JP5904947B2 - 単一発光粒子検出を用いた粒子の拡散特性値の測定方法 - Google Patents
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Description
<x(t)>2=2Dt …(1)
(ここで、<x(t)>は、変位の平均)
により定義されるので、かかる式(1)の関係を用いて、発光粒子の変位に基づいて算定されてよい。
ΔT=d/v …(2)
により与えられてよい。
2…光源
3…シングルモードオプティカルファイバー
4…コリメータレンズ
5…ダイクロイックミラー
6、7、11…反射ミラー
8…対物レンズ
9…マイクロプレート
10…ウェル(試料溶液容器)
12…コンデンサーレンズ
13…ピンホール
14…バリアフィルター
15…マルチモードオプティカルファイバー
16…光検出器
17…ミラー偏向器
17a…ステージ位置変更装置
18…コンピュータ
本発明による方法は、基本的な構成に於いて、図1(A)に模式的に例示されている如き、FCS、FIDA等が実行可能な共焦点顕微鏡の光学系と光検出器とを組み合わせてなる光分析装置により実現可能である。図1(A)を参照して、光分析装置1は、光学系2〜17と、光学系の各部の作動を制御すると共にデータを取得し解析するためのコンピュータ18とから構成される。光分析装置1の光学系は、通常の共焦点顕微鏡の光学系と同様であってよく、そこに於いて、光源2から放射されシングルモードファイバー3内を伝播したレーザー光(Ex)が、ファイバーの出射端に於いて固有のNAにて決まった角度にて発散する光となって放射され、コリメーター4によって平行光となり、ダイクロイックミラー5、反射ミラー6、7にて反射され、対物レンズ8へ入射される。対物レンズ8の上方には、典型的には、1〜数十μLの試料溶液が分注される試料容器又はウェル10が配列されたマイクロプレート9が配置されており、対物レンズ8から出射したレーザー光は、試料容器又はウェル10内の試料溶液中で焦点を結び、光強度の強い領域(励起領域)が形成される。試料溶液中には、観測対象物である発光粒子、典型的には、蛍光色素等の発光標識が付加された分子が分散又は溶解されており、発光粒子が励起領域に進入すると、その間、発光粒子が励起され光が放出される。放出された光(Em)は、対物レンズ8、ダイクロイックミラー5を通過し、ミラー11にて反射してコンデンサーレンズ12にて集光され、ピンホール13を通過する。なお、当業者に於いて知られている如く、ピンホール13は、対物レンズ8の焦点位置と共役の位置に配置されており、これにより、図1(B)に模式的に示されている如きレーザー光の焦点領域、即ち、励起領域内から発せられた光のみがピンホール13を通過し、焦点面以外からの光は遮断される。図1(B)に例示されたレーザー光の焦点領域は、通常、1〜10fL程度の実効体積を有する本光分析装置に於ける光検出領域であり、コンフォーカル・ボリュームと称される。コンフォーカル・ボリュームに於いては、典型的には、光強度が領域の中心を頂点とするガウス型分布又はローレンツ型分布となり、その実効体積は、光強度が1/e2となる面を境界とする略楕円球体の体積である。かくして、ピンホール13を通過した光は、ダイクロイックミラー14aを経て、バリアフィルター14を透過して(ここで、特定の波長帯域の光成分のみが選択される。)、マルチモードファイバー15に導入されて、対応する光検出器16に到達し、時系列の電気信号に変換された後、コンピュータ18へ入力され、後に説明される態様にて光分析のための処理が為される。光検出器16としては、好適には、フォトンカウンティングに使用可能な超高感度の光検出器が用いられ、これにより、1つの発光粒子からの光、例えば、一個又は数個の蛍光色素分子からの微弱光が検出可能となる。
