CN103477210B - 利用单个发光粒子检测的光分析装置、光分析方法以及光分析用计算机程序 - Google Patents

Abstract

提供了在使用通过共焦显微镜或多光子显微镜进行的光测量的扫描分子计数法中减小光强度数据的大小的结构。在本发明的对样本溶液中的发光粒子的光进行检测的光分析技术中，生成一边使显微镜的光检测区域的位置在样本溶液内移动一边检测出的来自光检测区域的光的时序光强度数据，个别地检测时序光强度数据中的发光粒子的信号。此时，特征在于，从按时间序列的光强度数据中去除时序光强度数据中的不存在表示发光粒子的光的信号的区域。

Description

利用单个发光粒子检测的光分析装置、光分析方法以及光分析用计算机程序

技术领域

本发明涉及一种光分析技术，能够使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统等能够检测来自溶液中的微小区域的光的光学系统，检测来自分散或溶解在溶液中的原子、分子或它们的聚合体(以下将它们称为“粒子”)、例如蛋白质、肽、核酸、脂质、糖链、氨基酸或它们的聚合体等生物体分子、病毒、细胞等粒子状的对象物、或非生物学粒子的光，来获取在分析或解析它们的状态(相互作用、结合/离解状态等)时有用的信息，更详细地说，涉及一种能够使用如上所述的光学系统个别检测来自单个发光的粒子的光并进行各种光分析的光分析装置、光分析方法以及光分析用计算机程序。此外，在本说明书中，发光的粒子(以下称为“发光粒子”)可以是其自身发光的粒子、或附加了任意的发光标识或发光探针的粒子，从发光粒子发出的光可以是荧光、磷光、化学发光、生物发光、散射光等。

背景技术

由于近年来的光测量技术的发展，使用共焦显微镜的光学系统和还能够进行光子计数(单光子检测)的超高灵敏度的光检测技术，能够检测/测量单光子或荧光单分子水平的微弱光。因此，提出了各种使用这样的微弱光的测量技术对生物体分子等的特性、分子间相互作用、或结合/离解反应进行检测的装置或方法。例如，在荧光相关光谱分析(Fluorescence CorrelationSpectroscopy：FCS。例如参照专利文献1-3、非专利文献1-3)中，利用激光共焦显微镜的光学系统和光子计数技术，测量来自出入样本溶液中的微小区域(被称为显微镜的激光会聚到的焦点区域-共焦区组织)内的荧光分子或被荧光标识的分子(荧光分子等)的荧光强度，根据由测量得到的该荧光强度的自相关函数的值所确定的在微小区域内的荧光分子等的平均滞留时间(平移扩散时间)和滞留分子的个数的平均值，获取荧光分子等的运动的速度或大小、浓度之类的信息，或检测分子的构造或大小的变化、分子的结合/离解反应或分散/聚合之类的各种现象。另外，在荧光强度分布分析(Fluorescence-IntensityDistribution Analysis：FIDA。例如专利文献4、非专利文献4)、光子计数直方图(Photon Counting Histogram：PCH。例如专利文献5)中，生成与FCS同样地测量出的出入共焦区组织内的荧光分子等的荧光强度的直方图，使统计性的模型公式拟合该直方图的分布，由此估算荧光分子等的固有的亮度的平均值和滞留在共焦区组织内的分子的个数的平均值，根据这些信息估计分子的构造或大小的变化、结合/离解状态、分散/聚合状态等。另外，除此以外，在专利文献6、7中，提出了根据利用共焦显微镜的光学系统测量出的样本溶液的荧光信号的时间经过来检测荧光性物质的方法。专利文献8提出了一种信号运算处理技术，其用于使用光子计数技术测量来自流通于流式细胞仪的荧光微粒子或固定在基板上的荧光微粒子的微弱光，来检测流体中或基板上的荧光微粒子的存在。

特别是，根据FCS、FIDA等使用了利用共焦显微镜的光学系统和光子计数技术进行微小区域的荧光测量的技术的方法，进行测量所需要的样本与以前相比可以是极低浓度且极微量(在一次测量中使用的量至多为几十μL左右)，测量时间也大幅缩短(在一次测量中反复多次进行秒级时间的测量)。因而，期待这些技术特别是在对医学、生物学的研究开发领域中经常使用的稀少或昂贵的样本进行分析的情况下，或在疾病的临床诊断、生理活性物质的筛选等检测体数多的情况下，成为与以前的生物化学方法相比能够廉价或迅速地执行实验或检查的强力工具。

专利文献1：日本特开2005-098876

专利文献2：日本特开2008-292371

专利文献3：日本特开2009-281831

专利文献4：日本专利第4023523号

专利文献5：国际公开2008-080417

专利文献6：日本特开2007-20565

专利文献7：日本特开2008-116440

专利文献8：日本特开平4-337446号公报

非专利文献1：金城政孝,蛋白质核酸酶Vol.44,No.9,1431-1438页1999年

非专利文献2：F.J.Meyer-Alms,荧光相关谱(Fluorescence CorrelationSpectroscopy),R.Rigler编,Springer,柏林,2000年,204-224页

