JPWO2012141019A1 - 単一発光粒子検出を用いた光分析装置、光分析方法及び光分析用コンピュータプログラム - Google Patents

単一発光粒子検出を用いた光分析装置、光分析方法及び光分析用コンピュータプログラム Download PDF

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Abstract

共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡による光計測を用いた走査分子計数法に於いて、光強度データの大きさを低減する構成が提供される。本発明による試料溶液中の発光粒子の光を検出する光分析技術は、試料溶液内に於いて顕微鏡の光検出領域の位置を移動させながら検出された光検出領域からの光の時系列光強度データを生成し、時系列光強度データに於ける発光粒子の信号を個別に検出する。その際、時系列光強度データに於ける発光粒子の光を表す信号の存在していない領域を時系列の光強度データから除去することを特徴とする。

Description

本発明は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いて、溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はこれらの凝集体（以下、これらを「粒子」と称する。）、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の対象物、或いは、非生物学的な粒子からの光を検出して、それらの状態（相互作用、結合・解離状態など）の分析又は解析に於いて有用な情報を取得することが可能な光分析技術に係り、より詳細には、上記の如き光学系を用いて単一の発光する粒子からの光を個別に検出して種々の光分析を可能にする光分析装置、光分析方法並びに光分析用コンピュータプログラムに係る。なお、本明細書に於いて、光を発する粒子（以下、「発光粒子」と称する。）は、それ自身が光を発する粒子、又は、任意の発光標識若しくは発光プローブが付加された粒子のいずれであってもよく、発光粒子から発せられる光は、蛍光、りん光、化学発光、生物発光、散乱光等であってよい。
近年の光計測技術の発展により、共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング（１光子検出）も可能な超高感度の光検出技術とを用いて、一光子又は蛍光一分子レベルの微弱光の検出・測定が可能となっている。そこで、そのような微弱光の計測技術を用いて、生体分子等の特性、分子間相互作用又は結合・解離反応の検出を行う装置又は方法が種々提案されている。例えば、蛍光相関分光分析（Fluorescence Correlation Spectroscopy：ＦＣＳ。例えば、特許文献１−３、非特許文献１−３参照）に於いては、レーザー共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術を用いて、試料溶液中の微小領域（顕微鏡のレーザー光が集光された焦点領域−コンフォーカル・ボリュームと称される。）内に出入りする蛍光分子又は蛍光標識された分子（蛍光分子等）からの蛍光強度の測定が為され、その測定された蛍光強度の自己相関関数の値から決定される微小領域内に於ける蛍光分子等の平均の滞留時間（並進拡散時間）及び滞留する分子の数の平均値に基づいて、蛍光分子等の運動の速さ又は大きさ、濃度といった情報の取得、或いは、分子の構造又は大きさの変化や分子の結合・解離反応又は分散・凝集といった種々の現象の検出が為される。また、蛍光強度分布分析(Fluorescence-Intensity Distribution Analysis：ＦＩＤＡ。例えば、特許文献４、非特許文献４)やフォトンカウンティングヒストグラム（Photon Counting Histogram：ＰＣＨ。例えば、特許文献５）では、ＦＣＳと同様に計測されるコンフォーカル・ボリューム内に出入りする蛍光分子等の蛍光強度のヒストグラムが生成され、そのヒストグラムの分布に対して統計的なモデル式をフィッティングすることにより、蛍光分子等の固有の明るさの平均値とコンフォーカル・ボリューム内に滞留する分子の数の平均値が算定され、これらの情報に基づいて、分子の構造又は大きさの変化、結合・解離状態、分散・凝集状態などが推定されることとなる。またその他に、特許文献６、７に於いては、共焦点顕微鏡の光学系を用いて計測される試料溶液の蛍光信号の時間経過に基づいて蛍光性物質を検出する方法が提案されている。特許文献８は、フローサイトメータに於いて流通させられた蛍光微粒子又は基板上に固定された蛍光微粒子からの微弱光をフォトンカウンティング技術を用いて計測してフロー中又は基板上の蛍光微粒子の存在を検出するための信号演算処理技術を提案している。
特に、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術とを用いた微小領域の蛍光測定技術を用いた方法によれば、測定に必要な試料は、従前に比して極めて低濃度且微量でよく（一回の測定で使用される量は、たかだか数十μＬ程度）、測定時間も大幅に短縮される（一回の測定で秒オーダーの時間の計測が数回繰り返される。）。従って、これらの技術は、特に、医学・生物学の研究開発の分野でしばしば使用される希少な或いは高価な試料についての分析を行う場合や、病気の臨床診断や生理活性物質のスクリーニングなど、検体数が多い場合に、従前の生化学的方法に比して、低廉に、或いは、迅速に実験又は検査が実行できる強力なツールとなることが期待されている。
特開２００５−０９８８７６ 特開２００８−２９２３７１ 特開２００９−２８１８３１ 特許第４０２３５２３号 国際公開２００８−０８０４１７ 特開２００７−２０５６５ 特開２００８−１１６４４０ 特開平４−３３７４４６号公報
金城政孝、蛋白質 核酸 酵素 Vol.４４、No.９、１４３１−１４３８頁 １９９９年 エフ・ジェイ・メイヤー・アルムス（F.J.Meyer-Alms）、フルオレセンス・コリレーション・スペクトロスコピー（Fluorescence Correlation Spectroscopy）、アール・リグラー編（R.Rigler）、スプリンガー（Springer）、ベルリン、２０００年、２０４−２２４頁 加藤則子外４名、遺伝子医学、Vol.６、No.２、２７１−２７７頁 カスク他３名、米国科学アカデミー紀要 １９９９年、９６巻、13756‐13761頁（P. Kask, K. Palo, D. Ullmann, K. Gall PNAS 96, 13756-13761 (1999)）
上記のＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術を用いた光分析技術では、計測される光は、蛍光一分子又は数分子から発せられた光であるが、その光の解析に於いて、時系列に測定された蛍光強度データの自己相関関数の演算又はヒストグラムに対するフィッティングといった蛍光強度のゆらぎの算出等の統計的処理が実行され、個々の蛍光分子等からの光の信号を個別に参照又は分析するわけではない。即ち、これらの光分析技術に於いては、複数の蛍光分子等からの光の信号が統計的に処理され、蛍光分子等について統計平均的な特性が検出されることとなる。従って、これらの光分析技術に於いて統計的に有意な結果を得るためには、試料溶液中の観測対象となる蛍光分子等の濃度又は数密度は、平衡状態に於いて、一回の秒オーダーの長さの計測時間のうちに統計的処理が可能な数の蛍光分子等が微小領域内を入出するレベル、好適には、微小領域内に常に一個程度の蛍光分子等が存在しているレベルである必要がある。実際、コンフォーカル・ボリュームの体積は、１ｆＬ程度となるので、上記の光分析技術に於いて使用される試料溶液中の蛍光分子等の濃度は、典型的には、１ｎＭ程度若しくはそれ以上であり、１ｎＭを大幅に下回るときには、蛍光分子等がコンフォーカル・ボリューム内に存在しない時間が生じて統計的に有意な分析結果が得られないこととなる。一方、特許文献６〜８に記載の蛍光分子等の検出方法では、蛍光強度のゆらぎの統計的演算処理が含まれておらず、試料溶液中の蛍光分子等が１ｎＭ未満であっても蛍光分子等の検出が可能であるが、溶液中でランダムに運動している蛍光分子等の濃度又は数密度を定量的に算出するといったことは達成されていない。
そこで、本願出願人は、特願２０１０−０４４７１４及びＰＣＴ／ＪＰ２０１１／５３４８１に於いて、観測対象となる発光粒子の濃度又は数密度が、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の統計的処理を含む光分析技術で取り扱われるレベルよりも低い試料溶液中の発光粒子の状態又は特性を定量的に観測することを可能にする新規な原理に基づく光分析技術を提案した。かかる新規な光分析技術に於いては、端的に述べれば、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等と同様に共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いるところ、試料溶液内に於いて光の検出領域である微小領域（以下、「光検出領域」と称する。）の位置を移動させながら、即ち、光検出領域により試料溶液内を走査しながら、光検出領域が試料溶液中に分散してランダムに運動する発光粒子を包含したときに、その発光粒子から発せられる光を検出し、これにより、試料溶液中の発光粒子の一つ一つを個別に検出して、発光粒子のカウンティングや試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度に関する情報の取得を可能にする。この新規な光分析技術（以下、「走査分子計数法」と称する。）によれば、測定に必要な試料がＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の光分析技術と同様に微量（例えば、数十μＬ程度）であってもよく、また、測定時間が短く、しかも、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の光分析技術の場合に比して、より低い濃度又は数密度の発光粒子の存在を検出し、その濃度、数密度又はその他の特性を定量的に検出することが可能となる。
上記の走査分子計数法では、より具体的には、試料溶液内に於ける光検出領域の位置の移動と共に、逐次的に計測された光強度値（若しくはフォトンカウント値）が時系列の光強度データとして記録され、そのデータ上に於いて、発光粒子から発せられる光を表す強度の変化が在った領域が検出される。即ち、時系列光強度データのうち、有意な情報が存在する領域は、発光粒子からの光を表す強度の変化のあった領域であり、それ以外の領域は不用な領域となる。従って、有意な情報の存在しない領域、即ち、発光粒子からの光を表す強度の変化のなかった領域を記録し保存することは、無駄に時系列光強度データの大きさを増大し、記憶装置の記憶容量を無駄に使用することとなり得る。そして、試料溶液中の発光粒子濃度が低いほど、時系列光強度データ上の発光粒子からの光を表す強度の変化のない領域が増大するので、無駄に使用される記憶容量が増大することとなる。また、時系列光強度データのデータ量の増大は、コンピュータに於けるデータ処理の負荷及び処理時間も増大することとなる。
かくして、本発明の一つの課題は、上記の如き走査分子計数法に於いて、時系列光強度データのデータ量を低減することを可能にする新規な手法を提案することである。
また、本発明のもう一つの課題は、上記の如き走査分子計数法に於いて処理される時系列光強度データのデータ量の低減により、データを保存するための記憶容量の節約とデータ処理の負荷及び処理時間を低減できるようにすることである。
