WO2013031309A1 - 光分析を用いた単一粒子検出装置、単一粒子検出方法及び単一粒子検出用コンピュータプログラム - Google Patents

光分析を用いた単一粒子検出装置、単一粒子検出方法及び単一粒子検出用コンピュータプログラム Download PDF

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拓哉 葉梨
田邊哲也
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Definitions

  • the average residence time (translational diffusion time) of the fluorescent molecules and the like in the minute region determined from the value of the autocorrelation function of the measured fluorescence intensity, and the average number of staying molecules
  • acquisition of information such as the speed or size of movement of fluorescent molecules, concentration, concentration, molecular structure or size change, molecular binding / dissociation reaction, dispersion / aggregation, etc.
  • the detection of various phenomena made.
  • fluorescence intensity distribution analysis Fluorescence-Intensity Distribution Analysis: FIDA.
  • Patent Document 4 Non-Patent Document 4 and Photon Counting Histogram (PCH.
  • Patent Document 5 are measured in the same manner as FCS.
  • a histogram of the fluorescence intensity of the fluorescent molecules entering and exiting the confocal volume generated is generated, and by fitting a statistical model formula to the distribution of the histogram, the average of the intrinsic brightness of the fluorescent molecules etc.
  • the average value of the value and the number of molecules staying in the confocal volume is calculated, and based on this information, changes in the structure or size of the molecule, binding / dissociation state, dispersion / aggregation state, etc. are estimated. It will be.
  • Patent Documents 6 and 7 propose a method for detecting a fluorescent substance based on the passage of time of a fluorescence signal of a sample solution measured using an optical system of a confocal microscope.
  • Patent Document 8 describes the presence of fluorescent fine particles in a flow or on a substrate by measuring weak light from fluorescent fine particles distributed in a flow cytometer or fluorescent fine particles fixed on a substrate using a photon counting technique. A signal arithmetic processing technique for detecting the signal is proposed.
  • Patent Document 9 discloses, as one aspect of FCS, the light intensity detected when particles that do not emit light dispersed in a solution in which a large amount of luminescent material is dissolved enter the confocal volume.
  • the value of the autocorrelation function of the fluorescence intensity is calculated, and the average value of the translational diffusion time and the number of staying particles in the confocal volume of particles that do not emit light (inverted FCS (iFCS)) has been disclosed.
  • iFCS inverted FCS
  • the sample necessary for the measurement is extremely low as compared with the past.
  • the concentration and amount may be fine (the amount used in one measurement is at most about several tens of ⁇ L), and the measurement time is greatly shortened (measurement of time on the order of seconds is repeated several times in one measurement). ). Therefore, these technologies are particularly useful for analyzing rare or expensive samples often used in the field of medical and biological research and development, for clinical diagnosis of diseases, screening for physiologically active substances, etc. When the number is large, it is expected to be a powerful tool capable of performing experiments or inspections at a lower cost or faster than conventional biochemical methods.
  • the behavior of a single particle is observed by using the change in light intensity at the level of one fluorescent molecule or several molecules.
  • statistical processing such as calculation of fluctuation of fluorescence intensity such as calculation of autocorrelation function of fluorescence intensity data measured in time series or fitting to a histogram is performed, and individual single It does not refer to or analyze the behavior of the particles individually. That is, in these analysis techniques, a change in light intensity indicating the presence of particles is statistically processed, and a statistical average characteristic of the particles is detected.
  • the concentration or number density of the single particle to be observed in the sample solution is in the order of one second in the equilibrium state.
  • a level at which a single particle that can be statistically processed within a measurement time of a length of is in and out of the microregion, preferably at a level where there is always about one single particle in the microregion It is necessary to be above.
  • the concentration of single particles in the sample solution used in the above optical analysis technique is typically about 1 nM or more. When well below 1 nM, a time when no single particle is present in the confocal volume occurs and a statistically significant analysis result cannot be obtained.
  • the single particle detection methods described in Patent Documents 6 to 8 do not include statistical calculation processing of fluctuations in fluorescence intensity, and even if the single particle in the sample solution is less than 1 nM, Although it is possible to detect particles, it has not been achieved to quantitatively calculate the concentration or number density of single particles moving randomly in a solution.
  • the applicant of the present application described in Japanese Patent Application No. 2010-044714 and PCT / JP2011 / 53481 includes the statistical processing such as FCS, FIDA, etc., where the concentration or number density of the luminescent particles to be observed (luminescent particles) is included.
  • FCS concentration or number density of the luminescent particles to be observed
  • An optical analysis technique based on a novel principle that makes it possible to quantitatively observe the state or characteristics of luminescent particles in a sample solution below the level handled by the analysis technique was proposed.
  • an optical system capable of detecting light from a minute region in a solution such as an optical system of a confocal microscope or a multiphoton microscope, like FCS, FIDA and the like.
  • the photodetection area When used, while moving the position of a minute region (hereinafter referred to as “light detection region”) that is a light detection region in the sample solution, that is, while scanning the sample solution by the light detection region,
  • the photodetection area includes luminescent particles that are dispersed in the sample solution and move randomly, the light emitted from the luminescent particles is detected, and each of the luminescent particles in the sample solution is detected individually.
  • the sample required for measurement is a very small amount (for example, about several tens of ⁇ L) as in the optical analysis techniques such as FCS and FIDA.
  • the measurement time is short, and the presence of luminescent particles having a lower concentration or number density is detected as compared with the case of optical analysis techniques such as FCS and FIDA, and the concentration, number density or Other characteristics can be detected quantitatively.
  • the scanning molecule counting method that individually detects the light of single particles that emit light as described above, the light from the single particles is weak, and is easily affected by stray light or Raman scattering of water. That is, in the case of an analysis method for identifying an increase in light intensity value representing light emitted from a luminescent particle as a signal of the luminescent particle, light due to stray light or water Raman scattering may be erroneously identified as a signal of the luminescent particle. is there. In the case of a scanning molecule counting method that detects light of a single particle, particles to be observed (observed particles) are limited to luminescent particles.
  • luminescent labels fluorescent labels, phosphorescent labels, etc.
  • the observation target particle may be denatured by applying a luminescent label.
  • the main problem of the present invention is that a scanning molecule counting method using particles that are not easily affected by stray light or Raman scattering of water and that does not emit light, that is, a single particle that does not emit light in a sample solution. It is to provide a single particle detection technique based on a novel principle that enables individual detection and quantitative observation of particle state or characteristics.
  • the above-described problem is solved by using a confocal microscope or an optical system of a multiphoton microscope to detect a single particle that is dispersed in a sample solution and randomly moves.
  • a light detection region moving unit that moves the position of the light detection region of the optical system of the microscope in the sample solution, a light detection unit that detects light from the light detection region, and the sample solution Generate time-series light intensity data of light from the light detection area detected by the light detection unit while moving the position of the light detection area, and each single particle in the time-series light intensity data
  • a signal processing unit that individually detects signals representing the light, the light from the light detection region includes substantially constant background light, and a signal representing the presence of each single particle is detected by the single particle.
  • the “single particles dispersed in the sample solution and moving randomly” are single particles such as atoms, molecules or aggregates thereof dispersed or dissolved in the sample solution, Any particles may be used as long as they are not fixed to the substrate or the like and freely move in the Brownian motion in the solution.
  • the single particle to be observed may be a particle that significantly reduces the amount of light from the light detection region due to the presence of the particle in the light detection region.
  • the particles are basically particles that do not emit light, but it should be understood that the particles may have a lower emission intensity than the background light in the detection light wavelength band.
  • the “light detection area” of the optical system of a confocal microscope or multiphoton microscope is a minute area in which light is detected in those microscopes.
  • the illumination light is Corresponds to the focused region (in a confocal microscope, it is determined in particular by the positional relationship between the objective lens and the pinhole).
  • single particle signal refers to a signal indicating the presence of a single particle unless otherwise specified.
  • a decrease in the light intensity or light quantity of the background light is individually detected as a single particle signal, thereby eliminating the presence of particles.
  • Various pieces of information relating to the state of the particles in the solution are acquired by sequentially detecting the particles one by one. That is, in the apparatus of the present invention, single particles are individually detected by detecting the shadow of single particles in a region where a certain background light exists. According to such a configuration, when the single particle to be observed does not emit light, or even when the emission intensity is low, it is not necessary to attach a luminescent label to the single particle, and stray light or Raman scattered light can be prevented. Misidentification as a signal of particles to be observed is eliminated.
  • the substantially constant background light that should be included in the light from the light detection region includes fluorescence, phosphorescence, chemiluminescence, biological matter caused by substances dispersed in the sample solution. It may be luminescent or scattered light.
  • the substance that emits or scatters light when the substance that emits or scatters light is not dispersed in the solution used as the sample solution, the substance that actively emits or scatters light may be dissolved or dispersed in the solution.
  • the solution used as the sample solution emits autofluorescence, the autofluorescence may be used as the background light.
  • the microscope apparatus is equipped with a light source and an optical system for illumination light.
  • the background light may be illumination light by transmitted illumination or the like if it is reduced when a single particle is present in the light detection region.
  • the degree of background light reduction is determined by the size of the single particle and the size of the light detection region. Depends on the relationship.
  • the outer diameter of the single particle to be observed is preferably 15% or more of the diameter of the light detection region, and more preferably, the outer diameter of the single particle. Has been found to be 35% or more of the diameter of the light detection region.
  • the moving speed of the position of the light detection region in the sample solution in the apparatus of the present invention may be appropriately changed based on the characteristics of single particles or the number density or concentration in the sample solution.
  • the moving speed of the light detection region is increased, the degree of decrease in light intensity or light amount due to the presence of a single particle is reduced. Therefore, the decrease in light intensity or light amount due to a single particle is accurate or sensitive. It is preferable that the moving speed of the light detection region can be changed as appropriate so that measurement can be performed.
  • the moving speed of the position of the light detection region in the sample solution is preferably set higher than the diffusion moving speed of the single particles to be detected (average moving speed of particles due to Brownian motion).
  • the device of the present invention detects the reduction of background light due to the presence of a single particle when the light detection region passes through the position where the single particle exists, and individually separates the single particle. To detect.
  • a single particle moves randomly in a solution due to Brownian motion and enters and exits the light detection region multiple times, a signal indicating its presence is detected multiple times from one single particle. Therefore, it becomes difficult to make the detected signal correspond to the presence of one single particle.
  • the moving speed of the light detection region is set to be higher than the diffusion moving speed of the single particle, thereby making one single particle correspond to one signal (representing the presence of a single particle). It becomes possible. Since the diffusion movement speed varies depending on the characteristics of the single particle, as described above, the apparatus of the present invention appropriately changes the movement speed of the light detection region according to the characteristics of the single particle (particularly, the diffusion constant). It is preferable that it is configured to be possible.
  • the movement of the position of the light detection region in the sample solution may be performed by an arbitrary method.
  • the position of the light detection region may be changed by changing the optical path of the optical system of the microscope by using a galvanometer mirror adopted in a laser scanning optical microscope, or
  • the position of the sample solution may be moved (for example, by moving a microscope stage) to move the relative position of the light detection region in the sample solution.
  • the movement trajectory of the position of the light detection region may be arbitrarily set, and may be selected from, for example, a circle, an ellipse, a rectangle, a straight line, and a curve.
  • the signal processing unit of the apparatus of the present invention determines whether or not one particle has entered the light detection region from the detection value signal from the sequential light detection unit. May be based on the shape of the signal representing the time-series light detected at. In an embodiment, it is typically determined that a single particle has entered the light detection region when a signal having a light intensity lower than a predetermined threshold, as measured from the intensity of the background light, is detected. Good. More specifically, as will be described later in the section of the embodiment, the signal indicating the presence of a single particle is usually a time-series detection value of the light detection unit, that is, light intensity data.
  • the signal processing unit of the apparatus of the present invention generates a bell-shaped pulse-shaped signal that is lower than a predetermined threshold value measured from the intensity of background light on the time-series light intensity data, and the presence of a single particle. It may be configured to detect as a signal representing.
  • the “predetermined threshold value” can be set to an appropriate value experimentally.
  • the signal processing unit smoothes the time-series light intensity data, processes the data so that the fine increase / decrease in the light intensity can be ignored, and then determines the background light intensity in the smoothed time-series light intensity data. It may be configured to detect a downwardly convex bell-shaped pulse signal having an intensity below a predetermined threshold, as a signal representing the presence of a single particle.
  • the number of single particles included in the light detection region may be counted by counting the number of signals (particle counting).
  • information on the number density or concentration of the identified single particles in the sample solution can be obtained by combining the number of detected single particles and the amount of movement of the position of the light detection region.
  • the number density or concentration ratio of a plurality of sample solutions, or the relative number density or concentration ratio with respect to the standard sample solution serving as a reference for the concentration or number density is calculated, or An absolute number density value or concentration value may be determined using a relative number density or concentration ratio relative to a standard sample solution that is a reference for concentration or number density.
  • the total volume of the movement locus of the position of the light detection region is specified by any method, for example, by moving the position of the light detection region at a predetermined speed, the number density or concentration of single particles Can be calculated specifically.
  • the number of single particle signals obtained during an arbitrarily set measurement time is counted.
  • the number of single particle signals detected varies depending on the length of the set measurement time.
  • the single particle calculated from the number of detection signals is low.
  • the variation of the density value becomes large and the accuracy can be lowered. Therefore, in the above-described apparatus of the present invention, as another aspect of particle counting, measurement is performed until the number of signals of a single particle reaches an arbitrarily set number.
  • One particle concentration value may be calculated.
  • the above-described apparatus allows the position of the light detection region of the optical system by the light detection region moving unit until the number of signals indicating the presence of single particles detected by the signal processing unit reaches a predetermined number.
  • the number representing the presence of a single particle signal is determined in advance by repeating the movement of the light, the detection of light from the light detection region by the light detection unit, and the detection of the signal indicating the presence of a single particle by the signal processing unit. May be configured to determine the concentration of a single particle in the sample solution based on the time taken to reach the number. In this case, shortening of the measurement time for a single particle high-concentration sample solution is expected, and the measurement for a single particle low-concentration sample solution is performed with sufficient time.
  • measurement time is optimized according to the density
  • a predetermined number is set to a number that achieves the accuracy required for the result, the time required to detect the predetermined number of single particles or any result derived therefrom can be obtained. Variations in this are suppressed to a small level, and the accuracy of the result can be satisfied.
  • a computer program is provided that causes a computer to execute a procedure for individually detecting each particle as a signal representing the presence of each particle.
  • the background light may be fluorescence, phosphorescence, chemiluminescence, bioluminescence, scattered light, or illumination light by a substance dispersed in the sample solution.
  • the outer diameter of the single particle is preferably 15% or more of the diameter of the photodetection region, and more preferably 35% or more of the diameter of the photodetection region.
  • the single particle that is the observation object is a particle that significantly reduces the amount of light from the light detection region due to the presence of the particle in the light detection region, that is, a particle that does not emit light or a detection light wavelength band. In this case, the particles have lower emission intensity than the background light.
  • the individual detection of the signal representing the presence of each single particle may be performed based on the shape of the time-series signal.
  • a signal having a light intensity lower than a predetermined threshold measured from the background light intensity is detected. It may be determined that one single particle has entered the light detection region.
  • a downwardly convex bell having an intensity below a predetermined threshold measured from the intensity of background light in time-series light intensity data is detected.
  • a pulse signal of the type may be detected as a signal representing the presence of a single particle, in which case the time-series light intensity data is smoothed and the downwardly convex bell in the smoothed time-series light intensity data.
  • a type of pulsed signal may be detected as a signal representing the presence of a single particle.
  • the moving speed of the position of the light detection region in the sample solution may be appropriately changed based on the characteristics of the single particle, the number density or concentration in the sample solution, and preferably in the sample solution.
  • the moving speed of the position of the light detection region at is set higher than the diffusion moving speed of the single particle to be detected.
  • the position of the light detection region in the sample solution may be moved by an arbitrary method.
  • the position of the light detection region is changed by changing the optical path of the optical system of the microscope or moving the position of the sample solution. May be changed.
  • the movement trajectory of the position of the light detection region may be arbitrarily set, and may be selected from, for example, a circle, an ellipse, a rectangle, a straight line, and a curve.
  • particle counting the number of single particle signals obtained during an arbitrarily set measurement time is typically counted. The measurement may be performed until the number of signals of one particle reaches an arbitrarily set number, and the single particle concentration value may be calculated based on the measurement time.
  • the above computer program also moves the position of the light detection region, detects light from the light detection region, and detects single particles until the number of signals indicating the presence of single particles reaches a predetermined number. Detection of a signal representing the presence of a single particle, and determining the concentration of a single particle in the sample solution based on the time taken for the number representing the presence of a single particle signal to reach a predetermined number.
  • a procedure may be configured.
  • light detection is performed in the presence of a constant background light while moving the position of the light detection region in the sample solution, and the light intensity or light quantity of the background light is detected. Is individually detected as a single particle signal, thereby realizing a novel method of detecting the presence of particles one after another individually.
  • a single particle detection method for detecting single particles dispersed and moving randomly in a sample solution using an optical system of a confocal microscope or a multiphoton microscope, The process of moving the position of the light detection area of the optical system of the microscope in the solution and the light containing a substantially constant background light from the light detection area while moving the position of the light detection area in the sample solution.
  • the time series light intensity data is detected and the time series light intensity data shows the decrease in light intensity that occurs when a single particle enters the light detection region.
  • the background light may be fluorescence, phosphorescence, chemiluminescence, bioluminescence, scattered light, or illumination light by a substance dispersed in the sample solution.
  • the outer diameter of the single particle is preferably 15% or more of the diameter of the photodetection region, and more preferably 35% or more of the diameter of the photodetection region.
  • the single particle that is the observation object is a particle that significantly reduces the amount of light from the light detection region due to the presence of the particle in the light detection region, that is, a particle that does not emit light or a detection light wavelength band. In this case, the particles have lower emission intensity than the background light.
  • the individual detection of the signal indicating the presence of each single particle may be performed based on the shape of the time-series signal.
  • a signal having a light intensity lower than a predetermined threshold is detected from the background light intensity. It may be determined that one single particle has entered the light detection region.
  • a downwardly convex bell having an intensity below a predetermined threshold measured from the intensity of background light in time-series light intensity data.
  • a pulse signal of the type may be detected as a signal representing the presence of a single particle, in which case the time-series light intensity data is smoothed and the downwardly convex bell in the smoothed time-series light intensity data.
  • a type of pulsed signal may be detected as a signal representing the presence of a single particle.
  • the moving speed of the position of the light detection region in the sample solution may be appropriately changed based on the characteristics of the single particle, the number density or concentration in the sample solution, and preferably in the sample solution.
