JP5904996B2 - 単一発光粒子検出を用いた光分析装置、光分析方法並びに光分析用コンピュータプログラム - Google Patents

Description

本発明は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いて、溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はこれらの凝集体（以下、これらを「粒子」と称する。）、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の対象物、或いは、非生物学的な粒子からの光を検出して、それらの状態（相互作用、結合・解離状態など）の分析又は解析に於いて有用な情報を取得することが可能な光分析技術に係り、より詳細には、上記の如き光学系を用いて単一の発光する粒子からの光を個別に検出して種々の光分析を可能にする光分析装置、光分析方法並びに光分析用コンピュータプログラムに係る。なお、本明細書に於いて、光を発する粒子（以下、「発光粒子」と称する。）は、それ自身が光を発する粒子、又は、任意の発光標識若しくは発光プローブが付加された粒子のいずれであってもよく、発光粒子から発せられる光は、蛍光、りん光、化学発光、生物発光、散乱光等であってよい。

近年の光計測技術の発展により、共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング（１光子検出）も可能な超高感度の光検出技術とを用いて、一光子又は蛍光一分子レベルの微弱光の検出・測定が可能となっている。そこで、そのような微弱光の計測技術を用いて、生体分子等の特性、分子間相互作用又は結合・解離反応の検出を行う装置又は方法が種々提案されている。例えば、蛍光相関分光分析（Fluorescence Correlation Spectroscopy：ＦＣＳ。例えば、特許文献１−３、非特許文献１−３参照）に於いては、レーザー共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術を用いて、試料溶液中の微小領域（顕微鏡のレーザー光が集光された焦点領域−コンフォーカル・ボリュームと称される。）内に出入りする蛍光分子又は蛍光標識された分子（蛍光分子等）からの蛍光強度の測定が為され、その測定された蛍光強度の自己相関関数の値から決定される微小領域内に於ける蛍光分子等の平均の滞留時間（並進拡散時間）及び滞留する分子の数の平均値に基づいて、蛍光分子等の運動の速さ又は大きさ、濃度といった情報の取得、或いは、分子の構造又は大きさの変化や分子の結合・解離反応又は分散・凝集といった種々の現象の検出が為される。また、蛍光強度分布分析(Fluorescence-Intensity Distribution Analysis：ＦＩＤＡ。例えば、特許文献４、非特許文献４)やフォトンカウンティングヒストグラム（Photon Counting Histogram：ＰＣＨ。例えば、特許文献５）では、ＦＣＳと同様に計測されるコンフォーカル・ボリューム内に出入りする蛍光分子等の蛍光強度のヒストグラムが生成され、そのヒストグラムの分布に対して統計的なモデル式をフィッティングすることにより、蛍光分子等の固有の明るさの平均値とコンフォーカル・ボリューム内に滞留する分子の数の平均値が算定され、これらの情報に基づいて、分子の構造又は大きさの変化、結合・解離状態、分散・凝集状態などが推定されることとなる。またその他に、特許文献６、７に於いては、共焦点顕微鏡の光学系を用いて計測される試料溶液の蛍光信号の時間経過に基づいて蛍光性物質を検出する方法が提案されている。特許文献８は、フローサイトメータに於いて流通させられた蛍光微粒子又は基板上に固定された蛍光微粒子からの微弱光をフォトンカウンティング技術を用いて計測してフロー中又は基板上の蛍光微粒子の存在を検出するための信号演算処理技術を提案している。

特に、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術とを用いた微小領域の蛍光測定技術を用いた方法によれば、測定に必要な試料は、従前に比して極めて低濃度且微量でよく（一回の測定で使用される量は、たかだか数十μＬ程度）、測定時間も大幅に短縮される（一回の測定で秒オーダーの時間の計測が数回繰り返される。）。従って、これらの技術は、特に、医学・生物学の研究開発の分野でしばしば使用される希少な或いは高価な試料についての分析を行う場合や、病気の臨床診断や生理活性物質のスクリーニングなど、検体数が多い場合に、従前の生化学的方法に比して、低廉に、或いは、迅速に実験又は検査が実行できる強力なツールとなることが期待されている。

特開２００５−０９８８７６ 特開２００８−２９２３７１ 特開２００９−２８１８３１ 特許第４０２３５２３号 国際公開２００８−０８０４１７ 特開２００７−２０５６５ 特開２００８−１１６４４０ 特開平４−３３７４４６号公報

金城政孝、蛋白質 核酸 酵素 Vol.４４、No.９、１４３１−１４３８頁 １９９９年 エフ・ジェイ・メイヤー・アルムス（F.J.Meyer-Alms）、フルオレセンス・コリレーション・スペクトロスコピー（Fluorescence Correlation Spectroscopy）、アール・リグラー編（R.Rigler）、スプリンガー（Springer）、ベルリン、２０００年、２０４−２２４頁 加藤則子外４名、遺伝子医学、Vol.６、No.２、２７１−２７７頁 カスク他３名、米国科学アカデミー紀要 １９９９年、９６巻、13756‐13761頁（P. Kask, K. Palo, D. Ullmann, K. Gall PNAS 96, 13756-13761 (1999)）

上記のＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術を用いた光分析技術では、計測される光は、蛍光一分子又は数分子から発せられた光であるが、その光の解析に於いて、時系列に測定された蛍光強度データの自己相関関数の演算又はヒストグラムに対するフィッティングといった蛍光強度のゆらぎの算出等の統計的処理が実行され、個々の蛍光分子等からの光の信号を個別に参照又は分析するわけではない。即ち、これらの光分析技術に於いては、複数の蛍光分子等からの光の信号が統計的に処理され、蛍光分子等について統計平均的な特性が検出されることとなる。従って、これらの光分析技術に於いて統計的に有意な結果を得るためには、試料溶液中の観測対象となる蛍光分子等の濃度又は数密度は、平衡状態に於いて、一回の秒オーダーの長さの計測時間のうちに統計的処理が可能な数の蛍光分子等が微小領域内を入出するレベル、好適には、微小領域内に常に一個程度の蛍光分子等が存在しているレベルである必要がある。実際、コンフォーカル・ボリュームの体積は、１ｆＬ程度となるので、上記の光分析技術に於いて使用される試料溶液中の蛍光分子等の濃度は、典型的には、１ｎＭ程度若しくはそれ以上であり、１ｎＭを大幅に下回るときには、蛍光分子等がコンフォーカル・ボリューム内に存在しない時間が生じて統計的に有意な分析結果が得られないこととなる。一方、特許文献６〜８に記載の蛍光分子等の検出方法では、蛍光強度のゆらぎの統計的演算処理が含まれておらず、試料溶液中の蛍光分子等が１ｎＭ未満であっても蛍光分子等の検出が可能であるが、溶液中でランダムに運動している蛍光分子等の濃度又は数密度を定量的に算出するといったことは達成されていない。

そこで、本願出願人は、特願２０１０−０４４７１４及びＰＣＴ／ＪＰ２０１１／５３４８１に於いて、観測対象となる発光粒子の濃度又は数密度が、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の統計的処理を含む光分析技術で取り扱われるレベルよりも低い試料溶液中の発光粒子の状態又は特性を定量的に観測することを可能にする新規な原理に基づく光分析技術を提案した。かかる新規な光分析技術に於いては、端的に述べれば、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等と同様に共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いるところ、試料溶液内に於いて光の検出領域である微小領域（以下、「光検出領域」と称する。）の位置を移動させながら、即ち、光検出領域により試料溶液内を走査しながら、光検出領域が試料溶液中に分散してランダムに運動する発光粒子を包含したときに、その発光粒子から発せられる光を検出し、これにより、試料溶液中の発光粒子の一つ一つを個別に検出して、発光粒子のカウンティングや試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度に関する情報の取得を可能にする。この新規な光分析技術（以下、「走査分子計数法」と称する。）によれば、測定に必要な試料がＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の光分析技術と同様に微量（例えば、数十μＬ程度）であってもよく、また、測定時間が短く、しかも、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の光分析技術の場合に比して、より低い濃度又は数密度の発光粒子の存在を検出し、その濃度、数密度又はその他の特性を定量的に検出することが可能となる。

上記の走査分子計数法では、試料溶液内にて光検出領域の位置を移動しながら計測された光強度値（若しくはフォトンカウント値）の時系列のデータに於いて、発光粒子からの光に相当する光強度の増大（典型的には、釣鐘状のプロファイル）が観測されたときに、一つの発光粒子が光検出領域内に包含されたと判定し、これにより、一つの発光粒子の存在の検出が為される。この構成に於いて、実際の時系列の光強度データには、発光粒子からの光の他に、ノイズ（光検出器の熱ノイズ、背景光）が存在するので、ノイズを排除して、発光粒子からの光を表す信号（発光粒子の信号）の存在を検出する必要がある。そこで、典型的には、発光粒子の信号の特性、例えば、強度の大きさ、信号の形状等を参照して、発光粒子の信号の抽出が試みられる。この点に関し、発光粒子の信号の特性やノイズの大きさや形状は、測定条件（装置及び光学系の調整状態、環境温度、発光粒子の発光特性、試料溶液の状態など）によって異なり、又、発光粒子の信号からノイズを排除する明確な基準は明らかでなかった。従って、典型的には、ノイズを排除するための基準の設定は、測定条件毎に、観測対象となる発光粒子又はそれと同等の粒子を含む対称溶液（ポジティブコントロール）と観測対象となる発光粒子又はそれと同等の粒子を含まない対称溶液（ネガティブコントロール）について時系列光強度データを取得し、それらの時系列光強度データに於いて観測される光強度値を比較しながら、試行錯誤により為される。しかしながら、ノイズを排除するための基準の設定に於ける試行錯誤は、分析の実施者にとって、煩わしく、又、時間と労力を要する作業となっている。

かくして、本発明の一つの課題は、上記の如き走査分子計数法に於いて、ノイズを排除しつつ発光粒子の信号を検出するための基準又は指標の設定を容易にする新規な手法を提案することである。

この点に関し、本発明の発明者は、走査分子計数法により或る測定条件に於いて任意の試料溶液を用いて得られた時系列光強度データに於ける光強度の発生頻度の分布（より詳細には、時系列の光強度データに於いて検出された信号の強度を変数として該変数以上の強度を有する信号の発生頻度の積算値の分布）に基づいてノイズ信号を排除して発光粒子の信号を検出するための基準を容易に決定できることを見出した。

後により詳細に述べる如く、「走査分子計数法」で利用する共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の焦点領域、即ち、「光検出領域」に於ける単一の発光粒子から放出され光検出器まで到達する光の強度は、光検出領域内での発光粒子の位置によって異なっており、典型的には、発光粒子の位置が光検出領域の略中心領域に在るときに光強度は最大となり（以下、光検出領域内に於ける発光粒子の光強度が最大となる位置を「最大強度点」と称する。）、発光粒子の位置が光検出領域の周縁へ近づくほど、光強度は徐々に低減する。即ち、光検出領域内に於いて発光粒子から放出され検出される光強度の分布は、最大強度点から周縁に向かって強度が低減する略釣鐘状のプロファイルを有する分布となる。そして、発光粒子は、光検出領域を含む試料溶液中に於いて略均等に分散していると考えられるので、発光粒子の信号の光強度の発生頻度の分布は、光検出領域内に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度分布、即ち、光検出領域から光検出器まで到達する光の強度分布によって決定される。一方、ノイズはランダムに発生し、ノイズの強度分布には、光検出領域内に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度分布に対する依存性はない。従って、時系列光強度データに於ける光強度の発生頻度の分布に於いて、光検出領域内に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度分布に対応する成分を与える信号が「発光粒子の信号」であり、それ以外の成分を与える信号が「ノイズ」であると考えることができる。かくして、時系列光強度データ上にて検出された信号が光検出領域内に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度分布に対応する成分であるか否かを基準にして、ノイズ信号を排除した状態にて発光粒子の信号を検出することが可能となる。

