DK154457B - Fremgangsmaade til automatisk cellevolumenbestemmelse - Google Patents

Description

DK 154457 B

Den foreliggende opfindelse angår automatiseret undersøgelse og karakterisering af biologiske materialer. Nærmere betegnet angår opfindelsen en fremgangsmåde til automatisk cellevolumenbestemmel-se.

05 Inden for mange biologiske og medicinske områder er det vig tigt at kende en celles volumen. Eksempelvis er middelcel levolumenet (MCV) for erythrocytter en hæmatologisk standardparameter, der benyttes ved sygdomsdiagnosticiering.

En kendt og ret ukompliceret fremgangsmåde, der er benyttet 10 til bestemmelse af middelvolumenet for celler i en suspension såsom blod, er at sedimentere cellerne og at måle det totale volumen for cellesuspensionen samt det af de sammenpakkede sedimenterede celler optagne volumen. Cellekoncentrationen måles ved hjælp af separate midler, og middelcellevolumenet beregnes som det sammenpak-15 kede cellevolumen divideret med produktet af det totale volumen og cellekoncentrationen. Denne fremgangsmåde er rimeligt nøjagtig, men er midlertid ikke tilstrækkeligt nøjagtig til visse anvendelser, som kræver, at der udføres korrektioner for den væske, som er indfanget mellem de pakkede celler. Endvidere er selve fremgangsmåden 20 langsommelig og langvarig.

Det er følgelig et primært formål for opfindelsen at tilvejebringe fremgangsmåder til automatisk cellevolumenbestemmelse, hvormed man undgår behovet for at sedimentere celler fra suspensionen, og hvormed man endvidere undgår fejl forårsaget af en ufuldstændig 25 sammenpakning under sedimenteringen. Det er endvidere et formål, at fremgangsmåden ifølge opfindelsen skal være kortvarig, simpel og i det væsentlige kvantitativt gentagelig.

Den kendte teknik omfatter også fremgangsmåder til cellevo-lumenmåling ved at benytte en strømning gennem celleanalyseap-30 parater, der også kendes som strømningscytometre. Der kendes forskellige typer af disse metoder, heri indbefattet det fra USA patentskrifterne 3.275.834 og 2.565.508 kendte. Disse kendte metoder er bestemt til at forbedre den hastighed og præcision, hvormed cellevolumenmålingerne kan udføres.

35 I strømningscytometriske instrumenter strømmer celler i sus pension igennem en følezone, der frembringer signaler, som står i relation til forskellige celleegenskaber. Sædvanligvis er ceilekoncen- 2

DK 154457 B

trationen si lav, at kun en enkelt celle befinder sig i følezonen ad gangen. I systemer af den type, hvorpå ovennævnte USA patentskrift 3.275.834 viser et eksempel, er følezonen dannet af en lysstråle, hvorimod følezonen i systemer af den type, hvorpå oven-05 nævnte USA patentskrift 2.565.508 viser et eksempel, er en elektrisk impedansføleåbning. Når følezonen er en lysstråle, gør kendte metoder typisk brug af lysspredning eller lysudslukning som mål for cellestørrelse. Disse optiske signaler afhænger imidlertid også af celleformen og brydningsindeks og indfører derved muligheder for fejl.

10 I systemer, som gør brug af en elektrisk impedansmåleibning som følezone, benyttes ændringer i åbningens impedans som mål for celievolumen, og denne metode involverer fejl i afhængighed af cellens form og elektriske modstand.

Nuværende strømningscytometriske metoder til måling af celle-15 volumen er følgelig generelt karakteriseret ved mangler, som introduceres af andre celleegenskaber end cellevolumenet, der samtidigt afføles, og som er vanskelige at isolere, vurdere og dermed korrigere. Eksempelvis gør anvendelse af en af de fra ovennævnte USA patentskrifter kendte metoder det sandsynligt at to celler med ens 20 volumen, men med forskellig form fejlagtigt kan måles til at have to forskellige cel I evo I umen er.

Det er kendt at mærke celler med et fluorescerende farvestof, som trænger ind i eller adhærerer til celleoverfladen. Ved belysning for eksempel med laserlys i et strømningscytometer kan cellens 25 fluorescensmissioner detekteres i forskellige retninger, hvilket kan være af interesse navnlig for bedømmelse af kvalitative parametre.

Der kan imidlertid ikke med denne metode opnås automatisk celle-volumenmåling med tilstrækkelig lethed, pålidelighed og nøjagtighed.