  • the moving speed of the position of the light detection region at is set higher than the diffusion moving speed of the single particle to be detected.
  • the position of the light detection region in the sample solution may be moved by an arbitrary method.
  • the position of the light detection region is changed by changing the optical path of the optical system of the microscope or moving the position of the sample solution. May be changed.
  • the movement trajectory of the position of the light detection region may be arbitrarily set, and may be selected from, for example, a circle, an ellipse, a rectangle, a straight line, and a curve.
  • the process of counting the number of individually detected single particle signals to count the number of single particles detected during the movement of the position of the light detection region and / or A step of determining the number density or concentration of single particles in the sample solution based on the number of single particles detected may be included.
  • particle counting the number of single particle signals obtained during an arbitrarily set measurement time is typically counted. Measurement may be performed until the number of particle signals reaches an arbitrarily set number, and a single particle concentration value may be calculated based on the measurement time.
  • the above method also moves the position of the light detection region, detects light from the light detection region, and detects the single particle until the number of signals indicating the presence of a single particle reaches a predetermined number.
  • the above-described single particle detection technique of the present invention typically involves particulate biological materials such as proteins, peptides, nucleic acids, lipids, sugar chains, amino acids or aggregates thereof, viruses, cells and the like.
  • particulate biological materials such as proteins, peptides, nucleic acids, lipids, sugar chains, amino acids or aggregates thereof, viruses, cells and the like.
  • non-biological particles eg, atoms, molecules, micelles, liposomes, metal colloids, beads (magnetic beads, polystyrene beads, latex beads, etc. ), Quenchers (azobenzenes (dabcyl, BHQ, etc.), metal particles, etc.
  • non-biological particles eg, atoms, molecules, micelles, liposomes, metal colloids, beads (magnetic beads, polystyrene beads, latex beads, etc. ), Quenchers (azobenzenes (dabcyl, BHQ, etc.),
  • the single particle detection technique of the present invention utilizes the principle of the scanning molecule counting method, and the single particle dispersed in the solution does not emit light (or has lower emission intensity than the background light in the detection light wavelength band). Detection of particles). Therefore, as in the normal scanning molecule counting method, the light detection mechanism itself is configured to detect light from the light detection region of the confocal microscope or the multiphoton microscope. Similarly, it may be a trace amount. However, in the present invention, since statistical processing such as calculating fluctuations in fluorescence intensity is not executed, the single particle detection technology of the present invention has a single particle number density or concentration of FCS, FIDA, PCH, etc. It can be applied to a sample solution that is significantly lower than the level required for other optical analysis techniques.
  • FIG. 1 (A) is a schematic diagram of the internal structure of a single particle detection apparatus that executes the inverted scanning molecule counting method according to the present invention.
  • FIG. 1B is a schematic diagram of a confocal volume (light detection region of a confocal microscope).
  • FIG. 1C is a schematic diagram of a mechanism for changing the direction of the mirror 7 to move the position of the light detection region in the sample solution.
  • FIG. 1D is a schematic diagram of a mechanism for moving the position of the photodetection region in the sample solution by moving the horizontal position of the microplate.
  • FIGS. 2A and 2B are a schematic diagram illustrating the principle of detecting the presence of a single particle in the inverted scanning molecule counting method according to the present invention, and time variation of measured light intensity, respectively.
  • FIG. FIG. 2 (C) is a diagram for explaining the principle of reduction in the amount of detected light when a single particle enters the light detection region
  • FIG. 2 (D) shows the diameter of the light detection region and the single particle. It is a figure which shows the relationship between ratio and the ratio of the fall of detected light quantity.
  • FIG. 3 is a diagram showing, in the form of a flowchart, one embodiment of the processing procedure of the inverted scanning molecule counting method executed in accordance with the present invention.
  • FIG. 4A and 4B show the case where the single particle crosses the light detection region while performing Brownian motion, and the position of the light detection region in the sample solution is faster than the diffusion movement speed of the single particle. It is a model diagram showing the mode of movement of particles when particles cross the photodetection region by moving at.
  • FIG. 4C shows a signal of a detection signal in a processing procedure for detecting the presence of a single particle from measured time-series light intensity data (time change of photon count) according to the inverted scanning molecule counting method. It is a figure explaining the example of a process.
  • FIG. 5 is a flowchart showing another aspect of the processing procedure of the inverted scanning molecule counting method executed according to the present invention.
  • FIG. 6 is a flowchart showing still another aspect of the processing procedure of the inverted scanning molecule counting method executed according to the present invention.
  • FIG. 7A shows time-series light intensity data (photon count data) obtained according to the inverted scanning molecular counting method using a solution in which a fluorescent dye is dissolved and containing magnetic beads at 10 mg / ml.
  • FIG. 7B is an enlarged view of a portion where a signal indicating the presence of magnetic beads is observed. In the figure, a curve obtained by smoothing the data value and a fitting curve for the magnetic bead signal are shown superimposed.
  • FIG. 7C shows the relationship between the concentration of magnetic beads in the solution and the number of signals indicating the presence of magnetic beads detected in time-series light intensity data obtained according to the inverted scanning molecule counting method. ing.
  • a single particle detection device that realizes the single particle detection technology according to the present invention has an FCS, as schematically illustrated in FIG. It may be an apparatus formed by combining an optical system of a confocal microscope capable of executing FIDA and the like and a photodetector.
  • single particle detection apparatus 1 includes optical systems 2 to 17 and a computer 18 for controlling the operation of each part of the optical system and acquiring and analyzing data.
  • the optical system of the single particle detection apparatus 1 may be the same as the optical system of a normal confocal microscope, in which laser light (Ex) emitted from the light source 2 and propagated through the single mode fiber 3 is transmitted.
  • the light diverges at an angle determined by the specific NA at the emission end of the fiber and is radiated, becomes parallel light by the collimator 4, is reflected by the dichroic mirror 5, and the reflection mirrors 6 and 7, and is objective.
  • the light enters the lens 8.
  • a microplate 9 in which a sample container or well 10 into which a sample solution of 1 to several tens of ⁇ L is dispensed is typically arranged is emitted from the objective lens 8.
  • the laser light is focused in the sample solution in the sample container or well 10 to form a region with high light intensity (excitation region).
  • a single particle as an observation target and an arbitrary luminescent substance that generates background light are dispersed or dissolved, and the single particle does not enter the excitation region.
  • the luminescent material is excited and substantially constant light is emitted to become background light, and the background light is reduced when a single particle enters the excitation region.
  • the light (Em) emitted from the excitation region passes through the objective lens 8 and the dichroic mirror 5, is reflected by the mirror 11, collected by the condenser lens 12, passes through the pinhole 13, and passes through the barrier filter.
  • 14 (here, only a light component in a specific wavelength band is selected), introduced into the multimode fiber 15, reaches the photodetector 16, and is converted into a time-series electrical signal. Thereafter, it is input to the computer 18 and processing for single particle detection is performed in a manner described later.
  • the pinhole 13 is disposed at a position conjugate with the focal position of the objective lens 8, and as a result, as shown in FIG.
  • the focal region of the laser beam illustrated in FIG. 1B is usually a light detection region in the present optical analyzer having an effective volume of about 1 to 10 fL (typically, the light intensity is in the region). It has a Gaussian distribution with the center at the apex.
  • the effective volume is the volume of a substantially elliptical sphere bounded by the plane where the light intensity is 1 / e 2 )), and is called confocal volume.
  • the photo detector 16 is preferably a photon.
  • An ultra-sensitive photodetector that can be used for counting is used.
  • the light intensity is measured in a manner in which the number of photons arriving at the photodetector is sequentially measured for a predetermined unit time (BIN TIME) over a predetermined time. Executed. Therefore, in this case, the time-series light intensity data is time-series photon count data.
  • a stage position changing device 17a for moving the horizontal position of the microplate 9 may be provided on a microscope stage (not shown) in order to change the well 10 to be observed.
  • the operation of the stage position changing device 17a may be controlled by the computer 18. With this configuration, it is possible to achieve quick measurement even when there are a plurality of specimens.
  • the sample solution is scanned by the light detection region, that is, the focal region, that is, the position of the light detection region is moved in the sample solution.
  • the mechanism is provided.
  • a mirror deflector 17 that changes the direction of the reflection mirror 7 may be employed as schematically illustrated in FIG. A method of moving the absolute position of the light detection area).
  • Such a mirror deflector 17 may be the same as a galvanometer mirror device provided in a normal laser scanning microscope.
  • FIG. 1D the horizontal position of the container 10 (microplate 9) into which the sample solution is injected is moved to detect light in the sample solution.
  • the stage position changing device 17a may be operated to move the relative position of the region (a method of moving the absolute position of the sample solution).
  • the mirror deflector 17 or the stage position changing device 17a cooperates with the light detection by the light detector 16 under the control of the computer 18 in order to achieve a desired movement pattern of the position of the light detection region.
  • the movement trajectory of the position of the light detection region may be arbitrarily selected from a circle, an ellipse, a rectangle, a straight line, a curve, or a combination thereof (so that various movement patterns can be selected by the program in the computer 18).
  • the absolute position of the light detection region can be moved while moving the position of the sample solution. May be executed. In this case, it is avoided that the same single particle is repeatedly detected when the light detection region in the short time passes through the same region. Or, by moving the absolute position of the light detection region, the same region is intentionally repeatedly passed through the light detection region, the same single particle is periodically detected multiple times, and the signal An improvement in accuracy may be achieved. In this case, after the absolute position of the light detection region is moved for a predetermined time, the position of the sample solution moves intermittently, and the same single particle is moved to another place in the sample solution.
  • the position of the light detection region is moved in the vertical direction by moving the objective lens 8 or the stage up and down, and the locus of the position of the light detection region is three-dimensionally within the sample solution. It may be designed to be deployed.
  • the above optical system is used as a multiphoton microscope. In that case, since there is light emission only in the focal region (light detection region) of the excitation light, the pinhole 13 may be removed. In addition, when the luminescent material that generates background light emits light regardless of excitation light due to chemiluminescence or bioluminescence, the optical systems 2 to 5 for generating excitation light may be omitted. When the luminescent material that generates background light emits light by phosphorescence or scattering, the optical system of the confocal microscope is used as it is.
  • a plurality of excitation light sources 2 may be provided, and the wavelength of the excitation light may be appropriately selected according to the excitation wavelength of the luminescent material.
  • a plurality of photodetectors 16 may be provided, and may be separately detected according to the wavelength of the background light.
  • the background light may be provided by illumination light. In that case, the sample solution is illuminated from above the objective lens by transmitted illumination (may be Koehler illumination).
  • the single particle detection technology of the present invention detects the shadow of a single particle.
  • a scanning molecule counting method that is, in the presence of background light, the position of the light detection region is moved within the sample solution.
  • the presence of a single particle is individually detected, and its count or information on the concentration in the sample solution Is acquired.
  • the concentration or number density of the luminescent particles is lower than that, for example, if the luminescent particles are at a level that only occasionally enters the light detection region CV, a significant value is obtained as illustrated on the right side of the figure.
  • the light intensity signal (photon count) appears only during a part of the measurement time, and it is difficult to calculate the fluctuation of the light intensity with high accuracy.
  • the concentration of the luminescent particles is much lower than the level at which about one luminescent particle is always present in the light detection area during measurement, the light intensity fluctuation is affected by the background. The measurement time is long to easily obtain significant light intensity data sufficient for calculation.
  • the applicant of the present application disclosed in Japanese Patent Application No. 2010-044714 and PCT / JP2011 / 53481 even when the concentration of the luminescent particles is lower than the level required by the above-described spectroscopic analysis techniques such as FCS and FIDA.
  • a “scanning molecule counting method” based on a novel principle that enables detection of properties such as number density or concentration of luminescent particles.
  • the particles to be observed are luminescent particles dispersed in the sample solution.
  • the light intensity measurement is performed while positioning. Then, when the light detection region includes the luminescent particles, the light from the luminescent particles reaches the light detection unit, so that an increase in the measured value of the light intensity occurs.
  • the presence of one luminescent particle will be detected individually.
  • statistical calculation processing such as calculation of fluctuations in fluorescence intensity is not performed, and luminescent particles are detected one by one. Therefore, FCS, FIDA, etc. have sufficient accuracy. Even with a sample solution in which the concentration of particles to be observed is so low that analysis is impossible, information on the concentration or number density of particles can be obtained.
  • particles to be observed are particles that emit light in the detection light wavelength band, and particles that do not emit light in the detection light wavelength band cannot be detected. Therefore, when particles that do not emit light originally are to be observed, it is necessary to attach luminescent labels such as fluorescent labels to the particles. However, depending on the particle, it may be difficult to apply the luminescent label, or the particle may be modified due to the application of the luminescent label.
  • the “inverted scanning molecule counting method” of the present invention emits background light from the light detection region (or the light detection region) in the optical measurement by the scanning molecule counting method.
  • the detection of a single particle is performed by capturing that the detected background light decreases.
  • the optical path is changed by driving a mechanism (mirror deflector 17) for moving the position of the light detection region, or a sample solution is injected.
  • the horizontal position of the container 10 (microplate 9) is moved to move the position of the light detection region CV in the sample solution as schematically illustrated in FIG. That is, light detection is performed while scanning the sample solution by the light detection region CV.
  • the luminescent material is dispersed in the sample solution, and a large number of luminescent materials are present in the light detection region CV.
  • t2 Basically, light from these luminescent materials is detected substantially uniformly.
  • the light detection region CV moves through the region where one particle that does not emit light (or a particle with low emission intensity in the detection light wavelength band) exists (t1)
  • the volume of the existence region is reduced, the total amount of light emitted by the luminescent material is reduced, and as shown in FIG. A decrease in light intensity (Em) will appear.
  • the movement of the position of the light detection region CV and the light detection described above are performed, and a significant decrease in light intensity in the form of pulses as illustrated in FIG.
  • a single particle is detected individually by detecting the signal representing the presence one by one, and by counting the number, the number of single particles present in the measured area, or the concentration or number density The information regarding can be acquired.
  • the degree of decrease in the light intensity can be estimated from the relationship between the diameter of the single particle and the diameter of the light detection region.
  • the light intensity distribution in the light detection region has a maximum intensity Imax at the center, as indicated by a solid line in the figure, and has a radius r direction. It has a bell-shaped profile f (r) that decreases toward. Therefore, using the radius a of the light detection region where f (r) becomes substantially 0, the total amount of light emitted from the light detection region when no single particle to be observed exists in the light detection region.
  • ⁇ 4 ⁇ r 2 f (r) dr [Integration interval is 0 to a] (1) Given in On the other hand, when a single particle having a radius b enters the photodetection region and is positioned at the center of the photodetection region as shown in the lower part of FIG. 2C, the luminescent material in that region is excluded. The amount of light corresponding to the hatched area in the upper part of FIG. 2C is reduced.
  • FIG. 2D is a graph plotting the light intensity decrease ratio ⁇ / ⁇ with respect to the radius ratio b / a using the equation (3).
  • the ratio b / a of the single particle radius to the radius of the light detection region should be 0.15 or more.
  • the ratio b / a of the detectable single particle radius to the radius of the photodetection region is 0.35.
  • the single particle to be observed is a quencher or a fluorescence energy transfer acceptor
  • the single particle absorbs ambient light (for example, 10 nm). It can be reduced from the illustrated radius.
  • the radius illustrated above is a value when a single particle to be observed does not substantially emit light in the detection light wavelength band, and the single particle has a certain degree in the detection light wavelength band. In the case of emitting light, the detectable single particle radius may be increased from the illustrated radius.
  • FIG. 3 shows processing in this embodiment expressed in the form of a flowchart.
  • the particles to be observed in the single particle detection technique of the present invention are particles that are dispersed in the sample solution and move randomly in the solution, and the particle size is the light detection region.
  • the diameter may be 15% or more, more preferably 35% or more, such as protein, peptide, nucleic acid, lipid, sugar chain, amino acid, or an aggregate thereof.
  • Particulate biological objects such as biomolecules, viruses, cells, non-biological particles (eg, atoms, molecules, micelles, liposomes, metal colloids, beads (magnetic beads, polystyrene beads, latex beads, etc.
  • a single particle may be a particle having a lower emission intensity than the background light in the detection light wavelength band.
  • the light-emitting substance that gives light may be any light-emitting molecule, for example, a fluorescent molecule, a phosphorescent molecule, or a chemical / bioluminescent molecule, and the light-emitting substance is always present at a concentration at which several molecules or more exist in the light detection region.
  • the sample solution is typically an aqueous solution, but is not limited thereto, and may be an organic solvent or any other liquid.
  • the computer 18 stores a program stored in a storage device (not shown) (procedure for moving the position of the light detection region in the sample solution, and from the light detection region during movement of the position of the light detection region).
  • a program stored in a storage device (not shown) (procedure for moving the position of the light detection region in the sample solution, and from the light detection region during movement of the position of the light detection region).
  • irradiation of excitation light and measurement of light intensity in the light detection region in the sample solution are started.
  • the mirror deflector 17 or the stage position changing device 17a drives the mirror 7 (galvanomirror) or the microplate 9 on the stage of the microscope, and the wells.
  • the position of the light detection region is moved, and at the same time, the light detector 16 sequentially converts the detected light into an electric signal and transmits it to the computer 18. In this manner, time-series light intensity data is generated from the transmitted signal and stored.
  • the photodetector 16 is an ultra-sensitive photodetector that can detect the presence or absence of the arrival of one photon. Therefore, when the light is detected by photon counting, the time-series light intensity data is It may be a series of photon count data.
  • the moving speed of the position of the light detection region during the measurement of the light intensity may be a predetermined speed that is arbitrarily set, for example, experimentally or so as to suit the purpose of analysis.
  • the size or volume of the region through which the light detection region has passed is required, so that the moving distance is grasped.
  • the movement of the position of the light detection region is executed in the manner.
  • the movement speed is basically a constant speed.
  • the present invention is not limited to this.
  • the moving speed of the position of the light detection region in order to carry out quantitatively accurate detection of single particles or counting of the number of single particles from the measured time-series light intensity data. For this reason, it is preferable that the moving speed is set to a value faster than the moving speed by the random movement of the single particle, that is, the Brownian movement.
  • the observation target particle of the single particle detection technique of the present invention is a particle which is dispersed or dissolved in a solution and moves freely and randomly, its position moves with time by Brownian motion. Accordingly, when the moving speed of the position of the light detection region is slower than the movement of the particle due to Brownian motion, the particle moves randomly within the region as schematically illustrated in FIG.