非专利文献3：加藤则子及其他4名,遗传医学,Vol.6,No.2,271-277页

非专利文献4：卡斯柯(Kask)及其他3名,美国科学学院纪要,1999年,96卷,13756-13761页(P.Kask,K.Palo,D.Ullmann,K.Gall PNAS 96,13756-13761(1999))

发明内容

发明要解决的问题

在上述的FCS、FIDA等使用了共焦显微镜的光学系统和光子计数技术的光学分析技术中，所测量的光是从荧光单分子或多分子发出的光，但在该光的分析中，执行时序地测量出的荧光强度数据的自相关函数的运算或对直方图拟合之类的荧光强度的波动的计算等统计性的处理，并非个别地参照或分析来自各个荧光分子等的光的信号。即，在这些光分析技术中，对来自多个荧光分子等的光的信号统计性地进行处理，针对荧光分子等检测统计平均性的特性。因而，为了在这些光分析技术中得到统计上有意义的结果，需要样本溶液中的作为观测对象的荧光分子等的浓度或数密度在平衡状态下为在一次的秒级长度的测量时间内能够进行统计性的处理的个数的荧光分子等出入微小区域内的水平，优选的是在微小区域内始终存在一个左右的荧光分子等的水平。实际上，共焦区组织的体积为1fL左右，因此，在上述的光分析技术中使用的样本溶液中的荧光分子等的浓度典型的是1nM左右或其以上，在大幅低于1nM时，产生在共焦区组织内不存在荧光分子等的时间而无法得到统计上有意义的分析结果。另一方面，在专利文献6～8所记载的荧光分子等的检测方法中，不包括荧光强度的波动的统计性的运算处理，即使样本溶液中的荧光分子等小于1nM也能够检测荧光分子等，但无法定量地计算在溶液中随机运动的荧光分子等的浓度或数密度。

因此，本申请的申请人在日本特愿2010-044714和PCT/JP2011/53481中，提出了基于以下的新原理的光分析技术，能够定量地观测作为观测对象的发光粒子的浓度或数密度低于利用FCS、FIDA等包含统计性处理的光分析技术进行处理的水平的样本溶液中的发光粒子的状态或特性。在所述新的光分析技术中，如果清楚地进行描述，则与FCS、FIDA等同样地，在使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统等能够检测来自溶液中的微小区域的光的光学系统的情况下，一边使作为光的检测区域的微小区域(以下称为“光检测区域”)的位置在样本溶液中移动、即一边通过光检测区域对样本溶液内进行扫描，一边在光检测区域包含在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子时检测从该发光粒子发出的光，由此，能够对样本溶液中的发光粒子逐个地进行个别检测，来获取与发光粒子的计数、样本溶液中的发光粒子的浓度或数密度有关的信息。根据该新的光分析技术(以下称为“扫描分子计数法”)，与FCS、FIDA等光分析技术同样地，进行测量所需要的样本可以是微量的(例如几十μL左右)，另外，测量时间短，并且与FCS、FIDA等光分析技术的情况相比，能够检测更低的浓度或数密度的发光粒子的存在，并定量地检测其浓度、数密度或其它特性。

在上述扫描分子计数法中，更具体地说，将与光检测区域的位置在样本溶液内移动的同时依次测量出的光强度值(或者光子计数值)记录为按时间序列的光强度数据，在该数据上检测存在表示从发光粒子发出的光的强度变化的区域。即，时序光强度数据中的存在有意义的信息的区域是存在表示来自发光粒子的光的强度变化的区域，除此以外的区域是无用的区域。因而，记录并保存不存在有意义的信息的区域、即没有表示来自发光粒子的光的强度变化的区域有可能无用地增大时序光强度数据的大小而无用地使用存储装置的存储容量。而且，样本溶液中的发光粒子浓度越低，时序光强度数据上的没有表示来自发光粒子的光的强度变化的区域越大，因此被无用地使用的存储容量增大。另外，时序光强度数据的数据量的增大使计算机中的数据处理的负荷以及处理时间也增大。

这样，本发明的一个课题在于提出一种在如上所述的扫描分子计数法中能够减少时序光强度数据的数据量的新方法。

另外，本发明的另一个课题在于能够通过减少在如上所述的扫描分子计数法中进行处理的时序光强度数据的数据量来节省用于保存数据的存储容量以及减少数据处理的负荷和处理时间。

