FI70481B - Foerfarande foer bestaemning av cellvolymen - Google Patents

Description

1 70481

Menetelmä solutilavuuden määrittämiseksi

Keksintö koskee menetelmää solutilavuuden määrittämiseksi biologisessa solunäytteessä.

5 Monilla biologian ja lääketieteen aloilla on tär keätä tietää solun tilavuus. Esimerkiksi punasolujen keskimääräinen solutilavuus (MCV) on eräs taudinmäärityksessä käytettävä vakioparametri.

Eräs tavanomainen ja melko yksinkertainen solujen 10 keskimääräisen tilavuuden määritysmenetelmä on suspensiossa (esim. veressä) olevien solujen sakkauttaminen (laskeuttaminen) ja suspension kokonaistilavuuden sekä tiiviin solusakan tilavuuden mittaaminen. Solutiheys lasketaan erillisellä menetelmällä, ja keskimääräinen solu-15 tilavuus saadaan jakamalla solusakan tilavuus kokonaistilavuuden ja solutiheyden tulolla. Tämä menetelmä on kohtuullisen tarkka mutta ei tarpeeksi tarkka suurta tarkkuutta vaativiin sovellutuksiin, joissa on tehtävä korjauksia solusakan solujen väliin jääneen nesteen vuok-2Q si. Lisäksi itse menetelmä on hankala ja aikaavievä.

Tämän keksinnön päätarkoituksena onkin saada aikaan automaattinen solutilavuuden määritysmenetelmä, jossa soluja ei tarvitse saostaa suspensiosta ja jotka lisäksi eliminoivat virheet, jotka johtuvat epätäydellisestä saos-25 tumisesta. Keksinnön tarkoituksena on edelleen, että saada aikaan menetelmä, joka on nopea, yksinkertainen ja olennaisesti kvantitatiivisesti toistettava.

Suspensiotiivistysmenetelmästä tunnetaan myös kehittyneempi versio, jossa käytetään läpivirtaussoluanaly-30 saattoria eli virtaussytometria. Tällaisia ratkaisuja on esitetty mm US-patenteissa 3 275 834 (Stevens) ja 2 565 508 (Coulter). Niiden tarkoituksena on lisätä solu-tilavuusmittausten nopeutta ja tarkkuutta.

Virtaussytometrilaitteissa suspensiossa olevat solut 35 kulkevat havaintovyöhykkeen läpi, joka synnyttää viestejä 2 70481 solujen eri ominaisuuksien mukaan. Solutiheys on yleensä niin pieni, että havaintovyöhykkeessä on vain yksi solu kerrallaan. Em. Stevensin patentissa havaintovyöhyk-keen määrää valonsäde, kun taas Coulterin patentissa 5 havaintovyöhyke on sähköimpedanssin havaitseva aukko.

Kun havaintovyöhyke on valonsäde, tavanomaiset sytometri-ratkaisut käyttävät tyypillisesti valon hajaantumista tai sammumista solun koon mittana. Nämä optiset viestit riippuvat kuitenkin myös solun koosta ja valontaitekertoimesta 10 solutilavuuden lisäksi, joten niissä esiintyy virhemahdollisuus. Sähköimpedanssin tunnistavaa aukkoa solutilavuuden mittaamiseen käyttävissä laitteissa ilmaisee aukon impedanssin muutos solun tilavuuden, ja tässä menetelmässä syntyy virhettä solun muodon ja sähköresistanssin vuok-15 si. Nykyisin käytössä oleville solutilavuuden virtaussyto-metrimittausmenetelmille on siis ominaista se, että mittaustuloksia huonontavat solujen muut ominaisuudet kuin tilavuus, ja että nämä ominaisuudet havaitaan samanaikaisesti tilavuuden kanssa ja että ne ovat hankalia eristää, 2Q arvioida ja siten myös korjata. Esimerkkinä voidaan mainita, että käytettäessä jompaakumpaa em. patenttien mukaisista ratkaisuista on todennäköistä, että kahdelle solulle, joilla on sama tilavuus mutta eri muoto, saadaan erisuuret tilavuudet.

25 Tämän keksinnön tarkoituksena on käyttää virtaus- sytometrimenetelmää solutilavuuden automaattiseen määrittämiseen, mutta sillä tavalla, että varsinaisen solutilavuuden mittauksen riippuvuus solun muista ominaisuuksista (esim. muoto, taitekerroin, impedanssi) vähenee.