本発明では、上記の知見を用いて、走査分子計数法に於いてノイズ信号を排除した状態にて発光粒子の信号を検出するための基準を容易に決定する構成が提案される。

本発明の一つの態様によれば、上記の課題は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析装置であって、顕微鏡の光学系の光路を変更することにより試料溶液内に於ける光学系の光検出領域の位置を移動する光検出領域移動部と、光検出領域からの光を検出する光検出部と、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動させながら光検出部にて検出された光検出領域からの光の時系列の光強度データを生成し、時系列の光強度データに於いて発光粒子の各々からの信号を個別に検出する信号処理部とを含み、信号処理部が、時系列の光強度データに於いて検出された信号の群から、発光粒子の信号として、時系列の光強度データに於いて検出された信号の強度を変数として該変数以上の強度を有する信号の発生頻度の積算値の分布である信号発生頻度積算値分布に基づいて設定された光強度範囲内の光強度を有する信号を抽出することにより発光粒子の各々からの信号を検出することを特徴とする装置によって達成される。かかる構成に於いて、「試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子」とは、試料溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はそれらの凝集体などの、光を発する粒子であって、基板などに固定されず、溶液中を自由にブラウン運動している粒子であれば任意の粒子であってよい。かかる発光粒子は、典型的には、蛍光性粒子であるが、りん光、化学発光、生物発光、光散乱等により光を発する粒子であってもよい。共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の「光検出領域」とは、それらの顕微鏡に於いて光が検出される微小領域であり、対物レンズから照明光が与えられる場合には、その照明光が集光された領域に相当する（共焦点顕微鏡に於いては、特に対物レンズとピンホールとの位置関係により確定される。発光粒子が照明光なしで発光する場合、例えば、化学発光又は生物発光により発光する粒子の場合には、顕微鏡に於いて照明光は要しない。）。なお、本明細書に於いて、「発光粒子の信号」という場合には、特に断らない限り、発光粒子からの光を表す信号を指すものとする。

上記から理解される如く、本発明の基本的な構成である走査分子計数法に於いては、まず、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動しながら、即ち、試料溶液内を光検出領域により走査しながら、逐次的に、光の検出が行われる。そうすると、試料溶液内にて移動する光検出領域が、ランダムに運動している発光粒子を包含したときには、発光粒子からの光が検出され、これにより、一つの発光粒子の存在が検出されることが期待される。従って、逐次的に検出された光に於いて発光粒子からの光の信号を個別に検出して、これにより、粒子の存在を一つずつ個別に逐次的に検出し、粒子の溶液内での状態に関する種々の情報が取得されることとなる。その際、本発明に於いては、上記に述べた知見、即ち、ノイズ信号を排除した発光粒子の信号の検出が時系列光強度データに於ける光強度の発生頻度の分布を参照することにより容易になるという知見に基づいて、「信号発生頻度積算値分布」、即ち、時系列の光強度データに於いて検出された信号の強度を変数として該変数以上の強度を有する信号の発生頻度の積算値の分布に基づいて、発光粒子の信号として抽出されるべき時系列の光強度データ上の信号の光強度範囲が設定される。そして、時系列の光強度データに於いて検出された信号の群から、ノイズを排除しつつ、前記の光強度範囲内の光強度を有する信号が抽出され、これにより、発光粒子の各々からの信号の検出が為される。

なお、後の実施形態の欄の説明から理解される如く、信号発生頻度積算値分布から、光検出領域内の位置に対する光検出領域内に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度の分布が推定可能であり、発光粒子の信号の強度は、光検出領域内に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度の分布に従うと考えられる。従って、上記の発光粒子の信号として抽出されるべき信号の光強度範囲は、好適には、信号発生頻度積算値分布に基づいて決定される光検出領域内の位置に対する信号の強度分布が光検出領域内に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度分布に実質的に合致している光強度範囲であってよい。（ここで、「実質的に合致している」とは、許容される誤差の範囲内でのずれは許されるという意味である。）

また、既に述べた如く、典型的には、光検出領域内に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度分布は、発光粒子の位置が最大強度点から光検出領域の周縁へ近づくほど光強度が低減する釣鐘状のプロファイルを有する分布であり、発光粒子の信号の強度の分布も同様の釣鐘状のプロファイルを有すると考えられる。（特に、発光粒子が励起光を照射されることにより光を放出する粒子であり、光検出領域が励起光の集光領域により画定される場合には、光検出領域に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度分布は光検出領域内の励起光の強度分布と一致する。）そして、実際に観測可能な発光粒子の信号は、その強度がノイズの強度より大きいものとなる（発光粒子の信号の強度分布の釣鐘状のプロファイルがノイズ強度に埋もれてしまう場合には、そもそも、発光粒子の信号の観測ができない。）。かくして、上記の本発明の構成に於いて、信号処理部は、信号発生頻度積算値分布に基づいて設定される光強度範囲の境界として閾値を設定し、その閾値を上回る強度を有する時系列の光強度データ上の信号を、発光粒子の信号として抽出するようになっていてよい。かかる閾値は、好適には、時系列の光強度データに於けるノイズ強度の上限値に設定されてよい。

上記の本発明の装置に於ける発光粒子の信号として抽出されるべき信号の光強度範囲の設定に於いては、より詳細には、例えば、信号発生頻度積算値分布に基づいて決定される光検出領域内の位置の関数値に対する信号の強度の分布を決定した後、かかる光検出領域内の位置の関数値に対する信号の強度の分布に対して、ガウス関数、ローレンツ関数などの釣鐘型関数がフィッティングされてよい。ここで、「光検出領域内の位置の関数値」とは、例えば、光検出領域内の最大強度点からの半径又はその関数値であってよい（後述の実施形態の欄にて説明される如く、時系列の光強度データ上の信号の強度を変数として該変数以上の強度を有する発光粒子の信号の発生頻度の積算値は、光検出領域内の位置、例えば、最大強度点からの半径、の関数として表すことが可能である。）。既に触れた如く、光検出領域内に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度分布は、釣鐘状のプロファイルを有し、釣鐘型関数により良好にフィッティング可能である。従って、信号の強度分布に於いて、釣鐘型関数によるフィッティングに於けるフィッティング誤差が大きい部位又は領域は、ノイズの影響が大きいと考えられ、かくして、発光粒子の信号として抽出されるべき信号の光強度範囲は、上記のフィッティング誤差を参照して、かかる誤差に基づいて設定可能である。

また、後の実施形態の欄の説明から理解される如く、信号発生頻度積算値分布に基づいて決定される光検出領域内の位置の関数値に対する信号の強度の分布の形状、或いは、信号発生頻度積算値分布自体の形状を参照すると、それらの分布の形状に於ける、光検出領域内に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度分布の釣鐘状のプロファイルからのずれの存在する領域を判断することも可能である。従って、発光粒子の信号として抽出されるべき時系列の光強度データ上の信号の光強度範囲は、信号発生頻度積算値分布に基づいて決定される光検出領域内の位置の関数値に対する信号の強度の分布の形状に基づいて又は信号発生頻度積算値分布自体の形状に基づいて設定されてもよい。更に、信号発生頻度積算値分布に基づいて決定される光検出領域内の位置の関数値に対する信号の強度の分布に於ける、光検出領域内の発光粒子から放出され検出される光の強度分布の釣鐘状のプロファイルからのずれの存在する領域は、信号発生頻度積算値分布に基づいて決定される光検出領域内の位置の関数値に対する信号の強度の分布に於ける位置の関数値に対する信号の強度の傾きからも判定可能である。従って、発光粒子の信号として抽出されるべき時系列の光強度データ上の信号の光強度範囲は、信号発生頻度積算値分布に基づいて決定される光検出領域内の位置の関数値に対する信号の強度の分布に於ける位置の関数値に対する信号の強度の傾きに基づいて設定されてもよい。

更に、上記の本発明の装置に於いて、装置の使用者が信号発生頻度積算値分布及び／又は信号発生頻度積算値分布に基づいて決定される光検出領域内の位置の関数値に対する信号の強度の分布を容易に把握可能にすべく、信号処理部は、信号発生頻度積算値分布に基づいて決定される光検出領域内の位置の関数値に対する信号の強度の分布及び／又は信号発生頻度積算値分布を表示可能な表示部を有していてよい。そして、表示部に於いて表示された光検出領域内の位置の関数値に対する信号の強度の分布又は信号発生頻度積算値分布上にて、発光粒子の信号として抽出されるべき時系列の光強度データ上の信号の光強度範囲を、装置の使用者が設定可能であってよい。かかる構成によれば、装置の使用者は、発光粒子の信号として抽出されるべき時系列の光強度データ上の信号の光強度範囲として設定すべき強度範囲を視覚的に確認しながら設定できるので、光強度範囲設定の操作が容易になり、有利である。

上記の本発明の実施の態様の一つに於いては、信号の数を計数して光検出領域に包含された発光粒子の数を計数するようになっていてよい（粒子のカウンティング）。その場合、検出された発光粒子の数と光検出領域の位置の移動量と組み合わせることにより、試料溶液中の同定された発光粒子の数密度又は濃度に関する情報が得られることとなる。具体的には、例えば、複数の試料溶液の数密度若しくは濃度の比、或いは、濃度若しくは数密度の基準となる標準試料溶液に対する相対的な数密度若しくは濃度の比が算出されるか、又は、濃度若しくは数密度の基準となる標準試料溶液に対する相対的な数密度若しくは濃度の比を用いて、絶対的な数密度値又は濃度値が決定されてよい。或いは、任意の手法により、例えば、所定の速度にて光検出領域の位置を移動するなどして、光検出領域の位置の移動軌跡の全体積を特定すれば、発光粒子の数密度又は濃度が具体的に算定できることとなる。

上記の本発明の構成に於ける光検出領域の位置の移動に関して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、発光粒子の特性又は試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて適宜変更されてよい。当業者に於いて理解される如く、発光粒子から検出される光の態様は、その特性又は試料溶液中の数密度又は濃度によって変化し得る。特に、光検出領域の移動速度が速くなると、１つの発光粒子から得られる光量は低減することとなるので、１つの発光粒子からの光が精度よく又は感度よく計測できるように、光検出領域の移動速度は、適宜変更されることが好ましい。

更に、上記の光検出領域の位置の移動に関して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、好適には、発光粒子の拡散移動速度（ブラウン運動による粒子の平均の移動速度）よりも高く設定される。上記に説明されている如く、本発明では、光検出領域が１つの発光粒子から発せられる光を検出して、発光粒子を個別に検出する。しかしながら、発光粒子が溶液中でブラウン運動することによりランダムに移動して、複数回、光検出領域を出入りする場合には、１つの発光粒子から複数回、（その存在を表す）信号が検出されてしまう可能性があり、検出された信号と１つの発光粒子の存在とを対応させることが困難となる。そこで、上記の如く、光検出領域の移動速度を発光粒子の拡散移動速度よりも高く設定し、これにより、１つの発光粒子を、１つの信号に対応させることが可能となる。なお、拡散移動速度は、発光粒子によって変わるので、上記の如く、発光粒子の特性（特に、拡散係数）に応じて、光検出領域の移動速度は適宜変更されることが好ましい。

光検出領域の位置の移動のための光学系の光路の変更は、任意の方式で為されてよい。例えば、レーザー走査型光学顕微鏡に於いて採用されているガルバノミラーを用いて光路を変更して光検出領域の位置が変更されるようになっていてよい。光検出領域の位置の移動軌跡は、任意に設定されてよく、例えば、円形、楕円形、矩形、直線及び曲線のうちから選択可能であってよい。なお、本発明に於いては、光学系の光路を変更して光検出領域の位置を移動するよう構成されていることにより、光検出領域の移動は、速やかであり、且つ、試料溶液に於いて機械的振動や流体力学的な作用が実質的に発生しないので、試料溶液中の発光粒子が力学的な作用の影響を受けることなく（アーティファクトの無い状態で）安定した状態にて、光の計測が可能である（例えば、試料に流れを発生させる場合には常に一様な流速を与えることは困難であると共に、装置構成が複雑となり、また、必要な試料量が大幅に増大すると共に、流れによる流体力学的作用によって溶液中の発光粒子又はその他の物質が変質又は変性してしまう可能性がある。）。そして、試料溶液を流通させるといった構成が必要ではないので、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の場合と同様に微量（１〜数十μＬ程度）の試料溶液にて計測及び分析が可能である。