  • the light intensity changes randomly (as already mentioned, the excitation light intensity in the light detection region decreases outward with the center of the region as the apex), corresponding to each single particle. It becomes difficult to identify a significant change in light intensity. Therefore, preferably, as shown in FIG. 4B, the particle crosses the light detection region in a substantially straight line, so that in the time-series light intensity data, the uppermost stage of FIG.
  • the light intensity change profile corresponding to each single particle becomes substantially uniform (if the single particle passes through the light detection region substantially linearly, the light intensity change profile is This is almost the same as the profile obtained by inverting the excitation light intensity distribution.)
  • the moving speed of the position of the light detection region is the average of the Brownian motion of the particles so that the correspondence between the individual particles and the light intensity can be easily identified. Is set to be faster than the moving speed (diffusion moving speed).
  • the moving speed of the position of the light detection region may be set to 15 mm / s or more, which is 10 times or more.
  • the profile of the change in the light intensity by setting the moving speed of the position of the light detection region in various ways is expected (typically, the excitation light intensity distribution).
  • a preliminary experiment for finding a condition that is substantially the same as that described above may be repeatedly performed to determine a suitable moving speed of the position of the light detection region.
  • the computer 18 detects a single particle signal by processing according to a program stored in a storage device, Various analyzes such as particle counting and concentration calculation are performed.
  • a signal in which the time width in which the decrease in light intensity below the threshold continues is not within the predetermined range is determined as a noise or foreign matter signal.
  • the intensity A and the width a calculated by fitting the equation (7) to a significant light intensity decrease profile (a profile that can be clearly determined not to be fluctuation of background light) are predetermined.
  • the light intensity profile corresponds to the passage of one particle through the light detection region, and one particle may be detected.
  • a signal whose intensity A and width a are outside the predetermined range is determined as a noise or foreign object signal and may be ignored in the subsequent analysis or the like.
  • time-series light intensity data (FIG. 4C, uppermost “detection result (unprocessed)” ) Is performed (step 110 in FIG. 3, step “smoothing” in FIG. 4C).
  • the light emitted by the luminescent material is probabilistically emitted, and the light intensity is relatively weak. Therefore, the fine increase / decrease occurs.
  • the detection accuracy of a signal indicating the presence of the signal is deteriorated.
  • the smoothing process makes it possible to ignore the fine increase and decrease on the data.
  • the smoothing process may be performed by, for example, a moving average method.
  • the parameters for executing the smoothing process are the moving speed (scanning of the position of the light detection region at the time of acquiring the light intensity data Speed) and BIN TIME may be set as appropriate.
  • a smoothing process is performed in order to detect a time region (pulse existing region) where a significant pulse-like signal (hereinafter referred to as “pulse signal”) exists.
  • a first derivative value with respect to time of the subsequent time-series light intensity data is calculated (step 120).
  • the time differential value of the time-series light intensity data has a large change in value at the time of change of the signal value, as illustrated in the lower “time differential” in FIG. By reference, significant signal start and end points can be advantageously determined.
  • a significant pulse signal is sequentially detected on the time-series light intensity data, and it is determined whether or not the detected signal is a signal corresponding to a single particle. Specifically, first, on the time-series time differential value data of the time-series light intensity data, with reference to the time differential value sequentially, the start point and the end point of one pulse signal are searched and determined, A pulse presence region is identified (step 130). When one pulse existence area is specified, a downward convex bell-shaped function fitting is performed on the smoothed time-series light intensity data in the pulse existence area (see FIG.
  • Bell-shaped function fitting ”), peak-shaped intensity of peak of bell-shaped function (maximum decrease from background light) Ipeak, pulse width (full width at half maximum) Wpeak, correlation coefficient (of least squares method) in fitting, etc.
  • a parameter is calculated (step 140).
  • the bell-shaped function to be fitted is typically a Gaussian function, but may be a Lorentz-type function.
  • the calculated bell-shaped function parameter is within the range assumed for the bell-shaped profile parameter drawn by the pulse signal detected when one particle passes the light detection region, that is, Whether the pulse peak intensity, pulse width, and correlation coefficient are within predetermined ranges, for example, The following conditions: 20 ⁇ s ⁇ pulse width ⁇ 400 ⁇ s peak intensity> 4.0 [pc / 10 ⁇ s] (A) Correlation coefficient> 0.95 Whether or not the condition is satisfied is determined (step 150).
  • the signal determined that the calculated bell-shaped function parameter is within the assumed range in the signal corresponding to one particle is determined to be the signal corresponding to one particle.
  • a pulse signal whose calculated bell-shaped function parameter is not within the assumed range is ignored as noise.
  • the search and determination of the pulse signal in the processing of the above steps 130 to 150 may be repeatedly executed over the entire area of the time series light intensity data (step 160).
  • the process which detects the signal of a single particle individually from time series light intensity data is not restricted to said procedure, You may perform by arbitrary methods.
  • the number of particles detected may be counted to determine the number of particles (particle counting). If the total volume of the region through which the light detection region has passed is calculated by an arbitrary method, the number density or concentration of particles in the sample solution is determined from the volume value and the number of particles (step 170). ).
  • the total volume of the region through which the light detection region has passed may be theoretically calculated based on the wavelength of the excitation light or detection light, the numerical aperture of the lens, and the adjustment state of the optical system.
  • control solution a solution having a known concentration
  • control solution a plurality of solutions having different concentrations of single particles are prepared, and measurement is performed on each of them.
  • the calculated average value of Vt is adopted as the total volume Vt of the region through which the light detection region passes. You may be supposed to.
  • the volume of the light detection region and the total volume of the region through which the light detection region has passed are given by any method, for example, using FCS or FIDA, without depending on the above method. It's okay.
  • information on the relationship between the concentration C and the number N of various standard particles is assumed for the assumed movement pattern of the light detection region.
  • Information stored in advance in the storage device of the computer 18 may be used so that the user of the device can appropriately use the stored information when performing single particle detection.
  • the counting and concentration of particles in the sample solution can be determined by the above processing procedure. It becomes.
  • the single particle detection process measurement of light intensity while moving in the light detection region and detection of single particle signals are repeated until the number of signals reaches a predetermined number, The time required for the number of particles to reach a predetermined number is measured, and based on the time required for the number of such single particle signals to reach a predetermined number, the particle concentration is determined. Good. According to this configuration, when the particle concentration in the sample solution is high, the time required for measuring the light intensity is shortened, and when the particle concentration in the sample solution is low, the result (ie, particle concentration) is required. The light intensity measurement can be continued until the number of particles that achieve the desired accuracy is obtained.
  • the number of single particle signals is a predetermined number.
  • the time taken to reach the value reflects the number of particles that achieve the required accuracy in the results, so the particle concentration value determined based on that time is acceptable or satisfactory. It is expected to have accuracy.
  • the concentration value of particles and the time required for the number of signals to reach a predetermined number are related as follows. That is, in a sample solution having a certain particle concentration C, when the photodetection region is moved at the scanning speed u over time ⁇ , the detected particle is represented by S as the cross-sectional area of the photodetection region.
  • the particle concentration C is linearly proportional to the detection speed V, and the correspondence between the particle concentration C and the detection speed V is easy to understand. Therefore, in an actual experiment, the particle concentration C May be determined using the detection speed V.
  • the single particle detection processing for detecting a certain number of signals may be executed, for example, by the processing procedure shown in the flowchart of FIG.
  • a series of processes of moving the position of the light detection region, detecting light from the light detection region, detecting a single particle signal and counting the detected particle signal are repeatedly executed at every analysis time interval t (predetermined time interval) until the detected particle number X reaches the end particle number XE (a predetermined number that a single particle number should reach).
  • t predetermined time interval
  • (A) Initial setting Referring to FIG. 5, in the operation process, specifically, first, the sample solution is injected into the well 10 of the microplate 9 and placed on the microscope stage, and then the user.
  • the computer 18 inputs an instruction to start light intensity measurement and particle detection / counting processing to the computer 18, the computer 18 sets the end particle number XE (step 10) and the analysis time interval t as initial settings. Is set (step 20).
  • the number of end particles XE and the analysis time interval t may be arbitrarily set by the user.
  • the number XE of end particles can be appropriately determined with reference to the result of a preliminary experiment using a solution having a known particle concentration so that the accuracy required for the result value of the particle concentration can be achieved.
  • the analysis time interval t is an arbitrary time interval that is sufficiently shorter than the time from the start of processing until the number of particles (X) reaches the number of end particles (XE). It may be set as appropriate in consideration.
  • the end particle number XE and the analysis time interval t values preliminarily determined with reference to the result of a preliminary experiment using a solution having a known particle concentration are stored in the apparatus 1, and such storage is performed. The set value may be used automatically or by user selection.
  • Step 40 is repeatedly executed until the total number of particles X (tn) reaches the final particle number XE (step 50).
  • the start time Ts of a series of processes may be stored (step 25).
  • the light detection / particle number detection process in step 30 may be the same as the process shown in FIG.
  • the light intensity is measured over the analysis time interval t while moving the position of the light detection region in the sample solution (scanning in the sample solution), and then the obtained analysis is performed.
  • the computer 18 performs processing according to a program stored in the storage device to detect a signal indicating the presence of a single particle and count the detected number. Executed.
  • Step 40 in FIG. 5 X (t n ) is the total number of particles detected up to the previous analysis time interval t, and its initial value is zero. Steps 30 to 40 are performed until the total number X (tn) of single particles reaches the end particle number XE, that is, X (t n ) ⁇ XE (15) Is repeated at each analysis time interval t until the above is established (step 50). If the equation (15) is satisfied while the steps 30 to 50 are repeated, the processing of measuring the light intensity of the sample solution and detecting / counting the particles is completed. When the iterative process of steps 30 to 50 ends, the end time TE may be stored (step 60).
  • each process indicated by a dotted line in the drawing is executed. Specifically, first, the latest total number of detected particles X (tn) calculated in step 40 is displayed on the display (step 52). If the repeated execution of steps 30 to 50 has already been performed, the value of the total number of detected particles X (tn) so far is updated. Next, in order to calculate the measurement end time TE or the measurement remaining time Tr, the particle detection speed v after the start of the processing of Steps 30 to 50 is calculated (Step 54).
  • Tp is the current time.
  • Tr the remaining measurement time Tr (time until the end of the processing in steps 30 to 50)
  • Tr (XE ⁇ X (t n )) / v (17)
  • the measurement end time TE (the time at which the processing of steps 30 to 50 is completed)
  • TE Tp + Tr (18) (Step 56).
  • the measurement of the light intensity in step 100 of FIG. 3 may be continuously performed during the execution of the signal processing steps other than step 100 from the start to the end of the measurement. That is, in the light detection / particle number detection process, when the measurement of the light intensity over the analysis time interval t of one cycle is completed, the measurement of the light intensity over the analysis time interval t of the next cycle is performed.
  • the computer 18 executes processing for detecting and counting the particle signal from the light intensity data acquired over the analysis time interval t of the completed cycle. Become. Thereby, detection / counting of particles is achieved in real time.
  • the particle concentration is calculated from the time T until reaching the end particle number and the end particle number XE using the equation (12), and the particle detection speed V is calculated. , Determined using the relationship of equation (13).
  • cross-sectional area S of the passage region of the light detection region in the equations (10) to (13) is theoretically calculated based on the wavelength of the excitation light or detection light, the numerical aperture of the lens, and the adjustment state of the optical system.
  • control solution for a solution having a known particle concentration (control solution), measurement of light intensity and particle detection described above under the same conditions as the measurement of the sample solution to be examined. It may be determined from the number of particles detected by performing the counting and the concentration of a single particle in the control solution.
  • the number of detected particles in the measurement of light intensity performed for a certain time ⁇ o at a moving speed uo for a control solution having a particle concentration C is N
  • a plurality of solutions having different concentrations of particles are prepared as a control solution, and measurement is performed on each of them.
  • the calculated average value of S is adopted as the cross-sectional area S of the light detection region. Good.
  • FIG. 6A is a flowchart of the measurement of the light intensity of the sample solution and the particle detection / counting process configured to include a process (step 20 ′) for correcting the analysis time interval t according to the particle detection state.
  • FIG. 6B shows the calculation processing of the analysis time interval t in step 20 ′ in the form of a flowchart.
  • the same step number is assigned to the same process as in FIG.
  • the analysis time interval t is corrected (step 20 ′).
  • the process of the example shown in the drawing is referred to as a predetermined number N (hereinafter referred to as “scheduled number of updates”) in one measurement from the start until the number of particles reaches the end particle number XE. ) Only the light intensity measurement and particle detection / counting processing cycles are executed. Specifically, as an initial setting, first, after setting the number XE of end particles (step 10) and storing the start time Ts (step 25), first the light intensity measurement and particle detection / counting processing are executed.
  • Step 50 the total number of detected particles X (t n ) and / or the measurement end time TE or the remaining measurement time Tr are displayed on a display such as the monitor of the computer 18. (Steps 52 and 58). If the number of particles has reached the end particle number XE in the first processing cycle, the light intensity measurement and particle detection / counting processes are terminated (step 50).
  • step 20 ′ for correcting the analysis time interval t it is first determined whether or not the number of particles X (tn) detected so far is 0 (step 220). .
  • the analysis time interval t in the immediately preceding cycle may be multiplied by m (m is a positive number of 1 or more).
  • the analysis time interval t is determined by using the remaining measurement time Tr, the scheduled update count N, and the execution count k of the processing cycle.
  • the measurement remaining time Tr reflects the detection state of particles in the sample solution to be observed. It will be optimized according to the detection status of such particles.
  • time-series light intensity data obtained by light measurement using the inverted scanning molecule counting method it was verified that a signal indicating the presence of a single particle can be detected and that the particle concentration can be detected.
  • the sample solution is a fluorescent dye ATTO488 (ATTO-TEC) as a luminescent substance for generating background light in a solution of 10 mM Tris-HCl (pH 7.0) so that the concentration becomes 12.5 ⁇ M or 15 nM.
  • the above-mentioned “(2) Measurement of light intensity of sample solution” is performed using a single-molecule fluorescence measuring apparatus MF20 (Olympus Corporation) equipped with a confocal fluorescence microscope optical system and a photon counting system.
  • time-series light intensity data photon count data
  • the diameter of the confocal volume (light detection area) is adjusted to 1 ⁇ m
  • the moving speed of the position of the light detection area in the sample solution is 15 mm / second
  • the BIN TIME is set to 10 ⁇ second for 100 seconds. Measurements were made.
  • FIG. 7A was obtained by using a solution having a fluorescent dye concentration of 12.5 ⁇ M in which magnetic beads were dispersed at about 5 pM (5 mg / ml) as a sample solution and using 10 ⁇ W of 488 nm laser light as excitation light.
  • a part of time-series photon count data (Raw) is shown.
  • the detection light was detected using a bandpass filter having a transmission wavelength of 650 to 690 nm and a bandpass filter having a transmission wavelength of 660 to 710 nm.
  • data after smoothing (Smoothing) and fitting curve (Fit) are also shown.
  • FIG. 7B is an enlarged view of the time-series photon count data shown in FIG. As is clear from FIG.
  • the ratio of the signal intensity of the beads to the background light intensity was -61% for the largest and -16% for the smallest.
  • the ratio of the intensity of the bead signal to the background light intensity is the integrated intensity of the pulse signal obtained by integrating the difference between the fluorescence intensity and the background in 200 ⁇ sec before and after the pulse signal, and the height is the background light.
  • FIG. 7C is obtained by using 50 ⁇ W of 488 nm laser light as excitation light for a sample solution in which magnetic beads are dispersed at 0 fM, 10 fM, 20 fM and 50 fM in a solution having a fluorescent dye concentration of 15 nM. It is the figure which plotted the number of signals obtained from the time series photon count data against magnetic bead concentration.
  • the detection light was detected using a bandpass filter having a transmission wavelength of 510 to 560 nm.
  • the sample container was moved at 1 mm / second along a circular orbit having a diameter of 1 mm.
  • the pulse signals that can be approximated by a Gaussian function those having an S / N ratio of 0.35 or more were counted as particle signals.
  • the number of detection signals and the concentration were generally proportional when the magnetic bead concentration was 10 fM or more.
  • the inverted scanning molecular counting method according to the teachings of the present invention, information on the detection of non-luminescent single particles dispersed in a sample solution and its concentration Can be acquired.
  • the present invention individually detects single particle signals, particles can be detected even if the particle concentration in the sample solution is lower than the concentration range required by optical analysis techniques such as FCS. Yes, such a feature may be advantageous when performing analysis on rare or expensive samples often used in the field of medical and biological research and development.
  • the observation target particles are not luminescent particles, and therefore it is not necessary to provide a luminescent label, so that artifacts due to the luminescent label are avoided.

