさ（Ｎ）の比率（以下、「Ｎ／Ｃ比」という）も、表層側の層から基底膜側の層に向かうにしたがい順次大きくなる。このため、Ｎ／Ｃ比と細胞の大きさＣは、たとえば図７（ｃ）に示すような関係となる。よって、Ｎ／Ｃ比の大きい細胞を抽出することにより、傍基底細胞と基底細胞を抽出することができる。

図８（ａ）は、細胞周期におけるＤＮＡ量と細胞数の関係を示す図である。

細胞は、一定のサイクル（細胞周期）にしたがって、ＤＮＡ複製、染色体の分配、核分裂、細胞質分裂などの事象を経て、２つの細胞となって出発点に戻る。細胞周期は、その段階に応じて、Ｇ１期（Ｓ期に入るための準備と点検の時期）と、Ｓ期（ＤＮＡ合成期）と、Ｇ２期（Ｍ期に入るための準備と点検の時期）と、Ｍ期（分裂期）の４期に分けることができ、この４期に細胞の増殖が休止しているＧ０期（休止期）を加えると、細胞は、５期のうちいずれかのステージにある。

細胞周期にしたがって細胞が増殖する際、細胞内の核の染色体も増加するため、細胞のＤＮＡ量を測定することで、当該細胞が細胞周期のどの状態にあるのかを推定することができる。正常な細胞の場合、図８（ｂ）に示すように、Ｇ０／Ｇ１期におけるＤＮＡ量は一定の値（２Ｃ）であり、続くＳ期においてはＤＮＡ量が徐々に増加し、その後Ｇ２期に入ると一定の値（４Ｃ）となり、この値はＭ期においても維持される。ここで、Ｃとは、半数体あたりのゲノムＤＮＡ含量のことを表す。すなわち、２Ｃは半数体あたりのゲノムＤＮＡ含量の２倍のＤＮＡ量、４Ｃは半数体あたりのゲノムＤＮＡ含量の４倍のＤＮＡ量を表す。細胞周期のＧ０期あるいはＧ１期の正常細胞のＤＮＡ量は２Ｃとなる。そして、正常な細胞について、ＤＮＡ量のヒストグラムを作成すると、図８（ａ）に示すようなヒストグラムとなる。最も高いピークを有する山はＤＮＡ量が最も少ないＧ０／Ｇ１期にある細胞に対応し、次に高いピークを有する山はＤＮＡ量が最も多いＧ２／Ｍ期にある細胞に対応し、それらの間はＳ期にある細胞に対応している。

正常な細胞の場合、Ｓ期とＧ２／Ｍ期の状態にある細胞の数は、Ｇ０／Ｇ１期にある細胞の数に比べて極めて少ない。しかし、癌化細胞の場合、Ｓ期とＧ２／Ｍ期の状態にある細胞の数は、正常な細胞に比べて多くなる。また、癌化細胞の場合、細胞の染色体の数も多くなるため、ＤＮＡ量も多くなる。

そこで、本実施の形態では、癌化の判定について、Ｎ／Ｃ比とＤＮＡ量に着目した２つの判定方法（判定１、２）が用いられる。“データ処理装置３による分析処理”（図６のＳ２０）では、判定１、２に基づいて癌化の判定が行われる。

判定１では、Ｎ／Ｃ比の大きい細胞を抽出することにより、癌化が進み易いとされる基底細胞、傍基底細胞、中層細胞を抽出する。続いて、このように抽出された細胞群のうち、ＤＮＡ量が多い細胞を抽出することにより、癌化細胞である可能性が高い細胞を効果的に抽出する（第２計数工程）。判定１では、第２計数工程によって得られる細胞数が多い場合に、癌化の可能性が高いと判定する。

判定２では、Ｎ／Ｃ比の小さい細胞を抽出することにより、癌化が進み難いとされる中層細胞、表層細胞を抽出する。続いて、このように抽出された細胞群のうち、ＤＮＡ量が少ない細胞を抽出することにより、癌化細胞である可能性が低い細胞を効果的に抽出する（第１計数工程）。一般に、組織の癌化が進むと、第２計数工程によって得られる細胞数が増加し、第１計数工程によって得られる細胞数が減少する。このため、両細胞数の比は、組織が正常である場合と癌化した場合とで大きく異なることとなる。判定２では、この比に基づいて組織の癌化を判定する。なお、このように互いに増減傾向が逆の２つの細胞数の比が用いられると、測定試料に含まれる測定対象細胞が比較的少なくても、信頼性の高い判定結果を得ることができる。

図９は、データ処理装置３における分析処理を示すフローチャートである。

データ処理装置３のＣＰＵ３０１は、測定装置２から測定データを受信すると、図１０（ａ）に示すスキャッタグラムを作成する。図１０（ａ）において、横軸は細胞の大きさ（前方散乱光信号波形の幅）を表し、縦軸はＤＮＡ量（側方蛍光信号波形の総和）を表している。

続いて、ＣＰＵ３０１は、白血球と上皮細胞を分離する（Ｓ１０１）。具体的には、ＣＰＵ３０１は、図１０（ａ）のスキャッタグラムにおいて、白血球に対応する左下の領域が欠けた領域Ａ１を設定し、この領域Ａ１に含まれる細胞を抽出する。

次に、ＣＰＵ３０１は、Ｓ１０１で抽出した細胞群から、図１０（ｂ）に示すスキャッタグラムを作成する。図１０（ｂ）において、横軸は（側方蛍光信号の差分総和／側方蛍光信号のピーク値）を表し、縦軸は（前方散乱光信号の差分総和／前方散乱光信号のピーク値）を表している。