「発明の概要」の欄に記載されている如く、本発明の方法によれば、端的に述べれば、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光検出領域の位置を試料溶液内にて所定の経路に沿って周期的に移動しながら、試料溶液中にて分散する発光粒子が光検出領域内に包含される際に放出する光を検出して発光粒子の存在を個別に検知する「走査分子計数法」に於いて、光検出領域が所定の経路を周回する間の発光粒子の位置のずれが反映される発光粒子の信号の発生時間の間隔に於ける光検出領域の移動周期からのずれ時間に基づいてその発光粒子の移動し易さ、即ち、発光粒子の拡散特性値又は拡散係数が算出される。かかる構成によれば、試料溶液中の発光粒子の各々を個別に検出し、その拡散特性値又は拡散係数が個別に測定されることになるので、試料溶液中の発光粒子濃度がFCS等の蛍光ゆらぎの大きさの算出のための統計的処理を要する分光分析技術で良好に測定可能な濃度よりも低い場合でも、発光粒子の拡散特性値又は拡散係数の測定が可能となる。以下、走査分子計数法及び本発明による拡散特性値又は拡散係数の測定方法の原理について説明する。
FCS等の分光分析技術は、従前の生化学的な分析技術に比して、必要な試料量が極めて少なく、且つ、迅速に検査が実行できる点で優れている。しかしながら、FCS等の分光分析技術では、原理的に、発光粒子の特性は、蛍光強度のゆらぎに基づいて算定されるので、精度のよい測定結果を得るためには、試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度が、図10(A)に模式的に描かれているように、蛍光強度の計測中に常に一個程度の発光粒子が光検出領域CV内に存在するレベルであり、同図の右側に示されている如く、計測時間中に常に有意な光強度(フォトンカウント)が検出されることが要求される。もし発光粒子の濃度又は数密度がそれよりも低い場合、例えば、図10(B)に描かれているように、発光粒子がたまにしか光検出領域CV内へ進入しないレベルである場合には、同図の右側に例示されている如く、有意な光強度の信号(フォトンカウント)が、計測時間の一部にしか現れないこととなり、精度のよい光強度のゆらぎの算定が困難となる。また、計測中に常に一個程度の発光粒子が光検出領域内に存在するレベルよりも発光粒子の濃度が大幅に低い場合には、光強度のゆらぎの演算に於いて、バックグラウンドの影響を受けやすく、演算に十分な量の有意な光強度データを得るために計測時間が長くなる。
上記の走査分子計数法に於いて、図3(A)に模式的に描かれている如く、光検出領域(CV)は、試料溶液中で、所定の経路(例えば、半径Rの円環)を通過するよう循環される。かかる光検出領域の移動の間、発光粒子は、ブラウン運動により、位置が移動するところ、一度検出された発光粒子(一度光検出領域に包含された発光粒子)が、光検出領域が所定の経路を周回する間に、光検出領域の通過する空間領域から逸脱しない場合には、その発光粒子は再び検出されることとなる。特に、発光粒子のブラウン運動の速度が比較的低いときには、一度検出された発光粒子は、しばらくの間、光検出領域の周回毎に光検出領域に包含されることとなるので、光強度データ上に於いて、発光粒子の光を表す信号が、図3(B)に模式的に例示されている如く、概ね、光検出領域が所定の経路を一周する時間(移動周期)tcycle毎に周期的に検出される。しかしながら、かかる周期的に検出される信号の発生時間の間隔は、光検出領域の移動周期に完全には一致しておらず、光検出領域が所定の経路を周回する時間に於ける発光粒子のブラウン運動による位置の移動に依存して光検出領域の移動周期に対して増減する、即ち、移動周期からのずれ時間が生ずることとなる。そこで、本発明に於いては、上記の周期的に検出される信号の発生時間の間隔に於ける光検出領域の移動周期からのずれ時間に基づいて、発光粒子のブラウン運動による移動のし易さ、即ち、拡散特性値の算出が試みられる。なお、以下、拡散特性値として、拡散係数を算出する例について説明されるが、その他の拡散特性値についても信号の発生時間の間隔に於ける移動周期からのずれ時間に基づいて適宜算出できることは理解されるべきであり、そのような場合も本発明の範囲に属することは理解されるべきである。
t=tk=to+k・tcycle+Δt …(3)
