WO2012141019A1 - 単一発光粒子検出を用いた光分析装置、光分析方法及び光分析用コンピュータプログラム - Google Patents

単一発光粒子検出を用いた光分析装置、光分析方法及び光分析用コンピュータプログラム Download PDF

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Definitions

  • the present invention uses an optical system capable of detecting light from a minute region in a solution, such as an optical system of a confocal microscope or a multiphoton microscope, and uses atoms, molecules or aggregates thereof dispersed or dissolved in a solution ( These are hereinafter referred to as “particles”), for example, biomolecules such as proteins, peptides, nucleic acids, lipids, sugar chains, amino acids or aggregates thereof, particulate objects such as viruses and cells, or non- It relates to optical analysis technology that can detect light from biological particles and obtain useful information in the analysis or analysis of those states (interaction, binding / dissociation state, etc.).
  • the present invention relates to an optical analysis device, an optical analysis method, and an optical analysis computer program that enable various optical analyzes by individually detecting light from a single light emitting particle using the optical system as described above.
  • a particle that emits light (hereinafter referred to as “luminescent particle”) is either a particle that emits light itself, or a particle to which an arbitrary luminescent label or luminescent probe is added.
  • the light emitted from the luminescent particles may be fluorescence, phosphorescence, chemiluminescence, bioluminescence, scattered light, or the like.
  • the average residence time (translational diffusion time) of the fluorescent molecules and the like in the minute region determined from the value of the autocorrelation function of the measured fluorescence intensity, and the average number of staying molecules Based on this, acquisition of information such as the speed or size of movement of fluorescent molecules, concentration, concentration, molecular structure or size change, molecular binding / dissociation reaction, dispersion / aggregation, etc.
  • fluorescence intensity distribution analysis Fluorescence-Intensity Distribution Analysis: FIDA.
  • Patent Document 4 Non-Patent Document 4 and Photon Counting Histogram (PCH.
  • Patent Document 5 are measured in the same manner as FCS.
  • a histogram of the fluorescence intensity of the fluorescent molecules entering and exiting the confocal volume generated is generated, and by fitting a statistical model formula to the distribution of the histogram, the average of the intrinsic brightness of the fluorescent molecules etc.
  • the average value of the value and the number of molecules staying in the confocal volume is calculated, and based on this information, changes in the structure or size of the molecule, binding / dissociation state, dispersion / aggregation state, etc. are estimated. It will be.
  • Patent Documents 6 and 7 propose a method for detecting a fluorescent substance based on the passage of time of a fluorescence signal of a sample solution measured using an optical system of a confocal microscope.
  • Patent Document 8 describes the presence of fluorescent fine particles in a flow or on a substrate by measuring weak light from fluorescent fine particles distributed in a flow cytometer or fluorescent fine particles fixed on a substrate using a photon counting technique. A signal arithmetic processing technique for detecting the signal is proposed.
  • the sample required for measurement has an extremely low concentration compared with the conventional method. It can be very small (the amount used in one measurement is about several tens of ⁇ L), and the measurement time is greatly shortened (measurement of time on the order of seconds is repeated several times in one measurement). . Therefore, these technologies are particularly useful for analyzing rare or expensive samples often used in the field of medical and biological research and development, for clinical diagnosis of diseases, screening for physiologically active substances, etc. When the number is large, it is expected to be a powerful tool capable of performing experiments or inspections at a lower cost or faster than conventional biochemical methods.
  • the light to be measured is light emitted from one or several fluorescent molecules.
  • statistical processing such as calculation of fluctuation of fluorescence intensity such as calculation of autocorrelation function of fluorescence intensity data measured in time series or fitting to histogram is executed, and light signals from individual fluorescent molecules etc. are processed. It is not individually referenced or analyzed. That is, in these photoanalysis techniques, light signals from a plurality of fluorescent molecules and the like are statistically processed, and statistical average characteristics of the fluorescent molecules and the like are detected.
  • the concentration or number density of the fluorescent molecules or the like to be observed in the sample solution is equal to one second in the equilibrium state.
  • the number of fluorescent molecules that can be statistically processed within the measurement time of the order length enters and exits the micro area, and preferably there is always about one fluorescent molecule in the micro area.
  • the concentration of fluorescent molecules or the like in the sample solution used in the above optical analysis technique is typically about 1 nM or more. When it is significantly lower than 1 nM, a time when the fluorescent molecule or the like is not present in the confocal volume occurs, and a statistically significant analysis result cannot be obtained.
  • the methods for detecting fluorescent molecules described in Patent Documents 6 to 8 do not include statistical calculation processing of fluctuations in fluorescence intensity, and even if the fluorescent molecules in the sample solution are less than 1 nM, the fluorescent molecules However, it has not been achieved to quantitatively calculate the concentration or number density of fluorescent molecules that are moving randomly in the solution.
  • the applicant of the present application deals with the optical analysis technique including the statistical processing such as FCS, FIDA, etc. in the concentration or number density of the luminescent particles to be observed in Japanese Patent Application No. 2010-044714 and PCT / JP2011 / 53481.
  • An optical analysis technique based on a novel principle that makes it possible to quantitatively observe the state or characteristics of luminescent particles in a sample solution below a certain level is proposed.
  • an optical system capable of detecting light from a minute region in a solution such as an optical system of a confocal microscope or a multiphoton microscope, like FCS, FIDA and the like.
  • the photodetection region When used, while moving the position of a minute region (hereinafter referred to as “light detection region”) that is a light detection region in the sample solution, that is, while scanning the sample solution by the light detection region,
  • the photodetection region includes luminescent particles that are dispersed in the sample solution and move randomly, the light emitted from the luminescent particles is detected, and each luminescent particle in the sample solution is individually detected
  • the sample required for measurement is a very small amount (for example, about several tens of ⁇ L) as in the optical analysis techniques such as FCS and FIDA.
  • the measurement time is short, and the presence of luminescent particles having a lower concentration or number density is detected as compared with the case of optical analysis techniques such as FCS and FIDA, and the concentration, number density or Other characteristics can be detected quantitatively.
  • the light intensity value (or photon count value) sequentially measured with the movement of the position of the light detection region in the sample solution is a time-series light intensity. It is recorded as data, and on the data, an area where there is a change in intensity representing light emitted from the luminescent particles is detected. That is, in the time-series light intensity data, areas where significant information exists are areas where the intensity representing light from the luminescent particles has changed, and other areas are unnecessary areas. Therefore, recording and storing a region where no significant information exists, that is, a region where the intensity representing light from the luminescent particles has not changed increases the size of time-series light intensity data unnecessarily. The storage capacity may be wasted.
  • one object of the present invention is to propose a novel method that makes it possible to reduce the amount of time-series light intensity data in the scanning molecule counting method as described above.
  • Another object of the present invention is to reduce the amount of time-series light intensity data processed in the scanning molecule counting method as described above, thereby saving storage capacity for storing data and reducing data processing. It is to be able to reduce load and processing time.
  • the above-described problem is an optical analyzer that detects light from luminescent particles that are dispersed in a sample solution and randomly move using an optical system of a confocal microscope or a multiphoton microscope.
  • a light detection region moving unit that moves the position of the light detection region of the optical system of the microscope in the sample solution, a light detection unit that detects light from the light detection region, and the sample solution
  • Time-series light intensity data from the light detection area detected by the light detection unit is generated while moving the position of the light detection area, and light from each of the luminescent particles is generated in the time-series light intensity data.
  • a signal processing unit that individually detects a signal that represents a time-series light in a region where there is no signal representing light from each of the luminescent particles in the time-series light intensity data.
  • a device characterized by removing from intensity data It is made.
  • a light-emitting particle dispersed in a sample solution and moving randomly is a particle that emits light, such as atoms, molecules, or aggregates thereof dispersed or dissolved in a sample solution. Any particle may be used as long as it is not fixed to the substrate or the like and freely moves in the solution in Brownian motion.
  • luminescent particles are typically fluorescent particles, but may be particles that emit light by phosphorescence, chemiluminescence, bioluminescence, light scattering, or the like.
  • the “light detection area” of the optical system of a confocal microscope or multiphoton microscope is a minute area in which light is detected in those microscopes. When illumination light is given from an objective lens, the illumination light is Corresponds to the focused region (in the confocal microscope, it is determined in particular by the positional relationship between the objective lens and the pinhole.
  • the term “light emitting particle signal” refers to a signal representing light from the light emitting particles unless otherwise specified.
  • the scanning molecule counting method which is the basic configuration of the present invention, first, the position of the photodetection region is moved in the sample solution, that is, the light is passed through the sample solution. Light is sequentially detected while scanning with the detection region. Then, when the light detection region that moves in the sample solution includes light emitting particles that are moving randomly, the light from the light emitting particles is detected, thereby detecting the presence of one light emitting particle. There is expected. Therefore, the light signals from the luminescent particles are detected individually in the sequentially detected light, thereby detecting the presence of the particles individually one by one, and in the solution of particles. Various information regarding the state is acquired.
  • the signal processing unit uses the time-series light intensity data in the time-series light intensity data in the region where the signal representing the light from each of the luminescent particles does not exist. It is configured to execute an operation for removing the time series light, thereby reducing the size of the time-series light intensity data.
  • the time-series light intensity data there are regions where signals representing the light from each of the luminescent particles are present, and there are signals representing the light from each of the luminescent particles.
  • the non-existing regions can be generally distinguished based on the characteristics of the light intensity data in those regions. That is, in the time-series light intensity data, in the time interval in which the light from the luminescent particles arrives at the light detection unit, the value of the output signal of the light detection unit changes in a pulse shape, and only noise occurs.
  • Each of the luminescent particles in the time-series light intensity data has a different characteristic from the time interval when the light from the luminescent particles does not arrive.
  • the signal processing unit calculates the characteristic value of the light intensity indicating the presence or absence of light from the luminescent particles for each time interval of a predetermined width in the time-series light intensity data, Using these characteristic values, a time interval in which a signal representing light from each of the luminescent particles does not exist is determined, and an area corresponding to the time interval in which no signal representing light from each of the luminescent particles is present is determined. It may be configured to remove from the series of light intensity data.
  • the characteristic value of the light intensity indicating the presence / absence of light from the luminescent particles is the size of the light from the luminescent particles in the time interval of the predetermined width where the light from the luminescent particles exists. Any value that is larger than the size of the predetermined time interval can be used. In that case, when the characteristic value of the light intensity is larger than a predetermined threshold, it is determined that a signal from the luminescent particles exists in a time interval of a predetermined width.
  • Such characteristic values include, for example, an integrated value of light intensity, a median value of light intensity, an average value of light intensity, a standard deviation of light intensity, a dispersion of light intensity, and an entropy of light intensity.
  • the light detection unit detects light from the light detection region by photon counting, and in this case, time-series light intensity data becomes time-series photon count data. Therefore, the characteristic value of the light intensity includes the total value of the photons in the time interval of the predetermined width, the median value of the photons, the average value of the photons, the standard deviation of the photons, the dispersion of the photons, and the entropy of the photons. Further, it may be a value selected from the group of particle numbers calculated from the autocorrelation function value of the photon number with the maximum value of the photon number and the correlation time being zero.
  • the removal from the time-series light intensity data of the region where the signal representing the light from each of the luminescent particles in the time-series light intensity data does not exist is as follows. It may be performed either before or after the individual detection process of signals representing light from each of the luminescent particles in the series of light intensity data. In the case where the region where the luminescent particle signal does not exist is to be removed before the individual detection process of the luminescent particle signal, the data processing of the device in the individual detection process of the luminescent particle signal is performed. Advantageously, load and processing time are reduced.
  • the signal processing unit removes from the time-series light intensity data the area where the signal representing the light from each of the luminescent particles in the time-series light intensity data does not exist.
  • the light intensity data may be configured to individually detect signals representing light from each of the luminescent particles. It should be noted that the accuracy of the individual detection process of the luminescent particle signal is ensured when the region where the luminescent particle signal does not exist is removed after the individual detection process of the luminescent particle signal. Is advantageous.
  • the signal processing unit has an area where there is no signal representing light from each of the luminescent particles in the time-series light intensity data.
  • the light intensity data obtained by being removed from the time-series light intensity data may be stored in a storage device.
  • the individual detection of the signal representing the light from each of the luminescent particles may be performed based on the shape of the time-series signal. In the embodiment, typically, when a signal having an intensity greater than a predetermined threshold is detected, it may be detected that one luminescent particle has entered the light detection region.
  • the moving speed of the position of the light detection region in the sample solution may be appropriately changed based on the characteristics of the luminescent particles or the number density or concentration in the sample solution.
  • the manner of light detected from the luminescent particles can vary depending on the properties of the luminescent particles or the number density or concentration in the sample solution.
  • the moving speed of the light detection region increases, the amount of light obtained from one light emitting particle decreases, so that the light from one light emitting particle can be measured with high accuracy or sensitivity. It is preferable that the moving speed can be appropriately changed.
  • the moving speed of the position of the light detection region in the sample solution is preferably set higher than the diffusion moving speed of the luminescent particles to be detected (average moving speed of particles due to Brownian motion).
  • the apparatus of the present invention detects the light emitted from the light emitting particles when the light detection region passes the position where the light emitting particles exist, and individually detects the light emitting particles.
  • the luminescent particles move randomly in the solution due to Brownian motion and enter and exit the photodetection region multiple times, a signal (representing the presence of the luminescent particles) is emitted multiple times from one luminescent particle.
  • it becomes difficult to make the detected signal correspond to the presence of one luminescent particle.
  • the moving speed of the light detection region is set to be higher than the diffusion moving speed of the luminescent particles, so that one luminescent particle can correspond to one signal (indicating the presence of the luminescent particle). It becomes. Since the diffusion movement speed varies depending on the luminescent particles, as described above, according to the characteristics of the luminescent particles (particularly, the diffusion constant), the apparatus of the present invention can appropriately change the movement speed of the light detection region. It is preferable to be configured.
  • the movement of the position of the light detection region in the sample solution may be performed by an arbitrary method.
  • the position of the light detection region may be changed by changing the optical path of the optical system of the microscope by using a galvanometer mirror adopted in a laser scanning optical microscope, or
  • the light detection region may be fixed, and the position of the sample solution may be moved (for example, by moving a microscope stage) to move the position of the light detection region in the sample solution.
  • the movement trajectory of the position of the light detection region may be arbitrarily set, and may be selected from, for example, a circle, an ellipse, a rectangle, a straight line, and a curve.
  • the position of the light detection region is changed by changing the optical path of the optical system of the microscope, the movement of the light detection region is quick, and mechanical vibrations and hydrodynamic actions are applied to the sample solution. Therefore, it is advantageous in that light can be measured in a stable state without the influence of the mechanical action of the luminescent particles to be detected.
  • the number of light-emitting particles included in the light detection region may be counted by counting the number of signals (particle counting).
  • information on the number density or concentration of the identified luminescent particles in the sample solution can be obtained by combining the number of detected luminescent particles and the amount of movement of the position of the light detection region.
  • the number density or concentration ratio of a plurality of sample solutions, or the relative number density or concentration ratio with respect to the standard sample solution serving as a reference for the concentration or number density is calculated, or An absolute number density value or concentration value may be determined using a relative number density or concentration ratio relative to a standard sample solution that is a reference for concentration or number density.
  • the total volume of the movement locus of the light detection region position is specified by any method, for example, by moving the position of the light detection region at a predetermined speed, the number density or concentration of the luminescent particles can be reduced. It can be calculated specifically.
  • light detection is performed by moving the position of the light detection region in the sample solution while detecting the signal from each luminescent particle individually.
  • the processing of the optical analysis technique capable of reducing the data size can also be realized by a general-purpose computer. Therefore, according to another aspect of the present invention, for optical analysis for detecting light from luminous particles dispersed and moving randomly in a sample solution using an optical system of a confocal microscope or a multiphoton microscope.
  • a computer program for moving the position of the light detection area of the microscope optical system in the sample solution and for moving light from the light detection area during movement of the position of the light detection area in the sample solution.
  • Computer program for causing a computer to execute a procedure for detecting and generating time-series light intensity data, and a procedure for individually detecting a signal representing light from each of the light emitting particles in the time-series light intensity data And a step of removing from the time-series light intensity data a region where there is no signal representing light from each of the light emitting particles in the time-series light intensity data.
  • Program is provided.
  • the procedure of detecting light from the light detection region and generating time-series light intensity data the light from the light detection region is detected by photon counting.
  • the time-series light intensity data is time-series photon count data.
  • the time-series light intensity data A signal representing the light from each of the luminescent particles is individually detected on the light intensity data in which the region where the signal representing the light from each of the luminescent particles does not exist is removed from the time-series light intensity data. Further, the storage device stores the light intensity data in which the region where the signal representing the light from each of the light emitting particles in the time-series light intensity data does not exist is removed from the time-series light intensity data.
  • the procedure for storing data may be executed by a computer.
  • a region where there is no signal representing light from each of the luminescent particles in the time-series light intensity data a light intensity characteristic value indicating the presence or absence of light from the luminescent particles is calculated for each time interval of a predetermined width, and the light from each of the luminescent particles is represented using such characteristic values.
  • a time interval in which no signal is present may be determined, and a region corresponding to a time interval in which a signal representing light from each of the luminescent particles does not exist may be removed from the time-series light intensity data.
  • the characteristic value of the light intensity indicating the presence or absence of light from the luminescent particles is the integrated value of the light intensity, the median value of the light intensity, the average value of the light intensity, Any of the number of particles calculated from the standard deviation, the dispersion of the light intensity, the entropy of the light intensity, the maximum value of the light intensity, and the autocorrelation function value of the light intensity with the correlation time being 0 may be adopted.
  • the characteristic value of the light intensity includes the total number of photons, the median of the number of photons, and the average of the number of photons in a predetermined time interval.
  • the individual detection of the signal representing the light from each of the luminescent particles may be performed based on the shape of the time-series signal.
  • the moving speed of the position of the light detection region in the sample solution may be appropriately changed based on the characteristics of the luminescent particles, the number density or the concentration in the sample solution, and preferably the light in the sample solution.
  • the moving speed of the position of the detection region is set higher than the diffusion moving speed of the luminescent particles to be detected.
  • the position of the light detection region in the sample solution may be moved by an arbitrary method.
  • the position of the light detection region is changed by changing the optical path of the optical system of the microscope or moving the position of the sample solution. May be changed.
  • the movement trajectory of the position of the light detection region may be arbitrarily set, and may be selected from, for example, a circle, an ellipse, a rectangle, a straight line, and a curve.
  • a procedure for counting the number of light-emitting particles detected during movement of the position of the light detection region by counting the number of signals from the individually detected light-emitting particles and / or A procedure for determining the number density or concentration of luminescent particles in the sample solution based on the number of detected luminescent particles may be included.
  • an optical analysis method for detecting light of individual luminescent particles while moving the position of a light detection region in a sample solution A novel method is realized that allows size reduction.
  • an optical analysis method for detecting light from luminous particles dispersed and moving randomly in a sample solution by using an optical system of a confocal microscope or a multiphoton microscope.
  • the process of moving the position of the light detection area of the optical system of the microscope in the solution and the time series light by detecting the light from the light detection area while moving the position of the light detection area in the sample solution In a method including a step of generating intensity data and a step of individually detecting a signal representing light from each light emitting particle in the time-series light intensity data, There is provided a method comprising the step of removing, from the time-series light intensity data, a region where there is no signal representing light from each of the luminescent particles. Even in such a method, typically, in the process of detecting light from the light detection region and generating time-series light intensity data, the light from the light detection region is detected by photon counting.
  • the time-series light intensity data is time-series photon count data. Also in the above method, in the process of individually detecting the signal representing the light from each light emitting particle in the time-series light intensity data, the time-series light intensity data An area where no signal representing the light from each of the light emitting particles is present is removed from the time-series light intensity data so that the signal representing the light from each of the light emitting particles is individually detected. In addition, in the time-series light intensity data, the light intensity data obtained by removing the region where the signal representing the light from each of the light emitting particles does not exist from the time-series light intensity data is stored in the storage device. The saving process may be executed.
  • time-series light intensity data in the process of removing from the time-series light intensity data a region where there is no signal representing light from each of the luminescent particles in the time-series light intensity data.
  • a characteristic value of light intensity representing the presence or absence of light from the luminescent particles is calculated for each time interval of a predetermined width, and the signal representing the light from each of the luminescent particles using such characteristic values A time interval in which no light is present is determined, and a region corresponding to a time interval in which a signal representing light from each of the luminescent particles does not exist may be removed from the time-series light intensity data.
  • the characteristic value of the light intensity indicating the presence or absence of light from the luminescent particles is the integrated value of the light intensity, the median value of the light intensity, the average value of the light intensity, Any of the number of particles calculated from the standard deviation, the dispersion of the light intensity, the entropy of the light intensity, the maximum value of the light intensity, and the autocorrelation function value of the light intensity with the correlation time being 0 may be adopted.
  • the characteristic value of the light intensity includes the total number of photons, the median of the number of photons, and the average of the number of photons in a predetermined time interval.
  • the individual detection of the signal representing the light from each of the luminescent particles may be performed based on the shape of the time-series signal.
  • a signal having an intensity greater than a predetermined threshold it may be detected that one luminescent particle has entered the light detection region.
  • the moving speed of the position of the light detection region in the sample solution may be appropriately changed based on the characteristics of the luminescent particles or the number density or concentration in the sample solution.
  • the moving speed of the position of the detection region is set higher than the diffusion moving speed of the luminescent particles to be detected.
  • the position of the light detection region in the sample solution may be moved by any method, and the position of the light detection region is changed by changing the optical path of the optical system of the microscope or moving the position of the sample solution. It may be like this.
  • the movement trajectory of the position of the light detection region may be arbitrarily set, and may be selected from, for example, a circle, an ellipse, a rectangle, a straight line, and a curve.
  • a step of determining the number density or concentration of the luminescent particles in the sample solution based on the number of luminescent particles formed may be included.
  • the optical analysis technique of the present invention described above is typically a biological molecule such as a protein, peptide, nucleic acid, lipid, sugar chain, amino acid or aggregate thereof, or a particulate biological object such as a virus or cell. It is used for analysis or analysis of the state of matter in solution, but it may also be used for analysis or analysis of the state of non-biological particles (eg, atoms, molecules, micelles, metal colloids, etc.) in solution. It should be understood that such cases are also within the scope of the present invention.
  • a biological molecule such as a protein, peptide, nucleic acid, lipid, sugar chain, amino acid or aggregate thereof, or a particulate biological object such as a virus or cell. It is used for analysis or analysis of the state of matter in solution, but it may also be used for analysis or analysis of the state of non-biological particles (eg, atoms, molecules, micelles, metal colloids, etc.) in solution. It should be understood that such cases are also within the scope of
  • the light intensity data is selectively deleted in the time-series light intensity data by eliminating the region where the signal of the luminescent particles does not exist. This reduces the load and processing time in the analysis process of the light intensity data, and saves the storage capacity for storing the data.
  • the light intensity indicating the presence or absence of light from the luminescent particles calculated for each time interval of a predetermined width.
  • the data amount can be compressed to about 1/10.
  • the storage capacity of the storage device necessary for storing the data and the computing capacity necessary for the analysis processing since it is possible to reduce the size of the light intensity data, it is possible to reduce the storage capacity of the storage device necessary for storing the data and the computing capacity necessary for the analysis processing, The cost required for carrying out the scanning molecule counting method will be reduced, and the use of the scanning molecule counting method is expected to expand.
  • FIG. 1A is a schematic diagram of the internal structure of an optical analyzer that performs the method of the present invention.
  • FIG. 1B is a schematic diagram of a confocal volume (observation region of a confocal microscope).
  • FIG. 1C is a schematic diagram of a mechanism for changing the direction of the mirror 7 to move the position of the light detection region in the sample solution.
  • FIG. 1D is a schematic diagram of a mechanism for moving the position of the photodetection region in the sample solution by moving the horizontal position of the microplate.
  • 2A and 2B are a schematic diagram for explaining the principle of light detection in a scanning molecule counting method to which the method of the present invention is applied, and a schematic diagram of a time change of measured light intensity, respectively. is there.
  • FIG. 1A is a schematic diagram of the internal structure of an optical analyzer that performs the method of the present invention.
  • FIG. 1B is a schematic diagram of a confocal volume (observation region of a conf
  • FIG. 2C is a diagram for explaining the principle when the signal of the luminescent particles is detected after deleting the region where the signal of the luminescent particles does not exist from the time-series light intensity data.
  • FIG. 2D is a diagram for explaining the principle in a case where a region where no luminescent particle signal exists is deleted from the time-series light intensity data after detection of the luminescent particle signal is performed.
  • FIGS. 3A and 3B are flowcharts showing the processing procedure of the scanning molecule counting method executed in accordance with the present invention.
  • FIG. 3C is a flowchart showing one example of a technique for individually detecting the light emitting particle signals on the light intensity data.
  • FIG. 4A and 4B show the case where the luminescent particles traverse the light detection region while performing Brownian motion, and the position of the light detection region in the sample solution at a speed faster than the diffusion movement speed of the luminescent particles. It is a model figure showing the mode of movement of particles when luminous particles cross a photodetection region by moving.
  • FIG. 4C shows the signal processing process of the detection signal in the processing procedure for detecting the presence of the luminescent particles from the measured time-series light intensity data (time change of the photon count) according to the scanning molecule counting method. It is a figure explaining an example.
  • FIG. 5 shows an actual measurement example (bar graph) of measured photon count data, a curve (dotted line) obtained by smoothing the data, and a Gaussian function (solid line) fitted in the pulse existence region.
  • a signal labeled “noise” is ignored as it is a signal due to noise or foreign matter.
  • the upper part of FIG. 6A is an example of light intensity (photon count) time-series data obtained by the light detection unit, and the lower part is an enlarged view of a part of the upper part of the upper part.
  • the upper part of FIG. 6B is an example of light intensity data obtained by digesting the time-series light intensity data of FIG. 6A, and the lower part shows an enlarged part of the beginning of the upper part. It is a figure.
  • the window size is set to 200 ⁇ sec, and the threshold value of the characteristic value (sum of the number of photons) is set to 5.
  • a round dotted line indicates a threshold value (one photon count) for detecting a signal of luminescent particles.
  • FIG. 7 shows characteristic values (photon values) of the number of detected pulses and the data compression rate when the detection processing of the luminescent particle signal is performed in the light intensity data obtained by digesting the time-series light intensity data. It is the graph which showed the change with respect to the threshold value of (sum).
  • FIG. 7 shows characteristic values (photon values) of the number of detected pulses and the data compression rate when the detection processing of the luminescent particle signal is performed in the light intensity data obtained by digesting the time-series light intensity data. It is the graph which showed the change with respect to the threshold value of (sum).
  • FIG. 8 is a graph showing the change of the data compression ratio of the light intensity data obtained by performing the digest processing after the detection processing of the luminescent particle signal in the time series light intensity data with respect to the window size. is there.
  • FIG. 9 is an example of the time change of the photon count (light intensity) obtained in the conventional optical analysis technique for calculating the fluctuation of fluorescence intensity.
  • FIG. 9A shows that the concentration of particles in the sample is sufficient. This is a case where measurement accuracy is given, and (B) is a case where the concentration of particles in the sample is significantly lower than in (A).