Abstract

共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡による光計測を用いて単一粒子を個別に検出し、粒子の状態又は特性を定量的に観測することを可能にする走査分子計数法による単一粒子検出技術が提供される。本発明による試料溶液中の単一粒子を検出する技術は、試料溶液内に於ける顕微鏡の光検出領域の位置を移動させながら光検出領域から実質的に一定の背景光を含む光を検出して時系列の光強度データを生成し、時系列光強度データに於いて発光しない単一粒子（又は検出波長帯域に於ける発光強度が背景光よりも低い粒子）が光検出領域内へ進入した際に生ずる光強度の低下を単一粒子の各々の存在を表す信号として個別に検出することを特徴とする。

Description

光分析を用いた単一粒子検出装置、単一粒子検出方法及び単一粒子検出用コンピュータプログラム
　本発明は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いて、溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はこれらの凝集体（以下、これらを「粒子」と称する。）、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の対象物、或いは、非生物学的な粒子を検出して、それらの状態（相互作用、結合・解離状態など）の分析又は解析に於いて有用な情報を取得することが可能な単一粒子検出技術に係り、より詳細には、上記の如き光学系を用いて単一の粒子の存在に依る光強度の変化を計測して単一粒子を検出し、種々の分析を可能にする単一粒子検出装置、単一粒子検出方法及び単一粒子検出用コンピュータプログラムに係る。
　近年の光計測技術の発展により、共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング（１光子検出）も可能な超高感度の光検出技術とを用いて、一光子又は蛍光一分子レベルの微弱光の検出・測定が可能となっている。そこで、そのような微弱光の計測技術を用いて単一粒子を検出し、生体分子等の特性、分子間相互作用又は結合・解離反応の検出を行う装置又は方法が種々提案されている。例えば、蛍光相関分光分析（Fluorescence　Correlation　Spectroscopy：ＦＣＳ。例えば、特許文献１－３、非特許文献１－３参照）に於いては、レーザー共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術を用いて、試料溶液中の微小領域（顕微鏡のレーザー光が集光された焦点領域－コンフォーカル・ボリュームと称される。）内に出入りする蛍光分子又は蛍光標識された分子（蛍光分子等）からの蛍光強度の測定が為され、その測定された蛍光強度の自己相関関数の値から決定される微小領域内に於ける蛍光分子等の平均の滞留時間（並進拡散時間）及び滞留する分子の数の平均値に基づいて、蛍光分子等の運動の速さ又は大きさ、濃度といった情報の取得、或いは、分子の構造又は大きさの変化や分子の結合・解離反応又は分散・凝集といった種々の現象の検出が為される。更に、蛍光強度分布分析(Fluorescence-Intensity　Distribution　Analysis：ＦＩＤＡ。例えば、特許文献４、非特許文献４)やフォトンカウンティングヒストグラム（Photon　Counting　Histogram：ＰＣＨ。例えば、特許文献５）では、ＦＣＳと同様に計測されるコンフォーカル・ボリューム内に出入りする蛍光分子等の蛍光強度のヒストグラムが生成され、そのヒストグラムの分布に対して統計的なモデル式をフィッティングすることにより、蛍光分子等の固有の明るさの平均値とコンフォーカル・ボリューム内に滞留する分子の数の平均値が算定され、これらの情報に基づいて、分子の構造又は大きさの変化、結合・解離状態、分散・凝集状態などが推定されることとなる。またその他に、特許文献６、７に於いては、共焦点顕微鏡の光学系を用いて計測される試料溶液の蛍光信号の時間経過に基づいて蛍光性物質を検出する方法が提案されている。特許文献８は、フローサイトメータに於いて流通させられた蛍光微粒子又は基板上に固定された蛍光微粒子からの微弱光をフォトンカウンティング技術を用いて計測してフロー中又は基板上の蛍光微粒子の存在を検出するための信号演算処理技術を提案している。また、特許文献９は、ＦＣＳの態様の一つとして、多量の発光物質が溶解された溶液中に於いて分散された発光しない粒子がコンフォーカル・ボリューム内に進入した際に検出される光強度が低下する系に於いて、蛍光強度の自己相関関数の値を算出し、発光しない粒子のコンフォーカル・ボリューム内に於ける並進拡散時間及び滞留粒子数の平均値を算出する方法（inverted　ＦＣＳ（ｉＦＣＳ））を開示した。
　上記の如きＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術とを用いた微小領域の蛍光測定技術を用いた方法によれば、測定に必要な試料は、従前に比して極めて低濃度且微量でよく（一回の測定で使用される量は、たかだか数十μＬ程度）、測定時間も大幅に短縮される（一回の測定で秒オーダーの時間の計測が数回繰り返される。）。従って、これらの技術は、特に、医学・生物学の研究開発の分野でしばしば使用される希少な或いは高価な試料についての分析を行う場合や、病気の臨床診断や生理活性物質のスクリーニングなど、検体数が多い場合に、従前の生化学的方法に比して、低廉に、或いは、迅速に実験又は検査が実行できる強力なツールとなることが期待されている。
特開２００５－０９８８７６ 特開２００８－２９２３７１ 特開２００９－２８１８３１ 特許第４０２３５２３号 国際公開２００８－０８０４１７ 特開２００７－２０５６５ 特開２００８－１１６４４０ 特開平４－３３７４４６号公報 国際公開２０１０－１１９０９８
金城政孝、蛋白質　核酸　酵素　Vol.４４、No.９、１４３１－１４３８頁　１９９９年 エフ・ジェイ・メイヤー・アルムス（F.J.Meyer-Alms）、フルオレセンス・コリレーション・スペクトロスコピー（Fluorescence　Correlation　Spectroscopy）、アール・リグラー編（R.Rigler）、スプリンガー（Springer）、ベルリン、２０００年、２０４－２２４頁 加藤則子外４名、遺伝子医学、Vol.６、No.２、２７１－２７７頁 カスク他３名、米国科学アカデミー紀要　１９９９年、９６巻、13756‐13761頁（P.　Kask,　K.　Palo,　D.　Ullmann,　K.　Gall　PNAS　96,　13756-13761　(1999)）
　上記の如きＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術を用いた分析技術では、蛍光一分子又は数分子レベルの光強度の変化を利用して単一粒子の挙動の観測を行うが、その光強度の解析に於いて、時系列に測定された蛍光強度データの自己相関関数の演算又はヒストグラムに対するフィッティングといった蛍光強度のゆらぎの算出等の統計的処理が実行され、個々の単一粒子の挙動を個別に参照又は分析するわけではない。即ち、これらの分析技術に於いては、粒子の存在を表す光強度の変化が統計的に処理され、粒子の統計平均的な特性が検出されることとなる。従って、これらの分析技術に於いて統計的に有意な結果を得るためには、試料溶液中の観測対象となる単一粒子の濃度又は数密度は、平衡状態に於いて、一回の秒オーダーの長さの計測時間のうちに統計的処理が可能な数の単一粒子が微小領域内を入出するレベル、好適には、微小領域内に常に一個程度の単一粒子が存在しているレベル以上である必要がある。実際、コンフォーカル・ボリュームの体積は、１ｆＬ程度となるので、上記の光分析技術に於いて使用される試料溶液中の単一粒子の濃度は、典型的には、１ｎＭ程度若しくはそれ以上であり、１ｎＭを大幅に下回るときには、単一粒子がコンフォーカル・ボリューム内に存在しない時間が生じて統計的に有意な分析結果が得られないこととなる。一方、特許文献６～８に記載の単一粒子の検出方法では、蛍光強度のゆらぎの統計的演算処理が含まれておらず、試料溶液中の単一粒子が１ｎＭ未満であっても単一粒子の検出が可能であるが、溶液中でランダムに運動している単一粒子の濃度又は数密度を定量的に算出するといったことは達成されていない。
　そこで、本願出願人は、特願２０１０－０４４７１４及びＰＣＴ／ＪＰ２０１１／５３４８１に於いて、観測対象となる発光する粒子（発光粒子）の濃度又は数密度が、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の統計的処理を含む分析技術で取り扱われるレベルよりも低い試料溶液中の発光粒子の状態又は特性を定量的に観測することを可能にする新規な原理に基づく光分析技術を提案した。かかる新規な光分析技術に於いては、端的に述べれば、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等と同様に共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いるところ、試料溶液内に於いて光の検出領域である微小領域（以下、「光検出領域」と称する。）の位置を移動させながら、即ち、光検出領域により試料溶液内を走査しながら、光検出領域が試料溶液中に分散してランダムに運動する発光粒子を包含したときに、その発光粒子から発せられる光を検出し、これにより、試料溶液中の発光粒子の一つ一つを個別に検出して、発光粒子のカウンティングや試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度に関する情報の取得を可能にする。この新規な光分析技術（以下、「走査分子計数法」と称する。）によれば、測定に必要な試料がＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の光分析技術と同様に微量（例えば、数十μＬ程度）であってもよく、また、測定時間が短く、しかも、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の光分析技術の場合に比して、より低い濃度又は数密度の発光粒子の存在を検出し、その濃度、数密度又はその他の特性を定量的に検出することが可能となる。
　上記の如き発光する単一粒子の光を個別に検出する走査分子計数法に於いては、単一粒子からの光は、微弱であるので、迷光や水のラマン散乱による影響を受けやすい。即ち、発光粒子から発せられる光を表す光強度値の増大を発光粒子の信号として識別する分析手法の場合、迷光や水のラマン散乱による光を誤って発光粒子の信号として識別してしまうことがある。また、単一粒子の光を検出する走査分子計数法の場合には、観測対象となる粒子（観測対象粒子）は、発光粒子に限られる。従って、発光しない粒子を観測したい場合には、観測対象となる粒子に発光標識（蛍光標識、りん光標識など）を付与する必要があるところ、観測対象粒子に常に適当な発光標識が付与可能であるとは限らない（発光標識の付与により、観測対象粒子が変性することもあり得る。）。
　かくして、本発明の主な課題は、迷光や水のラマン散乱による影響を受けにくく且つ発光しない粒子を観測対象粒子とする走査分子計数法、即ち、試料溶液中に於いて発光しない単一粒子を個別に検出し、粒子の状態又は特性を定量的に観測することを可能にする新規な原理による単一粒子検出技術を提供することである。
　この点に関し、一般に、顕微鏡の光学系により光計測を行う場合、背景光が高いときには、迷光や水のラマン散乱による影響を受けにくい。また、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の場合、通常の光学顕微鏡よりも光軸方向の分解能が高いので、発光しない単一粒子がコンフォーカル・ボリュームの内部を通過すると、コンフォーカル・ボリュームからの光強度の低下が観測される（特許文献９）。本発明に於いては、かかる知見が利用される。
　本発明の一つの態様によれば、上記の課題は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する単一粒子を検出する単一粒子検出装置であって、試料溶液内に於ける顕微鏡の光学系の光検出領域の位置を移動する光検出領域移動部と、光検出領域からの光を検出する光検出部と、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動させながら光検出部にて検出された光検出領域からの光の時系列の光強度データを生成し、時系列の光強度データに於いて単一粒子の各々の存在を表す信号を個別に検出する信号処理部とを含み、光検出領域からの光が実質的に一定の背景光を含み、単一粒子の各々の存在を表す信号が、単一粒子が光検出領域内へ進入した際に生ずる光検出部にて検出される光強度の低下であることを特徴とする装置によって達成される。かかる構成に於いて、「試料溶液中にて分散しランダムに運動する単一粒子」とは、試料溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はそれらの凝集体などの単一粒子であって、基板などに固定されず、溶液中を自由にブラウン運動している粒子であれば任意の粒子であってよい。又、本発明に於いて観測対象物となる単一粒子は、その粒子が光検出領域内に存在することにより光検出領域からの光量を有意に低下させる粒子であってよく、従って、単一粒子は、基本的には、発光しない粒子であるが、検出光波長帯域に於いて背景光よりも発光強度が低い粒子であってもよいことは理解されるべきである。共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の「光検出領域」とは、それらの顕微鏡に於いて光が検出される微小領域であり、対物レンズから照明光が与えられる場合には、その照明光が集光された領域に相当する（共焦点顕微鏡に於いては、特に対物レンズとピンホールとの位置関係により確定される。）。なお、本明細書に於いて、「単一粒子の信号」という場合には、特に断らない限り、単一粒子の存在を表す信号を指すものとする。
　上記から理解される如く、本発明の装置に於いては、特願２０１０－０４４７１４及びＰＣＴ／ＪＰ２０１１／５３４８１に記載されている「走査分子計数法」と同様に、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動しながら、即ち、試料溶液内を光検出領域により走査しながら、逐次的に、光の検出が行われる。かかる構成に於いて、光検出領域からの光に実質的に一定の背景光が含まれている場合には、単一粒子が光検出領域に進入したときに或いは試料溶液内にて移動する光検出領域が単一粒子を包含したときに、単一粒子の存在によって光検出領域からの光検出部まで到達する背景光の光強度又は光量が低下することとなる。かくして、本発明の装置では、逐次的に検出された光に於いて、かかる背景光の光強度又は光量の低下を単一粒子の信号として個別に検出して、これにより、粒子の存在を一つずつ個別に逐次的に検出し、粒子の溶液内での状態に関する種々の情報が取得されることとなる。即ち、本発明の装置に於いては、一定の背景光が存在する領域に於ける単一粒子の影を検出することにより、単一粒子が個別に検出される。かかる構成によれば、観測対象となる単一粒子が発光しない場合に、又は、発光強度が低い場合でも、その単一粒子に発光標識を付与する必要はなく、また、迷光やラマン散乱光を観測対象粒子の信号として誤判別することもなくなる。
　上記の本発明の装置に於いて、光検出領域からの光に含まれているべき実質的に一定の背景光としては、試料溶液内に分散された物質による蛍光、りん光、化学発光、生物発光又は散乱光であってよい。この場合、試料溶液として使用する溶液中に光を放出又は散乱する物質が分散していない場合には、かかる溶液中に積極的に光を放出又は散乱する物質が溶解又は分散されてよい。また、試料溶液として使用する溶液が自家蛍光を発する場合には、その自家蛍光が上記の背景光として利用されてよい。特に、背景光を生ずる物質が励起光又は照明光を必要とする場合には、顕微鏡装置に於いて照明光用の光源及び光学系が装備される。一方、背景光を生ずる物質が励起光又は照明光なしで発光する場合、例えば、化学発光又は生物発光により発光する物質の場合には、顕微鏡装置に於いて照明光は要しない。更に、背景光は、光検出領域内に単一粒子が存在する場合に低減するのであれば、透過照明等による照明光であってもよいことは理解されるべきである。なお、上記の本発明の構成に於いては、単一粒子の存在による背景光の低減を検出するところ、その背景光の低減の度合は、単一粒子の寸法と光検出領域の寸法との関係に依存する。この点に関し、後に詳細に述べる見積によれば、好ましくは、観測対象となる単一粒子の外径は、光検出領域の直径の１５％以上であり、より好ましくは、単一粒子の外径が光検出領域の直径の３５％以上であることが見出されている。
　上記の本発明の装置に於ける試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、単一粒子の特性又は試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて適宜変更可能となっていてよい。特に、光検出領域の移動速度が速くなると、単一粒子の存在による光強度又は光量の低下の度合が低減することとなるので、単一粒子による光強度又は光量の低下が精度よく又は感度よく計測できるように、光検出領域の移動速度は、適宜変更可能となっていることが好ましい。
　また、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、好適には、検出対象となる単一粒子の拡散移動速度（ブラウン運動による粒子の平均の移動速度）よりも高く設定される。上記に説明されている如く、本発明の装置は、光検出領域が単一粒子の存在位置を通過したときにその単一粒子の存在による背景光の低減を検出して単一粒子を個別に検出する。しかしながら、単一粒子が溶液中でブラウン運動することによりランダムに移動して、複数回、光検出領域を出入りする場合には、１つの単一粒子から複数回、その存在を表す信号が検出されてしまい、検出された信号と１つの単一粒子の存在とを対応させることが困難となる。そこで、上記の如く、光検出領域の移動速度を単一粒子の拡散移動速度よりも高く設定し、これにより、１つの単一粒子を一つの（単一粒子の存在を表す）信号に対応させることが可能となる。なお、拡散移動速度は、単一粒子の特性によって変わるので、上記の如く、単一粒子の特性（特に、拡散定数）に応じて、本発明の装置は、光検出領域の移動速度が適宜変更可能であるよう構成されていることが好ましい。
　試料溶液内での光検出領域の位置の移動は、任意の方式で為されてよい。例えば、レーザー走査型光学顕微鏡に於いて採用されているガルバノミラーを用いるなどして、顕微鏡の光学系の光路を変更して光検出領域の位置が変更されるようになっていてよく、或いは、試料溶液の位置を（例えば、顕微鏡のステージを移動するなどして）動かして、光検出領域の試料溶液内に於ける相対的な位置を移動するようになっていてよい。光検出領域の位置の移動軌跡は、任意に設定されてよく、例えば、円形、楕円形、矩形、直線及び曲線のうちから選択可能であってよい。特に、顕微鏡の光学系の光路を変更して光検出領域の位置が変更される場合、光検出領域の移動は、速やかであり、且つ、試料溶液に於いて機械的振動や流体力学的な作用が実質的に発生しないので、検出対象となる単一粒子が力学的な作用の影響を受けることなく安定した状態にて、光の計測が可能である点で有利である。