3Q Keksintö koskee menetelmää solutilavuuden määrittä miseksi biologisessa solunäytteessä. Menetelmälle on tunnusomaista, että (a) näytetteessä olevat solut suspendoidaan väliaineeseen, joka sisältää väriainetta, joka määrätyn valostimulaation 35 vaikutuksesta aiheuttaa fluoresenssireaktion ja joka ei 3 70481 tunkeudu eikä oleellisesti tartu soluihin, (b) saatu suspensio johdetaan optisen mittausvyöhykkeen läpi muodostamalla suspensiosta vyöhykkeen läpi kulkevan näytevirran, joka läpimitaltaan on soluja suurempi, 5 mutta rajoitettu niin, että vain yksi solu kerrallaan kulkee vyöhykkeen läpi, johon määrätty valostimulaatio kohdistetaan, (c) vyöhykkeen läpi kulkevien solujen aiheuttaman fluore-senssiemission pieneneminen detektoidaan, ja 10 (d) solutilavuus määritetään detektoidun fluoresenssi- emission pienenemiseen voimakkuuden perusteella.

Tämän keksinnön periaatteellinen perusta on fluo-resoinnin käyttö poissuljettavan tilavuuden merkitsemiseksi. Tämän keksinnön mukaan solut ovat isotoonisessa 15 väliaineessa, jonka sisältämä fluoresoiva väri ei tunkeudu soluihin eikä tartu niiden pintoihin. Solususpensio tuodaan virtaussytometrin läpi, jossa se muotoutuu putkimaiseksi näytevirraksi, joka kulkee fokusoidun valonsäteen läpi. Näytevirran läpimitta on suurempi kuin solu-20 jen, ja näytevirrassa olevat solut kulkevat yksitellen valonsäteen läpi. Näytevirtaa valaisevan valonsäteen aallonpituus on valittu siten, että näytevirrassa oleva fluoresoiva väri virittää tehokkaasti. Näytevirrasta tuleva fluoresenssivalo kootaan sopivilla linsseillä ja suo-25 timilla ja tuodaan ilmaisimeen, joka voi olla esim. mo-nistusvalokenno. Tämän keksinnön mukaisesti, samoin kuin tavanomaisissakin virtaussytometriratkaisuissa, näytevirran ja fokusoidun valonsäteen leikkauskohta määrittää havaintovyöhykkeen. Tämän keksinnön mukaisesti kuitenkin 30 solun poissaollessa havaintoalueelta aiheuttaa näytevirrassa oleva väri tasaisen fluoresenssivalon tason, joka puolestaan aiheuttaa sen, että ilmaisimen lähtöviesti pysyy vakiona. Kun havaintoalueelle tulee solu, havain-toalueella olevan fluoresenssivärin tilavuudesta katoaa 35 solun tilavuutta vastaava osa, jolloin havaintoalueen lä- , 70481 4 hettämän fluoresenssivalon voimakkuus pienenee vastaavasti. Tämä taas ilmenee ilmaisimen lähtöviestin pienenemisenä. Kun solu siis kulkee havaintovyöhykkeen läpi, se aiheuttaa pulssin, jonka amplitudi on verrannollinen 5 solun tilavuuteen.

Kuvio 1 esittää kaupallisesti saatavan virtaussyto-fluorometrilaitteen erästä versiota, ja kuvio 2 on esimerkki tämän keksinnön periaatteiden mukaisesti aikaansaadusta ihmisen punasolujen tilavuus-10 jakautumasta.

Kuviossa 1 on esitetty kaaviomaisesti laite, jota voidaan käyttää tämän keksinnön periaatteiden toteuttamiseen. Itse asiassa kuvio 1 esittää tiettyä laitteistoa, jota yhtiö Ortho Instruments (410 University Avenua, 15 Westwood, Massachusetts Q209Q, USA) markkinoi nimellä CYTOFLUOROGRAPII^. Kuvion 1 laitteisto käyttää virtaus-systometrian periaatteita, ja se pystyy havaitsemaan solun fluoresenssivaloreagoinnin erilaisille valaistustyy-peille.

