JP6013337B2 - 単一発光粒子検出を用いた光分析装置、光分析方法及び光分析用コンピュータプログラム - Google Patents
単一発光粒子検出を用いた光分析装置、光分析方法及び光分析用コンピュータプログラム Download PDFInfo
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Description
溶液への接近方向が容器底面からに限定されるマイクロタイタプレートへの適応が難しい。
v2・τ1>d
を満たすよう、光検出領域の位置の移動周期τ1と第二の経路の位置の移動v2とが設定される。これにより、光検出領域の位置が第二の経路を一周する間に第二の経路が少なくとも光検出領域の直径に相当する距離を移動することとなるので、光検出領域の位置の連続する周回に於いて光検出領域が前回の周回で通過した領域に重複することが回避されることとなる。
v2・τ1>d
を満たすよう設定されることが好ましい。そして、第二の経路に沿った光検出領域の位置の移動は、光学系の光路を変更することにより為され、第一の経路に沿った試料溶液内に於ける第二の経路の位置の移動は、試料溶液の位置を移動することにより為されてよい。その場合、光学系の光路を変更することによる試料溶液内での光検出領域の位置の移動は、例えば、レーザー走査型光学顕微鏡に於いて採用されているガルバノミラーを用いるなどして、顕微鏡の光学系の光路を変更して光検出領域の位置が変更されるようになっていてよい。また、第二の経路は円形又は楕円形であり、第一の経路は円形、楕円形又は直線であってよい。更に、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、発光粒子の特性、試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて適宜変更可能となっていてよく、好適には、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、検出対象となる発光粒子の拡散移動速度よりも高く設定される。
v2・τ1>d
を満たすよう設定されることが好ましい。そして、第二の経路に沿って光検出領域の位置の移動は、光学系の光路を変更することにより為され、第一の経路に沿って試料溶液内に於ける第二の経路の位置の移動は、試料溶液の位置を移動することにより為されてよい。その場合、光学系の光路を変更することによる試料溶液内での光検出領域の位置の移動は、例えば、レーザー走査型光学顕微鏡に於いて採用されているガルバノミラーを用いるなどして、顕微鏡の光学系の光路を変更して光検出領域の位置が変更されるようになっていてよい。また、第二の経路は円形又は楕円形であり、第一の経路は円形、楕円形又は直線であってよい。更に、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、発光粒子の特性、試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて適宜変更可能となっていてよく、好適には、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、検出対象となる発光粒子の拡散移動速度よりも高く設定される。
2…光源
3…シングルモードオプティカルファイバー
4…コリメータレンズ
5…ダイクロイックミラー
6、7、11…反射ミラー
8…対物レンズ
9…マイクロプレート
10…ウェル(試料溶液容器)
12…コンデンサーレンズ
13…ピンホール
14…バリアフィルター
14a…ダイクロイックミラー又は偏光ビームスプリッタ
15…マルチモードオプティカルファイバー
16…光検出器
17…ミラー偏向器
17a…ステージ位置変更装置
18…コンピュータ
本発明による光分析技術を実現する光分析装置は、基本的な構成に於いて、図1(A)に模式的に例示されている如き、FCS、FIDA等が実行可能な共焦点顕微鏡の光学系と光検出器とを組み合わせてなる装置であってよい。同図を参照して、光分析装置1は、光学系2〜17と、光学系の各部の作動を制御すると共にデータを取得し解析するためのコンピュータ18とから構成される。光分析装置1の光学系は、通常の共焦点顕微鏡の光学系と同様であってよく、そこに於いて、光源2から放射されシングルモードファイバー3内を伝播したレーザー光(Ex)が、ファイバーの出射端に於いて固有のNAにて決まった角度にて発散する光となって放射され、コリメーター4によって平行光となり、ダイクロイックミラー5、反射ミラー6、7にて反射され、対物レンズ8へ入射される。