　また、上記の本発明の装置の信号処理部の処理に於いて、逐次的な光検出部からの検出値の信号から１つの粒子が光検出領域に入ったか否かの判定は、光検出部にて検出された時系列の光を表す信号の形状に基づいて為されてよい。実施の形態に於いて、典型的には、背景光の強度から計って所定の閾値より低い光強度を有する信号が検出されたときに１つの単一粒子が光検出領域に入ったと判定されてよい。より具体的には、後の実施形態の欄にて説明される如く、通常、単一粒子の存在を表す信号は、光検出部の時系列の検出値、即ち、光強度データに於いて、或る程度の強度を下回る下に凸の釣鐘型のパルス状の信号として現れ、ノイズは、釣鐘型のパルス状ではないか、強度の高い信号として現れる。そこで、本発明の装置の信号処理部は、時系列光強度データ上に於いて、背景光の強度から計って所定閾値を下回る下に凸の釣鐘型のパルス状の信号を単一粒子の存在を表す信号として検出するよう構成されていてよい。「所定閾値」は、実験的に適当な値に設定することが可能である。
　更に、本発明の装置により得られる光強度は、比較的微弱であり、細かい増減が生じ、かかる光強度の細かい増減は、単一粒子の存在を表す信号の検出精度を悪化させる。そこで、信号処理部は、時系列の光強度データを平滑化し、光強度の細かい増減を無視できるようにデータを加工した後、平滑化された時系列光強度データに於いて背景光の強度から計って所定閾値を下回る強度を有する下に凸の釣鐘型のパルス状信号を単一粒子の存在を表す信号として検出するよう構成されていてよい。
　上記の本発明の実施の態様の一つに於いては、信号の数を計数して光検出領域に包含された単一粒子の数を計数するようになっていてよい（粒子のカウンティング）。その場合、検出された単一粒子の数と光検出領域の位置の移動量と組み合わせることにより、試料溶液中の同定された単一粒子の数密度又は濃度に関する情報が得られることとなる。具体的には、例えば、複数の試料溶液の数密度若しくは濃度の比、或いは、濃度若しくは数密度の基準となる標準試料溶液に対する相対的な数密度若しくは濃度の比が算出されるか、又は、濃度若しくは数密度の基準となる標準試料溶液に対する相対的な数密度若しくは濃度の比を用いて、絶対的な数密度値又は濃度値が決定されてよい。或いは、任意の手法により、例えば、所定の速度にて光検出領域の位置を移動するなどして、光検出領域の位置の移動軌跡の全体積を特定すれば、単一粒子の数密度又は濃度が具体的に算定できることとなる。
　ところで、粒子のカウンティングの典型的な態様に於いては、任意に設定された測定時間中に得られた単一粒子の信号の数が計数される。しかしながら、その場合、設定された測定時間の長さによって、検出される単一粒子の信号数が変動することとなり、特に、単一粒子濃度が低いときには、検出信号数から算定される単一粒子濃度値のばらつきが大きくなって精度が低下し得る。そこで、上記の本発明の装置に於いては、粒子のカウンティングの別の態様として、単一粒子の信号数が任意に設定された数に到達するまで測定が実行され、測定時間に基づいて単一粒子濃度値が算定されるようになっていてよい。即ち、上記の本発明の装置は、信号処理部が検出した単一粒子の存在を表す信号の数が予め定められた数に達するまで、光検出領域移動部による光学系の光検出領域の位置の移動と、光検出部による光検出領域からの光の検出と、信号処理部による単一粒子の存在を表す信号の検出とを繰り返し、単一粒子の信号の存在を表す数が予め定められた数に達するのに要した時間に基づいて試料溶液中の単一粒子の濃度を決定するよう構成されていてよい。この場合、単一粒子の高濃度の試料溶液についての測定時間の短縮が期待され、単一粒子の低濃度の試料溶液についての測定は、十分な時間を費やして実行されることとなる。即ち、上記の構成によれば、単一粒子の濃度に応じて測定時間が最適化される。また、予め定められた数を結果に要求される精度を達成する数に設定しておけば、その予め定められた数の単一粒子の検出に要した時間又はそれから導出される任意の結果に於けるばらつきは、小さく抑制され、結果の精度を満足するものとすることが可能となる。
　上記の本発明の装置に於いて、試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動させながら一定の背景光の存在下にて光検出を行い、背景光の光強度又は光量の低下を単一粒子の信号として個別に検出して、これにより、粒子の存在を一つずつ個別に逐次的に検出する単一粒子検出技術の処理は、汎用のコンピュータによっても実現可能である。従って、本発明のもう一つの態様によれば、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する単一粒子を検出する単一粒子検出用コンピュータプログラムであって、試料溶液内に於ける顕微鏡の光学系の光検出領域の位置を移動する手順と、試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動させながら光検出領域から実質的に一定の背景光を含む光を検出して時系列の光強度データを生成する手順と、時系列光強度データに於いて単一粒子が前記光検出領域内へ進入した際に生ずる光強度の低下を単一粒子の各々の存在を表す信号として個別に検出する手順とをコンピュータに実行させることを特徴とするコンピュータプログラムが提供される。
　かかる構成に於いても、背景光は、試料溶液内に分散された物質による蛍光、りん光、化学発光、生物発光又は散乱光であるか、照明光であってよい。また、単一粒子の外径は、好適には、光検出領域の直径の１５％以上であり、より好適には、光検出領域の直径の３５％以上となる。観測対象物となる単一粒子は、既に述べた如く、その粒子が光検出領域内に存在することにより光検出領域からの光量を有意に低下させる粒子、即ち、発光しない粒子又は検出光波長帯域に於いて背景光よりも発光強度が低い粒子である。
　また、上記のコンピュータプログラムに於いても、単一粒子の各々の存在を表す信号の個別の検出は、時系列の信号の形状に基づいて為されてよい。実施の形態に於いて、典型的には、単一粒子の存在を表す信号を個別に検出する手順に於いて、背景光の強度から計って所定の閾値より低い光強度を有する信号が検出されたときに１つの単一粒子が光検出領域に入ったと判定するようになっていてよい。具体的には、単一粒子の存在を表す信号を個別に検出する手順に於いて、時系列光強度データに於いて背景光の強度から計って所定閾値を下回る強度を有する下に凸の釣鐘型のパルス状信号が単一粒子の存在を表す信号として検出されてよく、その際、時系列光強度データが平滑化され、平滑化された時系列光強度データに於いて下に凸の釣鐘型のパルス状信号が単一粒子の存在を表す信号として検出されてよい。
　更に、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、単一粒子の特性、試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて適宜変更可能となっていてよく、好適には、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、検出対象となる単一粒子の拡散移動速度よりも高く設定される。試料溶液内での光検出領域の位置の移動は、任意の方式で為されてよく、好適には、顕微鏡の光学系の光路を変更して或いは試料溶液の位置を動かして光検出領域の位置が変更されるようになっていてよい。光検出領域の位置の移動軌跡は、任意に設定されてよく、例えば、円形、楕円形、矩形、直線及び曲線のうちから選択可能であってよい。
　更に、上記のコンピュータプログラムに於いても、個別に検出された単一粒子の信号の数を計数して光検出領域の位置の移動中に検出された単一粒子の数を計数する手順及び／又は検出された単一粒子の数に基づいて、試料溶液中の単一粒子の数密度又は濃度を決定する手順が含まれていてよい。なお、上記のコンピュータプログラムの場合にも、粒子のカウンティングの於いては、典型的には、任意に設定された測定時間中に得られた単一粒子の信号の数が計数されるが、単一粒子の信号数が任意に設定された数に到達するまで測定が実行され、測定時間に基づいて単一粒子濃度値が算定されるようになっていてよい。従って、上記のコンピュータプログラムも、単一粒子の存在を表す信号の数が予め定められた数に達するまで、光検出領域の位置の移動と、光検出領域からの光の検出と、単一粒子の存在を表す信号の検出とを繰り返し、単一粒子の信号の存在を表す数が予め定められた数に達するのに要した時間に基づいて試料溶液中の単一粒子の濃度を決定するよう手順が構成されていてよい。
　上記の本発明の装置又はコンピュータプログラムによれば、試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動させながら、一定の背景光の存在下にて光検出を行い、背景光の光強度又は光量の低下を単一粒子の信号として個別に検出して、これにより、粒子の存在を一つずつ個別に逐次的に検出する新規な方法が実現される。かくして、本発明によれば、更に、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する単一粒子を検出する単一粒子検出方法であって、試料溶液内に於ける顕微鏡の光学系の光検出領域の位置を移動する過程と、試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動させながら光検出領域から実質的に一定の背景光を含む光を検出して時系列の光強度データを生成する過程と、時系列光強度データに於いて単一粒子が光検出領域内へ進入した際に生ずる光強度の低下を単一粒子の各々の存在を表す信号として個別に検出する過程とを含むことを特徴とする方法が提供される。
　かかる構成に於いても、背景光は、試料溶液内に分散された物質による蛍光、りん光、化学発光、生物発光又は散乱光であるか、照明光であってよい。また、単一粒子の外径は、好適には、光検出領域の直径の１５％以上であり、より好適には、光検出領域の直径の３５％以上となる。観測対象物となる単一粒子は、既に述べた如く、その粒子が光検出領域内に存在することにより光検出領域からの光量を有意に低下させる粒子、即ち、発光しない粒子又は検出光波長帯域に於いて背景光よりも発光強度が低い粒子である。
　また、上記の方法に於いても、単一粒子の各々の存在を表す信号の個別の検出は、時系列の信号の形状に基づいて為されてよい。実施の形態に於いて、典型的には、単一粒子の存在を表す信号を個別に検出する過程に於いて、背景光の強度から計って所定の閾値より低い光強度を有する信号が検出されたときに１つの単一粒子が光検出領域に入ったと判定するようになっていてよい。具体的には、単一粒子の存在を表す信号を個別に検出する過程に於いて、時系列光強度データに於いて背景光の強度から計って所定閾値を下回る強度を有する下に凸の釣鐘型のパルス状信号が単一粒子の存在を表す信号として検出されてよく、その際、時系列光強度データが平滑化され、平滑化された時系列光強度データに於いて下に凸の釣鐘型のパルス状信号が単一粒子の存在を表す信号として検出されてよい。
　更に、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、単一粒子の特性、試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて適宜変更可能となっていてよく、好適には、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、検出対象となる単一粒子の拡散移動速度よりも高く設定される。試料溶液内での光検出領域の位置の移動は、任意の方式で為されてよく、好適には、顕微鏡の光学系の光路を変更して或いは試料溶液の位置を動かして光検出領域の位置が変更されるようになっていてよい。光検出領域の位置の移動軌跡は、任意に設定されてよく、例えば、円形、楕円形、矩形、直線及び曲線のうちから選択可能であってよい。
　更に、上記の方法に於いても、個別に検出された単一粒子の信号の数を計数して光検出領域の位置の移動中に検出された単一粒子の数を計数する過程及び／又は検出された単一粒子の数に基づいて、試料溶液中の単一粒子の数密度又は濃度を決定する過程が含まれていてよい。なお、上記の方法の場合にも、粒子のカウンティングの於いては、典型的には、任意に設定された測定時間中に得られた単一粒子の信号の数が計数されるが、単一粒子の信号数が任意に設定された数に到達するまで測定が実行され、測定時間に基づいて単一粒子濃度値が算定されるようになっていてよい。従って、上記の方法も、単一粒子の存在を表す信号の数が予め定められた数に達するまで、光検出領域の位置の移動と、光検出領域からの光の検出と、単一粒子の存在を表す信号の検出とを繰り返し、単一粒子の信号の存在を表す数が予め定められた数に達するのに要した時間に基づいて試料溶液中の単一粒子の濃度を決定するよう構成されていてよい。
　上記の本発明の単一粒子検出技術は、典型的には、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の生物学的な対象物の溶液中の状態の分析又は解析の用途に用いられるが、非生物学的な粒子（例えば、原子、分子、ミセル、リポソーム、金属コロイド、ビーズ（磁気ビーズ、ポリスチレンビーズ、ラテックスビーズ等）、消光剤（アゾベンゼン類（dabcyl,BHQなど）、金属粒子など）の溶液中の状態の分析又は解析に用いられてもよく、そのような場合も本発明の範囲に属することは理解されるべきである。
　総じて、本発明の単一粒子検出技術は、走査分子計数法の原理を利用して、溶液中に分散した発光しない単一粒子（又は検出光波長帯域に於いて背景光よりも発光強度が低い粒子）の検出を可能にする。従って、通常の走査分子計数法と同様に、その光検出機構自体については、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光検出領域からの光を検出するよう構成されているので、試料溶液の量は、同様に微量であってよい。しかしながら、本発明に於いては、蛍光強度のゆらぎを算出するといった統計的処理が実行されないので、本発明の単一粒子検出技術は、単一粒子の数密度又は濃度がＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨ等の光分析技術に必要であったレベルよりも大幅に低い試料溶液に適用可能である。また、かかる構成によれば、単一粒子に発光標識を付与する必要はなく、従って、発光標識を付与すると変性する粒子であっても、観測対象粒子として選択できることとなる。また、或る程度の背景光の存在下で、背景光の低減を単一粒子の存在を表す信号として検出する態様によれば、迷光やラマン散乱光を観測対象粒子の信号として誤検出することが無くなる。
　本発明のその他の目的及び利点は、以下の本発明の好ましい実施形態の説明により明らかになるであろう。
図１（Ａ）は、本発明による反転型走査分子計数法を実行する単一粒子検出装置の内部構造の模式図である。図１（Ｂ）は、コンフォーカル・ボリューム（共焦点顕微鏡の光検出領域）の模式図である。図１（Ｃ）は、ミラー７の向きを変更して試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動する機構の模式図である。図１（Ｄ）は、マイクロプレートの水平方向位置を移動して試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動する機構の模式図である。 図２（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、本発明に於ける反転型走査分子計数法に於ける単一粒子の存在を検出する原理を説明する模式図及び計測される光強度の時間変化の模式図である。図２（Ｃ）は、単一粒子が光検出領域に進入した際の検出光量の低下の原理を説明する図であり、図２（Ｄ）は、光検出領域と単一粒子との径の比と検出光量の低下の割合との関係を示す図である。 図３は、本発明に従って実行される反転型走査分子計数法の処理手順の一つの態様をフローチャートの形式で表した図である。 図４（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、単一粒子がブラウン運動をしながら光検出領域を横切る場合及び試料溶液内の光検出領域の位置を単一粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動することにより粒子が光検出領域を横切る場合の粒子の運動の態様を表すモデル図である。図４（Ｃ）は、反転型走査分子計数法に従って、計測された時系列光強度データ（フォトンカウントの時間変化）から単一粒子の存在を検出するための処理手順に於ける検出信号の信号処理過程の例を説明する図である。 図５は、本発明に従って実行される反転型走査分子計数法の処理手順の別の態様をフローチャートの形式で表した図である。 図６は、本発明に従って実行される反転型走査分子計数法の処理手順の更に別の態様をフローチャートの形式で表した図である。 図７（Ａ）は、蛍光色素が溶解された溶液であって磁性ビーズを１０ｍｇ／ｍｌにて含む溶液を用いて反転型走査分子計数法に従って得られた時系列光強度データ（フォトンカウントデータ）の例であり、図７（Ｂ）は、磁性ビーズの存在を表す信号が観察されている部分の拡大図である。図中、データ値を平滑化して得られる曲線と磁性ビーズの信号に対するフィッティング曲線とが重ねて示されている。図７（Ｃ）は、溶液中の磁性ビーズ濃度と、反転型走査分子計数法に従って得られた時系列光強度データに於いて検出された磁性ビーズの存在を表す信号の数との関係を示している。
１…光分析装置（共焦点顕微鏡）
２…光源
３…シングルモードオプティカルファイバー
４…コリメータレンズ
５…ダイクロイックミラー
６、７、１１…反射ミラー
８…対物レンズ
９…マイクロプレート
１０…ウェル（試料溶液容器）
１２…コンデンサーレンズ
１３…ピンホール
１４…バリアフィルター
１４ａ…ダイクロイックミラー又は偏光ビームスプリッタ
１５…マルチモードオプティカルファイバー
１６…光検出器
１７…ミラー偏向器
１７ａ…ステージ位置変更装置
１８…コンピュータ
　以下、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。
単一粒子検出装置の構成
　本発明による単一粒子検出技術を実現する単一粒子検出装置は、基本的な構成に於いて、図１（Ａ）に模式的に例示されている如き、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等が実行可能な共焦点顕微鏡の光学系と光検出器とを組み合わせてなる装置であってよい。同図を参照して、単一粒子検出装置１は、光学系２～１７と、光学系の各部の作動を制御すると共にデータを取得し解析するためのコンピュータ１８とから構成される。単一粒子検出装置１の光学系は、通常の共焦点顕微鏡の光学系と同様であってよく、そこに於いて、光源２から放射されシングルモードファイバー３内を伝播したレーザー光（Ｅｘ）が、ファイバーの出射端に於いて固有のＮＡにて決まった角度にて発散する光となって放射され、コリメーター４によって平行光となり、ダイクロイックミラー５、反射ミラー６、７にて反射され、対物レンズ８へ入射される。対物レンズ８の上方には、典型的には、１～数十μＬの試料溶液が分注される試料容器又はウェル１０が配列されたマイクロプレート９が配置されており、対物レンズ８から出射したレーザー光は、試料容器又はウェル１０内の試料溶液中で焦点を結び、光強度の強い領域（励起領域）が形成される。なお、試料溶液中には、典型的には、観測対象物である単一粒子と、背景光を生ずる任意の発光物質が分散又は溶解されており、単一粒子が励起領域に進入していないときには、発光物質が励起されて実質的に一定の光が放出されて、背景光となり、単一粒子が励起領域に進入すると、背景光が低減することとなる。