により与えられる。ここで、Δtは、発光粒子の位置の移動による発光粒子が光検出領域に包含される時刻のずれ、即ち、二つの信号の発生時間の間隔に於ける光検出領域の移動周期からのずれ時間である(Δtは、正又は負で有り得る。)。従って、k・tcycle(k周期)に於ける光検出領域の移動方向に沿った発光粒子の位置の変位x(k・tcycle)は、光検出領域の移動速度vを用いて、
x(k・tcycle)=vΔt …(4)
により与えられる。ところで、粒子の拡散係数Dと時間tに於ける粒子の一次元の変位x(t)の関係は、アインシュタイン−スモルコフスキー(Einstein-Smoluchowski)の式より、
<x(t)>2=2Dt …(5)
により与えられる。かくして、式(3)、(4)を用いて、周期的に検出される信号の発生時間の間隔に於ける光検出領域の移動周期からのずれ時間から発光粒子の位置の変位x(k・tcycle)を算出し、それらの変位を用いて、式(5)により、拡散係数Dを算定することが可能となる。
(2r)2>2δ・D・tcycle …(6)
(ここで、δは、次元であり、ここでは、δ=3である。)
を満たすよう調整される。なお、実際の測定に於いては、検査されるべき発光粒子の予想される拡散係数に於いて、上記の式(6)の条件が成立するよう光検出領域の移動周期tcycleが調整されてよい。
図1(A)に例示の光分析装置1を用いた本発明の方法による発光粒子の拡散係数の測定方法の実施形態に於いては、具体的には、(1)発光粒子を含む試料溶液の調製過程、(2)試料溶液の光強度の測定処理過程、及び(3)測定された光強度の分析処理過程が実行される。図4は、フローチャートの形式にて表した本実施形態に於ける処理過程を示している。
本発明の方法に於いて観測対象となる粒子は、溶解された分子等の、試料溶液中にて分散し溶液中にてランダムに運動する粒子であれば、任意のものであってよく、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞、或いは、金属コロイド、その他の非生物学的粒子などであってよい(試料溶液は、典型的には水溶液であるが、これに限定されず、有機溶媒その他の任意の液体であってよい。)。また、観測対象となる粒子は、それ自体が発光する粒子であってもよく、或いは、発光標識(蛍光分子、りん光分子、化学・生物発光分子)が任意の態様にて付加された粒子であってよい。
本実施形態の走査分子計数法による光強度の測定処理過程では、ミラー偏向器17を駆動して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動(試料溶液内の走査)を行いながら、光強度の測定が為される(図4−ステップ100)。操作処理に於いて、典型的には、マイクロプレート9のウェル10に試料溶液を注入して顕微鏡のステージ上に載置した後、使用者がコンピュータ18に対して、測定の開始の指示を入力すると、コンピュータ18は、記憶装置(図示せず)に記憶されたプログラム(試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動するべく光路を変更する手順と、光検出領域の位置の移動中に光検出領域からの光を検出する手順)に従って、試料溶液内の光検出領域に於ける励起光の照射及び光強度の計測が開始される。計測が開始されると、まず、コンピュータ18のプログラムに従った処理動作の制御下、光源2から、試料溶液中の発光粒子の励起波長の光が出射されると共に、ミラー偏向器17がミラー7(ガルバノミラー)を駆動して、ウェル10内に於いて光検出領域の位置の移動を実行し、これと同時に光検出器16は、逐次的に検出された光を電気信号に変換してコンピュータ18へ送信し、コンピュータ18は、任意の態様にて、送信された信号から時系列の光強度データを生成して保存する。典型的には、光検出器16は、一光子の到来を検出できる超高感度光検出器であるので、光の検出は、所定時間に亘って、逐次的に、所定の単位時間毎(BIN TIME)に、例えば、10μ秒毎に光検出器に到来するフォトンの数を計測する態様にて実行されるフォトンカウンティングであり、時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータであってよい。
