JP2012150020A - 単一発光粒子からの光の検出を用いた光分析方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡による光計測を用いた走査分子計数法に於いて、試料溶液中に於いて明るさの異なる発光粒子が混在している場合に、それらの濃度又は存在比率を決定可能にすること。
【解決手段】本発明の発光粒子からの光を検出し分析する技術は、顕微鏡の光学系の光路を変更することにより試料溶液内に於いて光学系の光検出領域の位置を移動させながら、光検出領域からの光の強度を検出して、発光粒子の光の信号を個別に検出し、検出された発光粒子の光の信号の光強度の発生頻度分布に基づいて、試料溶液中に含まれる前記明るさの互いに異なる発光粒子のうちの少なくとも一つの濃度又は存在比率を決定することを特徴とする。
【選択図】図３

Description

本発明は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いて、溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はこれらの凝集体（以下、これらを「粒子」と称する。）、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の対象物、或いは、非生物学的な粒子からの光を検出して、それらの状態（相互作用、結合・解離状態など）の分析又は解析に於いて有用な情報を取得することが可能な光分析方法に係り、より詳細には、上記の如き光学系を用いて単一の発光する粒子からの光を個別に検出して種々の光分析を可能にする方法に係る。なお、本明細書に於いて、光を発する粒子（以下、「発光粒子」と称する。）は、それ自身が光を発する粒子、又は、任意の発光標識若しくは発光プローブが付加された粒子のいずれであってもよく、発光粒子から発せられる光は、蛍光、りん光、化学発光、生物発光、散乱光等であってよい。

近年の光計測技術の発展により、共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング（１光子検出）も可能な超高感度の光検出技術とを用いて、一光子又は蛍光一分子レベルの微弱光の検出・測定が可能となっている。そこで、そのような微弱光の計測技術を用いて、生体分子等の特性、分子間相互作用又は結合・解離反応の検出を行う装置又は方法が種々提案されている。例えば、蛍光相関分光分析（Fluorescence Correlation Spectroscopy：ＦＣＳ。例えば、特許文献１−３、非特許文献１−３参照）に於いては、レーザー共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術を用いて、試料溶液中の微小領域（顕微鏡のレーザー光が集光された焦点領域−コンフォーカル・ボリュームと称される。）内に出入りする蛍光分子又は蛍光標識された分子（蛍光分子等）からの蛍光強度の測定が為され、その測定された蛍光強度の自己相関関数の値から決定される微小領域内に於ける蛍光分子等の平均の滞留時間（並進拡散時間）及び滞留する分子の数の平均値に基づいて、蛍光分子等の運動の速さ又は大きさ、濃度といった情報の取得、或いは、分子の構造又は大きさの変化や分子の結合・解離反応又は分散・凝集といった種々の現象の検出が為される。また、蛍光強度分布分析(Fluorescence-Intensity Distribution Analysis：ＦＩＤＡ。例えば、特許文献４、非特許文献４)やフォトンカウンティングヒストグラム（Photon Counting Histogram：ＰＣＨ。例えば、特許文献５）では、ＦＣＳと同様に計測されるコンフォーカル・ボリューム内に出入りする蛍光分子等の蛍光強度のヒストグラムが生成され、そのヒストグラムの分布に対して統計的なモデル式をフィッティングすることにより、蛍光分子等の固有の明るさの平均値とコンフォーカル・ボリューム内に滞留する分子の数の平均値が算定され、これらの情報に基づいて、分子の構造又は大きさの変化、結合・解離状態、分散・凝集状態などが推定されることとなる。またその他に、特許文献６、７に於いては、共焦点顕微鏡の光学系を用いて計測される試料溶液の蛍光信号の時間経過に基づいて蛍光性物質を検出する方法が提案されている。特許文献８は、フローサイトメータに於いて流通させられた蛍光微粒子又は基板上に固定された蛍光微粒子からの微弱光をフォトンカウンティング技術を用いて計測してフロー中又は基板上の蛍光微粒子の存在を検出するための信号演算処理技術を提案している。

特に、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術とを用いた微小領域の蛍光測定技術を用いた方法によれば、測定に必要な試料は、従前に比して極めて低濃度且微量でよく（一回の測定で使用される量は、たかだか数十μＬ程度）、測定時間も大幅に短縮される（一回の測定で秒オーダーの時間の計測が数回繰り返される。）。従って、これらの技術は、特に、医学・生物学の研究開発の分野でしばしば使用される希少な或いは高価な試料についての分析を行う場合や、病気の臨床診断や生理活性物質のスクリーニングなど、検体数が多い場合に、従前の生化学的方法に比して、低廉に、或いは、迅速に実験又は検査が実行できる強力なツールとなることが期待されている。

特開２００５−０９８８７６ 特開２００８−２９２３７１ 特開２００９−２８１８３１ 特許第４０２３５２３号 国際公開２００８−０８０４１７ 特開２００７−２０５６５ 特開２００８−１１６４４０ 特開平４−３３７４４６号公報

金城政孝、蛋白質 核酸 酵素 Vol.４４、No.９、１４３１−１４３８頁 １９９９年 エフ・ジェイ・メイヤー・アルムス（F.J.Meyer-Alms）、フルオレセンス・コリレーション・スペクトロスコピー（Fluorescence Correlation Spectroscopy）、アール・リグラー編（R.Rigler）、スプリンガー（Springer）、ベルリン、２０００年、２０４−２２４頁 加藤則子外４名、遺伝子医学、Vol.６、No.２、２７１−２７７頁 カスク他３名、米国科学アカデミー紀要 １９９９年、９６巻、13756‐13761頁（P. Kask, K. Palo, D. Ullmann, K. Gall PNAS 96, 13756-13761 (1999)）

上記のＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術を用いた光分析技術では、計測される光は、蛍光一分子又は数分子から発せられた光であるが、その光の解析に於いて、時系列に測定された蛍光強度データの自己相関関数の演算又はヒストグラムに対するフィッティングといった蛍光強度のゆらぎの算出等の統計的処理が実行され、個々の蛍光分子等からの光の信号を個別に参照又は分析するわけではない。即ち、これらの光分析技術に於いては、複数の蛍光分子等からの光の信号が統計的に処理され、蛍光分子等について統計平均的な特性が検出されることとなる。従って、これらの光分析技術に於いて統計的に有意な結果を得るためには、試料溶液中の観測対象となる蛍光分子等の濃度又は数密度は、平衡状態に於いて、一回の秒オーダーの長さの計測時間のうちに統計的処理が可能な数の蛍光分子等が微小領域内を入出するレベル、好適には、微小領域内に常に一個程度の蛍光分子等が存在しているレベルである必要がある。実際、コンフォーカル・ボリュームの体積は、１ｆＬ程度となるので、上記の光分析技術に於いて使用される試料溶液中の蛍光分子等の濃度は、典型的には、１ｎＭ程度若しくはそれ以上であり、１ｎＭを大幅に下回るときには、蛍光分子等がコンフォーカル・ボリューム内に存在しない時間が生じて統計的に有意な分析結果が得られないこととなる。一方、特許文献６〜８に記載の蛍光分子等の検出方法では、蛍光強度のゆらぎの統計的演算処理が含まれておらず、試料溶液中の蛍光分子等が１ｎＭ未満であっても蛍光分子等の検出が可能であるが、溶液中でランダムに運動している蛍光分子等の濃度又は数密度を定量的に算出するといったことは達成されていない。

そこで、本願出願人は、特願２０１０−０４４７１４に於いて、観測対象となる発光粒子の濃度又は数密度が、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の統計的処理を含む光分析技術で取り扱われるレベルよりも低い試料溶液中の発光粒子の状態又は特性を定量的に観測することを可能にする新規な原理に基づく光分析技術を提案した。かかる新規な光分析技術に於いては、端的に述べれば、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等と同様に共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いるところ、試料溶液内に於いて光の検出領域である微小領域（以下、「光検出領域」と称する。）の位置を移動させながら、即ち、光検出領域により試料溶液内を走査しながら、光検出領域が試料溶液中に分散してランダムに運動する発光粒子を包含したときに、その発光粒子から発せられる光を検出し、これにより、試料溶液中の発光粒子の一つ一つを個別に検出して、発光粒子のカウンティングや試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度に関する情報の取得を可能にする。この新規な光分析技術（以下、「走査分子計数法」と称する。）によれば、測定に必要な試料がＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の光分析技術と同様に微量（例えば、数十μＬ程度）であってもよく、また、測定時間が短く、しかも、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の光分析技術の場合に比して、より低い濃度又は数密度の発光粒子の存在を検出し、その濃度、数密度又はその他の特性を定量的に検出することが可能となる。

ところで、一般に、或る試料溶液中に明るさの互いに異なる発光粒子（同一の条件下での観測に於いて発光強度が互いに異なる発光粒子）が混在している場合、かかる明るさの互いに異なる発光粒子の濃度又は存在比率（濃度比、数密度比）を決定できると、種々の分析が可能となり、有利である。例えば、種々の分子の任意の反応の前後に於けるそれらの分子の濃度又は存在比率が分かれば、反応のし易さに関する情報が得られる（Ｂ／Ｆ分離）。また、試料溶液中に観測対象となる発光粒子（観測対象粒子）の他に種々の発光粒子が含まれている場合に、観測対象粒子の濃度又は存在比率が特定できれば、観測対象粒子以外の発光粒子の影響を排除して、観測対象粒子に関する情報（濃度若しくは数密度又はそれらの変化など）の抽出が可能となるであろう（バックグラウンドの除去）。