Det er formål for opfindelsen at udnytte strømningsfluorocyto-30 metrisk apparatur til automatisk måling af cellevolumen, men på en måde, som eliminerer eller væsentligt formindsker den aktuelle celle-volumenmålings afhængighed af andre celleegenskaber, såsom form, brydningsindeks samt celleimpedans.

Ovennævnte formål realiseres med de i den kendetegnende del 35 af krav 1 angivne ejendommeligheder for fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Den foreliggende opfindelses principper er baseret på udnyt- 3

DK 154457 B

telse af fluorescensvolumeneksklusion i optiske strømningscytometre.

I overensstemmelse med opfindelsen suspenderes celler i et isotonisk medium, der indeholder et fluorescerende farvestof, som hverken indtræder i cellerne eller hænger fast på celleoverfladen. Cellesus-05 pensionen føres igennem et strømningscytometer, hvori suspensionen formes til en cylindrisk prøvestrømning, der passerer igennem en fokuseret lysstråle. Prøvestrømningen har større diameter end cellerne, og cellerne i prøvestrømningen passerer igennem lysstrålen enkeltvis. Bølgelængden for det lys, som illuminerer prøvestrøm-10 ningen, udvælges således, at det fluorescerende farvestof i prøvestrømningen bliver effektivt aktiveret. Fluorescenslys fra prøvestrømningen samles af passende linser og filtre og føres til en detektor, såsom et fotomultiplikatorrør, og en føiezone er defineret af skæringen imellem prøvestrømningen og den fokuserede lysstråle.

15 Gennem valget af suspensionsmedium i overensstemmelse med opfindelsen opnås, at farvestoffet i prøvestrømningen, når en celle mangler i følezonen, frembringer et fluorescenslys af konstant niveau, som igen frembringer et konstant udgangssignal fra detektoren. Når en celle kommer ind i følezonen, bliver et volumen af 20 fluorescerende farvestof, som er lig med cellens volumen, ekskluderet eller udelukket fra følezonen, og intensiteten for det fluorescenslys, som udsendes fra følezonen, bliver formindsket tilsvarende.

Denne formindskelse af fluorescenslys bliver registreret som en ændring af detektorens udgangssignal, og denne ændring er pro-25 portional med cellens volumen.

I det følgende skal opfindelsen beskrives nærmere under henvisning til tegningen, hvor figur 1 viser en skematiseret version af et kommercielt tilgængeligt strømningscytofluormetrisk apparat, og 30 figur 2 et eksempel på cellevolumenfordelingen for menneske- erythrocytter, hvilket eksempel er optaget i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse.

Der henvises først til figur 1, som viser en stiliseret funktionsmæssig og strukturmæssig repræsentation af et apparat, der 35 kan benyttes i forbindelse med den foreliggende opfindelse. Ap-paratet i figur 1 er faktisk et specielt system, der er kommercielt tilgængeligt under varemærket CYTOFLUORGRAPH , og som for- 4

DK 154457 B

handles af Ortho Instruments, University Avenue 410, Westwood, Massachusetts 02090, USA. Apparatet i figur 1 gør brug af de strømningscytometriske principper til celleanalyse og indeholder midler til afføling af cellers fluorescensreaktion pi bestemte typer af 05 bestråling eller belysning.

En central komponent i apparatet i figur 1 er en strømningskanal 106, hvori celler føres enkeltvis efter hinanden og hurtigt (fx 2500 celler pr. sekund) igennem en følezone. Følezonen er fastlagt af skæringen mellem cellestrømmen og en indfaldende lysstråle, der TO typisk er fokuseret kohærent lys fra en gaslaser. Mens en celle passerer igennem følezonen, vekselvirker den med det indfaldende lys på flere forskellige mider. Noget af lyset bliver naturligvis absorberet af cellen, mens en anden del af lyset spredes inden for forholdsvis snævre vinkler i forhold til aksen for det indfaldende T5 lys. En yderligere del af lyset spredes under vinkler, som er ret afvigende fra aksen for det indfaldende lys, eksempelvis vinkelret på det indfaldende lys. Endvidere kan der også optræde fluorescensemissioner i afhængighed af naturen af selve cellen samt enhver farvning eller mærkning, som cellen tidligere har været udsat for.