用于解决问题的方案

根据本发明的一个方式，通过光分析装置达成上述课题，该光分析装置使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测来自在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子的光，该光分析装置的特征在于，包括：光检测区域移动部，其使光学系统的光检测区域的位置在样本溶液内移动；光检测部，其检测来自光检测区域的光；以及信号处理部，其生成一边使光检测区域的位置在样本溶液内移动一边由光检测部检测出的来自光检测区域的光的按时间序列的光强度数据，在按时间序列的光强度数据中个别地检测表示来自各个发光粒子的光的信号，其中，信号处理部从按时间序列的光强度数据中去除按时间序列的光强度数据中的不存在表示来自各个发光粒子的光的信号的区域。在所述结构中，“在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子”是指在样本溶液中分散或溶解的原子、分子或它们的聚合体等发出光的粒子，如果是不固定在基板等上而自由地在溶液中进行布朗运动的粒子，则可以是任意的粒子。所述发光粒子典型的是荧光性粒子，但也可以是通过磷光、化学发光、生物发光、光散射等来发出光的粒子。共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统的“光检测区域”是指这些显微镜中检测光的微小区域，在从物镜提供照明光的情况下，相当于该照明光会聚到的区域(在共焦显微镜中，特别地根据物镜和针孔之间的位置关系来确定。在发光粒子没有照明光而发光的情况下，例如是通过化学发光或生物发光来发光的粒子的情况下，在显微镜中不需要照明光。)。此外，在本说明书中，在称为“发光粒子的信号”的情况下，只要没有特别限定，是指表示来自发光粒子的光的信号。

如从上述理解的那样，在作为本发明的基本结构的扫描分子计数法中，首先，一边在使光检测区域的位置在样本溶液内移动、即一边通过光检测区域对样本溶液内进行扫描，一边依次进行光的检测。这样，可以期待在样本溶液内移动的光检测区域包含了随机运动的发光粒子时检测到来自发光粒子的光，由此检测一个发光粒子的存在。因而，在依次检测出的光中个别地检测来自发光粒子的光的信号，由此逐个地个别且依次检测粒子的存在，能够获取与粒子在溶液内的状态有关的各种信息。此时，如已经记述的那样，在依次测量出的光强度值的群、即时序光强度数据中，没有表示来自发光粒子的光的强度变化的区域是无用的区域，因此使时序光强度数据的大小无用地增大，并无用地使用存储装置的存储容量，另外，在从时序光强度数据中检测表示来自发光粒子的光的信号的信号处理中，数据处理的负荷和处理时间也可能增大。因此，在本发明中，如上述那样构成为信号处理部执行从按时间序列的光强度数据中去除按时间序列的光强度数据中的不存在表示来自各个发光粒子的光的信号的区域，由此减小时序光强度数据的大小。

在上述的本发明的结构中，时序光强度数据中存在表示来自各个发光粒子的光的信号的区域和不存在表示来自各个发光粒子的光的信号的区域能够根据这些区域中的光强度数据的特性大致区分。即，在时序光强度数据中，在来自发光粒子的光到达光检测部的时间区间，光检测部的输出信号的值呈脉冲状变化，具有与仅产生噪声的来自发光粒子的光未到达的时间区间不同的特性，因此如果参照这样的表示有无来自发光粒子的光的特性，则能够确定时序光强度数据中的不存在表示来自各个发光粒子的光的信号的区域。这样，在本发明的装置中，可以构成为信号处理部针对按时间序列的光强度数据中每个规定宽度的时间区间计算表示有无来自发光粒子的光的光强度的特性值，使用特性值决定不存在表示来自各个发光粒子的光的信号的时间区间，将与不存在表示来自各个发光粒子的光的信号的时间区间对应的区域从按时间序列的光强度数据中去除。

作为上述的表示有无来自发光粒子的光的光强度的特性值，能够采用存在来自发光粒子的光的规定宽度的时间区间中的特性值的大小大于不存在来自发光粒子的光的规定宽度的时间区间中的大小的任意的值。在这种情况下，在光强度的特性值大于规定的阈值时判定为在规定宽度的时间区间存在来自发光粒子的信号。这种特性值例如可以是规定宽度的时间区间内的光强度的累加值、光强度的中央值、光强度的平均值、光强度的标准偏差、光强度的方差、光强度的熵、光强度的最大值以及根据将光强度的自相关函数的相关时间设为0时的值估算的粒子数中的任一个。此外，典型的是，光检测部通过光子计数检测来自光检测区域的光，在这种情况下，按时间序列的光强度数据为按时间序列的光子计数数据。因而，光强度的特性值可以是从规定宽度的时间区间中的光子数的合计值、光子数的中央值、光子数的平均值、光子数的标准偏差、光子数的方差、光子数的熵、光子数的最大值以及根据将相关时间设为0的光子数的自相关函数值估算的粒子数的群中选择的值。

另外，在上述本发明的装置中，从时序光强度数据中去除按时间序列的光强度数据中的不存在表示来自各个发光粒子的光的信号的区域可以在个别地检测按时间序列的光强度数据中的表示来自各个发光粒子的光的信号的处理之前或之后执行。在个别地检测发光粒子的信号的处理之前去除不存在发光粒子的信号的区域的情况下，减少个别地检测发光粒子的信号的处理中的装置的数据处理负荷和处理时间，是有利的。即，在本发明的装置中，可以构成为信号处理部在从按时间序列的光强度数据中去除按时间序列的光强度数据中的不存在表示来自各个发光粒子的光的信号的区域而获得的光强度数据上，个别地检测表示来自各个发光粒子的光的信号。此外，在个别地检测发光粒子的信号的处理之后去除不存在发光粒子的信号的区域的情况下，在确保个别地检测发光粒子的信号的处理的精度方面是有利的。在所有的情况下都可以形成为为了节省存储装置的存储容量，信号处理部能够将通过从按时间序列的光强度数据中去除按时间序列的光强度数据中的不存在表示来自各个发光粒子的光的信号的区域而获得的光强度数据保存到存储装置中。