上記の本発明の装置に於いて試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動させながら光検出を行い、個々の発光粒子からの信号を個別に検出するという特徴的な光分析技術の処理は、汎用のコンピュータによっても実現可能である。従って、本発明のもう一つの態様によれば、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出するための光分析用コンピュータプログラムであって、顕微鏡の光学系の光路を変更することにより試料溶液内に於ける光学系の光検出領域の位置を移動する手順と、試料溶液内に於ける光検出領域の位置の移動中に光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する手順と、時系列の光強度データに於いて個々の発光粒子からの信号を個別に検出する手順にして、時系列の光強度データに於いて検出された信号の群から、発光粒子の信号として、時系列の光強度データに於いて検出された信号の強度を変数として該変数以上の強度を有する信号の発生頻度の積算値の分布である信号発生頻度積算値分布に基づいて設定された光強度範囲内の光強度を有する信号を抽出することにより発光粒子の各々からの信号を検出する手順とをコンピュータに実行させることを特徴とするコンピュータプログラムが提供される。

かかるコンピュータプログラムに於いても、個別に検出された発光粒子からの信号の数を計数して光検出領域の位置の移動中に検出された発光粒子の数を計数する手順及び／又は検出された発光粒子の数に基づいて、試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度を決定する手順が含まれていてよい。また、光検出領域の位置を移動する手順に於いて、光検出領域の位置が所定の速度にて或いは発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動されるようになっていてよく、光検出領域の位置の移動速度は、発光粒子の特性又は試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて設定されるようになっていてよい。光検出領域の位置の移動軌跡は、円形、楕円形、矩形、直線及び曲線のうちから選択可能であってよい。そして、上記のコンピュータプログラムに於いても、信号発生頻度積算値分布に基づいて設定された光強度範囲は、信号発生頻度積算値分布に基づいて決定される光検出領域内の位置に対する信号の強度分布が光検出領域内に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度分布に実質的に合致している光強度範囲であってよく、好適には、個々の発光粒子からの信号を個別に検出する手順に於いて、信号発生頻度積算値分布に基づいて決定される閾値を上回る強度を有する時系列の光強度データ上の信号が、発光粒子の信号として抽出され、或いは、個々の発光粒子からの信号を個別に検出する手順に於いて、信号発生頻度積算値分布に基づいて時系列の光強度データに於けるノイズ強度の上限が決定されるようになっていてよい。

また、上記のコンピュータプログラムに於いて、発光粒子の信号として抽出されるべき時系列の光強度データ上の信号の光強度範囲は、信号発生頻度積算値分布に基づいて決定される光検出領域内の位置の関数値に対する信号の強度の分布に対して釣鐘型関数をフィッティングしたときのフィッティング誤差に基づいて、信号発生頻度積算値分布に基づいて決定される光検出領域内の位置の関数値に対する信号の強度の分布の形状に基づいて若しくは信号発生頻度積算値分布の形状に基づいて、或いは、信号発生頻度積算値分布に基づいて決定される光検出領域内の位置の関数値に対する信号の強度の分布に於ける位置の関数値に対する前記信号の強度の傾きに基づいて、設定されるようになっていてよい。更に、上記のコンピュータプログラムには、信号発生頻度積算値分布に基づいて決定される前記光検出領域内の位置の関数値に対する前記信号の強度の分布及び／又は前記信号発生頻度積算値分布を表示装置上に表示する手順を含んでいてよく、個々の発光粒子からの信号を個別に検出する手順に於いて、表示装置上に表示された光検出領域内の位置の関数値に対する信号の強度の分布又は信号発生頻度積算値分布上にて、発光粒子の信号として抽出されるべき時系列の光強度データ上の信号の光強度範囲が設定できるようになっていてよい。

更に、上記の本発明の装置又はコンピュータプログラムによれば、試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動させながら、個々の発光粒子の光の検出を行う光分析方法であって、信号発生頻度積算値分布を参照して、発光粒子の信号の検出が実行される新規な方法が実現される。従って、本発明によれば、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析方法であって、顕微鏡の光学系の光路を変更することにより試料溶液内に於いて光学系の光検出領域の位置を移動する過程と、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動させながら光検出領域からの光の強度を測定して時系列の光強度データを生成する過程と、時系列の光強度データ上に於いて発光粒子の光を表す信号を個別に検出する過程とを含み、発光粒子の光を表す信号を個別に検出する過程に於いて、時系列の光強度データに於いて検出された信号の群から、発光粒子の信号として、時系列の光強度データに於いて検出された信号の強度を変数として該変数以上の強度を有する信号の発生頻度の積算値の分布である信号発生頻度積算値分布に基づいて設定された光強度範囲内の光強度を有する信号を抽出することにより発光粒子の各々からの信号を検出することを特徴とする方法が提供される。

上記の方法に於いても、個別に検出された発光粒子からの信号の数を計数して光検出領域の位置の移動中に検出された発光粒子の数を計数する過程及び／又は検出された発光粒子の数に基づいて、試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度を決定する過程が含まれていてよい。また更に、光検出領域の位置を移動するべく光学系の光路を変更する過程に於いて、光検出領域の位置が所定の速度にて或いは発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動されるようになっていてよく、光検出領域の位置の移動速度は、発光粒子の特性又は試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて設定されるようになっていてよい。光検出領域の位置の移動軌跡は、円形、楕円形、矩形、直線及び曲線のうちから選択可能であってよい。そして、上記の方法に於いても、信号発生頻度積算値分布に基づいて設定された光強度範囲は、信号発生頻度積算値分布に基づいて決定される光検出領域内の位置に対する信号の強度分布が光検出領域内に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度分布に実質的に合致している光強度範囲であってよく、好適には、発光粒子からの信号を個別に検出する過程に於いて、信号発生頻度積算値分布に基づいて決定される閾値を上回る強度を有する時系列の光強度データ上の信号が、発光粒子の信号として抽出され、或いは、発光粒子からの信号を個別に検出する過程に於いて、信号発生頻度積算値分布に基づいて前記時系列の光強度データに於けるノイズ強度の上限が決定されるようになっていてよい。

また、上記の方法に於いても、発光粒子の信号として抽出されるべき時系列の光強度データ上の信号の光強度範囲は、信号発生頻度積算値分布に基づいて決定される光検出領域内の位置の関数値に対する信号の強度の分布に対して釣鐘型関数をフィッティングしたときのフィッティング誤差に基づいて、信号発生頻度積算値分布に基づいて決定される光検出領域内の位置の関数値に対する信号の強度の分布の形状に基づいて若しくは信号発生頻度積算値分布の形状に基づいて、或いは、信号発生頻度積算値分布に基づいて決定される光検出領域内の位置の関数値に対する信号の強度の分布に於ける位置の関数値に対する前記信号の強度の傾きに基づいて、設定されるようになっていてよい。更に、信号発生頻度積算値分布に基づいて決定される前記光検出領域内の位置の関数値に対する前記信号の強度の分布及び／又は前記信号発生頻度積算値分布が、任意の表示装置上に表示される場合には、発光粒子からの信号を個別に検出する過程に於いて、表示装置上に表示された光検出領域内の位置の関数値に対する信号の強度の分布又は信号発生頻度積算値分布上にて、発光粒子の信号として抽出されるべき時系列の光強度データ上の信号の光強度範囲が設定できるようになっていてよい。

上記の本発明の光分析技術は、典型的には、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の生物学的な対象物の溶液中の状態の分析又は解析の用途に用いられるが、非生物学的な粒子（例えば、原子、分子、ミセル、金属コロイドなど）の溶液中の状態の分析又は解析に用いられてもよく、そのような場合も本発明の範囲に属することは理解されるべきである。

総じて、本発明の光分析技術では、走査分子計数法に於いて、時系列光強度データ上の信号の発生頻度の分布（信号発生頻度積算値分布）を参照することによって、ノイズの強度範囲が容易に決定可能であるという知見を利用して、時系列光強度データからの発光粒子の信号の抽出に要していた労力と時間が大幅に低減されることとなる。特に、信号発生頻度積算値分布に基づいて定められる発光粒子の信号として抽出されるべき信号の光強度範囲は、原理的には、明るさの同等の発光粒子（或る同一の発光条件下で発光強度が実質的に等しい発光粒子）について不変であるので、明るさの同等の発光粒子についての種々の試料溶液についての走査分子計数法による測定に於いて、或る一つの試料溶液について決定された上記の光強度範囲は、装置の設定条件等の測定条件が変わらない限り、他の試料溶液についての測定にも利用でき、かくして、ノイズ信号を排除した発光粒子の信号の検出のための基準を決定するための試行錯誤を軽減することが可能となる。そして、ノイズ排除が迅速になることから、走査分子計数法の利用可能な試料溶液の範囲が拡大され、分子間相互作用の観測及び分析などの走査分子計数法の応用範囲の拡大が期待される。

本発明のその他の目的及び利点は、以下の本発明の好ましい実施形態の説明により明らかになるであろう。

図１（Ａ）は、本発明の光分析技術を実行する光分析装置の内部構造の模式図である。図１（Ｂ）は、コンフォーカル・ボリューム（共焦点顕微鏡の観察領域）の模式図である。図１（Ｃ）は、ミラー７の向きを変更して試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動する機構の模式図である。 図２（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、本発明の光分析技術が適用される走査分子計数法に於ける光検出の原理を説明する模式図及び計測される光強度の時間変化の模式図である。図２（Ｃ）は、それぞれ、顕微鏡の光の進行方向から見た光検出領域の断面の模式図であり、図２（Ｄ）は、（Ｃ）の場合に計測される時系列の光強度データの例の模式図である。図２（Ｅ）は、光検出領域の最大強度点Ｉmaxからの放射方向位置ｒに対する発光粒子の信号の強度分布（太実線）を示す図である。重ねて、ノイズ信号（点線）が存在する場合の実際の信号の強度分布（細実線）が模式的に示されている。 図３（Ａ）、（Ｂ）は、本発明の方法に従って実行される走査分子計数法の処理手順をフローチャートの形式で表した図である。 図４（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、発光粒子がブラウン運動をしながら光検出領域を横切る場合及び試料溶液内の光検出領域の位置を発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動することにより発光粒子が光検出領域を横切る場合の粒子の運動の態様を表すモデル図である。図４（Ｃ）は、走査分子計数法に従って、計測された時系列光強度データ（フォトンカウントの時間変化）から発光粒子の存在を検出するための処理手順に於ける検出信号の信号処理過程の例を説明する図である。 図５は、計測されたフォトンカウントデータの実測例（棒グラフ）と、データをスムージングして得られる曲線（点線）と、パルス存在領域にてフィッティングされたガウス関数（実線）を示している。図中、「ノイズ」と付された信号は、ノイズ又は異物による信号であるとして無視される。 図６（Ａ）は、時系列光強度データに於ける光強度（フォトンカウント）Ｉ以上の強度を有する信号数Ｐ（Ｉ）の平方根Ｐ^１／２に対して光強度Ｉをプロットした図である。図中、プロットに対するフィッティング曲線も描かれている。図６（Ｂ）は、図６（Ａ）中の光強度（フォトンカウント）Ｉ以上の強度を有する信号数Ｐ（Ｉ）の平方根Ｐに対する光強度Ｉのプロットのフィッティング曲線に対する誤差Ｒ^２を、信号数Ｐ（Ｉ）の平方根Ｐ^１／２に対してプロットした図である。 図７（Ａ）は、種々の濃度の発光粒子を含む試料溶液について、本発明の光分析技術に従って実行された走査分子計数法（実施例１）により計測された発光粒子の信号として検出されたパルス数のグラフである。発光粒子の信号の抽出のための閾値は、信号発生頻度積算値分布に基づいて、２に設定した。図中の実線は、最小自乗法による発光粒子濃度に対するパルス数の近似直線を示している。図７（Ｂ）は、閾値を１〜３に設定した場合の発光粒子濃度に対するパルス数の近似直線の傾き（◆）と相関係数（□）を、設定された閾値に対してプロットした図である。 図８は、従来の蛍光強度のゆらぎを算出する光分析技術に於いて得られるフォトンカウント（光強度）の時間変化の例であり、（Ａ）は、試料内の粒子の濃度が、十分な計測精度が与えられる程度である場合であり、（Ｂ）は、（Ａ）の場合よりも大幅に試料内の粒子の濃度が低い場合である。