20 Under konventionel drift muliggør fotofølere, der er anbragt med forskellige orienteringer i forhold til cellestrømmen og det indfaldende laserlys, detektering af et sæt af reaktioner for hver given celletype. Figur 1 indeholder således en argonionlaser 101 samt en heliumneonlaser 102, idet det kohærente lys, som udsendes af 25 hver laser, bliver afbøjet på forskellig måde ved hjælp af spejle 103 og 104 samt en linse 105 i retning mod følezonen i strømningskanalen 106. Celleprøvestrømmen føres på kendt måde i laminar strømningstilstand inden i en strømmende fluidumkappe for at sikre, at kun en enkelt celle vil blive belyst i følezonen på et givet tids-30 punkt. Efterhånden som hver celle bliver belyst af lyset fra linsen, kan cellens vekselvirkning med lyset følgelig afføles.

Som vist i figur 1 detekterer en ekstinktionsføler 108 den lysmængde, som blokeres af cellen, og den fremadrettede lysspredning detekteres af fotofølere 109 og 110 tilnærmelsesvis inden for en keg-35 |e med en topvinkel på 40°. Elektriske signaler, der er frembragt af følerne 108, 109 og 110, er koblet til forstærkere 120 og 121, som afgiver elektriske signaler med passende amplitude og lignende for en efterfølgende analyse og/eller visning.

5

DK 154457 B

I apparatet i figur 1 bliver det lys, som udsendes fra cellen på grund af en fluorescensreaktion, affølt både vinkelret pi cellestrømmens retning og vinkelret pi aksen for det indfaldende lys. Et hulspejl 125 og en samlelinse 107 samler dette lys tilnærmelsesvis 05 inden for en kegle med topvinklen 40°, og dette lys føres igennem en åbning eller blænde 111, derefter til et dichroisk spejl 112 og til et andet spejl 113. Et første farvefilter 114 (der eksempelvis lader lys med forholdsvis lang bølgelængde, såsom rødt lys, passere), fører udvalgt lys fra det dichroiske spejl 112 og til en fotoføler TO (PMT) 117 (fx et fotomultiplikatorrør). Et andet filter 115 lader selektivt lys af en anden farve (eksempelvis forholdsvis kortbølget lys, såsom grønt lys), passere fra det andet spejl 113 og til en anden fotoføler (PMT) 116. Elektriske signaler fra følerne 116 og 117 i form af impulser svarende til lys fra respektive celler kobles 15 til forstærkere 118 og 119 for derved også at frembringe signaler, som er egnet til behandling.

Som vist i udførelsesformen i figur 1 frembringer en følervælger 122 udgangshistogrammer under anvendelse af signaler fra forstærkerne 118-121. Et eksempel på en velegnet form for udgangsda-20 ta er en afbildning af amplituden for rød fluorescens fra føleren 117 som funktion af amplituden for grøn fluorescens fra føleren 116. Et sådant histogram er vist i afbildningen 123, hvor hvert punkt på histogrammet repræsenterer en individuel celle. Klynger eller ansamlinger af indikatorer på histogrammet repræsenterer grupper af 25 celler af ens type. Fagfolk vil naturligvis også kunne finde det nyttigt at frembringe histogrammer over smalvinkelspredningen som funktion af intensiteten for grøn fluorescens, smalvinkelspredningen som funktion af aksial lysekstinktion osv.

Strømningscellen 106 er typisk konstrueret med flade afsnit af 50 kvartsglas og har en specielt udformet indsprøjtningsdyse og indløb for at sikre en stabil laminar strømning af prøvemateriale samt en koncentrisk kappe herom.

Konventionelt er de af fotomultiplikatorerne 116 og 117 frembragte signaler i form af positive impulser, som er blevet udsendt 55 ved belysning af en celle i strømningskanalen 106, som er blevet mærket med et fluorescerende farvestof. I overensstemmelse med opfindelsen vil en fotomultiplikator (fx 116) modtage et kontinuerligt

DK 154457B

6 fluorescenslyssignal fra et filter (fx 115) og negative impulser vil blive koblet til en forstærker (fx 118), når en celle, som eliminerer eller væsentligt formindsker det fra følezonen udsendte fluorescenslys, passerer igennem følezonen i strømningskanalen 106. Det foregs trækkes, at forstærkeren 118 er indrettet til at modtage negativt forløbende signaler i stedet for positivt forløbende signaler.

Forskellige farvestoffer eller fluorescerende makromolekyler kan være velegnede i forbindelse med den foreliggende opfindelse. I en foretrukket anvendelse af opfindelsen fremstilles et farvestof ud fra 10 fluorescein-isothiocyanat forbundet med dextran (FITC-dextran) med en molekylvægt pi ca. 20.000. De meget store dextranmolekyler hindrer farvestoffet i at trænge ind i cellerne, og endvidere ad-hærerer FITC-dextran ikke til cellernes overflade.