かくして、本発明の一つの課題は、上記の「走査分子計数法」を更に発展させ、試料溶液中に於いて明るさの異なる発光粒子が混在している場合に、かかる明るさの異なる発光粒子の濃度又は存在比率（濃度比、数密度比）を決定可能にする新規な方法を提供することである。

この点に関し、本発明の発明者は、「走査分子計数法」に於いて観測される或る明るさの発光粒子の光強度の発生頻度分布が、その発光粒子に固有のプロファイルを有し、試料溶液中に明るさの異なる発光粒子が混在する場合には、かかる光強度の発生頻度分布がそれらの濃度又は存在比率に依存して変化することを見出した。後により詳細に述べる如く、「走査分子計数法」で利用する共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の焦点領域、即ち、「光検出領域」に於ける単一の発光粒子から放出され光検出器まで到達する光の強度は、光検出領域内での発光粒子の位置によって異なっており、典型的には、発光粒子の位置が光検出領域の略中心領域に在るときに光強度は最大となり（以下、光検出領域内に於ける発光粒子の光強度が最大となる位置を「最大強度点」と称する。）、発光粒子の位置が光検出領域の周縁へ近づくほど、光強度は徐々に低減する。即ち、光検出領域内に於いて或る発光粒子から放出され検出される光強度の分布は、最大強度点から周縁に向かって強度が低減する略釣鐘状のプロファイルを有する分布となる。そして、発光粒子の検出される光強度の発生頻度分布は、光検出領域内に於いて発光粒子から放出され検出される光の強度分布によって決定されるところ、光検出領域内に於いて発光粒子から放出され検出される光の強度分布の最大強度点における強度値や分布の幅は、発光粒子の明るさによって異なる。従って、或る試料溶液を用いて「走査分子計数法」により観測される発光粒子の光強度の頻度分布のプロファイルは、その試料溶液中に含まれる発光粒子の明るさによって、或いは、その試料溶液中での明るさの互いに異なる発光粒子の濃度又は存在比率によって、変化することとなる。かかる知見は、本発明の構成に於いて、明るさの互いに異なる発光粒子の濃度又は存在比率を決定する際に利用される。

本発明によれば、上記の課題は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する明るさの互いに異なる発光粒子からの光を検出し分析する方法であって、顕微鏡の光学系の光路を変更することにより試料溶液内に於いて光学系の光検出領域の位置を移動する過程と、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動させながら光検出領域からの光の強度を測定して光強度データを生成する過程と、光強度データ上に於いて発光粒子の光を表す信号を個別に検出する過程と、個別に検出された発光粒子の光を表す信号の光強度の発生頻度分布に基づいて、試料溶液中に含まれる明るさの互いに異なる発光粒子のうちの少なくとも一つの濃度又は存在比率を決定する過程とを含むことを特徴とする方法によって達成される。

かかる本発明の構成に於いて、「試料溶液中にて分散しランダムに運動する」発光粒子とは、試料溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はそれらの凝集体などの、光を発する粒子であって、基板などに固定されず、溶液中を自由にブラウン運動している粒子であれば任意の粒子であってよい。かかる発光粒子は、典型的には、蛍光性粒子であるが、りん光、化学発光、生物発光、光散乱等により光を発する粒子であってもよい。特に、本発明に於いては、「明るさの互いに異なる発光粒子」、即ち、「同一の条件下での観測に於いて発光強度が互いに異なる発光粒子」が混在する試料溶液が観測の対象となる。また、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の「光検出領域」とは、それらの顕微鏡に於いて光が検出される微小領域であり、対物レンズから照明光が与えられる場合には、その照明光が集光された領域に相当する（共焦点顕微鏡に於いては、特に対物レンズとピンホールとの位置関係により確定される。発光粒子が照明光なしで発光する場合、例えば、化学発光又は生物発光により発光する粒子の場合には、顕微鏡に於いて照明光は要しない。）。なお、本明細書に於いて、「信号」という場合には、特に断らない限り、発光粒子からの光を表す信号を指すものとする。更に、「個別に検出された発光粒子の光を表す信号の光強度の発生頻度分布」とは、検出された発光粒子の光を表す信号に於ける光強度毎の信号数の分布（光強度を変数とするヒストグラム）、或いは、光強度を変数とした分布であって、かかる変数を超える光強度を有する信号の総数の分布（光強度毎の信号数の積算値の分布）であってよい。そして、「信号の光強度」とは、各信号のピーク強度、各信号に於ける強度の積算値などあってよい。

上記から理解される如く、本発明の基本的な構成である走査分子計数法に於いては、まず、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動しながら、即ち、試料溶液内を光検出領域により走査しながら、逐次的に、光の検出が行われる。そうすると、移動する光検出領域が、ランダムに運動している発光粒子を包含したときには、発光粒子からの光が検出され、これにより、一つの発光粒子の存在が検出されることが期待される。従って、逐次的に検出された光に於いて発光粒子からの光の信号を個別に検出して、これにより、粒子の存在を一つずつ個別に逐次的に検出し、粒子の溶液内での状態に関する種々の情報が取得されることとなる。その際、特に、明るさの互いに異なる発光粒子が試料溶液中に含まれている場合に、後述の実施形態の欄に於いてより詳細に記載されている如く、明るさの互いに異なる発光粒子の濃度及び存在比率は、発光粒子の光を表す信号の光強度の発生頻度分布に反映される。そこで、上記の本発明の方法に於いては、個別に検出された発光粒子の光を表す信号の光強度の発生頻度分布に基づいて、検出された発光粒子の全てのうちの明るさの互いに異なる発光粒子のうちの少なくとも一つの濃度又は存在比率が決定される。

なお、既に述べた如く、典型的には、光検出領域内に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度分布は、光検出領域内の最大強度点から光検出領域の周縁に向かって発光粒子から放出され検出される光の強度が低減する分布、即ち、発光粒子の位置が最大強度点から光検出領域の周縁へ近づくほど光強度が低減する分布である（特に、発光粒子が励起光を照射されることにより光を放出する粒子であり、光検出領域が励起光の集光領域により画定される場合には、光検出領域に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度分布は光検出領域内の励起光の強度分布と一致する。）。従って、好適には、発光粒子の光を表す信号の光強度の発生頻度分布に基づいて、明るさの互いに異なる発光粒子の濃度又は存在比率を決定する際には、上記の如き光検出領域内に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度分布が考慮される。

また、後述の実施形態の欄の説明から理解される如く、発光粒子の信号の光強度の発生頻度分布は、明るさの互いに異なる発光粒子の各々の濃度と光検出領域内に於ける単一の発光粒子から放出され光検出器まで到達する光の強度の分布関数とにより与えられる。従って、明るさの互いに異なる発光粒子のうちの少なくとも一つの濃度又は存在比率を決定する際には、光検出領域内に於ける単一の発光粒子から放出され光検出器まで到達する光の強度の分布関数の形及びそこに於けるパラメータの値が予め把握されていることが好ましい。かかる分布関数の形及びそのパラメータの値は、理論的に設計値等や観測対象となる発光粒子の特性から算出することも原理的には可能であるが、算出処理は、煩雑であり、必ずしも精度が高いとは言えない。一方、かかる分布関数の形及びそのパラメータの値は、濃度が既知の発光粒子の溶液を用いて「走査分子計数法」を実行して得られた結果から決定可能である。そこで、上記の本発明の構成に於いては、個別に検出された発光粒子の光を表す信号の光強度の発生頻度分布に基づいて明るさの互いに異なる発光粒子のうちの少なくとも一つの濃度又は存在比率を決定する具体的な手法の一つとして、明るさの互いに異なる発光粒子のうちの少なくとも一つの濃度が既知である溶液内にて光検出領域の位置を移動させながら光検出領域からの光の強度を測定して得られた光強度データ上に於いて個別に検出された発光粒子の光を表す信号の光強度と信号の数とに基づいて決定された光検出領域内に於ける単一の発光粒子から放出され光検出器まで到達する光の強度の分布関数を用いて、個別に検出された発光粒子の光を表す信号の光強度の発生頻度分布から、試料溶液中に含まれる明るさの互いに異なる発光粒子のうちの少なくとも一つの濃度又は存在比率が決定されるようになっていてよい。

更に、上記の本発明の実施の態様の一つに於いては、個別に検出された発光粒子の光の信号の数を計数して光検出領域の位置の移動中に検出された発光粒子の数を計数する過程が実行されてよい（粒子のカウンティング）。その場合、検出された発光粒子の数と光検出領域の位置の移動量と組み合わせることにより、試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度に関する情報が得られることとなる。具体的には、例えば、複数の試料溶液の数密度若しくは濃度の比、或いは、濃度若しくは数密度の基準となる標準試料溶液に対する相対的な数密度若しくは濃度の比が算出されるか、又は、濃度若しくは数密度の基準となる標準試料溶液に対する相対的な数密度若しくは濃度の比を用いて、絶対的な数密度値又は濃度値が決定されてよい。或いは、任意の手法により、例えば、所定の速度にて光検出領域の位置を移動するなどして、光検出領域の位置の移動軌跡の全体積及び／又はみかけの光検出領域（或る閾値以上の光強度を有する発光粒子を検出する領域。実施形態の欄参照。）の全体積を特定すれば、発光粒子の数密度又は濃度が具体的に算定できることとなる。