  • optical analysis apparatus 1 that realizes the optical analysis technique according to the present invention is capable of executing FCS, FIDA, and the like as schematically illustrated in FIG.
  • the apparatus may be a combination of an optical system of a confocal microscope and a photodetector.
  • optical analysis apparatus 1 includes optical systems 2 to 17 and a computer 18 for controlling the operation of each part of the optical system and acquiring and analyzing data.
  • the optical system of the optical analyzer 1 may be the same as the optical system of a normal confocal microscope, in which the laser light (Ex) emitted from the light source 2 and propagated through the single mode fiber 3 is a fiber.
  • the light is emitted as a divergent light at an angle determined by a specific NA at the outgoing end of the light, becomes parallel light by the collimator 4, is reflected by the dichroic mirror 5, the reflection mirrors 6, 7, and the objective lens 8. Is incident on.
  • a microplate 9 in which a sample container or well 10 into which a sample solution of 1 to several tens of ⁇ L is dispensed is typically arranged is emitted from the objective lens 8.
  • the laser light is focused in the sample solution in the sample container or well 10 to form a region with high light intensity (excitation region).
  • light-emitting particles that are the observation target typically particles to which fluorescent labels such as fluorescent particles or fluorescent dyes are added are dispersed or dissolved, and these light-emitting particles enter the excitation region.
  • the luminescent particles are excited and light is emitted.
  • the emitted light (Em) passes through the objective lens 8 and the dichroic mirror 5, is reflected by the mirror 11, is collected by the condenser lens 12, passes through the pinhole 13, and passes through the barrier filter 14. (Here, only the light component of a specific wavelength band is selected.), Introduced into the multimode fiber 15, reaches the photodetector 16, is converted into a time-series electrical signal, and then to the computer 18.
  • Input and processing for optical analysis is performed in a manner described later.
  • the pinhole 13 is disposed at a position conjugate with the focal position of the objective lens 8, and as a result, as shown in FIG. Only the light emitted from the focal region of the laser beam, that is, the excitation region as schematically shown, passes through the pinhole 13, and the light from other than the excitation region is blocked.
  • the focal region of the laser beam illustrated in FIG. 1B is usually a light detection region in the present optical analyzer having an effective volume of about 1 to 10 fL (typically, the light intensity is in the region).
  • the photodetector 16 is preferably an ultra-high light that can be used for photon counting.
  • a sensitive photodetector is used.
  • the time-series light intensity data is time-series photon count data.
  • a stage position changing device 17a for moving the horizontal position of the microplate 9 may be provided on a microscope stage (not shown) in order to change the well 10 to be observed.
  • the operation of the stage position changing device 17a may be controlled by the computer 18. With this configuration, it is possible to achieve quick measurement even when there are a plurality of specimens.
  • a mechanism for scanning the sample solution with the light detection region that is, for moving the position of the focal region, that is, the light detection region in the sample solution.
  • a mechanism for moving the position of the light detection region for example, a mirror deflector 17 that changes the direction of the reflection mirror 7 may be employed as schematically illustrated in FIG. A method of moving the absolute position of the light detection area).
  • Such a mirror deflector 17 may be the same as a galvanometer mirror device provided in a normal laser scanning microscope.
  • FIG. 1D the horizontal position of the container 10 (microplate 9) into which the sample solution is injected is moved to detect light in the sample solution.
  • the stage position changing device 17a may be operated to move the relative position of the region (a method of moving the absolute position of the sample solution).
  • the mirror deflector 17 or the stage position changing device 17a cooperates with the light detection by the light detector 16 under the control of the computer 18 in order to achieve a desired movement pattern of the position of the light detection region.
  • the movement trajectory of the position of the light detection region may be arbitrarily selected from a circle, an ellipse, a rectangle, a straight line, a curve, or a combination thereof (so that various movement patterns can be selected by the program in the computer 18). It may be.)
  • the position of the light detection region may be moved in the vertical direction by moving the objective lens 8 or the stage up and down.
  • the above optical system is used as a multiphoton microscope. In that case, since there is light emission only in the focal region (light detection region) of the excitation light, the pinhole 13 may be removed. Further, when the luminescent particles to be observed emit light regardless of excitation light due to chemiluminescence or bioluminescence phenomenon, the optical systems 2 to 5 for generating excitation light may be omitted. When the luminescent particles emit light by phosphorescence or scattering, the optical system of the confocal microscope is used as it is.
  • a plurality of excitation light sources 2 may be provided, and the wavelength of the excitation light may be appropriately selected according to the excitation wavelength of the luminescent particles.
  • a plurality of photodetectors 16 may be provided, and when a plurality of types of light emitting particles having different wavelengths are included in the sample, light can be separately detected based on the wavelengths. It's okay.
  • the concentration or number density of the luminescent particles is a level in which about one luminescent particle is always present in the light detection region CV during the measurement of the fluorescence intensity. As shown on the right side of the figure, it is required that a significant light intensity (photon count) is always detected during the measurement time. If the concentration or number density of the luminescent particles is lower than that, for example, as shown in FIG. 9B, the luminescent particles are at a level that only occasionally enters the light detection region CV. As illustrated on the right side of the figure, a significant light intensity signal (photon count) appears only during a part of the measurement time, making it difficult to accurately calculate the fluctuation of the light intensity.
  • the concentration of the luminescent particles is much lower than the level at which about one luminescent particle is always present in the light detection area during measurement, the light intensity fluctuation is affected by the background.
  • the measurement time is long in order to easily obtain significant light intensity data sufficient for calculation.
  • FIG. 2 As a process executed in the scanning molecule counting method, in short, a mechanism (mirror deflector 17) for moving the position of the light detection region is driven to change the optical path, and FIG. As schematically depicted in FIG. 2, light detection is performed while moving the position of the light detection region CV in the sample solution, that is, while scanning the sample solution by the light detection region CV. . Then, for example, when the light detection region CV moves (time to to t2 in the figure) and passes through the region where one light emitting particle exists (t1), light is emitted from the light emitting particle, A pulse-like signal having a significant light intensity (Em) appears on the time-series light intensity data as depicted in FIG.
  • Em significant light intensity
  • the movement of the position of the light detection region CV and the light detection are executed, and pulse-like signals (significant light intensity) appearing in the meantime illustrated in FIG. 2B are detected one by one.
  • the luminescent particles are individually detected, and the number of the luminescent particles is counted to obtain information on the number, concentration, or number density of the luminescent particles present in the measured region.
  • statistical calculation processing such as calculation of fluctuations in fluorescence intensity is not performed, and luminescent particles are detected one by one. Therefore, FCS, FIDA, etc. have sufficient accuracy. Even with a sample solution in which the concentration of particles to be observed is so low that analysis is impossible, information on the concentration or number density of particles can be obtained.
  • digest processing of time-series light intensity data there is no signal of luminescent particles in the time-series light intensity data.
  • a region is detected, light intensity data (digested light intensity data) obtained by removing the region from the time-series light intensity data is prepared, and individual detection of the signal of the luminescent particles is performed on the digested light intensity data. .
  • light intensity data digested light intensity data obtained by removing the region from the time-series light intensity data
  • individual detection of the signal of the luminescent particles is performed on the digested light intensity data.
  • the presence or absence of light from the luminescent particles is determined using the light intensity value (number of photons) in each time interval.
  • a characteristic value of the light intensity to be expressed is calculated.
  • the pulsed signal exists in the region where the signal of the luminescent particle exists, but in the region where the signal of the luminescent particle does not exist, only the noise is emitted.
  • the region where the signal of the particle exists and the region where the signal of the luminescent particle does not exist have different characteristics in light intensity value.
  • an arbitrary light intensity characteristic value indicating the presence or absence of light from the luminescent particles is calculated for each time interval of a predetermined width, and based on such characteristic values, the signal of the luminescent particles is calculated. It becomes possible to determine a time interval corresponding to a non-existing region.
  • the characteristic value of the light intensity indicating the presence / absence of light from the luminescent particles is such that the size of the light in the time interval of the predetermined width in which the light from the luminescent particles is present does not exist. Any value that is larger than the size in the time interval of the predetermined width can be adopted. In that case, when the characteristic value of the light intensity is larger than a predetermined threshold, it is determined that a signal from the luminescent particles exists in a time interval of a predetermined width.
  • Such characteristic values include, for example, an integrated value of light intensity, a median value of light intensity, an average value of light intensity, a standard deviation of light intensity, a dispersion of light intensity, and an entropy of light intensity.
  • the light detection unit detects light from the light detection region by photon counting, and in this case, time-series light intensity data becomes time-series photon count data. Therefore, the characteristic value of the light intensity includes the total value of the photons in the time interval of the predetermined width, the median value of the photons, the average value of the photons, the standard deviation of the photons, the dispersion of the photons, and the entropy of the photons.
  • it may be a value selected from the group of particle numbers calculated from the autocorrelation function value of the photon number with the maximum value of the photon number and the correlation time being zero. (In FIG. 2C, the total number of photons in each time interval is adopted as the characteristic value.)
  • the light emission in each time interval is referred to by referring to the characteristic value, for example, whether or not the characteristic value exceeds a predetermined threshold value. It is determined whether or not a particle signal exists, and regions (regions B and D in the figure) corresponding to the time interval in which the luminescent particle signal exists are selectively extracted. As described above, digested light intensity data from which regions (regions A and C in the figure) corresponding to the time interval in which the signal of the luminescent particles does not exist is removed is prepared. Then, on the digested light intensity data thus prepared, for example, a signal of the luminescent particles is detected in a manner described in detail later.
  • the size of the data to be subjected to the detection processing of the signal of the luminescent particles is reduced, and it is not necessary to perform data processing for an unnecessary area, so that the load and processing time in data processing can be reduced. Be expected. Further, in storing the measured data in the storage device, it is possible to save the storage capacity of the storage device by storing the digested light intensity data.
  • the predetermined width of the time interval and the threshold value for the characteristic value may be arbitrarily set.
  • the detection accuracy of the luminescent particle signal and the data compression ratio are predetermined in the time interval. Since it varies depending on the setting of the threshold value for the width and the characteristic value, it is preferably set to an appropriate value using the result of a preliminary experiment or the like.
  • FIG. 3 shows processing in this embodiment expressed in the form of a flowchart.
  • (A) is a process in the case of detecting the signal of the luminescent particles after the digestion process
  • (B) shows a process in the case of performing the digest process after the detection of the signal of the luminescent particles.
  • (C) shows an example of detection processing of a signal of luminescent particles.
  • the particles to be observed in the optical analysis technique of the present invention are arbitrary as long as they are dispersed particles in the sample solution and move randomly in the solution, such as dissolved molecules.
  • biomolecules such as proteins, peptides, nucleic acids, lipids, sugar chains, amino acids or aggregates thereof, viruses, cells, metal colloids, other non-biological molecules, etc. It's okay.
  • a luminescent label fluorescent molecule, phosphorescent molecule, chemical / bioluminescent molecule
  • the sample solution is typically an aqueous solution, but is not limited thereto, and may be an organic solvent or any other liquid.
  • the light intensity in the optical analysis by the scanning molecule counting method of the present embodiment is measured by driving the mirror deflector 17 or the stage position changing device 17a during the measurement to move the position of the light detection region in the sample solution.
  • it may be executed in the same manner as the light intensity measurement process in FCS or FIDA.
  • the operation process typically, after injecting the sample solution into the well 10 of the microplate 9 and placing it on the stage of the microscope, the user inputs an instruction to start measurement to the computer 18.
  • the computer 18 stores a program stored in a storage device (not shown) (procedure for moving the position of the light detection region in the sample solution, and from the light detection region during movement of the position of the light detection region).
  • a program stored in a storage device (not shown) (procedure for moving the position of the light detection region in the sample solution, and from the light detection region during movement of the position of the light detection region).
  • irradiation of excitation light and measurement of light intensity in the light detection region in the sample solution are started.
  • the mirror deflector 17 or the stage position changing device 17a drives the mirror 7 (galvanomirror) or the microplate 9 on the stage of the microscope, and the wells.
  • the position of the light detection region is moved, and at the same time, the light detector 16 sequentially converts the detected light into an electric signal and transmits it to the computer 18.
  • time-series light intensity data is generated from the transmitted signal and stored.
  • the photodetector 16 is an ultra-sensitive photodetector that can detect the arrival of one photon, and therefore when the light detection is based on photon counting, the time-series light intensity data is a time-series data. It may be photon count data.
  • the moving speed of the position of the light detection region during the measurement of the light intensity may be a predetermined speed that is arbitrarily set, for example, experimentally or so as to suit the purpose of analysis.
  • the size or volume of the region through which the light detection region has passed is required, so that the movement distance can be grasped.
  • the movement of the position of the light detection area is executed at.
  • the movement speed is basically a constant speed.
  • the present invention is not limited to this.
  • the moving speed of the position of the light detection region in order to quantitatively and accurately execute individual detection of luminescent particles from the measured time-series light intensity data, or counting of the number of luminescent particles.
  • the moving speed is preferably set to a value faster than the random movement of the luminescent particles, that is, the moving speed due to the Brownian movement.
  • the observation target particle of the optical analysis technique of the present invention is a particle that is dispersed or dissolved in a solution and moves freely and randomly, the position moves with time by Brownian motion. Accordingly, when the moving speed of the position of the light detection region is slower than the movement of the particle due to Brownian motion, the particle moves randomly within the region as schematically illustrated in FIG.
  • the moving speed of the position of the light detection region is the average moving speed (diffusion due to the Brownian motion of the particle) It is set faster than (moving speed).
  • the moving speed of the position of the photodetection region may be set to 15 mm / s, which is 10 times or more.
  • the profile of the change in the light intensity by setting the moving speed of the position of the light detection region in various ways is expected (typically, the excitation light intensity distribution).
  • a preliminary experiment for finding a condition that is substantially the same as that described above may be repeatedly performed to determine a suitable moving speed of the position of the light detection region.
  • the computer 18 detects the signal of the luminescent particles and detects the luminescent particles by processing according to the program stored in the storage device. Various analyzes such as counting and concentration calculation are executed. As described above, in particular, in the present invention, digest processing of time-series light intensity data is executed before or after detection of the signal of the luminescent particles.
  • digest processing of time-series light intensity data is executed before or after detection of the signal of the luminescent particles.
  • step 20 in FIG. 3A In the case of performing digest processing before detection of the signal of the luminescent particles, as already mentioned, in the time-series light intensity data obtained in step 10, a time interval of a predetermined width is used. A characteristic value of light intensity is calculated for each time.
  • the characteristic value of the light intensity when the time-series light intensity data is time-series photon count data, as described above, the total value of the number of photons in the time interval of the predetermined width, the median value of the number of photons Particles calculated from the average value of photons, the standard deviation value of the number of photons, the dispersion value of the number of photons, the entropy value of the number of photons, the maximum value of the number of photons, and the autocorrelation function value of the number of photons. It may be a value selected from a group of numbers.
  • the total value (total) of the number of photons is the total value of the number of photons in a predetermined time interval. Since the total value of the time interval in which the signal of the luminescent particles exists is increased by the number of photons from the luminescent particles than the total value of the other time intervals, the total value of a certain time interval is larger than a predetermined threshold value. When the value is large, it is determined that the signal of the luminescent particles is present in the time interval.
  • the median value and maximum value of the number of photons are the median value and maximum value of the number of photons found in the time interval of the predetermined width, respectively. Since the number of photons is larger in the period when the light of the luminescent particles arrives at the photodetector than when only normal noise occurs, the median and maximum values of the time interval in which the signal of the luminescent particles is present also increase. . Accordingly, when the median or maximum value of a certain time interval is larger than a predetermined threshold, it is determined that a signal of luminescent particles is present in that time interval.
  • the average value of the number of photons is the time average value of the number of photons in a predetermined time interval. As described above, since the total value of the time interval in which the signal of the luminescent particles exists is increased by the number of photons from the luminescent particles than the total value of the other time intervals, the time of the number of photons in the time interval of the predetermined width. The average value also increases. Therefore, when the average value in a certain time interval is larger than a predetermined threshold, it is determined that a signal of luminescent particles exists in that time interval.
  • the standard deviation value, dispersion value, and entropy value of the number of photons are the standard deviation value, dispersion value, and entropy value of the information amount in the time average of the number of photons in the time interval of the predetermined width, respectively.
  • This is a characteristic value representing the degree of variation in the time change of the number of photons found in the time interval.
  • the standard deviation value, dispersion value, and entropy value of the number of photons in the time interval in which the signal of the luminescent particle is present increase as compared to the values in the other time intervals.
  • the entropy value of the number of photons is the number of times when the number of photons is x in a certain time interval when the probability that the number of photons at a certain time (BIN TIME) is x is px.
  • ix -Log 2 (p0 i0 ⁇ p1 i1 ⁇ px ix ⁇ pn in ) (4) Is the value given by Usually, the probability px that the number of photons is x is p0>p1>p2>...> Px.
  • Entropy value of the interval only noise only does not exist is the -log 2 (p0 i0 ⁇ p1 i1 ⁇ p2 i2) about, in a section where the signal of the luminescent particles are present, -log 2 (p0 i0 ⁇ p1 i1 ⁇ P2 i2 ⁇ p3 i3 ⁇ p4 i4 ), etc., and the value increases.
  • the number of particles calculated from the autocorrelation function value of the number of photons with zero correlation time in a time interval of a predetermined width is an amount corresponding to the number of particles in that time interval.
  • the autocorrelation function C ( ⁇ ) of light intensity is (Where ⁇ D is the translational diffusion time, AR is the structure parameter, and N is the number of particles).
  • C (0) when the correlation time ⁇ 0, the number N of particles is given by 1 / (C (0) ⁇ 1). Since the number of particles is considered to be the number of particles found for each time interval, it is determined that there is a signal of luminescent particles in the time interval when the value is larger than a predetermined threshold, as in the above characteristic value. Is done.
  • a time interval having a characteristic value exceeding a predetermined threshold is selected as a region where the signal of the luminescent particles exists. Then, a time interval having a characteristic value lower than a predetermined threshold value is specified and removed as a region where the signal of the luminescent particles does not exist, and digested light intensity data is prepared as illustrated in the lower part of FIG.
  • the signal it has corresponds to the passage of one particle through the light detection region and one luminescent particle may be detected.
  • a signal whose light intensity does not exceed the threshold value Ith or whose time width ⁇ is not within a predetermined range is determined as a noise or foreign matter signal.
  • the light intensity profile corresponds to the passage of one particle through the light detection region, and one luminescent particle may be detected.
  • a signal whose intensity A and width a are outside the predetermined range is determined as a noise or foreign object signal and may be ignored in the subsequent analysis or the like.
  • smoothing is performed on the light intensity data (FIG. 4C, “detection result (unprocessed)” at the uppermost stage).
  • Processing is performed (FIG. 3 (C) -step 110, upper part “smoothing” in FIG. 4 (C)).
  • the light emitted by the luminescent particles is probabilistically emitted, and data values may be lost in a very short time. Therefore, such a data value loss can be ignored by the smoothing process.
  • the smoothing process may be performed by a moving average method, for example.
  • the parameters for executing the smoothing process are the moving speed (scanning of the position of the light detection region at the time of acquiring the light intensity data).
  • Speed scanning of the position of the light detection region at the time of acquiring the light intensity data.
  • BIN TIME may be set as appropriate.
  • a primary differential value with respect to time of the light intensity data is calculated (step 120).
  • the time differential value of the light intensity data has a large change in the value at the time of change of the signal value as illustrated in the lower “time differential” in FIG.
  • the significant signal start and end points can be advantageously determined.
  • step 130 significant pulse signals are sequentially detected on the light intensity data. Specifically, first, the start and end points of one pulse signal are searched and determined sequentially on the time differential value data of the light intensity data to identify the pulse existence region. (Step 130). When one pulse existence area is specified, a bell-shaped function fitting is performed on the smoothed light intensity data in the pulse existence area (FIG. 4 (C), lower section “bell-shaped function fitting”). Parameters such as the intensity Ipeak of the peak (maximum value) of the pulse of the bell-shaped function, the pulse width (full width at half maximum) Wpeak, and the correlation coefficient (of the least square method) in the fitting are calculated (step 140).
  • the bell-shaped function to be fitted is typically a Gaussian function, but may be a Lorentz-type function. Whether or not the calculated bell-shaped function parameter is within a range assumed for the bell-shaped profile parameter drawn by the pulse signal detected when one luminescent particle passes through the light detection region, That is, it is determined whether or not the peak intensity, pulse width, and correlation coefficient of the pulse are within predetermined ranges (step 150). Thus, as shown in the left of FIG. 5, the signal determined that the calculated bell-shaped function parameter is within the range assumed in the signal corresponding to one luminescent particle is one luminescent particle. Thus, one luminescent particle is detected. On the other hand, as shown in the right of FIG. 5, a pulse signal whose calculated bell-shaped function parameter is not within the assumed range is ignored as noise. Note that the counting of the number of signals, that is, the counting of the luminescent particles may be performed simultaneously with the detection of the signal of the luminescent particles.
  • the search and determination of the pulse signal in the processing of the above steps 130 to 150 may be repeatedly executed over the entire area of the light intensity data (step 160).
  • the process which detects the signal of a luminescent particle separately from light intensity data is not restricted to said procedure, You may perform by arbitrary methods.
  • digest processing is performed after detection processing of luminescent particle signal (step 20).
  • step 30 is performed after detection processing of luminescent particle signal (step 20).
  • Detection of the luminescent particle signal is performed.
  • counting of the number of signals that is, counting of the luminescent particles may be performed simultaneously with the detection of the signal of the luminescent particles.
  • time-series light intensity data a region corresponding to a time interval of a predetermined width in which the signal of the luminescent particles exists is selected, and the signal of the luminescent particles is schematically drawn as shown in FIG. The time interval in which no is present is removed, and the digested light intensity data is prepared.
  • the total volume of the region through which the light detection region passes may be theoretically calculated based on the wavelength of the excitation light or detection light, the numerical aperture of the lens, and the adjustment state of the optical system.
  • control solution a plurality of solutions having different concentrations of luminescent particles are prepared, measurement is performed for each, and the calculated average value of Vt is adopted as the total volume Vt of the region through which the light detection region has passed. It may be like this.
  • the volume of the light detection region and the total volume of the region through which the light detection region has passed are given by any method, for example, using FCS or FIDA, without depending on the above method. It's okay.
  • the relationship between the concentration C of various standard luminescent particles and the number N of luminescent particles (formula (6)) with respect to the assumed movement pattern of the light detection region. ) May be stored in advance in the storage device of the computer 18 so that the user can use the information stored as appropriate when the user of the device performs optical analysis.
  • digested light intensity data is prepared from time-series light intensity data by removing regions where no luminescent particle signal exists.
  • the digested light intensity data is stored.
  • the size of the digested light intensity data is significantly larger than that of the time-series light intensity data by appropriately setting the time interval of the predetermined width. As a result, the storage area in the storage device can be greatly saved.
  • the digested light intensity data may be displayed on the display device of the computer 18.
  • the digested light intensity data stored in the storage device may be read out. In that case, display / reading of data can be completed in a shorter time than in the case of time-series light intensity data.
  • the digested light intensity data is prepared by removing the region where the signal of the luminescent particles does not exist, and the digestion is performed.
  • Digested light intensity data is prepared from the time-series light intensity data obtained by light measurement by scanning molecule counting method, according to the above-mentioned method, by removing the areas where the luminescent particle signal does not exist. In this study, we verified the influence of detection accuracy when detecting the signal of luminescent particles and the amount of data reduced by digestion.
  • a solution containing a fluorescent dye ATTO633 (Sigma-Aldrich, Cat. No. 18620) at 10 pM as a luminescent particle in a phosphate buffer (containing 0.05% Tween 20) was prepared.
  • a single molecule fluorescence measurement device MF20 (Olympus Corporation) equipped with an optical system of a confocal fluorescence microscope and a photon counting system is used as an optical analysis device, and the above-mentioned “(2) Sample solution In accordance with the embodiment described in “Measurement of Light Intensity”, time-series light intensity data (photon count data) was obtained for the sample solution.
  • time-series light intensity data was 200,000 records ( 2/10 ⁇ 10 ⁇ 6 ), and the data amount was approximately 1 MB.
  • FIG. 6 (A) shows a part of time-series light intensity data obtained by converting the output obtained by the photodetector into time-series data.
  • the upper row shows the photon count value every 10 ⁇ sec from the start of measurement to 50000 ⁇ sec
  • the lower row enlarges the photon count value every 10 ⁇ sec from the start of measurement to 5000 ⁇ sec. It shows.
  • the signal of the luminescent particles is a pulsed signal having a photon count value exceeding 1 (dotted line in the figure).
  • a part of the time-series light intensity data in which the signal of the luminescent particles actually appears is a part, and the other areas are unnecessary areas.
  • the photon count value is less than 1 over the entire area, it is an unnecessary area in the detection of the signal of the luminescent particles.
  • the time-series light intensity data was digested in the manner described in the above digesting process [(i) When digesting process is performed before detection of luminescent particle signal]. Specifically, the time-series light intensity data was divided into 200 ⁇ sec time intervals, and the total number of photons was calculated as the light intensity characteristic value for each time interval. Next, a region corresponding to a time interval in which the total number of photons exceeds 5 (threshold value threshold value) was selected, and digested light intensity data was prepared by deleting regions corresponding to other time intervals.
  • the upper part of FIG. 6B shows digested light intensity data (from the beginning to the 5000th record) obtained by digesting the time-series light intensity data of FIG. 6A, and FIG.
  • the lower part shows an enlarged view of the upper part (from the beginning to the 500th record).
  • the region below 1 which is the threshold for detection of the luminescent particle signal is reduced, and thus is unnecessary in detecting the signal of the luminescent particle.
  • the area was reduced.
  • the detection accuracy of the light emitting particle is lowered, that is, the signal of the light emitting particle signal that cannot be detected is detected. It is conceivable that the number increases. Therefore, the influence of the threshold for the predetermined width of the time interval and the characteristic value when dividing the time-series light intensity data in the digesting process on the detection accuracy of the luminescent particle signal was confirmed.
  • the threshold value of the characteristic value is set to 0 to 0 when the predetermined width of the time interval in the division of the time series light intensity data is set to 200 ⁇ sec, 300 ⁇ sec, 500 ⁇ sec, and 1000 ⁇ sec.
  • the optimal predetermined width is 200 ⁇ sec. It was. (In the conditions of this experimental example, the transit time of the light-emitting particles through the light detection region is about 74 ⁇ sec. Therefore, when the predetermined width is less than 200 ⁇ sec, the signal of one light-emitting particle is spread over different time intervals. The possibility of appearing is increased, which is considered undesirable.) In any given width, when the threshold value of the characteristic value (photon number threshold value) is increased, the number of signals of the detected luminescent particles is reduced. This indicates that if the threshold value of the characteristic value is set to an appropriate value, the amount of reduction in the number of detected luminescent particle signals can be suppressed to an acceptable level.
  • FIG. 7 is a graph showing the number of detected luminescent particle signals (number of pulses) and the data compression rate with respect to the threshold value of the characteristic value when the predetermined width in Table 1 is set to 200 ⁇ sec. is there.
  • the threshold was set to 5
  • the data compression rate was reduced to about 12%, but almost no reduction in the number of detected luminescent particle signals was observed.
  • the threshold value was set to 10 or more
  • the amount of data tended to slightly decrease but was almost saturated, while the number of detected luminescent particle signals was greatly reduced. This suggests that part of the region where the luminescent particles are present has also been removed by the digestion process.
  • the time-series light intensity data is divided into time intervals in which the predetermined width is set to 200 ⁇ sec, and the threshold value of the characteristic value is set to 5, so that the digest is performed in an optimal state.
  • the process can be executed.
  • the amount of data can be reduced by suppressing the decrease in the detection accuracy of the signal of the luminescent particles as much as possible by the digest processing.
  • time-series light intensity data obtained by the light measurement by the scanning molecule counting method after performing individual detection of the signal of the luminescent particles, digestion processing was performed to prepare digested light intensity data.
  • the time-series light intensity data was the same as in Example 1, and the individual detection of the luminescent particle signal was performed in the same manner as in Example 1. After that, the time-series light intensity data was divided into time intervals of a predetermined width, and the regions where no luminescent particle signals existed were removed. In this embodiment, since the signal of the luminescent particles is detected on the time-series light intensity data, the accuracy of detection of the signal of the luminescent particles does not decrease.
  • FIG. 8 shows changes in the data compression rate when the predetermined width (window size) of the time interval is changed.
  • the predetermined width is 200 ⁇ s
  • the data compression rate is 7.8%.
  • the amount of data can be reduced while suppressing a decrease in the accuracy of detection of the signal of the luminescent particles.
  • the storage capacity of the storage device can be saved, the data processing load and the processing time can be reduced, and the use range of the scanning molecule counting method can be expanded.