続いて、ＣＰＵ３０１は、単一上皮細胞と凝集上皮細胞を分離する（Ｓ１０２）。具体的には、ＣＰＵ３０１は、図１０（ｂ）のスキャッタグラムにおいて、単一上皮細胞に対応する領域Ａ２を設定し、この領域Ａ２に含まれる細胞を抽出する。なお、凝集細胞の除去は、単一細胞としては正常なＤＮＡ量であるにもかかわらず複数の細胞が凝集することで測定ＤＮＡ量が異常値を示すことによる分析精度の低下を防ぐために行われる。

次に、ＣＰＵ３０１は、Ｓ１０２で抽出した細胞群から、図１０（ｃ）に示すスキャッタグラムを作成する。図１０（ｃ）のヒストグラムにおいて、横軸は、細胞核の大きさＮを細胞の大きさＣで除算した値（Ｎ／Ｃ比）を表しており、縦軸は細胞の大きさを表している。

続いて、ＣＰＵ３０１は、図１０（ｃ）のヒストグラムにおいて、Ｖ１１≦Ｎ／Ｃ比≦Ｖ１２の細胞群を抽出する（Ｓ１０３）。具体的には、ＣＰＵ３０１は、図１０（ｃ）のスキャッタグラムにおいて領域Ａ４を設定し、この領域Ａ４に含まれる細胞群を抽出する。なお、領域Ａ４の左端の値と右端の値は、それぞれ、Ｎ／Ｃ比の値がＶ１１、Ｖ１２に設定されている。Ｖ１１は、中層細胞と傍基底細胞を分ける閾値である。Ｖ１１は、感度と特異度の観点から適宜設定される。本実施の形態では、Ｖ１１は、０．２〜０．４の範囲で設定される。Ｖ１２は、基底細胞と意義不明な細胞を分ける閾値である。Ｖ１２は、感度と特異度の観点から適宜設定される。本実施の形態では、Ｖ１２は、０．６〜１の範囲で設定される。

次に、ＣＰＵ３０１は、Ｓ１０３で抽出した細胞数が閾値Ｓ０以上であるかを判定する（Ｓ１０４）。細胞数が十分でない場合、癌化の判定精度が低下する惧れがある。したがって、かかる細胞数が閾値Ｓ０未満である場合（Ｓ１０４：ＮＯ）、ＣＰＵ３０１は、この検体が不適検体である旨を表示する（Ｓ１１６）。具体的には、ＣＰＵ３０１は、図１１（ａ）に示すように、「不適検体」と表示されたダイアログＤ１を表示部３２に表示する。なお、ダイアログＤ１には、「ＮＧ」、「分析不能」等のメッセージが表示されても良い。そして、ＣＰＵ３０１は、癌化情報の出力を行わずに、処理を終了する。なお、閾値Ｓ０は、検体の採取不適を判断する閾値である。閾値Ｓ０は、感度と特異度の観点から適宜設定される。本実施の形態では、閾値Ｓ０は、５０〜１０００の範囲で設定される。

Ｓ１０３で抽出した細胞数が閾値Ｓ０以上であると（Ｓ１０４：ＹＥＳ）、ＣＰＵ３０１は、ハードディスク３０４に記憶しているフラグ１の値をリセットする（Ｓ１０５）。フラグ１は、上述した「判定１」による判定結果を示すためのものである。続いて、ＣＰＵ３０１は、Ｓ１０３と同様に図１０（ｃ）のスキャッタグラムにおいてＶ１１≦Ｎ／Ｃ比≦Ｖ１２の細胞群を抽出し、図１０（ｄ）に示すヒストグラム（ＤＮＡプロイディ）を作成する（Ｓ１０６）。図１０（ｄ）のヒストグラムにおいて、横軸はＤＮＡ量を表しており、縦軸は細胞数を表している。

次に、ＣＰＵ３０１は、Ｓ１０６で作成したヒストグラムにおいて、ＤＮＡ量が正常細胞のＳ期以上である細胞数、すなわち、細胞周期がＧ０期あるいはＧ１期にある正常細胞のＤＮＡ量を超えるＤＮＡ量を有する細胞数が、閾値Ｓ１以上であるかを判定する（Ｓ１０７）。具体的には、ＣＰＵ３０１は、図１０（ｄ）に示すヒストグラムにおいて領域Ａ５を設定し、この領域Ａ５に含まれる細胞数が閾値Ｓ１以上であるかを判定する。領域Ａ５の左端の値Ｖ２１は、癌化情報提供装置１で、細胞周期がＧ０／Ｇ１期にある正常細胞のＤＮＡ量として検出されるＤＮＡ量の範囲の上限値となるよう設定され、領域Ａ５の右端は右方向に全ての細胞を含むように設定される。細胞数の判定に用いられる細胞数の閾値Ｓ１は、主検出部２２のフローセル４３に供給される単一上皮細胞が約２万個であることに対応して決定されている。なお、閾値Ｓ１は、癌検体と陰性検体を分画する閾値である。閾値Ｓ１は、測定された細胞数により異なる為、感度と特異度の観点から適宜設定される。本実施の形態では、閾値Ｓ１は、２０００〜４０００の範囲で設定される。

領域Ａ５に含まれる細胞数が閾値Ｓ１以上であると（Ｓ１０７：ＹＥＳ）、ＣＰＵ３０１は、フラグ１に「Ｃａｎｃｅｒ」をセットする（Ｓ１０８）。領域Ａ５に含まれる細胞数が閾値Ｓ１未満であると（Ｓ１０７：ＮＯ）、Ｓ１０８がスキップされる。なお、Ｓ１０５〜Ｓ１０８の処理が、上述した「判定１」に相当する。