上記の本発明の構成に於ける光検出領域の位置の移動に関して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、発光粒子の特性又は試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて適宜変更されてよい。特に、光検出領域の移動速度が速くなると、１つの発光粒子から得られる光量は低減することとなるので、１つの発光粒子からの光が精度よく又は感度よく計測できるように、光検出領域の移動速度は、適宜変更されることが好ましい。

更に、上記の光検出領域の位置の移動に関して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、好適には、発光粒子の拡散移動速度（ブラウン運動による粒子の平均の移動速度）よりも高く設定される。上記に説明されている如く、本発明の方法では、光検出領域が包含した１つの発光粒子から発せられる光を検出して、発光粒子を個別に検出する。しかしながら、発光粒子が溶液中でブラウン運動することによりランダムに移動して、複数回、光検出領域を出入りする場合には、１つの発光粒子から複数回、（その存在を表す）信号が検出されてしまう可能性があり、検出された信号と１つの発光粒子の存在とを対応させることが困難となる。そこで、上記の如く、光検出領域の移動速度を発光粒子の拡散移動速度よりも高く設定し、これにより、１つの発光粒子を、１つの信号に対応させることが可能となる。なお、拡散移動速度は、発光粒子によって変わるので、上記の如く、発光粒子の特性に応じて、光検出領域の移動速度は適宜変更されることが好ましい。

光検出領域の位置の移動のための光学系の光路の変更は、任意の方式で為されてよい。例えば、レーザー走査型光学顕微鏡に於いて採用されているガルバノミラーを用いて光路を変更して光検出領域の位置が変更されるようになっていてよい。光検出領域の位置の移動経路は、任意に設定されてよく、例えば、円形、楕円形、矩形、直線及び曲線のうちから選択可能であってよい。なお、本発明に於いては、光学系の光路を変更して光検出領域の位置を移動するよう構成されていることにより、光検出領域の移動は、速やかであり、且つ、試料溶液に於いて機械的振動や流体力学的な作用が実質的に発生しないので、試料溶液中の発光粒子が力学的な作用の影響を受けることなく（アーティファクトの無い状態で）安定した状態にて、光の計測が可能である（例えば、試料に流れを発生させる場合には常に一様な流速を与えることは困難であると共に、装置構成が複雑となり、また、必要な試料量が大幅に増大すると共に、流れによる流体力学的作用によって溶液中の発光粒子又はその他の物質が変質又は変性してしまう可能性がある。）。そして、試料溶液を流通させるといった構成が必要ではないので、ＦＣＳ等の場合と同様に微量（１〜数十μＬ程度）の試料溶液にて計測及び分析が可能である。

本発明による光分析技術は、典型的には、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の生物学的な対象物の溶液中の状態の分析又は解析の用途に用いられるが、非生物学的な粒子（例えば、原子、分子、ミセル、金属コロイドなど）の溶液中の状態の分析又は解析に用いられてもよく、そのような場合も本発明の範囲に属することは理解されるべきである。

総じて、本発明によれば、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡に於いて、その光検出領域により試料溶液中を走査することにより、発光粒子の存在を個別に検出する走査分子計数法に於いて、試料溶液中に明るさの互いに異なる発光粒子が混在する場合でも、明るさの互いに異なる発光粒子の濃度や存在比率を決定でき、従って、明るさの互いに異なる発光粒子のそれぞれの状態、数密度又は濃度に関する情報が得られることとなる。かかる特徴によれば、例えば、粒子の結合・解離反応又は分散・凝集反応といった種々の現象に於ける観測対象となる粒子に発光標識を付加し、反応の前後で、明るさの互いに異なる発光粒子の濃度又は存在比率を比較することによって、反応の強さや進行程度を評価するといったことが可能となる。発光粒子の明るさに応じて、発光粒子の濃度又は存在比率が把握されるので、試料溶液中に於いて、種々の発光粒子が混在する試料溶液中に於いて注目する発光粒子の数密度若しくは濃度、比率、或いはそれらの変化を知ることができ有利である。また、本発明では、発光粒子を個別に検出しその濃度又は比率が決定されるようになっていることから、試料溶液中で相対的に濃度が低い発光粒子であって、その光が従前の方法ではその他の発光粒子からの光に埋没してしまう発光粒子であっても、検出可能であり、その存在が観測可能となる。かかる特徴は、反応率の比較的低い反応の生成物や相対的に数の少ない中間生成物の検出への応用も期待される。

本発明のその他の目的及び利点は、以下の本発明の好ましい実施形態の説明により明らかになるであろう。

図１（Ａ）は、本発明の光分析技術を実現する光分析装置の内部構造の模式図である。図１（Ｂ）は、コンフォーカル・ボリューム（共焦点顕微鏡の観察領域）の模式図である。図１（Ｃ）は、ミラー７の向きを変更して試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動する機構の模式図である。 図２（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、本発明の光分析技術の一部を構成する走査分子計数法に於ける光検出の原理を説明する模式図及び計測される光強度の時間変化の模式図である。 図３は、本発明の方法に従って、明るさの互いに異なる発光粒子の濃度又は存在比率を決定するための原理を説明する図である。（Ａ）は、光検出領域に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度分布、閾値及びみかけの光検出領域の関係を説明する図である。左上は、光検出領域内に於ける発光粒子（ｉ）及び（ii）から放出され検出される光の強度分布であり、右下は、発光粒子が（ｉ）の場合の光検出領域ＣＶ、みかけの光検出領域ｑＣＶ１、ｑＣＶ２の模式的な斜視図であり、左下は、発光粒子が（ｉ）の場合の光検出領域の移動方向から見た光検出領域ＣＶ、みかけの光検出領域ｑＣＶ１、ｑＣＶ２の模式的な断面図である。（Ｂ）は、顕微鏡の光の進行方向から見た光検出領域の断面の模式図であり、光検出領域ＣＶ内を通過する発光粒子を模式的に表している。(Ｃ）は、（Ｂ）の場合に計測される時系列の光強度データの例の模式図である。（Ｄ）は、光強度を変数とした発光粒子の光強度の頻度の分布（光強度を変数としてその変数を超える光強度を有する信号の総数の分布）を模式的に表した図である。 図４は、本発明の方法に従って実行される走査分子計数法の処理手順をフローチャートの形式で表した図である。 図５（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、発光粒子がブラウン運動をしながら光検出領域を横切る場合及び試料溶液内の光検出領域の位置を発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動することにより発光粒子が光検出領域を横切る場合の粒子の運動の態様を表すモデル図である。図５（Ｃ）は、走査分子計数法に従って、計測された時系列光強度データ（フォトンカウントの時間変化）から発光粒子の存在を検出するための処理手順に於ける検出信号の信号処理過程の例を説明する図である。 図６は、計測されたフォトンカウントデータの実測例（棒グラフ）と、データをスムージングして得られる曲線（点線）と、パルス存在領域にてフィッティングされたガウス関数（実線）を示している。図中、「ノイズ」と付された信号は、ノイズ又は異物による信号であるとして無視される。 図７は、本発明の方法に従って蛍光色素ＡＴＴＯ５９０とＴＡＭＲＡを含む試料溶液について得られた発光粒子の光強度の頻度の分布（光強度を変数としてその変数を超える光強度を有する信号の総数の分布）の結果を示すグラフ図である。（Ａ）は、１０ｐＭ ＴＡＭＲＡ、（Ｂ）は、１０ｐＭ ＡＴＴＯ５９０をそれぞれ含む溶液を用いた光強度の頻度の分布であり、下記の式（４）をフィッティングされている。（Ｃ）は、１０ｐＭ ＴＡＭＲＡ、（Ｄ）は、１０ｐＭ ＴＡＭＲＡ及び１０ｐＭ ＡＴＴＯ５９０、（Ｅ）は、１０ｐＭ ＴＡＭＲＡ及び１００ｐＭ ＡＴＴＯ５９０をそれぞれ含む溶液を用いた光強度の頻度の分布であり、下記の式（７）をフィッティングされている。 図８は、図７（Ｃ）〜（Ｅ）の各頻度分布に基づいて決定された蛍光色素の濃度を示すグラフである。 図９は、従来の蛍光強度のゆらぎを算出する光分析技術に於いて得られるフォトンカウント（光強度）の時間変化の例であり、（Ａ）は、試料内の粒子の濃度が、十分な計測精度が与えられる程度である場合であり、（Ｂ）は、（Ａ）の場合よりも大幅に試料内の粒子の濃度が低い場合である。

１…光分析装置（共焦点顕微鏡）
２…光源
３…シングルモードオプティカルファイバー
４…コリメータレンズ
５…ダイクロイックミラー
６、７、１１…反射ミラー
８…対物レンズ
９…マイクロプレート
１０…ウェル（試料溶液容器）
１２…コンデンサーレンズ
１３…ピンホール
１４…バリアフィルター
１４ａ…検出光用ダイクロイックミラー
１５…マルチモードオプティカルファイバー
１６…光検出器
１７…ミラー偏向器
１７ａ…ステージ位置変更装置
１８…コンピュータ