并且，在本发明的装置的信号处理部的处理中，可以根据按时间序列的信号的形状进行表示来自各个发光粒子的光的信号的个别检测。在实施方式中，典型的是在检测出具有大于规定的阈值的强度的信号时，检测出一个发光粒子进入了光检测区域。

在上述的本发明的装置中，可以根据发光粒子的特性或者样本溶液中的数密度或浓度适当变更样本溶液内的光检测区域的位置的移动速度。如本领域技术人员所理解的那样，从发光粒子检测出光的方式能够根据发光粒子的特性或者样本溶液中的数密度或浓度而变化。特别是当光检测区域的移动速度变快时，从一个发光粒子获得的光量减少，因此优选的是，能够适当地变更光检测区域的移动速度以能够高精度地或高灵敏度地测量来自一个发光粒子的光。

另外，优选的是，将样本溶液内的光检测区域的位置的移动速度设定得比作为检测对象的发光粒子的扩散移动速度(由布朗运动所造成的粒子的平均移动速度)高。如上述说明的那样，本发明的装置对光检测区域通过发光粒子存在的位置时从该发光粒子发出的光进行检测，来个别检测发光粒子。然而，发光粒子由于在溶液中进行布朗运动而随机地移动，在多次出入光检测区域的情况下，导致从一个发光粒子多次检测到(表示该发光粒子的存在的)信号，难以使检测出的信号与一个发光粒子的存在对应起来。因此，如上述那样，将光检测区域的移动速度设定得比发光粒子的扩散移动速度高，由此能够使一个发光粒子对应一个(表示发光粒子的存在的)信号。此外，扩散移动速度因发光粒子的不同而变化，因此，如上所述，优选的是本发明的装置能够根据发光粒子的特性(特别是扩散常数)适当地变更光检测区域的移动速度。

可以通过任意的方式进行样本溶液内的光检测区域的位置的移动。例如可以使用在激光扫描型光学显微镜中所采用的检电镜(Galvano-mirror)等变更显微镜的光学系统的光路来变更光检测区域的位置，或者将光检测区域固定，使样本溶液的位置移动(例如移动显微镜的台等)来移动光检测区域在样本溶液内的位置。可以任意地设定光检测区域的位置的移动路径，例如能够从圆形、椭圆形、矩形、直线以及曲线中选择即可。特别是在变更显微镜的光学系统的光路来变更光检测区域的位置的情况下，光检测区域的移动迅速，并且在样本溶液中实质上不发生机械振动、流体动力的作用，因此作为检测对象的发光粒子不会受到力学作用的影响而能够在稳定的状态下进行光的测量，在这点上是有利的。

在上述的本发明的一个实施方式中，可以对信号的个数进行计数来对包含在光检测区域中的发光粒子的个数进行计数(粒子的计数)。在这种情况下，通过将检测出的发光粒子的个数和光检测区域的位置的移动量组合，能够获得与样本溶液中的被同定的发光粒子的数密度或浓度有关的信息。具体地说，例如可以计算多个样本溶液的数密度或浓度之比，或者计算相对于作为浓度或数密度的基准的标准样本溶液的相对的数密度或浓度之比，或者使用相对于作为浓度或数密度的基准的标准样本溶液的相对的数密度或浓度之比来决定绝对的数密度值或浓度值。或者，通过任意的方法，例如以规定的速度移动光检测区域的位置等，如果确定出光检测区域的位置的移动轨迹的总体积，则能够具体估算发光粒子的数密度或浓度。

通过通用的计算机也能够实现在上述本发明的装置中一边使光检测区域的位置在样本溶液内移动一边进行光检测来个别地检测来自各个发光粒子的信号且能够减小光强度数据的大小的光分析技术的处理。因而，根据本发明的另一个方式，提供一种光分析用计算机程序，用于使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测来自在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子的光，该计算机程序的特征在于，使计算机执行以下步骤：使显微镜的光学系统的光检测区域的位置在样本溶液内移动；在使光检测区域的位置在样本溶液内移动的过程中，检测来自光检测区域的光生成按时间序列的光强度数据；以及个别地检测按时间序列的光强度数据中的每个表示来自各个发光粒子的光的信号；其中，还包括以下步骤：从按时间序列的光强度数据中去除按时间序列的光强度数据中的不存在表示来自各个发光粒子的光的信号的区域。在所述结构中，典型的是，在检测来自光检测区域的光生成按时间序列的光强度数据的步骤中，通过光子计数检测来自光检测区域的光，在这种情况下，按时间序列的光强度数据为按时间序列的光子计数数据。另外，在上述的计算机程序中也同样，可以形成为在个别地检测按时间序列的光强度数据中的每个表示来自各个发光粒子的光的信号的步骤中，在从按时间序列的光强度数据中去除按时间序列的光强度数据中的不存在表示来自各个发光粒子的光的信号的区域而获得的光强度数据上，个别地检测表示来自各个发光粒子的光的信号，还可以形成为通过计算机执行以下步骤：将从按时间序列的光强度数据中去除按时间序列的光强度数据中的不存在表示来自各个发光粒子的光的信号的区域而获得的光强度数据保存到存储装置中。