　かくして、励起領域から放出された光（Ｅｍ）は、対物レンズ８、ダイクロイックミラー５を通過し、ミラー１１にて反射してコンデンサーレンズ１２にて集光され、ピンホール１３を通過し、バリアフィルター１４を透過して（ここで、特定の波長帯域の光成分のみが選択される。）、マルチモードファイバー１５に導入されて、光検出器１６に到達し、時系列の電気信号に変換された後、コンピュータ１８へ入力され、後に説明される態様にて単一粒子検出のための処理が為される。なお、当業者に於いて知られている如く、上記の構成に於いて、ピンホール１３は、対物レンズ８の焦点位置と共役の位置に配置されており、これにより、図１（Ｂ）に模式的に示されている如きレーザー光の焦点領域、即ち、励起領域内から発せられた光のみがピンホール１３を通過し、励起領域以外からの光は遮断される。図１（Ｂ）に例示されたレーザー光の焦点領域は、通常、１～１０ｆＬ程度の実効体積を有する本光分析装置に於ける光検出領域であり（典型的には、光強度が領域の中心を頂点とするガウス様分布となる。実効体積は、光強度が１／ｅ２となる面を境界とする略楕円球体の体積である。）、コンフォーカル・ボリュームと称される。また、本発明では、数分子程度の蛍光色素分子からの微弱光からなる背景光に於ける単一粒子の存在による光量の低下を検出するので、光検出器１６としては、好適には、フォトンカウンティングに使用可能な超高感度の光検出器が用いられる。光の検出がフォトンカウンティングによる場合、光強度の測定は、所定時間に亘って、逐次的に、所定の単位時間毎（ＢＩＮ　ＴＩＭＥ）に、光検出器に到来するフォトンの数を計測する態様にて実行される。従って、この場合、時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータである。また、顕微鏡のステージ（図示せず）には、観察するべきウェル１０を変更するべく、マイクロプレート９の水平方向位置を移動するためのステージ位置変更装置１７ａが設けられていてよい。ステージ位置変更装置１７ａの作動は、コンピュータ１８により制御されてよい。かかる構成により、検体が複数在る場合にも、迅速な計測が達成可能となる。
　更に、上記の単一粒子検出装置の光学系に於いては、試料溶液内を光検出領域により走査する、即ち、試料溶液内に於いて焦点領域、即ち、光検出領域の位置を移動するための機構が設けられる。かかる光検出領域の位置を移動するための機構としては、例えば、図１（Ｃ）に模式的に例示されている如く、反射ミラー７の向きを変更するミラー偏向器１７が採用されてよい（光検出領域の絶対的な位置を移動する方式）。かかるミラー偏向器１７は、通常のレーザー走査型顕微鏡に装備されているガルバノミラー装置と同様であってよい。或いは、別の態様として、図１（Ｄ）に例示されている如く、試料溶液が注入されている容器１０（マイクロプレート９）の水平方向の位置を移動し、試料溶液内に於ける光検出領域の相対的な位置を移動するべくステージ位置変更装置１７ａが作動されてもよい（試料溶液の絶対的な位置を移動する方式）。いずれの方式による場合も、所望の光検出領域の位置の移動パターンを達成するべく、ミラー偏向器１７又はステージ位置変更装置１７ａは、コンピュータ１８の制御の下、光検出器１６による光検出と協調して駆動される。光検出領域の位置の移動軌跡は、円形、楕円形、矩形、直線、曲線又はこれらの組み合わせから任意に選択されてよい（コンピュータ１８に於けるプログラムに於いて、種々の移動パターンが選択できるようになっていてよい。）。また、光検出領域の絶対的な位置を移動する方式と試料溶液の絶対的な位置を移動する方式とを組み合わせて、試料溶液の位置を動かしつつ、光検出領域の絶対的な位置の移動が実行されてよい。この場合、短時間のうちの光検出領域が同一の領域を通過することにより同一の単一粒子を繰り返し検出することが回避される。或いは、光検出領域の絶対的な位置を移動する方式により、意図的に光検出領域に同一の領域を繰り返し通過させ、同一の単一粒子を複数回に亘って周期的に検出し、信号の精度の向上が図られてもよい。この場合、光検出領域の絶対的な位置の移動を所定時間に亘って実行した後に、試料溶液の位置が間歇的に移動して、試料溶液内の別の場所にて、同一の単一粒子の繰り返し検出を実行し、検出される単一粒子の数の増大が図られてよい。なお、図示していないが、対物レンズ８又はステージを上下に移動することにより、光検出領域の位置が上下方向に移動されて、光検出領域の位置の軌跡が、試料溶液内にて三次元的に展開されるようになっていてもよい。
　背景光を生成する発光物質が多光子吸収により発光する場合には、上記の光学系は、多光子顕微鏡として使用される。その場合には、励起光の焦点領域（光検出領域）のみで光の放出があるので、ピンホール１３は、除去されてよい。また、背景光を生成する発光物質が化学発光や生物発光現象により励起光によらず発光する場合には、励起光を生成するための光学系２～５が省略されてよい。背景光を生成する発光物質がりん光又は散乱により発光する場合には、上記の共焦点顕微鏡の光学系がそのまま用いられる。更に、装置１に於いては、図示の如く、複数の励起光源２が設けられていてよく、発光物質の励起波長によって適宜、励起光の波長が選択できるようになっていてよい。同様に、光検出器１６も複数個備えられていてよく、背景光の波長に応じて別々に検出できるようになっていてよい。更にまた、背景光は、照明光により与えられてもよい。その場合、対物レンズの上方から透過照明（ケーラー照明であってよい。）により試料溶液が照明される。
本発明の単一粒子検出技術の原理
　「発明の概要」の欄に記載されている如く、本発明の単一粒子検出技術に於いては、端的に述べれば、単一粒子の影を検出する形式の走査分子計数法（以下、「反転型走査分子計数法」と称する。）にて、即ち、背景光の存在下で、試料溶液内にて光検出領域の位置を移動し、単一粒子が光検出領域に包含された際の背景光の低下を単一粒子の信号として検出する態様にて、単一粒子の存在が個別に検出され、その計数、或いは、試料溶液中の濃度に関する情報が取得される。以下、本発明による反転型走査分子計数法の原理について説明する。
１.反転型走査分子計数法の原理
　ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の分光分析技術は、従前の生化学的な分析技術に比して、必要な試料量が極めて少なく、且つ、迅速に検査が実行できる点で優れている。しかしながら、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の分光分析技術では、原理的に、発光粒子の濃度や特性は、蛍光強度のゆらぎに基づいて算定されるので、精度のよい測定結果を得るためには、試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度が、蛍光強度の計測中に常に一個程度の発光粒子が光検出領域ＣＶ内に存在するレベルであり、計測時間中に常に有意な光強度（フォトンカウント）が検出されることが要求される。もし発光粒子の濃度又は数密度がそれよりも低い場合、例えば、発光粒子がたまにしか光検出領域ＣＶ内へ進入しないレベルである場合には、同図の右側に例示されている如く、有意な光強度の信号（フォトンカウント）が、計測時間の一部にしか現れないこととなり、精度のよい光強度のゆらぎの算定が困難となる。また、計測中に常に一個程度の発光粒子が光検出領域内に存在するレベルよりも発光粒子の濃度が大幅に低い場合には、光強度のゆらぎの演算に於いて、バックグラウンドの影響を受けやすく、演算に十分な量の有意な光強度データを得るために計測時間が長くなる。
　そこで、本願出願人は、特願２０１０－０４４７１４及びＰＣＴ／ＪＰ２０１１／５３４８１に於いて、発光粒子の濃度が、上記の如きＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の分光分析技術にて要求されるレベルよりも低い場合でも、発光粒子の数密度又は濃度等の特性の検出を可能にする新規な原理に基づく「走査分子計数法」を提案した。かかる走査分子計数法に於いては、端的に述べれば、観測対象となる粒子は、試料溶液内にて分散された発光粒子であり、上記の単一粒子検出装置に於いて、光検出領域の位置をしながら、光強度の測定が実行される。そして、光検出領域が発光粒子を包含したときには、発光粒子からの光が光検出部に到達することにより、光強度の測定値の増大が生ずるので、かかる光強度値の増大を検出して、一つの発光粒子の存在が個別に検出されることとなる。かかる走査分子計数法の原理に於いては、蛍光強度のゆらぎの算出の如き統計的な演算処理は行われず、発光粒子が一つずつ検出されるので、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等では十分な精度にて分析ができないほど、観測されるべき粒子の濃度が低い試料溶液でも、粒子の濃度若しくは数密度に関する情報が取得可能である。
　上記の通常の「走査分子計数法」の場合には、観測対象となる粒子は、検出光波長帯域にて発光する粒子であり、検出光波長帯域にて発光しない粒子を検出することができない。従って、本来的には発光しない粒子を観測対象とする場合には、かかる粒子に蛍光標識等の発光標識を付与する必要がある。しかしながら、粒子によっては、発光標識の付与が困難であったり、発光標識の付与に起因して粒子の変性が起き得る。また、粒子の放出する光をその粒子の存在を表す信号として識別する形式の場合、迷光や散乱光或いは光検出器の電気的ノイズにより、光強度データ上の値の増大が生じたときに、その値の増大を誤って発光粒子の信号として識別してしまう場合が在り得る。
　かくして、本発明の「反転型走査分子計数法」は、上記に触れたように、上記の走査分子計数法による光計測に於いて、光検出領域から背景光を放出させ（或いは、光検出領域を照明光にて照明し）、観測対象となる粒子が光検出領域に進入した際に、検出される背景光が低下することを捉えて、単一粒子の検出が為される。具体的には、通常の走査分子計数法と同様に、光検出領域の位置を移動するための機構（ミラー偏向器１７）を駆動して光路を変更し、或いは、試料溶液が注入されている容器１０（マイクロプレート９）の水平方向の位置を移動して、図２（Ａ）にて模式的に描かれているように、試料溶液内に於いて光検出領域ＣＶの位置を移動しながら、即ち、光検出領域ＣＶにより試料溶液内を走査しながら、光検出が実行される。既に触れたように、試料溶液中には発光物質が分散され、光検出領域ＣＶ内には、多数の発光物質が存在しているので、光検出領域ＣＶの移動中（図中、時間ｔｏ～ｔ２）、基本的には、それらの発光物質からの光が略一様に検出される。しかしながら、光検出領域ＣＶが移動する間に於いて１つの発光しない粒子（又は検出光波長帯域に於いて発光強度が低い粒子）の存在する領域を通過する際（ｔ１）には、発光物質の存在領域の体積が低減するので、発光物質の放出する光の総量が低減し、図２（Ｂ）に描かれている如く、時系列の光強度データ上に、釣鐘型のパルス状の有意な光強度（Ｅｍ）の低下が出現することとなる。かくして、上記の光検出領域ＣＶの位置の移動と光検出を実行し、その間に出現する図２（Ｂ）に例示されている如きパルス状の有意な光強度の低下、即ち、単一粒子の存在を表す信号を一つずつ検出することによって、単一粒子が個別に検出され、その数をカウントすることにより、計測された領域内に存在する単一粒子の数、或いは、濃度若しくは数密度に関する情報が取得できることとなる。
　上記の光強度の低下の度合は、単一粒子の径と光検出領域の径との関係から概算することが可能である。図２（Ｃ）を参照して、典型的には、光検出領域内の光強度分布は、図中、実線にて示されている如く、中心にて最大強度Ｉｍａｘを有し、半径ｒ方向に向かって低減する釣鐘型のプロファイルｆ（ｒ）を有している。従って、ｆ（ｒ）が略０になる光検出領域の半径ａを用いて、光検出領域内に観測対象の単一粒子が存在していないときの光検出領域内から放出される光の総量αは、
　　α＝４π∫ｒ２ｆ（ｒ）ｄｒ　［積分区間は、０～ａ］　　　…（１）
にて与えられる。一方、光検出領域内に、半径ｂの単一粒子が進入し、図２（Ｃ）の下段の如く光検出領域の中心に位置するとき、その領域の発光物質が排除されることとなるので、図２（Ｃ）の上段の斜線領域に相当する光量が低減することとなる。その排除される発光物質に相当する光量、つまり低下量βは、
　　β＝４π∫ｒ２ｆ（ｒ）ｄｒ　［積分区間は、０～ｂ］　　　…（２）
にて与えられる。かくして、光強度の低下の割合は、β／αにより概算することが可能となる。
　ここで、ｆ（ｒ）がガウス関数であり、α＝１、ａ＝１となるとき、
　　ｆ（ｒ）＝０．６８４ｅｘｐ（－２ｒ２）　　　…（３）
となる。図２（Ｄ）は、式（３）を用いて、半径比ｂ／ａに対する光強度の低下の割合β／αをプロットした図である。同図を参照して、典型的には、背景光の変動率が１％程度であり、単一粒子による光強度の低下の割合が１％以下であると、信号の検出が不可能となるので、光検出領域の半径に対する単一粒子半径の比ｂ／ａは、０．１５以上とすべきである。また、単一粒子による光強度の低下の割合を１０％以上とする場合には、光検出領域の半径に対する検出可能な単一粒子半径の比ｂ／ａは、０．３５となる。
　なお、観測されるべき単一粒子が消光剤や蛍光エネルギー移動のアクセプタである場合、単一粒子が周囲（例えば、１０ｎｍ）の光を吸収するので、検出可能な単一粒子半径は、上記に例示の半径よりも低減し得る。また、上記に例示の半径は、検出光波長帯域に於いて観測対象の単一粒子が実質的に発光しない場合の値であり、かかる単一粒子が検出光波長帯域に於いて或る程度の光を発する場合には、検出可能な単一粒子半径は、例示の半径よりも増大し得る。
走査分子計数法の処理操作過程
　図１（Ａ）に例示の単一粒子検出装置１を用いた本発明に従った反転型走査分子計数法の実施形態に於いては、具体的には、（１）単一粒子と背景光を生成する発光物質とを含む試料溶液の調製、（２）試料溶液の光強度の測定処理、及び（３）測定された光強度の分析処理が実行される。図３は、フローチャートの形式にて表した本実施形態に於ける処理を示している。
（１）試料溶液の調製
　本発明の単一粒子検出技術の観測対象物となる粒子は、試料溶液中にて分散し溶液中にてランダムに運動する粒子であって、粒径が光検出領域の径の好適には１５％以上、より好適には、３５％以上であれば、任意のものであってよく、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の生物学的な対象物、非生物学的な粒子（例えば、原子、分子、ミセル、リポソーム、金属コロイド、ビーズ（磁気ビーズ、ポリスチレンビーズ、ラテックスビーズ等）、消光剤（アゾベンゼン類（dabcyl,BHQなど）、金属粒子など）などであってよい。この点に関し、「発明の概要」の欄に於いて既に述べた如く、本発明では、単一粒子が光検出領域内に存在することによる光検出領域からの光量の有意な低下を検出するので、単一粒子は、検出光波長帯域に於いて背景光よりも発光強度が低い粒子であってもよい。また、背景光を与える発光物質としては、任意の発光分子、例えば、蛍光分子、りん光分子、化学・生物発光分子であってよく、発光物質は、光検出領域内に常に数分子以上存在する濃度にて試料溶液中に溶解又は分散される。試料溶液は、典型的には水溶液であるが、これに限定されず、有機溶媒その他の任意の液体であってもよい。
（２）試料溶液の光強度の測定（図３－ステップ１００）
　本実施形態の反転型走査分子計数法による光分析に於ける光強度の測定は、測定中にミラー偏向器１７又はステージ位置変更装置１７ａを駆動して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動（試料溶液内の走査）を行う他は、ＦＣＳ又はＦＩＤＡに於ける光強度の測定過程と同様の態様にて実行されてよい。操作処理に於いて、典型的には、マイクロプレート９のウェル１０に試料溶液を注入して顕微鏡のステージ上に載置した後、使用者がコンピュータ１８に対して、測定の開始の指示を入力すると、コンピュータ１８は、記憶装置（図示せず）に記憶されたプログラム（試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動する手順と、光検出領域の位置の移動中に光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する手順）に従って、試料溶液内の光検出領域に於ける励起光の照射及び光強度の計測が開始される。かかる計測中、コンピュータ１８のプログラムに従った処理動作の制御下、ミラー偏向器１７又はステージ位置変更装置１７ａは、ミラー７（ガルバノミラー）又は顕微鏡のステージ上のマイクロプレート９を駆動して、ウェル１０内に於いて光検出領域の位置の移動を実行し、これと同時に光検出器１６は、逐次的に検出された光を電気信号に変換してコンピュータ１８へ送信し、コンピュータ１８では、任意の態様にて、送信された信号から時系列の光強度データを生成して保存する。なお、典型的には、光検出器１６は、一光子の到来の有無を検出できる超高感度光検出器であるので、光の検出が、フォトンカウンティングによる場合、時系列光強度データは、時系列のフォトンカウントデータであってよい。
　光強度の計測中の光検出領域の位置の移動速度は、任意に、例えば、実験的に又は分析の目的に適合するよう設定された所定の速度であってよい。検出された単一粒子の数に基づいて、その数密度又は濃度に関する情報を取得する場合には、光検出領域の通過した領域の大きさ又は体積が必要となるので、移動距離が把握される態様にて光検出領域の位置の移動が実行される。なお、計測中の経過時間と光検出領域の位置の移動距離とが比例関係にある方が測定結果の解釈が容易となるので、移動速度は、基本的に、一定速度であることが好ましいが、これに限定されない。
　ところで、光検出領域の位置の移動速度に関して、計測された時系列の光強度データからの単一粒子の個別の検出、或いは、単一粒子の数のカウンティングを、定量的に精度よく実行するためには、かかる移動速度は、単一粒子のランダムな運動、即ち、ブラウン運動による移動速度よりも速い値に設定されることが好ましい。本発明の単一粒子検出技術の観測対象粒子は、溶液中に分散又は溶解されて自由にランダムに運動する粒子であるので、その位置がブラウン運動によって時間と伴に移動する。従って、光検出領域の位置の移動速度が粒子のブラウン運動による移動に比して遅い場合には、図４（Ａ）に模式的に描かれている如く、粒子が領域内をランダムに移動し、これにより、光強度がランダムに変化し（既に触れた如く、光検出領域の励起光強度は、領域の中心を頂点として外方に向かって低減する。）、個々の単一粒子に対応する有意な光強度の変化を特定することが困難となる。そこで、好適には、図４（Ｂ）に描かれている如く、粒子が光検出領域を略直線に横切り、これにより、時系列の光強度データに於いて、図４（Ｃ）の最上段に例示の如く、個々の単一粒子に対応する光強度の変化のプロファイルが略一様となり（単一粒子が略直線的に光検出領域を通過する場合には、光強度の変化のプロファイルは、励起光強度分布を反転したプロファイルと略同様となる。）、個々の粒子と光強度との対応が容易に特定できるように、光検出領域の位置の移動速度は、粒子のブラウン運動による平均の移動速度（拡散移動速度）よりも速く設定される。
　具体的には、拡散係数Ｄを有する粒子がブラウン運動によって半径Ｗｏの光検出領域（コンフォーカルボリューム）を通過するときに要する時間Δｔは、平均二乗変位の関係式
　　（２Ｗｏ）２＝６Ｄ・Δｔ　　　…（４）
から、
　　Δｔ＝（２Ｗｏ）２／６Ｄ　　　…（５）
となるので、粒子がブラウン運動により移動する速度（拡散移動速度）Ｖdifは、概ね、
　　Ｖdif＝２Ｗｏ／Δｔ＝３Ｄ／Ｗｏ　　　…（６）