本発明の一つの態様によれば、上記の課題は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析装置であって、試料溶液内に於ける顕微鏡の光学系の光検出領域の位置を移動する光検出領域移動部と、光検出領域からの光を検出する光検出部と、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動させながら光検出部にて検出された光検出領域からの光の時系列の光強度データを生成し、時系列の光強度データに於いて発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出する信号処理部とを含み、信号処理部が、時系列の光強度データに於ける発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない領域を時系列の光強度データから除去することを特徴とする装置によって達成される。かかる構成に於いて、「試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子」とは、試料溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はそれらの凝集体などの、光を発する粒子であって、基板などに固定されず、溶液中を自由にブラウン運動している粒子であれば任意の粒子であってよい。かかる発光粒子は、典型的には、蛍光性粒子であるが、りん光、化学発光、生物発光、光散乱等により光を発する粒子であってもよい。共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の「光検出領域」とは、それらの顕微鏡に於いて光が検出される微小領域であり、対物レンズから照明光が与えられる場合には、その照明光が集光された領域に相当する（共焦点顕微鏡に於いては、特に対物レンズとピンホールとの位置関係により確定される。発光粒子が照明光なしで発光する場合、例えば、化学発光又は生物発光により発光する粒子の場合には、顕微鏡に於いて照明光は要しない。）。なお、本明細書に於いて、「発光粒子の信号」という場合には、特に断らない限り、発光粒子からの光を表す信号を指すものとする。
上記から理解される如く、本発明の基本的な構成である走査分子計数法に於いては、まず、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動しながら、即ち、試料溶液内を光検出領域により走査しながら、逐次的に、光の検出が行われる。そうすると、試料溶液内にて移動する光検出領域が、ランダムに運動している発光粒子を包含したときには、発光粒子からの光が検出され、これにより、一つの発光粒子の存在が検出されることが期待される。従って、逐次的に検出された光に於いて発光粒子からの光の信号を個別に検出して、これにより、粒子の存在を一つずつ個別に逐次的に検出し、粒子の溶液内での状態に関する種々の情報が取得されることとなる。その際、既に述べた如く、逐次的に計測された光強度値の群、即ち、時系列光強度データに於いて、発光粒子からの光を表す強度の変化のない領域は不用な領域であるので、無駄に時系列光強度データの大きさを増大させ、記憶装置の記憶容量を無駄に使用することとなり、また、時系列光強度データから発光粒子からの光を表す信号を検出する信号処理に於けるデータ処理の負荷及び処理時間も増大し得る。そこで、本発明に於いては、上記の如く、信号処理部は、時系列の光強度データに於ける発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない領域を時系列の光強度データから除去する操作を実行するよう構成され、これにより、時系列光強度データの大きさの低減が図られる。
上記の本発明の構成に於いて、時系列光強度データに於ける発光粒子の各々からの光を表す信号の存在している領域と、発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない領域とは、それらの領域に於ける光強度データの特性に基づいて概ね見分けることが可能である。即ち、時系列光強度データに於いて、発光粒子からの光が光検出部に到来している時間区間では、光検出部の出力信号の値は、パルス状にて変化し、ノイズのみが生ずる発光粒子からの光が到来していない時間区間とは異なる特性を有するので、そのような発光粒子からの光の有無を表す特性を参照すれば、時系列光強度データに於ける発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない領域を特定することが可能となる。かくして、本発明の装置に於いては、信号処理部が、時系列の光強度データに於いて所定幅の時間区間毎に発光粒子からの光の有無を表す光強度の特性値を算出し、かかる特性値を用いて発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない時間区間を決定し、発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない時間区間に対応する領域を時系列の光強度データから除去するよう構成されていてよい。
上記の発光粒子からの光の有無を表す光強度の特性値としては、発光粒子からの光が存在している所定幅の時間区間に於けるその大きさが、発光粒子からの光が存在していない所定幅の時間区間に於ける大きさよりも大きくなる任意の値が採用可能である。その場合、光強度の特性値が所定の閾値より大きいときに所定幅の時間区間に発光粒子からの信号が存在すると判定される。そのような特性値は、例えば、所定幅の時間区間に於ける光強度の積算値、光強度の中央値、光強度の平均値、光強度の標準偏差、光強度の分散、光強度のエントロピー、光強度の最大値及び光強度の自己相関関数の相関時間を０としたときの値から算定される粒子数のうちのいずれかであってよい。なお、典型的には、光検出部は、フォトンカウンティングにより光検出領域からの光を検出し、その場合、時系列の光強度データが時系列のフォトンカウントデータとなる。従って、光強度の特性値は、所定幅の時間区間に於ける光子数の合計値、光子数の中央値、光子数の平均値、光子数の標準偏差、光子数の分散、光子数のエントロピー、光子数の最大値及び相関時間を０とした光子数の自己相関関数値から算定される粒子数の群の中から選択された値であってよい。
また、上記の本発明の装置に於いて、時系列の光強度データに於ける発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない領域の、時系列光強度データからの除去は、時系列の光強度データに於ける発光粒子の各々からの光を表す信号の個別の検出処理の前或いは後のいずれかに於いて実行されてよい。発光粒子の信号の個別の検出処理の前に於いて、発光粒子の信号の存在していない領域の除去を行う場合には、発光粒子の信号の個別の検出処理に於ける装置のデータ処理の負荷及び処理時間が低減され有利である。即ち、本発明の装置に於いて、信号処理部が、時系列の光強度データに於ける発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない領域が時系列の光強度データから除去された光強度データ上にて発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出するよう構成されていてよい。なお、発光粒子の信号の個別の検出処理の後に於いて、発光粒子の信号の存在していない領域の除去を行う場合には、発光粒子の信号の個別の検出処理の精度が担保される点で有利である。いずれの場合に於いても、記憶装置の記憶容量を節約するために、信号処理部は、時系列の光強度データに於ける発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない領域が時系列の光強度データから除去されることにより得られる光強度データを記憶装置に保存できるようになっていてよい。
更に、本発明の装置の信号処理部の処理に於いて、発光粒子の各々からの光を表す信号の個別の検出は、時系列の信号の形状に基づいて為されてよい。実施の形態に於いて、典型的には、所定の閾値より大きい強度を有する信号が検出されたときに、１つの発光粒子が光検出領域に入ったと検出されるようになっていてよい。
上記の本発明の装置に於いて、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、発光粒子の特性又は試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて適宜変更可能となっていてよい。当業者に於いて理解される如く、発光粒子から検出される光の態様は、発光粒子の特性又は試料溶液中の数密度又は濃度によって変化し得る。特に、光検出領域の移動速度が速くなると、一つの発光粒子から得られる光量は低減することとなるので、一つの発光粒子からの光が精度よく又は感度よく計測できるように、光検出領域の移動速度は、適宜変更可能となっていることが好ましい。
また、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、好適には、検出対象となる発光粒子の拡散移動速度（ブラウン運動による粒子の平均の移動速度）よりも高く設定される。上記に説明されている如く、本発明の装置は、光検出領域が発光粒子の存在位置を通過したときにその発光粒子から発せられる光を検出して、発光粒子を個別に検出する。しかしながら、発光粒子が溶液中でブラウン運動することによりランダムに移動して、複数回、光検出領域を出入りする場合には、１つの発光粒子から複数回、（発光粒子の存在を表す）信号が検出されてしまい、検出された信号と１つの発光粒子の存在とを対応させることが困難となる。そこで、上記の如く、光検出領域の移動速度を発光粒子の拡散移動速度よりも高く設定し、これにより、１つの発光粒子を一つの（発光粒子の存在を表す）信号に対応させることが可能となる。なお、拡散移動速度は、発光粒子によって変わるので、上記の如く、発光粒子の特性（特に、拡散定数）に応じて、本発明の装置は、光検出領域の移動速度が適宜変更可能であるよう構成されていることが好ましい。
試料溶液内での光検出領域の位置の移動は、任意の方式で為されてよい。例えば、レーザー走査型光学顕微鏡に於いて採用されているガルバノミラーを用いるなどして、顕微鏡の光学系の光路を変更して光検出領域の位置が変更されるようになっていてよく、或いは、光検出領域を固定して、試料溶液の位置を（例えば、顕微鏡のステージを移動するなどして）動かして、光検出領域の試料溶液内に於ける位置を移動するようになっていてよい。光検出領域の位置の移動軌跡は、任意に設定されてよく、例えば、円形、楕円形、矩形、直線及び曲線のうちから選択可能であってよい。特に、顕微鏡の光学系の光路を変更して光検出領域の位置が変更される場合、光検出領域の移動は、速やかであり、且つ、試料溶液に於いて機械的振動や流体力学的な作用が実質的に発生しないので、検出対象となる発光粒子が力学的な作用の影響を受けることなく安定した状態にて、光の計測が可能である点で有利である。
上記の本発明の実施の態様の一つに於いては、信号の数を計数して光検出領域に包含された発光粒子の数を計数するようになっていてよい（粒子のカウンティング）。その場合、検出された発光粒子の数と光検出領域の位置の移動量と組み合わせることにより、試料溶液中の同定された発光粒子の数密度又は濃度に関する情報が得られることとなる。具体的には、例えば、複数の試料溶液の数密度若しくは濃度の比、或いは、濃度若しくは数密度の基準となる標準試料溶液に対する相対的な数密度若しくは濃度の比が算出されるか、又は、濃度若しくは数密度の基準となる標準試料溶液に対する相対的な数密度若しくは濃度の比を用いて、絶対的な数密度値又は濃度値が決定されてよい。或いは、任意の手法により、例えば、所定の速度にて光検出領域の位置を移動するなどして、光検出領域の位置の移動軌跡の全体積を特定すれば、発光粒子の数密度又は濃度が具体的に算定できることとなる。