并且，在上述的计算机程序中也同样，可以形成为在从按时间序列的光强度数据中去除按时间序列的光强度数据中的不存在表示来自各个发光粒子的光的信号的区域的步骤中，针对按时间序列的光强度数据中每个规定宽度的时间区间计算表示有无来自发光粒子的光的光强度的特性值，使用特性值决定不存在表示来自各个发光粒子的光的信号的时间区间，将与不存在表示来自各个发光粒子的光的信号的时间区间对应的区域从按时间序列的光强度数据中去除。具体地说，表示有无来自发光粒子的光的光强度的特性值可以采用规定宽度的时间区间中的光强度的累加值、光强度的中央值、光强度的平均值、光强度的标准偏差、光强度的方差、光强度的熵、光强度的最大值以及根据将相关时间设为0的光强度的自相关函数值估算的粒子数中的任一个。特别是在按时间序列的光强度数据为按时间序列的光子计数数据时，光强度的特性值可以是从规定宽度的时间区间中的光子数的合计值、光子数的中央值、光子数的平均值、光子数的标准偏差、光子数的方差、光子数的熵、光子数的最大值以及根据将相关时间设为0的光子数的自相关函数值估算的粒子数的群中选择的值。

另外，在上述的计算机程序中也同样，可以根据按时间序列的信号的形状进行表示来自各个发光粒子的光的信号的个别检测。在实施方式中，典型的是，可以形成为在检测出具有大于规定的阈值的强度的信号时，检测出一个发光粒子进入了光检测区域。可以根据发光粒子的特性、样本溶液中的数密度或浓度适当变更样本溶液内的光检测区域的位置的移动速度，优选的是，将样本溶液内的光检测区域的位置的移动速度设定得比作为检测对象的发光粒子的扩散移动速度高。可以通过任意的方式进行样本溶液内的光检测区域的位置的移动，优选的是，可以变更显微镜的光学系统的光路或者使样本溶液的位置移动来变更光检测区域的位置。可以任意地设定光检测区域的位置的移动轨迹，例如能够从圆形、椭圆形、矩形、直线以及曲线中选择即可。

并且，在上述的计算机程序中也同样，可以包括以下步骤：对个别检测出的来自发光粒子的信号的个数进行计数来对在光检测区域的位置的移动过程中检测出的发光粒子的个数进行计数；和/或根据检测出的发光粒子的个数来决定样本溶液中的发光粒子的数密度或浓度。

根据上述的本发明的装置或计算机程序，能够实现一边使光检测区域的位置在样本溶液内移动一边进行各个发光粒子的光的检测的光分析方法且实现能够减小光强度数据的大小的新方法。这样，根据本发明，还提供了一种光分析方法，使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测来自在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子的光，该光分析方法的特征在于，包括以下过程：使显微镜的光学系统的光检测区域的位置在样本溶液内移动；一边使光检测区域的位置在样本溶液内移动一边检测来自光检测区域的光，生成按时间序列的光强度数据；以及个别地检测按时间序列的光强度数据中的每个表示来自各个发光粒子的光的信号，其中，该光分析方法还包括以下过程：从按时间序列的光强度数据中去除按时间序列的光强度数据中的不存在表示来自各个发光粒子的光的信号的区域。在所述方法中，典型的是，也可以在检测来自光检测区域的光生成按时间序列的光强度数据的过程中，通过光子计数检测来自光检测区域的光，在这种情况下，按时间序列的光强度数据为按时间序列的光子计数数据。另外，在上述的方法中也同样，可以在个别地检测按时间序列的光强度数据中的每个表示来自各个发光粒子的光的信号的过程中，在从按时间序列的光强度数据中去除按时间序列的光强度数据中的不存在表示来自各个发光粒子的光的信号的区域而获得的光强度数据上，个别地检测表示来自各个发光粒子的光的信号，还可以执行以下过程：将从按时间序列的光强度数据中去除按时间序列的光强度数据中的不存在表示来自各个发光粒子的光的信号的区域而获得的光强度数据保存到存储装置中。