(2r)2=6D・Δτ …(7)
から、
Δτ=(2r)2/6D …(8)
となるので、発光粒子がブラウン運動により移動する速度(拡散移動速度)Vdifは、概ね、
Vdif=2r/Δτ=3D/r …(9)
となる。そこで、光検出領域の位置の移動速度は、かかるVdifを参照して、それよりも十分に早い値に設定されてよい。例えば、発光粒子の拡散係数が、D=2.0×10−10m2/s程度であると予想される場合には、rが、0.62μm程度だとすると、Vdifは、1.0×10−3m/sとなるので、光検出領域の位置の移動速度は、その10倍以上の15mm/sと設定されてよい。なお、発光粒子の拡散係数が未知の場合には、光検出領域の位置の移動速度を種々設定して光強度の変化のプロファイルが、予想されるプロファイル(典型的には、励起光強度分布と略同様)となる条件を見つけるための予備実験を繰り返し実行して、好適な光検出領域の位置の移動速度が決定されてよい。
2πR=v・tcycle …(10)
により与えられるので、式(6)から、光検出領域の移動速度vは、
v>(3πR/r2)・D …(11)
も成立するよう設定される。
上記の処理により試料溶液中の発光粒子の時系列の光強度データが得られると、コンピュータ18に於いて、記憶装置に記憶されたプログラムに従った処理により、光強度データ上に於ける発光粒子からの光に対応する信号の検出、同一の発光粒子の信号の抽出、拡散係数の算出が実行される。
時系列の光強度データに於いて、一つの発光粒子の光検出領域を通過する際の軌跡が、図5(B)に示されている如く略直線状である場合、その粒子に対応する信号に於ける光強度の変化は、(光学系により決定される)光検出領域内の光強度分布を反映した略釣鐘状のプロファイルを有する(図8(B)参照)。従って、走査分子計数法では、基本的には、適宜設定される閾値を超える光強度が継続する時間幅が所定の範囲にあるとき、その光強度のプロファイルを有する信号が一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されるようになっていてよい。そして、閾値を超える光強度が継続する時間幅が所定の範囲にない信号は、ノイズ又は異物の信号として判定される。また、光検出領域の光強度分布が、ガウス分布:
I=A・exp(−2t2/a2) …(12)
であると仮定できるときには、有意な光強度のプロファイル(バックグラウンドでないと明らかに判断できるプロファイル)に対して式(12)をフィッティングして算出された強度A及び幅aが所定の範囲内にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されてよい。(強度A及び幅aが所定の範囲外にある信号は、ノイズ又は異物の信号として判定され、その後の分析等に於いて無視されてよい。)
時系列光強度データ上に於ける発光粒子のパルス信号の検出が為されると、それらのパルス信号のうちから、同一の発光粒子の信号の抽出が為される。上記までの説明から理解される如く、同一の発光粒子の信号は、光検出領域の移動周期に(完全に一致しないが)概ね等しい周期にて連続的に出現する。そこで、同一の発光粒子の信号の抽出は、光検出領域の移動周期に概ね等しい周期にて連続的に出現する信号を任意の手法又はアルゴリズムにより選択することにより為されてよい。例えば、最も単純には、実験者が時系列光強度データ上に於いて光検出領域の移動周期に概ね等しい周期にて連続的に出現する信号を目視によって特定することにより、同一の発光粒子の信号が抽出されてよい。
ΔT=d/v …(2)