となる。そこで、光検出領域の位置の移動速度は、かかるＶdifを参照して、それよりも十分に早い値に設定されてよい。例えば、観測対象粒子の拡散係数が、Ｄ＝２．０×１０－１０ｍ２／ｓ程度であると予想される場合には、Ｗｏが、０．６２μｍ程度だとすると、Ｖdifは、１．０×１０－３ｍ／ｓとなるので、光検出領域の位置の移動速度は、その１０倍以上の１５ｍｍ／ｓなどと設定されてよい。なお、観測対象粒子の拡散係数が未知の場合には、光検出領域の位置の移動速度を種々設定して光強度の変化のプロファイルが、予想されるプロファイル（典型的には、励起光強度分布と略同様）となる条件を見つけるための予備実験を繰り返し実行して、好適な光検出領域の位置の移動速度が決定されてよい。
（３）光強度の分析
　上記の処理により時系列光強度データが得られると、コンピュータ１８に於いて、記憶装置に記憶されたプログラムに従った処理により、単一粒子の信号の検出、単一粒子のカウンティング、濃度算出等の各種分析が実行される。
（ｉ）単一粒子信号の個別検出
　時系列の光強度データに於いて、一つの粒子の光検出領域を通過する際の軌跡が、図４（Ｂ）に示されている如く略直線状である場合、その粒子に対応する信号に於ける光強度の変化は、（光学系により決定される）光検出領域内の光強度分布を反映した下に凸の略釣鐘状のプロファイルを有する（図４（Ｃ）最上段参照）。従って、走査分子計数法では、基本的には、背景光から計った適宜設定される閾値を下回る光強度の低下が継続する時間幅が所定の範囲にあるとき、その光強度の低下のプロファイルを有する信号が一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの粒子の検出が為されるようになっていてよい。そして、閾値を下回る光強度の低下が継続する時間幅が所定の範囲にない信号は、ノイズ又は異物の信号として判定される。また、光検出領域の光強度分布が、背景光Ｉｂｇから下に凸のガウス分布：
　　Ｉ＝Ｉｂｇ－Ａ・ｅｘｐ（－２ｔ２／ａ２）　　　…（７）
であると仮定できるときには、有意な光強度の低下のプロファイル（背景光のゆらぎではないと明らかに判断できるプロファイル）に対して式（７）をフィッティングして算出された強度Ａ及び幅ａが所定の範囲内にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの粒子の検出が為されてよい。（強度Ａ及び幅ａが所定の範囲外にある信号は、ノイズ又は異物の信号として判定され、その後の分析等に於いて無視されてよい。）
　時系列光強度データからの単一粒子の一括的な検出を行う処理方法の一つの例としては、まず、時系列光強度データ（図４（Ｃ）、最上段「検出結果（未処理）」）に対して、スムージング（平滑化）処理が為される（図３－ステップ１１０、図４（Ｃ）中上段「スムージング」）。発光物質の発する光は確率的に放出されるものであり、また、その光強度は、比較的微弱であるので、細かい増減が生じるところ、かかる光強度の細かい増減（ゆらぎ）は、単一粒子の存在を表す信号の検出精度を悪化させる。スムージング処理は、かかるデータ上の細かい増減を無視できるようにすることとなる。スムージング処理は、例えば、移動平均法等により為されてよい。なお、スムージング処理を実行する際のパラメータ、例えば、移動平均法に於いて一度に平均するデータ点数や移動平均の回数など、は、光強度データ取得時の光検出領域の位置の移動速度（走査速度）、ＢＩＮ　ＴＩＭＥに応じて適宜設定されてよい。
　次いで、スムージング処理後の時系列光強度データに於いて、有意なパルス状の信号（以下、「パルス信号」と称する。）が存在する時間領域（パルス存在領域）を検出するために、スムージング処理後の時系列光強度データの時間についての一次微分値が演算される（ステップ１２０）。時系列光強度データの時間微分値は、図４（Ｃ）中下段「時間微分」に例示されている如く、信号値の変化時点に於ける値の変化が大きくなるので、かかる時間微分値を参照することによって、有意な信号の始点と終点を有利に決定することができる。
　しかる後、時系列光強度データ上に於いて、逐次的に、有意なパルス信号を検出し、検出された信号が単一粒子に対応する信号であるか否かが判定される。具体的には、まず、時系列光強度データの時系列の時間微分値データ上にて、逐次的に時間微分値を参照して、一つのパルス信号の始点と終点とが探索され決定され、パルス存在領域が特定される（ステップ１３０）。一つのパルス存在領域が特定されると、そのパルス存在領域に於けるスムージングされた時系列光強度データに対して、下に凸の釣鐘型関数のフィッティングが行われ（図４（Ｃ）下段「釣鐘型関数フィッティング」）、釣鐘型関数のパルスのピークの強度（背景光からの最大低下量）Ｉpeak、パルス幅（半値全幅）Ｗpeak、フィッティングに於ける（最小二乗法の）相関係数等のパラメータが算出される（ステップ１４０）。なお、フィッティングされる釣鐘型関数は、典型的には、ガウス関数であるが、ローレンツ型関数であってもよい。そして、算出された釣鐘型関数のパラメータが、一つの粒子が光検出領域を通過したときに検出されるパルス信号が描く釣鐘型のプロファイルのパラメータについて想定される範囲内にあるか否か、即ち、パルスのピーク強度、パルス幅、相関係数が、それぞれ、所定範囲内にあるか否か、例えば、
下記の条件:
　　　２０μ秒＜パルス幅＜４００μ秒
　　　ピーク強度＞４．０［ｐｃ／１０μｓ］　　　　…（Ａ）
　　　相関係数＞０．９５
を満たすか否か等が判定される（ステップ１５０）。かくして、算出された釣鐘型関数のパラメータが一つの粒子に対応する信号に於いて想定される範囲内にあると判定された信号は、一つの粒子に対応する信号であると判定される。一方、算出された釣鐘型関数のパラメータが想定される範囲内になかったパルス信号は、ノイズとして無視される。
　上記のステップ１３０～１５０の処理に於けるパルス信号の探索及び判定は、時系列光強度データの全域に渡って繰り返し実行されてよい（ステップ１６０）。なお、時系列光強度データから単一粒子の信号を個別に検出する処理は、上記の手順に限らず、任意の手法により実行されてよい。
（ii）粒子濃度の決定
　更に、検出された単一粒子の信号の数を計数して、粒子の数の決定が為されてもよい（粒子のカウンティング）。また、任意の手法にて、光検出領域の通過した領域の総体積が算定されれば、その体積値と粒子の数とから試料溶液中の粒子の数密度又は濃度が決定される（ステップ１７０）。
　光検出領域の通過した領域の総体積は、励起光又は検出光の波長、レンズの開口数、光学系の調整状態に基づいて理論的に算定されてもよいが、実験的に、例えば、粒子の濃度が既知の溶液（対照溶液）について、検査されるべき試料溶液の測定と同様の条件にて、上記に説明した光強度の測定、粒子の検出及びカウンティングを行うことにより検出された粒子の数と、対照溶液の粒子の濃度とから決定されるようになっていてよい。具体的には、例えば、粒子濃度Ｃの対照溶液について、対照溶液の単一粒子の検出数がＮであったとすると、光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔは、
　　　Ｖｔ＝Ｎ／Ｃ　　　…（８）
により与えられる。また、対照溶液として、単一粒子の複数の異なる濃度の溶液が準備され、それぞれについて測定が実行されて、算出されたＶｔの平均値が光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔとして採用されるようになっていてよい。そして、Ｖｔが与えられると、単一粒子のカウンティング結果がｎの試料溶液の粒子濃度ｃは、
　　　ｃ＝ｎ／Ｖｔ　　　…（９）
により与えられる。なお、光検出領域の体積、光検出領域の通過した領域の総体積は、上記の方法によらず、任意の方法にて、例えば、ＦＣＳ、ＦＩＤＡを利用するなどして与えられるようになっていてよい。また、本実施形態の装置に於いては、想定される光検出領域の移動パターンについて、種々の標準的な粒子についての濃度Ｃと粒子の数Ｎとの関係（式（６））の情報をコンピュータ１８の記憶装置に予め記憶しておき、装置の使用者が単一粒子検出を実施する際に適宜記憶された関係の情報を利用できるようになっていてよい。
　かくして、光検出領域により試料溶液中にて走査して粒子を個別に検出する反転型走査分子計数法に於いて、上記の処理手順により、試料溶液中の粒子のカウンティング、濃度の決定等が可能となる。
（４）一定の信号数を検出する単一粒子検出処理
　上記の単一粒子検出処理に於いては、或る設定した時間に亘って光測定を実行した後、得られた光強度データ上にて単一粒子の信号が検出される。その場合、試料溶液中の粒子濃度が未知であるとき、或る固定された測定時間に亘って光強度の測定を行う場合には、粒子の濃度が低い場合に備えて、測定時間は、十分に長く設定されることとなる。一方、試料溶液中の粒子の濃度が高い場合には、濃度等の特性を許容可能な又は満足する精度にて決定するのに必要な時間以上に光強度の測定が継続されることとなる。また、試料溶液中の粒子濃度が実験者の想定した濃度よりも低く、設定された測定時間が足りない場合には、結果の誤差が大きくなってしまう。そこで、単一粒子検出処理の別の態様として、光検出領域を移動しながらの光強度の測定と単一粒子の信号の検出とを信号の数が予め定められた数に達するまで繰り返し、信号の数が予め定められた数に達するのに要した時間が計測され、かかる単一粒子の信号の数が予め定められた数に達するのに要した時間に基づいて、粒子濃度が決定されてよい。かかる構成によれば、試料溶液中の粒子濃度が高い場合には、光強度の測定に要する時間は短縮され、試料溶液中の粒子濃度が低い場合には、結果（即ち、粒子濃度）に要求される精度を達成する粒子数が得られるまで光強度の測定を継続させることが可能となる。そして、単一粒子の信号の数が達するべき予め定められた数を結果に要求される精度を達成する粒子数に設定しておくことにより、単一粒子の信号の数が予め定められた数に達するのに要した時間には、結果に要求される精度を達成する粒子数が反映されることとなるので、その時間に基づいて決定される粒子の濃度値は、許容可能な又は満足する精度を有していることが期待される。
（ｉ）基本原理
　粒子の濃度値と、信号数が予め定められた数に達するのに要した時間とは、以下の如く、関係づけられる。即ち、或る粒子濃度Ｃの試料溶液中に於いて、時間τに亘って、光検出領域を走査速度ｕにて移動させた場合、光検出領域の断面積をＳとすると、検出される粒子信号の数Ｘは、
　　Ｘ＝ＣＳｕτＮＡ　　　…（１０）
となる。ここで、ＮＡは、アボガドロ数である。従って、信号数が予め定められた数ＸＥに達するのに時間Ｔを要したとすると、粒子濃度Ｃは、
　　Ｃ＝ＸＥ／（ＳＴｕＮＡ）　　　…（１１）
により、時間Ｔの関数として与えられる。なお、式（１１）に於いて、単位時間当たりの粒子の検出速度Ｖは、信号数が予め定められた数ＸＥに達するのに要した時間Ｔと粒子検出数ＸＥとに基づいて
　　Ｖ＝ＸＥ／Ｔ　　　…（１２）
により与えられるので、粒子濃度Ｃは、
　　Ｃ＝Ｖ／（ＳｕＮＡ）…（１３）
と表される。この式（１３）に於いては、粒子濃度Ｃが、検出速度Ｖに一次に比例し、粒子濃度Ｃと検出速度Ｖとの対応関係がわかり易いので、実際の実験に於いては、粒子濃度Ｃは、検出速度Ｖを用いて決定されてもよい。
（ii）処理操作手順
　一定の信号数を検出する単一粒子検出処理は、例えば、図５のフローチャートに示した処理手順により実行されてよい。同図の例に於いては、端的に述べれば、光検出領域の位置の移動、光検出領域からの光の検出、単一粒子の信号の検出及び検出された粒子信号の計数の一連の処理が、解析時間間隔ｔ（所定の時間間隔）毎に、検出された粒子数Ｘが終了粒子数ＸＥ（単一粒子数が到達すべき予め定められた数）に到達するまで反復して実行される。なお、以下に述べる一連の処理及び構成は、コンピュータ１８の処理作動により実現されることは理解されるべきである。
（ａ）初期設定
　図５を参照して、操作処理に於いて、具体的には、まず、マイクロプレート９のウェル１０に試料溶液を注入して顕微鏡のステージ上に載置した後、使用者がコンピュータ１８に対して、光強度の測定と粒子の検出・計数の処理の開始の指示を入力すると、コンピュータ１８は、初期設定として、終了粒子数ＸＥの設定（ステップ１０）及び解析時間間隔ｔの設定（ステップ２０）を行う。終了粒子数ＸＥと解析時間間隔ｔとは、使用者により任意に設定されてよい。終了粒子数ＸＥは、粒子濃度の結果値に要求される精度を達成できるように粒子濃度が既知の溶液を用いた予備実験による結果を参考にして適宜決定可能である。解析時間間隔ｔとしては、処理の開始後から粒子数（Ｘ）が終了粒子数（ＸＥ）に到達するまでの時間よりも十分に短い任意の時間間隔が、装置１に於ける処理速度等を考慮して適宜設定されてよい。また、終了粒子数ＸＥと解析時間間隔ｔとは、それぞれ、粒子濃度が既知の溶液を用いた予備実験による結果を参考にして予め決定された値が、装置１に於いて記憶され、かかる記憶された値が自動的に又は使用者の選択により使用されるようになっていてもよい。
（ｂ）粒子数の検出
　上記の如く終了粒子数ＸＥと解析時間間隔ｔの設定が為されると、以下の如く、解析時間間隔ｔ毎に、解析時間間隔ｔに亘る走査分子計数法による光強度の測定処理及び測定された光強度データからの粒子信号の検出並びに粒子数ｘの検出（ステップ３０）と、ステップ３０にて検出された粒子数ｘを累積して粒子の総数Ｘ（ｔｎ）を算定する処理（ステップ４０）とが粒子の総数Ｘ（ｔｎ）が終了粒子数ＸＥに到達するまで（ステップ５０）、反復して実行される。なお、ステップ３０～５０の処理の反復実行に先だって、一連の処理の開始時間Ｔｓが記憶されてよい（ステップ２５）。
　ステップ３０に於ける光検出・粒子数検出の処理は、図３に示した処理と同様であってよい。端的に述べれば、試料溶液内での光検出領域の位置の移動（試料溶液内の走査）を行いながら、光強度の測定が解析時間間隔ｔに亘って為され、しかる後、得られた解析時間間隔ｔに於ける時系列光強度データに於いて、コンピュータ１８に於いて、記憶装置に記憶されたプログラムに従った処理により、単一粒子の存在を表す信号の検出及び検出数のカウンティングが実行される。
　かくして、解析時間間隔ｔに亘る時系列光強度データに於ける粒子数ｘが検出されると、単一粒子の検出総数Ｘ（ｔｎ）が
　　Ｘ（ｔｎ）＝Ｘ（ｔｎ－１）＋ｘ　　　…（１４）
により算出される（図５－ステップ４０）。なお、Ｘ（ｔｎ－１）は、前回の解析時間間隔ｔまでに検出された粒子の検出総数であり、その初期値は０である。そして、ステップ３０～４０は、単一粒子の検出総数Ｘ（ｔｎ）が終了粒子数ＸＥに到達するまで、即ち、
　　Ｘ（ｔｎ）≧ＸＥ　　　…（１５）
が成立するまで（ステップ５０）、解析時間間隔ｔ毎に繰り返される。そして、ステップ３０～５０を反復しているうちに、式（１５）が成立すると、試料溶液の光強度の測定と粒子の検出・計数との処理が終了する。ステップ３０～５０の反復処理が終了すると、終了時間ＴＥが記憶されてよい（ステップ６０）。
（ｃ）粒子数と測定終了時間の表示
　ところで、解析時間間隔ｔ毎にステップ３０～５０の反復実行期間に於いて（式（１５）が成立するまで）、コンピュータ１８のモニター上などの表示器に、粒子の検出総数Ｘ（ｔｎ）及び／又は測定終了時間ＴＥ若しくは測定残り時間Ｔｒが表示されるようになっていてよい。かかる構成によれば、使用者は、それらの表示を見ることによって、実行中の測定がいつ頃終了するのかを予測することができる点で有利である。
　上記の如き表示を実行する場合には、図５のステップ５０の判定に於いて、式（１５）が成立しなかった場合に、図中、点線にて示された各処理が実行される。具体的には、まず、ステップ４０に於いて算定された最新の粒子の検出総数Ｘ（ｔｎ）が表示器上に表示される（ステップ５２）。なお、既にステップ３０～５０の反復実行が為されている場合には、それまでの粒子の検出総数Ｘ（ｔｎ）の値が更新される。次いで、測定終了時間ＴＥ若しくは測定残り時間Ｔｒを算出するために、ステップ３０～５０の処理の開始後からの粒子の検出速度ｖが算出される（ステップ５４）。現在までの粒子の検出速度ｖは、
　　ｖ＝Ｘ（ｔｎ）／（Ｔｐ－Ｔｓ）　　　…（１６）
により与えられてよい。ここで、Ｔｐは、現在の時刻である。かくして、粒子の検出速度ｖを用いて、測定残り時間Ｔｒ（ステップ３０～５０の処理終了までの時間）が、
　　Ｔｒ＝（ＸＥ－Ｘ（ｔｎ））／ｖ　　　…（１７）
により推定され、また、測定終了時間ＴＥ（ステップ３０～５０の処理が終了する時間）が、
　　ＴＥ＝Ｔｐ＋Ｔｒ　　　…（１８）
により推定される（ステップ５６）。そして、推定された測定終了時間ＴＥ若しくは測定残り時間Ｔｒが表示器上に表示される（ステップ５８）。なお、既にステップ３０～５０の反復実行が為されている場合には、既に表示されている値が更新される。また、Ｘ（ｔｎ）＝０のときは、式（１７）又は（１８）は、演算されずに、Ｔｒ及びＴＥは、不明であると表示されてよい。
　上記の図５のステップ３０～５０の処理は、既に述べた如く、解析時間間隔ｔ毎に繰り返される。この点に関し、図３のステップ１００の光強度の測定は、測定の開始から終了まで、ステップ１００以外の信号処理ステップの実行中も連続的に実行されてよい。即ち、光検出・粒子数検出の処理に於いては、一つのサイクルの解析時間間隔ｔに亘る光強度の測定が完了されると、次のサイクルの解析時間間隔ｔに亘る光強度の測定がそのまま連続して実行されると同時に、コンピュータ１８に於いて、完了したサイクルの解析時間間隔ｔに亘って取得された光強度データからの粒子の信号の検出・計数の処理が実行されることとなる。これにより、リアルタイムに粒子の検出・計数が達成されることとなる。
（ｄ）濃度算出等の分析
　かくして、粒子数が終了粒子数に到達すると、粒子数が終了粒子数に到達するまでの時間Ｔ（＝ＴＥ－Ｔｓ）或いは検出された粒子の信号から得られるその他の情報を用いて、濃度算出等の分析が実行されてよい（ステップ７０）。粒子濃度は、既に述べた如く、式（１２）を用いて、終了粒子数に到達するまでの時間Ｔと終了粒子数ＸＥとから、粒子の検出速度Ｖを算出し、粒子の検出速度Ｖから、式（１３）の関係を用いて決定される。
　なお、式（１０）～（１３）中の光検出領域の通過領域の断面積Ｓは、励起光又は検出光の波長、レンズの開口数、光学系の調整状態に基づいて理論的に算定されてもよいが、実験的に、例えば、粒子濃度が既知の溶液（対照溶液）について、検査されるべき試料溶液の測定と同様の条件にて、上記に説明した光強度の測定、粒子の検出・計数を行うことにより検出された粒子の数と、対照溶液の単一粒子の濃度とから決定されるようになっていてよい。具体的には、例えば、粒子の濃度Ｃの対照溶液について、移動速度ｕｏにて或る時間τｏに亘って実行された光強度の測定に於ける粒子の検出数がＮであったとすると、光検出領域の通過領域の断面積Ｓは、
　　　Ｓ＝Ｎ／（Ｃ・ＮＡ・ｕｏ・τｏ）　　　…（１９）
により与えられる。また、対照溶液として、粒子の複数の異なる濃度の溶液が準備され、それぞれについて測定が実行されて、算出されたＳの平均値が光検出領域の断面積Ｓとして採用されるようになっていてよい。
（ｅ）試料溶液の光強度の測定と粒子の検出・計数の処理の修正例
　上記の試料溶液の光強度の測定と単一粒子の検出・計数の処理に於いて、別の態様として、解析時間間隔ｔは、固定値ではなく、単一粒子の検出状況に応じて修正されるようになっていてもよい。図６（Ａ）は、解析時間間隔ｔを粒子の検出状況に応じて修正する処理（ステップ２０’）を含むよう構成された試料溶液の光強度の測定と粒子の検出・計数の処理をフローチャートの形式で表したものであり、図６（Ｂ）は、ステップ２０’に於ける解析時間間隔ｔの演算処理をフローチャートの形式で表したものである。なお、図６（Ａ）に於いて、図５と同一の処理には、同一のステップ番号が付されている。
