JPH0660875B2 - フローサイトメータ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は流体試料が流れるフローチヤンネルを有し光学
的に透明なフローセル及びこれを具備し上記試料の分析
測定をなすためのフローサイトメータに関するものであ
る。

本発明によるフローセル及びフローサイトメータは例え
ば臨床検査の分野において検体血液中の血球等有形成分
を光学的に分類測定する際にきわめて有益である。

従来の技術 液体または懸濁液試料がシース液に包まれてフローチヤ
ンネル内を流れこのチヤンネルの一部に光を入射し得る
ようにしたフローセルは、特に光学的粒子検出技術にお
いて粒子径（または容積）情報を専ら散乱光により与え
る。しかし、この散乱自体はフローセルからの狭角前方
散乱光に近い光を受光して測定されるため、光強度が本
来比較的微弱であり、その反面励起光光源の光強度をよ
り大きくしたり広口径のレンズを用いて大きな立体角で
フローセルに励起光を入射してやる必要があつた。この
ため、フローセルの試料透過光や迷光を遮断して、所要
の散乱光のみを受光し得るようにマスクまたは遮蔽板
（レンズビームストツパ）を光路に介在させるが、励起
光の立体角が大きいことに対応してマスクも大きくなり
狭角散乱光の相当部分を遮断してしまうのみならず、フ
ローセルの散乱光出射境界面で散乱光が反射されて損失
が大きくなり、こうして粒子径に関する散乱光情報の精
細な、換言すれば粒径の高分解能測定が不可能であつ
た。すなわち、従来のフローセルに関する第７図に示す
ごとく、励起光の光軸に対してフローセル８０の出射面
はこれまで直交しており、反射光が散乱光ロス１３０と
してセル外に散逸し集光レンズ９０に到達しないこと、
さらに前方散乱光の大部分が励起光を遮断する際に大き
な遮蔽板１００に遮ぎられて集光レンズ９０の光路に入
つていかないことに照応する難点であつた。もつとも拡
散の小さい事実上平行なレーザビームを励起光源とした
場合、遮蔽板１００は小さくてもよく励起光強度も大き
くしやすいが、フローセル８０の出射境界面の反射によ
る散乱光損失も同様に大きいことは第６図より明らかで
ある。

上述したフローサイトメータは、細胞や各種粒子の有力
な分析手段となり、特に血液試料に関しては螢光染色し
た血球の放出する螢光の水平・垂直方向の異方性比を測
定するもの（特開昭５９−１０２１３９号）、細胞の蛍
光強度分布より細胞の分類計数を行うもの（特公昭５４
−１４９５７号）、細胞の蛍光染色試薬として網状赤血
球に対する選択性の強いチオフラビンＴを用いるもの
（特開昭５９−１４２４６５号）、レーザ光源を用い蛍
光と散乱光を同時測光して網状赤血球を同定計数するも
の（米国特許第４，３２５，７０６号）などが挙げられ
る。これらのうち、前二者は蛍光強度の測定のみを行つ
ているのに対し、後二者は散乱光強度も螢光と同時に測
定し各細胞の同定精度を高めようとしている。レーザ光
源を用いた場合、発行波長が単一であるため励起光源の
波長幅を広げようとすれば複数のレーザを組み込むなど
複雑な光学系を構成しなければならず、ある程度の光源
波長幅が得られても励起によつて放出される螢光波長が
特定され、多種類の細胞の微妙な螢光強度差による応答
が検出しにくくなり一般的に多種の細胞分類が難しいと
いう問題がある。

水銀アークランプまたはキセノンアークランプは単一の
光源でもそれ自体が広い励起光波長範囲（２５０〜６３
０nm）を有し、フイルタを多数設けかつ細胞別に複数の
染料を組合せれば多種の螢光波長の同時検出により多種
の細胞分類が可能となる。しかしながら、前述し第７図
に示したように微弱な散乱光強度の同時検出はそのフロ
ーセル境界面の反射損失が大きく事実上困難であり、こ
のため粒子径による異種粒子の弁別に細孔通過時の導電
率測定を併行するかたちでランプ光源を用いるという光
学的−電気的測定の組合せが必要であつた。（上掲米国
特許第４，３２５，７０６号）。