対物レンズ8の上方には、典型的には、1〜数十μLの試料溶液が分注される試料容器又はウェル10が配列されたマイクロプレート9が配置されており、対物レンズ8から出射したレーザー光は、試料容器又はウェル10内の試料溶液中で焦点を結び、光強度の強い領域(励起領域)が形成される。試料溶液中には、観測対象物である発光粒子、典型的には、蛍光性粒子又は蛍光色素等の発光標識が付加された粒子が分散又は溶解されており、かかる発光粒子が励起領域に進入すると、その間、発光粒子が励起され光が放出される。放出された光(Em)は、対物レンズ8、ダイクロイックミラー5を通過し、ミラー11にて反射してコンデンサーレンズ12にて集光され、ピンホール13を通過し、バリアフィルター14を透過して(ここで、特定の波長帯域の光成分のみが選択される。)、マルチモードファイバー15に導入されて、光検出器16に到達し、時系列の電気信号に変換された後、コンピュータ18へ入力され、後に説明される態様にて光分析のための処理が為される。なお、当業者に於いて知られている如く、上記の構成に於いて、ピンホール13は、対物レンズ8の焦点位置と共役の位置に配置されており、これにより、図1(B)に模式的に示されている如きレーザー光の焦点領域、即ち、励起領域内から発せられた光のみがピンホール13を通過し、励起領域以外からの光は遮断される。図1(B)に例示されたレーザー光の焦点領域は、通常、1〜10fL程度の実効体積を有する本光分析装置に於ける光検出領域であり(典型的には、光強度が領域の中心を頂点とするガウス様分布となる。実効体積は、光強度が1/e2となる面を境界とする略楕円球体の体積である。)、コンフォーカル・ボリュームと称される。また、本発明では、1つの発光粒子からの光、例えば、一つの蛍光色素分子からの微弱光が検出されるので、光検出器16としては、好適には、フォトンカウンティングに使用可能な超高感度の光検出器が用いられる。光の検出がフォトンカウンティングによる場合、光強度の測定は、所定時間に亘って、逐次的に、所定の単位時間毎(BIN TIME)に、光検出器に到来するフォトンの数を計測する態様にて実行される。従って、この場合、時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータである。また、顕微鏡のステージ(図示せず)には、観察するべきウェル10を変更するべく、マイクロプレート9の水平方向位置を移動するためのステージ位置変更装置17aが設けられていてよい。ステージ位置変更装置17aの作動は、コンピュータ18により制御されてよい。かかる構成により、検体が複数在る場合にも、迅速な計測が達成可能となる。
「発明の概要」の欄に記載されている如く、本発明の光分析技術に於いては、端的に述べれば、走査分子計数法に於いて、試料溶液内の平面内にて、光検出領域の位置の移動中に、光検出領域の位置の走査軌道を移動させて、短時間の内にできるだけ同一の領域を通過しないようにすることによって、同一の発光粒子を別の粒子として検出すること及び光検出領域の寸法や形状の変化をできるだけ回避し、発光粒子の検出数に於けるばらつきの抑制、検出精度の向上が図られる。以下、本発明の走査分子計数法の原理、光検出領域の周回移動の態様について説明する。
FCS、FIDA等の分光分析技術は、従前の生化学的な分析技術に比して、必要な試料量が極めて少なく、且つ、迅速に検査が実行できる点で優れている。しかしながら、FCS、FIDA等の分光分析技術では、原理的に、発光粒子の濃度や特性は、蛍光強度のゆらぎに基づいて算定されるので、精度のよい測定結果を得るためには、試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度が、図7(A)に模式的に描かれているように、蛍光強度の計測中に常に一個程度の発光粒子が光検出領域CV内に存在するレベルであり、同図の右側に示されている如く、計測時間中に常に有意な光強度(フォトンカウント)が検出されることが要求される。もし発光粒子の濃度又は数密度がそれよりも低い場合、例えば、図7(B)に描かれているように、発光粒子がたまにしか光検出領域CV内へ進入しないレベルである場合には、同図の右側に例示されている如く、有意な光強度の信号(フォトンカウント)が、計測時間の一部にしか現れないこととなり、精度のよい光強度のゆらぎの算定が困難となる。また、計測中に常に一個程度の発光粒子が光検出領域内に存在するレベルよりも発光粒子の濃度が大幅に低い場合には、光強度のゆらぎの演算に於いて、バックグラウンドの影響を受けやすく、演算に十分な量の有意な光強度データを得るために計測時間が長くなる。