20 Laitteistossa on virtauskanava 106, jossa nestesus- pensiossa olevat solut kulkevat havaintoalueen läpi jonossa nopeaa vauhtia (esim. 2500 solua sekunnissa). Havainto-alueen rajaa soluvirran ja valonsäteen leikkauskohta; tyypillisessä tapauksessa käytetään kaasulaserista saa-25 tavaa tahdistettua valoa. Kun solu kulkee havaintoalueen läpi, se vaikuttaa tulevaan valoon useilla eri tavoilla. Osan valosta se tietenkin imee itseensä, osa valosta heijastuu suhteellisen pienissä kulmissa tulevaan valonsäteeseen nähden, ja osa valosta taas heijastuu tulevan valon-3Q säteen suunnasta melkoisesti poikkeaviin suuntiin, esim. suorassa kulmassa siihen nähden. Solusta itsestään ja sen mahdollisesti aikaisemmasta värjäyksestä riippuen saattaa esiintyä myös fluoresenssivalon emissiota.

Tavanomaisessa käytössä soluvirtaan nähden eri suun-35 tiin asetetut valosensorit havaitsevat tietyn reaktiosar- 5 70481 jän kullekin tietylle solutyypille. Kuviossa 1 on argoni-onilaser 101 sekä heliumneonlaser 102, joiden lähettämä koherentti valo tuodaan peilien 103 ja 104 sekä linssin 105 avulla virtauskanavan 106 havaintoalueeseen. Kuten 5 tekniikan tasosta tiedetään, solunäytevirta kulkee lami-naarivirtauksena nestevirtausputkessa, mikä takaa sen, että vain yksi solu kerrallaan tulee valaistuksi havain-toalueessa. Kun linssistä tuleva valo valaisee kutakin solua tällä tavoin, voidaan tutkia solun ja valon vuorovaiku-10 tusta.

Sammutusanturi 108 havaitsee solun estämän valon määrän, ja valoanturit 109 ja 110 havaitsevat eteenpäin tapahtuvan valon heijastumisen kartiossa, jonka puolikul-ma on 20°. Anturien 108, 109 ja 110 kehittämät sähkövies-15 tit tuodaan vahvistimiin 120 ja 121, jotka muokkaavat viestit amplitudiltaan yms sopiviksi jatkotarkastelua ja/tai esittämistä varten.

Solun lähettämä fluoresenssivalo havaitaan suorassa kulmassa sekä soluvirran suuntaan että tulevan valon 2Q akseliin nähden. Pyöröpeili 25 ja kokoojalinssi 107 keräävät tämän valon suunnilleen kartioksi, jonka puolikulma on 2Q°, ja tuovat sen aukkoon 111, värinerottelupeiliin 112 sekä toiseen peiliin 113. Ensimmäinen värisuodin 114 (joka päästää lävitseen esim. suhteellisen pitkän aallon-25 pituuden omaavaa valoa, esim. punaista) tuo valitun valon erottelupeilistä 112 valoanturiin 117 (joka voi olla esim. monistusvalokenno. Toinen suodin 115 päästää selektiivisesti lävitseen eriväristä valoa (esimerkiksi suhteellisen lyhytaaltoista valoa, esim. vihreää) toisesta peilis-30 tä 113 toiseen valoanturiin 116. Anturien 116 ja 117 säh-köviestit, jotka esiintyvät ko solujen lähettämää valoa vastaavina pulsseina, tuodaan vahvistimiin 118 ja 119 käsittelyä varten.

Anturivalitsin 122 muodostaa vahvistimien 118-121 35 viesteistä tuloshistogrammeja. Eräs hyödyllinen tulostus- 6 70481 muoto on esim. näyttää punafluoresenssin (anturista 117) amplitudi vihreän fluoresenssin anturista 116 amplitudin funktiona. Tällainen histogrammi onkin esitetty näytössä 123, jonka jokainen piste vastaa yhtä solua. Histogram-5 min pisterykelmät esittävät samantyyppisten solujen ryhmiä. Alalla kohtuullisenkin taidon omaaville on ilmeistä, että tällä tavoin voidaan muodostaa histogrammeja, joissa pienen hajaantumiskulman valo esitetään vihreä fluoresenssin funktiona, aksiaalivalon sammumisen funktio-1Q na, tsm.