１…光分析装置（共焦点顕微鏡）
２…光源
３…シングルモードオプティカルファイバー
４…コリメータレンズ
５…ダイクロイックミラー
６、７、１１…反射ミラー
８…対物レンズ
９…マイクロプレート
１０…ウェル（試料溶液容器）
１２…コンデンサーレンズ
１３…ピンホール
１４…バリアフィルター
１５…マルチモードオプティカルファイバー
１６…光検出器
１７…ミラー偏向器
１７ａ…ステージ位置変更装置
１８…コンピュータ

以下、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。

光分析装置の構成
本発明による光分析技術は、基本的な構成に於いて、図１（Ａ）に模式的に例示されている如き、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等が実行可能な共焦点顕微鏡の光学系と光検出器とを組み合わせてなる光分析装置により実現可能である。図１（Ａ）を参照して、光分析装置１は、光学系２〜１７と、光学系の各部の作動を制御すると共にデータを取得し解析するためのコンピュータ１８とから構成される。光分析装置１の光学系は、通常の共焦点顕微鏡の光学系と同様であってよく、そこに於いて、光源２から放射されシングルモードファイバー３内を伝播したレーザー光（Ｅｘ）が、ファイバーの出射端に於いて固有のＮＡにて決まった角度にて発散する光となって放射され、コリメーター４によって平行光となり、ダイクロイックミラー５、反射ミラー６、７にて反射され、対物レンズ８へ入射される。対物レンズ８の上方には、典型的には、１〜数十μＬの試料溶液が分注される試料容器又はウェル１０が配列されたマイクロプレート９が配置されており、対物レンズ８から出射したレーザー光は、試料容器又はウェル１０内の試料溶液中で焦点を結び、光強度の強い領域（励起領域）が形成される。試料溶液中には、観測対象物である発光粒子、典型的には、蛍光色素等の発光標識が付加された分子が分散又は溶解されており、発光粒子が励起領域に進入すると、その間、発光粒子が励起され光が放出される。放出された光（Ｅｍ）は、対物レンズ８、ダイクロイックミラー５を通過し、ミラー１１にて反射してコンデンサーレンズ１２にて集光され、ピンホール１３を通過する。なお、当業者に於いて知られている如く、ピンホール１３は、対物レンズ８の焦点位置と共役の位置に配置されており、これにより、図１（Ｂ）に模式的に示されている如きレーザー光の焦点領域、即ち、励起領域内から発せられた光のみがピンホール１３を通過し、焦点面以外からの光は遮断される。図１（Ｂ）に例示されたレーザー光の焦点領域は、通常、１〜１０ｆＬ程度の実効体積を有する本光分析装置に於ける光検出領域であり、コンフォーカル・ボリュームと称される。コンフォーカル・ボリュームに於いては、典型的には、光強度が領域の中心を頂点とするガウス型分布又はローレンツ型分布となり、その実効体積は、光強度が１／ｅ^２となる面を境界とする略楕円球体の体積である。かくして、ピンホール１３を通過した光は、ダイクロイックミラー１４ａを経て、バリアフィルター１４を透過して（ここで、特定の波長帯域の光成分のみが選択される。）、マルチモードファイバー１５に導入されて、対応する光検出器１６に到達し、時系列の電気信号に変換された後、コンピュータ１８へ入力され、後に説明される態様にて光分析のための処理が為される。光検出器１６としては、好適には、フォトンカウンティングに使用可能な超高感度の光検出器が用いられ、これにより、単一の発光粒子からの光、例えば、一個又は数個の蛍光色素分子からの微弱光が検出可能となる。光の検出がフォトンカウンティングによる場合、光強度の測定は、所定時間に亘って、逐次的に、所定の単位時間毎（ＢＩＮ ＴＩＭＥ）に、光検出器に到来するフォトンの数を計測する態様にて実行される。従って、この場合、時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータである。

また、上記の光分析装置の光学系に於いて、更に、光学系の光路を変更して試料溶液内を光検出領域により走査する、即ち、試料溶液内に於いて焦点領域（即ち、光検出領域）の位置を移動するための機構が設けられる。かかる光検出領域の位置を移動するための機構としては、例えば、図１（Ｃ）に模式的に例示されている如く、反射ミラー７の向きを変更するミラー偏向器１７が採用されてよい。かかるミラー偏向器１７は、通常のレーザー走査型顕微鏡に装備されているガルバノミラー装置と同様であってよい。また、所望の光検出領域の位置の移動パターンを達成するべく、ミラー偏向器１７は、コンピュータ１８の制御の下、光検出器１６による光検出と協調して駆動される。光検出領域の位置の移動軌跡は、円形、楕円形、矩形、直線、曲線又はこれらの組み合わせから任意に選択されてよい（コンピュータ１８に於けるプログラムに於いて、種々の移動パターンが選択できるようになっていてよい。）。なお、図示していないが、対物レンズ８を上下に移動することにより、光検出領域の位置が上下方向に移動されるようになっていてもよい。上記の如く、試料溶液を移動するのではなく、光学系の光路を変更して光検出領域の位置を移動する構成によれば、試料溶液内に機械的な振動や流体力学的な作用が実質的に発生することがなくなり、観測対象物に対する力学的な作用の影響を排除することが可能となり、安定的な計測が達成される。

なお、追加的な構成として、顕微鏡のステージ（図示せず）には、観察するウェル１０を変更するべく、マイクロプレート９の水平方向位置を移動するためのステージ位置変更装置１７ａが設けられていてよい。ステージ位置変更装置１７ａの作動は、コンピュータ１８により制御されてよい。

発光粒子が多光子吸収により発光する場合には、上記の光学系は、多光子顕微鏡として使用される。その場合には、励起光の焦点領域（光検出領域）のみで光の放出があるので、ピンホール１３は、除去されてよい。発光粒子がりん光又は散乱により発光する場合には、上記の共焦点顕微鏡の光学系がそのまま用いられる。また、発光粒子が化学発光や生物発光現象により励起光によらず発光する場合には、励起光を生成するための光学系２〜５が省略されてよい。更に、光分析装置１に於いては、図示の如く、複数の励起光源２が設けられていてよく、発光粒子を励起する光の波長によって適宜、励起光の波長が選択できるようになっていてよい。同様に、光検出器１６も複数個備えられていてよく、試料中に波長の異なる複数種の発光粒子が含まれている場合に、それらからの光を波長によって別々に検出できるようになっていてよい。

本発明の方法の原理
「発明の概要」の欄に記載されている如く、本発明の光分析技術に於いては、端的に述べれば、走査分子計数法に於いて、時系列光強度データに於ける光強度の発生頻度の分布（信号発生頻度積算値分布）を参照して、ノイズを排除して発光粒子の信号を検出するための基準を容易に決定することが試みられる。以下、本発明の走査分子計数法及びノイズ排除の原理について説明する。

１.走査分子計数法の原理
ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の分光分析技術は、従前の生化学的な分析技術に比して、必要な試料量が極めて少なく、且つ、迅速に検査が実行できる点で優れている。しかしながら、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の分光分析技術では、原理的に、発光粒子の濃度や特性は、蛍光強度のゆらぎに基づいて算定されるので、精度のよい測定結果を得るためには、試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度が、図８（Ａ）に模式的に描かれているように、蛍光強度の計測中に常に一個程度の発光粒子が光検出領域ＣＶ内に存在するレベルであり、同図の右側に示されている如く、計測時間中に常に有意な光強度（フォトンカウント）が検出されることが要求される。もし発光粒子の濃度又は数密度がそれよりも低い場合、例えば、図８（Ｂ）に描かれているように、発光粒子がたまにしか光検出領域ＣＶ内へ進入しないレベルである場合には、同図の右側に例示されている如く、有意な光強度の信号（フォトンカウント）が、計測時間の一部にしか現れないこととなり、精度のよい光強度のゆらぎの算定が困難となる。また、計測中に常に一個程度の発光粒子が光検出領域内に存在するレベルよりも発光粒子の濃度が大幅に低い場合には、光強度のゆらぎの演算に於いて、バックグラウンドの影響を受けやすく、演算に十分な量の有意な光強度データを得るために計測時間が長くなる。

そこで、本願出願人は、特願２０１０−０４４７１４及びＰＣＴ／ＪＰ２０１１／５３４８１に於いて、発光粒子の濃度が、上記の如きＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の分光分析技術にて要求されるレベルよりも低い場合でも、発光粒子の数密度又は濃度等の特性の検出を可能にする新規な原理に基づく「走査分子計数法」を提案した。

走査分子計数法に於いて実行される処理としては、端的に述べれば、光検出領域の位置を移動するための機構（ミラー偏向器１７）を駆動して光路を変更し、図２（Ａ）にて模式的に描かれているように、試料溶液内に於いて光検出領域ＣＶの位置を移動しながら、即ち、光検出領域ＣＶにより試料溶液内を走査しながら、光検出が実行される。そうすると、例えば、光検出領域ＣＶが移動する間（図中、時間ｔｏ〜ｔ２）に於いて１つの発光粒子の存在する領域を通過する際（ｔ１）には、発光粒子から光が放出され、図２（Ｂ）に描かれている如き時系列の光強度データ上に有意な光強度（Ｅｍ）のパルス状の信号が出現することとなる。かくして、上記の光検出領域ＣＶの位置の移動と光検出を実行し、その間に出現する図２（Ｂ）に例示されている如きパルス状の信号（有意な光強度）を一つずつ検出することによって、発光粒子が個別に検出され、その数をカウントすることにより、計測された領域内に存在する発光粒子の数、或いは、濃度若しくは数密度に関する情報が取得できることとなる。かかる走査分子計数法の原理に於いては、蛍光強度のゆらぎの算出の如き統計的な演算処理は行われず、発光粒子が一つずつ検出されるので、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等では十分な精度にて分析ができないほど、観測されるべき粒子の濃度が低い試料溶液でも、粒子の濃度若しくは数密度に関する情報が取得可能である。

２．信号発生頻度積算値分布を用いた発光粒子の信号の抽出のための光強度範囲の決定
既に述べた如く、上記の走査分子計数法により光検出器１６により経時的に取得された光強度のデータ（時系列光強度データ）上には、発光粒子の信号の他、光検出器の熱ノイズや背景光等に起因にするノイズが存在する。従って、発光粒子の信号の検出に際しては、時系列光強度データからの発光粒子の信号の抽出のための処理が必要となる。発光粒子の信号の抽出処理としては、典型的には、時系列光強度データ上の信号の強度を参照して、所定の強度範囲内に入る強度を有する信号、より具体的には、所定の閾値以上の又はその閾値を上回る強度を有する信号を発光粒子の信号として抽出するといった処理が為される。しかしながら、従前、ノイズが排除された状態で発光粒子の信号を抽出する明確な基準は見出されておらず、従って、前記の所定の強度範囲若しくは閾値は、試行錯誤又は装置の使用者の経験等により定められており、このことは、発光粒子の信号の検出のための労力、時間を要し、或いは、発光粒子の信号の検出結果の精度の悪化の要因ともなり得た。