上記の走査分子計数法に於いて、光検出領域の位置の移動は、後により詳細に説明される如く、発光粒子のブラウン運動による移動速度(拡散移動速度)よりも高速であることが好ましい。また、発光粒子その他の物質の安定性のために、試料溶液内の流れや振動等の擾乱は最小にすべきである。従って、光検出領域の位置の移動は、原則としては、顕微鏡の光学系の光路の変更による方が好ましい。上記に説明されている如く、ミラー偏向器17による光路の変更によれば、光検出領域の位置の移動を比較的容易に高速にて実行可能だからである。この点に関し、対物レンズの視野の周縁は、一般に収差が大きくなり、光検出領域の寸法や形状が場所によって異なる可能性があるため、光路の変更による光検出領域の位置の移動範囲は、対物レンズの収差の少ない視野の中心付近の領域内にて実行されることが好ましい。しかしながら、光検出領域の位置の移動範囲が対物レンズの視野の中心付近の領域内に限られると、光検出領域の通過する領域、即ち、走査領域が小さくなり、検出され得る発光粒子の数も少なくなる。また、小さい領域を繰り返し通過する場合には、特に、拡散の遅い粒子については、その存在領域を光検出領域が繰り返し通過することとなり、同一の粒子を複数回検出することとなる。もっとも、意図的に同一の粒子からの光を繰り返し検出することにより、その光の特性を精度よく見積もることも有用であるが、発光粒子の数のカウンティングや濃度又は数密度の検出など、できるだけ発光粒子の検出数を多くしたいときには、同一の粒子を複数回検出することをせずに、より広範囲の領域又はより長い距離を走査できることが好ましい。また、その際、発光粒子の濃度についての情報を得たいときには、光検出領域の寸法や形状に変化が殆どなく、走査領域(光検出領域の通過領域)の長さ又は体積の見積が容易であることが好ましい。
v2・τ1>d …(1)
の関係が成立するよう設定される。具体的には、光検出領域の直径dは、0.4〜30μmであり、光検出領域の走査軌道上の移動周期τ1が0.6〜600m秒であるとすると、試料溶液の位置の移動速度v2は、0.67μm/秒以上となる。実際には、通常、光検出領域の走査軌道上の移動周期τ1は、6〜60m秒と設定されるので、その場合には、試料溶液の位置の移動速度v2は、17μm/秒以上となる。光検出領域の走査軌道上での移動速度は、典型的には、10〜90mm/秒に設定されるので、試料溶液の位置の移動速度v2は、殆ど無視できるほど小さい。
図1(A)に例示の光分析装置1を用いた本発明に従った走査分子計数法の実施形態に於いては、具体的には、(1)発光粒子を含む試料溶液の調製、(2)試料溶液の光強度の測定処理、及び(3)測定された光強度の分析処理が実行される。図3は、フローチャートの形式にて表した本実施形態に於ける処理を示している。
本発明の光分析技術の観測対象物となる粒子は、溶解された分子等の、試料溶液中にて分散し溶液中にてランダムに運動する粒子であれば、任意のものであってよく、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞、或いは、金属コロイド、その他の非生物学的分子などであってよい。観測対象物となる粒子が光を発する粒子でない場合には、発光標識(蛍光分子、りん光分子、化学・生物発光分子)が観測対象物となる粒子に任意の態様にて付加されたものが用いられる。試料溶液は、典型的には水溶液であるが、これに限定されず、有機溶媒その他の任意の液体であってよい。
本実施形態の走査分子計数法による光分析に於ける光強度の測定は、測定中にミラー偏向器17及びステージ位置変更装置17aを駆動して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動(試料溶液内の走査)及び試料溶液の移動を行う他は、FCS又はFIDAに於ける光強度の測定過程と同様の態様にて実行されてよい。操作処理に於いて、典型的には、マイクロプレート9のウェル10に試料溶液を注入して顕微鏡のステージ上に載置した後、使用者がコンピュータ18に対して、測定の開始の指示を入力すると、コンピュータ18は、記憶装置(図示せず)に記憶されたプログラム(試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動する手順と、光検出領域の位置の移動中に光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する手順)に従って、試料溶液内の光検出領域に於ける励起光の照射及び光強度の計測が開始される。