次に、ＣＰＵ３０１は、ハードディスク３０４に記憶しているフラグ２の値をリセットする（Ｓ１０９）。フラグ２は、上述した「判定２」による判定結果を示すためのものである。続いて、ＣＰＵ３０１は、図１０（ｃ）のスキャッタグラムにおいてＶ１３≦Ｎ／Ｃ比＜Ｖ１１の細胞群（領域Ａ３に含まれる細胞群）を抽出し、図１０（ｅ）に示すヒストグラム（ＤＮＡプロイディ）を作成する（Ｓ１１０）。Ｖ１３は、Ｖ１３≦Ｎ／Ｃ比＜Ｖ１１の範囲に、表層細胞または中層細胞が含まれるようにするための閾値である。Ｖ１３は、感度と特異度の観点から適宜設定される。本実施の形態では、Ｖ１３は、Ｖ１１よりも小さく０以上の範囲で設定される。図１０（ｅ）のヒストグラムにおいて、横軸はＤＮＡ量を表しており、縦軸は細胞数を表している。

次に、ＣＰＵ３０１は、Ｓ１１０で作成したヒストグラムにおいて、ＤＮＡ量が正常細胞の２Ｃである細胞数、すなわち、細胞周期がＧ０期あるいはＧ１期にある正常細胞のＤＮＡ量を有する細胞数を得る。具体的には、ＣＰＵ３０１は、図１０（ｅ）に示すヒストグラムにおいて領域Ａ６を設定し、この領域Ａ６に含まれる細胞数を得る。領域Ａ６の右端の値Ｖ３２は、領域Ａ５の左端の値Ｖ２１と同じとなるよう設定される。

ここで設定したＶ３２（Ｖ２１）は、Ｇ０期またはＧ１期にある正常細胞が有するＤＮＡ量（２Ｃ）とＳ期にある正常細胞が有するＤＮＡ量を分ける値として設定されている。具体的には、細胞周期がＧ０期またはＧ１期にある正常細胞のＤＮＡ量を示す値Ｖ３０を設定し、Ｖ３１と、Ｖ３２（Ｖ２１）は、Ｖ３１とＶ３２（Ｖ２１）の範囲にＶ３０が含まれ、Ｖ３１とＶ３２の範囲の幅がＡとなるよう設定されている。

続いて、ＣＰＵ３０１は、Ｓ１０６で作成したヒストグラムにおいてＤＮＡ量が正常細胞のＳ期以上である細胞数、すなわち細胞周期がＧ０期またはＧ１期にある正常細胞が有するＤＮＡ量を越えるＤＮＡ量を有する細胞数を、Ｓ１１０で作成したヒストグラムにおいてＤＮＡ量が２Ｃである細胞数、すなわち細胞周期がＧ０期またはＧ１期にある正常細胞が有するＤＮＡ量を有する細胞数で除算した値（以下、「癌化比率」という）を得る。そして、ＣＰＵ３０１は、癌化比率が所定の閾値Ｓ２以上であるかを判定する（Ｓ１１１）。癌化比率が閾値Ｓ２以上であると（Ｓ１１１：ＹＥＳ）、ＣＰＵ３０１は、フラグ２に「Ｃａｎｃｅｒ」をセットする（Ｓ１１２）。癌化比率が閾値Ｓ２未満であると（Ｓ１１１：ＮＯ）、Ｓ１１２がスキップされる。なお、Ｓ１０９〜Ｓ１１２の処理が、上述した「判定２」に相当する。閾値Ｓ２は、癌検体と陰性検体を分画する閾値である。閾値Ｓ２は、感度と特異度の観点から適宜設定される。本実施の形態では、閾値Ｓ２は、０．５〜１．５の範囲で設定される。

次に、フラグ１、２の何れかが「Ｃａｎｃｅｒ」であると（Ｓ１１３：ＹＥＳ）、すなわち、判定１または判定２において「Ｃａｎｃｅｒ」と判定されると、ＣＰＵ３０１は、癌化に関する情報として、再検査が必要である旨の表示を行う（Ｓ１１４）。具体的には、ＣＰＵ３０１は、図１１（ｂ）に示すように、「要再検査」と表示されたダイアログＤ２を表示部３２に表示する。なお、ダイアログＤ２には、癌化の疑いが高いことを示すため、図１１（ｃ）に示すように、さらに「Ｃａｎｃｅｒ？」との表示が付加されるようにしても良い。

他方、フラグ１、２が両方とも「Ｃａｎｃｅｒ」でないと（Ｓ１１３：ＮＯ）、すなわち、判定１、２の両方において「Ｃａｎｃｅｒ」と判定されないと、ＣＰＵ３０１は、再検査が不要である旨の表示を行う（Ｓ１１５）。具体的には、ＣＰＵ３０１は、図１１（ｄ）に示すように、「再検査不要」と表示されたダイアログＤ３を表示部３２に表示する。

なお、生体容器４に含まれる生体試料が少ないために、癌細胞検出のために必要な有意細胞数が確保できない場合、判定１において適正な結果を得られない惧れがある。このような場合、Ｓ１１３において、フラグ２の値にのみ基づいて「Ｃａｎｃｅｒ」であるか否かが判定されるようにしても良い。