この点に関し、本発明の発明者等は、既に触れた如く、時系列光強度データ上の信号発生頻度積算値分布を参照すると、発光粒子の信号の強度範囲とノイズの強度範囲とがそれぞれ推定可能となり、発光粒子の信号の抽出のための前記の所定の光強度範囲若しくは閾値が、信号発生頻度積算値分布に基づいて容易に決定されることを見出した。以下、時系列光強度データの信号発生頻度積算値分布を用いた発光粒子の信号の抽出のための光強度範囲の決定の原理について説明する。

図２（Ｃ）〜（Ｅ）を参照して、光検出領域ＣＶに於いて、そこを通過する発光粒子から放出され光検出器まで到達する光の強度は、光検出領域ＣＶに於ける発光粒子の位置によって異なり、明るさの同じ発光粒子（同一の条件下での観測に於いて発光強度が実質的に等しい発光粒子）であっても、発光粒子の光検出領域内に於ける通過位置によって検出される光強度が異なる。例えば、或る発光粒子が照明光を照射されて発光する粒子である場合、照明光の光検出領域内に於ける光の強度は、典型的には、光検出領域（集光領域）の略中心にて最大となり、かかる最大強度点から略放射方向に低減する。従って、発光粒子からの光の強度は、発光粒子が光検出領域の略中心を横切る際に最大となり、発光粒子の位置が光検出領域の周縁へ近づくほど、光強度は徐々に低減する。即ち、光検出領域内の位置を最大強度点からの放射方向距離（半径ｒ）にて表したとき、光検出領域内に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度の分布は、図２（Ｅ）にて太実線にて例示されている如き最大強度点からの半径ｒに対して釣鐘状の分布となっている。例えば、図２（Ｃ）中の発光粒子α、β、γが同じ明るさの粒子であったとしても、各発光粒子の通過する経路によって、検出される光強度が互いに異なり、図中、光検出領域の略中心を通過する発光粒子βの光強度は、発光粒子α、γの光強度よりも高くなる（図２（Ｄ）参照）。

光検出領域内に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度の分布が、図２（Ｅ）にて太実線の如きプロファイルを有しているとき、発光粒子は試料溶液中に略均等に分散しており、従って、最大強度点からの放射方向距離が大きくなるほど、光検出領域を通過する発光粒子の数が多くなると考えられるので、光検出領域の移動中に光検出領域内に包含されて検出される発光粒子の信号の強度に対する頻度分布は、図２（Ｅ）にて太実線の如き光検出領域内に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度の分布に対応して、光強度（図２（Ｅ）の縦軸）が大きくなるほど、頻度（横軸）が小さくなる分布となる。

より具体的には、まず、図２（Ｅ）にて太実線にて例示されている如き光検出領域内に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度の分布が、ローレンツ関数で近似できる場合、分布の最大強度点Ｉmaxからの半径ｒに於ける光強度Ｉは、光強度分布の最大値Imax（Imaxは、単一発光粒子の最大光強度に相当する。）、分布の半値半幅ｗ、強度のバックグラウンドIbgを用いて、

により与えられる。一方、或る発光粒子の濃度ｃの試料溶液中に於いて、時間ｔの間、光検出領域を走査速度ｕにて移動させた場合、光検出領域内に於いて光強度Ｉ以上の光強度を与える小領域の移動方向に垂直な方向の断面積をＳとすると、光強度Ｉ以上の強度を有する発光粒子の信号の総数Ｐは、
Ｐ＝ｃＳｕｔＮ_Ａ …（２）
となる（Ｎ_Ａは、アボガドロ数）。ここで、光強度Ｉ以上の光強度を与える小領域の断面積Ｓが近似的にＳ＝πｒ^２により与えられるとすると（より厳密には、光検出領域の断面は楕円であるが、演算の簡略化のため、円にて近似する。以下同様。）、半径ｒは、

と表されるので、結局、光強度Ｉ以上の光強度を有する発光粒子の信号数Ｐの平方根が、光強度Ｉを与える小領域の断面積の半径に比例することとなる（信号数Ｐの平方根は、光検出領域内の位置を表す半径ｒの関数値であるということができる。）。従って、光強度Ｉ以上の光強度を有する発光粒子の信号数Ｐ（Ｉ）の分布、即ち、信号発生頻度積算値分布は、式（１）、（２）から、

により与えられる。また、式（１）、（３）の関係から、図２（Ｅ）の如き光強度Ｉの分布は、下記の如く、発光粒子の信号数Ｐの平方根を変数としたローレンツ関数により近似できることとなる。

かくして、時系列光強度データ上の発光粒子の信号について、その光強度Ｉ以上の光強度を有する発光粒子の信号数Ｐの平方根に対する光強度Ｉの分布を参照することにより、光検出領域内に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度の分布が推定できることとなる。例えば、光強度Ｉ毎に光強度Ｉ以上の光強度を有する発光粒子の信号数Ｐを得た後（信号発生頻度積算値分布の調製）、発光粒子の信号数Ｐの平方根から算出される半径ｒに対する光強度Ｉのプロットを描き、更に、信号数Ｐの平方根＝０の軸について対称的に光強度Ｉのプロットを描くことにより、図２（Ｅ）の太実線の如き、光検出領域内に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度の分布のプロファイルが描かれることとなる。

なお、光検出領域内に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度の分布が、ガウス関数で近似できる場合には、分布の最大強度点Ｉmaxから距離ｒに於ける光強度Ｉは、

となるので、信号発生頻度積算値分布は、

により表される。そして、図２（Ｅ）の如き光強度Ｉの分布は、下記の如く、発光粒子の信号数Ｐの平方根を変数としたガウス関数により近似できることとなる。

一方、ノイズ信号について、その強度の分布は、光検出領域内に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度の分布とは無関係であり、信号数の平方根に対する強度の分布（信号発生頻度積算値分布）は、図２（Ｅ）中の点線の如きプロファイルとなる。そうすると、時系列光強度データに於ける全信号についての信号数の平方根に対する強度の分布（信号発生頻度積算値分布）は、図２（Ｅ）中で太実線にて描かれた発光粒子の信号についての分布と、点線にて描かれたノイズ信号についての分布を合成してなる細実線にて描かれている如きプロファイルとなる。かかる細実線のプロファイルに於いては、図から理解される如く、ノイズ信号についての分布の最大値にてプロファイルが横方向に不連続に屈曲して拡大することとなるので、その形状が光検出領域内に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度の分布の釣鐘型関数から逸脱することとなる。従って、ノイズ信号についての分布の最大値、即ち、プロファイルの不連続点に於ける光強度以上の強度を有する信号が発光粒子の信号であり、ノイズ信号についての分布の最大値以下の信号には、ノイズ信号が混在していることが把握されることとなる。かくして、時系列光強度データに於ける全信号についての信号数の平方根に対する強度の分布のプロファイルの不連続点を検出又は特定して、その点の光強度以上の光強度範囲を発光粒子の信号の抽出のための光強度範囲として画定して、即ち、プロファイルの不連続点の強度を閾値Ｉｔｈとして決定して、閾値Ｉｔｈ以上の信号を抽出することによって、ノイズ信号の影響を実質的に排除した発光粒子の信号の検出が可能となる。なお、閾値Ｉｔｈ以上の信号のみを発光粒子の信号として抽出することは、光検出領域内の最大強度点から半径ｒの小領域内を通過する発光粒子のみを検出すること、即ち、発光粒子を検出する領域を縮小することに相当する。

走査分子計数法の処理操作過程
図１（Ａ）に例示の光分析装置１を用いた本発明に従った走査分子計数法の実施形態に於いては、具体的には、（１）発光粒子を含む試料溶液の調製、（２）試料溶液の光強度の測定処理、及び（３）測定された光強度の分析処理が実行される。図３は、フローチャートの形式にて表した本実施形態に於ける処理を示している。

（１）試料溶液の調製
本発明の方法に於いて観測対象となる粒子は、溶解された分子等の、試料溶液中にて分散し溶液中にてランダムに運動する粒子であれば、任意のものであってよく、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞、或いは、金属コロイド、その他の非生物学的粒子などであってよい（試料溶液は、典型的には水溶液であるが、これに限定されず、有機溶媒その他の任意の液体であってよい。）。また、観測対象となる粒子は、それ自体が発光する粒子であってもよく、或いは、発光標識（蛍光分子、りん光分子、化学・生物発光分子）が任意の態様にて付加された粒子であってよい。

（２）試料溶液の光強度の測定
本実施形態の走査分子計数法による光分析に於ける光強度の測定処理では、ミラー偏向器１７を駆動して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動（試料溶液内の走査）を行いながら、光強度の測定が為される（図４−ステップ１００）。操作処理に於いて、典型的には、マイクロプレート９のウェル１０に試料溶液を注入して顕微鏡のステージ上に載置した後、使用者がコンピュータ１８に対して、測定の開始の指示を入力すると、コンピュータ１８は、記憶装置（図示せず）に記憶されたプログラム（光学系の光路を変更することにより試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動する手順と、光検出領域の位置の移動中に光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する手順）に従って、試料溶液内の光検出領域に於ける励起光の照射及び光強度の計測が開始される。計測が開始されると、まず、コンピュータ１８のプログラムに従った処理動作の制御下、光源２から、試料溶液中の発光粒子の励起波長の光が出射されると共に、ミラー偏向器１７がミラー７（ガルバノミラー）を駆動して、ウェル１０内に於いて光検出領域の位置の移動を実行し、これと同時に光検出器１６は、逐次的に検出された光を電気信号に変換してコンピュータ１８へ送信し、コンピュータ１８は、任意の態様にて、送信された信号から時系列の光強度データを生成して保存する。典型的には、光検出器１６は、一光子の到来を検出できる超高感度光検出器であるので、光の検出は、所定時間に亘って、逐次的に、所定の単位時間毎（ＢＩＮ ＴＩＭＥ）に、例えば、１０μ秒毎に光検出器に到来するフォトンの数を計測する態様にて実行されるフォトンカウンティングであり、時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータであってよい。

光強度の計測中の光検出領域の位置の移動速度は、任意に、例えば、実験的に又は分析の目的に適合するよう設定された所定の速度であってよい。検出された発光粒子の数に基づいて、その数密度又は濃度に関する情報を取得する場合には、光検出領域の通過した領域の大きさ又は体積が必要となるので、移動距離が把握される態様にて光検出領域の位置の移動が実行されることが好ましい。なお、計測中の経過時間と光検出領域の位置の移動距離とが比例関係にある方が測定結果の解釈が容易となるので、移動速度は、基本的に、一定速度であることが好ましいが、これに限定されない。

ところで、光検出領域の位置の移動速度に関して、計測された時系列の光強度データからの発光粒子の個別の検出、或いは、発光粒子の数のカウンティングを、定量的に精度よく実行するためには、かかる移動速度は、発光粒子のランダムな運動、即ち、ブラウン運動による移動速度よりも速い値に設定されることが好ましい。本実施形態に於いて観測対象となる発光粒子は、溶液中に分散又は溶解されて自由にランダムに運動する粒子であるので、ブラウン運動によって位置が時間と伴に移動する。従って、光検出領域の位置の移動速度が粒子のブラウン運動による移動に比して遅い場合には、図４（Ａ）に模式的に描かれている如く、粒子が領域内をランダムに移動し、これにより、光強度がランダムに変化し（光検出領域の励起光強度は、領域の中心を頂点として外方に向かって低減する。）、個々の発光粒子に対応する有意な光強度の変化（発光粒子からの光を表す信号）を特定することが困難となる。そこで、好適には、図４（Ｂ）に描かれている如く、粒子が光検出領域を略直線に横切り、これにより、時系列の光強度データに於いて、図４（Ｃ）の上段に例示の如く、個々の粒子に対応する光強度の変化のプロファイルが略同様となり（粒子が略直線的に光検出領域を通過する場合には、光強度の変化のプロファイルは、励起光強度分布と略同様となる。）、個々の発光粒子と光強度との対応が容易に特定できるように、光検出領域の位置の移動速度は、粒子のブラウン運動による平均の移動速度（拡散移動速度）よりも速く設定される。