上記の本発明の装置に於いて試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動させながら光検出を行い、個々の発光粒子からの信号を個別に検出する光分析技術であって、光強度データの大きさの低減が可能な光分析技術の処理は、汎用のコンピュータによっても実現可能である。従って、本発明のもう一つの態様によれば、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出するための光分析用コンピュータプログラムであって、試料溶液内に於ける顕微鏡の光学系の光検出領域の位置を移動する手順と、試料溶液内に於ける光検出領域の位置の移動中に光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する手順と、時系列の光強度データに於ける個々の発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出する手順とをコンピュータに実行させるコンピュータプログラムにして、時系列の光強度データに於ける発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない領域を時系列の光強度データから除去する手順を含むことを特徴とするコンピュータプログラムが提供される。かかる構成に於いて、典型的には、光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する手順に於いて、光検出領域からの光がフォトンカウンティングにより検出され、その場合、時系列の光強度データは時系列のフォトンカウントデータとなる。また、上記のコンピュータプログラムに於いても、時系列の光強度データに於ける個々の発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出する手順に於いて、時系列の光強度データに於ける発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない領域が時系列の光強度データから除去された光強度データ上にて発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出するようになっていてよく、更に、時系列の光強度データに於ける発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない領域が時系列の光強度データから除去された光強度データを記憶装置に保存する手順がコンピュータにより実行されるようになっていてよい。
更に、上記のコンピュータプログラムに於いても、時系列の光強度データに於ける発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない領域を時系列の光強度データから除去する手順に於いて、時系列の光強度データに於いて所定幅の時間区間毎に発光粒子からの光の有無を表す光強度の特性値が算出され、かかる特性値を用いて発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない時間区間が決定され、発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない時間区間に対応する領域が時系列の光強度データから除去されるようになっていてよい。発光粒子からの光の有無を表す光強度の特性値は、具体的には、所定幅の時間区間に於ける光強度の積算値、光強度の中央値、光強度の平均値、光強度の標準偏差、光強度の分散、光強度のエントロピー、光強度の最大値及び相関時間を０とした光強度の自己相関関数値から算定される粒子数のうちのいずれかが採用されてよい。特に、時系列の光強度データが時系列のフォトンカウントデータであるときには、光強度の特性値は、所定幅の時間区間に於ける光子数の合計値、光子数の中央値、光子数の平均値、光子数の標準偏差、光子数の分散、光子数のエントロピー、光子数の最大値及び相関時間を０とした光子数の自己相関関数値から算定される粒子数の群の中から選択された値であってよい。
また、上記のコンピュータプログラムに於いても、発光粒子の各々からの光を表す信号の個別の検出は、時系列の信号の形状に基づいて為されてよい。実施の形態に於いて、典型的には、所定の閾値より大きい強度を有する信号が検出されたときに、１つの発光粒子が光検出領域に入ったと検出されるようになっていてよい。試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、発光粒子の特性、試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて適宜変更可能となっていてよく、好適には、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、検出対象となる発光粒子の拡散移動速度よりも高く設定される。試料溶液内での光検出領域の位置の移動は、任意の方式で為されてよく、好適には、顕微鏡の光学系の光路を変更して或いは試料溶液の位置を動かして光検出領域の位置が変更されるようになっていてよい。光検出領域の位置の移動軌跡は、任意に設定されてよく、例えば、円形、楕円形、矩形、直線及び曲線のうちから選択可能であってよい。
更に、上記のコンピュータプログラムに於いても、個別に検出された発光粒子からの信号の数を計数して光検出領域の位置の移動中に検出された発光粒子の数を計数する手順及び／又は検出された発光粒子の数に基づいて、試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度を決定する手順が含まれていてよい。
上記の本発明の装置又はコンピュータプログラムによれば、試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動させながら、個々の発光粒子の光の検出を行う光分析方法であって、光強度データの大きさの低減を可能にする新規な方法が実現される。かくして、本発明によれば、更に、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析方法であって、試料溶液内に於ける顕微鏡の光学系の光検出領域の位置を移動する過程と、試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動させながら光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する過程と、時系列の光強度データに於ける個々の発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出する過程とを含む方法にして、時系列の光強度データに於ける発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない領域を時系列の光強度データから除去する過程を含むことを特徴とする方法が提供される。かかる方法に於いても、典型的には、光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する過程に於いて、光検出領域からの光がフォトンカウンティングにより検出され、その場合、時系列の光強度データは時系列のフォトンカウントデータとなる。また、上記の方法に於いても、時系列の光強度データに於ける個々の発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出する過程に於いて、時系列の光強度データに於ける発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない領域が時系列の光強度データから除去された光強度データ上にて発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出するようになっていてよく、更に、時系列の光強度データに於ける発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない領域が時系列の光強度データから除去された光強度データを記憶装置に保存する過程が実行されるようになっていてよい。
更に、上記の方法に於いても、時系列の光強度データに於ける発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない領域を時系列の光強度データから除去する過程に於いて、時系列の光強度データに於いて所定幅の時間区間毎に発光粒子からの光の有無を表す光強度の特性値が算出され、かかる特性値を用いて発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない時間区間が決定され、発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない時間区間に対応する領域が時系列の光強度データから除去されるようになっていてよい。発光粒子からの光の有無を表す光強度の特性値は、具体的には、所定幅の時間区間に於ける光強度の積算値、光強度の中央値、光強度の平均値、光強度の標準偏差、光強度の分散、光強度のエントロピー、光強度の最大値及び相関時間を０とした光強度の自己相関関数値から算定される粒子数のうちのいずれかが採用されてよい。特に、時系列の光強度データが時系列のフォトンカウントデータであるときには、光強度の特性値は、所定幅の時間区間に於ける光子数の合計値、光子数の中央値、光子数の平均値、光子数の標準偏差、光子数の分散、光子数のエントロピー、光子数の最大値及び相関時間を０とした光子数の自己相関関数値から算定される粒子数の群の中から選択された値であってよい。
また、上記の方法に於いても、発光粒子の各々からの光を表す信号の個別の検出は、時系列の信号の形状に基づいて為されてよい。実施の形態に於いて、典型的には、所定の閾値より大きい強度を有する信号が検出されたときに、１つの発光粒子が光検出領域に入ったと検出されるようになっていてよい。試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、発光粒子の特性又は試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて適宜変更可能となっていてよく、好適には、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、検出対象となる発光粒子の拡散移動速度よりも高く設定される。試料溶液内での光検出領域の位置の移動は、任意の方式で為されてよく、顕微鏡の光学系の光路を変更して或いは試料溶液の位置を動かして光検出領域の位置が変更されるようになっていてよい。光検出領域の位置の移動軌跡は、任意に設定されてよく、例えば、円形、楕円形、矩形、直線及び曲線のうちから選択可能であってよい。
更に、上記の方法に於いても、個別に検出された発光粒子からの信号の数を計数して光検出領域の位置の移動中に検出された発光粒子の数を計数する過程及び／又は検出された発光粒子の数に基づいて、試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度を決定する過程が含まれていてよい。
上記の本発明の光分析技術は、典型的には、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の生物学的な対象物の溶液中の状態の分析又は解析の用途に用いられるが、非生物学的な粒子（例えば、原子、分子、ミセル、金属コロイドなど）の溶液中の状態の分析又は解析に用いられてもよく、そのような場合も本発明の範囲に属することは理解されるべきである。
総じて、本発明の光分析技術では、走査分子計数法に於いて、時系列光強度データ上に於いて、発光粒子の信号が存在していない領域を選択的に削除することにより、光強度データの大きさを低減して、かかる光強度データの分析処理に於ける負荷、処理時間を低減すると共に、データを記憶するための記憶容量の節約が図られる。後述の実施形態の説明の欄にて詳細に例示される如く、特に、時系列の光強度データに於いて所定幅の時間区間毎に算出された発光粒子からの光の有無を表す光強度の特性値を用いて発光粒子の信号の存在していない時間区間を決定し、発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない時間区間に対応する領域を時系列の光強度データから除去する態様によれば、条件によっては、データ量を約１０分の１程度まで圧縮することも可能となる。かくして、本発明によれば、光強度データの大きさの低減が可能となることから、データの保存に必要な記憶装置の記憶容量の低減と分析処理に必要な演算能力の低減が可能となり、走査分子計数法の実施に要する費用の低減も図られることとなり、走査分子計数法の利用機会の拡大が期待される。
本発明のその他の目的及び利点は、以下の本発明の好ましい実施形態の説明により明らかになるであろう。