図１２（ａ）〜（ｅ）は、癌の進行度合いが異なる５つの検体のスキャッタグラムである。図１２（ａ）〜（ｅ）は、癌の進行度合いを示す「Ｃａｎｃｅｒ」、「ＣＩＮ３」、「ＣＩＮ２」、「ＣＩＮ１」、「Ｎｏｒｍａｌ」に対応している。「Ｎｏｒｍａｌ」から「Ｃａｎｃｅｒ」へと癌が進行するにつれて、Ｎ／Ｃ比の大きい領域Ａ４に含まれる細胞数が、Ｎ／Ｃ比の小さい領域Ａ３に含まれる細胞に比べて多くなっていることが分かる。

図１３（ａ）〜（ｅ）は、それぞれ、図１２（ａ）〜（ｅ）のＮ／Ｃ比の高い領域Ａ４に含まれる細胞群を抽出して作成したヒストグラムである。ここでは、図１３（ａ）〜（ｅ）のＳ期以上のＤＮＡ量に対応する領域Ａ５に、それぞれ、６７８５個、８７５個、４０４２個、５８９個、１２１個の細胞が含まれている。このとき、閾値Ｓ０の値を１００、閾値Ｓ１の値を８７５と４０４２の間に設定すると、図９の判定１において、図１３（ａ）、（ｃ）の検体は「Ｃａｎｃｅｒ」と判定され、図１３（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）の検体は「Ｃａｎｃｅｒ」と判定されない。よって、この場合、図１３（ａ）、（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）の検体は、判定１において適正に癌であるか否かが判定されるが、図１３（ｃ）の検体は、判定１において適正に癌であるか否かが判定されない。

図１４（ａ）〜（ｅ）は、それぞれ、図１２（ａ）〜（ｅ）のＮ／Ｃ比の低い領域Ａ４に含まれる細胞群を抽出して作成したヒストグラムである。ここでは、図１４（ａ）〜（ｅ）の２ＣのＤＮＡ量に対応する領域Ａ６に、それぞれ、７３８個、１８７８個、８２７０個、２８７８７個、１９４８５個の細胞が含まれている。これにより、図９のＳ１１１で得られる癌化比率は、図１４（ａ）〜（ｅ）の検体において、それぞれ、９．１９、０．４７、０．４９、０．０２、０．０１となる。このとき、閾値Ｓ０の値を１００、閾値Ｓ２の値を０．４９と９．１９の間に設定すると、図９の判定２において、図１４（ａ）の検体は「Ｃａｎｃｅｒ」と判定され、図１４（ｂ）〜（ｅ）の検体は「Ｃａｎｃｅｒ」と判定されない。よって、この場合、図１４（ａ）〜（ｅ）の検体は、判定２において、全て適正に癌であるか否かが判定される。

図１５（ａ）〜（ｃ）は、組織診の判定結果と、図９の判定１による判定結果との関係を説明する図である。なお、ここでは、１０３５個のサンプルに対して、判定が行われている。

図１５（ａ）の左側の領域Ａ１１はデータのバラつき等を表す箱ひげ図であり、右側の領域Ａ１２はヒストグラムである。領域Ａ１１、Ａ１２内において、横軸の５つの値は、左から、組織診の結果の「Ｎｏｒｍａｌ」、「ＣＩＮ１」、「ＣＩＮ２」、「ＣＩＮ３」、「Ｃａｎｃｅｒ」に対応している。図１５（ａ）の縦軸は、図９のＳ１０７で計数したＳ期にある正常細胞が有するＤＮＡ量以上である細胞数を表している。

図１５（ａ）の領域Ａ１１では、一つのドットが一つのサンプル（検体）に対応している。組織診において「Ｎｏｒｍａｌ」と診断された各サンプルは、最も左の列の、対応する細胞数（縦軸）の位置にプロットされる。たとえば、「Ｎｏｒｍａｌ」と診断されたあるサンプルについて、図９のＳ１０７で計数されたＳ期にある正常細胞が有するＤＮＡ量以上である細胞数が閾値Ｓ１未満であれば、このサンプルは、最も左の列（「Ｎｏｒｍａｌ」の列）の縦軸方向において、この細胞数に対応する位置にプロットされる。「ＣＩＮ１」、「ＣＩＮ２」、「ＣＩＮ３」、「Ｃａｎｃｅｒ」と診断された各サンプルについても同様に、対応する癌化段階の列上の縦軸方向において、細胞数に対応する位置にプロットされる。図１５（ａ）の領域Ａ１２は、各癌化段階に含まれるサンプルが、縦軸上においてどのような割合で分布するかを棒グラフで表したものである。なお、図１５（ａ）には、図９のＳ１０７にて設定された細胞数の閾値Ｓ１の位置が点線で示されている。すなわち、この点線よりも細胞数が多い位置にプロットされたサンプルは、図９の判定１において「Ｃａｎｃｅｒ」と判定される。

図１５（ａ）を参照して、組織診により「Ｎｏｒｍａｌ」と判定された検体のうち、判定１において「Ｃａｎｃｅｒ」と判定された検体、すなわち、Ｓ期にある正常細胞が有するＤＮＡ量以上の細胞数が閾値Ｓ１以上であるため陽性となった検体が１つあることが分かる。組織診により「ＣＩＮ１」と判定された検体は、判定１において全て「Ｎｏｒｍａｌ」と適正に判定されたことが分かる。組織診により「ＣＩＮ２」と「ＣＩＮ３」と判定された検体のうち、判定１において「Ｃａｎｃｅｒ」と判定された検体が、それぞれ２つずつあることが分かる。組織診により「Ｃａｎｃｅｒ」と判定された検体は、判定１において全て「Ｃａｎｃｅｒ」と適正に判定されたことが分かる。