以下、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。

光分析装置の構成
本発明による方法は、基本的な構成に於いて、図１（Ａ）に模式的に例示されている如き、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等が実行可能な共焦点顕微鏡の光学系と光検出器とを組み合わせてなる光分析装置により実現可能である。図１（Ａ）を参照して、光分析装置１は、光学系２〜１７と、光学系の各部の作動を制御すると共にデータを取得し解析するためのコンピュータ１８とから構成される。光分析装置１の光学系は、通常の共焦点顕微鏡の光学系と同様であってよく、そこに於いて、光源２から放射されシングルモードファイバー３内を伝播したレーザー光（Ｅｘ）が、ファイバーの出射端に於いて固有のＮＡにて決まった角度にて発散する光となって放射され、コリメーター４によって平行光となり、ダイクロイックミラー５、反射ミラー６、７にて反射され、対物レンズ８へ入射される。対物レンズ８の上方には、典型的には、１〜数十μＬの試料溶液が分注される試料容器又はウェル１０が配列されたマイクロプレート９が配置されており、対物レンズ８から出射したレーザー光は、試料容器又はウェル１０内の試料溶液中で焦点を結び、光強度の強い領域（励起領域）が形成される。試料溶液中には、観測対象物である発光粒子、典型的には、蛍光色素等の発光標識が付加された分子が分散又は溶解されており、発光粒子が励起領域に進入すると、その間、発光粒子が励起され光が放出される。放出された光（Ｅｍ）は、対物レンズ８、ダイクロイックミラー５を通過し、ミラー１１にて反射してコンデンサーレンズ１２にて集光され、ピンホール１３を通過する。なお、当業者に於いて知られている如く、ピンホール１３は、対物レンズ８の焦点位置と共役の位置に配置されており、これにより、図１（Ｂ）に模式的に示されている如きレーザー光の焦点領域、即ち、励起領域内から発せられた光のみがピンホール１３を通過し、焦点面以外からの光は遮断される。図１（Ｂ）に例示されたレーザー光の焦点領域は、通常、１〜１０ｆＬ程度の実効体積を有する本光分析装置に於ける光検出領域であり、コンフォーカル・ボリュームと称される。コンフォーカル・ボリュームに於いては、典型的には、光強度が領域の中心を頂点とするガウス型分布又はローレンツ型分布となり、その実効体積は、光強度が１／ｅ^２となる面を境界とする略楕円球体の体積である。かくして、ピンホール１３を通過した光は、ダイクロイックミラー１４ａを経て、バリアフィルター１４を透過して（ここで、特定の波長帯域の光成分のみが選択される。）、マルチモードファイバー１５に導入されて、対応する光検出器１６に到達し、時系列の電気信号に変換された後、コンピュータ１８へ入力され、後に説明される態様にて光分析のための処理が為される。光検出器１６としては、好適には、フォトンカウンティングに使用可能な超高感度の光検出器が用いられ、これにより、１つの発光粒子からの光、例えば、一個又は数個の蛍光色素分子からの微弱光が検出可能となる。

また、上記の光分析装置の光学系に於いて、更に、光学系の光路を変更して試料溶液内を光検出領域により走査する、即ち、試料溶液内に於いて焦点領域（即ち、光検出領域）の位置を移動するための機構が設けられる。かかる光検出領域の位置を移動するための機構としては、例えば、図１（Ｃ）に模式的に例示されている如く、反射ミラー７の向きを変更するミラー偏向器１７が採用されてよい。かかるミラー偏向器１７は、通常のレーザー走査型顕微鏡に装備されているガルバノミラー装置と同様であってよい。また、所望の光検出領域の位置の移動パターンを達成するべく、ミラー偏向器１７は、コンピュータ１８の制御の下、光検出器１６による光検出と協調して駆動される。光検出領域の位置の移動軌跡は、円形、楕円形、矩形、直線、曲線又はこれらの組み合わせから任意に選択されてよい（コンピュータ１８に於けるプログラムに於いて、種々の移動パターンが選択できるようになっていてよい。）。なお、図示していないが、対物レンズ８を上下に移動することにより、光検出領域の位置が上下方向に移動されるようになっていてもよい。上記の如く、試料溶液を移動するのではなく、光学系の光路を変更して光検出領域の位置を移動する構成によれば、試料溶液内に機械的な振動や流体力学的な作用が実質的に発生することがなくなり、観測対象物に対する力学的な作用の影響を排除することが可能となり、安定的な計測が達成される。

なお、追加的な構成として、顕微鏡のステージ（図示せず）には、観察するウェル１０を変更するべく、マイクロプレート９の水平方向位置を移動するためのステージ位置変更装置１７ａが設けられていてよい。ステージ位置変更装置１７ａの作動は、コンピュータ１８により制御されてよい。

発光粒子が多光子吸収により発光する場合には、上記の光学系は、多光子顕微鏡として使用される。その場合には、励起光の焦点領域（光検出領域）のみで光の放出があるので、ピンホール１３は、除去されてよい。発光粒子がりん光又は散乱により発光する場合には、上記の共焦点顕微鏡の光学系がそのまま用いられる。また、発光粒子が化学発光や生物発光現象により励起光によらず発光する場合には、励起光を生成するための光学系２〜５が省略されてよい。更に、光分析装置１に於いては、図示の如く、複数の励起光源２が設けられていてよく、発光粒子を励起する光の波長によって適宜、励起光の波長が選択できるようになっていてよい。同様に、光検出器１６も複数個備えられていてよく、試料中に波長の異なる複数種の発光粒子が含まれている場合に、それらからの光を波長によって別々に検出できるようになっていてよい。

本発明の方法の原理
「発明の概要」の欄に記載されている如く、本発明の方法は、端的に述べれば、上記の如き共焦点顕微鏡（又は多光子顕微鏡）により発光粒子からの光を一つずつ検出する「走査分子計数法」に於いて、明るさの互いに異なる発光粒子が試料溶液中に混在する場合に、発光粒子の信号の光強度の頻度分布から、明るさの互いに異なる発光粒子のうちの少なくとも一つ或いは各々の濃度又は存在比率（粒子数の比率）を決定するというものである。以下、走査分子計数法及び本発明の方法の原理について説明する。

１.走査分子計数法の原理
ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の分光分析技術は、従前の生化学的な分析技術に比して、必要な試料量が極めて少なく、且つ、迅速に検査が実行できる点で優れている。しかしながら、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の分光分析技術では、原理的に、発光粒子の濃度や特性は、蛍光強度のゆらぎに基づいて算定されるので、精度のよい測定結果を得るためには、試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度が、図９（Ａ）に模式的に描かれているように、蛍光強度の計測中に常に一個程度の発光粒子が光検出領域ＣＶ内に存在するレベルであり、同図の右側に示されている如く、計測時間中に常に有意な光強度（フォトンカウント）が検出されることが要求される。もし発光粒子の濃度又は数密度がそれよりも低い場合、例えば、図９（Ｂ）に描かれているように、発光粒子がたまにしか光検出領域ＣＶ内へ進入しないレベルである場合には、同図の右側に例示されている如く、有意な光強度の信号（フォトンカウント）が、計測時間の一部にしか現れないこととなり、精度のよい光強度のゆらぎの算定が困難となる。また、計測中に常に一個程度の発光粒子が光検出領域内に存在するレベルよりも発光粒子の濃度が大幅に低い場合には、光強度のゆらぎの演算に於いて、バックグラウンドの影響を受けやすく、演算に十分な量の有意な光強度データを得るために計測時間が長くなる。

そこで、本願出願人は、特願２０１０−０４４７１４に於いて、発光粒子の濃度が、上記の如きＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の分光分析技術にて要求されるレベルよりも低い場合でも、発光粒子の数密度又は濃度等の特性の検出を可能にする新規な原理に基づく「走査分子計数法」を提案した。

走査分子計数法に於いて実行される処理としては、端的に述べれば、光検出領域の位置を移動するための機構（ミラー偏向器１７）を駆動して光路を変更し、図２にて模式的に描かれているように、試料溶液内に於いて光検出領域ＣＶの位置を移動しながら、即ち、光検出領域ＣＶにより試料溶液内を走査しながら、光検出が実行される。そうすると、例えば、図２（Ａ）の如く、光検出領域ＣＶが移動する間（図中、時間ｔｏ〜ｔ２）に於いて１つの発光粒子の存在する領域を通過する際（ｔ１）には、発光粒子から光が放出され、図２（Ｂ）に描かれている如き時系列の光強度データ上に有意な光強度（Ｅｍ）のパルス状の信号が出現することとなる。かくして、上記の光検出領域ＣＶの位置の移動と光検出を実行し、その間に出現する図２（Ｂ）に例示されている如きパルス状の信号（有意な光強度）を一つずつ検出することによって、発光粒子が個別に検出され、その数をカウントすることにより、計測された領域内に存在する発光粒子の数、或いは、濃度若しくは数密度に関する情報が取得できることとなる。かかる走査分子計数法の原理に於いては、蛍光強度のゆらぎの算出の如き統計的な演算処理は行われず、発光粒子が一つずつ検出されるので、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等では十分な精度にて分析ができないほど、観測されるべき粒子の濃度が低い試料溶液でも、粒子の濃度若しくは数密度に関する情報が取得可能である。