図１（Ａ）は、本発明の方法を実行する光分析装置の内部構造の模式図である。図１（Ｂ）は、コンフォーカル・ボリューム（共焦点顕微鏡の観察領域）の模式図である。図１（Ｃ）は、ミラー７の向きを変更して試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動する機構の模式図である。図１（Ｄ）は、マイクロプレートの水平方向位置を移動して試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動する機構の模式図である。 図２（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、本発明の方法が適用される走査分子計数法に於ける光検出の原理を説明する模式図及び計測される光強度の時間変化の模式図である。図２（Ｃ）は、時系列光強度データから発光粒子の信号が存在しない領域を削除してから発光粒子の信号を検出する場合の原理を説明する図である。図２（Ｄ）は、発光粒子の信号の検出を実行した後に時系列光強度データから発光粒子の信号が存在しない領域を削除する場合の原理を説明する図である。 図３（Ａ）、（Ｂ）は、本発明に従って実行される走査分子計数法の処理手順をフローチャートの形式で表した図である。図３（Ｃ）は、光強度データ上に於いて、発光粒子の信号を個別に検出する手法の一つの例をフローチャートの形式で表した図である。 図４（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、発光粒子がブラウン運動をしながら光検出領域を横切る場合及び試料溶液内の光検出領域の位置を発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動することにより発光粒子が光検出領域を横切る場合の粒子の運動の態様を表すモデル図である。図４（Ｃ）は、走査分子計数法に従って、計測された時系列光強度データ（フォトンカウントの時間変化）から発光粒子の存在を検出するための処理手順に於ける検出信号の信号処理過程の例を説明する図である。 図５は、計測されたフォトンカウントデータの実測例（棒グラフ）と、データをスムージングして得られる曲線（点線）と、パルス存在領域にてフィッティングされたガウス関数（実線）を示している。図中、「ノイズ」と付された信号は、ノイズ又は異物による信号であるとして無視される。 図６（Ａ）の上段は、光検出部により得られる光強度（フォトンカウント）の時系列データの例であり、下段は、上段の初めの一部を拡大して示した図である。図６（Ｂ）の上段は、図６（Ａ）の時系列光強度データをダイジェスト化処理して得られる光強度データの例であり、下段は、上段の初めの一部を拡大して示した図である。光強度の測定条件は、本文参照。ダイジェスト化処理は、ウィンドウサイズを２００μ秒として、特性値（光子数和）の閾値を５とした。図中、丸点線は、発光粒子の信号の検出のための閾値（１フォトンカウント）を示している。 図７は、時系列光強度データをダイジェスト化処理して得られる光強度データに於いて、発光粒子の信号の検出処理を行った場合の検出パルス数とデータ圧縮率との、特性値（光子数和）の閾値に対する変化を示したグラフ図である。 図８は、時系列光強度データに於いて発光粒子の信号の検出処理を行った後、ダイジェスト化処理して得られる光強度データのデータ圧縮率の、ウィンドウサイズに対する変化を示したグラフ図である。 図９は、従来の蛍光強度のゆらぎを算出する光分析技術に於いて得られるフォトンカウント（光強度）の時間変化の例であり、（Ａ）は、試料内の粒子の濃度が、十分な計測精度が与えられる程度である場合であり、（Ｂ）は、（Ａ）の場合よりも大幅に試料内の粒子の濃度が低い場合である。
１…光分析装置（共焦点顕微鏡）
２…光源
３…シングルモードオプティカルファイバー
４…コリメータレンズ
５…ダイクロイックミラー
６、７、１１…反射ミラー
８…対物レンズ
９…マイクロプレート
１０…ウェル（試料溶液容器）
１２…コンデンサーレンズ
１３…ピンホール
１４…バリアフィルター
１５…マルチモードオプティカルファイバー
１６…光検出器
１７…ミラー偏向器
１７ａ…ステージ位置変更装置
１８…コンピュータ
以下、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。
光分析装置の構成
本発明による光分析技術を実現する光分析装置は、基本的な構成に於いて、図１（Ａ）に模式的に例示されている如き、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等が実行可能な共焦点顕微鏡の光学系と光検出器とを組み合わせてなる装置であってよい。同図を参照して、光分析装置１は、光学系２〜１７と、光学系の各部の作動を制御すると共にデータを取得し解析するためのコンピュータ１８とから構成される。光分析装置１の光学系は、通常の共焦点顕微鏡の光学系と同様であってよく、そこに於いて、光源２から放射されシングルモードファイバー３内を伝播したレーザー光（Ｅｘ）が、ファイバーの出射端に於いて固有のＮＡにて決まった角度にて発散する光となって放射され、コリメーター４によって平行光となり、ダイクロイックミラー５、反射ミラー６、７にて反射され、対物レンズ８へ入射される。対物レンズ８の上方には、典型的には、１〜数十μＬの試料溶液が分注される試料容器又はウェル１０が配列されたマイクロプレート９が配置されており、対物レンズ８から出射したレーザー光は、試料容器又はウェル１０内の試料溶液中で焦点を結び、光強度の強い領域（励起領域）が形成される。試料溶液中には、観測対象物である発光粒子、典型的には、蛍光性粒子又は蛍光色素等の発光標識が付加された粒子が分散又は溶解されており、かかる発光粒子が励起領域に進入すると、その間、発光粒子が励起され光が放出される。放出された光（Ｅｍ）は、対物レンズ８、ダイクロイックミラー５を通過し、ミラー１１にて反射してコンデンサーレンズ１２にて集光され、ピンホール１３を通過し、バリアフィルター１４を透過して（ここで、特定の波長帯域の光成分のみが選択される。）、マルチモードファイバー１５に導入されて、光検出器１６に到達し、時系列の電気信号に変換された後、コンピュータ１８へ入力され、後に説明される態様にて光分析のための処理が為される。なお、当業者に於いて知られている如く、上記の構成に於いて、ピンホール１３は、対物レンズ８の焦点位置と共役の位置に配置されており、これにより、図１（Ｂ）に模式的に示されている如きレーザー光の焦点領域、即ち、励起領域内から発せられた光のみがピンホール１３を通過し、励起領域以外からの光は遮断される。図１（Ｂ）に例示されたレーザー光の焦点領域は、通常、１〜１０ｆＬ程度の実効体積を有する本光分析装置に於ける光検出領域であり（典型的には、光強度が領域の中心を頂点とするガウス様分布となる。実効体積は、光強度が１／ｅ２となる面を境界とする略楕円球体の体積である。）、コンフォーカル・ボリュームと称される。また、本発明では、１つの発光粒子からの光、例えば、一つの蛍光色素分子からの微弱光が検出されるので、光検出器１６としては、好適には、フォトンカウンティングに使用可能な超高感度の光検出器が用いられる。光の検出がフォトンカウンティングによる場合、光強度の測定は、所定時間に亘って、逐次的に、所定の単位時間毎（ＢＩＮ ＴＩＭＥ）に、光検出器に到来するフォトンの数を計測する態様にて実行される。従って、この場合、時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータである。また、顕微鏡のステージ（図示せず）には、観察するべきウェル１０を変更するべく、マイクロプレート９の水平方向位置を移動するためのステージ位置変更装置１７ａが設けられていてよい。ステージ位置変更装置１７ａの作動は、コンピュータ１８により制御されてよい。かかる構成により、検体が複数在る場合にも、迅速な計測が達成可能となる。
更に、上記の光分析装置の光学系に於いては、試料溶液内を光検出領域により走査する、即ち、試料溶液内に於いて焦点領域、即ち、光検出領域の位置を移動するための機構が設けられる。かかる光検出領域の位置を移動するための機構としては、例えば、図１（Ｃ）に模式的に例示されている如く、反射ミラー７の向きを変更するミラー偏向器１７が採用されてよい（光検出領域の絶対的な位置を移動する方式）。かかるミラー偏向器１７は、通常のレーザー走査型顕微鏡に装備されているガルバノミラー装置と同様であってよい。或いは、別の態様として、図１（Ｄ）に例示されている如く、試料溶液が注入されている容器１０（マイクロプレート９）の水平方向の位置を移動し、試料溶液内に於ける光検出領域の相対的な位置を移動するべくステージ位置変更装置１７ａが作動されてもよい（試料溶液の絶対的な位置を移動する方式）。いずれの方式による場合も、所望の光検出領域の位置の移動パターンを達成するべく、ミラー偏向器１７又はステージ位置変更装置１７ａは、コンピュータ１８の制御の下、光検出器１６による光検出と協調して駆動される。光検出領域の位置の移動軌跡は、円形、楕円形、矩形、直線、曲線又はこれらの組み合わせから任意に選択されてよい（コンピュータ１８に於けるプログラムに於いて、種々の移動パターンが選択できるようになっていてよい。）。なお、図示していないが、対物レンズ８又はステージを上下に移動することにより、光検出領域の位置が上下方向に移動されるようになっていてもよい。
観測対象物となる発光粒子が多光子吸収により発光する場合には、上記の光学系は、多光子顕微鏡として使用される。その場合には、励起光の焦点領域（光検出領域）のみで光の放出があるので、ピンホール１３は、除去されてよい。また、観測対象物となる発光粒子が化学発光や生物発光現象により励起光によらず発光する場合には、励起光を生成するための光学系２〜５が省略されてよい。発光粒子がりん光又は散乱により発光する場合には、上記の共焦点顕微鏡の光学系がそのまま用いられる。更に、光分析装置１に於いては、図示の如く、複数の励起光源２が設けられていてよく、発光粒子の励起波長によって適宜、励起光の波長が選択できるようになっていてよい。同様に、光検出器１６も複数個備えられていてよく、試料中に波長の異なる複数種の発光粒子が含まれている場合に、それらから光をその波長によって別々に検出できるようになっていてよい。
本発明の光分析技術の原理
「発明の概要」の欄に記載されている如く、本発明の光分析技術に於いては、端的に述べれば、走査分子計数法に於いて、時系列光強度データの大きさの低減（ダイジェスト化処理）が実行される。以下、本発明の走査分子計数法及び時系列光強度データのダイジェスト化処理の原理について説明する。
１.走査分子計数法の原理
ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の分光分析技術は、従前の生化学的な分析技術に比して、必要な試料量が極めて少なく、且つ、迅速に検査が実行できる点で優れている。しかしながら、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の分光分析技術では、原理的に、発光粒子の濃度や特性は、蛍光強度のゆらぎに基づいて算定されるので、精度のよい測定結果を得るためには、試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度が、図９（Ａ）に模式的に描かれているように、蛍光強度の計測中に常に一個程度の発光粒子が光検出領域ＣＶ内に存在するレベルであり、同図の右側に示されている如く、計測時間中に常に有意な光強度（フォトンカウント）が検出されることが要求される。もし発光粒子の濃度又は数密度がそれよりも低い場合、例えば、図９（Ｂ）に描かれているように、発光粒子がたまにしか光検出領域ＣＶ内へ進入しないレベルである場合には、同図の右側に例示されている如く、有意な光強度の信号（フォトンカウント）が、計測時間の一部にしか現れないこととなり、精度のよい光強度のゆらぎの算定が困難となる。また、計測中に常に一個程度の発光粒子が光検出領域内に存在するレベルよりも発光粒子の濃度が大幅に低い場合には、光強度のゆらぎの演算に於いて、バックグラウンドの影響を受けやすく、演算に十分な量の有意な光強度データを得るために計測時間が長くなる。
そこで、本願出願人は、特願２０１０−０４４７１４及びＰＣＴ／ＪＰ２０１１／５３４８１に於いて、発光粒子の濃度が、上記の如きＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の分光分析技術にて要求されるレベルよりも低い場合でも、発光粒子の数密度又は濃度等の特性の検出を可能にする新規な原理に基づく「走査分子計数法」を提案した。