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Abstract

共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡による光計測を用いた走査分子計数法に於いて、光強度データの大きさを低減する構成が提供される。本発明による試料溶液中の発光粒子の光を検出する光分析技術は、試料溶液内に於いて顕微鏡の光検出領域の位置を移動させながら検出された光検出領域からの光の時系列光強度データを生成し、時系列光強度データに於ける発光粒子の信号を個別に検出する。その際、時系列光強度データに於ける発光粒子の光を表す信号の存在していない領域を時系列の光強度データから除去することを特徴とする。

Description

単一発光粒子検出を用いた光分析装置、光分析方法及び光分析用コンピュータプログラム
　本発明は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いて、溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はこれらの凝集体（以下、これらを「粒子」と称する。）、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の対象物、或いは、非生物学的な粒子からの光を検出して、それらの状態（相互作用、結合・解離状態など）の分析又は解析に於いて有用な情報を取得することが可能な光分析技術に係り、より詳細には、上記の如き光学系を用いて単一の発光する粒子からの光を個別に検出して種々の光分析を可能にする光分析装置、光分析方法並びに光分析用コンピュータプログラムに係る。なお、本明細書に於いて、光を発する粒子（以下、「発光粒子」と称する。）は、それ自身が光を発する粒子、又は、任意の発光標識若しくは発光プローブが付加された粒子のいずれであってもよく、発光粒子から発せられる光は、蛍光、りん光、化学発光、生物発光、散乱光等であってよい。
　近年の光計測技術の発展により、共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング（１光子検出）も可能な超高感度の光検出技術とを用いて、一光子又は蛍光一分子レベルの微弱光の検出・測定が可能となっている。そこで、そのような微弱光の計測技術を用いて、生体分子等の特性、分子間相互作用又は結合・解離反応の検出を行う装置又は方法が種々提案されている。例えば、蛍光相関分光分析（Fluorescence　Correlation　Spectroscopy：ＦＣＳ。例えば、特許文献１－３、非特許文献１－３参照）に於いては、レーザー共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術を用いて、試料溶液中の微小領域（顕微鏡のレーザー光が集光された焦点領域－コンフォーカル・ボリュームと称される。）内に出入りする蛍光分子又は蛍光標識された分子（蛍光分子等）からの蛍光強度の測定が為され、その測定された蛍光強度の自己相関関数の値から決定される微小領域内に於ける蛍光分子等の平均の滞留時間（並進拡散時間）及び滞留する分子の数の平均値に基づいて、蛍光分子等の運動の速さ又は大きさ、濃度といった情報の取得、或いは、分子の構造又は大きさの変化や分子の結合・解離反応又は分散・凝集といった種々の現象の検出が為される。また、蛍光強度分布分析(Fluorescence-Intensity　Distribution　Analysis：ＦＩＤＡ。例えば、特許文献４、非特許文献４)やフォトンカウンティングヒストグラム（Photon　Counting　Histogram：ＰＣＨ。例えば、特許文献５）では、ＦＣＳと同様に計測されるコンフォーカル・ボリューム内に出入りする蛍光分子等の蛍光強度のヒストグラムが生成され、そのヒストグラムの分布に対して統計的なモデル式をフィッティングすることにより、蛍光分子等の固有の明るさの平均値とコンフォーカル・ボリューム内に滞留する分子の数の平均値が算定され、これらの情報に基づいて、分子の構造又は大きさの変化、結合・解離状態、分散・凝集状態などが推定されることとなる。またその他に、特許文献６、７に於いては、共焦点顕微鏡の光学系を用いて計測される試料溶液の蛍光信号の時間経過に基づいて蛍光性物質を検出する方法が提案されている。特許文献８は、フローサイトメータに於いて流通させられた蛍光微粒子又は基板上に固定された蛍光微粒子からの微弱光をフォトンカウンティング技術を用いて計測してフロー中又は基板上の蛍光微粒子の存在を検出するための信号演算処理技術を提案している。
　特に、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術とを用いた微小領域の蛍光測定技術を用いた方法によれば、測定に必要な試料は、従前に比して極めて低濃度且微量でよく（一回の測定で使用される量は、たかだか数十μＬ程度）、測定時間も大幅に短縮される（一回の測定で秒オーダーの時間の計測が数回繰り返される。）。従って、これらの技術は、特に、医学・生物学の研究開発の分野でしばしば使用される希少な或いは高価な試料についての分析を行う場合や、病気の臨床診断や生理活性物質のスクリーニングなど、検体数が多い場合に、従前の生化学的方法に比して、低廉に、或いは、迅速に実験又は検査が実行できる強力なツールとなることが期待されている。
特開２００５－０９８８７６ 特開２００８－２９２３７１ 特開２００９－２８１８３１ 特許第４０２３５２３号 国際公開２００８－０８０４１７ 特開２００７－２０５６５ 特開２００８－１１６４４０ 特開平４－３３７４４６号公報
金城政孝、蛋白質　核酸　酵素　Vol.４４、No.９、１４３１－１４３８頁　１９９９年 エフ・ジェイ・メイヤー・アルムス（F.J.Meyer-Alms）、フルオレセンス・コリレーション・スペクトロスコピー（Fluorescence　Correlation　Spectroscopy）、アール・リグラー編（R.Rigler）、スプリンガー（Springer）、ベルリン、２０００年、２０４－２２４頁 加藤則子外４名、遺伝子医学、Vol.６、No.２、２７１－２７７頁 カスク他３名、米国科学アカデミー紀要　１９９９年、９６巻、13756‐13761頁（P.　Kask,　K.　Palo,　D.　Ullmann,　K.　Gall　PNAS　96,　13756-13761　(1999)）
　上記のＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術を用いた光分析技術では、計測される光は、蛍光一分子又は数分子から発せられた光であるが、その光の解析に於いて、時系列に測定された蛍光強度データの自己相関関数の演算又はヒストグラムに対するフィッティングといった蛍光強度のゆらぎの算出等の統計的処理が実行され、個々の蛍光分子等からの光の信号を個別に参照又は分析するわけではない。即ち、これらの光分析技術に於いては、複数の蛍光分子等からの光の信号が統計的に処理され、蛍光分子等について統計平均的な特性が検出されることとなる。従って、これらの光分析技術に於いて統計的に有意な結果を得るためには、試料溶液中の観測対象となる蛍光分子等の濃度又は数密度は、平衡状態に於いて、一回の秒オーダーの長さの計測時間のうちに統計的処理が可能な数の蛍光分子等が微小領域内を入出するレベル、好適には、微小領域内に常に一個程度の蛍光分子等が存在しているレベルである必要がある。実際、コンフォーカル・ボリュームの体積は、１ｆＬ程度となるので、上記の光分析技術に於いて使用される試料溶液中の蛍光分子等の濃度は、典型的には、１ｎＭ程度若しくはそれ以上であり、１ｎＭを大幅に下回るときには、蛍光分子等がコンフォーカル・ボリューム内に存在しない時間が生じて統計的に有意な分析結果が得られないこととなる。一方、特許文献６～８に記載の蛍光分子等の検出方法では、蛍光強度のゆらぎの統計的演算処理が含まれておらず、試料溶液中の蛍光分子等が１ｎＭ未満であっても蛍光分子等の検出が可能であるが、溶液中でランダムに運動している蛍光分子等の濃度又は数密度を定量的に算出するといったことは達成されていない。
　そこで、本願出願人は、特願２０１０－０４４７１４及びＰＣＴ／ＪＰ２０１１／５３４８１に於いて、観測対象となる発光粒子の濃度又は数密度が、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の統計的処理を含む光分析技術で取り扱われるレベルよりも低い試料溶液中の発光粒子の状態又は特性を定量的に観測することを可能にする新規な原理に基づく光分析技術を提案した。かかる新規な光分析技術に於いては、端的に述べれば、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等と同様に共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いるところ、試料溶液内に於いて光の検出領域である微小領域（以下、「光検出領域」と称する。）の位置を移動させながら、即ち、光検出領域により試料溶液内を走査しながら、光検出領域が試料溶液中に分散してランダムに運動する発光粒子を包含したときに、その発光粒子から発せられる光を検出し、これにより、試料溶液中の発光粒子の一つ一つを個別に検出して、発光粒子のカウンティングや試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度に関する情報の取得を可能にする。この新規な光分析技術（以下、「走査分子計数法」と称する。）によれば、測定に必要な試料がＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の光分析技術と同様に微量（例えば、数十μＬ程度）であってもよく、また、測定時間が短く、しかも、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の光分析技術の場合に比して、より低い濃度又は数密度の発光粒子の存在を検出し、その濃度、数密度又はその他の特性を定量的に検出することが可能となる。
　上記の走査分子計数法では、より具体的には、試料溶液内に於ける光検出領域の位置の移動と共に、逐次的に計測された光強度値（若しくはフォトンカウント値）が時系列の光強度データとして記録され、そのデータ上に於いて、発光粒子から発せられる光を表す強度の変化が在った領域が検出される。即ち、時系列光強度データのうち、有意な情報が存在する領域は、発光粒子からの光を表す強度の変化のあった領域であり、それ以外の領域は不用な領域となる。従って、有意な情報の存在しない領域、即ち、発光粒子からの光を表す強度の変化のなかった領域を記録し保存することは、無駄に時系列光強度データの大きさを増大し、記憶装置の記憶容量を無駄に使用することとなり得る。そして、試料溶液中の発光粒子濃度が低いほど、時系列光強度データ上の発光粒子からの光を表す強度の変化のない領域が増大するので、無駄に使用される記憶容量が増大することとなる。また、時系列光強度データのデータ量の増大は、コンピュータに於けるデータ処理の負荷及び処理時間も増大することとなる。
　かくして、本発明の一つの課題は、上記の如き走査分子計数法に於いて、時系列光強度データのデータ量を低減することを可能にする新規な手法を提案することである。
　また、本発明のもう一つの課題は、上記の如き走査分子計数法に於いて処理される時系列光強度データのデータ量の低減により、データを保存するための記憶容量の節約とデータ処理の負荷及び処理時間を低減できるようにすることである。
　本発明の一つの態様によれば、上記の課題は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析装置であって、試料溶液内に於ける顕微鏡の光学系の光検出領域の位置を移動する光検出領域移動部と、光検出領域からの光を検出する光検出部と、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動させながら光検出部にて検出された光検出領域からの光の時系列の光強度データを生成し、時系列の光強度データに於いて発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出する信号処理部とを含み、信号処理部が、時系列の光強度データに於ける発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない領域を時系列の光強度データから除去することを特徴とする装置によって達成される。かかる構成に於いて、「試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子」とは、試料溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はそれらの凝集体などの、光を発する粒子であって、基板などに固定されず、溶液中を自由にブラウン運動している粒子であれば任意の粒子であってよい。かかる発光粒子は、典型的には、蛍光性粒子であるが、りん光、化学発光、生物発光、光散乱等により光を発する粒子であってもよい。共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の「光検出領域」とは、それらの顕微鏡に於いて光が検出される微小領域であり、対物レンズから照明光が与えられる場合には、その照明光が集光された領域に相当する（共焦点顕微鏡に於いては、特に対物レンズとピンホールとの位置関係により確定される。発光粒子が照明光なしで発光する場合、例えば、化学発光又は生物発光により発光する粒子の場合には、顕微鏡に於いて照明光は要しない。）。なお、本明細書に於いて、「発光粒子の信号」という場合には、特に断らない限り、発光粒子からの光を表す信号を指すものとする。
　上記から理解される如く、本発明の基本的な構成である走査分子計数法に於いては、まず、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動しながら、即ち、試料溶液内を光検出領域により走査しながら、逐次的に、光の検出が行われる。そうすると、試料溶液内にて移動する光検出領域が、ランダムに運動している発光粒子を包含したときには、発光粒子からの光が検出され、これにより、一つの発光粒子の存在が検出されることが期待される。従って、逐次的に検出された光に於いて発光粒子からの光の信号を個別に検出して、これにより、粒子の存在を一つずつ個別に逐次的に検出し、粒子の溶液内での状態に関する種々の情報が取得されることとなる。その際、既に述べた如く、逐次的に計測された光強度値の群、即ち、時系列光強度データに於いて、発光粒子からの光を表す強度の変化のない領域は不用な領域であるので、無駄に時系列光強度データの大きさを増大させ、記憶装置の記憶容量を無駄に使用することとなり、また、時系列光強度データから発光粒子からの光を表す信号を検出する信号処理に於けるデータ処理の負荷及び処理時間も増大し得る。そこで、本発明に於いては、上記の如く、信号処理部は、時系列の光強度データに於ける発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない領域を時系列の光強度データから除去する操作を実行するよう構成され、これにより、時系列光強度データの大きさの低減が図られる。
　上記の本発明の構成に於いて、時系列光強度データに於ける発光粒子の各々からの光を表す信号の存在している領域と、発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない領域とは、それらの領域に於ける光強度データの特性に基づいて概ね見分けることが可能である。即ち、時系列光強度データに於いて、発光粒子からの光が光検出部に到来している時間区間では、光検出部の出力信号の値は、パルス状にて変化し、ノイズのみが生ずる発光粒子からの光が到来していない時間区間とは異なる特性を有するので、そのような発光粒子からの光の有無を表す特性を参照すれば、時系列光強度データに於ける発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない領域を特定することが可能となる。かくして、本発明の装置に於いては、信号処理部が、時系列の光強度データに於いて所定幅の時間区間毎に発光粒子からの光の有無を表す光強度の特性値を算出し、かかる特性値を用いて発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない時間区間を決定し、発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない時間区間に対応する領域を時系列の光強度データから除去するよう構成されていてよい。
　上記の発光粒子からの光の有無を表す光強度の特性値としては、発光粒子からの光が存在している所定幅の時間区間に於けるその大きさが、発光粒子からの光が存在していない所定幅の時間区間に於ける大きさよりも大きくなる任意の値が採用可能である。その場合、光強度の特性値が所定の閾値より大きいときに所定幅の時間区間に発光粒子からの信号が存在すると判定される。そのような特性値は、例えば、所定幅の時間区間に於ける光強度の積算値、光強度の中央値、光強度の平均値、光強度の標準偏差、光強度の分散、光強度のエントロピー、光強度の最大値及び光強度の自己相関関数の相関時間を０としたときの値から算定される粒子数のうちのいずれかであってよい。なお、典型的には、光検出部は、フォトンカウンティングにより光検出領域からの光を検出し、その場合、時系列の光強度データが時系列のフォトンカウントデータとなる。従って、光強度の特性値は、所定幅の時間区間に於ける光子数の合計値、光子数の中央値、光子数の平均値、光子数の標準偏差、光子数の分散、光子数のエントロピー、光子数の最大値及び相関時間を０とした光子数の自己相関関数値から算定される粒子数の群の中から選択された値であってよい。
　また、上記の本発明の装置に於いて、時系列の光強度データに於ける発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない領域の、時系列光強度データからの除去は、時系列の光強度データに於ける発光粒子の各々からの光を表す信号の個別の検出処理の前或いは後のいずれかに於いて実行されてよい。発光粒子の信号の個別の検出処理の前に於いて、発光粒子の信号の存在していない領域の除去を行う場合には、発光粒子の信号の個別の検出処理に於ける装置のデータ処理の負荷及び処理時間が低減され有利である。即ち、本発明の装置に於いて、信号処理部が、時系列の光強度データに於ける発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない領域が時系列の光強度データから除去された光強度データ上にて発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出するよう構成されていてよい。なお、発光粒子の信号の個別の検出処理の後に於いて、発光粒子の信号の存在していない領域の除去を行う場合には、発光粒子の信号の個別の検出処理の精度が担保される点で有利である。いずれの場合に於いても、記憶装置の記憶容量を節約するために、信号処理部は、時系列の光強度データに於ける発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない領域が時系列の光強度データから除去されることにより得られる光強度データを記憶装置に保存できるようになっていてよい。
　更に、本発明の装置の信号処理部の処理に於いて、発光粒子の各々からの光を表す信号の個別の検出は、時系列の信号の形状に基づいて為されてよい。実施の形態に於いて、典型的には、所定の閾値より大きい強度を有する信号が検出されたときに、１つの発光粒子が光検出領域に入ったと検出されるようになっていてよい。
　上記の本発明の装置に於いて、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、発光粒子の特性又は試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて適宜変更可能となっていてよい。当業者に於いて理解される如く、発光粒子から検出される光の態様は、発光粒子の特性又は試料溶液中の数密度又は濃度によって変化し得る。特に、光検出領域の移動速度が速くなると、一つの発光粒子から得られる光量は低減することとなるので、一つの発光粒子からの光が精度よく又は感度よく計測できるように、光検出領域の移動速度は、適宜変更可能となっていることが好ましい。
　また、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、好適には、検出対象となる発光粒子の拡散移動速度（ブラウン運動による粒子の平均の移動速度）よりも高く設定される。上記に説明されている如く、本発明の装置は、光検出領域が発光粒子の存在位置を通過したときにその発光粒子から発せられる光を検出して、発光粒子を個別に検出する。しかしながら、発光粒子が溶液中でブラウン運動することによりランダムに移動して、複数回、光検出領域を出入りする場合には、１つの発光粒子から複数回、（発光粒子の存在を表す）信号が検出されてしまい、検出された信号と１つの発光粒子の存在とを対応させることが困難となる。そこで、上記の如く、光検出領域の移動速度を発光粒子の拡散移動速度よりも高く設定し、これにより、１つの発光粒子を一つの（発光粒子の存在を表す）信号に対応させることが可能となる。なお、拡散移動速度は、発光粒子によって変わるので、上記の如く、発光粒子の特性（特に、拡散定数）に応じて、本発明の装置は、光検出領域の移動速度が適宜変更可能であるよう構成されていることが好ましい。