２．本発明による明るさの異なる発光粒子の濃度・存在比率の決定の原理
上記の走査分子計数法に於いて、発光粒子は一つずつ検出されるところ、明るさの互いに異なる発光粒子同士、例えば、明るさは互いに異なるが共通の発光波長を有する異なる種類の発光粒子同士や、同一の発光標識が付加されているがその数が異なる粒子同士は、互いに区別がつけられない。その理由は、光検出領域に於いて、そこを通過する発光粒子から放出され光検出器まで到達する光の強度が、光検出領域に於ける発光粒子の位置によって異なり、明るさの同じ発光粒子（同一の条件下での観測に於いて発光強度が実質的に等しい発光粒子）であっても、発光粒子の光検出領域内に於ける通過位置によって検出される光強度が異なってしまうためである。例えば、或る発光粒子が照明光を照射されて発光する粒子である場合、照明光の光検出領域内に於ける光の強度は、典型的には、光検出領域（集光領域）の略中心にて最大となり、かかる最大強度点から略放射方向に低減する。従って、発光粒子からの光の強度は、発光粒子が光検出領域の略中心を横切る際に最大となり、発光粒子の位置が光検出領域の周縁へ近づくほど、光強度は徐々に低減する。即ち、光検出領域内に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度の分布は、図３（Ａ）左上に例示されている如き釣鐘状の分布となっており、例えば、図３（Ｂ）に描かれている如く、発光粒子α、β、γが同じ明るさの粒子であったとしても、各発光粒子の通過する経路によって、検出される光強度が互いに異なり、図中、光検出領域の略中心を通過する発光粒子βの光強度は、発光粒子α、γの光強度よりも高くなる（図３（Ｃ）参照）。

しかしながら、或る明るさの発光粒子についての光検出領域内に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度の分布が光検出領域の最大強度点からの距離ｒによって一つに決まること及び溶液中に於いて発光粒子が均等に分散していると仮定できることから、或る明るさの発光粒子が或る濃度にて含まれている試料溶液に於いて、その発光粒子の、上記の走査分子計数法により個別に検出される光強度の頻度分布は、その発光粒子に固有のものとなる。

より具体的には、まず、或る発光粒子の濃度ｃの試料溶液中に於いて、時間ｔの間、光検出領域を走査速度ｕにて移動させた場合、光検出領域の断面積をＳとすると、検出される光の信号の総数Ｐは、
Ｐ＝ｃＳｕｔＮ_Ａ …（１）
となる（Ｎ_Ａは、アボガドロ数）。ここで、光検出領域の断面積Ｓは、検出対象とする光の信号の光強度の大きさに応じて変化すると考えることができる。即ち、図３（Ａ）を再度参照して、例えば、検出対象とする光の信号の光強度の下限の閾値がI0のとき（光強度が閾値を下回る信号を無視するとき）は、同図左上の光検出領域内に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度の分布に於いて、I0を超える強度を有する信号が抽出されることとなるので、同図の左下及び右下の図中のＣＶと付された領域内に進入した発光粒子からの光が信号として検出される。従って、前記の閾値をI0→I1→I2の順に上げる場合には、検出される信号の強度の下限が上昇することとなるので、信号として検出される光を発する発光粒子の通過領域は、ＣＶ→ｑＣＶ１→ｑＣＶ２の順に縮小されることとなる。換言すれば、光検出領域の走査中に時系列に取得された光強度のデータからの発光粒子の信号の抽出処理に於いて、或る閾値（例えば、I1、I2）を設定することにより、単一の発光粒子を検出する領域、つまり、「みかけの光検出領域」（例えば、ｑＣＶ１、ｑＣＶ２）が画定され、そのみかけの光検出領域内を通過する発光粒子の信号のみを選択的に検出できることとなる。

かくして、上記の式（１）の光検出領域の断面積Ｓは、「みかけの光検出領域」の断面積であると考えれば、光検出領域の断面積Ｓは、光検出領域内に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度の分布関数から導出することができる。まず、図３（Ａ）左上に例示されている如き、光検出領域内に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度の分布がローレンツ関数で近似できる場合、分布の最大強度点から距離ｒに於ける光強度Ｉは、光強度分布の最大値Imax（Imaxは、単一発光粒子の最大光強度に相当する。）、分布の半値半幅ｗ、強度のバックグラウンドIbgを用いて、

により表される。ここで、みかけの光検出領域の（移動方向に垂直な方向の）断面積Ｓが近似的にＳ＝πｒ^２により与えられるとすると（より厳密には、光検出領域の断面は楕円であるが、演算の簡略化のため、円にて近似する。以下同様。）、光強度Ｉが被検出信号の光強度の下限値となるみかけの光検出領域の断面積Ｓ（即ち、光強度Ｉを与える円領域より内側の面積）は、式（２）より、

にて与えられる。従って、式（３）を式（１）に代入すると、光強度Ｉを超える光強度を有する信号の総数Ｐ（Ｉ）は、

により与えられることとなる。式（４）のＰ（Ｉ）は、光強度Ｉを変数としたかかる変数を超える光強度を有する信号の総数の分布を与える関数である。また、Ｐ（Ｉ）を光強度Ｉで微分した値に微小量ｄＩを乗じて得られる関数
（ｄＰ（Ｉ）／ｄＩ）・ｄＩ …（５）
は、光強度Ｉ〜Ｉ＋ｄＩに於いて検出される信号数であり、検出された発光粒子の光を表す信号に於ける光強度毎の信号数の分布（光強度を変数とするヒストグラム）を与える関数である。

上記の式（４）、（５）に於いて、光強度分布の最大値Imax、半値半幅ｗは、励起光強度等の装置の設定条件が一定であるとの条件下で、或る明るさの発光粒子に固有の値であるので、式（４）、（５）にて表される信号の頻度分布は、その発光粒子に固有のものとなる。従って、発光粒子の明るさが異なるときには、式（４）、（５）にて表される信号の頻度分布は、変化する。例えば、図３（Ａ）の左上の如く、明るさの互いに異なる発光粒子（ｉ）と（ii）とについて、発光粒子（ｉ）の式（４）にて表される分布は、図３（Ｄ）中の実線（ｉ）の如きプロファイルになるのに対し、発光粒子（ii）の式（４）にて表される分布は、図３（Ｄ）中の実線（ii）の如きプロファイルとなる。［上記の式（３）を参照して、光強度分布の最大値Imax、半値半幅ｗは、或る明るさの発光粒子について固有の値となる。従って、明るさの互いに異なる発光粒子に於いて、光強度分布の最大値Imax、半値半幅ｗが互いに異なるので、或る光強度Ｉを下限値とするみかけの光検出領域の断面積Ｓも異なることとなる。従って、明るさの互いに異なる発光粒子の各々の濃度が等しい場合でも、明るさの互いに異なる発光粒子に於ける光強度Ｉを超える信号の総数Ｐ（Ｉ）が互いに異なることとなる。］

複数成分の明るさの互いに異なる発光粒子が混在する試料溶液の場合、光強度Ｉを超える光強度を有する信号の総数の分布を与える関数は、式（４）の和、即ち、

により与えられる。ここで、ｃk、ｗk、Ｉmaxkは、それぞれ、試料溶液中に含まれる明るさの互いに異なる発光粒子の各々の濃度、光強度分布の半値半幅、最大値である。なお、光強度毎の信号数の分布を関数は、式（６）を光強度で微分して得られる関数である。また、例えば、図３（Ａ）中の明るさが互いに異なる２種類の発光粒子（ｉ）と発光粒子（ii）とが混合されている試料溶液では、分布を与える関数は、

により与えられ（光強度毎の信号数の分布を関数は、式（７）を光強度で微分し得られる関数である。）、光強度Ｉを超える光強度を有する信号の総数の分布のプロファイルは、図３（Ｄ）中の一点鎖線（ｉ）＋（ii）の如く、発光粒子（ｉ）又は（ii）が単独で検出される場合のプロファイルとは異なることとなる。

そこで、本発明に於いては、明るさの互いに異なる発光粒子が混在する試料溶液について、上記の走査分子計数法に於ける光検出過程により得られた光強度データに於いて検出された発光粒子の信号について、光強度Ｉを超える光強度を有する信号の総数の分布又は光強度毎の信号数の分布を調製し、かかる分布に上記の式（６）（又は式（６）の微分関数）をフィッティングして、明るさの互いに異なる発光粒子の各々の濃度（ｃｋ）が決定され、これにより、明るさの互いに異なる発光粒子の存在比率が決定される。なお、式（６）（又は式（６）の微分関数）のフィッティングに於いて、フィッティングにより決定されるパラメータは、少ないほど精度が良くなる。従って、試料溶液中の観測対象となる発光粒子について、それぞれが単独で測定可能な（好適には、既知濃度の）溶液について、走査分子計数法による光検出を実行して得られた光強度データに於ける信号の光強度の頻度分布に対して、式（４）又は（５）をフィッティングして、それぞれの発光粒子の光強度分布の最大値Imaxk、半値半幅ｗkを決定しておくことが好ましい。

光検出領域内に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度の分布がガウス関数で近似できる場合、光強度Ｉが被検出信号の光強度の下限値となるみかけの光検出領域の断面積Ｓは、

によって与えられる。従って、式（８）を式（１）に代入することにより、上記と同様に式（４）〜（７）に相当する関数が得られる。

ところで、式（１）とＳ＝πｒ^２の関係とを用いると、光検出領域に於ける最大強度点から或る光強度Ｉを与える領域までの距離ｒ（Ｉ）と光強度Ｉを超える光強度を有する信号の総数Ｐ（Ｉ）との関係が以下の如く与えられる。