本発明は、上記の問題点にかんがみ構想され実現された
もので、単一のアークランプ光源で散乱光及び多種の螢
光波長を同時に測定することができこれによつて赤血
球、血小板、白血球の別は勿論、幼若（網状）赤血球、
成熟赤血球等の弁別を同時に可能となし得るフローセル
及びこれを具備し臨床検査装置として好適なフローサイ
トメータを提供することを目的とするものである。

問題点を解決するための手段 本発明は上記の目的を達成するため、粒子を含有する試
料をシース液で包み粒子を整列させて流すフローセル
と、フローセル内の粒子の流れ領域を横切るように光を
照射する光源と、粒子からの光を測定する光学系と、を
備えたフローサイトメータであって：光の入射又は出射
が可能な第１、第２、第３の面を有し、粒子は第１、第
２及び第３の面と平行に一直線状に流れ、第１の面は光
源からの光をほぼ垂直に入射させる面をなし、第２の面
は第１の面と鋭角に交差しており、上記入射光に対して
前方に発せられた光を出射させる面をなし、さらに第３
の面は第１の面と直交しており、上記入射光に対して側
方に発せられた光を出射させる面をなしているフローセ
ル；フローセルを透過した光源からの直接光を遮ぎる遮
光部材；第２の面から出射される光を測光する測光光学
系；第３の面から出射される側方光を測光する測光光学
系；からなることを特色とするものであり、シース液が
試料液体の流れを層流状に包み込んでフローチヤンネル
を流動する際に励起光の光軸に対して事実上直交する励
起光入射面と、フローチヤンネルに入射して光学的に刺
激した領域より放出される散乱光の出射面とを、鋭角的
に交差せしめ得るフローセルを具体化したものである。
さらに、本発明は上記第１の面から出射される、入射光
に対して後方に発せられた光を測光する測光光学系を備
えるフローサイトメータを特色とする、またさらに、本
発明はフローセルの粒子の流れと直交する平面における
横断面が、上記第１、第２、第３により直角三角形をな
しているフローサイトメータを特色とするものである。
このフローセルは、励起用光源と、励起光の光軸に対し
て事実上直交する励起光入射面と光学的刺激域から放出
される散乱光の測光光学系と、光学的刺激域から放出さ
れる螢光の測光光学系とによつて螢光−散乱光を同時測
定するフローサイトメータを構成することができる。こ
のフローサイトメータの励起用光源は水銀アークランプ
あるいはキセノンアークランプであつてよい。また、フ
ローセルの横断面形状は、事実上中心部に微小孔からな
るフローチヤンネルを貫設し励起光が入射して試料の光
学的応答を取出し得る少なくとも刺激域の部分について
は三角形またはこれに近い形をしていることが好都合で
ある。なお、上記フローセルのシース液および試料液入
口、出口については光の入出射に無関係となるので他の
適宜形状であつて差支えない。特に、シース液および試
料液入口は、液体を層流状態を保ちながら微小孔からな
るフローチヤンネルに移動させるためにこのフローチヤ
ンネルの口径よりも大きな直径の円孔を形成し得る半球
形状等にされていてよい。さらに、光学的刺激域を有す
るフローセル入出射面については、この入出射面からフ
ローチヤンネルの微小孔までの距離を小さくする、すな
わちフローセル構成材料の厚みを薄くすることが望まし
い。試料液または粒子の分散媒が水などの場合、フロー
セルの構成材料をガラスにすれば両者の屈折率がほぼ近
似しているので、微小孔とフローセル面との境界におけ
る光反射または屈折の影響が殆んど無視し得る程度であ
ることは言うまでもない。

上記の如き、フローセルは励起光入出射面を鋭角的に交
差させた光学素子を組込んだフローサイトメータは、ア
ークランプ光源からの選択された波長の励起光をフロー
セルに入射し、光学的刺激域から出射した後方螢光およ
び前方の狭角散乱光をそれぞれ測光しデータを解析する
ように構成することにより、血球分類測定装置などに利
用し得る。この場合、前方散乱光と同時に粒子の寸法情
報を得るために側方散乱光を測光しデータ解析に用いる
ようにした血球分類測定装置も製作することができる。