　試料溶液内での光検出領域の位置の移動は、任意の方式で為されてよい。例えば、レーザー走査型光学顕微鏡に於いて採用されているガルバノミラーを用いるなどして、顕微鏡の光学系の光路を変更して光検出領域の位置が変更されるようになっていてよく、或いは、光検出領域を固定して、試料溶液の位置を（例えば、顕微鏡のステージを移動するなどして）動かして、光検出領域の試料溶液内に於ける位置を移動するようになっていてよい。光検出領域の位置の移動軌跡は、任意に設定されてよく、例えば、円形、楕円形、矩形、直線及び曲線のうちから選択可能であってよい。特に、顕微鏡の光学系の光路を変更して光検出領域の位置が変更される場合、光検出領域の移動は、速やかであり、且つ、試料溶液に於いて機械的振動や流体力学的な作用が実質的に発生しないので、検出対象となる発光粒子が力学的な作用の影響を受けることなく安定した状態にて、光の計測が可能である点で有利である。
　上記の本発明の実施の態様の一つに於いては、信号の数を計数して光検出領域に包含された発光粒子の数を計数するようになっていてよい（粒子のカウンティング）。その場合、検出された発光粒子の数と光検出領域の位置の移動量と組み合わせることにより、試料溶液中の同定された発光粒子の数密度又は濃度に関する情報が得られることとなる。具体的には、例えば、複数の試料溶液の数密度若しくは濃度の比、或いは、濃度若しくは数密度の基準となる標準試料溶液に対する相対的な数密度若しくは濃度の比が算出されるか、又は、濃度若しくは数密度の基準となる標準試料溶液に対する相対的な数密度若しくは濃度の比を用いて、絶対的な数密度値又は濃度値が決定されてよい。或いは、任意の手法により、例えば、所定の速度にて光検出領域の位置を移動するなどして、光検出領域の位置の移動軌跡の全体積を特定すれば、発光粒子の数密度又は濃度が具体的に算定できることとなる。
　上記の本発明の装置に於いて試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動させながら光検出を行い、個々の発光粒子からの信号を個別に検出する光分析技術であって、光強度データの大きさの低減が可能な光分析技術の処理は、汎用のコンピュータによっても実現可能である。従って、本発明のもう一つの態様によれば、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出するための光分析用コンピュータプログラムであって、試料溶液内に於ける顕微鏡の光学系の光検出領域の位置を移動する手順と、試料溶液内に於ける光検出領域の位置の移動中に光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する手順と、時系列の光強度データに於ける個々の発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出する手順とをコンピュータに実行させるコンピュータプログラムにして、時系列の光強度データに於ける発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない領域を時系列の光強度データから除去する手順を含むことを特徴とするコンピュータプログラムが提供される。かかる構成に於いて、典型的には、光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する手順に於いて、光検出領域からの光がフォトンカウンティングにより検出され、その場合、時系列の光強度データは時系列のフォトンカウントデータとなる。また、上記のコンピュータプログラムに於いても、時系列の光強度データに於ける個々の発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出する手順に於いて、時系列の光強度データに於ける発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない領域が時系列の光強度データから除去された光強度データ上にて発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出するようになっていてよく、更に、時系列の光強度データに於ける発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない領域が時系列の光強度データから除去された光強度データを記憶装置に保存する手順がコンピュータにより実行されるようになっていてよい。
　更に、上記のコンピュータプログラムに於いても、時系列の光強度データに於ける発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない領域を時系列の光強度データから除去する手順に於いて、時系列の光強度データに於いて所定幅の時間区間毎に発光粒子からの光の有無を表す光強度の特性値が算出され、かかる特性値を用いて発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない時間区間が決定され、発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない時間区間に対応する領域が時系列の光強度データから除去されるようになっていてよい。発光粒子からの光の有無を表す光強度の特性値は、具体的には、所定幅の時間区間に於ける光強度の積算値、光強度の中央値、光強度の平均値、光強度の標準偏差、光強度の分散、光強度のエントロピー、光強度の最大値及び相関時間を０とした光強度の自己相関関数値から算定される粒子数のうちのいずれかが採用されてよい。特に、時系列の光強度データが時系列のフォトンカウントデータであるときには、光強度の特性値は、所定幅の時間区間に於ける光子数の合計値、光子数の中央値、光子数の平均値、光子数の標準偏差、光子数の分散、光子数のエントロピー、光子数の最大値及び相関時間を０とした光子数の自己相関関数値から算定される粒子数の群の中から選択された値であってよい。
　また、上記のコンピュータプログラムに於いても、発光粒子の各々からの光を表す信号の個別の検出は、時系列の信号の形状に基づいて為されてよい。実施の形態に於いて、典型的には、所定の閾値より大きい強度を有する信号が検出されたときに、１つの発光粒子が光検出領域に入ったと検出されるようになっていてよい。試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、発光粒子の特性、試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて適宜変更可能となっていてよく、好適には、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、検出対象となる発光粒子の拡散移動速度よりも高く設定される。試料溶液内での光検出領域の位置の移動は、任意の方式で為されてよく、好適には、顕微鏡の光学系の光路を変更して或いは試料溶液の位置を動かして光検出領域の位置が変更されるようになっていてよい。光検出領域の位置の移動軌跡は、任意に設定されてよく、例えば、円形、楕円形、矩形、直線及び曲線のうちから選択可能であってよい。
　更に、上記のコンピュータプログラムに於いても、個別に検出された発光粒子からの信号の数を計数して光検出領域の位置の移動中に検出された発光粒子の数を計数する手順及び／又は検出された発光粒子の数に基づいて、試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度を決定する手順が含まれていてよい。
　上記の本発明の装置又はコンピュータプログラムによれば、試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動させながら、個々の発光粒子の光の検出を行う光分析方法であって、光強度データの大きさの低減を可能にする新規な方法が実現される。かくして、本発明によれば、更に、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析方法であって、試料溶液内に於ける顕微鏡の光学系の光検出領域の位置を移動する過程と、試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動させながら光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する過程と、時系列の光強度データに於ける個々の発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出する過程とを含む方法にして、時系列の光強度データに於ける発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない領域を時系列の光強度データから除去する過程を含むことを特徴とする方法が提供される。かかる方法に於いても、典型的には、光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する過程に於いて、光検出領域からの光がフォトンカウンティングにより検出され、その場合、時系列の光強度データは時系列のフォトンカウントデータとなる。また、上記の方法に於いても、時系列の光強度データに於ける個々の発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出する過程に於いて、時系列の光強度データに於ける発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない領域が時系列の光強度データから除去された光強度データ上にて発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出するようになっていてよく、更に、時系列の光強度データに於ける発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない領域が時系列の光強度データから除去された光強度データを記憶装置に保存する過程が実行されるようになっていてよい。
　更に、上記の方法に於いても、時系列の光強度データに於ける発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない領域を時系列の光強度データから除去する過程に於いて、時系列の光強度データに於いて所定幅の時間区間毎に発光粒子からの光の有無を表す光強度の特性値が算出され、かかる特性値を用いて発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない時間区間が決定され、発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない時間区間に対応する領域が時系列の光強度データから除去されるようになっていてよい。発光粒子からの光の有無を表す光強度の特性値は、具体的には、所定幅の時間区間に於ける光強度の積算値、光強度の中央値、光強度の平均値、光強度の標準偏差、光強度の分散、光強度のエントロピー、光強度の最大値及び相関時間を０とした光強度の自己相関関数値から算定される粒子数のうちのいずれかが採用されてよい。特に、時系列の光強度データが時系列のフォトンカウントデータであるときには、光強度の特性値は、所定幅の時間区間に於ける光子数の合計値、光子数の中央値、光子数の平均値、光子数の標準偏差、光子数の分散、光子数のエントロピー、光子数の最大値及び相関時間を０とした光子数の自己相関関数値から算定される粒子数の群の中から選択された値であってよい。
　また、上記の方法に於いても、発光粒子の各々からの光を表す信号の個別の検出は、時系列の信号の形状に基づいて為されてよい。実施の形態に於いて、典型的には、所定の閾値より大きい強度を有する信号が検出されたときに、１つの発光粒子が光検出領域に入ったと検出されるようになっていてよい。試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、発光粒子の特性又は試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて適宜変更可能となっていてよく、好適には、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、検出対象となる発光粒子の拡散移動速度よりも高く設定される。試料溶液内での光検出領域の位置の移動は、任意の方式で為されてよく、顕微鏡の光学系の光路を変更して或いは試料溶液の位置を動かして光検出領域の位置が変更されるようになっていてよい。光検出領域の位置の移動軌跡は、任意に設定されてよく、例えば、円形、楕円形、矩形、直線及び曲線のうちから選択可能であってよい。
　更に、上記の方法に於いても、個別に検出された発光粒子からの信号の数を計数して光検出領域の位置の移動中に検出された発光粒子の数を計数する過程及び／又は検出された発光粒子の数に基づいて、試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度を決定する過程が含まれていてよい。
　上記の本発明の光分析技術は、典型的には、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の生物学的な対象物の溶液中の状態の分析又は解析の用途に用いられるが、非生物学的な粒子（例えば、原子、分子、ミセル、金属コロイドなど）の溶液中の状態の分析又は解析に用いられてもよく、そのような場合も本発明の範囲に属することは理解されるべきである。
　総じて、本発明の光分析技術では、走査分子計数法に於いて、時系列光強度データ上に於いて、発光粒子の信号が存在していない領域を選択的に削除することにより、光強度データの大きさを低減して、かかる光強度データの分析処理に於ける負荷、処理時間を低減すると共に、データを記憶するための記憶容量の節約が図られる。後述の実施形態の説明の欄にて詳細に例示される如く、特に、時系列の光強度データに於いて所定幅の時間区間毎に算出された発光粒子からの光の有無を表す光強度の特性値を用いて発光粒子の信号の存在していない時間区間を決定し、発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない時間区間に対応する領域を時系列の光強度データから除去する態様によれば、条件によっては、データ量を約１０分の１程度まで圧縮することも可能となる。かくして、本発明によれば、光強度データの大きさの低減が可能となることから、データの保存に必要な記憶装置の記憶容量の低減と分析処理に必要な演算能力の低減が可能となり、走査分子計数法の実施に要する費用の低減も図られることとなり、走査分子計数法の利用機会の拡大が期待される。
　本発明のその他の目的及び利点は、以下の本発明の好ましい実施形態の説明により明らかになるであろう。
図１（Ａ）は、本発明の方法を実行する光分析装置の内部構造の模式図である。図１（Ｂ）は、コンフォーカル・ボリューム（共焦点顕微鏡の観察領域）の模式図である。図１（Ｃ）は、ミラー７の向きを変更して試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動する機構の模式図である。図１（Ｄ）は、マイクロプレートの水平方向位置を移動して試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動する機構の模式図である。 図２（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、本発明の方法が適用される走査分子計数法に於ける光検出の原理を説明する模式図及び計測される光強度の時間変化の模式図である。図２（Ｃ）は、時系列光強度データから発光粒子の信号が存在しない領域を削除してから発光粒子の信号を検出する場合の原理を説明する図である。図２（Ｄ）は、発光粒子の信号の検出を実行した後に時系列光強度データから発光粒子の信号が存在しない領域を削除する場合の原理を説明する図である。 図３（Ａ）、（Ｂ）は、本発明に従って実行される走査分子計数法の処理手順をフローチャートの形式で表した図である。図３（Ｃ）は、光強度データ上に於いて、発光粒子の信号を個別に検出する手法の一つの例をフローチャートの形式で表した図である。 図４（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、発光粒子がブラウン運動をしながら光検出領域を横切る場合及び試料溶液内の光検出領域の位置を発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動することにより発光粒子が光検出領域を横切る場合の粒子の運動の態様を表すモデル図である。図４（Ｃ）は、走査分子計数法に従って、計測された時系列光強度データ（フォトンカウントの時間変化）から発光粒子の存在を検出するための処理手順に於ける検出信号の信号処理過程の例を説明する図である。 図５は、計測されたフォトンカウントデータの実測例（棒グラフ）と、データをスムージングして得られる曲線（点線）と、パルス存在領域にてフィッティングされたガウス関数（実線）を示している。図中、「ノイズ」と付された信号は、ノイズ又は異物による信号であるとして無視される。 図６（Ａ）の上段は、光検出部により得られる光強度（フォトンカウント）の時系列データの例であり、下段は、上段の初めの一部を拡大して示した図である。図６（Ｂ）の上段は、図６（Ａ）の時系列光強度データをダイジェスト化処理して得られる光強度データの例であり、下段は、上段の初めの一部を拡大して示した図である。光強度の測定条件は、本文参照。ダイジェスト化処理は、ウィンドウサイズを２００μ秒として、特性値（光子数和）の閾値を５とした。図中、丸点線は、発光粒子の信号の検出のための閾値（１フォトンカウント）を示している。 図７は、時系列光強度データをダイジェスト化処理して得られる光強度データに於いて、発光粒子の信号の検出処理を行った場合の検出パルス数とデータ圧縮率との、特性値（光子数和）の閾値に対する変化を示したグラフ図である。 図８は、時系列光強度データに於いて発光粒子の信号の検出処理を行った後、ダイジェスト化処理して得られる光強度データのデータ圧縮率の、ウィンドウサイズに対する変化を示したグラフ図である。 図９は、従来の蛍光強度のゆらぎを算出する光分析技術に於いて得られるフォトンカウント（光強度）の時間変化の例であり、（Ａ）は、試料内の粒子の濃度が、十分な計測精度が与えられる程度である場合であり、（Ｂ）は、（Ａ）の場合よりも大幅に試料内の粒子の濃度が低い場合である。
１…光分析装置（共焦点顕微鏡）
２…光源
３…シングルモードオプティカルファイバー
４…コリメータレンズ
５…ダイクロイックミラー
６、７、１１…反射ミラー
８…対物レンズ
９…マイクロプレート
１０…ウェル（試料溶液容器）
１２…コンデンサーレンズ
１３…ピンホール
１４…バリアフィルター
１５…マルチモードオプティカルファイバー
１６…光検出器
１７…ミラー偏向器
１７ａ…ステージ位置変更装置
１８…コンピュータ
　以下、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。
光分析装置の構成
　本発明による光分析技術を実現する光分析装置は、基本的な構成に於いて、図１（Ａ）に模式的に例示されている如き、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等が実行可能な共焦点顕微鏡の光学系と光検出器とを組み合わせてなる装置であってよい。同図を参照して、光分析装置１は、光学系２～１７と、光学系の各部の作動を制御すると共にデータを取得し解析するためのコンピュータ１８とから構成される。光分析装置１の光学系は、通常の共焦点顕微鏡の光学系と同様であってよく、そこに於いて、光源２から放射されシングルモードファイバー３内を伝播したレーザー光（Ｅｘ）が、ファイバーの出射端に於いて固有のＮＡにて決まった角度にて発散する光となって放射され、コリメーター４によって平行光となり、ダイクロイックミラー５、反射ミラー６、７にて反射され、対物レンズ８へ入射される。対物レンズ８の上方には、典型的には、１～数十μＬの試料溶液が分注される試料容器又はウェル１０が配列されたマイクロプレート９が配置されており、対物レンズ８から出射したレーザー光は、試料容器又はウェル１０内の試料溶液中で焦点を結び、光強度の強い領域（励起領域）が形成される。試料溶液中には、観測対象物である発光粒子、典型的には、蛍光性粒子又は蛍光色素等の発光標識が付加された粒子が分散又は溶解されており、かかる発光粒子が励起領域に進入すると、その間、発光粒子が励起され光が放出される。放出された光（Ｅｍ）は、対物レンズ８、ダイクロイックミラー５を通過し、ミラー１１にて反射してコンデンサーレンズ１２にて集光され、ピンホール１３を通過し、バリアフィルター１４を透過して（ここで、特定の波長帯域の光成分のみが選択される。）、マルチモードファイバー１５に導入されて、光検出器１６に到達し、時系列の電気信号に変換された後、コンピュータ１８へ入力され、後に説明される態様にて光分析のための処理が為される。なお、当業者に於いて知られている如く、上記の構成に於いて、ピンホール１３は、対物レンズ８の焦点位置と共役の位置に配置されており、これにより、図１（Ｂ）に模式的に示されている如きレーザー光の焦点領域、即ち、励起領域内から発せられた光のみがピンホール１３を通過し、励起領域以外からの光は遮断される。図１（Ｂ）に例示されたレーザー光の焦点領域は、通常、１～１０ｆＬ程度の実効体積を有する本光分析装置に於ける光検出領域であり（典型的には、光強度が領域の中心を頂点とするガウス様分布となる。実効体積は、光強度が１／ｅ２となる面を境界とする略楕円球体の体積である。）、コンフォーカル・ボリュームと称される。また、本発明では、１つの発光粒子からの光、例えば、一つの蛍光色素分子からの微弱光が検出されるので、光検出器１６としては、好適には、フォトンカウンティングに使用可能な超高感度の光検出器が用いられる。光の検出がフォトンカウンティングによる場合、光強度の測定は、所定時間に亘って、逐次的に、所定の単位時間毎（ＢＩＮ　ＴＩＭＥ）に、光検出器に到来するフォトンの数を計測する態様にて実行される。従って、この場合、時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータである。また、顕微鏡のステージ（図示せず）には、観察するべきウェル１０を変更するべく、マイクロプレート９の水平方向位置を移動するためのステージ位置変更装置１７ａが設けられていてよい。ステージ位置変更装置１７ａの作動は、コンピュータ１８により制御されてよい。かかる構成により、検体が複数在る場合にも、迅速な計測が達成可能となる。