従って、任意の光検出領域内に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度の分布に於いて、種々の光強度値についてＰ（Ｉ）を決定することにより、光強度Ｉと最大強度点からの距離ｒとの関係が導出可能となり、光強度Ｉを最大強度点からの距離ｒの関数Ｉ（ｒ）として表すことが可能となる。かかる関数は、観測結果に一致する連続で微分可能である関数であれば任意のものであってよいが、好適には、釣鐘型の形状を有するローレンツ関数、ガウス関数、フォークト関数である。かくして得られた光検出領域内に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度の分布を表す関数をＩ＝ｆ（ｒ）とすると、光強度Ｉを超える光強度を有する信号の総数Ｐ（Ｉ）を与える式（１）は、下記の式により表される。
Ｐ（Ｉ）＝ｃπ｛ｆ^−１（Ｉ）｝^２ｕｔＮａ …（１０）

処理操作過程
図１（Ａ）に例示の光分析装置１を用いた本発明による光分析の実施形態に於いては、具体的には、（１）発光粒子を含む試料溶液の調製過程、（２）試料溶液の光強度の測定処理過程、及び（３）測定された光強度の分析処理過程が実行される。図４は、フローチャートの形式にて表した本実施形態に於ける処理過程を示している。

（１）試料溶液の調製
本発明の光分析技術に於いて観測対象となる粒子は、溶解された分子等の、試料溶液中にて分散し溶液中にてランダムに運動する粒子であれば、任意のものであってよく、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞、或いは、金属コロイド、その他の非生物学的粒子などであってよい（試料溶液は、典型的には水溶液であるが、これに限定されず、有機溶媒その他の任意の液体であってよい。）。また、観測対象となる粒子は、それ自体が発光する粒子であってもよく、或いは、発光標識（蛍光分子、りん光分子、化学・生物発光分子）が任意の態様にて付加された粒子であってよい。

なお、本実施形態の方法に於いては、試料溶液中に含まれている明るさの互いに異なる発光粒子の各濃度又は各存在比率（濃度比）が決定可能であるので、試料溶液中に明るさの互いに異なる発光粒子が混在していてよい。例えば、濃度が未知の複数の成分を含む溶液、結合解離反応や分子間相互作用の前後で明るさの互いに異なる複数の成分の発光粒子の存在比率が変化する溶液などが試料溶液として用いられ、各成分の濃度若しくは存在比率、或いは、複数の成分の少なくとも一つの濃度若しくは存在比率が決定され、これにより、反応や相互作用の有無、進行の程度が検出される。

（２）試料溶液の光強度の測定
本実施形態の走査分子計数法による光強度の測定処理過程では、ミラー偏向器１７を駆動して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動（試料溶液内の走査）を行いながら、光強度の測定が為される（図４−ステップ１００）。操作処理に於いて、典型的には、マイクロプレート９のウェル１０に試料溶液を注入して顕微鏡のステージ上に載置した後、使用者がコンピュータ１８に対して、測定の開始の指示を入力すると、コンピュータ１８は、記憶装置（図示せず）に記憶されたプログラム（試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動するべく光路を変更する手順、励起光を光検出領域に照射する手順（必要な場合のみ）及び光検出領域の位置の移動中に光検出領域からの光を検出する手順）に従って、試料溶液内の光検出領域に於ける励起光の照射（必要な場合のみ）及び光強度の計測が開始される。計測が開始されると、まず、コンピュータ１８のプログラムに従った処理動作の制御下、光源２から、試料溶液中の発光粒子の励起波長の光が出射されると共に、ミラー偏向器１７がミラー７（ガルバノミラー）を駆動して、ウェル１０内に於いて光検出領域の位置の移動を実行し、これと同時に光検出器１６は、逐次的に受光した光を電気信号に変換してコンピュータ１８へ送信し、コンピュータ１８は、任意の態様にて、送信された信号から時系列の光強度データを生成して保存する。典型的には、光検出器１６は、一光子の到来を検出できる超高感度光検出器であるので、光の検出は、所定時間に亘って、逐次的に、所定の単位時間毎（ＢＩＮ ＴＩＭＥ）に、例えば、１０μ秒毎に光検出器に到来するフォトンの数を計測する態様にて実行されるフォトンカウンティングであり、時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータであってよい。

光検出領域の位置の移動速度に関して、走査分子計数法に於いて、計測された時系列の光強度データからの発光粒子の個別の検出を、定量的に精度よく実行するために、好適には、光強度の計測中の光検出領域の位置の移動速度は、発光粒子のランダムな運動、即ち、ブラウン運動による移動速度よりも速い値に設定される。光検出領域の位置の移動速度が粒子のブラウン運動による移動に比して遅い場合には、図５（Ａ）に模式的に描かれている如く、粒子が領域内をランダムに移動し、これにより、光強度がランダムに変化し（光検出領域の励起光強度は、領域の中心を頂点として外方に向かって低減する。）、個々の発光粒子に対応する有意な光強度の変化（発光粒子からの光を表す信号）を特定することが困難となる。そこで、好適には、図５（Ｂ）に描かれている如く、粒子が光検出領域ＣＶを略直線に横切り、これにより、時系列の光強度データに於いて、個々の粒子に対応する光強度の変化のプロファイルが、図５（Ｃ）最上段に例示されている如く励起光強度分布と略同様の略釣鐘状となって、個々の発光粒子と光強度との対応が容易に特定できるように、光検出領域の位置の移動速度は、粒子のブラウン運動による平均の移動速度（拡散移動速度）よりも速く設定される。

具体的には、拡散係数Ｄを有する発光粒子がブラウン運動によって半径ｒの光検出領域（コンフォーカルボリューム）を通過するときに要する時間Δτは、平均二乗変位の関係式
（２ｒ）^２＝６Ｄ・Δτ …（１１）
から、
Δτ＝（２ｒ）^２／６Ｄ …（１２）
となるので、発光粒子がブラウン運動により移動する速度（拡散移動速度）Ｖdifは、概ね、
Ｖdif＝２ｒ／Δτ＝３Ｄ／ｒ …（１３）
となる。そこで、光検出領域の位置の移動速度は、かかるＶdifを参照して、それよりも十分に早い値に設定されてよい。例えば、発光粒子の拡散係数が、Ｄ＝２．０×１０^−１０ｍ^２／ｓ程度であると予想される場合には、ｒが、０．６２μｍ程度だとすると、Ｖdifは、１．０×１０^−３ｍ／ｓとなるので、光検出領域の位置の移動速度は、その１０倍以上の、例えば、１５ｍｍ／ｓと設定されてよい。なお、発光粒子の拡散係数が未知の場合には、光検出領域の位置の移動速度を種々設定して光強度の変化のプロファイルが、予想されるプロファイル（典型的には、励起光強度分布と略同様）となる条件を見つけるための予備実験を繰り返し実行して、好適な光検出領域の位置の移動速度が決定されてよい。なお、好適には、光検出領域の位置の移動速度は、本装置に於いて光が検出される発光粒子の全ての拡散移動速度よりも速いことが望ましい。

（３）光強度の分析
上記の処理により試料溶液中の発光粒子の時系列の光強度データが得られると、コンピュータ１８に於いて、記憶装置に記憶されたプログラムに従った処理により、光強度データ上に於ける発光粒子からの光に対応する信号の検出及び明るさの互いに異なる発光粒子の各濃度及び／又は各存在比率の決定が実行される。

（ｉ）発光粒子に対応する信号の検出
時系列の光強度データに於いて、一つの発光粒子の光検出領域を通過する際の軌跡が、図５（Ｂ）に示されている如く略直線状である場合、その粒子に対応する信号に於ける光強度の変化は、（光学系により決定される）光検出領域内の光強度分布を反映した略釣鐘状のプロファイルを有する（図５（Ｃ）最上段参照）。従って、走査分子計数法では、基本的には、適宜設定される閾値を超える光強度が継続する時間幅が所定の範囲にあるとき、その光強度のプロファイルを有する信号が一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されるようになっていてよい。そして、閾値を超える光強度が継続する時間幅が所定の範囲にない信号は、ノイズ又は異物の信号として判定される。また、光検出領域の光強度分布が、ガウス分布：
Ｉ＝Ａ・ｅｘｐ（−２ｔ^２／ａ^２） …（１４）
であると仮定できるときには、有意な光強度のプロファイル（バックグラウンドでないと明らかに判断できるプロファイル）に対して式（１４）をフィッティングして算出された強度Ａ及び幅ａが所定の範囲内にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されてよい。（強度Ａ及び幅ａが所定の範囲外にある信号は、ノイズ又は異物の信号として判定され、その後の分析等に於いて無視されてよい。）

時系列光強度データからの発光粒子の一括的な検出を行う処理方法の一つの例としては、まず、時系列光強度データ（図５（Ｃ）、最上段「検出結果（未処理）」）に対して、スムージング（平滑化）処理が為される（図４−ステップ１１０、図５（Ｃ）中上段「スムージング」）。発光粒子の発する光は確率的に放出されるものであり、微小な時間に於いてデータ値の欠落が生じ得るため、かかるスムージング処理によって、前記の如きデータ値の欠落を無視できることとなる。スムージング処理は、例えば、移動平均法等により為されてよい。なお、スムージング処理を実行する際のパラメータ、例えば、移動平均法に於いて一度に平均するデータ点数や移動平均の回数など、は、光強度データ取得時の光検出領域の位置の移動速度（走査速度）、ＢＩＮ ＴＩＭＥに応じて適宜設定されてよい。

次いで、スムージング処理後の時系列光強度データに於いて、有意なパルス状の信号（以下、「パルス信号」と称する。）が存在する時間領域（パルス存在領域）を検出するために、スムージング処理後の時系列光強度データの時間についての一次微分値が演算される（ステップ１２０）。時系列光強度データの時間微分値は、図５（Ｃ）中下段「時間微分」に例示されている如く、信号値の変化時点に於ける値の変化が大きくなるので、かかる時間微分値を参照することによって、有意な信号の始点と終点を有利に決定することができる。