Tyypillisessä tapauksessa virtauskenno 106 on tehty litteistä kvartsilasiosista, ja siinä on erityismuotoil-tu suihkusuutin ja suppilo, joilla taataan vakaa laminaa-rinen näytevirtaus samankeskisen suojavirtauksen sisällä.

15 Tavanomaisessa ratkaisussa monistinvalokennojen 116 ja 117 muodostamat viestit ovat siis positiivisia pulsseja, jotka johtuvat virtauskanavassa 106 olevan, fluoresoivalla värillä värjätyn solun valaisusta. Tämän keksinnön mukaisesti monistusvalokenno (esim. 116) saa suotimes-2Q ta 115 jatkuvan fluoresenssivaloviestin, ja solun kulkeminen virtauskanavan 106 havaintoalueen läpi aiheuttaa negatiivisten pulssien tuomisen vahvistimeen 118 solun eliminoidessa tai olennaisesti vähentäessä havaintoalueelta tulevaa fluoresenssivaloa. Vahvistin 118 on parempi teh-25 dä negatiivissuuntaiseksi kuin positiivissuuntaiseksi.

Tämä on alalla tavanomaisen kyvykkyyden omaavien helposti hallittavissa.

Tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä voidaan käyttää erilaisia väriaineita tai fluoresoivia makromole-30 kyylejä. Eräässä edullisessa suoritusmuodossa väriaine tehdään konjugoimalla fluoreseiini-isotiosyanaattia deks-traaniin (FITC-dekstraaniin), jonka molekyylipaino on noin 20 000. Suuret dekstraanimolekyylit estävät värin tunkeutumisen soluun, eikä FITC-dekstraani tartu solujen 35 pintaan. Solususpension sopiva konsentraatio on 0,01-1 7 70481 paino-% FITC-dekstraania. Tällaiselle väriaineelle sopiva valolähde on 488 nm argonlaser, jollainen on mu-kana em. CYTOFLUOROGRAPH -laitteistossa. Solususpension valaiseminen sinisellä argonlaserilla 101 synnyttää vih-5 reän fluoresenssivalon, joka läpäisee värierottelupeilin 112, heijastuu pelistä 113 ja kulkee vihersuotimen 115 läpi ja muunnetaan sähköviesteiksi monistusvalokennossa 116.

Tämän keksinnön periaate perustuu tilavuuden pois-10 sulkemiseen, ja sen mukaisesti fluoresenssinäytevirran on oltava suurempi kuin siinä suspensiossa olevan solun. Muutoin suuremman solun kulkeminen optisen havaintoalueen läpi aiheuttaisi vain solutilavuuden osan poissulkemisen. Kun havaintoalue on sopivasti suurempi kuin sen läpi kul-15 keva solu, tämän havaintoalueesta poissulkeina tilavuus voidaan ilmaista näytevirtaa leikkaavan lasersäteen, näy-tevirran läpimitan ja solutilavuuden funktiona siten, että poissuljettu tilavuusosa on solutilavuus jaettuna lasersäteen korkeuden ja näytevirran poikkipinta-alan tulolla. 20 Jos valonvoimakkuus on tasainen lasersäteen poikkipinnalla, poissuljettu tilavuusosa on suoraan verrannollinen fluoresenssitilavuuspoissulkupulssiin. On kuitenkin todennäköisempää, että lasersäteen valonvoimakkuus ei ole tasainen vaan noudattaa poikkipinnalla esim. Gaussin jakau-25 maa keskustan ollessa voimakkaampi ja voimakkuuden laskiessa reunoille päin. Tällöin on suositeltavampaa ja tarkempaa mitata poissulkupulssien amplitudin lisäksi myös näiden pulssien kertyvä integraali (siis pulssin amplitudia ajan funktiona kuvaavan käyrän alle jäävä ala). 30 Poissulkupulssien integraali esittää tilavuuden poissulku-viestin keskiarvoa epätasaisen valovoimakkuusjakauman omaavaa laseria käytettäessä. Useissa sovellutuksissa on suositeltavaa käyttää solutilavuuden mittana tilavuuden poissulkupulssin integraalia.

35 Tämän toteuttaminen pelkän amplitudiseurannan ase mesta on alaa hallitsevien helposti tehtävissä vaihtamalla 8 70481 esim. vahvistin 118 sellaiseksi, että se integroi monis-tusvalokennosta 116 kanavaa 2 pitkin tulevat pulssit.