具体的には、拡散係数Ｄを有する発光粒子がブラウン運動によって半径Ｗｏの光検出領域（コンフォーカルボリューム）を通過するときに要する時間Δｔは、平均二乗変位の関係式
（２Ｗｏ）^２＝６Ｄ・Δｔ …（９）
から、
Δｔ＝（２Ｗｏ）^２／６Ｄ …（１０）
となるので、発光粒子がブラウン運動により移動する速度（拡散移動速度）Ｖdifは、概ね、
Ｖdif＝２ｒ／Δτ＝３Ｄ／ｒ …（１１）
となる。そこで、光検出領域の位置の移動速度は、かかるＶdifを参照して、それよりも十分に早い値に設定されてよい。例えば、発光粒子の拡散係数が、Ｄ＝２．０×１０^−１０ｍ^２／ｓ程度であると予想される場合には、Ｗｏが、０．６２μｍ程度だとすると、Ｖdifは、１．０×１０^−３ｍ／ｓとなるので、光検出領域の位置の移動速度は、その１０倍以上の１５ｍｍ／ｓと設定されてよい。なお、発光粒子の拡散係数が未知の場合には、光検出領域の位置の移動速度を種々設定して光強度の変化のプロファイルが、予想されるプロファイル（典型的には、励起光強度分布と略同様）となる条件を見つけるための予備実験を繰り返し実行して、好適な光検出領域の位置の移動速度が決定されてよい。

（３）光強度の分析
上記の処理により時系列光強度データが得られると、コンピュータ１８に於いて、記憶装置に記憶されたプログラムに従った処理により、時系列光強度データ上に於ける信号の検出、発光粒子の信号の抽出のための閾値の決定、発光粒子の信号の抽出、発光粒子のカウンティング、濃度算出等の各種分析が実行される。

（ｉ）時系列光強度データ上に於ける信号の検出
既に触れた如く、時系列光強度データに於いて、一つの発光粒子の光検出領域を通過する際の軌跡が、図４（Ｂ）に示されている如く略直線状である場合、その粒子に対応する信号に於ける光強度の変化は、（光学系により決定される）光検出領域内の光強度分布を反映した略釣鐘状のプロファイルを有する。従って、走査分子計数法では、基本的には、適宜設定される閾値Ｉｔｈを超える光強度値が継続する時間幅Δτが所定の範囲にあるとき、その光強度のプロファイルを有する信号が一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されるようになっていてよい。そして、光強度が閾値Ｉｔｈを超えないか、時間幅Δτが所定の範囲にない信号は、ノイズ又は異物の信号として判定される。また、光検出領域の光強度分布が、ガウス分布：
Ｉ＝Ａ・ｅｘｐ（−２ｔ^２／ａ^２） …（１２）
であると仮定できるときには、有意な光強度のプロファイル（バックグラウンドでないと明らかに判断できるプロファイル）に対して式（１２）をフィッティングして算出された強度Ａ及び幅ａが所定の範囲内にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されてよい。（強度Ａ及び幅ａが所定の範囲外にある信号は、ノイズ又は異物の信号として判定され、その後の分析等に於いて無視されてよい。）

しかしながら、既に述べた如く、そもそも、時系列光強度データに見出される信号からノイズの信号を除去するための閾値Ｉｔｈを決定するためには、ノイズの信号の強度を把握する必要がある。そこで、本発明の光分析技術に於いては、まず、図２（Ｃ）〜（Ｅ）に関連した説明に於いて記載されている如く、時系列光強度データの信号から信号発生頻度積算値分布を調製し、その分布に基づいて、閾値Ｉｔｈが決定される。しかる後、時系列光強度データに見出される信号のうち、閾値Ｉｔｈ以上の強度を有する信号が発光粒子の信号として抽出される。

時系列光強度データ上の信号の検出の処理の一つの例に於いては、まず、時系列光強度データ（図４（Ｃ）、最上段「検出結果（未処理）」）に対して、スムージング（平滑化）処理が為される（図３（Ａ）−ステップ１１０、図４（Ｃ）中上段「スムージング」）。発光粒子の発する光は確率的に放出されるものであり、微小な時間に於いてデータ値の欠落が生じ得るため、かかるスムージング処理によって、前記の如きデータ値の欠落を無視できることとなる。スムージング処理は、例えば、移動平均法により為されてよい。なお、スムージング処理を実行する際のパラメータ、例えば、移動平均法に於いて一度に平均するデータ点数や移動平均の回数など、は、光強度データ取得時の光検出領域の位置の移動速度（走査速度）、ＢＩＮ ＴＩＭＥに応じて適宜設定されてよい。

次いで、スムージング処理後の時系列光強度データに於いて、有意なパルス状の信号（以下、「パルス信号」と称する。）が存在する時間領域（パルス存在領域）を検出するために、スムージング処理後の時系列光強度データの時間についての一次微分値が演算される（ステップ１２０）。時系列光強度データの時間微分値は、図４（Ｃ）中下段「時間微分」に例示されている如く、信号値の変化時点に於ける値の変化が大きくなるので、かかる時間微分値を参照することによって、有意な信号の始点と終点を有利に決定することができる。

しかる後、時系列光強度データ上に於いて、逐次的に、有意なパルス信号が検出される（ステップ１３０〜１６０）。具体的には、まず、時系列光強度データの時系列の時間微分値データ上にて、逐次的に時間微分値を参照して、一つのパルス信号の始点と終点とが探索され決定され、パルス存在領域が特定される（ステップ１３０）。一つのパルス存在領域が特定されると、そのパルス存在領域に於けるスムージングされた時系列光強度データに対して、釣鐘型関数のフィッティングが行われ（図４（Ｃ）下段「釣鐘型関数フィッティング」）、釣鐘型関数のパルスのピーク（最大値）の強度Ｉpeak、パルス幅（半値全幅）Ｗpeak、フィッティングに於ける（最小二乗法の）相関係数等のパラメータが算出される（ステップ１４０）。なお、フィッティングされる釣鐘型関数は、典型的には、ガウス関数であるが、ローレンツ型関数であってもよい。

そして、算出されたパルスのピーク強度、パルス幅、相関係数等のパラメータが、それぞれ、所定範囲内にあるか否かが判定され、釣鐘型関数の各パラメータが所定範囲内にある信号が検出される（ステップ１５０）。ここに於いて、パルスのピーク強度、パルス幅、相関係数についての所定範囲は、基本的には、一つの発光粒子が光検出領域を通過したときに検出されるパルス信号が描く釣鐘型のプロファイルのパラメータについて想定される範囲に設定され、これにより、時系列光強度データから発光粒子の信号と想定される信号が検出されることとなる。しかしながら、既に述べた如く、ノイズ信号を排除するための明確な基準は、この段階に於いて判明していない。従って、このステップに於いて、パルスのピーク強度に対する閾値として、適宜設定されてよい仮値が用いられ（仮値は、ノイズ信号強度の最大値よりも低いと予想される任意の値であってよい。）、かかる仮の閾値以上の信号が抽出される。かくして、図５左に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが一つの発光粒子に対応する信号に於いて想定されるものと仮に設定された範囲内にあると判定された信号が、一つの発光粒子に対応する信号であると仮に判定される。一方、図５右に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが想定される範囲内になかったパルス信号は、ノイズとして無視される。

上記のステップ１３０〜１５０の処理に於けるパルス信号の探索及び判定は、時系列光強度データの全域に渡って繰り返し実行される（ステップ１６０）。また、時系列光強度データから発光粒子の信号として仮に判定される信号を個別に検出する処理は、上記の手順に限らず、任意の手法により実行されてよい。

（ii）閾値の決定
上記のステップ１３０〜１６０の処理により、時系列光強度データ上に於いてパルス信号が検出されると、その信号発生頻度積算値分布に基づいて、ノイズを実質的に排除した状態での発光粒子の信号の抽出のための真の閾値が決定される。具体的には、まず、時系列光強度データ上にて検出されたパルス信号についての信号発生頻度積算値分布の調製が為される（ステップ２００）。即ち、光強度Ｉ毎にその光強度Ｉ以上の強度を有する信号数Ｐ（Ｉ）が計数される。しかる後、信号数Ｐ（Ｉ）の平方根又はそれから式（３）を用いて算出される最大強度点からの放射方向距離（半径）ｒ（ただし、半径ｒは、発光粒子濃度ｃが既知の場合のみ算定可能である。）に対する光強度Ｉの分布が調製される（ステップ２１０−図６（Ａ）参照。）。ここに於いて、信号発生頻度積算値分布、或いは、信号数Ｐ（Ｉ）の平方根又はそれから算出される半径ｒに対する光強度Ｉの分布は、コンピュータ１８の表示装置の画面上に表示され、装置の使用者に、信号発生頻度積算値分布及び／又は信号数Ｐ（Ｉ）の平方根若しくは最大強度点からの半径ｒに対する光強度Ｉの分布が容易に視覚的に把握できるようになっていてよい。しかる後、信号発生頻度積算値分布及び／又は信号数Ｐ（Ｉ）の平方根若しくは最大強度点からの半径ｒに対する光強度Ｉの分布を参照して、ノイズ信号を排除して発光粒子の信号の抽出を行うための閾値の決定が為される。閾値の決定の手法としては、例えば、下記のいずれかにより為されてよい。

最も簡単には、表示装置の画面上に表示された信号数Ｐ（Ｉ）の平方根若しくは最大強度点からの半径ｒに対する光強度Ｉの分布及び／又は信号発生頻度積算値分布を装置の使用者が参照して、分布の形状から、適宜、閾値を設定するようになっていてよい（分布形状の判定）。既に述べた如く、信号数Ｐ（Ｉ）の平方根若しくは最大強度点からの半径ｒに対する光強度Ｉの分布又は信号発生頻度積算値分布に於いて、その形状は、ノイズが混在する強度範囲の境界（ノイズ信号強度の上限）にて不連続的に屈曲する（図２（Ｅ）細実線参照）。従って、表示された分布上で、不連続的に屈曲する個所を特定して、その個所の強度値が閾値として設定されてよい。そのために、コンピュータ１８は、表示装置の画面上に於いて、分布図と重ねて、カーソル等を表示し、装置の使用者がカーソルを画面上で移動しながら、分布上の任意の点の光強度値Ｉ、信号数Ｐ（Ｉ）の平方根若しくは半径ｒの値を知ることができるよう構成されていてよい。

閾値の決定の手法の別の例としては、信号数Ｐ（Ｉ）の平方根又は最大強度点からの半径ｒに対する光強度Ｉの分布に対して式（５）又は（８）、或いは式（１）又は（６）の釣鐘型関数のフィッティングが行われるか、信号発生頻度積算値分布に対して式（４）或いは（７）の釣鐘型関数のフィッティングが行われる。そして、光強度Ｉ毎のフィッティングに於ける残差（フィッティング誤差）が大きい領域（通常、光強度Ｉの低い領域）には、ノイズ領域が混在していると判断できるので、許容可能なフィッティング誤差を与える領域の境界（ノイズ信号強度の上限に相当する）に於ける光強度Ｉが閾値として設定される。かかる処理について、釣鐘型関数のフィッティングとフィッティング誤差の算出は、コンピュータ１８に於いて所定のプログラムに従った作動により、例えば最小自乗法を用いて、実行されてよい。フィッティングされた釣鐘型関数、フィッティング誤差の分布は、表示装置の画面上に表示され、装置の使用者がそれらを視覚的に把握できるようになっていてよい。許容可能なフィッティング誤差を与える領域の境界は、コンピュータ１８の所定のプログラムによる作動により自動的に決定されてもよく、表示装置の画面上のフィッティング誤差の分布を参照して装置の使用者が適宜設定できるようになっていてもよい。