かかる計測中、コンピュータ18のプログラムに従った処理動作の制御下、まず、ミラー偏向器17は、ミラー7(ガルバノミラー)を駆動して、ウェル10内に於いて走査軌道に沿った光検出領域の位置の周回移動を実行すると共に、ステージ位置変更装置17aが顕微鏡のステージ上のマイクロプレート9の位置を移動する。これと同時に光検出器16は、逐次的に検出された光を電気信号に変換してコンピュータ18へ送信し、コンピュータ18では、任意の態様にて、送信された信号から時系列の光強度データを生成して保存する。かくして、これらの処理が、任意の時間に亘って実行され、一回の測定が終了する。なお、典型的には、光検出器16は、一光子の到来を検出できる超高感度光検出器であるので、光の検出が、フォトンカウンティングによる場合、時系列光強度データは、時系列のフォトンカウントデータであってよい。
(2Wo)2=6D・Δt …(2)
から、
Δt=(2Wo)2/6D …(3)
となるので、発光粒子がブラウン運動により移動する速度(拡散移動速度)Vdifは、概ね、
Vdif=2Wo/Δt=3D/Wo …(4)
となる。そこで、光検出領域の位置の移動速度は、かかるVdifを参照して、それよりも十分に早い値に設定されてよい。例えば、観測対象粒子の拡散係数が、D=2.0×10−10m2/s程度であると予想される場合には、Woが、0.62μm程度だとすると、Vdifは、1.0×10−3m/sとなるので、光検出領域の位置の移動速度は、その10倍以上の15mm/sなどと設定されてよい。なお、観測対象粒子の拡散係数が未知の場合には、光検出領域の位置の移動速度を種々設定して光強度の変化のプロファイルが、予想されるプロファイル(典型的には、励起光強度分布と略同様)となる条件を見つけるための予備実験を繰り返し実行して、好適な光検出領域の位置の移動速度が決定されてよい。
上記の処理により試料溶液中の発光粒子の時系列の光強度データが得られると、コンピュータ18に於いて、記憶装置に記憶されたプログラムに従った処理により、光強度データ上に於ける発光粒子からの光に対応する信号の検出、発光粒子濃度の算出等の分析が実行される。
時系列の光強度データに於いて、一つの発光粒子の光検出領域を通過する際の軌跡が、図4(B)に示されている如く略直線状である場合、その粒子に対応する信号に於ける光強度の変化は、(光学系により決定される)光検出領域内の光強度分布を反映した略釣鐘状のプロファイルを有する(図4(C)最上段参照)。従って、走査分子計数法では、基本的には、適宜設定される閾値を超える光強度が継続する時間幅が所定の範囲にあるとき、その光強度のプロファイルを有する信号が一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されるようになっていてよい。そして、閾値を超える光強度が継続する時間幅が所定の範囲にない信号は、ノイズ又は異物の信号として判定される。また、光検出領域の光強度分布が、ガウス分布:
I=A・exp(−2t2/a2) …(5)
であると仮定できるときには、有意な光強度のプロファイル(バックグラウンドでないと明らかに判断できるプロファイル)に対して式(5)をフィッティングして算出された強度A及び幅aが所定の範囲内にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されてよい。(強度A及び幅aが所定の範囲外にある信号は、ノイズ又は異物の信号として判定され、その後の分析等に於いて無視されてよい。)
下記の条件:
20μ秒<パルス幅<400μ秒
ピーク強度>1.0[pc/10μs] …(A)
相関係数>0.95
を満たすか否か等が判定される(ステップ150)。かくして、図5左に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが一つの発光粒子に対応する信号に於いて想定される範囲内にあると判定された信号は、一つの発光粒子に対応する信号であると判定され、これにより、一つの発光粒子が検出されたこととなる。一方、図5右に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが想定される範囲内になかったパルス信号は、ノイズとして無視される。
更に、検出された発光粒子の信号の数を計数して、発光粒子の数の決定が為されてもよい(発光粒子のカウンティング)。また、任意の手法にて、光検出領域の通過した領域の総体積が算定されれば、その体積値と発光粒子の数とから試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度が決定される(ステップ170)。
Vt=N/C …(6)