の範囲内に発生した信号は、前記の一つの発光粒子と同一の発光粒子の信号であると判断できる。そこで、同一の発光粒子の信号の抽出方法の一つとして、時系列光強度データ上に於いて、1つの発光粒子の信号の発生時間に光検出領域の周期を加算した時間を中心とする時間幅ΔTの範囲内に発生した信号が、前記の1つの信号に対応する発光粒子と同一の発光粒子の信号であると判定するアルゴリズムが採用されてよい。より具体的には、図7(A)に模式的に例示されている如く、例えば、或る発光粒子の信号α(i)を選択した後、その選択された信号α(i)の発生時刻(ピーク時であってよい。)から光検出領域の一周期が経過する時間を中心として、時間幅ΔTの範囲内に信号α(ii)が存在する場合には、その信号α(ii)が信号α(i)と同一の発光粒子の信号として選択される。しかる後、更に、選択された信号α(ii)の発生時刻から光検出領域の一周期が経過する時間(tcycle)を中心として、時間幅ΔTの範囲内に信号α(iii)が存在する場合には、その信号α(iii)が既に選択された信号α(i)、α(ii)と同一の発光粒子の信号として選択される。かくして、新たに信号が選択される毎に、その選択された信号の発生時刻から光検出領域の一周期が経過する時間を中心として時間幅ΔTの範囲内に存在する信号を選択する処理を順に反復して実行することにより、時系列光強度データ上に於いて、同一の発光粒子の一連の信号(信号群)を抽出することが可能となる。(なお、最初に選択された信号の発生時刻を基準として、光検出領域の移動周期(tcycle)が経過する毎に、各周期が終了する時間を中心として、時間幅ΔTの範囲内に存在する信号が最初に選択された信号と同一の発光粒子の信号として選択されるようになっていてもよい。)
上記の如く(発光粒子毎に)同一の発光粒子の信号群が抽出されると、各信号の発生時間の間隔に於ける光検出領域の移動周期からのずれ時間に基づいて発光粒子の変位が見積もられる。既に触れたように、光検出領域が所定の経路をk周する時間(k・tcycle)の発光粒子の変位は、k回の光検出領域の周回に於ける最初の信号の発生時間toと最後の信号の発生時間tkとの間に於けるk周期に相当する時間k・tcycleからのずれ時間
Δt=tk−to−k・tcycle …(13)
を用いて、式(4)にて算出される。従って、発光粒子の変位の算出に於いては、典型的には、抽出された信号群に於ける信号のうちから二つの信号の組合せの全てについて、式(13)により、ずれ時間Δtが算出され、算出されたΔtに光検出領域の移動速度vが乗ぜられて(式(4)により)、各信号の発生時間の間隔に於ける発光粒子の変位xが算出されてよい。例えば、図7(B)の如く、5個の信号が略周期的な信号が検出されているとすると、光検出領域の移動の1周期、2周期、3周期及び4周期に相当する時間に於けるずれ時間(粒子の変位)を与える信号の組合せ数は、それぞれ、4組(1、5、8、10)、3組(2、6、9)、2組(3、7)及び1組(4)となり、全部で、10個のずれ時間及び粒子の変位のデータが算出されることとなる。そして、発光粒子の信号群の信号数がn個であるときには、1〜n−1周期に相当する時間の各々に対して、ずれ時間及び粒子の変位のデータが得られ、データの総数は、n(n−1)/2個となる。
かくして、上記のステップ180に於ける処理により、一つの発光粒子の、光検出領域の移動時間(周回数×移動周期)の各々に於ける粒子の変位が算出されると、式(5)の関係を用いて、その発光粒子の拡散係数Dが算出される。例えば、一つの態様に於いては、図7(C)に模式的に例示されている如く、時間(周回数×移動周期)に対するステップ180で得られた粒子の変位の二乗値x2のプロットに対して、最小二乗法等により直線をフィッティングし、その直線の傾き(=2D)から、拡散係数Dが算出されてよい(直線のフィッティングに於いては、粒子の変位の二乗値x2(図中、×)に対して直線をフィッティングが為されるか、周期毎の粒子の変位の二乗値x2の平均値(図中、●)に対して直線をフィッティングが為されてよい。)。また、それぞれの粒子の変位xについて、
D=x2/(2k・tcycle) …(14)
を算出し、算出されたDの平均値をその発光粒子の拡散係数としてもよい。
本発明の方法により発光粒子の拡散係数が測定されることを検証した。
20μ秒<パルス幅<400μ秒
ピーク強度>1.0[pc/10μs] …(A)
相関係数>0.95