　更に、上記の光分析装置の光学系に於いては、試料溶液内を光検出領域により走査する、即ち、試料溶液内に於いて焦点領域、即ち、光検出領域の位置を移動するための機構が設けられる。かかる光検出領域の位置を移動するための機構としては、例えば、図１（Ｃ）に模式的に例示されている如く、反射ミラー７の向きを変更するミラー偏向器１７が採用されてよい（光検出領域の絶対的な位置を移動する方式）。かかるミラー偏向器１７は、通常のレーザー走査型顕微鏡に装備されているガルバノミラー装置と同様であってよい。或いは、別の態様として、図１（Ｄ）に例示されている如く、試料溶液が注入されている容器１０（マイクロプレート９）の水平方向の位置を移動し、試料溶液内に於ける光検出領域の相対的な位置を移動するべくステージ位置変更装置１７ａが作動されてもよい（試料溶液の絶対的な位置を移動する方式）。いずれの方式による場合も、所望の光検出領域の位置の移動パターンを達成するべく、ミラー偏向器１７又はステージ位置変更装置１７ａは、コンピュータ１８の制御の下、光検出器１６による光検出と協調して駆動される。光検出領域の位置の移動軌跡は、円形、楕円形、矩形、直線、曲線又はこれらの組み合わせから任意に選択されてよい（コンピュータ１８に於けるプログラムに於いて、種々の移動パターンが選択できるようになっていてよい。）。なお、図示していないが、対物レンズ８又はステージを上下に移動することにより、光検出領域の位置が上下方向に移動されるようになっていてもよい。
　観測対象物となる発光粒子が多光子吸収により発光する場合には、上記の光学系は、多光子顕微鏡として使用される。その場合には、励起光の焦点領域（光検出領域）のみで光の放出があるので、ピンホール１３は、除去されてよい。また、観測対象物となる発光粒子が化学発光や生物発光現象により励起光によらず発光する場合には、励起光を生成するための光学系２～５が省略されてよい。発光粒子がりん光又は散乱により発光する場合には、上記の共焦点顕微鏡の光学系がそのまま用いられる。更に、光分析装置１に於いては、図示の如く、複数の励起光源２が設けられていてよく、発光粒子の励起波長によって適宜、励起光の波長が選択できるようになっていてよい。同様に、光検出器１６も複数個備えられていてよく、試料中に波長の異なる複数種の発光粒子が含まれている場合に、それらから光をその波長によって別々に検出できるようになっていてよい。
本発明の光分析技術の原理
　「発明の概要」の欄に記載されている如く、本発明の光分析技術に於いては、端的に述べれば、走査分子計数法に於いて、時系列光強度データの大きさの低減（ダイジェスト化処理）が実行される。以下、本発明の走査分子計数法及び時系列光強度データのダイジェスト化処理の原理について説明する。
１.走査分子計数法の原理
　ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の分光分析技術は、従前の生化学的な分析技術に比して、必要な試料量が極めて少なく、且つ、迅速に検査が実行できる点で優れている。しかしながら、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の分光分析技術では、原理的に、発光粒子の濃度や特性は、蛍光強度のゆらぎに基づいて算定されるので、精度のよい測定結果を得るためには、試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度が、図９（Ａ）に模式的に描かれているように、蛍光強度の計測中に常に一個程度の発光粒子が光検出領域ＣＶ内に存在するレベルであり、同図の右側に示されている如く、計測時間中に常に有意な光強度（フォトンカウント）が検出されることが要求される。もし発光粒子の濃度又は数密度がそれよりも低い場合、例えば、図９（Ｂ）に描かれているように、発光粒子がたまにしか光検出領域ＣＶ内へ進入しないレベルである場合には、同図の右側に例示されている如く、有意な光強度の信号（フォトンカウント）が、計測時間の一部にしか現れないこととなり、精度のよい光強度のゆらぎの算定が困難となる。また、計測中に常に一個程度の発光粒子が光検出領域内に存在するレベルよりも発光粒子の濃度が大幅に低い場合には、光強度のゆらぎの演算に於いて、バックグラウンドの影響を受けやすく、演算に十分な量の有意な光強度データを得るために計測時間が長くなる。
　そこで、本願出願人は、特願２０１０－０４４７１４及びＰＣＴ／ＪＰ２０１１／５３４８１に於いて、発光粒子の濃度が、上記の如きＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の分光分析技術にて要求されるレベルよりも低い場合でも、発光粒子の数密度又は濃度等の特性の検出を可能にする新規な原理に基づく「走査分子計数法」を提案した。
　走査分子計数法に於いて実行される処理としては、端的に述べれば、光検出領域の位置を移動するための機構（ミラー偏向器１７）を駆動して光路を変更し、図２（Ａ）にて模式的に描かれているように、試料溶液内に於いて光検出領域ＣＶの位置を移動しながら、即ち、光検出領域ＣＶにより試料溶液内を走査しながら、光検出が実行される。そうすると、例えば、光検出領域ＣＶが移動する間（図中、時間ｔｏ～ｔ２）に於いて１つの発光粒子の存在する領域を通過する際（ｔ１）には、発光粒子から光が放出され、図２（Ｂ）に描かれている如き時系列の光強度データ上に有意な光強度（Ｅｍ）のパルス状の信号が出現することとなる。かくして、上記の光検出領域ＣＶの位置の移動と光検出を実行し、その間に出現する図２（Ｂ）に例示されている如きパルス状の信号（有意な光強度）を一つずつ検出することによって、発光粒子が個別に検出され、その数をカウントすることにより、計測された領域内に存在する発光粒子の数、或いは、濃度若しくは数密度に関する情報が取得できることとなる。かかる走査分子計数法の原理に於いては、蛍光強度のゆらぎの算出の如き統計的な演算処理は行われず、発光粒子が一つずつ検出されるので、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等では十分な精度にて分析ができないほど、観測されるべき粒子の濃度が低い試料溶液でも、粒子の濃度若しくは数密度に関する情報が取得可能である。
２．時系列光強度データのダイジェスト化処理の原理
　既に述べた如く、上記の走査分子計数法により光検出器１６により経時的に取得された光強度のデータ（時系列光強度データ）に於いて、発光粒子の信号が存在する領域は、全領域の一部であり、発光粒子の信号の存在しない領域に於いては、光検出器の熱ノイズや背景光等に起因にするノイズが存在するのみである。従って、本発明に於いては、時系列光強度データに於ける発光粒子の信号の存在しない領域を時系列光強度データから除去し、時系列光強度データの大きさの低減が図られる。なお、本明細書に於いて、時系列光強度データの大きさの低減処理を、以下「ダイジェスト化処理」と称する。
（ｉ）ダイジェスト化処理後に発光粒子の信号の検出を行う場合
　時系列光強度データのダイジェスト化処理の一つの態様に於いては、時系列光強度データ上に於いて発光粒子の信号の存在しない領域を検出し、かかる領域を時系列光強度データから除去した光強度データ（ダイジェスト化光強度データ）を調製し、ダイジェスト化光強度データ上にて発光粒子の信号の個別の検出が実行される。具体的には、発光粒子の信号の存在する領域と発光粒子の信号の存在しない領域とを区別するために、まず、図２（Ｃ）の上段にて示されている如く、時系列光強度データ上に於いて、所定幅の時間区間毎に（例えば、図中、領域Ａ～Ｄ毎に）、各時間区間内の光強度値（光子数）を用いて発光粒子からの光の有無を表す光強度の特性値が算出される。既に触れた如く、時系列光強度データに於いて、発光粒子の信号の存在する領域には、パルス状の信号が存在するが、発光粒子の信号の存在しない領域では、ノイズのみであり、発光粒子の信号の存在する領域と発光粒子の信号の存在しない領域とは、光強度値に於いて、互いに異なる特性を有する。従って、時系列光強度データ上で、所定幅の時間区間毎に、発光粒子からの光の有無を表す任意の光強度の特性値を算定し、かかる特性値に基づいて、発光粒子の信号の存在しない領域に対応する時間区間を決定することが可能となる。
　発光粒子からの光の有無を表す光強度の特性値としては、発光粒子からの光が存在している所定幅の時間区間に於けるその大きさが、発光粒子からの光が存在していない所定幅の時間区間に於ける大きさよりも大きくなる任意の値が採用可能である。その場合、光強度の特性値が所定の閾値より大きいときに所定幅の時間区間に発光粒子からの信号が存在すると判定される。そのような特性値は、例えば、所定幅の時間区間に於ける光強度の積算値、光強度の中央値、光強度の平均値、光強度の標準偏差、光強度の分散、光強度のエントロピー、光強度の最大値及び光強度の自己相関関数の相関時間を０としたときの値から算定される粒子数のうちのいずれかであってよい。なお、典型的には、光検出部は、フォトンカウンティングにより光検出領域からの光を検出し、その場合、時系列の光強度データが時系列のフォトンカウントデータとなる。従って、光強度の特性値は、所定幅の時間区間に於ける光子数の合計値、光子数の中央値、光子数の平均値、光子数の標準偏差、光子数の分散、光子数のエントロピー、光子数の最大値及び相関時間を０とした光子数の自己相関関数値から算定される粒子数の群の中から選択された値であってよい。（図２（Ｃ）では、特性値として、各時間区間内の光子数の総和が採用されている。）
　かくして、各時間区間内の特性値が決定されると、かかる特性値を参照して、例えば、特性値が所定の閾値を超えているか否かを参照して、各時間区間に於いて、発光粒子の信号が存在するか否かが決定され、発光粒子の信号が存在する時間区間に対応する領域（図中、領域Ｂ、Ｄ）が選択的に抽出され、図２（Ｃ）の下段の如く、発光粒子の信号の存在しない時間区間に対応する領域（図中、領域Ａ、Ｃ）が除去されたダイジェスト化光強度データが調製される。そして、かくして調製されたダイジェスト化光強度データ上にて、例えば、後に詳細に説明される態様にて発光粒子の信号が検出される。かかる態様によれば、発光粒子の信号の検出処理の対象となるデータの大きさが小さくなり、不用な領域についてデータ処理をする必要がなくなるので、データ処理に於ける負荷と処理時間の短縮が期待される。また、計測されたデータの記憶装置への保存に於いては、ダイジェスト化光強度データを保存することにより、記憶装置の記憶容量の節約が可能となる。
　なお、上記の処理に於いて、時間区間の所定幅と特性値のための閾値は、任意に設定されてよい。しかしながら、後の実施例に於いて説明される如く、発光粒子信号の検出精度とデータの圧縮率（ダイジェスト化光強度データの大きさ／時系列光強度データの大きさ）は、時間区間の所定幅と特性値のための閾値の設定によって変わるので、予備実験等の結果を用いて適正な値に設定されることが好ましい。
（ii）発光粒子の信号の検出の後にダイジェスト化処理を行う場合
　時系列光強度データのダイジェスト化処理のもう一つの態様に於いては、時系列光強度データ上に於いて、まず、図２（Ｄ）の上段に模式的に示されている如く、例えば、（後述の如き）釣鐘型関数のフィッティング処理等を含む処理にて発光粒子の信号の検出を実行した後、発光粒子の信号の存在しない時間区間に対応する領域を除いて、発光粒子の信号の存在した時間区間に対応する領域のみを選択してダイジェスト化光強度データが調製される（図２（Ｄ）参照）。この場合、発光粒子の信号の検出処理については、（ｉ）の場合よりも負荷及び処理時間が大きくなるが、保存するデータをダイジェスト化光強度データとすることにより、記憶装置の記憶容量の節約が可能となる。時間区間の所定幅は、データの圧縮率に影響するので、予備実験等の結果を用いて適正な値に設定されることが好ましい。（後述の実施例参照）
走査分子計数法の処理操作過程
　図１（Ａ）に例示の光分析装置１を用いた本発明に従った走査分子計数法の実施形態に於いては、具体的には、（１）発光粒子を含む試料溶液の調製、（２）試料溶液の光強度の測定処理、及び（３）測定された光強度の分析処理が実行される。図３は、フローチャートの形式にて表した本実施形態に於ける処理を示している。なお、（Ａ）は、ダイジェスト化処理後に発光粒子の信号の検出を行う場合の処理であり、（Ｂ）は、発光粒子の信号の検出の後にダイジェスト化処理を行う場合の処理を示している。また、（Ｃ）は、発光粒子の信号の検出処理の例を示している。
（１）試料溶液の調製
　本発明の光分析技術の観測対象物となる粒子は、溶解された分子等の、試料溶液中にて分散し溶液中にてランダムに運動する粒子であれば、任意のものであってよく、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞、或いは、金属コロイド、その他の非生物学的分子などであってよい。観測対象物となる粒子が光を発する粒子でない場合には、発光標識（蛍光分子、りん光分子、化学・生物発光分子）が観測対象物となる粒子に任意の態様にて付加されたものが用いられる。試料溶液は、典型的には水溶液であるが、これに限定されず、有機溶媒その他の任意の液体であってよい。
（２）試料溶液の光強度の測定（図３（Ａ）、（Ｂ）ステップ１０）
　本実施形態の走査分子計数法による光分析に於ける光強度の測定は、測定中にミラー偏向器１７又はステージ位置変更装置１７ａを駆動して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動（試料溶液内の走査）を行う他は、ＦＣＳ又はＦＩＤＡに於ける光強度の測定過程と同様の態様にて実行されてよい。操作処理に於いて、典型的には、マイクロプレート９のウェル１０に試料溶液を注入して顕微鏡のステージ上に載置した後、使用者がコンピュータ１８に対して、測定の開始の指示を入力すると、コンピュータ１８は、記憶装置（図示せず）に記憶されたプログラム（試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動する手順と、光検出領域の位置の移動中に光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する手順）に従って、試料溶液内の光検出領域に於ける励起光の照射及び光強度の計測が開始される。かかる計測中、コンピュータ１８のプログラムに従った処理動作の制御下、ミラー偏向器１７又はステージ位置変更装置１７ａは、ミラー７（ガルバノミラー）又は顕微鏡のステージ上のマイクロプレート９を駆動して、ウェル１０内に於いて光検出領域の位置の移動を実行し、これと同時に光検出器１６は、逐次的に検出された光を電気信号に変換してコンピュータ１８へ送信し、コンピュータ１８では、任意の態様にて、送信された信号から時系列の光強度データを生成して保存する。なお、典型的には、光検出器１６は、一光子の到来を検出できる超高感度光検出器であるので、光の検出が、フォトンカウンティングによる場合、時系列光強度データは、時系列のフォトンカウントデータであってよい。
　光強度の計測中の光検出領域の位置の移動速度は、任意に、例えば、実験的に又は分析の目的に適合するよう設定された所定の速度であってよい。検出された発光粒子の数に基づいて、その数密度又は濃度に関する情報を取得する場合には、光検出領域の通過した領域の大きさ又は体積が必要となるので、移動距離が把握される態様にて光検出領域の位置の移動が実行される。なお、計測中の経過時間と光検出領域の位置の移動距離とが比例関係にある方が測定結果の解釈が容易となるので、移動速度は、基本的に、一定速度であることが好ましいが、これに限定されない。
　ところで、光検出領域の位置の移動速度に関して、計測された時系列の光強度データからの発光粒子の個別の検出、或いは、発光粒子の数のカウンティングを、定量的に精度よく実行するためには、かかる移動速度は、発光粒子のランダムな運動、即ち、ブラウン運動による移動速度よりも速い値に設定されることが好ましい。本発明の光分析技術の観測対象粒子は、溶液中に分散又は溶解されて自由にランダムに運動する粒子であるので、ブラウン運動によって位置が時間と伴に移動する。従って、光検出領域の位置の移動速度が粒子のブラウン運動による移動に比して遅い場合には、図４（Ａ）に模式的に描かれている如く、粒子が領域内をランダムに移動し、これにより、光強度がランダムに変化し（既に触れた如く、光検出領域の励起光強度は、領域の中心を頂点として外方に向かって低減する。）、個々の発光粒子に対応する有意な光強度の変化を特定することが困難となる。そこで、好適には、図４（Ｂ）に描かれている如く、粒子が光検出領域を略直線に横切り、これにより、時系列の光強度データに於いて、図４（Ｃ）の最上段に例示の如く、個々の発光粒子に対応する光強度の変化のプロファイルが略一様となり（発光粒子が略直線的に光検出領域を通過する場合には、光強度の変化のプロファイルは、励起光強度分布と略同様となる。）、個々の発光粒子と光強度との対応が容易に特定できるように、光検出領域の位置の移動速度は、粒子のブラウン運動による平均の移動速度（拡散移動速度）よりも速く設定される。
　具体的には、拡散係数Ｄを有する発光粒子がブラウン運動によって半径Ｗｏの光検出領域（コンフォーカルボリューム）を通過するときに要する時間Δｔは、平均二乗変位の関係式
　　（２Ｗｏ）２＝６Ｄ・Δｔ　　　…（１）
から、
　　Δｔ＝（２Ｗｏ）２／６Ｄ　　　…（２）
となるので、発光粒子がブラウン運動により移動する速度（拡散移動速度）Ｖdifは、概ね、
　　Ｖdif＝２Ｗｏ／Δｔ＝３Ｄ／Ｗｏ　　　…（３）
となる。そこで、光検出領域の位置の移動速度は、かかるＶdifを参照して、それよりも十分に早い値に設定されてよい。例えば、観測対象粒子の拡散係数が、Ｄ＝２．０×１０－１０ｍ２／ｓ程度であると予想される場合には、Ｗｏが、０．６２μｍ程度だとすると、Ｖdifは、１．０×１０－３ｍ／ｓとなるので、光検出領域の位置の移動速度は、その１０倍以上の１５ｍｍ／ｓと設定されてよい。なお、観測対象粒子の拡散係数が未知の場合には、光検出領域の位置の移動速度を種々設定して光強度の変化のプロファイルが、予想されるプロファイル（典型的には、励起光強度分布と略同様）となる条件を見つけるための予備実験を繰り返し実行して、好適な光検出領域の位置の移動速度が決定されてよい。
（３）光強度の分析
　上記の処理により時系列光強度データが得られると、コンピュータ１８に於いて、記憶装置に記憶されたプログラムに従った処理により、発光粒子の信号の検出、発光粒子のカウンティング、濃度算出等の各種分析が実行される。また、既に述べた如く、特に、本発明に於いては、発光粒子の信号の検出の前又は後に時系列光強度データのダイジェスト化処理が実行される。以下、（ｉ）発光粒子の信号の検出の前にダイジェスト化処理を行う場合（図３（Ａ））、及び、（ii）発光粒子の信号の検出の後にダイジェスト化処理を行う場合（図３（Ｂ））のそれぞれについて説明する。
（ｉ）発光粒子の信号の検出の前にダイジェスト化処理を行う場合
（ａ）ダイジェスト化処理（図３（Ａ）ステップ２０）
　発光粒子の信号の検出の前にダイジェスト化処理を行う場合のダイジェスト化処理に於いては、既に触れた如く、ステップ１０にて得られた時系列光強度データに於いて、所定幅の時間区間毎に光強度の特性値が算出される。光強度の特性値としては、時系列の光強度データが時系列のフォトンカウントデータである場合には、上記の如く、所定幅の時間区間に於ける光子数の合計値、光子数の中央値、光子数の平均値、光子数の標準偏差値、光子数の分散値、光子数のエントロピー値、光子数の最大値及び相関時間を０とした光子数の自己相関関数値から算定される粒子数の群の中から選択された値であってよい。
　各特性値について、より詳細には、光子数の合計値（総和）は、所定幅の時間区間に於ける光子数の合計値である。発光粒子の信号が存在する時間区間の合計値は、その他の時間区間の合計値よりも発光粒子からの光子数だけ増大するので、或る時間区間の合計値の大きさが所定の閾値よりも大きいとき、その時間区間に於いて発光粒子の信号が存在すると判定される。