により与えられる。また、対照溶液として、発光粒子の複数の異なる濃度の溶液が準備され、それぞれについて測定が実行されて、算出されたVtの平均値が光検出領域の通過した領域の総体積Vtとして採用されるようになっていてよい。そして、Vtが与えられると、発光粒子のカウンティング結果がnの試料溶液の発光粒子の濃度cは、
c=n/Vt …(7)
により与えられる。なお、光検出領域の体積、光検出領域の通過した領域の総体積は、上記の方法によらず、任意の方法にて、例えば、FCS、FIDAを利用するなどして与えられるようになっていてよい。また、本実施形態の光分析装置に於いては、想定される光検出領域の移動パターンについて、種々の標準的な発光粒子についての濃度Cと発光粒子の数Nとの関係(式(6))の情報をコンピュータ18の記憶装置に予め記憶しておき、装置の使用者が光分析を実施する際に適宜記憶された関係の情報を利用できるようになっていてよい。
発光粒子信号の検出が為されると、発光粒子濃度の他に、信号の強度値を用いて種々の発光粒子の光の特性、発光粒子自体の特性に関する情報(信号の特徴量)を得ることが可能となる。例えば、検出光の計測に於いて、検出光を偏光方向毎に別々に計測して、偏光方向毎に光強度データを生成している場合、それらの光強度データからそれぞれ得られた信号の強度値から偏光度、偏光異方性等の偏光特性を表す任意指標値が算出され、かかる指標値から更に発光粒子の回転拡散特性の指標値を算出することが可能である。また、検出光の計測に於いて、検出光を複数の波長帯域の成分を別々に計測して、波長帯域毎に光強度データを生成している場合、それらの光強度データからそれぞれ得られた信号の強度値から発光粒子の発光波長スペクトルに関する情報(例えば、複数の波長に於ける強度比)を得ることが可能である。ここで理解されるべきことは、本発明の対象となっている走査分子計数法では、上記の如き発光粒子の光の特性、発光粒子自体の特性に関する情報が発光粒子毎に決定されるという点である。
(モレキュラー・ビーコンの標的となる核酸の調製)
k-Ras遺伝子を人工的に合成し、プラスミドへ挿入してクローニングにより精製した(合成及び精製は北海道システムサイエンスへ依頼)。合成したプラスミドをテンプレート(pUC57ベクターにk-RasWt配列を挿入したテンプレート)として、k-Rasプラスミド10000コピー、0.1μM FwPrimer(Fasmac)、0.1μM RePrimer(Fasmac)、0.125U PrimeStar Taq(TaKaRa,R010A)、1倍 PrimeStar Buffer、800mM dNTPs、2% DMSOを10μLの反応容量で、(98℃ 10秒→72℃ 3分)×35サイクルのサーマルサイクルにてPCR増幅した。そして、PCR産物を、ウィザード・SVゲル・アンド・PCRクリーンアップ・システム(Wizard SV Gel and PCR Clean-Up system (Promega,A9281)を用いて精製し、標的配列を有する核酸を調製した。なお、FwPrimer(kRas遺伝子増幅用)は、配列番号1の塩基配列を有し、RePrimer(kRas遺伝子増幅用)は、配列番号2を有し、pUC57ベクターにk-Rasを導入したテンプレートは、配列番号3の塩基配列を有する。
配列番号4の塩基配列を有するDNAの5’末端にATTO647Nが標識され、3’末端にBHQ2が標識されたモレキュラー・ビーコン(83b、20pM、シグマジェノシス)と、k-Ras遺伝子を挿入したプラスミドをPCR増幅して精製したテンプレート(0〜50pM)を混合し、Trisバッファ(10mM Tris-HCl(pH8.0)、400mM NaCl、0.1% PluronicF-127、10%デキストラン硫酸))中で、95℃ 2分、60℃ 3時間のアニーリングを行い、10℃にて保存し回収した。
20μ秒<パルス幅<400μ秒
ピーク強度>1.0[pc/10μs] …(A)
相関係数>0.95
を満たすパルス信号のみを発光粒子に対応する信号であると判定する一方、上記の条件を満たさないパルス信号はノイズとして無視し、発光粒子に対応する信号であると判定された信号の数を「パルス数」として計数した。なお、上記のピーク強度の閾値は、光検出器APD自身のノイズが発光粒子の信号として誤検出されない程度の大きさである。
Claims (27)
- 共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析装置であって、
前記試料溶液内の平面内に於いて前記光学系の光検出領域の位置を移動する光検出領域移動部と、
前記光検出領域からの光を検出する光検出部と、