しかる後、時系列光強度データ上に於いて、逐次的に、有意なパルス信号を検出し、検出された信号が発光粒子に対応する信号であるか否かが判定される。具体的には、まず、時系列光強度データの時系列の時間微分値データ上にて、逐次的に時間微分値を参照して、一つのパルス信号の始点と終点とが探索され決定され、パルス存在領域が特定される（ステップ１３０）。一つのパルス存在領域が特定されると、そのパルス存在領域に於けるスムージングされた時系列光強度データに対して、釣鐘型関数のフィッティングが行われ（図５（Ｃ）下段「釣鐘型関数フィッティング」）、釣鐘型関数のパルスのピーク（最大値）の強度Ｉpeak、パルス幅（半値全幅）Ｗpeak、フィッティングに於ける（最小二乗法の）相関係数等のパラメータが算出される（ステップ１４０）。なお、フィッティングされる釣鐘型関数は、典型的には、ガウス関数であるが、ローレンツ型関数であってもよい。そして、算出された釣鐘型関数のパラメータが、一つの発光粒子が光検出領域を通過したときに検出されるパルス信号が描く釣鐘型のプロファイルのパラメータについて想定される範囲内にあるか否か、即ち、パルスのピーク強度、パルス幅、相関係数が、それぞれ、所定範囲内にあるか否か等が判定される（ステップ１５０）。かくして、図６左に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが一つの発光粒子に対応する信号に於いて想定される範囲内にあると判定された信号は、一つの発光粒子に対応する信号であると判定され、これにより、一つの発光粒子が検出されたこととなる。一方、図６右に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが想定される範囲内になかったパルス信号は、ノイズとして無視される。

上記のステップ１３０〜１５０の処理に於けるパルス信号の探索及び判定は、時系列光強度データの全域に渡って繰り返し実行されてよい（ステップ１６０）。なお、時系列光強度データから発光粒子の信号を個別に検出する処理は、上記の手順に限らず、任意の手法により実行されてよい。

（ii）明るさの互いに異なる発光粒子の各濃度・各存在比率の決定（図４−ステップ１７０）
かくして、時系列光強度データに於いて、発光粒子の信号が検出されると、発光粒子の信号に於ける強度、即ち、発光粒子の光強度の頻度分布が調製される。頻度分布は、光強度Ｉを変数とし、光強度Ｉ毎に光強度Ｉを超える光強度を有する信号の総数の分布Ｐ（Ｉ）、或いは、光強度Ｉ毎にＩ〜Ｉ＋ｄＩに於ける信号の数の分布｛ｄＰ（Ｉ）／ｄＩ｝・ｄＩのいずれであってもよい。ここで参照する光強度としては、ステップ１３０〜１６０に於いて検出された発光粒子の信号のピーク強度（パルス存在領域に於ける最大値）、フォトンカウントの積算値、或いは、フィッティングされた釣鐘型関数の時間積分値又はピーク強度などが採用されてよい。

発光粒子の光強度の頻度分布が調製されると、かかる頻度分布に対して、上記に説明した分布の理論式がフィッティングされる。かかるフィッティングには、頻度分布が光強度Ｉを超える光強度を有する信号の総数の分布Ｐ（Ｉ）であるときは、式（６）［特に、試料溶液中の明るさの異なる発光粒子の成分が２成分であるときには、式（７）］が用いられ、頻度分布が光強度Ｉ毎にＩ〜Ｉ＋ｄＩに於ける信号の数の分布であるときには、式（６）［若しくは式（７）］の微分値にｄＩを乗じた式が用いられる。フィッティングは、例えば、最小二乗法を用いて実行されてよい。なお、既に述べた如く、フィッティングにより決定されるパラメータが少ないほど、フィッティングの精度が良くなる。そこで、好適には、観測される発光粒子について、それぞれの発光粒子の光強度分布の最大値Imaxk、半値半幅ｗkが、それぞれの発光粒子が単独で測定可能な（好適には、既知濃度の）溶液を用いて、走査分子計数法による光検出を実行して得られた光強度データに於ける信号の光強度の頻度分布に対して、式（４）又は（５）をフィッティングして決定され、かくして決定された最大値Imaxk、半値半幅ｗkが、試料溶液の発光粒子の光強度の頻度分布に対する式（６）［若しくは式（７）］又はその微分値のフィッティングに於いて既知数として用いられてよい。［これにより、式（６）［若しくは式（７）］又はその微分値が、それぞれの発光粒子の濃度が既知である溶液について走査分子計数法により得られた発光粒子の信号の光強度と信号の数とに基づいて決定された光検出領域内に於ける単一の発光粒子から放出され光検出器まで到達する光の強度の分布関数の組合せにより表され、フィッティングは、かかる分布関数の組合せを用いて為されることとなる。］

かくして、発光粒子の光強度の頻度分布に対する分布の理論式のフィッティングが為されると、明るさの互いに異なる発光粒子の各々の濃度ｃｋが決定される。従って、明るさの互いに異なる発光粒子の存在比率は、かかる濃度ｃｋの比によって決定される。なお、試料溶液中の明るさの互いに異なる発光粒子のうち、一部の成分の濃度又は存在比率が既知であるときには、かかる既知濃度又は既知存在比率を既知数として、上記のフィッティングが実行され、濃度又は存在比率が未知の成分の濃度又は存在比率を決定するようになっていてよい。また、明るさの互いに異なる発光粒子の存在比率が既知であるが、濃度が未知である試料溶液については、既知の存在比率を既知数として、上記のフィッティングが実行され、各成分の濃度が決定されるようになっていてもよい。

ところで、上記の実施形態に於いて、更に、検出された発光粒子の信号の数を計数して、発光粒子の数の決定が為されてもよい（発光粒子のカウンティング）。また、任意の手法にて、光検出領域の通過した領域の総体積が算定されれば、その体積値と発光粒子の数とからも試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度が決定される。

光検出領域の通過した領域の総体積は、励起光又は検出光の波長、レンズの開口数、光学系の調整状態に基づいて理論的に算定されてもよいが、実験的に、例えば、発光粒子の濃度が既知の溶液（対照溶液）について、検査されるべき試料溶液の測定と同様の条件にて、上記に説明した光強度の測定、発光粒子の検出及びカウンティングを行うことにより検出された発光粒子の数と、対照溶液の発光粒子の濃度とから決定されるようになっていてよい。具体的には、例えば、発光粒子の濃度Ｃの対照溶液について、対照溶液の発光粒子の検出数がＮであったとすると、光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔは、
Ｖｔ＝Ｎ／Ｃ …（１５）
により与えられる。また、対照溶液として、発光粒子の複数の異なる濃度の溶液が準備され、それぞれについて測定が実行されて、算出されたＶｔの平均値が光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔとして採用されるようになっていてよい。そして、Ｖｔが与えられると、発光粒子のカウンティング結果がｎの試料溶液の発光粒子の濃度ｃは、
ｃ＝ｎ／Ｖｔ …（１６）
により与えられる。なお、光検出領域の体積、光検出領域の通過した領域の総体積は、上記の方法によらず、任意の方法にて、例えば、ＦＣＳ、ＦＩＤＡを利用するなどして与えられるようになっていてよい。また、本実施形態の光分析装置に於いては、想定される光検出領域の移動パターンについて、種々の標準的な発光粒子についての濃度Ｃと発光粒子の数Ｎとの関係（式（１５））の情報をコンピュータ１８の記憶装置に予め記憶しておき、装置の使用者が光分析を実施する際に適宜記憶された関係の情報を利用できるようになっていてよい。明るさの互いに異なる発光粒子が混在する試料溶液が観測の対象となる場合、既に触れたように、明るさの互いに異なる発光粒子同士では、みかけの光検出領域の断面積の大きさが異なり、光検出領域の通過した領域の実効的な総体積Ｖｔも異なる。従って、上記の手法で光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔを算出するためには、明るさの互いに異なる発光粒子の各々について、濃度が既知の参照溶液を準備して、光強度の測定、発光粒子の検出及びカウンティング、総体積Ｖｔの算出が行われる。光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔを用いて決定される発光粒子の濃度は、発光粒子の光強度の頻度分布に対する分布の理論式のフィッティングから決定される濃度と比較し、頻度分布に対する分布の理論式のフィッティングの精度の評価に利用されてよい。

かくして、上記の本発明によれば、光検出領域により試料溶液中にて走査して発光粒子を個別に検出する走査分子計数法に於いて、試料溶液中に混在する明るさの互いに異なる発光粒子の各々の濃度及び／又は存在比率が決定できることとなる。

上記に説明した本発明の有効性を検証するために、以下の如き実験を行った。なお、以下の実施例は、本発明の有効性を例示するものであって、本発明の範囲を限定するものではないことは理解されるべきである。