　光子数の中央値、最大値は、それぞれ、所定幅の時間区間に見出される光子数の中央値、最大値である。発光粒子の光が光検出器に到来している期間は、通常のノイズのみが発生する場合より光子数が大きくなるので、発光粒子の信号が存在する時間区間の中央値、最大値も増大する。従って、或る時間区間の中央値又は最大値の大きさが所定の閾値よりも大きいとき、その時間区間に於いて発光粒子の信号が存在すると判定される。
　光子数の平均値は、所定幅の時間区間に於ける光子数の時間平均値である。上記の如く、発光粒子の信号が存在する時間区間の合計値は、その他の時間区間の合計値よりも発光粒子からの光子数だけ増大するので、所定幅の時間区間に於ける光子数の時間平均値も増大する。従って、或る時間区間の平均値の大きさが所定の閾値よりも大きいとき、その時間区間に於いて発光粒子の信号が存在すると判定される。
　光子数の標準偏差値、分散値及びエントロピー値は、それぞれ、所定幅の時間区間に於ける光子数の時間平均に於ける標準偏差値、分散値及び情報量のエントロピー値であり、所定幅の時間区間内に見出される光子数の時間変化のばらつきの程度を表す特性値である。或る時間区間に発光粒子の信号が存在する場合、その他の時間区間に比して、光子数の時間変化が激しくなる。従って、発光粒子の信号が存在する時間区間の光子数の標準偏差値、分散値、エントロピー値は、その他の時間区間の各値に比して増大するので、或る時間区間の各値が、所定の閾値よりも大きいとき、その時間区間に於いて発光粒子の信号が存在すると判定される。なお、光子数のエントロピー値は、或る時点（ＢＩＮ　ＴＩＭＥ）に於ける光子数がｘ個である確率がpｘであったとき、或る時間区間に於いて光子数がｘ個の時点の数ixを用いて、
　　－ｌｏｇ２（p0i0・p1i1・…・pxix・…・pnin）　　　…（４）
により与えられる値である。通常、光子数がｘ個である確率pｘは、p0＞p1＞p2＞…＞px…＞pnである。ノイズのみしか存在していない区間のエントロピー値は、－ｌｏｇ２（p0i0・p1i1・p2i2）程度であるが、発光粒子の信号が存在する区間では、－ｌｏｇ２（p0i0・p1i1・p2i2・p3i3・p4i4）などとなり、値が増大する。
　所定幅の時間区間に於ける相関時間を０とした光子数の自己相関関数値から算定される粒子数とは、その時間区間に於ける粒子数に相当する量である。ＦＣＳの理論によれば、光強度の自己相関関数Ｃ（τ）は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
 により与えられる（ここで、τＤは、並進拡散時間であり、ＡＲは、ストラクチャ・パラメータであり、Ｎは、粒子数である。）。上記の式に於いて、相関時間τ＝０のときのＣ（０）から、粒子数Ｎは、１／（Ｃ（０）－１）により与えられる。この粒子数は、時間区間毎に見出される粒子数であると考えられるので、上記の特性値と同様に、所定の閾値よりも大きいとき、その時間区間に於いて発光粒子の信号が存在すると判定される。
　かくして、時系列光強度データ上の各時間区間に於いて、上記のいずれかの特性値を算定し、所定の閾値を越える特性値を有する時間区間を発光粒子の信号の存在する領域として選択し、所定の閾値を下回る特性値を有する時間区間を発光粒子の信号の存在しない領域として特定して除去し、図２（Ｃ）下段に例示の如く、ダイジェスト化光強度データが調製される。
（ｂ）発光粒子の信号の個別検出（図３（Ａ）ステップ３０、図３（Ｃ）参照）
　上記の処理にてダイジェスト化光強度データが調製されると、かかる光強度データ上にて、発光粒子の信号を個別に検出する処理が実行される。既に触れた如く、一つの発光粒子の光検出領域を通過する際の軌跡が、図４（Ｂ）に示されている如く略直線状である場合、その粒子に対応する信号に於ける光強度データ上での光強度の変化は、光学系により決定される光検出領域内の光強度分布を反映した略釣鐘状のプロファイルを有する。従って、走査分子計数法では、基本的には、光強度データ上で、適宜設定される閾値Ｉｔｈを超える光強度値が継続する時間幅Δτが所定の範囲にあるとき、その光強度のプロファイルを有する信号が一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されるようになっていてよい。そして、光強度が閾値Ｉｔｈを超えないか、時間幅Δτが所定の範囲にない信号は、ノイズ又は異物の信号として判定される。また、光検出領域の光強度分布が、ガウス分布：
　　Ｉ＝Ａ・ｅｘｐ（－２ｔ２／ａ２）　　　…（６）
であると仮定できるときには、有意な光強度のプロファイル（バックグラウンドでないと明らかに判断できるプロファイル）に対して式（６）をフィッティングして算出された強度Ａ及び幅ａが所定の範囲内にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されてよい。（強度Ａ及び幅ａが所定の範囲外にある信号は、ノイズ又は異物の信号として判定され、その後の分析等に於いて無視されてよい。）
　光強度データ上の信号の検出の処理の一つの例に於いては、まず、光強度データ（図４（Ｃ）、最上段「検出結果（未処理）」）に対して、スムージング（平滑化）処理が為される（図３（Ｃ）－ステップ１１０、図４（Ｃ）中上段「スムージング」）。発光粒子の発する光は確率的に放出されるものであり、微小な時間に於いてデータ値の欠落が生じ得るため、かかるスムージング処理によって、前記の如きデータ値の欠落を無視できることとなる。スムージング処理は、例えば、移動平均法により為されてよい。なお、スムージング処理を実行する際のパラメータ、例えば、移動平均法に於いて一度に平均するデータ点数や移動平均の回数など、は、光強度データ取得時の光検出領域の位置の移動速度（走査速度）、ＢＩＮ　ＴＩＭＥに応じて適宜設定されてよい。
　次いで、スムージング処理後の光強度データに於いて、有意なパルス状の信号（以下、「パルス信号」と称する。）が存在する時間領域（パルス存在領域）を検出するために、スムージング処理後の光強度データの時間についての一次微分値が演算される（ステップ１２０）。光強度データの時間微分値は、図４（Ｃ）中下段「時間微分」に例示されている如く、信号値の変化時点に於ける値の変化が大きくなるので、かかる時間微分値を参照することによって、有意な信号の始点と終点を有利に決定することができる。
　しかる後、光強度データ上に於いて、逐次的に、有意なパルス信号が検出される（ステップ１３０～１６０）。具体的には、まず、光強度データの時間微分値データ上にて、逐次的に時間微分値を参照して、一つのパルス信号の始点と終点とが探索され決定され、パルス存在領域が特定される（ステップ１３０）。一つのパルス存在領域が特定されると、そのパルス存在領域に於けるスムージングされた光強度データに対して、釣鐘型関数のフィッティングが行われ（図４（Ｃ）下段「釣鐘型関数フィッティング」）、釣鐘型関数のパルスのピーク（最大値）の強度Ｉpeak、パルス幅（半値全幅）Ｗpeak、フィッティングに於ける（最小二乗法の）相関係数等のパラメータが算出される（ステップ１４０）。なお、フィッティングされる釣鐘型関数は、典型的には、ガウス関数であるが、ローレンツ型関数であってもよい。そして、算出された釣鐘型関数のパラメータが、一つの発光粒子が光検出領域を通過したときに検出されるパルス信号が描く釣鐘型のプロファイルのパラメータについて想定される範囲内にあるか否か、即ち、パルスのピーク強度、パルス幅、相関係数が、それぞれ、所定範囲内にあるか否か等が判定される（ステップ１５０）。かくして、図５左に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが一つの発光粒子に対応する信号に於いて想定される範囲内にあると判定された信号は、一つの発光粒子に対応する信号であると判定され、これにより、一つの発光粒子が検出されたこととなる。一方、図５右に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが想定される範囲内になかったパルス信号は、ノイズとして無視される。なお、発光粒子の信号の検出と同時に信号数のカウンティング、即ち、発光粒子のカウンティングが実行されてよい。
　上記のステップ１３０～１５０の処理に於けるパルス信号の探索及び判定は、光強度データの全域に渡って繰り返し実行されてよい（ステップ１６０）。なお、光強度データから発光粒子の信号を個別に検出する処理は、上記の手順に限らず、任意の手法により実行されてよい。
（ii）発光粒子の信号の検出の後にダイジェスト化処理を行う場合
　図３（Ｂ）に示されている如く、発光粒子の信号の検出処理（ステップ２０）の後にダイジェスト化処理（ステップ３０）を実行する場合、まず、ステップ１０にて得られた時系列光強度データに於いて、そのまま、例えば、式（６）のフィッティング又は図３（Ｃ）に示された処理に従って、上記と同様に、発光粒子の信号の検出が実行される。その際、発光粒子の信号の検出と同時に信号数のカウンティング、即ち、発光粒子のカウンティングが実行されてよい。しかる後、時系列光強度データに於いて発光粒子の信号の存在する所定幅の時間区間に対応する領域が選択され、図２（Ｄ）に模式的に描かれている如く、発光粒子の信号の存在しない時間区間が除去されて、ダイジェスト化光強度データが調製される。
（iii）発光粒子濃度の決定
　検出された発光粒子の信号の数を計数して、発光粒子の数の決定が為されている場合、任意の手法にて、光検出領域の通過した領域の総体積が算定されれば、その体積値と発光粒子の数とから試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度が決定される（ステップ４０）。
　光検出領域の通過した領域の総体積は、励起光又は検出光の波長、レンズの開口数、光学系の調整状態に基づいて理論的に算定されてもよいが、実験的に、例えば、発光粒子の濃度が既知の溶液（対照溶液）について、検査されるべき試料溶液の測定と同様の条件にて、上記に説明した光強度の測定、発光粒子の検出及びカウンティングを行うことにより検出された発光粒子の数と、対照溶液の発光粒子の濃度とから決定されるようになっていてよい。具体的には、例えば、発光粒子の濃度Ｃの対照溶液について、対照溶液の発光粒子の検出数がＮであったとすると、光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔは、
　　　Ｖｔ＝Ｎ／Ｃ　　　…（６）
により与えられる。また、対照溶液として、発光粒子の複数の異なる濃度の溶液が準備され、それぞれについて測定が実行されて、算出されたＶｔの平均値が光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔとして採用されるようになっていてよい。そして、Ｖｔが与えられると、発光粒子のカウンティング結果がｎの試料溶液の発光粒子の濃度ｃは、
　　　ｃ＝ｎ／Ｖｔ　　　…（７）
により与えられる。なお、光検出領域の体積、光検出領域の通過した領域の総体積は、上記の方法によらず、任意の方法にて、例えば、ＦＣＳ、ＦＩＤＡを利用するなどして与えられるようになっていてよい。また、本実施形態の光分析装置に於いては、想定される光検出領域の移動パターンについて、種々の標準的な発光粒子についての濃度Ｃと発光粒子の数Ｎとの関係（式（６））の情報をコンピュータ１８の記憶装置に予め記憶しておき、装置の使用者が光分析を実施する際に適宜記憶された関係の情報を利用できるようになっていてよい。
（iv）データの保存・表示・読込
　本発明に於いては、上記の如く、時系列光強度データから、発光粒子の信号の存在しない領域を除去したダイジェスト化光強度データが調製されることから、好適には、コンピュータ１８の記憶装置（図示せず）に於いて、データの保存を行う場合には、ダイジェスト化光強度データが保存される。後の実施例に於いて示される如く、ダイジェスト化光強度データの大きさは、前記の所定幅の時間区間を適当に設定することによって、時系列光強度データの大きさに比して大幅に低減されるので、記憶装置に於ける記憶領域が大幅に節約できることとなる。また、ダイジェスト化光強度データは、コンピュータ１８の表示装置に表示されるようになっていてよい。更に、光強度の測定後、時間を空けて、測定結果の種々の分析・表示をする際に、記憶装置に保存されたダイジェスト化光強度データが読み出されるようになっていてよい。その場合、時系列光強度データの場合よりも、短時間で、データの表示・読込が完了できることとなる。
　かくして、上記の本発明によれば、走査分子計数法に於いて、時系列光強度データに於いて、発光粒子の信号の存在しない領域を除去したダイジェスト化光強度データを調製し、かかるダイジェスト化光強度データを、保存、表示、分析の対象となるデータとして用いることにより、記憶領域の節約、種々のデータ処理に於ける処理の負荷、処理時間の低減が図られることとなる。
　上記に説明した本発明の有効性を検証するために、以下の如き実験を行った。なお、以下の実施例は、本発明の有効性を例示するものであって、本発明の範囲を限定するものではないことは理解されるべきである。
　走査分子計数法による光測定により得られた時系列光強度データから、上記に述べた手法に従って、発光粒子の信号の存在しない領域を除去したダイジェスト化光強度データを調製し、ダイジェスト化光強度データに於いて発光粒子の信号の検出を実行した場合の検出精度の影響、ダイジェスト化によって低減されるデータ量の大きさについて検証した。
　試料溶液として、リン酸緩衝液（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０を含む）中に、発光粒子として蛍光色素ＡＴＴＯ６３３(Sigma-Aldrich,　Cat.　No.　18620)を１０ｐＭにて含む溶液を調製した。光の測定に於いては、光分析装置として、共焦点蛍光顕微鏡の光学系とフォトンカウンティングシステムを備えた１分子蛍光測定装置ＭＦ２０（オリンパス株式会社）を用い、上記の「（２）試料溶液の光強度の測定」にて説明した態様に従って、上記の試料溶液について、時系列光強度データ（フォトンカウントデータ）を取得した。その際、励起光は、６３３ｎｍのレーザー光を用い、バンドパスフィルターを用いて、６６０－７１０ｎｍの波長帯域の光を測定し、時系列光強度データを生成した。試料溶液中に於ける光検出領域の位置の移動速度は、３０ｍｍ／秒とし、ＢＩＮ　ＴＩＭＥを１０μ秒とし、２秒間の測定を行った。この場合、時系列光強度データのレコード数（データ点の数）は、２０万レコード（２／１０×１０－６）となり、概ねデータ量は、約１ＭＢとなった。
　図６（Ａ）は、光検出器にて得られた出力を時系列にデータ化した時系列光強度データの一部を示している。同図に於いて、上段は、測定の開始後から５００００μ秒までの１０μ秒毎のフォトンカウント値であり、下段は、測定の開始後から５０００μ秒までの１０μ秒毎のフォトンカウント値を拡大して示している。同図を参照して、本実験の条件に於いては、発光粒子の信号は、フォトンカウント値が１（図中、丸点線）を超えるパルス状の信号であることが分かっている。従って、上段の図から理解される如く、時系列光強度データのうち、実際に発光粒子の信号の出現する領域は、一部であり、それ以外の領域は、不用な領域である。例えば、図６（Ａ）の下段に示した拡大図では、全域に亘ってフォトンカウント値が１を下回っているので、発光粒子の信号の検出に於いて不用な領域である。
　そこで、上記のダイジェスト化処理［（ｉ）発光粒子の信号の検出の前にダイジェスト化処理を行う場合］に於いて記載した要領にて、時系列光強度データのダイジェスト化を行った。具体的には、時系列光強度データを２００μ秒の時間区間に分割し、それぞれの時間区間毎に、光強度の特性値として、光子数の総和を算定した。次いで、光子数の総和が５（特性値の閾値）を超える時間区間に対応する領域を選択し、それ以外の時間区間に対応する領域を削除したダイジェスト化光強度データを調製した。図６（Ｂ）の上段は、図６（Ａ）の時系列光強度データをダイジェスト化して得られたダイジェスト化光強度データ（初めから５０００レコード目まで）を示しており、図６（Ｂ）の下段は、上段の拡大図（初めから５００レコード目まで）を示している。図から理解される如く、ダイジェスト化光強度データに於いては、発光粒子の信号の検出のための閾値である１を下回る領域が低減され、従って、発光粒子の信号の検出に於いて不用な領域が低減された。
　上記の如くダイジェスト化処理を行って得られたダイジェスト化光強度データを用いて発光粒子の信号の検出を行う場合、発光粒子の信号の検出の精度の低下、即ち、検出できない発光粒子の信号の数が増大することが考えられる。そこで、ダイジェスト化処理に於ける時系列光強度データを分割する際の時間区間の所定幅と特性値のための閾値の発光粒子の信号の検出の精度に対する影響を確認した。
　具体的には、時系列光強度データの分割に於ける時間区間の所定幅を、２００μ秒、３００μ秒、５００μ秒、１０００μ秒に設定した場合の各々に於いて、特性値の閾値を０～２０に設定してダイジェスト化処理を行って得られたダイジェスト化光強度データの各々を用いて、発光粒子の信号の個別検出と信号数のカウンティングを行った。発光粒子の信号の検出は、「（ｂ）発光粒子の信号の個別検出」及び図３（Ｃ）に記載された要領に従って、ダイジェスト化光強度データにスムージング処理を施し、スムージングされたデータに於いて、パルス信号の始点及び終点を決定した後、各パルス信号にガウス関数を最小自乗法によりフィッティングして、（ガウス関数に於ける）ピーク強度、パルス幅（半値全幅）、相関係数を決定した。そして、下記の条件:
　　　２０μ秒＜パルス幅＜４００μ秒
　　　ピーク強度＞１［ｐｃ／１０μｓ］　　　　…（Ａ）
　　　相関係数＞０．９５
を満たすパルス信号のみを発光粒子の信号として抽出した。また、これと共に、時系列光強度データの大きさに対するダイジェスト化光強度データの大きさの割合（データ圧縮率）についても確認した。
　下記の表１は、時系列光強度データの分割に於ける時間区間の所定幅（Window　Size）を２００μ秒～１０００μ秒とし、特性値のための閾値（光子数閾値）を５～２０とした場合のそれぞれについての、検出された発光粒子の信号の数（パルス数）とデータ圧縮率とを示している。なお、光子数閾値＝０のときは、領域の除去を行わない場合である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　上記の表を参照して、所定幅が小さいほど、データ圧縮率が小さくなる、即ち、データ量をより低減できることが示され、本実験例の場合には、所定幅は２００μ秒が最適であった。（本実験例の条件に於いて、発光粒子の光検出領域の通過時間は、約７４μ秒であるので、所定幅が２００μ秒を下回ると、一つの発光粒子の信号が異なる時間区間に亘って出現する可能性が高くなり好ましくないと考えられる。）また、いずれの所定幅の場合も、特性値の閾値（光子数閾値）を増大すると、検出される発光粒子の信号数が低減した。このことは、特性値の閾値は、適切な値に設定すれば、検出される発光粒子の信号数の低減量が許容できる程度に抑えられることを示している。
　図７は、上記の表１の所定幅が２００μ秒に設定した場合の特性値の閾値に対する発光粒子の信号の検出数（パルス数）とデータ圧縮率とをそれぞれグラフの型式で表したものである。同図を参照して、閾値を５に設定した際に、データ圧縮率は、１２％程度まで小さくなったが、発光粒子の信号の検出数の低減量は、殆ど見られなかった。一方、閾値を１０以上に設定したときには、データ量は、若干低減する傾向があるが概ね飽和した状態となる一方、発光粒子の信号の検出数は大幅に低減した。このことは、ダイジェスト化処理によって、発光粒子の存在する領域の一部も除去されてしまっていることを示唆する。かくして、本実験例の条件の場合は、時系列光強度データを、所定幅を２００μ秒に設定した時間区間に分割し、特性値の閾値を５に設定することにより、最適な状態にてダイジェスト化処理が実行できることを示している。また、ダイジェスト化処理によって、発光粒子の信号の検出の精度の低下をできるだけ抑えて、データ量を低減することが可能であることが示された。
　走査分子計数法による光測定により得られた時系列光強度データに於いて、発光粒子の信号の個別検出を行った後に、ダイジェスト化処理を行って、ダイジェスト化光強度データを調製した。時系列光強度データは、実施例１と同じデータを用い、発光粒子の信号の個別検出は、実施例１と同様に実行した。しかる後、時系列光強度データを所定幅の時間区間に分割し、発光粒子の信号の存在しない領域を除去した。なお、本実施例では、時系列光強度データ上にて発光粒子の信号の検出を行っているので、発光粒子の信号の検出の精度の低下は生じない。
　図８は、時間区間の所定幅（ウィンドウサイズ）を変更した場合のデータ圧縮率の変化を示している。同図を参照して、所定幅が小さいほど、データ量は小さくなり、所定幅２００μ秒の場合に、データ圧縮率は、７．８％となった。
　かくして、上記の実施例の結果から理解される如く、本発明の教示に従って、走査分子計数法に於いて取得された時系列光強度データから発光粒子の信号の存在しない領域を除去することにより、発光粒子の信号の検出の精度の低下を抑えながら、データ量の低減が可能となる。これにより、記憶装置の記憶容量の節約、データ処理の負荷及び処理時間の低減が図られ、走査分子計数法の利用範囲の拡大が期待される。