并且，在上述的方法中也同样，可以在从按时间序列的光强度数据中去除按时间序列的光强度数据中的不存在表示来自各个发光粒子的光的信号的区域的过程中，针对按时间序列的光强度数据中每个规定宽度的时间区间计算表示有无来自发光粒子的光的光强度的特性值，使用特性值决定不存在表示来自各个发光粒子的光的信号的时间区间，将与不存在表示来自各个发光粒子的光的信号的时间区间对应的区域从按时间序列的光强度数据中去除。具体地说，表示有无来自发光粒子的光的光强度的特性值可以采用规定宽度的时间区间中的光强度的累加值、光强度的中央值、光强度的平均值、光强度的标准偏差、光强度的方差、光强度的熵、光强度的最大值以及根据将相关时间设为0的光强度的自相关函数值估算的粒子数中的任一个。特别是在按时间序列的光强度数据为按时间序列的光子计数数据时，光强度的特性值可以是从规定宽度的时间区间中的光子数的合计值、光子数的中央值、光子数的平均值、光子数的标准偏差、光子数的方差、光子数的熵、光子数的最大值以及根据将相关时间设为0的光子数的自相关函数值估算的粒子数的群中选择的值。

另外，在上述的方法中也同样，可以根据按时间序列的信号的形状进行表示来自各个发光粒子的光的信号的个别检测。在实施方式中，典型的是，可以在检测出具有大于规定的阈值的强度的信号时，检测为一个发光粒子进入了光检测区域。可以根据发光粒子的特性或者样本溶液中的数密度或浓度适当变更样本溶液内的光检测区域的位置的移动速度，优选的是，将样本溶液内的光检测区域的位置的移动速度设定得比作为检测对象的发光粒子的扩散移动速度高。可以通过任意的方式进行样本溶液内的光检测区域的位置的移动，可以通过变更显微镜的光学系统的光路或者使样本溶液的位置移动来变更光检测区域的位置。可以任意地设定光检测区域的位置的移动轨迹，例如能够从圆形、椭圆形、矩形、直线以及曲线中选择即可。

并且，在上述的方法中也同样，可以包括以下过程：对来自个别检测出的发光粒子的信号的个数进行计数来对在光检测区域的位置的移动过程中检测出的发光粒子的个数进行计数；和/或根据检测出的发光粒子的个数来决定样本溶液中的发光粒子的数密度或浓度。

上述本发明的光分析技术典型地用于分析或解析蛋白质、肽、核酸、脂质、糖链、氨基酸或它们的聚合体等生物体分子、病毒、细胞等粒子状的生物学对象物在溶液中的状态的用途，但是也可以用于分析或解析非生物学粒子(例如原子、分子、胶束(micelles)、金属胶体等)在溶液中的状态，应该理解为这种情况也属于本发明的范围。

发明的效果

总而言之，本发明的光分析技术中，通过在扫描分子计数法中在时序光强度数据上选择性地删除不存在发光粒子的信号的区域，能够减小光强度数据的大小，减少所述光强度数据的分析处理中的负荷、处理时间，并且能够节省用于存储数据的存储容量。如后述的实施方式的说明一栏中详细例示的那样，特别地，使用针对按时间序列的光强度数据中每个规定宽度的时间区间计算出的表示有无来自发光粒子的光的光强度的特性值来决定不存在发光粒子的信号的时间区间，将与不存在表示来自各个发光粒子的光的信号的时间区间对应的区域从按时间序列的光强度数据中去除，根据该方式，根据条件的不同能够将数据量压缩到大约十分之一的程度。这样，根据本发明，由于能够减小光强度数据的大小，因此能够减少保存数据所需的存储装置的存储容量以及降低分析处理所需要的运算能力，还能够实现实施扫描分子计数法所需要的费用的减少，能够期待扩大扫描分子计数法的利用机会。

本发明的其它目的和优点将通过本发明的以下优选实施方式的说明变得清楚。

附图说明

图1的(A)是执行本发明的方法的光分析装置的内部结构的示意图。图1的(B)是共焦区组织(共焦显微镜的观察区域)的示意图。图1的(C)是变更反射镜7的朝向使光检测区域的位置在样本溶液内移动的机构的示意图。图1的(D)是移动微板的水平方向位置来使光检测区域的位置在样本溶液内移动的机构的示意图。

图2的(A)、(B)分别是说明应用本发明的方法的扫描分子计数法中的光检测原理的示意图以及所测量的光强度的时间变化的示意图。图2的(C)是说明从时序光强度数据中删除不存在发光粒子的信号的区域后检测发光粒子的信号时的原理的图。图2的(D)是说明在执行了发光粒子的信号的检测之后从时序光强度数据中删除不存在发光粒子的信号的区域时的原理的图。

图3的(A)、(B)是以流程图的形式表示依照本发明执行的扫描分子计数法的处理过程的图。图3的(C)是以流程图的形式表示在光强度数据上个别地检测发光粒子的信号的方法的一个例子的图。

图4的(A)、(B)分别是表示在发光粒子一边进行布朗运动一边横穿光检测区域时以及在由于以比发光粒子的扩散移动速度快的速度使样本溶液内的光检测区域的位置移动而发光粒子横穿光检测区域时的粒子的运动方式的模型图。图4的(C)是说明用于依照扫描分子计数法根据所测量的时序光强度数据(光子计数的时间变化)检测发光粒子的存在的处理步骤中的检测信号的信号处理过程的例子的图。