図１５（ｂ）は、図１５（ａ）の内容をまとめた表である。組織診の項目において、陽性は検体が癌であることを示し、陰性はＣＩＮ３以下の検体を示している。判定１の項目において、陽性は図９のＳ１０７でＹＥＳと判定された検体を示し、陰性は図９のＳ１０７でＮＯと判定された検体を示している。

図１５（ｂ）を参照して、判定１により陽性と判定された１１の検体のうち、組織診において陽性であった検体は６つである。すなわち、判定１により５つの検体が偽陽性（組織診と相違）となっている。また、判定１により陰性と判定された１０２４の検体は、全て組織診において陰性と診断されている。

図１５（ｃ）は、図１５（ｂ）の判定結果をパーセントで表示したものである。

判定１により、組織診において陽性であった６つの検体全てが陽性と判定されたので、判定１による感度は６／６＝１００．０％となる。また、判定１により、組織診において陰性であった１０２９の検体のうち１０２４の検体が陰性と判定されたので、判定１による特異度は１０２４／１０２９＝９９．５％となる。

図１６（ａ）〜（ｃ）は、図１５（ａ）〜（ｃ）と同様、組織診の判定結果と、図９の判定２による判定結果との関係を説明する図である。なお、図１６（ａ）の縦軸は、図９の判定２で算出した癌化比率（Ｓ１１１で求められる比率）を表している。なお、図１６（ａ）には、図９のＳ１１１にて設定された癌化比率の閾値Ｓ２の位置が点線で示されている。すなわち、この点線よりも癌化比率が高い位置にプロットされたサンプルは、図９の判定２において「Ｃａｎｃｅｒ」と判定される。

図１６（ａ）を参照して、組織診により「Ｎｏｒｍａｌ」と判定された検体のうち、判定２において「Ｃａｎｃｅｒ」と判定された検体、すなわち、癌化比率が閾値Ｓ２以上であるため陽性となった検体が８つあることが分かる。組織診により「ＣＩＮ１」と「ＣＩＮ２」と判定された検体は、判定２において全て「Ｎｏｒｍａｌ」と適正に判定されたことが分かる。組織診により「ＣＩＮ３」と判定された検体のうち、判定２において「Ｃａｎｃｅｒ」と判定された検体が１つあることが分かる。組織診により「Ｃａｎｃｅｒ」と判定された検体のうち、判定２において「Ｃａｎｃｅｒ」と判定されなかった、すなわち、本来「Ｃａｎｃｅｒ」と判定されるべきところを「Ｃａｎｃｅｒ」でないと不適正に判定された検体が１つあることが分かる。

図１６（ｂ）は、図１５（ｂ）と同様にして、図１６（ａ）の内容をまとめた表である。

図１６（ｂ）を参照して、判定２により陽性と判定された１４の検体のうち、組織診において陽性であった検体は５つである。すなわち、判定２により９つの検体が偽陽性（組織診と相違）となっている。また、判定２により陰性と判定された１０２１の検体のうち、組織診において陰性であった検体は１０２０個である。すなわち、判定２により１つの検体が偽陰性（組織診と相違）となっている。

図１６（ｃ）は、図１６（ｂ）の判定結果をパーセントで表示したものである。

判定２により、組織診において陽性であった６つの検体のうち５つの検体が陽性と判定されたので、判定２による感度は５／６＝８３．３％となる。また、判定２により、組織診において陰性である１０２９の検体のうち１０２０の検体が陰性と判定されたので、判定２による特異度は１０２０／１０２９＝９９．１％となる。

ここで、本実施の形態に示すように、図９のＳ１１３で判定１、２を組み合わせることにより「Ｃａｎｃｅｒ」の判定を行う場合、組織診の判定結果と、図９のＳ１１３の判定結果との関係は、図１６（ｄ）、（ｅ）に示すようになる。

図１６（ｄ）を参照して、Ｓ１１３により陽性と判定された１８の検体のうち、組織診において陽性であった検体は６つである。すなわち、Ｓ１１３の判定により１２の検体が偽陽性（組織診と相違）となっている。また、Ｓ１１３の判定により陰性と判定された１０１７の検体は、全て実際に陰性である。

図１６（ｅ）を参照して、Ｓ１１３の判定により、組織診において陽性であった６つの検体の全てが陽性と判定されたので、Ｓ１１３による感度は６／６＝１００．０％となる。また、Ｓ１１３の判定により、組織診において陰性であった１０２９の検体のうち１０１７の検体が陰性と判定されたので、Ｓ１１３による特異度は１０１７／１０２９＝９８．８％となる。

以上、本実施の形態によれば、図９の判定１により癌であるか否かを判定することができる。判定１によれば、図１５（ａ）〜（ｃ）を参照して説明したように、１０２９の陰性検体のうち５つの検体が偽陽性となったものの、組織診で「Ｃａｎｃｅｒ」と判定された６つの検体は全て適正に「Ｃａｎｃｅｒ」と判定され得る。

また、判定１では、Ｎ／Ｃ比がＶ１１〜Ｖ１２の細胞群のうち、ＤＮＡ量がＶ２１以上の細胞群が抽出された。このように、抽出する細胞のＮ／Ｃ比が高い範囲に限定されているため、判定１による判定精度が高められ得る。