閾値の決定の手法の更に別の例としては、信号数Ｐ（Ｉ）の平方根又は最大強度点からの半径ｒに対する光強度Ｉの分布の信号数Ｐ（Ｉ）の平方根又は半径ｒに対する光強度Ｉの傾きを参照して閾値が決定されてよい。図２（Ｅ）の細実線を参照して理解される如く、信号数Ｐ（Ｉ）の平方根又は最大強度点からの半径ｒに対する光強度Ｉの分布に於いて、その形状は、ノイズが混在する強度範囲の境界にて不連続的に屈曲するので、信号数Ｐ（Ｉ）の平方根又は半径ｒに対する光強度Ｉの傾きを参照して、その値が不連続的に変化する点の光強度Ｉがノイズ強度の上限であると推定される。かくして、かかる光強度Ｉの分布に於いて、信号数Ｐ（Ｉ）の平方根又は半径ｒに対する光強度Ｉの傾きを算出し、その傾きが不連続的に変化する点の光強度Ｉが閾値として設定されてよい。なお、図示していないが、信号数Ｐ（Ｉ）の平方根又は半径ｒに対する光強度Ｉの傾きの変化もグラフ形式にて表示装置の画面上に表示され、その表示された光強度Ｉの傾きの変化のグラフを参照して、装置の使用者が閾値を適宜設定できるようになっていてよい。また、閾値は、コンピュータ１８の所定のプログラムによる作動により自動的に決定されてもよい。

（iii）発光粒子の信号の抽出
かくして、光強度Ｉに対する閾値が、上記のいずれかの手法により決定されると、ステップ１１０〜１６０の処理により時系列光強度データから検出された信号の群のうち、前記の決定された閾値以上のピーク強度を有する信号が発光粒子の信号として抽出され（ステップ２３０）、これにより、単一の発光粒子が個別に検出されたこととなる。なお、かかる抽出処理と共に、抽出された信号の数が発光粒子の信号として計数されてよい。

なお、複数の試料溶液について走査分子計数法による計測を行う場合、測定条件が同一であれば、ノイズの発生状況は実質的に同一であると考えられるので、一旦、或る試料溶液について決定された閾値は、他の試料溶液についての時系列光強度データから発光粒子の信号を検出する際に利用されてよい。その場合には、ステップ１５０に於ける信号検出に於いて、上記の如く決定された真の閾値が用いられることにより、ノイズ信号を排除した状態での発光粒子の信号の検出が達成されることとなる。

（iv）発光粒子濃度の決定
時系列光強度データに於ける発光粒子の数密度又は濃度は、発光粒子の信号の数と、時系列光強度データの取得の間に光検出領域の通過した領域の総体積を用いて決定可能である。しかしながら、光検出領域の実効体積は、励起光又は検出光の波長、レンズの開口数、光学系の調整状態に依存して変動するため、設計値から算定することは、一般に困難であり、従って、光検出領域の通過した領域の総体積を算定することも簡単ではない。また、既に触れたように、閾値の設定によって光検出領域内に於ける検出対象となる領域が変化するので、かかる領域の総体積を理論的に算定することは困難である。そこで、典型的には、発光粒子の濃度が既知の溶液（参照溶液）について、検査されるべき試料溶液の測定と同様の条件にて、上記に説明した光強度の測定、粒子の検出及びカウンティングを行い、検出された発光粒子の数と参照溶液の発光粒子の濃度とから、光検出領域の通過した領域のうちの検出対象となる領域の総体積、即ち、発光粒子の検出数と濃度との関係が決定されるようになっていてよい。参照溶液の発光粒子としては、好ましくは、各発光粒子と同様の波長特性を有する発光標識（蛍光色素等）であってよい。具体的には、例えば、発光粒子の濃度（数密度）Ｃの参照溶液について、その発光粒子の検出数がＮであったとすると、検出対象となる領域の通過した領域の総体積Ｖｔは、
Ｖｔ＝Ｎ／Ｃ …（１３）
により与えられる。また、参照溶液として、複数の異なる濃度の溶液が準備され、それぞれについて測定が実行されて、算出されたＶｔの平均値が光検出領域のうちの検出対象となる領域の通過した領域の総体積Ｖｔとして採用されるようになっていてよい。そして、Ｖｔが与えられると、粒子のカウンティング結果がｎの試料溶液の発光粒子の濃度（数密度）ｃは、
ｃ＝ｎ／Ｖｔ …（１４）
により与えられる。なお、光検出領域の体積、光検出領域の通過した領域の総体積は、上記の方法によらず、任意の方法にて、例えば、ＦＣＳ、ＦＩＤＡを利用するなどして与えられるようになっていてよい。また、本実施形態の光分析装置に於いては、想定される光検出領域の移動パターンについて、種々の標準的な粒子についての濃度Ｃと粒子の数Ｎとの関係（式（１３））の情報をコンピュータ１８の記憶装置に予め記憶しておき、装置の使用者が光分析を実施する際に適宜記憶された関係の情報を利用できるようになっていてよい。

かくして、上記の本発明によれば、走査分子計数法に於いて光強度データからノイズ信号を排除した状態での発光粒子の信号の検出のための基準、即ち、発光粒子の信号として抽出されるべき時系列の光強度データ上の信号の光強度範囲又は閾値が、信号発生頻度積分値分布に基づいて、効率的に決定可能となる。このことにより、ノイズ信号を排除した検出結果を得るために要する労力及び時間が短縮され、検出結果の精度の向上が期待される。

上記に説明した本発明の有効性を検証するために、以下の如き実験を行った。なお、以下の実施例は、本発明の有効性を例示するものであって、本発明の範囲を限定するものではないことは理解されるべきである。

走査分子計数法による光測定により得られた時系列光強度データから、ノイズ信号を実質的に排除して発光粒子の信号を検出するための閾値が、信号発生頻度積分値分布に基づいて設定可能であることを検証した。

試料溶液として、リン酸緩衝液（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含む）中に、発光粒子として蛍光色素ＡＴＴＯ６３３(Sigma-Aldrich, Cat. No. 18620)を、１ｆＭ、１０ｆＭ、１００ｆＭにて、含む溶液をそれぞれ調製した。光の測定に於いては、光分析装置として、共焦点蛍光顕微鏡の光学系とフォトンカウンティングシステムを備えた１分子蛍光測定装置ＭＦ２０（オリンパス株式会社）を用い、上記の「（２）試料溶液の光強度の測定」にて説明した態様に従って、上記の各試料溶液について、時系列光強度データ（フォトンカウントデータ）を取得した。その際、励起光は、６３３ｎｍのレーザー光を用い、バンドパスフィルターを用いて、６６０−７１０ｎｍの波長帯域の光を測定し、時系列光強度データを生成した。試料溶液中に於ける光検出領域の位置の移動速度は、２２．５ｍｍ／秒とし、ＢＩＮ ＴＩＭＥを１０μ秒とし、各試料溶液について２０秒間の測定を行った。光強度の測定後、上記の「（３）（ｉ）時系列光強度データ上に於ける信号の検出」に記載された処理手順に従って、各試料溶液について取得された時系列光強度データにスムージング処理を施し、スムージングされたデータに於いて、パルス信号の始点及び終点を決定した後、各パルス信号にガウス関数を最小自乗法によりフィッティングして、（ガウス関数に於ける）ピーク強度、パルス幅（半値全幅）、相関係数を決定した。

そして、下記の条件:
２０μ秒＜パルス幅＜４００μ秒
ピーク強度＞１［ｐｃ／１０μｓ］ …（Ａ）
相関係数＞０．９５
を満たすパルス信号のみを抽出した。次いで、光強度Ｉ毎に、光強度Ｉを超える強度を有する信号数を計数し（信号発生頻度積算値分布の調製）、しかる後、信号数の平方根に対する光強度Ｉの分布を調製し、更に、信号数の平方根に対する光強度Ｉの分布に対して、式（８）をフィッティングした。

図６（Ａ）は、発光粒子濃度１ｆＭの試料溶液について得られた時系列光強度データから調製した信号数の平方根に対する光強度Ｉの分布とフィッティング曲線とを示している。同図に於いて、実際のデータは、右半分のみであり、左半分は、フィッティングのために、右半分のデータの信号数の平方根の符号を反転して調製されたプロットである。なお、フォトン数に小数点以下の表示が現れるのは、フォトンカウントデータをスムージングするためである。即ち、フォトンカウント値は、スムージング処理によって連続的な値として扱われる。

同図を参照して、図２（Ｅ）に関連した説明から予想される如く、光強度Ｉが約２以上に於いては、光強度Ｉのプロットは、フィッティング曲線に良好に一致し、光強度Ｉが約２を下回ると、光強度Ｉのプロットは、フィッティング曲線から逸脱して外方に拡大した。このことは、光強度Ｉが約２よりも低い光強度範囲では、ノイズ信号が混在していることを示唆している。また、図６（Ｂ）に示されている如く、フィッティング誤差として、信号数の平方根に対する図６（Ａ）の光強度Ｉのプロットとフィッティング曲線との差分（プロットの光強度Ｉ−フィッティング曲線の光強度Ｉ）の二乗値（残差の二乗値）の分布を調製した。そして、同図に於いて、フィッティング誤差が１以下となる信号数の平方根は、３．１６であり、信号数の平方根＝３．１６に於ける光強度Ｉは、図６（Ａ）に於いて、２であった。かくして、図６（Ａ）の時系列光強度データに於いて、ノイズ信号の上限は、２であり、かかる値を閾値として発光粒子の信号を抽出すると、ノイズ信号を排除した結果が得られることとなる。

図７（Ａ）は、閾値を２に設定して、各試料溶液について取得された時系列光強度データから抽出された発光粒子の信号数を各濃度に対してプロットした図である。同図から理解される如く、発光粒子の信号数は、試料溶液中の発光粒子濃度に比例して増大し、濃度に対する発光粒子の信号数の最小自乗法による近似直線に良好に一致した（相関係数Ｒ^２は、０．９６２４であった。）。

更に、上記に於いて設定された閾値の妥当性を検証するために、各試料溶液について、閾値を変更して時系列光強度データから抽出された信号数を計数した後、各濃度に対する発光粒子の信号数に対して最小自乗法による直線近似を実行し、近似直線の傾きと相関係数Ｒ^２とを算定した。図７（Ｂ）は、閾値に対して、近似直線の傾きと相関係数Ｒ^２とをプロットした図である。同図を参照して、相関係数Ｒ^２は、閾値が小さいときには小さく、閾値が２以上にて０．９付近で飽和した。このことは、閾値が小さいほど、時系列光強度データから抽出された信号数に於けるノイズ信号の割合が高く、閾値が２以上にて実質的に、ノイズ信号が排除されていることを示唆している。また、近似直線の傾きについて、その値は、閾値が増大するほど、低下した。これは、閾値が増大すると、光検出領域内の検出対象となる領域が縮小し、発光粒子の信号の検出数が低下するためである。濃度に対する発光粒子の信号数を検出する場合、発光粒子の信号数は多いほど、濃度に対する発光粒子の信号数の比の精度が向上する。従って、本実施例に於いて、相関係数Ｒ^２の値が飽和し始める閾値である２が最適であるということができる。

かくして、上記の実施例の結果から理解される如く、上記の本発明の教示に従って、走査分子計数法に於いて発光粒子の信号の検出のための基準である閾値が、信号発生頻度積算値分布を利用して、効率的に設定可能であることが示された。本発明によれば、閾値の設定のための試行錯誤、即ち、種々閾値を変更しながら発光粒子の信号の検出を繰り返すといった操作処理を行う必要がなくなるので、走査分子計数法のデータ処理の労力及び時間が短縮され、また、結果の精度が向上されることが期待される。また、これにより、走査分子計数法の利用範囲の拡大が期待される。