Tyypillisessä tapauksessa fluoresenssitilavuuden poissulkupulssien käyttäminen solutilavuuden mittana 5 antaa melko alhaisen signaalikohinasuhteen. Kuviossa 2 on esitetty esimerkkinä ihmisen punasoluja vastaavien fluo-resenssitilavuuden poissulkupulssien jakauma, kun vereen on lisätty edellä esitetyllä tavalla FITC-dekstraania. Kuviossa 2, jossa abskissana on integroitu pulssiampli-1Q tudi ja oordinaattana tapahtumien lukumäärä, eli vastaavan integroidun pulssiamplitudin omaavien solujen lukumäärä, esiintyy pulssiamplitudiakselin alapäässä jyrkkä leikkauskohta, jonka aiheuttaa kuvion 1 mukaisen laitteiston elektroniikka. Voidaan mainita, että ihmisen pu-15 nasolujen tilavuusjakauma on symmetrinen ja noudattaa suunnilleen Gassin jakaumaa.

Näiden havaittujen ja teoreettisten jakaumien ominaisuuksia voidaan tarkastella kvantitatiivisesti määrittelemällä variaatiokertoimeksi (COV) keskihajonnan (stan-20 dardipoikkeaman) suhde keskiarvoon. Jos viestit olisivat kohinattomia, kuvion 2 esittämän jakauman variaatiokerroin olisi 0,15-0,2 (viestien kohinalla on taipumusta suurentaa variaatiokerrointa). Kuvion 2 tiedoille todellinen variaatiokerroin oli 0,8. Kuvion 2 analyysi osoit-25 taa siis, että viesti on kovin kohinainen, joten fluoresenssi-integroinnin ja -analysoinnin elektroniikan ohjaamisessa sekä sen antamien tietojen tulkinnassa esiintyy joitakin vaikeuksia.

Tämän keksinnön erään piirteen mukaisesti voidaan 30 poissulkupulsseja käyttää solutilavuuden mittaamiseen huomattavasti tehokkaammin Hipaisemalla fluoresenssi-integrointi ja -analysointielektroniikka solusta saatavalla riippumattomalla viestillä. Tällaisia riippumattomia viestejä voivat olla esim. anturien 109 ja 110 vastaanottama 35 pienen kulman heijastuma tai peilin 112 ja monistusvalo- 9 70481 kennon 117 havaitsema laajan kulman heijastuma, kunhan vain peili 112 ja suodin 114 muunnetaan heijastumaa (esim. sinistä valoa) havaitseviksi. Itse asiassa kuvion 2 tiedot saatiin Hipaisemalla fluoresenssi- ja analysointi-5 elektroniikka pienen kulman hajaantumaviestillä, joka saadaan samanaikaisesti fluoresenssiviestin kanssa solun kulkiessa lasersäteen poikki. Toisin sanoen antureilla 109 ja 110 tarkkaillaan valoa, jonka solu on hajottanut ja heijastanut kulkiessaan havaintoalueen läpi, ja tätä 10 käytetään vahvistimessa 120 aiheuttamaan sen, että anturi-valitsin 122 ottaa vastaan ja käsittelee vahvistimesta 118 tulevan fluoresenssitiedon. Sama voidaan vaihtoehtoisesti hoitaa vahvistimesta 119 tulevalla laajan kulman hei-jastusyiestillä.

15 Kohinaisia fluoresenssitilavuuden poissulkupulsseja voidaan myös käyttää hyvin tarkasti mittaamaan solujoukon keskimääräistä solutilavuutta, jos tutkittavana on tarpeeksi suuri määrä soluja. Tässä ratkaisussa voidaan käyttää hyväksi tunnettuja tilastollisia yhtäpitävyyksiä määritet-20 täessä mittauksen keskiarvon tarkkuutta. Esimerkiksi keskimääräinen integroitu poissulkuviesti voidaan määrittää 1 % tarkkuudella ja 99 % luotettavuustasolla, jos viestin jakauman variaatiokerroin on 0,8 ja jos analysoitavina on 50 000 solua. Keskiarvo voidaan vastaavasti määrätä tar-25 kemminkin, jos käytettävissä on enemmän soluja.