本発明によるフローセルはフローセル８の入射面を励起
光光軸とほぼ直角に、また出射面が入射面に対して鋭角
をなすように交差して構成される。フローチヤンネルに
集束された励起光は遮蔽板10で遮断し、散乱光を集光レ
ンズ９で受光する（第８図）。シース液および試料液入
口５０がほぼ半球状部からなる図示の三角フローセル８
は、励起光の入出射面の部分の横断面が三角形をしてい
る。フローチヤンネル４０はこの三角形の部分を貫通す
る微小孔からなつている。（第９図）三角フローセル８
を光路に配置したフローサイトメータは第１図に示すよ
うに、水銀またはキセノン等のアークランプ光源１、コ
ールドミラー３、励起光波長選択フイルタ４、スリツト
を穿設したスリツト板５、ダイクロイツクミラー６、こ
のダイクロイツクミラー６の背後に設けた励起光モニタ
１６、三角フローセル８の入射前面に設けた集光レンズ
７、三角フローセル８の出射面後方の遮蔽板１０、集光
レンズ９、散乱光から迷光等をカツトするピンホール板
１１、散乱光受光部１２、ダイクロイツクミラー６を透
過した螢光に対するピンホール板１３、受光用フイルタ
１４、螢光受光部１５、さらに散乱光受光部１２、螢光
受光部１５および励起光モニタ１６からのそれぞれの光
強度信号をデータとして記憶し解析するデータ解析部２
０を備えてなるものである。

作用 上記のフローセルおよびフローサイトメータは次のよう
に作用する。

三角フローセル８の励起光入射面が励起光光軸に直交し
ていると、集束された励起光束はフローセル８中央部の
フローチヤンネル４０に到達した後、前方散乱光１８に
ついてはその狭角散乱光が出射面から集光レンズ９を経
て受光系に進むが、この時フローセル８の出射面は狭角
散乱孔の光軸に対して比較的直角に近い角度をなしてお
り、このためフローセル８の構成材料内部から出射境界
面に当たつて反射され受光系から外れていく狭角散乱光
の損失３０は極めて少なくなる。励起光の光軸に対して
直角方向の側方散乱光２０を受光する場合（第５図）、
フローセル８の側方散乱光出射面を励起光光軸とほぼ平
行になるように配置すれば、側方散乱光の損失は最小に
なり微小粒子の散乱状況も受光データとして入手でき
る。フローセル８の透過光（前方）は迷光と共に遮蔽板
１０がカツトする。

フローセル８に入射される励起光１７は光源１の発光波
長から特定の波長域に絞るため励起光波長選択フイルタ
４を透過させスリツト５で点光源にした後、ダイクロイ
ツクミラー６で吸光波長に達しない波長光を反射し吸光
波長を超える波長光を透過させて二分割する。ダイクロ
イツクミラー６の透過光は励起光モニタ１６に達し、こ
こでフローセル８に入射すべき励起光強度を調節して最
適光量が設定される。

受光部１２，１５はいずれも光電増倍管のような変換機
能を有し、前者は狭角散乱光の後者は螢光の光強度信号
を受光する。第５図のものでは、受光部２３が側方散乱
光２０を受光する。

上記受光部の検知した散乱光、螢光の強度信号は、例え
ば第２図および第３図に示すような強度−頻度分布を有
し、試料が血液である場合各血球毎の光応答を第４図に
示すように二次元表示することにより、公知の知見に従
つて通常赤血球、血小板、網状赤血球（幼若赤血球）、
白血球などに分類計数することができる。こうした光強
度信号を記憶解析するのがデータ解析部２０である。

発明の効果 本発明は次の如き特有の効果を有する。

(1)フローセルを出射する際の散乱光の損失が著しく小
さくなるため、フローチヤンネルを通過する粒子の寸法
・形態特性を高精度、高分解能の散乱光強度信号によつ
て確定し得る。

(2)微小な散乱光の変動も逃がさないからフローサイト
メータによる判別可能な粒子の種類や弁別速度が増大し
た。

(3)励起用光源としてアークランプなど広い波長幅の光
源を用い得るので、光刺激に用いる波長選択の融通性が
高くなり、フローサイトメータの操作範囲を拡大すると
共に容易化し、試料の種類や測定条件の変化に対して追
従性が高まつた。