　同図を参照して、図６の処理では、解析時間間隔ｔに亘る光強度の測定が完了する毎に解析時間間隔ｔが修正される（ステップ２０’）。また、図示の例の処理は、特に、開始から粒子数が終了粒子数ＸＥに到達するまでの一回の測定に於いて、予め定められた回数Ｎ（以下、「更新予定回数」と称する。）だけ、光強度の測定と粒子の検出・計数の処理サイクルが実行されるよう構成される。具体的には、まず、初期設定として、終了粒子数ＸＥの設定（ステップ１０）及び開始時間Ｔｓの記憶（ステップ２５）の後、最初に光強度の測定と粒子の検出・計数の処理を実行する際、即ち、光強度の測定と粒子の検出・計数の処理サイクルの実行回数ｋが０のとき、解析時間間隔ｔに、任意に設定されてよい初期値ｔｏが与えられる（図６（Ｂ）ステップ２００、２１０参照）。そして、処理サイクルの実行回数ｋが１増大され（ステップ２７０）、図５に記載の処理と同様に解析時間間隔ｔに亘る光強度の測定及び粒子の検出・計数の処理が実行される（ステップ３０～５０）。かくして、最初のサイクルの粒子数ｘ（＝Ｘ（ｔ１））が得られると、粒子検出速度ｖ（ステップ５４）、測定残り時間Ｔｒ（ステップ５６）が順に算定される。なお、図５の場合と同様に、コンピュータ１８のモニター上などの表示器に、粒子の検出総数Ｘ（ｔｎ）及び／又は測定終了時間ＴＥ若しくは測定残り時間Ｔｒが表示されるようになっていてよい（ステップ５２、５８）。また、最初の処理サイクルで粒子数が終了粒子数ＸＥに到達していたときには、そのまま、光強度の測定と粒子の検出・計数の処理が終了する（ステップ５０）。
　最初の処理サイクルの後、解析時間間隔ｔの修正と、図５の場合と同様の光強度の測定と粒子の検出・計数の処理サイクル（ステップ２０’、３０～５８）が、粒子数が終了粒子数ＸＥに到達するまで反復される。その際、解析時間間隔ｔの修正を行うステップ２０’に於いては、まず、そのときまでに検出されている粒子数Ｘ（ｔｎ）が０であるか否かが判定される（ステップ２２０）。Ｘ（ｔｎ）＝０のときは、直前のサイクルに於ける解析時間間隔ｔがｍ倍されてよい（ｍは、１以上の正数）。Ｘ（ｔｎ）＞０であるときには、測定残り時間Ｔｒと更新予定回数Ｎと処理サイクルの実行回数ｋとを用いて、解析時間間隔ｔが、
　　ｔ＝Ｔｒ／（Ｎ－ｋ）　　　…（２０）
により算定される（ステップ２４０）。なお、算定される解析時間間隔ｔには、下限が設定されていてよく、解析時間間隔ｔが下限値ｔｍｉｎを下回るときには、解析時間間隔ｔは、下限値ｔｍｉｎに設定されてよい（ステップ２５０、２６０）。上記の如く、解析時間間隔ｔが修正される態様によれば、測定残り時間Ｔｒには、観測対象となっている試料溶液中の粒子の検出状況が反映されているので、解析時間間隔ｔがかかる粒子の検出状況に応じて最適化されることとなる。
　上記に説明した本発明の有効性を検証するために、以下の如き実験を行った。なお、以下の実施例は、本発明の有効性を例示するものであって、本発明の範囲を限定するものではないことは理解されるべきである。
　反転型走査分子計数法による光測定により得られた時系列光強度データに於いて、単一粒子の存在を表す信号が検出可能であること及び粒子濃度が検出可能であることを検証した。
　試料溶液は、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）の溶液中に、背景光を生成するための発光物質として、蛍光色素ＡＴＴＯ４８８（ＡＴＴＯ－ＴＥＣ）を、濃度が１２．５μＭ又は１５ｎＭとなるように溶解し、更に、観測対象となる単一粒子として、１μｍ径の磁性ビーズ（Dynabeads（登録商標）MyOne　Streptavidin　C1　:invitorgen）を、種々の濃度にて分散することにより調製した（ここで採用した磁性ビーズは、実質的に発光しない粒子である。）。光の測定に於いては、共焦点蛍光顕微鏡の光学系とフォトンカウンティングシステムを備えた１分子蛍光測定装置ＭＦ２０（オリンパス株式会社）を用い、上記の「（２）試料溶液の光強度の測定」にて説明した態様に従って、上記の蛍光色素と磁性ビーズとを含む試料溶液のそれぞれについて、時系列光強度データ（フォトンカウントデータ）を取得した。また、コンフォーカル・ボリューム（光検出領域）の直径は、１μｍに調整し、試料溶液中に於ける光検出領域の位置の移動速度は、１５ｍｍ／秒とし、ＢＩＮ　ＴＩＭＥを１０μ秒として１００秒間の測定を行った。
　上記の光計測の後のデータ処理では、時系列フォトンカウントデータに於いて、単一粒子の信号の個別検出と信号数のカウンティングを行った。単一粒子の信号の検出は、「（ｉ）単一粒子信号の個別検出」及び図３のステップ１１０～１６０に記載された要領に従って、時系列フォトンカウントデータにスムージング処理を施し、スムージングされたデータに於いて、パルス信号の始点及び終点を決定した後、各パルス信号に下に凸のガウス関数（式（７））を最小自乗法によりフィッティングして、（ガウス関数に於ける）ピーク強度（光強度の低下量）、パルス幅（半値全幅）、相関係数を決定した。そして、下記の条件:
　　　２０μ秒＜パルス幅＜４００μ秒
　　　ピーク強度＞４［ｐｃ／１０μｓ］　　　　…（Ａ）
　　　相関係数＞０．９５
を満たすパルス信号のみを単一粒子の信号として抽出し、その信号数を計数した。
　図７（Ａ）は、磁性ビーズが約５ｐＭ（５ｍｇ／ｍｌ）にて分散された蛍光色素濃度１２．５μＭの溶液を試料溶液とし、１０μＷの４８８ｎｍのレーザー光を励起光として用いて得られた時系列フォトンカウントデータ（Raw）の一部を示している。なお、検出光は、透過波長が６５０～６９０ｎｍのバンドパスフィルターと透過波長が６６０～７１０ｎｍのバンドパスフィルターとを用いて検出した。また、同図に於いて、平滑化後のデータ（Smoothing）、フィッティング曲線（Fit）も示されている。また、図７（Ｂ）は、図７（Ａ）の記載の時系列フォトンカウントデータの拡大図である。同図、特に、図７（Ｂ）を参照して明らかな如く、時系列フォトンカウントデータに於いて下に凸の釣鐘型関数にフィッティングができる光強度の低下が観察された。ビーズの信号の強度の背景光強度に対する割合は、最も大きいもので－６１％、最も小さいもので－１６％であった。（ビーズの信号の強度の背景光強度に対する割合は、パルス信号の前後２００μ秒間に於ける蛍光強度とバックグラウンドとの差分を積分して得られたパルス信号の積分強度を、高さが背景光強度の平均値であり且つ半値全幅が１００μ秒であるガウス関数の積分値で割ったものとした。これらのピーク最小値の下限はピーク検出アルゴリズムの精度やバックグラウンドの安定性に依存して決まるが、ピークの最大値の上限は存在しない。）
　図７（Ｃ）は、蛍光色素濃度１５ｎＭの溶液中に磁性ビーズが、０ｆＭ、１０ｆＭ、２０ｆＭ及び５０ｆＭにてそれぞれ分散された試料溶液について、５０μＷの４８８ｎｍのレーザー光を励起光として用いて得られた時系列フォトンカウントデータから得られた信号数を、磁性ビーズ濃度に対してプロットした図である。なお、検出光は、透過波長が５１０～５６０ｎｍのバンドパスフィルターを用いて検出した。また、光測定に於いては、光路の変更による光検出領域の移動（１５ｍｍ／秒）に加えて、試料容器が直径１ｍｍの円形軌道に沿って１ｍｍ／秒にて移動された。更に、ガウス関数にて近似できたパルス状の信号のうち、Ｓ／Ｎ比が０．３５以上のものを粒子信号として計数した。図７（Ｃ）から理解される如く、磁性ビーズ濃度が１０ｆＭ以上の場合について、検出信号数と濃度とが概ね比例した。
　以上の結果から、図７（Ｂ）に観察されている時系列フォトンカウントデータに於いて下に凸の釣鐘型関数にフィッティングができる光強度の低下が単一粒子（磁性ビーズ）の存在を表す信号であり、かかる光強度の低下を計数することにより、試料溶液中の粒子濃度を決定できることが示された。
　かくして、上記の実施例の結果から理解される如く、本発明の教示に従った反転型走査分子計数法によれば、試料溶液中に分散された発光しない単一粒子の検出及びその濃度に関する情報の取得が可能となる。特に、本発明は、単一粒子の信号を個別に検出するので、試料溶液中の粒子濃度が、ＦＣＳ等の光分析技術で要求される濃度域よりも低くても、粒子の検出が可能であり、かかる特徴は、医学・生物学の研究開発の分野でしばしば使用される希少な或いは高価な試料についての分析を行う場合に有利であろう。また、本発明の場合、観測対象粒子が発光粒子ではなく、従って、発光標識の付与が必要ないので、発光標識の付与によるアーティファクトが回避される。

Claims (36)

  1. 　共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する単一粒子を検出する単一粒子検出装置であって、
    　前記試料溶液内に於ける前記光学系の光検出領域の位置を移動する光検出領域移動部と、
    　前記光検出領域からの光を検出する光検出部と、
    　前記試料溶液内に於いて前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出部にて検出された前記光検出領域からの光の時系列の光強度データを生成し、前記時系列の光強度データに於いて前記単一粒子の各々の存在を表す信号を個別に検出する信号処理部とを含み、
    　前記光検出領域からの光が実質的に一定の背景光を含み、前記単一粒子の各々の存在を表す信号が前記単一粒子が前記光検出領域内へ進入した際に生ずる前記光検出部にて検出される光強度の低下であることを特徴とする装置。
  2. 　請求項１の装置であって、前記背景光が、前記試料溶液内に分散された物質による蛍光、りん光、化学発光、生物発光、散乱光又は照明光であることを特徴とする装置。
  3. 　請求項１の装置であって、前記単一粒子の検出光波長帯域に於ける発光強度が背景光より低いことを特徴とする装置。
  4. 　請求項１乃至３のいずれかの装置であって、前記単一粒子の外径が前記光検出領域の直径の１５％以上であることを特徴とする装置。
  5. 　請求項４の装置であって、前記単一粒子の外径が前記光検出領域の直径の３５％以上であることを特徴とする装置。
  6. 　請求項１乃至５のいずれかの装置であって、前記光検出領域移動部が前記単一粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて前記光検出領域の位置を移動することを特徴とする装置。
  7. 　請求項１乃至６のいずれかの装置であって、前記光検出領域移動部が前記光学系の光路を変更することにより前記試料溶液内に於ける前記光検出領域の位置を移動することを特徴とする装置。
  8. 　請求項１乃至７のいずれかの装置であって、前記信号処理部が、前記背景光の強度から計って所定の閾値より低い光強度を有する信号が検出されたときに１つの単一粒子が前記光検出領域に入ったと判定することを特徴とする装置。
  9. 　請求項１乃至８のいずれかの装置であって、前記信号処理部が前記時系列光強度データを平滑化し、前記平滑化された時系列光強度データに於いて前記背景光の強度から計って所定閾値を下回る強度を有する下に凸の釣鐘型のパルス状信号を前記単一粒子の存在を表す信号として検出することを特徴とする装置。
  10. 　請求項１乃至９のいずれかの装置であって、前記信号処理部が、前記個別に検出された単一粒子の存在を表す信号の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記単一粒子の数を計数することを特徴とする装置。
  11. 　請求項１乃至１０のいずれかの装置であって、前記信号処理部が前記検出された単一粒子の数に基づいて、前記試料溶液中の単一粒子の数密度又は濃度を決定することを特徴とする装置。
  12. 　請求項１乃至１０のいずれかの装置であって、前記信号処理部が検出した前記単一粒子の存在を表す信号の数が予め定められた数に達するまで、前記光検出領域移動部による前記光学系の光検出領域の位置の移動と、前記光検出部による前記光検出領域からの光の検出と、前記信号処理部による前記単一粒子の存在を表す信号の検出とを繰り返し、前記単一粒子の信号の存在を表す数が予め定められた数に達するのに要した時間に基づいて前記試料溶液中の前記単一粒子の濃度を決定することを特徴とする装置。
  13. 　共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する単一粒子を検出する単一粒子検出方法であって、
    　前記試料溶液内に於ける前記光学系の光検出領域の位置を移動する過程と、
    　前記試料溶液内に於ける前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出領域から実質的に一定の背景光を含む光を検出して時系列の光強度データを生成する過程と、
    　前記時系列光強度データに於いて前記単一粒子が前記光検出領域内へ進入した際に生ずる光強度の低下を前記単一粒子の各々の存在を表す信号として個別に検出する過程と
    を含むことを特徴とする方法。
  14. 　請求項１３の方法であって、前記背景光が、前記試料溶液内に分散された物質による蛍光、りん光、化学発光、生物発光、散乱光又は照明光であることを特徴とする方法。
  15. 　請求項１３の方法であって、前記単一粒子の検出光波長帯域に於ける発光強度が背景光より低いことを特徴とする方法。
  16. 　請求項１３乃至１５のいずれかの方法であって、前記単一粒子の外径が前記光検出領域の直径の１５％以上であることを特徴とする方法。
  17. 　請求項１６の方法であって、前記単一粒子の外径が前記光検出領域の直径の３５％以上であることを特徴とする方法。
  18. 　請求項１３乃至１７のいずれかの方法であって、前記光検出領域の位置を移動する過程に於いて、前記光検出領域の位置が前記単一粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動されることを特徴とする方法。
  19. 　請求項１３乃至１８のいずれかの方法であって、前記光検出領域の位置を移動する過程に於いて、前記光学系の光路を変更することにより前記試料溶液内に於ける前記光検出領域の位置を移動することを特徴とする方法。
  20. 　請求項１３乃至１９のいずれかの方法であって、前記単一粒子の存在を表す信号を個別に検出する過程に於いて、前記背景光の強度から計って所定の閾値より低い光強度を有する信号が検出されたときに１つの単一粒子が前記光検出領域に入ったと判定することを特徴とする方法。
  21. 　請求項１３乃至２０のいずれかの方法であって、前記単一粒子の存在を表す信号を個別に検出する過程に於いて、前記時系列光強度データが平滑化され、前記平滑化された時系列光強度データに於いて前記背景光の強度から計って所定閾値を下回る強度を有する下に凸の釣鐘型のパルス状信号を前記単一粒子の存在を表す信号として検出することを特徴とする方法。
  22. 　請求項１３乃至２１のいずれかの方法であって、更に、前記個別に検出された単一粒子の存在を表す信号の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記単一粒子の数を計数する過程を含むことを特徴とする方法。
  23. 　請求項１３乃至２２のいずれかの方法であって、更に、前記検出された単一粒子の数に基づいて、前記試料溶液中の単一粒子の数密度又は濃度を決定する過程を含むことを特徴とする方法。
  24. 　請求項１３乃至２２のいずれかの方法であって、前記単一粒子の存在を表す信号の数が予め定められた数に達するまで、前記光検出領域の位置の移動と、前記光検出領域からの光の検出と、前記単一粒子の存在を表す信号の検出とを繰り返し、前記単一粒子の信号の存在を表す数が予め定められた数に達するのに要した時間に基づいて前記試料溶液中の前記単一粒子の濃度を決定することを特徴とする方法。
  25. 　共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する単一粒子を検出する単一粒子検出用コンピュータプログラムであって、
    　前記試料溶液内に於ける前記光学系の光検出領域の位置を移動する手順と、
    　前記試料溶液内に於ける前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出領域から実質的に一定の背景光を含む光を検出して時系列の光強度データを生成する手順と、
    　前記時系列光強度データに於いて前記単一粒子が前記光検出領域内へ進入した際に生ずる光強度の低下を前記単一粒子の各々の存在を表す信号として個別に検出する手順と
    をコンピュータに実行させることを特徴とするコンピュータプログラム。
  26. 　請求項２５のコンピュータプログラムであって、前記背景光が、前記試料溶液内に分散された物質による蛍光、りん光、化学発光、生物発光、散乱光又は照明光であることを特徴とするコンピュータプログラム。
  27. 　請求項２６のコンピュータプログラムであって、前記単一粒子の検出光波長帯域に於ける発光強度が背景光より低いことを特徴とするコンピュータプログラム。
  28. 　請求項２５乃至２７のいずれかのコンピュータプログラムであって、前記単一粒子の外径が前記光検出領域の直径の１５％以上であることを特徴とするコンピュータプログラム。
  29. 　請求項２８のコンピュータプログラムであって、前記単一粒子の外径が前記光検出領域の直径の３５％以上であることを特徴とするコンピュータプログラム。
  30. 　請求項２５乃至２９のいずれかのコンピュータプログラムであって、前記光検出領域の位置を移動する手順に於いて、前記光検出領域の位置が前記単一粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動されることを特徴とするコンピュータプログラム。
  31. 　請求項２５乃至３０のいずれかのコンピュータプログラムであって、前記光検出領域の位置を移動する手順に於いて、前記光学系の光路を変更することにより前記試料溶液内に於ける前記光検出領域の位置を移動することを特徴とするコンピュータプログラム。
  32. 　請求項２５乃至３１のいずれかのコンピュータプログラムであって、前記単一粒子の存在を表す信号を個別に検出する手順に於いて、前記背景光の強度から計って所定の閾値より低い光強度を有する信号が検出されたときに１つの単一粒子が前記光検出領域に入ったと判定することを特徴とするコンピュータプログラム。
  33. 　請求項２５乃至３２のいずれかのコンピュータプログラムであって、前記単一粒子の存在を表す信号を個別に検出する手順に於いて、前記時系列光強度データが平滑化され、前記平滑化された時系列光強度データに於いて前記背景光の強度から計って所定閾値を下回る強度を有する下に凸の釣鐘型のパルス状信号を前記単一粒子の存在を表す信号として検出することを特徴とするコンピュータプログラム。
  34. 　請求項２５乃至３３のいずれかのコンピュータプログラムであって、更に、前記個別に検出された単一粒子の存在を表す信号の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記単一粒子の数を計数する手順を含むことを特徴とするコンピュータプログラム。
  35. 　請求項２５乃至３４のいずれかのコンピュータプログラムであって、更に、前記検出された単一粒子の数に基づいて、前記試料溶液中の単一粒子の数密度又は濃度を決定する手順を含むことを特徴とするコンピュータプログラム。
  36. 　請求項２５乃至３４のいずれかのコンピュータプログラムであって、前記単一粒子の存在を表す信号の数が予め定められた数に達するまで、前記光検出領域の位置の移動と、前記光検出領域からの光の検出と、前記単一粒子の存在を表す信号の検出とを繰り返し、前記単一粒子の信号の存在を表す数が予め定められた数に達するのに要した時間に基づいて前記試料溶液中の前記単一粒子の濃度を決定することを特徴とするコンピュータプログラム。
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