前記試料溶液内に於いて前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出部にて検出された前記光検出領域からの光の時系列の光強度データを生成し、前記時系列の光強度データを平滑化し、前記平滑化された時系列の光強度データに於いて所定の閾値を超える強度を有する釣鐘型のパルス状信号を単一の前記発光粒子からの光を表す信号として検出することにより前記発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出する信号処理部とを含み、
前記光検出領域移動部が、第一の経路に沿って位置が移動する第二の経路に沿って前記光検出領域の位置を移動することを特徴とする装置。 - 請求項1の装置であって、前記第一及び第二の経路が循環経路であり、前記第二の経路に沿った前記光検出領域の位置の移動周期が前記第一の経路に沿った前記第二の経路の位置の移動周期よりも短いことを特徴とする装置。
- 請求項2の装置であって、前記光検出領域の位置の移動周期τ1と前記第二の経路の位置の移動速度v2と前記光検出領域の直径dとが、
v2・τ1>d
を満たすことを特徴とする装置。 - 請求項1乃至3のいずれかの装置であって、前記光学系の光路を変更することにより前記第二の経路に沿って前記光検出領域の位置が移動され、前記試料溶液の位置を移動することにより前記第一の経路に沿って前記試料溶液内に於ける前記第二の経路の位置が移動されることを特徴とする装置。
- 請求項1乃至4のいずれかの装置であって、前記第二の経路が円形又は楕円形であり、前記第一の経路が円形、楕円形又は直線であることを特徴とする装置。
- 請求項1乃至5の装置であって、前記光検出領域移動部が前記発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて前記光検出領域の位置を移動することを特徴とする装置。
- 請求項1乃至6のいずれかの装置であって、前記信号処理部が、前記個別に検出された発光粒子からの光を表す信号の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記発光粒子の数を計数することを特徴とする装置。
- 請求項1乃至7のいずれかの装置であって、前記信号処理部が、前記所定の閾値より大きい強度を有する光を表す信号が検出されたときに1つの発光粒子が前記光検出領域に入ったことを検出することを特徴とする装置。
- 請求項1乃至8のいずれかの装置であって、前記信号処理部が前記検出された発光粒子の数に基づいて、前記試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度を決定することを特徴とする装置。
- 共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析方法であって、
前記試料溶液内の平面内に於いて前記光学系の光検出領域の位置を移動する光検出領域移動過程と、
前記光検出領域の位置の移動の間に前記光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する時系列光強度データ生成過程と、
前記時系列の光強度データを平滑化し、前記平滑化された時系列光強度データに於いて所定の閾値を超える強度を有する釣鐘型のパルス状信号を単一の前記発光粒子からの光を表す信号として検出することにより、前記発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出する発光粒子信号検出過程と
を含み、
前記光検出領域移動過程に於いて、第一の経路に沿って位置が移動する第二の経路に沿って前記光検出領域の位置が移動されることを特徴とすることを特徴とする方法。 - 請求項10の方法であって、前記第一及び第二の経路が循環経路であり、前記第二の経路に沿った前記光検出領域の位置の移動周期が前記第一の経路に沿った前記第二の経路の位置の移動周期よりも短いことを特徴とする方法。
- 請求項10又は11の方法であって、前記光検出領域の位置の移動周期τ1と前記第二の経路の位置の移動速度v2と前記光検出領域の直径dとが、
v2・τ1>d
を満たすことを特徴とする方法。 - 請求項10乃至12のいずれかの方法であって、前記光学系の光路を変更することにより前記第二の経路に沿って前記光検出領域の位置が移動され、前記試料溶液の位置を移動することにより前記第一の経路に沿って前記試料溶液内に於ける前記第二の経路の位置が移動されることを特徴とする方法。
- 請求項10乃至13のいずれかの方法であって、前記第二の経路が円形又は楕円形であり、前記第一の経路が円形、楕円形又は直線であることを特徴とする方法。