なお、判定１では、副検出部１３において濃度検出（プレ測定）が行われ、癌細胞検出のために必要な有意細胞数が確保される程度に必要な試料が主検出部２２に供給される。これにより、図９のＳ１０７において、Ｓ期にある正常細胞が有するＤＮＡ量以上の細胞数と所定の個数（Ｓ１）と比較することにより、癌であるか否かを精度良く判定することが可能となる。

また、本実施の形態によれば、図９の判定２により癌であるか否かを判定することができる。判定２によれば、図１６（ａ）〜（ｃ）を参照して説明したように、１０２９の陰性検体のうち９つの検体が偽陽性となり、６つの陽性検体のうち１つの検体が偽陰性となるものの、組織診でＣａｎｃｅｒと判定される検体の大部分は適正に「Ｃａｎｃｅｒ」と判定され得る。

また、本実施の形態によれば、図９のＳ１１３において、判定１、２の何れかが「Ｃａｎｃｅｒ」であると、最終結果として「Ｃａｎｃｅｒ」と判定し、この旨が操作者に通知される。これにより、判定１、２の何れかの結果に偽陰性の検体が含まれる場合でも、他方の判定において「Ｃａｎｃｅｒ」と判定されれば結果として「Ｃａｎｃｅｒ」と判定されるため、「Ｃａｎｃｅｒ」と判定すべき検体を確実に「Ｃａｎｃｅｒ」と判定することができる。

なお、本実施の形態では、判定１、２を並列させ、判定１、２の結果を図９のＳ１１３にて判定することにより、最終的に「Ｃａｎｃｅｒ」であるか否かを判定したが、判定１、２の何れかのみを用いて最終判定を行うようにしても良い。

図１７（ａ）は、判定１のみを用いる場合を示す図であり、図１７（ｂ）は、判定２のみを用いる場合を示す図である。なお、図１７（ａ）、（ｂ）において、図９の処理と同じ箇所には同じ番号が付与されており、判定１、２の近傍のみが示されている。

図１７（ａ）では、図９と同様の判定１が行われた後、データ処理装置３のＣＰＵ３０１は、フラグ１が「Ｃａｎｃｅｒ」であるか否かを判定する（Ｓ１２１）。また、図１７（ｂ）では、図９と同様の判定２が行われた後、ＣＰＵ３０１は、フラグ２が「Ｃａｎｃｅｒ」であるか否かを判定する（Ｓ１２２）。図１７（ａ）、（ｂ）のように最終的な判定が行われる場合、それぞれ、図１５（ａ）〜（ｃ）の判定結果と、図１６（ａ）〜（ｃ）の判定結果が最終的な判定となる。また、図１７（ａ）、（ｂ）のように判定が行われると、それぞれ、上述した判定１、２と同様の効果が奏される。

また、本実施の形態では、図９のＳ１０１において、白血球と上皮細胞（単一上皮細胞、凝集上皮細胞）が分離された。これにより、測定対象となる上皮細胞の癌化の判定精度を高めることができる。また、本実施の形態では、図９のＳ１０２において、単一上皮細胞と凝集上皮細胞が分離された。これにより、測定対象となる上皮細胞の癌化の判定精度を高めることができる。

また、本実施の形態では、図９のＳ１０４においてＮＯと判定されると、「不適検体」である旨が表示されて処理が終了する。これにより、抽出した細胞数が少なく、適正な判定を行うことができない場合でも、細胞の癌化に関する情報の出力を禁止することにより、信頼性の悪い情報が出力されることを未然に防止することができ、適正な診断を円滑に進めることができる。なお、この場合は、測定対象細胞の数が足らなかったことを報知する情報が出力されるのが望ましい。こうすると、上皮細胞の再採取を行う等の措置を円滑に進めることができる。

以上、本発明の実施の形態ついて説明したが、本発明は、上記実施の形態に制限されるものではなく、また、本発明の実施の形態も上記以外に種々の変更が可能である。

たとえば、上記実施の形態では、子宮頸部の上皮細胞が分析対象とされたが、口腔細胞、膀胱、咽頭などの他の上皮細胞、さらには臓器の上皮細胞が分析対象とされ、これら細胞の癌化の判定が行われても良い。

また、上記実施の形態では、副検出部１３において細胞数の検出（プレ測定）が行われたが、生体試料ごとに測定対象細胞の濃度のバラつきが小さく、分析結果への影響が小さい場合には、副検出部１３は省略されても良い。

また、上記実施の形態では、Ｎ／Ｃ比は、側方蛍光強度の波形の幅に基づいて得られる細胞核の幅を示す数値（細胞核の大きさＮ）と、前方散乱光強度の波形の幅に基づいて得られる細胞の幅を示す数値（細胞の大きさＣ）の比として算出された。しかしながら、これに限らず、Ｎ／Ｃ比は、細胞核の面積と細胞の面積の比として算出されても良い。なお、上記実施の形態では、前方散乱光強度の波形の幅に基づいて細胞の幅を示す数値（細胞の大きさＣ）を得た。これにより、所定の方向に長い形をしている細胞がフローセルを流れた際にも、細胞の大きさを精度良く表すことができる。

図１８（ａ）は、図９のＳ１０６における細胞群の抽出範囲の上限を無くした状態、すなわち、図１０（ｃ）の領域Ａ４の右側の境界が右方向に広げられた状態を示す図である。図１８（ｂ）は、図９のＳ１０６における細胞群の抽出範囲（領域Ａ４）の上限と下限の両方を無くした状態を示す図である。