走査分子計数法に於いて実行される処理としては、端的に述べれば、光検出領域の位置を移動するための機構（ミラー偏向器１７）を駆動して光路を変更し、図２（Ａ）にて模式的に描かれているように、試料溶液内に於いて光検出領域ＣＶの位置を移動しながら、即ち、光検出領域ＣＶにより試料溶液内を走査しながら、光検出が実行される。そうすると、例えば、光検出領域ＣＶが移動する間（図中、時間ｔｏ〜ｔ２）に於いて１つの発光粒子の存在する領域を通過する際（ｔ１）には、発光粒子から光が放出され、図２（Ｂ）に描かれている如き時系列の光強度データ上に有意な光強度（Ｅｍ）のパルス状の信号が出現することとなる。かくして、上記の光検出領域ＣＶの位置の移動と光検出を実行し、その間に出現する図２（Ｂ）に例示されている如きパルス状の信号（有意な光強度）を一つずつ検出することによって、発光粒子が個別に検出され、その数をカウントすることにより、計測された領域内に存在する発光粒子の数、或いは、濃度若しくは数密度に関する情報が取得できることとなる。かかる走査分子計数法の原理に於いては、蛍光強度のゆらぎの算出の如き統計的な演算処理は行われず、発光粒子が一つずつ検出されるので、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等では十分な精度にて分析ができないほど、観測されるべき粒子の濃度が低い試料溶液でも、粒子の濃度若しくは数密度に関する情報が取得可能である。
２．時系列光強度データのダイジェスト化処理の原理
既に述べた如く、上記の走査分子計数法により光検出器１６により経時的に取得された光強度のデータ（時系列光強度データ）に於いて、発光粒子の信号が存在する領域は、全領域の一部であり、発光粒子の信号の存在しない領域に於いては、光検出器の熱ノイズや背景光等に起因にするノイズが存在するのみである。従って、本発明に於いては、時系列光強度データに於ける発光粒子の信号の存在しない領域を時系列光強度データから除去し、時系列光強度データの大きさの低減が図られる。なお、本明細書に於いて、時系列光強度データの大きさの低減処理を、以下「ダイジェスト化処理」と称する。
（ｉ）ダイジェスト化処理後に発光粒子の信号の検出を行う場合
時系列光強度データのダイジェスト化処理の一つの態様に於いては、時系列光強度データ上に於いて発光粒子の信号の存在しない領域を検出し、かかる領域を時系列光強度データから除去した光強度データ（ダイジェスト化光強度データ）を調製し、ダイジェスト化光強度データ上にて発光粒子の信号の個別の検出が実行される。具体的には、発光粒子の信号の存在する領域と発光粒子の信号の存在しない領域とを区別するために、まず、図２（Ｃ）の上段にて示されている如く、時系列光強度データ上に於いて、所定幅の時間区間毎に（例えば、図中、領域Ａ〜Ｄ毎に）、各時間区間内の光強度値（光子数）を用いて発光粒子からの光の有無を表す光強度の特性値が算出される。既に触れた如く、時系列光強度データに於いて、発光粒子の信号の存在する領域には、パルス状の信号が存在するが、発光粒子の信号の存在しない領域では、ノイズのみであり、発光粒子の信号の存在する領域と発光粒子の信号の存在しない領域とは、光強度値に於いて、互いに異なる特性を有する。従って、時系列光強度データ上で、所定幅の時間区間毎に、発光粒子からの光の有無を表す任意の光強度の特性値を算定し、かかる特性値に基づいて、発光粒子の信号の存在しない領域に対応する時間区間を決定することが可能となる。
発光粒子からの光の有無を表す光強度の特性値としては、発光粒子からの光が存在している所定幅の時間区間に於けるその大きさが、発光粒子からの光が存在していない所定幅の時間区間に於ける大きさよりも大きくなる任意の値が採用可能である。その場合、光強度の特性値が所定の閾値より大きいときに所定幅の時間区間に発光粒子からの信号が存在すると判定される。そのような特性値は、例えば、所定幅の時間区間に於ける光強度の積算値、光強度の中央値、光強度の平均値、光強度の標準偏差、光強度の分散、光強度のエントロピー、光強度の最大値及び光強度の自己相関関数の相関時間を０としたときの値から算定される粒子数のうちのいずれかであってよい。なお、典型的には、光検出部は、フォトンカウンティングにより光検出領域からの光を検出し、その場合、時系列の光強度データが時系列のフォトンカウントデータとなる。従って、光強度の特性値は、所定幅の時間区間に於ける光子数の合計値、光子数の中央値、光子数の平均値、光子数の標準偏差、光子数の分散、光子数のエントロピー、光子数の最大値及び相関時間を０とした光子数の自己相関関数値から算定される粒子数の群の中から選択された値であってよい。（図２（Ｃ）では、特性値として、各時間区間内の光子数の総和が採用されている。）
かくして、各時間区間内の特性値が決定されると、かかる特性値を参照して、例えば、特性値が所定の閾値を超えているか否かを参照して、各時間区間に於いて、発光粒子の信号が存在するか否かが決定され、発光粒子の信号が存在する時間区間に対応する領域（図中、領域Ｂ、Ｄ）が選択的に抽出され、図２（Ｃ）の下段の如く、発光粒子の信号の存在しない時間区間に対応する領域（図中、領域Ａ、Ｃ）が除去されたダイジェスト化光強度データが調製される。そして、かくして調製されたダイジェスト化光強度データ上にて、例えば、後に詳細に説明される態様にて発光粒子の信号が検出される。かかる態様によれば、発光粒子の信号の検出処理の対象となるデータの大きさが小さくなり、不用な領域についてデータ処理をする必要がなくなるので、データ処理に於ける負荷と処理時間の短縮が期待される。また、計測されたデータの記憶装置への保存に於いては、ダイジェスト化光強度データを保存することにより、記憶装置の記憶容量の節約が可能となる。
なお、上記の処理に於いて、時間区間の所定幅と特性値のための閾値は、任意に設定されてよい。しかしながら、後の実施例に於いて説明される如く、発光粒子信号の検出精度とデータの圧縮率（ダイジェスト化光強度データの大きさ／時系列光強度データの大きさ）は、時間区間の所定幅と特性値のための閾値の設定によって変わるので、予備実験等の結果を用いて適正な値に設定されることが好ましい。
（ii）発光粒子の信号の検出の後にダイジェスト化処理を行う場合
時系列光強度データのダイジェスト化処理のもう一つの態様に於いては、時系列光強度データ上に於いて、まず、図２（Ｄ）の上段に模式的に示されている如く、例えば、（後述の如き）釣鐘型関数のフィッティング処理等を含む処理にて発光粒子の信号の検出を実行した後、発光粒子の信号の存在しない時間区間に対応する領域を除いて、発光粒子の信号の存在した時間区間に対応する領域のみを選択してダイジェスト化光強度データが調製される（図２（Ｄ）参照）。この場合、発光粒子の信号の検出処理については、（ｉ）の場合よりも負荷及び処理時間が大きくなるが、保存するデータをダイジェスト化光強度データとすることにより、記憶装置の記憶容量の節約が可能となる。時間区間の所定幅は、データの圧縮率に影響するので、予備実験等の結果を用いて適正な値に設定されることが好ましい。（後述の実施例参照）
走査分子計数法の処理操作過程
図１（Ａ）に例示の光分析装置１を用いた本発明に従った走査分子計数法の実施形態に於いては、具体的には、（１）発光粒子を含む試料溶液の調製、（２）試料溶液の光強度の測定処理、及び（３）測定された光強度の分析処理が実行される。図３は、フローチャートの形式にて表した本実施形態に於ける処理を示している。なお、（Ａ）は、ダイジェスト化処理後に発光粒子の信号の検出を行う場合の処理であり、（Ｂ）は、発光粒子の信号の検出の後にダイジェスト化処理を行う場合の処理を示している。また、（Ｃ）は、発光粒子の信号の検出処理の例を示している。
（１）試料溶液の調製
本発明の光分析技術の観測対象物となる粒子は、溶解された分子等の、試料溶液中にて分散し溶液中にてランダムに運動する粒子であれば、任意のものであってよく、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞、或いは、金属コロイド、その他の非生物学的分子などであってよい。観測対象物となる粒子が光を発する粒子でない場合には、発光標識（蛍光分子、りん光分子、化学・生物発光分子）が観測対象物となる粒子に任意の態様にて付加されたものが用いられる。試料溶液は、典型的には水溶液であるが、これに限定されず、有機溶媒その他の任意の液体であってよい。
（２）試料溶液の光強度の測定（図３（Ａ）、（Ｂ）ステップ１０）
本実施形態の走査分子計数法による光分析に於ける光強度の測定は、測定中にミラー偏向器１７又はステージ位置変更装置１７ａを駆動して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動（試料溶液内の走査）を行う他は、ＦＣＳ又はＦＩＤＡに於ける光強度の測定過程と同様の態様にて実行されてよい。操作処理に於いて、典型的には、マイクロプレート９のウェル１０に試料溶液を注入して顕微鏡のステージ上に載置した後、使用者がコンピュータ１８に対して、測定の開始の指示を入力すると、コンピュータ１８は、記憶装置（図示せず）に記憶されたプログラム（試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動する手順と、光検出領域の位置の移動中に光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する手順）に従って、試料溶液内の光検出領域に於ける励起光の照射及び光強度の計測が開始される。かかる計測中、コンピュータ１８のプログラムに従った処理動作の制御下、ミラー偏向器１７又はステージ位置変更装置１７ａは、ミラー７（ガルバノミラー）又は顕微鏡のステージ上のマイクロプレート９を駆動して、ウェル１０内に於いて光検出領域の位置の移動を実行し、これと同時に光検出器１６は、逐次的に検出された光を電気信号に変換してコンピュータ１８へ送信し、コンピュータ１８では、任意の態様にて、送信された信号から時系列の光強度データを生成して保存する。なお、典型的には、光検出器１６は、一光子の到来を検出できる超高感度光検出器であるので、光の検出が、フォトンカウンティングによる場合、時系列光強度データは、時系列のフォトンカウントデータであってよい。
光強度の計測中の光検出領域の位置の移動速度は、任意に、例えば、実験的に又は分析の目的に適合するよう設定された所定の速度であってよい。検出された発光粒子の数に基づいて、その数密度又は濃度に関する情報を取得する場合には、光検出領域の通過した領域の大きさ又は体積が必要となるので、移動距離が把握される態様にて光検出領域の位置の移動が実行される。なお、計測中の経過時間と光検出領域の位置の移動距離とが比例関係にある方が測定結果の解釈が容易となるので、移動速度は、基本的に、一定速度であることが好ましいが、これに限定されない。
ところで、光検出領域の位置の移動速度に関して、計測された時系列の光強度データからの発光粒子の個別の検出、或いは、発光粒子の数のカウンティングを、定量的に精度よく実行するためには、かかる移動速度は、発光粒子のランダムな運動、即ち、ブラウン運動による移動速度よりも速い値に設定されることが好ましい。本発明の光分析技術の観測対象粒子は、溶液中に分散又は溶解されて自由にランダムに運動する粒子であるので、ブラウン運動によって位置が時間と伴に移動する。従って、光検出領域の位置の移動速度が粒子のブラウン運動による移動に比して遅い場合には、図４（Ａ）に模式的に描かれている如く、粒子が領域内をランダムに移動し、これにより、光強度がランダムに変化し（既に触れた如く、光検出領域の励起光強度は、領域の中心を頂点として外方に向かって低減する。）、個々の発光粒子に対応する有意な光強度の変化を特定することが困難となる。そこで、好適には、図４（Ｂ）に描かれている如く、粒子が光検出領域を略直線に横切り、これにより、時系列の光強度データに於いて、図４（Ｃ）の最上段に例示の如く、個々の発光粒子に対応する光強度の変化のプロファイルが略一様となり（発光粒子が略直線的に光検出領域を通過する場合には、光強度の変化のプロファイルは、励起光強度分布と略同様となる。）、個々の発光粒子と光強度との対応が容易に特定できるように、光検出領域の位置の移動速度は、粒子のブラウン運動による平均の移動速度（拡散移動速度）よりも速く設定される。
具体的には、拡散係数Ｄを有する発光粒子がブラウン運動によって半径Ｗｏの光検出領域（コンフォーカルボリューム）を通過するときに要する時間Δｔは、平均二乗変位の関係式
（２Ｗｏ）２＝６Ｄ・Δｔ …（１）
から、
Δｔ＝（２Ｗｏ）２／６Ｄ …（２）
となるので、発光粒子がブラウン運動により移動する速度（拡散移動速度）Ｖdifは、概ね、
Ｖdif＝２Ｗｏ／Δｔ＝３Ｄ／Ｗｏ …（３）