Claims (32)

1. 共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析装置であって、
   前記光学系の光路を変更することにより前記試料溶液内に於ける前記光学系の光検出領域の位置を移動する光検出領域移動部と、
   前記光検出領域からの光を検出する光検出部と、
   前記試料溶液内に於いて前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出部にて検出された前記光検出領域からの光の時系列の光強度データを生成し、前記時系列の光強度データに於いて前記発光粒子の各々からの信号を個別に検出する信号処理部とを含み、
   前記信号処理部が、前記時系列の光強度データに於いて検出された信号の群から、前記発光粒子の信号として、前記時系列の光強度データに於いて検出された信号の強度を変数として該変数以上の強度を有する前記信号の発生頻度の積算値の分布である信号発生頻度積算値分布に基づいて設定された光強度範囲内の光強度を有する信号を抽出することにより前記発光粒子の各々からの信号を検出することを特徴とする装置。
2. 請求項１の装置であって、前記信号処理部が、前記信号発生頻度積算値分布に基づいて決定される閾値を上回る強度を有する前記時系列の光強度データ上の信号を、前記発光粒子の信号として抽出することを特徴とする装置。
3. 請求項１の装置であって、前記信号発生頻度積算値分布に基づいて設定された光強度範囲が、前記信号発生頻度積算値分布に基づいて決定される前記光検出領域内の位置に対する信号の強度分布が前記光検出領域内に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度分布に実質的に合致している光強度範囲であることを特徴とする装置。
4. 請求項１の装置であって、前記信号処理部が、前記信号発生頻度積算値分布に基づいて前記時系列の光強度データに於けるノイズ強度の上限を決定可能であることを特徴とする装置。
5. 請求項１の装置であって、前記信号処理部が、前記信号発生頻度積算値分布に基づいて決定される前記光検出領域内の位置の関数値に対する前記信号の強度の分布及び／又は前記信号発生頻度積算値分布を表示可能な表示部を有していることを特徴とする装置。
6. 請求項５の装置であって、前記表示部に於いて表示された前記光検出領域内の位置の関数値に対する前記信号の強度の分布又は前記信号発生頻度積算値分布上にて、前記発光粒子の信号として抽出されるべき前記時系列の光強度データ上の信号の前記光強度範囲を、前記装置の使用者が設定可能であることを特徴とする装置。
7. 請求項１の装置であって、前記発光粒子の信号として抽出されるべき前記時系列の光強度データ上の信号の前記光強度範囲が、前記信号発生頻度積算値分布に基づいて決定される前記光検出領域内の位置の関数値に対する前記信号の強度の分布に対して釣鐘型関数をフィッティングしたときのフィッティング誤差に基づいて設定可能であることを特徴とする装置。
8. 請求項１の装置であって、前記発光粒子の信号として抽出されるべき前記時系列の光強度データ上の信号の前記光強度範囲が、前記信号発生頻度積算値分布に基づいて決定される前記光検出領域内の位置の関数値に対する前記信号の強度の分布の形状に基づいて又は前記信号発生頻度積算値分布の形状に基づいて設定可能であることを特徴とする装置。
9. 請求項１の装置であって、前記発光粒子の信号として抽出されるべき前記時系列の光強度データ上の信号の前記光強度範囲が、前記信号発生頻度積算値分布に基づいて決定される前記光検出領域内の位置の関数値に対する前記信号の強度の分布に於ける前記位置の関数値に対する前記信号の強度の傾きに基づいて設定可能であることを特徴とする装置。
10. 請求項１乃至９のいずれかの装置であって、前記光検出領域移動部が前記発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて前記光検出領域の位置を移動することを特徴とする装置。
11. 請求項１乃至１０のいずれかの装置であって、前記信号処理部が前記検出された発光粒子の数に基づいて、前記試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度を決定することを特徴とする装置。
12. 共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析方法であって、
    前記光学系の光路を変更することにより前記試料溶液内に於いて前記光学系の光検出領域の位置を移動する過程と、
    前記試料溶液内に於いて前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出領域からの光の強度を測定して時系列の光強度データを生成する過程と、
    前記時系列の光強度データ上に於いて発光粒子の光を表す信号を個別に検出する過程とを含み、
    前記発光粒子の光を表す信号を個別に検出する過程に於いて、前記時系列の光強度データに於いて検出された信号の群から、前記発光粒子の信号として、前記時系列の光強度データに於いて検出された信号の強度を変数として該変数以上の強度を有する前記信号の発生頻度の積算値の分布である信号発生頻度積算値分布に基づいて設定された光強度範囲内の光強度を有する信号を抽出することにより前記発光粒子の各々からの信号を検出することを特徴とする方法。
13. 請求項１２の方法であって、前記発光粒子の光を表す信号を個別に検出する過程に於いて、前記信号発生頻度積算値分布に基づいて決定される閾値を上回る強度を有する前記時系列の光強度データ上の信号を、前記発光粒子の信号として抽出することを特徴とする方法。
14. 請求項１２の方法であって、前記信号発生頻度積算値分布に基づいて設定された光強度範囲が、前記信号発生頻度積算値分布に基づいて決定される前記光検出領域内の位置に対する信号の強度分布が前記光検出領域内に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度分布に実質的に合致している光強度範囲であることを特徴とする方法。
15. 請求項１２の方法であって、前記発光粒子の光を表す信号を個別に検出する過程に於いて、前記信号発生頻度積算値分布に基づいて前記時系列の光強度データに於けるノイズ強度の上限を決定することを特徴とする方法。
16. 請求項１２の方法であって、前記発光粒子の光を表す信号を個別に検出する過程に於いて、表示装置上に表示された前記光検出領域内の位置の関数値に対する前記信号の強度の分布又は前記信号発生頻度積算値分布上にて、前記発光粒子の信号として抽出されるべき前記時系列の光強度データ上の信号の前記光強度範囲を設定することを特徴とする方法。
17. 請求項１２の方法であって、前記発光粒子の光を表す信号を個別に検出する過程に於いて、前記発光粒子の信号として抽出されるべき前記時系列の光強度データ上の信号の前記光強度範囲が、前記信号発生頻度積算値分布に基づいて決定される前記光検出領域内の位置の関数値に対する前記信号の強度の分布に対して釣鐘型関数をフィッティングしたときのフィッティング誤差に基づいて設定されることを特徴とする方法。
18. 請求項１２の方法であって、前記発光粒子の光を表す信号を個別に検出する過程に於いて、前記発光粒子の信号として抽出されるべき前記時系列の光強度データ上の信号の前記光強度範囲が、前記信号発生頻度積算値分布に基づいて決定される前記光検出領域内の位置の関数値に対する前記信号の強度の分布の形状に基づいて又は前記信号発生頻度積算値分布の形状に基づいて設定されることを特徴とする方法。
19. 請求項１２の方法であって、前記発光粒子の光を表す信号を個別に検出する過程に於いて、前記発光粒子の信号として抽出されるべき前記時系列の光強度データ上の信号の前記光強度範囲が、前記信号発生頻度積算値分布に基づいて決定される前記光検出領域内の位置の関数値に対する前記信号の強度の分布に於ける前記位置の関数値に対する前記信号の強度の傾きに基づいて設定されることを特徴とする方法。
20. 請求項１２乃至１９のいずれかの方法であって、前記光検出領域の位置が前記試料溶液中の発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動されることを特徴とする方法。
21. 請求項１２乃至２０のいずれかの方法であって、更に、前記検出された発光粒子の数に基づいて、該発光粒子の数密度又は濃度を決定する過程を含むことを特徴とする方法。
22. 共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出するための光分析用コンピュータプログラムであって、
    前記光学系の光路を変更することにより前記試料溶液内に於ける前記光学系の光検出領域の位置を移動する手順と、
    前記試料溶液内に於ける前記光検出領域の位置の移動中に前記光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する手順と、
    前記時系列の光強度データに於いて個々の発光粒子からの信号を個別に検出する手順にして、前記時系列の光強度データに於いて検出された信号の群から、前記発光粒子の信号として、前記時系列の光強度データに於いて検出された信号の強度を変数として該変数以上の強度を有する前記信号の発生頻度の積算値の分布である信号発生頻度積算値分布に基づいて設定された光強度範囲内の光強度を有する信号を抽出することにより前記発光粒子の各々からの信号を検出する手順と
    をコンピュータに実行させることを特徴とするコンピュータプログラム。
23. 請求項２２のコンピュータプログラムであって、前記個々の発光粒子からの信号を個別に検出する手順に於いて、前記信号発生頻度積算値分布に基づいて決定される閾値を上回る強度を有する前記時系列の光強度データ上の信号を、前記発光粒子の信号として抽出することを特徴とするコンピュータプログラム。
24. 請求項２２のコンピュータプログラムであって、前記信号発生頻度積算値分布に基づいて設定された光強度範囲が、前記信号発生頻度積算値分布に基づいて決定される前記光検出領域内の位置に対する信号の強度分布が前記光検出領域内に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度分布に実質的に合致している光強度範囲であることを特徴とするコンピュータプログラム。
25. 請求項２２のコンピュータプログラムであって、前記個々の発光粒子からの信号を個別に検出する手順に於いて、前記信号発生頻度積算値分布に基づいて前記時系列の光強度データに於けるノイズ強度の上限が決定されることを特徴とするコンピュータプログラム。
26. 請求項２２のコンピュータプログラムであって、更に、前記信号発生頻度積算値分布に基づいて決定される前記光検出領域内の位置の関数値に対する前記信号の強度の分布及び／又は前記信号発生頻度積算値分布を表示装置上に表示する手順をコンピュータに実行させることを特徴とするコンピュータプログラム。
27. 請求項２６のコンピュータプログラムであって、前記個々の発光粒子からの信号を個別に検出する手順に於いて、前記表示装置上に表示された前記光検出領域内の位置の関数値に対する前記信号の強度の分布又は前記信号発生頻度積算値分布上にて、前記発光粒子の信号として抽出されるべき前記時系列の光強度データ上の信号の前記光強度範囲が設定可能であることを特徴とするコンピュータプログラム。
28. 請求項２２のコンピュータプログラムであって、前記発光粒子の信号として抽出されるべき前記時系列の光強度データ上の信号の前記光強度範囲が、前記信号発生頻度積算値分布に基づいて決定される前記光検出領域内の位置の関数値に対する前記信号の強度の分布に対して釣鐘型関数をフィッティングしたときのフィッティング誤差に基づいて設定されることを特徴とするコンピュータプログラム。
29. 請求項２２のコンピュータプログラムであって、前記発光粒子の信号として抽出されるべき前記時系列の光強度データ上の信号の前記光強度範囲が、前記信号発生頻度積算値分布に基づいて決定される前記光検出領域内の位置の関数値に対する前記信号の強度の分布の形状に基づいて又は前記信号発生頻度積算値分布の形状に基づいて設定されることを特徴とするコンピュータプログラム。
30. 請求項２２のコンピュータプログラムであって、前記発光粒子の信号として抽出されるべき前記時系列の光強度データ上の信号の前記光強度範囲が、前記信号発生頻度積算値分布に基づいて決定される前記光検出領域内の位置の関数値に対する前記信号の強度の分布に於ける前記位置の関数値に対する前記信号の強度の傾きに基づいて設定されることを特徴とするコンピュータプログラム。
31. 請求項２２乃至３０のいずれかのコンピュータプログラムであって、前記光学系の光検出領域の位置を移動する手順に於いて、前記光検出領域の位置が前記発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動されることを特徴とするコンピュータプログラム。
32. 請求項２２乃至３１のいずれかのコンピュータプログラムであって、更に、前記検出された発光粒子の数に基づいて、前記試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度を決定する手順を含むことを特徴とするコンピュータプログラム。

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