なお、図１８（ａ）、（ｂ）のように領域Ａ４を設定して、上記と同様、１０３５個の検体（サンプル）について癌化の判定を行ったところ、判定２では、感度は上記実施の形態と同様、８３．３％になり、特異度は、それぞれ、９４．６％と９３．３％となり、上記実施の形態から僅かに低下するに留まった。よって、このように抽出する細胞の範囲を広げても、上記実施の形態と同様、適正に「Ｃａｎｃｅｒ」と判定することができる。この結果から、図１８（ａ）、（ｂ）のように領域Ａ４を設定した場合、判定１についても、同様に、感度と特異度は維持されることが類推され得る。

また、上記実施の形態では、図１０（ｄ）に示すＳ期にある正常細胞が有するＤＮＡ量以上のＤＮＡ量を設定する領域Ａ５の左端の値はＶ２１に設定され、右端の値はＳ期にある正常細胞が有するＤＮＡ量以上の細胞全てを含むように設定されたが、かかる設定範囲の最小値と最大値は上記のように固定されるものでなく、感度と特異度が向上するよう、適宜、上記の値以外に設定されても良い。また、図１０（ｅ）に示す２ＣのＤＮＡ量を設定する領域Ａ６の左端と右端の値はそれぞれＶ３１、Ｖ３２に設定されたが、かかる設定範囲の最小値と最大値は上記Ｖ３１、Ｖ３２に固定されるものでなく、感度と特異度が向上するよう、適宜、上記の値以外に設定されても良い。

図１８（ｃ）は、図９のＳ１１１において抽出される２Ｃの細胞の範囲が変更された状態、すなわち、図１０（ｅ）の領域Ａ６の右端が縮められた状態を示す図である。図１８（ｃ）の領域Ａ６のＶ３１とＶ３２は、Ｖ３１とＶ３２の範囲にＶ３０が含まれ、Ｖ３１とＶ３２の範囲の幅が、図１０（ｅ）のＶ３１とＶ３２の範囲の幅Ａより小さいＢとなるよう設定されている。図１８（ｄ）は、図９のＳ１０７において抽出されるＳ期にある正常細胞が有するＤＮＡ量以上の細胞の範囲が変更された状態、すなわち、図１０（ｄ）の領域Ａ５の左端が広げられた状態を示す図である。図１８（ｄ）の領域Ａ５の左端の値Ｖ２１は、Ｖ３１とＶ３２の範囲にＶ３０が含まれ、Ｖ３１とＶ３２の範囲の幅がＡとなるよう設定されている場合に、Ｖ３０より大きくＶ３２より小さい値となるように設定されている。

なお、図１８（ｃ）、（ｄ）のように領域Ａ５、Ａ６を設定して、上記と同様、１０３５個の検体（サンプル）について癌化の判定を行ったところ、判定２では、感度は上記実施の形態と同様、８３．３％になり、特異度は、それぞれ、９８．７％と９８．５％となり、上記実施の形態と略同様となった。よって、このように抽出する細胞の範囲を変化させても、上記実施の形態と同様、適正に「Ｃａｎｃｅｒ」と判定することができる。

また、上記実施の形態では、図９のＳ１０５以降において、まず、Ｖ１１≦Ｎ／Ｃ比≦Ｖ１２の細胞群が抽出され、抽出された細胞群のうちＤＮＡ量がＳ期にある正常細胞が有するＤＮＡ量以上の細胞群が計数され、この計数値が、Ｓ１０７における細胞数またはＳ１１１における癌化比率の分子に用いられた。しかしながら、これに替えて、まず、ＤＮＡ量がＳ期にある正常細胞が有するＤＮＡ量以上の細胞群が抽出され、抽出された細胞群のうちＶ１１≦Ｎ／Ｃ比≦Ｖ１２の細胞群が計数され、この計数値がＳ１０７における細胞数またはＳ１１１における癌化比率の分子に用いられても良い。

また、上記実施の形態では、図９のＳ１０９以降において、まず、Ｖ１３≦Ｎ／Ｃ比＜Ｖ１１の細胞群が抽出され、抽出された細胞群のうちＤＮＡ量が２Ｃの細胞群が計数され、この計数値が癌化比率の分母として設定された。しかしながら、これに替えて、まず、ＤＮＡ量が２Ｃの細胞群が抽出され、抽出された細胞群のうちＶ１３≦Ｎ／Ｃ比＜Ｖ１１の細胞群が計数され、この計数値がＳ１１１における癌化比率の分母として設定されても良い。

この他、本発明の実施の形態は、特許請求の範囲に示された技術的思想の範囲内において、適宜、種々の変更が可能である。

１ … 癌化情報提供装置
４０ … フローサイトメータ（検出部）
４３ … フローセル
３０１ … ＣＰＵ（制御部）

Claims (15)