となる。そこで、光検出領域の位置の移動速度は、かかるＶdifを参照して、それよりも十分に早い値に設定されてよい。例えば、観測対象粒子の拡散係数が、Ｄ＝２．０×１０−１０ｍ２／ｓ程度であると予想される場合には、Ｗｏが、０．６２μｍ程度だとすると、Ｖdifは、１．０×１０−３ｍ／ｓとなるので、光検出領域の位置の移動速度は、その１０倍以上の１５ｍｍ／ｓと設定されてよい。なお、観測対象粒子の拡散係数が未知の場合には、光検出領域の位置の移動速度を種々設定して光強度の変化のプロファイルが、予想されるプロファイル（典型的には、励起光強度分布と略同様）となる条件を見つけるための予備実験を繰り返し実行して、好適な光検出領域の位置の移動速度が決定されてよい。
（３）光強度の分析
上記の処理により時系列光強度データが得られると、コンピュータ１８に於いて、記憶装置に記憶されたプログラムに従った処理により、発光粒子の信号の検出、発光粒子のカウンティング、濃度算出等の各種分析が実行される。また、既に述べた如く、特に、本発明に於いては、発光粒子の信号の検出の前又は後に時系列光強度データのダイジェスト化処理が実行される。以下、（ｉ）発光粒子の信号の検出の前にダイジェスト化処理を行う場合（図３（Ａ））、及び、（ii）発光粒子の信号の検出の後にダイジェスト化処理を行う場合（図３（Ｂ））のそれぞれについて説明する。
（ｉ）発光粒子の信号の検出の前にダイジェスト化処理を行う場合
（ａ）ダイジェスト化処理（図３（Ａ）ステップ２０）
発光粒子の信号の検出の前にダイジェスト化処理を行う場合のダイジェスト化処理に於いては、既に触れた如く、ステップ１０にて得られた時系列光強度データに於いて、所定幅の時間区間毎に光強度の特性値が算出される。光強度の特性値としては、時系列の光強度データが時系列のフォトンカウントデータである場合には、上記の如く、所定幅の時間区間に於ける光子数の合計値、光子数の中央値、光子数の平均値、光子数の標準偏差値、光子数の分散値、光子数のエントロピー値、光子数の最大値及び相関時間を０とした光子数の自己相関関数値から算定される粒子数の群の中から選択された値であってよい。
各特性値について、より詳細には、光子数の合計値（総和）は、所定幅の時間区間に於ける光子数の合計値である。発光粒子の信号が存在する時間区間の合計値は、その他の時間区間の合計値よりも発光粒子からの光子数だけ増大するので、或る時間区間の合計値の大きさが所定の閾値よりも大きいとき、その時間区間に於いて発光粒子の信号が存在すると判定される。
光子数の中央値、最大値は、それぞれ、所定幅の時間区間に見出される光子数の中央値、最大値である。発光粒子の光が光検出器に到来している期間は、通常のノイズのみが発生する場合より光子数が大きくなるので、発光粒子の信号が存在する時間区間の中央値、最大値も増大する。従って、或る時間区間の中央値又は最大値の大きさが所定の閾値よりも大きいとき、その時間区間に於いて発光粒子の信号が存在すると判定される。
光子数の平均値は、所定幅の時間区間に於ける光子数の時間平均値である。上記の如く、発光粒子の信号が存在する時間区間の合計値は、その他の時間区間の合計値よりも発光粒子からの光子数だけ増大するので、所定幅の時間区間に於ける光子数の時間平均値も増大する。従って、或る時間区間の平均値の大きさが所定の閾値よりも大きいとき、その時間区間に於いて発光粒子の信号が存在すると判定される。
光子数の標準偏差値、分散値及びエントロピー値は、それぞれ、所定幅の時間区間に於ける光子数の時間平均に於ける標準偏差値、分散値及び情報量のエントロピー値であり、所定幅の時間区間内に見出される光子数の時間変化のばらつきの程度を表す特性値である。或る時間区間に発光粒子の信号が存在する場合、その他の時間区間に比して、光子数の時間変化が激しくなる。従って、発光粒子の信号が存在する時間区間の光子数の標準偏差値、分散値、エントロピー値は、その他の時間区間の各値に比して増大するので、或る時間区間の各値が、所定の閾値よりも大きいとき、その時間区間に於いて発光粒子の信号が存在すると判定される。なお、光子数のエントロピー値は、或る時点（ＢＩＮ ＴＩＭＥ）に於ける光子数がｘ個である確率がpｘであったとき、或る時間区間に於いて光子数がｘ個の時点の数ixを用いて、
−ｌｏｇ２（p0i0・p1i1・…・pxix・…・pnin） …（４）
により与えられる値である。通常、光子数がｘ個である確率pｘは、p0＞p1＞p2＞…＞px…＞pnである。ノイズのみしか存在していない区間のエントロピー値は、−ｌｏｇ２（p0i0・p1i1・p2i2）程度であるが、発光粒子の信号が存在する区間では、−ｌｏｇ２（p0i0・p1i1・p2i2・p3i3・p4i4）などとなり、値が増大する。
所定幅の時間区間に於ける相関時間を０とした光子数の自己相関関数値から算定される粒子数とは、その時間区間に於ける粒子数に相当する量である。ＦＣＳの理論によれば、光強度の自己相関関数Ｃ（τ）は、
Figure 2012141019
 により与えられる（ここで、τＤは、並進拡散時間であり、ＡＲは、ストラクチャ・パラメータであり、Ｎは、粒子数である。）。上記の式に於いて、相関時間τ＝０のときのＣ（０）から、粒子数Ｎは、１／（Ｃ（０）−１）により与えられる。この粒子数は、時間区間毎に見出される粒子数であると考えられるので、上記の特性値と同様に、所定の閾値よりも大きいとき、その時間区間に於いて発光粒子の信号が存在すると判定される。
かくして、時系列光強度データ上の各時間区間に於いて、上記のいずれかの特性値を算定し、所定の閾値を越える特性値を有する時間区間を発光粒子の信号の存在する領域として選択し、所定の閾値を下回る特性値を有する時間区間を発光粒子の信号の存在しない領域として特定して除去し、図２（Ｃ）下段に例示の如く、ダイジェスト化光強度データが調製される。
（ｂ）発光粒子の信号の個別検出（図３（Ａ）ステップ３０、図３（Ｃ）参照）
上記の処理にてダイジェスト化光強度データが調製されると、かかる光強度データ上にて、発光粒子の信号を個別に検出する処理が実行される。既に触れた如く、一つの発光粒子の光検出領域を通過する際の軌跡が、図４（Ｂ）に示されている如く略直線状である場合、その粒子に対応する信号に於ける光強度データ上での光強度の変化は、光学系により決定される光検出領域内の光強度分布を反映した略釣鐘状のプロファイルを有する。従って、走査分子計数法では、基本的には、光強度データ上で、適宜設定される閾値Ｉｔｈを超える光強度値が継続する時間幅Δτが所定の範囲にあるとき、その光強度のプロファイルを有する信号が一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されるようになっていてよい。そして、光強度が閾値Ｉｔｈを超えないか、時間幅Δτが所定の範囲にない信号は、ノイズ又は異物の信号として判定される。また、光検出領域の光強度分布が、ガウス分布：
Ｉ＝Ａ・ｅｘｐ（−２ｔ２／ａ２） …（６）
であると仮定できるときには、有意な光強度のプロファイル（バックグラウンドでないと明らかに判断できるプロファイル）に対して式（６）をフィッティングして算出された強度Ａ及び幅ａが所定の範囲内にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されてよい。（強度Ａ及び幅ａが所定の範囲外にある信号は、ノイズ又は異物の信号として判定され、その後の分析等に於いて無視されてよい。）
光強度データ上の信号の検出の処理の一つの例に於いては、まず、光強度データ（図４（Ｃ）、最上段「検出結果（未処理）」）に対して、スムージング（平滑化）処理が為される（図３（Ｃ）−ステップ１１０、図４（Ｃ）中上段「スムージング」）。発光粒子の発する光は確率的に放出されるものであり、微小な時間に於いてデータ値の欠落が生じ得るため、かかるスムージング処理によって、前記の如きデータ値の欠落を無視できることとなる。スムージング処理は、例えば、移動平均法により為されてよい。なお、スムージング処理を実行する際のパラメータ、例えば、移動平均法に於いて一度に平均するデータ点数や移動平均の回数など、は、光強度データ取得時の光検出領域の位置の移動速度（走査速度）、ＢＩＮ ＴＩＭＥに応じて適宜設定されてよい。
次いで、スムージング処理後の光強度データに於いて、有意なパルス状の信号（以下、「パルス信号」と称する。）が存在する時間領域（パルス存在領域）を検出するために、スムージング処理後の光強度データの時間についての一次微分値が演算される（ステップ１２０）。光強度データの時間微分値は、図４（Ｃ）中下段「時間微分」に例示されている如く、信号値の変化時点に於ける値の変化が大きくなるので、かかる時間微分値を参照することによって、有意な信号の始点と終点を有利に決定することができる。
しかる後、光強度データ上に於いて、逐次的に、有意なパルス信号が検出される（ステップ１３０〜１６０）。具体的には、まず、光強度データの時間微分値データ上にて、逐次的に時間微分値を参照して、一つのパルス信号の始点と終点とが探索され決定され、パルス存在領域が特定される（ステップ１３０）。一つのパルス存在領域が特定されると、そのパルス存在領域に於けるスムージングされた光強度データに対して、釣鐘型関数のフィッティングが行われ（図４（Ｃ）下段「釣鐘型関数フィッティング」）、釣鐘型関数のパルスのピーク（最大値）の強度Ｉpeak、パルス幅（半値全幅）Ｗpeak、フィッティングに於ける（最小二乗法の）相関係数等のパラメータが算出される（ステップ１４０）。なお、フィッティングされる釣鐘型関数は、典型的には、ガウス関数であるが、ローレンツ型関数であってもよい。そして、算出された釣鐘型関数のパラメータが、一つの発光粒子が光検出領域を通過したときに検出されるパルス信号が描く釣鐘型のプロファイルのパラメータについて想定される範囲内にあるか否か、即ち、パルスのピーク強度、パルス幅、相関係数が、それぞれ、所定範囲内にあるか否か等が判定される（ステップ１５０）。かくして、図５左に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが一つの発光粒子に対応する信号に於いて想定される範囲内にあると判定された信号は、一つの発光粒子に対応する信号であると判定され、これにより、一つの発光粒子が検出されたこととなる。一方、図５右に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが想定される範囲内になかったパルス信号は、ノイズとして無視される。なお、発光粒子の信号の検出と同時に信号数のカウンティング、即ち、発光粒子のカウンティングが実行されてよい。
上記のステップ１３０〜１５０の処理に於けるパルス信号の探索及び判定は、光強度データの全域に渡って繰り返し実行されてよい（ステップ１６０）。なお、光強度データから発光粒子の信号を個別に検出する処理は、上記の手順に限らず、任意の手法により実行されてよい。
（ii）発光粒子の信号の検出の後にダイジェスト化処理を行う場合
図３（Ｂ）に示されている如く、発光粒子の信号の検出処理（ステップ２０）の後にダイジェスト化処理（ステップ３０）を実行する場合、まず、ステップ１０にて得られた時系列光強度データに於いて、そのまま、例えば、式（６）のフィッティング又は図３（Ｃ）に示された処理に従って、上記と同様に、発光粒子の信号の検出が実行される。その際、発光粒子の信号の検出と同時に信号数のカウンティング、即ち、発光粒子のカウンティングが実行されてよい。しかる後、時系列光強度データに於いて発光粒子の信号の存在する所定幅の時間区間に対応する領域が選択され、図２（Ｄ）に模式的に描かれている如く、発光粒子の信号の存在しない時間区間が除去されて、ダイジェスト化光強度データが調製される。
（iii）発光粒子濃度の決定
検出された発光粒子の信号の数を計数して、発光粒子の数の決定が為されている場合、任意の手法にて、光検出領域の通過した領域の総体積が算定されれば、その体積値と発光粒子の数とから試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度が決定される（ステップ４０）。
光検出領域の通過した領域の総体積は、励起光又は検出光の波長、レンズの開口数、光学系の調整状態に基づいて理論的に算定されてもよいが、実験的に、例えば、発光粒子の濃度が既知の溶液（対照溶液）について、検査されるべき試料溶液の測定と同様の条件にて、上記に説明した光強度の測定、発光粒子の検出及びカウンティングを行うことにより検出された発光粒子の数と、対照溶液の発光粒子の濃度とから決定されるようになっていてよい。具体的には、例えば、発光粒子の濃度Ｃの対照溶液について、対照溶液の発光粒子の検出数がＮであったとすると、光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔは、