图5示出了所测量的光子计数数据的实测例子(直方图表)、对数据进行平滑处理而得到的曲线(虚线)以及在脉冲存在区域拟合的高斯函数(实线)。在图中，附加为“噪声”的信号作为由噪声或异物造成的信号而被忽略。

图6的(A)的上部是由光检测部得到的光强度(光子计数)的时序数据的例子，下部是将上部的开始的一部分放大示出的图。图6的(B)的上部是对图6的(A)的时序光强度数据进行简化处理得到的光强度数据的例子，下部是将上部的开始的一部分放大示出的图。光强度的测量条件参照正文。简化处理是将窗口大小设为200μs、将特性值(光子数和)的阈值设为5。在图中，圆点线表示用于检测发光粒子的信号的阈值(单光子计数)。

图7是表示在对时序光强度数据进行简化处理得到的光强度数据中进行了发光粒子的信号的检测处理时的、针对特性值(光子数和)的阈值的检测脉冲数和数据压缩率的变化的曲线图。

图8是表示在时序光强度数据中进行了发光粒子的信号的检测处理之后进行简化处理得到的光强度数据的、针对窗口大小的数据压缩率的变化的曲线图。

图9是在以往的计算荧光强度的波动的光分析技术中得到的光子计数(光强度)的时间变化的例子，(A)是样本内的粒子的浓度为能够提供足够的测量精度的程度的情况，(B)是样本内的粒子的浓度相比于(A)的情况大幅降低的情况。

附图标记说明

1：光分析装置(共焦显微镜)；2：光源；3：单模光纤(single-mode opticalfiber)；4：准直透镜；5：分色镜；6、7、11：反射镜；8：物镜；9：微板；10：皿(样本溶液容器)；12：聚光镜(condenser lens)；13：针孔；14：屏蔽滤波器；15：多模光纤(multi-mode optical fiber)；16：光检测器；17：反射镜偏转器；17a：台位置变更装置；18：计算机。

具体实施方式

下面，详细说明本发明的优选实施方式。

光分析装置的结构

实现本发明的光分析技术的光分析装置可以是如下的装置：在基本结构中，如图1的(A)示意性地例示那样，组合能够执行FCS、FIDA等的共焦显微镜的光学系统和光检测器而成。参照该图，光分析装置1由光学系统2～17以及用于控制光学系统的各部分的动作并且获取并解析数据的计算机18构成。光分析装置1的光学系统可以与普通的共焦显微镜的光学系统相同，在此，使从光源2发射并在单模光纤3内传播的激光(Ex)在光纤的出射端成为以由固有的NA决定的角度发散的光而被发射，通过准直器4成为平行光，被分色镜5、反射镜6、7反射，入射到物镜8。典型的是在物镜8的上方配置有微板9，该微板9排列有注入了1μL～几十μL的样本溶液的样本容器或皿10，从物镜8射出的激光在样本容器或皿10内的样本溶液中形成焦点，形成光强度强的区域(激励区域)。在样本溶液中分散或溶解有作为观测对象物的发光粒子、典型的是附加有荧光性粒子或荧光色素等发光标识的粒子，当所述发光粒子进入到激励区域时，在其间发光粒子被激励而释放出光。所释放的光(Em)通过物镜8、分色镜5，被反射镜11反射而在聚光镜12聚光，通过针孔13，透过屏蔽滤波器14(在此，只选择特定波长频带的光成分。)，被导入到多模光纤15，到达光检测器16，在被变换为按时间序列的电信号之后输入到计算机18，以后面说明的方式进行用于光分析的处理。此外，如本领域技术人员所了解的那样，针孔13配置在与物镜8的焦点位置共轭的位置，由此仅从如图1的(B)示意性地表示的激光的焦点区域、即激励区域内发出的光通过针孔13，来自激励区域以外的光被遮断。图1的(B)所例示的激光的焦点区域通常是具有1fL～10fL左右的有效体积的本光分析装置中的光检测区域(典型的是光强度以区域中心为顶点的高斯型分布。有效体积是以光强度为1/e2的面为边界的大致椭圆球体的体积。)，被称为共焦区组织。另外，在本发明中，检测来自一个发光粒子的光、例如来自一个荧光色素分子的微弱光，因此作为光检测器16，优选的是使用能够在光子计数中使用的超高灵敏度的光检测器。在光的检测是通过光子计数进行的情况下，以在规定时间内按每个规定的单位时间(BIN TIME)依次测量来到光检测器的光子的个数的方式执行光强度的测量。因而，在这种情况下，按时间序列的光强度的数据是按时间序列的光子计数数据。另外，可以在显微镜的台(未图示)设置用于移动微板9的水平方向位置以变更要观察的皿10的台位置变更装置17a。可以由计算机18控制台位置变更装置17a的动作。根据所述结构，在存在多个检体的情况下也能够达成迅速的测量。