1. 上皮細胞を含む測定試料に含まれる各細胞から蛍光および散乱光を検出して、蛍光信号および散乱光信号を出力し、
   出力された蛍光信号の波形の差分総和およびピーク値、並びに、出力された散乱光信号の波形の差分総和およびピーク値に基づいて、複数の上皮細胞が凝集した凝集細胞と、単一の上皮細胞とを弁別し、
   弁別した単一の上皮細胞のうち、細胞核の大きさを示す第１データおよび細胞の大きさを示す第２データが所定の条件に合致する細胞を計数し、
   得られた細胞数が閾値未満である場合には、検体が不適検体である旨、又は、細胞の分析が不能である旨を示すメッセージを含む警告情報を出力し、得られた細胞数が閾値以上である場合には、前記警告情報を出力することなく、単一の上皮細胞から得られた蛍光信号に基づいて細胞の癌化に関する情報を出力する、
   ことを特徴とする細胞分析方法。
2. 前記凝集細胞と前記単一の上皮細胞とを弁別する工程では、前記蛍光信号の波形の差分総和をピーク値で除した第１の値、及び、前記散乱光信号の波形の差分総和をピーク値で除した第２の値に基づいて、前記凝集細胞と前記単一の上皮細胞を弁別する、請求項１に記載の細胞分析方法。
3. 前記凝集細胞と前記単一の上皮細胞とを弁別する工程では、前記第１の値が下限値および上限値を含む第１範囲内にあり、かつ、前記第２の値が下限値および上限値を含む第２範囲内にある細胞を単一の上皮細胞として弁別する、請求項２に記載の細胞分析方法。
4. 前記第２範囲は前記第１範囲より大きい、請求項３に記載の細胞分析方法。
5. 前記細胞の癌化に関する情報を出力する工程では、前記第１データおよび前記第２データが前記所定の条件に合致する細胞群に含まれるそれぞれの細胞から得られた蛍光信号に基づいて前記細胞の癌化に関する情報を出力する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞分析方法。
6. 前記所定の条件は、表皮細胞、中層細胞、傍基底細胞および基底細胞から選択される細胞を抽出するための条件である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞分析方法。
7. 前記上皮細胞は、子宮頸部の上皮細胞である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞分析方法。
8. 前記細胞の癌化に関する情報は、癌化の疑いがあるため再検査が必要である旨を示す情報を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の細胞分析方法。
9. 細胞の癌化に関する情報を提供する癌化情報提供方法であって、
   上皮細胞を含む測定試料に含まれる各細胞から蛍光および散乱光を検出して、蛍光信号および散乱光信号を出力し、
   出力された蛍光信号の波形の差分総和およびピーク値、並びに、出力された散乱光信号の波形の差分総和およびピーク値、の少なくとも一方に基づいて、前記測定試料中の単一の上皮細胞を、複数の上皮細胞が凝集した凝集細胞から弁別し、
   弁別した単一の上皮細胞のうち、細胞核の大きさを示す第１データおよび細胞の大きさを示す第２データが所定の条件に合致する細胞を計数し、
   得られた細胞数が閾値以上である場合には、単一の上皮細胞から得られた蛍光信号に基づいて細胞の癌化に関する情報を出力し、得られた細胞数が閾値未満である場合には、細胞の癌化に関する情報の出力を禁止する、
   ことを特徴とする癌化情報提供方法。
10. 前記細胞の癌化に関する情報は、癌化の疑いがあるため再検査が必要である旨を示す情報を含む、請求項９に記載の癌化情報提供方法。
11. 上皮細胞を含む測定試料に光を照射し、前記測定試料に含まれる各細胞から蛍光および散乱光を検出して、蛍光信号および散乱光信号を出力する検出部と、
    表示部と、
    前記検出部から出力された蛍光信号の波形の差分総和およびピーク値、並びに、前記検出部から出力された散乱光信号の波形の差分総和およびピーク値に基づいて、複数の上皮細胞が凝集した凝集細胞と、単一の上皮細胞とを弁別し、弁別した単一の上皮細胞のうち、細胞核の大きさを示す第１データおよび細胞の大きさを示す第２データが所定の条件に合致する細胞を計数し、得られた細胞数が閾値未満である場合には、検体が不適検体である旨、又は、細胞の分析が不能である旨を示すメッセージを含む警告情報を前記表示部に表示させ、得られた細胞数が閾値以上である場合には、前記警告情報を前記表示部に表示させることなく、単一の上皮細胞から得られた蛍光信号に基づいて細胞の癌化に関する情報を前記表示部に表示させる制御部と、
    を備えることを特徴とする細胞分析装置。
12. 前記制御部は、前記蛍光信号の波形の差分総和をピーク値で除した第１の値、及び、前記散乱光信号の波形の差分総和をピーク値で除した第２の値に基づいて、前記凝集細胞と前記単一の上皮細胞を弁別する、請求項１１に記載の細胞分析装置。
13. 前記制御部は、前記第１の値が下限値および上限値を含む第１範囲内にあり、かつ、前記第２の値が、下限値および上限値を含む第２範囲内にある細胞を単一の上皮細胞として弁別する、請求項１２に記載の細胞分析装置。
14. 前記検出部は、前記測定試料を流すためのフローセルと、前記フローセルを流れる前記測定試料に光を照射するための光源と、前記測定試料から蛍光および散乱光を受光する受光部とを含む、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の細胞分析装置。
15. 細胞の癌化に関する情報を提供する癌化情報提供装置であって、
    上皮細胞を含む測定試料に光を照射し、前記測定試料に含まれる各細胞から蛍光および散乱光を検出して、蛍光信号および散乱光信号を出力する検出部と、
    表示部と、
    前記検出部から出力された蛍光信号の波形の差分総和およびピーク値、並びに、前記検出部から出力された散乱光信号の波形の差分総和およびピーク値、の少なくとも一方に基づいて、前記測定試料中の単一の上皮細胞を、複数の上皮細胞が凝集した凝集細胞から弁別し、弁別した単一の上皮細胞のうち、細胞核の大きさを示す第１データおよび細胞の大きさを示す第２データが所定の条件に合致する細胞を計数し、得られた細胞数が閾値以上である場合には、単一の上皮細胞から得られた蛍光信号に基づいて細胞の癌化に関する情報を前記表示部に表示させ、得られた細胞数が閾値未満である場合には、細胞の癌化に関する情報の表示を禁止する制御部と、
    を備えることを特徴とする癌化情報提供装置。

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