Ｖｔ＝Ｎ／Ｃ …（６）
により与えられる。また、対照溶液として、発光粒子の複数の異なる濃度の溶液が準備され、それぞれについて測定が実行されて、算出されたＶｔの平均値が光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔとして採用されるようになっていてよい。そして、Ｖｔが与えられると、発光粒子のカウンティング結果がｎの試料溶液の発光粒子の濃度ｃは、
ｃ＝ｎ／Ｖｔ …（７）
により与えられる。なお、光検出領域の体積、光検出領域の通過した領域の総体積は、上記の方法によらず、任意の方法にて、例えば、ＦＣＳ、ＦＩＤＡを利用するなどして与えられるようになっていてよい。また、本実施形態の光分析装置に於いては、想定される光検出領域の移動パターンについて、種々の標準的な発光粒子についての濃度Ｃと発光粒子の数Ｎとの関係（式（６））の情報をコンピュータ１８の記憶装置に予め記憶しておき、装置の使用者が光分析を実施する際に適宜記憶された関係の情報を利用できるようになっていてよい。
（iv）データの保存・表示・読込
本発明に於いては、上記の如く、時系列光強度データから、発光粒子の信号の存在しない領域を除去したダイジェスト化光強度データが調製されることから、好適には、コンピュータ１８の記憶装置（図示せず）に於いて、データの保存を行う場合には、ダイジェスト化光強度データが保存される。後の実施例に於いて示される如く、ダイジェスト化光強度データの大きさは、前記の所定幅の時間区間を適当に設定することによって、時系列光強度データの大きさに比して大幅に低減されるので、記憶装置に於ける記憶領域が大幅に節約できることとなる。また、ダイジェスト化光強度データは、コンピュータ１８の表示装置に表示されるようになっていてよい。更に、光強度の測定後、時間を空けて、測定結果の種々の分析・表示をする際に、記憶装置に保存されたダイジェスト化光強度データが読み出されるようになっていてよい。その場合、時系列光強度データの場合よりも、短時間で、データの表示・読込が完了できることとなる。
かくして、上記の本発明によれば、走査分子計数法に於いて、時系列光強度データに於いて、発光粒子の信号の存在しない領域を除去したダイジェスト化光強度データを調製し、かかるダイジェスト化光強度データを、保存、表示、分析の対象となるデータとして用いることにより、記憶領域の節約、種々のデータ処理に於ける処理の負荷、処理時間の低減が図られることとなる。
上記に説明した本発明の有効性を検証するために、以下の如き実験を行った。なお、以下の実施例は、本発明の有効性を例示するものであって、本発明の範囲を限定するものではないことは理解されるべきである。
走査分子計数法による光測定により得られた時系列光強度データから、上記に述べた手法に従って、発光粒子の信号の存在しない領域を除去したダイジェスト化光強度データを調製し、ダイジェスト化光強度データに於いて発光粒子の信号の検出を実行した場合の検出精度の影響、ダイジェスト化によって低減されるデータ量の大きさについて検証した。
試料溶液として、リン酸緩衝液（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含む）中に、発光粒子として蛍光色素ＡＴＴＯ６３３(Sigma-Aldrich, Cat. No. 18620)を１０ｐＭにて含む溶液を調製した。光の測定に於いては、光分析装置として、共焦点蛍光顕微鏡の光学系とフォトンカウンティングシステムを備えた１分子蛍光測定装置ＭＦ２０（オリンパス株式会社）を用い、上記の「（２）試料溶液の光強度の測定」にて説明した態様に従って、上記の試料溶液について、時系列光強度データ（フォトンカウントデータ）を取得した。その際、励起光は、６３３ｎｍのレーザー光を用い、バンドパスフィルターを用いて、６６０−７１０ｎｍの波長帯域の光を測定し、時系列光強度データを生成した。試料溶液中に於ける光検出領域の位置の移動速度は、３０ｍｍ／秒とし、ＢＩＮ ＴＩＭＥを１０μ秒とし、２秒間の測定を行った。この場合、時系列光強度データのレコード数（データ点の数）は、２０万レコード（２／１０×１０−６）となり、概ねデータ量は、約１ＭＢとなった。
図６（Ａ）は、光検出器にて得られた出力を時系列にデータ化した時系列光強度データの一部を示している。同図に於いて、上段は、測定の開始後から５００００μ秒までの１０μ秒毎のフォトンカウント値であり、下段は、測定の開始後から５０００μ秒までの１０μ秒毎のフォトンカウント値を拡大して示している。同図を参照して、本実験の条件に於いては、発光粒子の信号は、フォトンカウント値が１（図中、丸点線）を超えるパルス状の信号であることが分かっている。従って、上段の図から理解される如く、時系列光強度データのうち、実際に発光粒子の信号の出現する領域は、一部であり、それ以外の領域は、不用な領域である。例えば、図６（Ａ）の下段に示した拡大図では、全域に亘ってフォトンカウント値が１を下回っているので、発光粒子の信号の検出に於いて不用な領域である。
そこで、上記のダイジェスト化処理［（ｉ）発光粒子の信号の検出の前にダイジェスト化処理を行う場合］に於いて記載した要領にて、時系列光強度データのダイジェスト化を行った。具体的には、時系列光強度データを２００μ秒の時間区間に分割し、それぞれの時間区間毎に、光強度の特性値として、光子数の総和を算定した。次いで、光子数の総和が５（特性値の閾値）を超える時間区間に対応する領域を選択し、それ以外の時間区間に対応する領域を削除したダイジェスト化光強度データを調製した。図６（Ｂ）の上段は、図６（Ａ）の時系列光強度データをダイジェスト化して得られたダイジェスト化光強度データ（初めから５０００レコード目まで）を示しており、図６（Ｂ）の下段は、上段の拡大図（初めから５００レコード目まで）を示している。図から理解される如く、ダイジェスト化光強度データに於いては、発光粒子の信号の検出のための閾値である１を下回る領域が低減され、従って、発光粒子の信号の検出に於いて不用な領域が低減された。
上記の如くダイジェスト化処理を行って得られたダイジェスト化光強度データを用いて発光粒子の信号の検出を行う場合、発光粒子の信号の検出の精度の低下、即ち、検出できない発光粒子の信号の数が増大することが考えられる。そこで、ダイジェスト化処理に於ける時系列光強度データを分割する際の時間区間の所定幅と特性値のための閾値の発光粒子の信号の検出の精度に対する影響を確認した。
具体的には、時系列光強度データの分割に於ける時間区間の所定幅を、２００μ秒、３００μ秒、５００μ秒、１０００μ秒に設定した場合の各々に於いて、特性値の閾値を０〜２０に設定してダイジェスト化処理を行って得られたダイジェスト化光強度データの各々を用いて、発光粒子の信号の個別検出と信号数のカウンティングを行った。発光粒子の信号の検出は、「（ｂ）発光粒子の信号の個別検出」及び図３（Ｃ）に記載された要領に従って、ダイジェスト化光強度データにスムージング処理を施し、スムージングされたデータに於いて、パルス信号の始点及び終点を決定した後、各パルス信号にガウス関数を最小自乗法によりフィッティングして、（ガウス関数に於ける）ピーク強度、パルス幅（半値全幅）、相関係数を決定した。そして、下記の条件:
２０μ秒＜パルス幅＜４００μ秒
ピーク強度＞１［ｐｃ／１０μｓ］ …（Ａ）
相関係数＞０．９５
を満たすパルス信号のみを発光粒子の信号として抽出した。また、これと共に、時系列光強度データの大きさに対するダイジェスト化光強度データの大きさの割合（データ圧縮率）についても確認した。
下記の表１は、時系列光強度データの分割に於ける時間区間の所定幅（Window Size）を２００μ秒〜１０００μ秒とし、特性値のための閾値（光子数閾値）を５〜２０とした場合のそれぞれについての、検出された発光粒子の信号の数（パルス数）とデータ圧縮率とを示している。なお、光子数閾値＝０のときは、領域の除去を行わない場合である。
Figure 2012141019
上記の表を参照して、所定幅が小さいほど、データ圧縮率が小さくなる、即ち、データ量をより低減できることが示され、本実験例の場合には、所定幅は２００μ秒が最適であった。（本実験例の条件に於いて、発光粒子の光検出領域の通過時間は、約７４μ秒であるので、所定幅が２００μ秒を下回ると、一つの発光粒子の信号が異なる時間区間に亘って出現する可能性が高くなり好ましくないと考えられる。）また、いずれの所定幅の場合も、特性値の閾値（光子数閾値）を増大すると、検出される発光粒子の信号数が低減した。このことは、特性値の閾値は、適切な値に設定すれば、検出される発光粒子の信号数の低減量が許容できる程度に抑えられることを示している。
図７は、上記の表１の所定幅が２００μ秒に設定した場合の特性値の閾値に対する発光粒子の信号の検出数（パルス数）とデータ圧縮率とをそれぞれグラフの型式で表したものである。同図を参照して、閾値を５に設定した際に、データ圧縮率は、１２％程度まで小さくなったが、発光粒子の信号の検出数の低減量は、殆ど見られなかった。一方、閾値を１０以上に設定したときには、データ量は、若干低減する傾向があるが概ね飽和した状態となる一方、発光粒子の信号の検出数は大幅に低減した。このことは、ダイジェスト化処理によって、発光粒子の存在する領域の一部も除去されてしまっていることを示唆する。かくして、本実験例の条件の場合は、時系列光強度データを、所定幅を２００μ秒に設定した時間区間に分割し、特性値の閾値を５に設定することにより、最適な状態にてダイジェスト化処理が実行できることを示している。また、ダイジェスト化処理によって、発光粒子の信号の検出の精度の低下をできるだけ抑えて、データ量を低減することが可能であることが示された。
走査分子計数法による光測定により得られた時系列光強度データに於いて、発光粒子の信号の個別検出を行った後に、ダイジェスト化処理を行って、ダイジェスト化光強度データを調製した。時系列光強度データは、実施例１と同じデータを用い、発光粒子の信号の個別検出は、実施例１と同様に実行した。しかる後、時系列光強度データを所定幅の時間区間に分割し、発光粒子の信号の存在しない領域を除去した。なお、本実施例では、時系列光強度データ上にて発光粒子の信号の検出を行っているので、発光粒子の信号の検出の精度の低下は生じない。
図８は、時間区間の所定幅（ウィンドウサイズ）を変更した場合のデータ圧縮率の変化を示している。同図を参照して、所定幅が小さいほど、データ量は小さくなり、所定幅２００μ秒の場合に、データ圧縮率は、７．８％となった。
かくして、上記の実施例の結果から理解される如く、本発明の教示に従って、走査分子計数法に於いて取得された時系列光強度データから発光粒子の信号の存在しない領域を除去することにより、発光粒子の信号の検出の精度の低下を抑えながら、データ量の低減が可能となる。これにより、記憶装置の記憶容量の節約、データ処理の負荷及び処理時間の低減が図られ、走査分子計数法の利用範囲の拡大が期待される。

Claims (30)

  1. 共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析装置であって、
    前記試料溶液内に於ける前記光学系の光検出領域の位置を移動する光検出領域移動部と、
    前記光検出領域からの光を検出する光検出部と、
    前記試料溶液内に於いて前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出部にて検出された前記光検出領域からの光の時系列の光強度データを生成し、前記時系列の光強度データに於いて前記発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出する信号処理部とを含み、
    前記信号処理部が、前記時系列の光強度データに於ける前記発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない領域を前記時系列の光強度データから除去することを特徴とする装置。
  2. 請求項１の装置であって、前記信号処理部が、前記時系列の光強度データに於いて所定幅の時間区間毎に発光粒子からの光の有無を表す光強度の特性値を算出し、前記特性値を用いて前記発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない時間区間を決定し、前記発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない時間区間に対応する領域を前記時系列の光強度データから除去することを特徴とする装置。