Claims (30)

  1. 　共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析装置であって、
    　前記試料溶液内に於ける前記光学系の光検出領域の位置を移動する光検出領域移動部と、
    　前記光検出領域からの光を検出する光検出部と、
    　前記試料溶液内に於いて前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出部にて検出された前記光検出領域からの光の時系列の光強度データを生成し、前記時系列の光強度データに於いて前記発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出する信号処理部とを含み、
    　前記信号処理部が、前記時系列の光強度データに於ける前記発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない領域を前記時系列の光強度データから除去することを特徴とする装置。
  2. 　請求項１の装置であって、前記信号処理部が、前記時系列の光強度データに於いて所定幅の時間区間毎に発光粒子からの光の有無を表す光強度の特性値を算出し、前記特性値を用いて前記発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない時間区間を決定し、前記発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない時間区間に対応する領域を前記時系列の光強度データから除去することを特徴とする装置。
  3. 　請求項１又は２の装置であって、前記信号処理部が、前記時系列の光強度データに於ける前記発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない領域を前記時系列の光強度データから除去することにより得られた光強度データ上にて前記発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出することを特徴とする装置。
  4. 　請求項１乃至３のいずれかの装置であって、前記信号処理部が、前記時系列の光強度データに於ける前記発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない領域を前記時系列の光強度データから除去することにより得られた光強度データを記憶装置に保存することを特徴とする装置。
  5. 　請求項１乃至４のいずれかの装置であって、前記信号処理部が、所定の閾値より大きい強度を有する光を表す信号が検出されたときに１つの発光粒子が前記光検出領域に入ったことを検出することを特徴とする装置。
  6. 　請求項１乃至５のいずれかの装置であって、前記光検出領域移動部が前記発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて前記光検出領域の位置を移動することを特徴とする装置。
  7. 　請求項１乃至６のいずれかの装置であって、前記光検出領域移動部が前記光学系の光路を変更することにより前記試料溶液内に於いて前記光学系の光検出領域の位置を移動することを特徴とする装置。
  8. 　請求項１乃至７のいずれかの装置であって、前記信号処理部が前記検出された発光粒子の数に基づいて、前記試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度を決定することを特徴とする装置。
  9. 　請求項２のいずれかの装置であって、前記光検出部がフォトンカウンティングにより前記光検出領域からの光を検出し、前記時系列の光強度データが時系列のフォトンカウントデータであることを特徴とする装置。
  10. 　請求項９の装置であって、前記光強度の特性値が、前記所定幅の時間区間に於ける光子数の合計値、光子数の中央値、光子数の平均値、光子数の標準偏差、光子数の分散、光子数のエントロピー、光子数の最大値及び相関時間を０とした光子数の自己相関関数値から算定される粒子数の群の中から選択された値であることを特徴とする装置。
  11. 　共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析方法であって、
    　前記試料溶液内に於ける前記光学系の光検出領域の位置を移動する過程と、
    　前記試料溶液内に於ける前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する過程と、
    　前記時系列の光強度データに於ける個々の発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出する過程と
    を含む方法にして、
    　前記時系列の光強度データに於ける前記発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない領域を前記時系列の光強度データから除去する過程を含むことを特徴とする方法。
  12. 　請求項１１の方法であって、前記時系列の光強度データに於ける前記発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない領域を前記時系列の光強度データから除去する過程に於いて、前記時系列の光強度データに於いて所定幅の時間区間毎に発光粒子からの光の有無を表す光強度の特性値を算出し、前記特性値を用いて前記発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない時間区間を決定し、前記発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない時間区間に対応する領域を前記時系列の光強度データから除去することを特徴とする方法。
  13. 　請求項１１又は１２の方法であって、前記時系列の光強度データに於ける個々の発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出する過程に於いて、前記時系列の光強度データに於ける前記発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない領域を前記時系列の光強度データから除去することにより得られた光強度データ上にて前記発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出することを特徴とする方法。
  14. 　請求項１１乃至１３のいずれかの方法であって、更に、前記時系列の光強度データに於ける前記発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない領域を前記時系列の光強度データから除去することにより得られた光強度データを記憶装置に保存する過程を含むことを特徴とする方法。
  15. 　請求項１１乃至１４のいずれかの方法であって、前記個々の発光粒子からの光を表す信号を個別に検出する過程に於いて、所定の閾値より大きい強度を有する光を表す信号が検出されたときに１つの発光粒子が前記光検出領域に入ったことを検出することを特徴とする方法。
  16. 　請求項１１乃至１５のいずれかの方法であって、前記光検出領域の位置を移動する過程に於いて、前記光検出領域の位置が前記発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動されることを特徴とする方法。
  17. 　請求項１１乃至１６のいずれかの方法であって、前記光検出領域の位置を移動する過程に於いて、前記光学系の光路を変更することにより前記試料溶液内に於いて前記光学系の光検出領域の位置を移動することを特徴とする方法。
  18. 　請求項１１乃至１７のいずれかの方法であって、更に、前記検出された発光粒子の数に基づいて、前記試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度を決定する過程を含むことを特徴とする方法。
  19. 　請求項１１乃至１８のいずれかの方法であって、前記光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する過程に於いて、前記光検出領域からの光がフォトンカウンティングにより検出され、前記時系列の光強度データが時系列のフォトンカウントデータであることを特徴とする方法。
  20. 　請求項１９の方法であって、前記光強度の特性値が、前記所定幅の時間区間に於ける光子数の合計値、光子数の中央値、光子数の標準偏差、光子数の分散、光子数のエントロピー、光子数の最大値及び相関時間を０とした光子数の自己相関関数値から算定される粒子数の群の中から選択された値であることを特徴とする方法。
  21. 　共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出するための光分析用コンピュータプログラムであって、
    　前記試料溶液内に於ける前記光学系の光検出領域の位置を移動する手順と、
    　前記試料溶液内に於ける前記光検出領域の位置の移動中に前記光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する手順と、
    　前記時系列の光強度データに於ける個々の発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出する手順と
    をコンピュータに実行させるコンピュータプログラムにして、
    　前記時系列の光強度データに於ける前記発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない領域を前記時系列の光強度データから除去する手順を含むことを特徴とするコンピュータプログラム。
  22. 　請求項２１のコンピュータプログラムであって、前記時系列の光強度データに於ける前記発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない領域を前記時系列の光強度データから除去する手順に於いて、前記時系列の光強度データに於いて所定幅の時間区間毎に発光粒子からの光の有無を表す光強度の特性値を算出し、前記特性値を用いて前記発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない時間区間を決定し、前記発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない時間区間に対応する領域を前記時系列の光強度データから除去することを特徴とするコンピュータプログラム。
  23. 　請求項２１又は２２のコンピュータプログラムであって、前記時系列の光強度データに於ける個々の発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出する手順に於いて、前記時系列の光強度データに於ける前記発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない領域を前記時系列の光強度データから除去することにより得られた光強度データ上にて前記発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出することを特徴とするコンピュータプログラム。
  24. 　請求項２１乃至２３いずれかのコンピュータプログラムであって、更に、前記時系列の光強度データに於ける前記発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない領域を前記時系列の光強度データから除去することにより得られた光強度データを記憶装置に保存する手順をコンピュータに実行させることを特徴とするコンピュータプログラム。
  25. 　請求項２１乃至２４のいずれかのコンピュータプログラムであって、個々の発光粒子からの光を表す信号を個別に検出する手順に於いて、所定の閾値より大きい強度を有する光を表す信号が検出されたときに１つの発光粒子が前記光検出領域に入ったことを検出することを特徴とするコンピュータプログラム。
  26. 　請求項２１乃至２５のいずれかのコンピュータプログラムであって、前記試料溶液内に於ける前記光学系の光検出領域の位置を移動する手順に於いて、前記光検出領域の位置が前記発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動されることを特徴とするコンピュータプログラム。
  27. 　請求項２１乃至２６のいずれかのコンピュータプログラムであって、前記試料溶液内に於ける前記光学系の光検出領域の位置を移動する手順に於いて、前記光学系の光路を変更することにより前記試料溶液内に於いて前記光学系の光検出領域の位置を移動することを特徴とするコンピュータプログラム。
  28. 　請求項２１乃至２７のいずれかのコンピュータプログラムであって、更に、前記検出された発光粒子の数に基づいて、前記試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度を決定する手順を含むことを特徴とするコンピュータプログラム。
  29. 　請求項２１乃至２８のいずれかの１８のコンピュータプログラムであって、前記光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する手順に於いて、前記光検出領域からの光がフォトンカウンティングにより検出され、前記時系列の光強度データが時系列のフォトンカウントデータであることを特徴とするコンピュータプログラム。
  30. 　請求項２９のコンピュータプログラムであって、前記光強度の特性値が、前記所定幅の時間区間に於ける光子数の合計値、光子数の中央値、光子数の標準偏差、光子数の分散、光子数のエントロピー、光子数の最大値及び相関時間を０とした光子数の自己相関関数値から算定される粒子数の群の中から選択された値であることを特徴とするコンピュータプログラム。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20180067035A1 (en) * 2013-03-15 2018-03-08 Sony Corporation Fine particle analyzing apparatus, fine particle analyzing method, program, and fine particle analyzing system