En passende koncentration er 0,01-1 vægt-% FITC-dextran. For 15 et sådant farvestof er en velegnet belysningskilde lys af bølgelængden 488 nm. fra en argonlaser, der konventionelt indgår i det ovenfor beskrevne kendte apparat. Cellesuspensionens belysning med den blå argonlaser 101 frembringer et grønt fluorescenslys, der passerer gennem det dichroiske spejl 112, reflekteres fra spejlet 113 20 09 passerer igennem grønfilteret 115 for derefter at blive omdannet til elektriske signaler af fotomultiplikatorrøret 116.

I overensstemmelse med den foreliggende opfindelse, der er baseret på en volumenudelukkelsesteknik, skal den fluorescerende prøvematerialezone være større end den heri medførte celle. I mod-25 sat fald ville passage af en større celle igennem den optiske følezo-ne resultere i, at der kun blev udelukket en del af det totale cellevolumen. Med en given følezone, hvori prøvematerialestrømmen er passende større end den heri medførte celle, kan den brøkdel af følezonens volumen, som er optaget eller udelukket af cellen, re-30 præsenteres udtrykt ved højden af den laserstråle, som skærer prøvematerialestrømmen, diameteren for prøvematerialestrømmen samt cellens volumen, således at den optagne volumenandel er forholdet imellem cellevolumen og produktet af laserstrålehøjden og prøvematerialestrømmens tværsnitsareal. Hvis lysintensiteten er ensartet igen-35 nem laserstrålen, er den optagne eller udelukkede volumenandel direkte proportional med amplituden for den fluorescerende volumenudelukkelsesimpuls.

7

DK 154457 B

I det mere sandsynlige tilfælde har den illuminerende laserstråle ikke ensartet intensitet over strålens tværsnit, idet der er større intensitet ved strålens centrum og mindre intensitet ved strålens periferi, eksempelvis i overensstemmelse med en Gaussisk intensi-05 tetsfordeling. I så fald er det hensigtsmæssigt og mere nøjagtigt at måle ikke blot amplituden for de fluorescerende volumenudelukkelsesimpulser, men også at akkumulere integralet af sådanne impulser (dvs. arealet under kurven, som repræsenterer impulsens amplitude som funktion af tiden). Integralet af den fluorescerende 10 volumenudelukkelsesimpuls repræsenterer en gennemsnitsværdi af volumenudelukkelsessignalet, når cellen afsøges af den ikke ensartede laserstråle. Til mange anvendelser er integralet af volumenudelukkelsesimpulsen et foretrukket mål for cellevolumenet.

I tilfælde af, at det ønskes at benytte integralet af impulsen i 15 stedet for simpelthen at benytte amplituden, må det tilknyttede forstærkerudstyr, såsom forstærkeren 118 i figur 1, være indrettet til at integrere impulser, som ankommer fra fotomultiplikatorrøret 116 igennem kanal 2.

Udnyttelsen af volumenudelukkelsesimpulser som et indeks for 20 cellevolumen kan ofte resultere i et ret lavt signalstøjforhold. I figur 2 cr der eksempelvis vist en fordeling af integrerede volumenudelukkelsesimpulser for erythocytter under anvendelse af den ovenfor beskrevne FITC-dextran forbindelse som en tilsætning til menneskeblod. I figur 2, hvor abscissen repræsenterer den integrerede 25 impulsamplitude, og hvor ordinaten repræsenterer antallet af hændelser eller celler med den tilsvarende integrerede impulsamplitude, ses en skarp afbrydelse ved den nederste ende af aksen for integreret impulsamplitude, og denne afbrydelse er en følge af den elektronik, som benyttes i systemer af den i figur 1 viste type. Til 30 sammenligning tilsiger konventionelt kendskab og erfaring, at den virkelige volumenfordeling for menneskeerythrocytter er en symmetrisk og tilnærmelsesvis Gaussisk fordeling.

Disse observerede og teoretiske fordelingskarakteristikker kan observeres kvantitativt ved at definere variationskoefficienten 35 (COV) som forholdet imellem standardafvigelse og middelværdi. Hvis signalerne var støjfrie, ville variationskoefficienten for fordelingen i figur 2 være 0,15-0,2 (støj i signalerne har tendens til at forøge

DK 154457 B

8 koefficienten). For de i figur 2 viste data er den aktuelle variationskoefficient ca. 0,8. Af figur 2 og af tilknyttet analyse ses signalet følgelig at være ret støjfyldt, hvilket giver anledning til visse vanskeligheder med hensyn til nøjagtig styring af elektronik til integra-05 tion og analyse og med hensyn til fortolkning af de herved frembragte data.