を満たすパルス信号のみを発光粒子に対応する信号であると判定する一方、上記の条件を満たさないパルス信号はノイズとして無視した。
信号1 1510.741
信号2 1520.726
信号3 1530.738
信号4 1540.767
信号5 1550.825
これらの一連の信号の周期は、光検出領域の移動周期に略等しく、同一の発光粒子の信号であると考えられる。そこで、上記の信号のピーク時刻を用いて、「(iii)発光粒子の変位の算出」に記載されている要領にて、5つの信号のうちの二つの信号の組合せの全てについて、式(13)により、信号の発生時間の間隔に於ける移動周期に相当する時間(周期数×移動周期)からのずれ時間Δtを算出し、更に、式(4)により発光粒子の変位xを算出した。図8(C)は、かくして算出された変位xの二乗値(x2)を時間(周期数×移動周期)に対してプロットした図である(各点は、各時間に於ける変位xの二乗値の平均値である。)。図から理解される如く、変位xの二乗値x2の平均値は、時間に対して略比例した。このことは、変位xの二乗値x2の平均値と時間との間に式(5)にて表される関係が成立しており、上記の信号の発生時間の間隔に於ける移動周期に相当する時間からのずれ時間Δtに基づいて、ブラウン運動による発光粒子の変位xが算定できることを示している。なお、図8(C)のプロットに対して、最小二乗法により直線をフィッティングして得られた直線の傾き(=2D)から得られた拡散係数Dは、3.89×10−11[m2/s]であった。
Claims (6)
- 共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子の拡散特性値を測定する方法であって、
前記光学系の光路を変更することにより前記試料溶液内に於いて前記光学系の光検出領域の位置を所定の経路に沿って周期的に移動する過程と、
前記試料溶液内に於いて前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出領域からの光の強度を測定して光強度データを生成する過程と、
前記光強度データ上に於いて発光粒子の光を表す信号を個別に検出する過程と、
前記検出された発光粒子の光を表す信号のうち、同一の発光粒子に対応する複数の信号を抽出する過程と、
前記抽出された信号の発生時間の間隔に於ける前記光検出領域の移動周期からのずれ時間に基づいて前記抽出された信号に対応する発光粒子の拡散特性値を算出する過程と
を含み、
前記同一の発光粒子に対応する複数の信号を抽出する過程に於いて、前記検出された発光粒子の光を表す信号のうちの1つの信号の発生時間に前記光検出領域の周期を加算した時間を中心とする前記光検出領域の寸法と移動速度とに基づいて決定される時間幅内に発生した信号が前記1つの信号に対応する発光粒子と同一の発光粒子の信号であると判定されることを特徴とする方法。 - 請求項1の方法であって、前記拡散特性値を算出する過程に於いて、前記抽出された信号の発生時間の間隔に於ける前記光検出領域の移動周期からのずれ時間と前記光検出領域の移動速度とから算出される前記抽出された信号に対応する発光粒子の変位に基づいて前記拡散特性値が算出されることを特徴とする方法。
- 請求項1の方法であって、前記抽出された信号の発生時間の間隔が複数の連続した前記抽出された信号のうちのいずれか二つの信号の発生時間の時間差であることを特徴する方法。
- 請求項1の方法であって、前記光強度データ上に於いて複数の発光粒子からの光を表す信号が存在している場合には、前記複数の発光粒子の各々について別々に前記拡散特性値が算出されることを特徴とする方法。
- 請求項1乃至4のいずれかの方法であって、前記拡散特性値が拡散係数であることを特徴とする方法。
- 請求項1乃至5のいずれかの方法であって、前記光検出領域の位置が前記試料溶液中の発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動されることを特徴とする方法。
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