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012099234A1 (ja) 2011-01-20 2012-07-26 オリンパス株式会社 単一発光粒子からの光の検出を用いた光分析方法及び光分析装置
EP2746748B1 (en) * 2011-08-15 2017-12-06 Olympus Corporation Photometric analysis device using single light emitting particle detection, photometric analysis method and computer program for photometric analysis,
JP6010033B2 (ja) * 2011-08-26 2016-10-19 オリンパス株式会社 光分析を用いた単一粒子検出装置、単一粒子検出方法及び単一粒子検出用コンピュータプログラム
CN103765196B (zh) 2011-08-26 2016-03-02 奥林巴斯株式会社 利用单个发光粒子检测的光分析装置及光分析方法
JP6010035B2 (ja) * 2011-08-30 2016-10-19 オリンパス株式会社 単一発光粒子検出を用いた光分析装置、光分析方法及び光分析用コンピュータプログラム
EP2816344A4 (en) 2012-02-17 2015-09-23 Olympus Corp OPTICAL ANALYSIS DEVICE USING SINGLE PARTICLE DETECTION TECHNIQUE, OPTICAL ANALYSIS METHOD, AND COMPUTER PROGRAM FOR OPTICAL ANALYSIS
CN104246479B (zh) 2012-04-18 2016-10-19 奥林巴斯株式会社 利用光分析的单个粒子检测装置、单个粒子检测方法以及单个粒子检测用计算机程序
WO2013157283A1 (ja) 2012-04-18 2013-10-24 オリンパス株式会社 標的粒子の検出方法
EP3059577A4 (en) * 2013-10-07 2017-05-31 Olympus Corporation Photometric analysis device employing single light-emitting particle detection, photometric analysis method, and computer program for photometric analysis
JPWO2017098597A1 (ja) 2015-12-09 2018-10-11 オリンパス株式会社 単一発光粒子検出を用いた光分析方法及び光分析装置
CN106198505A (zh) * 2016-08-31 2016-12-07 四川迈克生物医疗电子有限公司 样本检测装置和体外诊断设备
WO2018089629A1 (en) 2016-11-11 2018-05-17 Carrier Corporation High sensitivity fiber optic based detection
EP4300457A3 (en) 2016-11-11 2024-03-13 Carrier Corporation High sensitivity fiber optic based detection
ES2919300T3 (es) 2016-11-11 2022-07-22 Carrier Corp Detección basada en fibra óptica de alta sensibilidad
EP3539108B1 (en) 2016-11-11 2020-08-12 Carrier Corporation High sensitivity fiber optic based detection
WO2018089660A1 (en) * 2016-11-11 2018-05-17 Carrier Corporation High sensitivity fiber optic based detection
CN112424587A (zh) * 2018-06-15 2021-02-26 宽腾矽公司 用于具有脉冲光源的先进分析仪器的数据采集控制
CN111693469B (zh) * 2020-04-30 2023-03-14 新绎健康科技有限公司 一种测试光路系统稳定性的方法及系统
DE102020127071B3 (de) 2020-10-14 2021-06-17 Abberior Instruments Gmbh Verfahren und Mikroskop mit einer Einrichtung zum Erfassen von Verlagerungen einer Probe gegenüber einem Objektiv

Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH04337446A (ja) 1991-05-15 1992-11-25 Hitachi Ltd 微粒子計測方法、定量方法および微粒子計測装置
JP2005098876A (ja) 2003-09-25 2005-04-14 Institute Of Physical & Chemical Research ２成分相互作用分析方法
JP2007020565A (ja) 2005-06-13 2007-02-01 Kansai Bunri Sogo Gakuen 試料中のウイルスを検出する方法およびシステム
JP4023523B2 (ja) 1996-10-12 2007-12-19 オリンパス株式会社 比明度関数の決定によるサンプルの分析方法
JP2008116440A (ja) 2006-10-13 2008-05-22 Shiga Pref Gov 試料中の蛍光性物質を検出する方法およびシステム
WO2008080417A1 (en) 2006-12-28 2008-07-10 Flult Biosystems Gmbh A method of determining characteristic properties of a sample containing particles
JP2008292371A (ja) 2007-05-25 2008-12-04 Institute Of Physical & Chemical Research 蛍光相関分光による複数成分相互作用の分析方法及び相互作用制御化合物のスクリーニング方法
JP2009281831A (ja) 2008-05-21 2009-12-03 Hamamatsu Photonics Kk 蛍光解析装置及び解析方法
JP2010190730A (ja) * 2009-02-18 2010-09-02 Olympus Corp 相関分光分析方法及び相関分光分析装置
JP2011002415A (ja) * 2009-06-22 2011-01-06 Olympus Corp 蛍光相関分光装置
JP2011508219A (ja) * 2007-12-19 2011-03-10 シンギュレックス・インコーポレイテッド 単一分子検出走査分析器およびその使用方法
WO2011108369A1 (ja) * 2010-03-01 2011-09-09 オリンパス株式会社 光分析装置、光分析方法並びに光分析用コンピュータプログラム
WO2012032955A1 (ja) * 2010-09-10 2012-03-15 オリンパス株式会社 複数の波長帯域の光計測を用いた光分析方法

Family Cites Families (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4251733A (en) 1978-06-29 1981-02-17 Hirleman Jr Edwin D Technique for simultaneous particle size and velocity measurement
US4580895A (en) * 1983-10-28 1986-04-08 Dynatech Laboratories, Incorporated Sample-scanning photometer
FI98765C (fi) 1995-01-16 1997-08-11 Erkki Soini Virtaussytometrinen menetelmä ja laite
US5866336A (en) 1996-07-16 1999-02-02 Oncor, Inc. Nucleic acid amplification oligonucleotides with molecular energy transfer labels and methods based thereon
JP3270722B2 (ja) * 1996-09-27 2002-04-02 オルガノ株式会社 細菌の検出方法及び検出装置
US6235471B1 (en) 1997-04-04 2001-05-22 Caliper Technologies Corp. Closed-loop biochemical analyzers
US6710871B1 (en) 1997-06-09 2004-03-23 Guava Technologies, Inc. Method and apparatus for detecting microparticles in fluid samples
GB2326229A (en) 1997-06-13 1998-12-16 Robert Jeffrey Geddes Carr Detecting and analysing submicron particles
SE9800360D0 (sv) 1998-02-06 1998-02-06 Goeteborg University Science I Method, apparatus and flow cell for high sensitivity detection of fluorescent molecules
KR100618502B1 (ko) 1998-03-16 2006-09-01 지이 헬스케어 바이오-사이언시즈 코프. 공초점 마이크로스코피 영상 시스템에서 사용하기 위한 전자기 방출의 집속 시스템 및 방법
US20030036855A1 (en) 1998-03-16 2003-02-20 Praelux Incorporated, A Corporation Of New Jersey Method and apparatus for screening chemical compounds
US6388788B1 (en) 1998-03-16 2002-05-14 Praelux, Inc. Method and apparatus for screening chemical compounds
US6320196B1 (en) * 1999-01-28 2001-11-20 Agilent Technologies, Inc. Multichannel high dynamic range scanner
US6376843B1 (en) 1999-06-23 2002-04-23 Evotec Oai Ag Method of characterizing fluorescent molecules or other particles using generating functions
DE60001731T2 (de) 1999-04-29 2004-02-05 Evotec Oai Ag Verfahren zur erfassung von fluoreszierenden molekülen oder anderen teilchen mittels erzeugenden funktionen
US8264680B2 (en) 1999-05-28 2012-09-11 Yokogawa Electric Corporation Biochip reader and electrophoresis system
US6965113B2 (en) 2000-02-10 2005-11-15 Evotec Ag Fluorescence intensity multiple distributions analysis: concurrent determination of diffusion times and molecular brightness
US20010035954A1 (en) 2000-03-10 2001-11-01 Rahn John Richard Method and apparatus for measuring particle size distributions using light scattering
DE10035190C5 (de) 2000-07-20 2009-07-16 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Verfahren und Vorrichtung zur Fluoreszenzmessung
DE10038528A1 (de) 2000-08-08 2002-02-21 Zeiss Carl Jena Gmbh Verfahren und Anordnung zur Erhöhung der spektralen und räumlichen Detektorauflösung
US6947133B2 (en) 2000-08-08 2005-09-20 Carl Zeiss Jena Gmbh Method for increasing the spectral and spatial resolution of detectors
WO2002020010A1 (en) * 2000-09-08 2002-03-14 Zeria Pharmaceutical Co., Ltd. Pharmaceutical compositions containing aminothiazole derivatives for the treatment of colonic motor dysfunctions
AU2002230592A1 (en) * 2000-10-27 2002-05-06 Molecular Devices Corporation Light detection device
HU226937B1 (en) 2000-11-17 2010-03-29 Mta Szegedi Biolog Koezpont Method and apparatus for determining polarization amount of material by a laser scanning microscope
WO2002048693A1 (fr) 2000-12-14 2002-06-20 Olympus Optical Co., Ltd. Analyseur fluorometrique et analyse fluorometrique
US6750963B2 (en) 2002-05-21 2004-06-15 Agilent Technologies, Inc. Imaging systems for signals on a surface
FI112504B (fi) * 2002-08-07 2003-12-15 Cyflo Oy Menetelmä bakteerien tunnistamiseksi
WO2004042404A1 (en) 2002-11-07 2004-05-21 Erasmus Universiteit Rotterdam Fret probes and methods for detecting interacting molecules
JP4315794B2 (ja) 2002-12-27 2009-08-19 オリンパス株式会社 共焦点顕微鏡
US7038848B2 (en) 2002-12-27 2006-05-02 Olympus Corporation Confocal microscope
JP3999701B2 (ja) * 2003-05-30 2007-10-31 オリンパス株式会社 分光分析装置
JP4224640B2 (ja) * 2004-03-29 2009-02-18 オリンパス株式会社 蛍光分光分析装置
US20060078998A1 (en) 2004-09-28 2006-04-13 Singulex, Inc. System and methods for sample analysis
US7528384B2 (en) 2005-01-31 2009-05-05 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Methods and devices for characterizing particles in clear and turbid media
JP4800655B2 (ja) * 2005-04-01 2011-10-26 オリンパス株式会社 光測定装置
EP1906172A4 (en) * 2005-07-15 2014-01-08 Olympus Corp LIGHT METER
WO2007118209A2 (en) * 2006-04-07 2007-10-18 Kim Laboratories Apparatus and method for rapid detection of analytes
US8445655B2 (en) 2006-06-16 2013-05-21 Cornell Research Foundation, Inc. Functional nucleic acid ligands to fluorescent proteins
WO2008007580A1 (fr) 2006-07-13 2008-01-17 Olympus Corporation Procédé d'analyse de particules fines
DE102006033294A1 (de) * 2006-07-17 2008-01-31 Evotec Technologies Gmbh Analyseverfahren für chemische und/oder biologische Proben
US20080052009A1 (en) 2006-08-23 2008-02-28 Washington, University Of Method for deconvolving single-molecule intensity distributions for quantitative biological measurements
GB0618057D0 (en) 2006-09-14 2006-10-25 Perkinelmer Ltd Improvements in and relating to scanning confocal microscopy
JPWO2008099778A1 (ja) 2007-02-14 2010-05-27 株式会社ニコン スリット走査共焦点顕微鏡
JP2009145242A (ja) 2007-12-14 2009-07-02 Olympus Corp 光測定装置
JP2009288161A (ja) 2008-05-30 2009-12-10 Olympus Corp 光測定装置及び光測定方法
JP5590781B2 (ja) 2008-07-10 2014-09-17 オリンパス株式会社 標的核酸比率推定方法
US9896720B2 (en) * 2008-09-10 2018-02-20 Rutgers, The State University Of New Jersey Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes
US20100177190A1 (en) 2008-12-16 2010-07-15 Ann-Shyn Chiang Microscopy system with revolvable stage
US20100251438A1 (en) * 2009-03-25 2010-09-30 The Royal College Of Surgeons In Ireland Microscopy control system and method
JP2010276380A (ja) * 2009-05-26 2010-12-09 Olympus Corp 蛍光相関分光分析装置及び方法並びにそのためのコンピュータプログラム
WO2012014778A1 (ja) 2010-07-26 2012-02-02 オリンパス株式会社 発光プローブを用いて溶液中の希薄粒子を検出する方法
EP2602613B1 (en) * 2010-09-10 2017-02-22 Olympus Corporation Optical analysis method using optical intensity of single light-emitting particle
EP2620762B1 (en) 2010-09-21 2017-02-01 Olympus Corporation Optical analysis method using the detection of a single light-emitting particle

Patent Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH04337446A (ja) 1991-05-15 1992-11-25 Hitachi Ltd 微粒子計測方法、定量方法および微粒子計測装置
JP4023523B2 (ja) 1996-10-12 2007-12-19 オリンパス株式会社 比明度関数の決定によるサンプルの分析方法
JP2005098876A (ja) 2003-09-25 2005-04-14 Institute Of Physical & Chemical Research ２成分相互作用分析方法
JP2007020565A (ja) 2005-06-13 2007-02-01 Kansai Bunri Sogo Gakuen 試料中のウイルスを検出する方法およびシステム
JP2008116440A (ja) 2006-10-13 2008-05-22 Shiga Pref Gov 試料中の蛍光性物質を検出する方法およびシステム
WO2008080417A1 (en) 2006-12-28 2008-07-10 Flult Biosystems Gmbh A method of determining characteristic properties of a sample containing particles
JP2008292371A (ja) 2007-05-25 2008-12-04 Institute Of Physical & Chemical Research 蛍光相関分光による複数成分相互作用の分析方法及び相互作用制御化合物のスクリーニング方法
JP2011508219A (ja) * 2007-12-19 2011-03-10 シンギュレックス・インコーポレイテッド 単一分子検出走査分析器およびその使用方法
JP2009281831A (ja) 2008-05-21 2009-12-03 Hamamatsu Photonics Kk 蛍光解析装置及び解析方法
JP2010190730A (ja) * 2009-02-18 2010-09-02 Olympus Corp 相関分光分析方法及び相関分光分析装置
JP2011002415A (ja) * 2009-06-22 2011-01-06 Olympus Corp 蛍光相関分光装置
WO2011108369A1 (ja) * 2010-03-01 2011-09-09 オリンパス株式会社 光分析装置、光分析方法並びに光分析用コンピュータプログラム
WO2012032955A1 (ja) * 2010-09-10 2012-03-15 オリンパス株式会社 複数の波長帯域の光計測を用いた光分析方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
F.J.MEYER-ALMS: "Fluorescence Correlation Spectroscopy", 2000, SPRINGER, BERLIN, pages: 204 - 224
MASATAKA KANESHIRO, PROTEIN, NUCLEIC ACID, ENZYME, vol. 44, no. 9, 1999, pages 1431 - 1438
NORIKO KATO ET AL., GENE MEDICINE, vol. 6, no. 2, pages 271 - 277
P. KASK; K. PALO; D. ULLMANN; K. GALL, PNAS, vol. 96, 1999, pages 13756 - 13761
See also references of EP2706346A4

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20180067035A1 (en) * 2013-03-15 2018-03-08 Sony Corporation Fine particle analyzing apparatus, fine particle analyzing method, program, and fine particle analyzing system
US10732090B2 (en) * 2013-03-15 2020-08-04 Sony Corporation Fine particle analyzing apparatus, fine particle analyzing method, program, and fine particle analyzing system

Also Published As

Publication number Publication date
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