(4)レーザ光源を用いなくてもよいのでフローサイトメ
ータの製作保守が簡易化され、製作コストが低減され
た。

実施例 第８，９図及び第１，５図に示すものは本発明によるフ
ローセル及びフローサイトメータの実施例であつて、フ
ローセルの光入出射域の横断面が三角形に形成されたも
のである。この三角フローセル８のシース液及び試料入
口５０は直径約１２mmの半球状部に直径約８mmで開口し
斗状に狭窄して約３００μ径のフローチヤンネルにつ
ながり、上端部に液流出口が開口している。しーす液
（食塩水など）でオーラミン染色等した血液試料を包囲
するように層流状に送り込みフローチヤンネルを通過さ
せる。この時水銀アークランプ１、励起光波長選択フイ
ルタ４、スリツト５を通過した励起光１７を集光レンズ
７で集束後三角フローセル８の三角形横断面部に入射さ
せフローチヤンネルの細流に交差結像させる。螢光染色
された試料中の各血球細胞から発生する散乱光は、フロ
ーセル前方の遮蔽板１０で狭角散乱光１８を残して遮断
された後受光部１２により前方散乱光強度信号として光
電変換されデータ解析部２０に送入され、粒子検出に伴
う諸情報が集積、分類、計数等される。前方散乱光及び
後方赤色螢光の各強度信号データは第２〜４図に表示さ
れ得る（単位は相対的）。

第５図のフローサイトメータは、第１図の装置に細胞
核、顆粒等に関する内部情報を保持した側方散乱光の測
光系を付加したもので、側方散乱孔２０はフローセル８
を出射し集光レンズ２１で集光されたピンポール板２２
上に試料像として結像された後受光部２３に導かれ、前
方散乱孔の受光部１２からの信号、さらにフローセル８
の後方螢光を波長幅で２分割して受光し各螢光強度信号
に変換する受光部１５及び受光部２６からの信号や励起
光モニタ１６からの制御データなどもデータ解析部に送
り込まれる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明によるフローセルを使用した散乱光−螢
光フローサイトメータの基本構成図、第２図は第１図の
フローサイトメータで測定計数された血球の散乱光とス
トグラムを表わすグラフ、第３図は同様の螢光ヒストグ
ラムを表わすグラフ、第４図はこれらのヒストグラムを
二次元表示することにより血球細胞の分類の弁別域を画
定するためのグラフ、第５図は第１図の異型例を示す基
本構成図、第６図は従来のフローセルにレーザ光源の励
起光を入射したときの説明図、第７図は従来のフローセ
ルにアークランプ光源の励起光を入射したときの説明
図、第８図は本発明によるフローセル（本例では三角フ
ローセル）にアークランプ光源の励起光を入射したとき
の説明図、第９図は三角フローセルの一例を示す斜視図
である。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】粒子を含有する試料をシース液で包み粒子
   を整列させて流すフローセルと、フローセル内の粒子の
   流れ領域を横切るように光を照射する光源と、粒子から
   の光を測光する光学系と、を備えたフローサイトメータ
   であって、下記の構成要素を具備することを特徴とする
   フローサイトメータ： 光の入射又は出射が可能な第１、第２、第３の面を有
   し、粒子は第１、第２及び第３の面と平行に一直線状に
   流れ、上記第１の面は光源からの光をほぼ垂直に入射さ
   せる面をなし、上記第２の面は上記第１の面と鋭角に交
   差しており、上記入射光に対して上記前方に発せられた
   光を出射させる面をなし、さらに上記第３の面は上記第
   １の面と直交しており、上記入射光に対して側方に発せ
   られた光を出射させる面をなしているフローセル；該フ
   ローセルを透過した上記光源からの直接光を遮ぎる遮光
   部材；上記第２の面から出射される光を測定する測光光
   学系；上記第３の面から出射される側方光を測光する測
   光光学系。
2. 【請求項２】特許請求の範囲第１項に記載のフローサイ
   トメータにおいて、さらに上記第１の面から出射され
   る、入射光に対して後方に発せられた光を測光する測光
   光学系を備えることを特徴とするフローサイトメータ。
3. 【請求項３】特許請求の範囲第１項に記載のフローサイ
   トメータにおいて、フローセルの粒子の流れと直交する
   平面における横断面が、上記第１、第２、第３の面によ
   り直角三角形をなしていることを特徴とするフローサイ
   トメータ。