  3. 請求項１又は２の装置であって、前記信号処理部が、前記時系列の光強度データに於ける前記発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない領域を前記時系列の光強度データから除去することにより得られた光強度データ上にて前記発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出することを特徴とする装置。
  4. 請求項１乃至３のいずれかの装置であって、前記信号処理部が、前記時系列の光強度データに於ける前記発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない領域を前記時系列の光強度データから除去することにより得られた光強度データを記憶装置に保存することを特徴とする装置。
  5. 請求項１乃至４のいずれかの装置であって、前記信号処理部が、所定の閾値より大きい強度を有する光を表す信号が検出されたときに１つの発光粒子が前記光検出領域に入ったことを検出することを特徴とする装置。
  6. 請求項１乃至５のいずれかの装置であって、前記光検出領域移動部が前記発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて前記光検出領域の位置を移動することを特徴とする装置。
  7. 請求項１乃至６のいずれかの装置であって、前記光検出領域移動部が前記光学系の光路を変更することにより前記試料溶液内に於いて前記光学系の光検出領域の位置を移動することを特徴とする装置。
  8. 請求項１乃至７のいずれかの装置であって、前記信号処理部が前記検出された発光粒子の数に基づいて、前記試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度を決定することを特徴とする装置。
  9. 請求項２のいずれかの装置であって、前記光検出部がフォトンカウンティングにより前記光検出領域からの光を検出し、前記時系列の光強度データが時系列のフォトンカウントデータであることを特徴とする装置。
  10. 請求項９の装置であって、前記光強度の特性値が、前記所定幅の時間区間に於ける光子数の合計値、光子数の中央値、光子数の平均値、光子数の標準偏差、光子数の分散、光子数のエントロピー、光子数の最大値及び相関時間を０とした光子数の自己相関関数値から算定される粒子数の群の中から選択された値であることを特徴とする装置。
  11. 共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析方法であって、
    前記試料溶液内に於ける前記光学系の光検出領域の位置を移動する過程と、
    前記試料溶液内に於ける前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する過程と、
    前記時系列の光強度データに於ける個々の発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出する過程と
    を含む方法にして、
    前記時系列の光強度データに於ける前記発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない領域を前記時系列の光強度データから除去する過程を含むことを特徴とする方法。
  12. 請求項１１の方法であって、前記時系列の光強度データに於ける前記発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない領域を前記時系列の光強度データから除去する過程に於いて、前記時系列の光強度データに於いて所定幅の時間区間毎に発光粒子からの光の有無を表す光強度の特性値を算出し、前記特性値を用いて前記発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない時間区間を決定し、前記発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない時間区間に対応する領域を前記時系列の光強度データから除去することを特徴とする方法。
  13. 請求項１１又は１２の方法であって、前記時系列の光強度データに於ける個々の発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出する過程に於いて、前記時系列の光強度データに於ける前記発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない領域を前記時系列の光強度データから除去することにより得られた光強度データ上にて前記発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出することを特徴とする方法。
  14. 請求項１１乃至１３のいずれかの方法であって、更に、前記時系列の光強度データに於ける前記発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない領域を前記時系列の光強度データから除去することにより得られた光強度データを記憶装置に保存する過程を含むことを特徴とする方法。
  15. 請求項１１乃至１４のいずれかの方法であって、前記個々の発光粒子からの光を表す信号を個別に検出する過程に於いて、所定の閾値より大きい強度を有する光を表す信号が検出されたときに１つの発光粒子が前記光検出領域に入ったことを検出することを特徴とする方法。
  16. 請求項１１乃至１５のいずれかの方法であって、前記光検出領域の位置を移動する過程に於いて、前記光検出領域の位置が前記発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動されることを特徴とする方法。
  17. 請求項１１乃至１６のいずれかの方法であって、前記光検出領域の位置を移動する過程に於いて、前記光学系の光路を変更することにより前記試料溶液内に於いて前記光学系の光検出領域の位置を移動することを特徴とする方法。
  18. 請求項１１乃至１７のいずれかの方法であって、更に、前記検出された発光粒子の数に基づいて、前記試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度を決定する過程を含むことを特徴とする方法。
  19. 請求項１１乃至１８のいずれかの方法であって、前記光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する過程に於いて、前記光検出領域からの光がフォトンカウンティングにより検出され、前記時系列の光強度データが時系列のフォトンカウントデータであることを特徴とする方法。
  20. 請求項１９の方法であって、前記光強度の特性値が、前記所定幅の時間区間に於ける光子数の合計値、光子数の中央値、光子数の標準偏差、光子数の分散、光子数のエントロピー、光子数の最大値及び相関時間を０とした光子数の自己相関関数値から算定される粒子数の群の中から選択された値であることを特徴とする方法。
  21. 共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出するための光分析用コンピュータプログラムであって、
    前記試料溶液内に於ける前記光学系の光検出領域の位置を移動する手順と、
    前記試料溶液内に於ける前記光検出領域の位置の移動中に前記光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する手順と、
    前記時系列の光強度データに於ける個々の発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出する手順と
    をコンピュータに実行させるコンピュータプログラムにして、
    前記時系列の光強度データに於ける前記発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない領域を前記時系列の光強度データから除去する手順を含むことを特徴とするコンピュータプログラム。
  22. 請求項２１のコンピュータプログラムであって、前記時系列の光強度データに於ける前記発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない領域を前記時系列の光強度データから除去する手順に於いて、前記時系列の光強度データに於いて所定幅の時間区間毎に発光粒子からの光の有無を表す光強度の特性値を算出し、前記特性値を用いて前記発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない時間区間を決定し、前記発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない時間区間に対応する領域を前記時系列の光強度データから除去することを特徴とするコンピュータプログラム。
  23. 請求項２１又は２２のコンピュータプログラムであって、前記時系列の光強度データに於ける個々の発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出する手順に於いて、前記時系列の光強度データに於ける前記発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない領域を前記時系列の光強度データから除去することにより得られた光強度データ上にて前記発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出することを特徴とするコンピュータプログラム。
  24. 請求項２１乃至２３いずれかのコンピュータプログラムであって、更に、前記時系列の光強度データに於ける前記発光粒子の各々からの光を表す信号の存在していない領域を前記時系列の光強度データから除去することにより得られた光強度データを記憶装置に保存する手順をコンピュータに実行させることを特徴とするコンピュータプログラム。
  25. 請求項２１乃至２４のいずれかのコンピュータプログラムであって、個々の発光粒子からの光を表す信号を個別に検出する手順に於いて、所定の閾値より大きい強度を有する光を表す信号が検出されたときに１つの発光粒子が前記光検出領域に入ったことを検出することを特徴とするコンピュータプログラム。
  26. 請求項２１乃至２５のいずれかのコンピュータプログラムであって、前記試料溶液内に於ける前記光学系の光検出領域の位置を移動する手順に於いて、前記光検出領域の位置が前記発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動されることを特徴とするコンピュータプログラム。
  27. 請求項２１乃至２６のいずれかのコンピュータプログラムであって、前記試料溶液内に於ける前記光学系の光検出領域の位置を移動する手順に於いて、前記光学系の光路を変更することにより前記試料溶液内に於いて前記光学系の光検出領域の位置を移動することを特徴とするコンピュータプログラム。
  28. 請求項２１乃至２７のいずれかのコンピュータプログラムであって、更に、前記検出された発光粒子の数に基づいて、前記試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度を決定する手順を含むことを特徴とするコンピュータプログラム。
  29. 請求項２１乃至２８のいずれかの１８のコンピュータプログラムであって、前記光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する手順に於いて、前記光検出領域からの光がフォトンカウンティングにより検出され、前記時系列の光強度データが時系列のフォトンカウントデータであることを特徴とするコンピュータプログラム。
  30. 請求項２９のコンピュータプログラムであって、前記光強度の特性値が、前記所定幅の時間区間に於ける光子数の合計値、光子数の中央値、光子数の標準偏差、光子数の分散、光子数のエントロピー、光子数の最大値及び相関時間を０とした光子数の自己相関関数値から算定される粒子数の群の中から選択された値であることを特徴とするコンピュータプログラム。
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