本発明により走査分子計数法に於いて明るさの互いに異なる発光粒子を含む試料溶液中に於ける明るさの互いに異なる発光粒子の各々の濃度の決定が可能であることを検証した。

試料溶液として、
（ｉ）１０ｐＭ ＴＡＭＲＡ、
（ii）１０ｐＭ ＡＴＴＯ５９０、
（iii）１０ｐＭ ＴＡＭＲＡ及び１０ｐＭ ＡＴＴＯ５９０
（iv）１０ｐＭ ＴＡＭＲＡ及び１００ｐＭ ＡＴＴＯ５９０
をそれぞれ含む４つの溶液を調製した。光の測定に於いては、光分析装置として、共焦点蛍光顕微鏡の光学系とフォトンカウンティングシステムを備えた１分子蛍光測定装置ＭＦ−２０（オリンパス株式会社）を用い、上記の「（２）試料溶液の光強度の測定」にて説明した態様に従って、上記の各々の試料溶液について、時系列光強度データ（フォトンカウントデータ）を取得した。その際、励起光は、５００μＷの５４３ｎｍのレーザー光を用い、バンドパスフィルターを用いて、５６５−５９５ｎｍの波長帯域の光を測定し、時系列光強度データを生成した。試料溶液中に於ける光検出領域は、１５ｍｍ／秒の移動速度にて移動させた。また、ＢＩＮ ＴＩＭＥを１０μ秒とし、測定時間は、２秒間とした。測定は、各溶液について３回行った。

光強度の測定後、上記の「（３）（ｉ）発光粒子に対応する信号の検出」に記載された処理手順に従って、時系列光強度データにスムージング処理を施し、スムージングされたデータに於いて、パルス信号の始点及び終点を決定した後、各パルス信号にガウス関数を最小二乗法によりフィッティングして、（ガウス関数に於ける）ピーク強度、パルス幅（半値全幅）、相関係数を決定した。そして、下記の条件:
２０μ秒＜パルス幅＜４００μ秒
ピーク強度＞１．０［ｐｃ／１０μｓ］ …（Ａ）
相関係数＞０．９５
を満たすパルス信号のみを発光粒子に対応する信号であると判定する一方、上記の条件を満たさないパルス信号はノイズとして無視した。

発光粒子の信号を検出した後、溶液毎に、平滑化された各信号のピーク強度を参照して、光強度Ｉを変数として、光強度Ｉを超える光強度を有する信号の総数の分布を調製し、調製された分布に対して、上記の式（４）［溶液（ｉ）、（ii）の場合］或いは式（７）［溶液（ｉ）、（iii）、（iv）の場合］をフィッティングした。なお、フィッティングは、OriginLab社製のOrigin 8Jを用いて行った。

図７（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、上記の溶液（ｉ）、（ii）の光強度Ｉを超える光強度を有する信号の総数［頻度（積算）］の分布をグラフの形式にて表した図である。図中、実曲線は、それぞれ、式（４）に於いてImaxとｃｕｔＮ_Ａπｗ^２を未知数として、同式を、３回の測定の頻度（積算）の値に対してフィッティングして得られた曲線である。同図を参照して、頻度（積算）の分布は、いずれも、光検出領域内に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度の分布としてローレンツ関数を用いて得られる式（４）に良好に一致した。特に、１０ｐＭ ＴＡＭＲＡのみを含む溶液（ｉ）については（図７（Ａ））、
Imax＝４．３
ｃｕｔＮ_Ａπｗ^２＝８１
相関係数＝０．９８
となり、ｃ＝１０ｐＭ、ｕ＝１５ｍｍ／秒、ｔ＝２秒、Ｎ_Ａ＝６．０２×１０^２３を用いて、ｗ＝０．３７μｍと算出された。この値は、別途、ＦＣＳ測定により得られる推定値と略一致した。一方、１０ｐＭ ＡＴＴＯ５９０のみを含む溶液（ii）については（図７（Ｂ））、
Imax＝３．４
ｃｕｔＮ_Ａπｗ^２＝８．１７
相関係数＝０．９５
となり、上記と同様にして、ｗ＝０．１２μｍと算出され、溶液（ｉ）の場合と、Imax及びｗの値が異なった。これらの結果から理解される如く、光検出領域内に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度の分布のピーク強度Imax及び半値半幅ｗは、或る明るさの発光粒子に固有の値であり、従って、光強度の頻度分布も或る明るさの発光粒子に固有のプロファイルを有することが示された。

更に、溶液（ｉ）、溶液（iii）及び溶液（iv）の光強度の頻度分布に対して、式（７）をフィッティングして、ＴＡＭＲＡ及びＡＴＴＯ５９０の濃度をそれぞれ算出した。なお、フィッティングに於いては、式（７）の第１項及び第２項を、それぞれ、ＴＡＭＲＡの分布関数及びＡＴＴＯ５９０の分布関数とし、ＴＡＭＲＡのImax1、ｗ１として上記の溶液（ｉ）のImax及びｗの値を代入し、ＡＴＴＯ５９０のImax2、ｗ２として上記の溶液（ii）のImax及びｗの値を代入して、ＴＡＭＲＡの濃度ｃ１及びＡＴＴＯ５９０の濃度ｃ２を未知数とした。図７（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）は、それぞれ、溶液(ｉ)、（iii）、（iv）の頻度（積算）分布と式（７）をフィッティングして得られた曲線とを示している。同図から理解される如く、いずれも、光検出領域内に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度の分布としてローレンツ関数を用いて得られる理論式（７）に良好に一致した。図８は、式（７）のフィッティングにより算出された溶液（ｉ）、（iii）及び（iv）中のＴＡＭＲＡの濃度ｃ１、ＡＴＴＯ５９０の濃度ｃ２をグラフの形式にて表した図である。同図から理解される如く、ＴＡＭＲＡの濃度ｃ１は、溶液（ｉ）、（iii）及び（iv）のいずれの場合も略１０ｐＭと算出され、ＡＴＴＯ５９０の濃度ｃ２は、概ね、０ｐＭ、１０ｐＭ、１００ｐＭと算出された。これらの結果は、光強度の頻度分布に対して式（７）をフィッティングすることにより、試料溶液中の明るさの互いに異なる発光粒子の濃度を決定できることを示唆している。また、かくして算出された発光粒子の濃度の値から、明るさの互いに異なる発光粒子の試料溶液中での存在比率を決定することが可能である。

かくして、上記の実施例の結果から理解される如く、上記の本発明によれば、走査分子計数法に於いて、発光粒子の光を表す信号の光強度の発生頻度分布に基づいて、試料溶液中に含まれる明るさの互いに異なる発光粒子のうちの少なくとも一つの濃度又は存在比率を決定することが可能となる。特に、本発明は、発光粒子の信号を個別に検出して、各発光粒子の種類の識別が可能となるので、試料溶液中の発光粒子濃度が、ＦＣＳ等の光分析技術で要求される濃度域よりも低くても、発光粒子の検出が可能であり、かかる特徴は、医学・生物学の研究開発の分野でしばしば使用される希少な或いは高価な試料についての分析を行う場合に有利であろう。また、本発明により、試料溶液中に明るさの互いに異なる発光粒子が混在する場合でも、走査分子計数法に於いて各発光粒子の濃度又は存在比率が決定できることから、走査分子計数法の応用範囲が拡大されることが期待される。例えば、試料溶液中に観測対象の粒子以外の発光粒子が含まれている場合であっても、観測対象の粒子の濃度又は存在比率の決定ができるので、試料溶液中の不純物等の除去のための労力が軽減されるといった利点を有する。

Claims (7)

1. 共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する明るさの互いに異なる発光粒子からの光を検出し分析する方法であって、
   前記光学系の光路を変更することにより前記試料溶液内に於いて前記光学系の光検出領域の位置を移動する過程と、
   前記試料溶液内に於いて前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出領域からの光の強度を測定して光強度データを生成する過程と、
   前記光強度データ上に於いて発光粒子の光を表す信号を個別に検出する過程と、
   前記個別に検出された発光粒子の光を表す信号の光強度の発生頻度分布に基づいて、前記試料溶液中に含まれる前記明るさの互いに異なる発光粒子のうちの少なくとも一つの濃度又は存在比率を決定する過程と
   を含むことを特徴とする方法。
2. 請求項１の方法であって、前記光検出領域内に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度分布が、前記光検出領域内の最大強度点から前記光検出領域の周縁に向かって前記発光粒子から放出され検出される光の強度が低減する分布であることを特徴とする方法。
3. 請求項１の方法であって、前記個別に検出された発光粒子の光を表す信号の光強度の発生頻度分布が、光強度を変数とした前記変数を超える光強度を有する信号の総数の分布であることを特徴とする方法。
4. 請求項１の方法であって、前記明るさの互いに異なる発光粒子のうちの少なくとも一つの濃度が既知である溶液内にて前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出領域からの光の強度を測定して得られた光強度データ上に於いて個別に検出された発光粒子の光を表す信号の光強度と前記信号の数とに基づいて決定された前記光検出領域内に於ける単一の発光粒子から放出され光検出器まで到達する光の強度の分布関数を用いて、前記個別に検出された発光粒子の光を表す信号の光強度の発生頻度分布から、前記試料溶液中に含まれる前記明るさの互いに異なる発光粒子のうちの少なくとも一つの濃度又は存在比率を決定することを特徴とする方法。
5. 請求項１の方法であって、前記発光粒子が励起光を照射されることにより光を放出する粒子であり、前記光検出領域に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度分布が前記光検出領域内の前記励起光の強度分布と一致していることを特徴とする方法。
6. 請求項１の方法であって、更に、前記個別に検出された発光粒子の光の信号の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記発光粒子の数を計数する過程を含むことを特徴とする方法。
7. 請求項１乃至６のいずれかの方法であって、前記光検出領域の位置を移動する過程に於いて、前記光検出領域の位置が前記発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動されることを特徴とする方法。

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