- 請求項10乃至14の方法であって、前記光検出領域移動過程に於いて、前記発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて前記光検出領域の位置を移動することを特徴とする方法。
- 請求項10乃至15のいずれかの方法であって、更に、前記個別に検出された発光粒子からの光を表す信号の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記発光粒子の数を計数する過程を含むことを特徴とする方法。
- 請求項10乃至16のいずれかの方法であって、前記発光粒子信号検出過程に於いて、前記所定の閾値より大きい強度を有する光を表す信号が検出されたときに1つの発光粒子が前記光検出領域に入ったことが検出されることを特徴とする方法。
- 請求項10乃至17のいずれかの方法であって、更に、前記検出された発光粒子の数に基づいて、前記試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度を決定する過程を含むことを特徴とする方法。
- 共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出するための光分析用コンピュータプログラムであって、
前記試料溶液内の平面内に於いて第一の経路に沿って位置が移動する第二の経路に沿って前記光学系の光検出領域の位置を移動する光検出領域移動手順と、
前記光検出領域の位置の移動の間に前記光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する時系列光強度データ生成手順と、
前記時系列の光強度データを平滑化し、前記平滑化された時系列光強度データに於いて所定の閾値を超える強度を有する釣鐘型のパルス状信号を単一の前記発光粒子からの光を表す信号として検出することにより、前記発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出する発光粒子信号検出手順と
をコンピュータに実行させることを特徴とするコンピュータプログラム。 - 請求項19のコンピュータプログラムであって、前記第一及び第二の経路が循環経路であり、前記第二の経路に沿った前記光検出領域の位置の移動周期が前記第一の経路に沿った前記第二の経路の位置の移動周期よりも短いことを特徴とするコンピュータプログラム。
- 請求項19又は20のコンピュータプログラムであって、前記光検出領域の位置の移動周期τ1と前記第二の経路の位置の移動速度v2と前記光検出領域の直径dとが、
v2・τ1>d
を満たすことを特徴とするコンピュータプログラム。 - 請求項19乃至21のいずれかのコンピュータプログラムであって、前記光学系の光路を変更することにより前記第二の経路に沿って前記光検出領域の位置が移動され、前記試料溶液の位置を移動することにより前記第一の経路に沿って前記試料溶液内に於ける前記第二の経路の位置が移動されることを特徴とするコンピュータプログラム。
- 請求項19乃至22のいずれかのコンピュータプログラムであって、前記第二の経路が円形又は楕円形であり、前記第一の経路が円形、楕円形又は直線であることを特徴とするコンピュータプログラム。
- 請求項19乃至23の方法であって、前記光検出領域移動手順に於いて、前記発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて前記光検出領域の位置を移動することを特徴とするコンピュータプログラム。
- 請求項19乃至24のいずれかのコンピュータプログラムであって、更に、前記個別に検出された発光粒子からの光を表す信号の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記発光粒子の数を計数する手順をコンピュータに実行させることを特徴とするコンピュータプログラム。
- 請求項19乃至25のいずれかのコンピュータプログラムであって、前記発光粒子信号検出手順に於いて、前記所定の閾値より大きい強度を有する光を表す信号が検出されたときに1つの発光粒子が前記光検出領域に入ったことを検出することを特徴とするコンピュータプログラム。
- 請求項19乃至26のいずれかのコンピュータプログラムであって、更に、前記検出された発光粒子の数に基づいて、前記試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度を決定する手順をコンピュータに実行させることを特徴とするコンピュータプログラム。
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