Joissakin olosuhteissa saattaa esiintyä hajailmiöi-tä, joiden kompensointiin tarvitaan suurta tarkkuutta.

Ensinnäkin viestiin saattaa vaikuttaa tuleva tai fluoresentti valo, jonka solu hajauttaa tai imee. Vaik-30 ka tällainen heijastuminen ja absorptio jääkin yleensä minimaaliseksi, niiden vaikutusta voidaan kuitenkin pienentää. Heijastumailmiöitä voidaan vähentää mahdollisimman paljon valitsemalla virtauskanavassa 106 kulkevan näytteen ja suojanesteen taitekertoimet samaksi kuin solun 35 taitekerroin. Absorptioilmiöitä voidaan taas minimoida 70481 ίο valitsemalla viritys- ja emissioaallonpituudet oikein.

Toiseksi saattaa erittäin tarkkoihin määrityksiin vaikuttaa solun aiheuttama näytevirran häirintä. Jos näy-tevirran läpimitta on vain hiukan solun läpimittaa suu-5 rempi, negatiivista poissulkupulssia saattaa seurata positiivinen pulssi, joka on yleensä suurempi, ja negatiivinen poissulkupulssi yleensä pienempi, solun läpimitan lähestyessä havaintoalueen kokoa.

Äärimmäisessä tapauksessa, kun näytevirta on hyvin 10 pieni, varsinainen poissulkupulssi saattaa olla mitättömän pieni, kun taas sen jäljessä tuleva positiivinen pulssi voi olla suurikin. Mitattavina olevien solujen sekä niiden suhteellisten läpimittojen tuntemus mahdollistaa näytevirran koon valinnan siten, että positiiviset jälki-15 pulssit minimoituvat ja negatiivisten pulssien integroinnin tarkkuus siis säilyy. Positiiviset jälkipulssit voidaan eliminoida myös elektronisilla havainnoinneilla ja liipaisu-korjauksilla, mikä kuitenkaan ei ole yhtä suositeltavaa.

Claims (6)

1. Menetelmä solutilavuuden määrittämiseksi biologisessa solunäytteessä, t unnettu siitä, että 5 (a) näytteessä olevat solut suspendoidaan väliaineeseen, joka sisältää väriainetta, joka määrätyn valostimulaation vaikutuksesta aiheuttaa fluoresenssireaktion ja joka ei tunkeudu eikä oleellisesti tartu soluihin, (b) saatu suspensio johdetaan optisen mittausvyöhykkeen 10 läpi muodostamalla suspensiosta vyöhykkeen läpikulkevan näytevirran, joka läpimitaltaan on soluja suurempi, mutta rajoitettu niin, että vain yksi solu kerrallaan kulkee vyöhykkeen läpi, johon määrätty valostimulaatio kohdistetaan, 15 (c) vyöhykkeen läpi kulkevien solujen aiheuttaman fluore- senssiemission pieneneminen detektioidaan, ja (d) solutilavuus määritetään detektoidun fluoresenssi-emission pienenemisen voimakkuuden perusteella.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n -2Q n e t t u siitä, että detektointivaihe käsittää vyöhykkeestä tulevan fluoresenssiemission voimakkuutta kuvaavan pulssisignaalin muodostamisen, ja että määritysvaihe käsittää pulssisignalain integroimisen keskimääräistä solutilavuutta kuvaavan signaalin muodostamiseksi.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se lisäksi käsittää vaiheen, jossa valostimulaatiosta johtuva valon hajonta vyöhykkeessä olevista soluista detektoidaan ja että detektointi- ja määritysvaiheet perustuvat valostimulaatiosta saatavien 3Q komponenttien detektointiin.

4. Jonkin patenttivaatimusten 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että väriaine on dekstraa-niin konjugoitua fluoreseiini-isotiosyanaattia.

5. Jonkin patenttivaatimusten 1-4 mukainen mene- 12 70481 telmä, tunnettu siitä, että vyöhykettä valotetaan sinisellä värialueella olevalla fokusoidulla kohe-rentilla valolla.

6. Jonkin patenttivaatimusten 1-5 mukainen mene-5 telmä, tunnettu siitä, että näyte saatetaan laminaariseen virtaukseen virtaavan kantajan sisällä, jolloin väliaineen ja kantajan optiset taitekertoimet on valittu solujen taitekertoimen mukaan. 13 70481