Ifølge et træk ved den foreliggende opfindelse kan udnyttelsen af volumenudelukkelsesimpulser som et mil for cellevolumen forbedres betragteligt ved at benytte et uafhængigt signal fra cellen til at 10 trigge eller udløse det elektroniske udstyr fil fluorescensintegration og analyse. Sådanne uafhængige signaler kan eksempelvis være smalvinkelspredning ved følerne 109 og 110 eller bredvinkelspred-ning via spejlet 112 og fotomultiplikatorrøret 117 under forudsætning af, at spejlet 112 og filteret 114 er indrettet til at afføle spredning 15 (fx blåt lys) i stedet for at afføle fluorescenskomponenter. De i figur 2 viste data blev opnået ved at trigge det elektroniske fluorescens- og analyseudstyr med et smalvinkellysspredningssignal, der blev frembragt samtidigt med fluorescenssignalet, når en celle bevæger sig igennem laserstrålen. Med andre ord og under hen-20 visning til figur 1 udnyttes detektering af lys ved 109 og 110, som er blevet spredt af en celle, der passerer igennem følezonen, til via forstærkeren 120 at åbne eller aktivere følervælgeren 122 og derefter til at modtage og behandle data fra forstærkeren 118. Alternativt kan der benyttes en lignende åbning efter aktivering ved 25 hjælp af et bredvinkelspredningssignal fra forstærkeren 119.

Støjfyldte fluorescensvolumenudelukkeisessignaler kan også benyttes til en ret præcis måling af middelcellevolumenet for en cellepopulation, hvis der analyseres et tilstrækkeligt antal celler. I denne forbindelse kan der benyttes velkendte statistiske relationer til 30 at bestemme præcision for målingens middelværdi. Eksempelvis kan det integrerede middelvolumenudelukkelsessignal bestemmes med en præcision på 1%, og med et konfidensniveau på 99%, hvis signalfordelingen har en variationskoefficient på 0,8, og hvis der analyseres 50.000 celler. Middelværdien kan også bestemmes endnu mere præ-35 cist, hvis der analyseres mere end 50.000 celler. Under visse omstændigheder er det muligt at falske eller fremmede signaler kan blive medtaget, og høje nøjagtighedsniveauer kan kræve kompensa-

Claims (3)

10 For det andet kan bestemmelser af høj nøjagtighed være påvir ket af fremmedsignaler, der er knyttet til forstyrrelse af prøvematerialestrømmen på grund af cellens tilstedeværelse. Hvis prøvematerialestrømmens diameter kun er lidt større end cellen, kan der følge en fluorescensimpuls med positiv polaritet efter fluorescensvolumen-15 udelukkelsesimpulsen med negativ polaritet. Almindeligvis vil den efterfølgende positive impuls blive større og den negative udelukkelsesimpuls mindre, når cellediameteren nærmer sig følezonens størrelse. I det ekstreme tilfælde med en meget lille prøvematerialestrøm 20 kan den fluorescerende volumenudelukkelsesimpuls blive forsvindende lille, mens den efterfølgende positive impuls kan blive temmelig stor. Følgelig giver kendskab til arten af celler, som måles, samt cellernes relative diameterinterval mulighed for at vælge en strømningsstørrelse, hvormed de efterfølgende positive fluorescensimpul-25 ser kan nedbringes til et minimum, og nøjagtigheden i integrationen af negative fluorescensudelukkelsesimpulser vil dermed blive beva ret. Mindre hensigtsmæssigt kan elektroniske observationer og styrede korrektioner benyttes til at eliminere den uønskede effekt af de efterfølgende positive falske impulser. 30

1. Fremgangsmåde til under anvendelse af et gennemstrømnings-fluorocytometer at bestemme volumenet af celler suspenderet i en væske KENDETEGNET ved, AT der vælges en væske, som inde-35 holder et farvestof, som reagerer fluorescerende på en valgt stimulering, og som er ikke-indtrængende i og i det væsentlige ikke-adhærerende til nævnte celler, og AT reduktionen i emissionen under en celles passage detekteres som mål for cellens volumen. , DK 154457 B

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, AT nævnte detektering omfatter en frembringelse af et impulssignal, der repræsenterer udelukkelse af fluorescensemission fra nævnte zone, og AT nævnte volumenbestemmelse omfatter en integration af 05 dette impulssignal for at frembringe et signal, der repræsenterer middelcel levolumen.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, KENDETEGNET ved, AT nævnte farvestof består af fluorescein-isothiocyanat bundet til dextran. 15 20 25 30 35