并且，在上述的光分析装置的光学系统中，设置有通过光检测区域扫描样本溶液内的、即用于使焦点区域即光检测区域的位置在样本溶液内移动的机构。作为所述的用于使光检测区域的位置移动的机构，例如图1的(C)示意性地例示的那样，可以采用变更反射镜7的朝向的反射镜偏转器17(移动光检测区域的绝对位置的方式)。所述反射镜偏转器17可以与在通常的激光扫描型显微镜中装备的检电镜装置相同。或者，作为其它的方式，如图1的(D)所例示的那样，也可以使台位置变更装置17a进行动作以移动注入了样本溶液的容器10(微板9)的水平方向的位置，使光检测区域在样本溶液内的相对位置移动(使样本溶液的绝对位置移动的方式)。无论在哪种方式的情况下，都在计算机18的控制下，与光检测器16的光检测协调地驱动反射镜偏转器17或台位置变更装置17a以达成所期望的光检测区域的位置的移动图案。可以从圆形、椭圆形、矩形、直线、曲线或它们的组合中任意地选择光检测区域的位置的移动轨迹(可以设为在计算机18中的程序中能够选择各种移动图案。)。此外，虽然没有图示，但也可以通过使物镜8或台上下移动来使光检测区域的位置在上下方向上移动。

在作为观测对象物的发光粒子通过多光子吸收而发光的情况下，上述光学系统被用作多光子显微镜。在这种情况下，只在激励光的焦点区域(光检测区域)释放光，因此可以去除针孔13。另外，在作为观测对象物的发光粒子不通过激励光而通过化学发光、生物发光现象发光的情况下，可以省略用于生成激励光的光学系统2～5。在发光粒子通过磷光或散射而发光的情况下，能够直接使用上述的共焦显微镜的光学系统。并且，可以在光分析装置1中如图示那样设置多个激励光源2，可以设为能够根据发光粒子的激励波长而适当地选择激励光的波长。同样地，也可以具备多个光检测器16，在样本中包含有波长不同的多种发光粒子的情况下，可以设为能够根据其波长分别检测来自它们的光。

本发明的光分析技术的原理

如“发明内容”一栏所记载的那样，如果清楚地进行描述，则在本发明的光分析技术中，在扫描分子计数法中执行时序光强度数据的大小的减小(简化处理)。下面，说明本发明的扫描分子计数法和时序光强度数据的简化处理的原理。

1．扫描分子计数法的原理

FCS、FIDA等光谱分析技术与现有的生物化学的分析技术相比，其优点在于所需要的样本量极少且能够迅速地执行检查。然而，在FCS、FIDA等光谱分析技术中，在原理上，根据荧光强度的波动来估算发光粒子的浓度、特性，因此为了得到高精度的测量结果，要求如图9的(A)示意性地描绘的那样样本溶液中的发光粒子的浓度或数密度为在测量荧光强度的过程中在光检测区域CV内始终存在一个左右的发光粒子的水平，如该图的右侧所示那样在计量时间中始终检测到有意义的光强度(光子计数)。如果发光粒子的浓度或数密度低于此水平，则例如图9的(B)所描绘的那样，在发光粒子为只是偶尔进入到光检测区域CV内的水平的情况下，如该图的右侧所例示的那样，只在测量时间的一部分出现有意义的光强度的信号(光子计数)，难以估算高精度的光强度的波动。另外，与在测量中在光检测区域内始终存在一个左右的发光粒子的水平相比发光粒子的浓度大幅降低的情况下，在光强度的波动的运算中，容易受到背景的影响，为了得到足够进行运算的量的有意义的光强度数据而测量时间变长。

因此，本申请的申请人在日本特愿2010-044714和PCT/JP2011/53481中，提出了基于新原理的“扫描分子计数法”，即使发光粒子的浓度低于如上所述的在FCS、FIDA等光谱分析技术中要求的水平的情况下，也能够检测发光粒子的数密度或浓度等特性。

作为在扫描分子计数法中执行的处理，如果清楚地描述，则驱动用于使光检测区域的位置移动的机构(反射镜偏转器17)来变更光路，如图2的(A)示意性地描述的那样，一边使光检测区域CV的位置在样本溶液内移动、即一边通过光检测区域CV扫描样本溶液内，一边执行光检测。这样，例如在光检测区域CV移动的期间(图中为时间t0～t2)，在通过存在一个发光粒子的区域时(t1)，从发光粒子释放出光，如在图2的(B)中所描绘的那样，在按时间序列的光强度数据上出现有意义的光强度(Em)的脉冲状的信号。这样，执行上述的光检测区域CV的位置的移动和光检测，逐个地检测其间出现的如图2的(B)所例示的脉冲状的信号(有意义的光强度)，由此个别检测发光粒子，并对其个数进行计数，从而能够获取在所测量的区域内存在的发光粒子的个数、或者与浓度或数密度有关的信息。在所述的扫描分子计数法的原理中，不进行如荧光强度的波动的计算那样的统计性的运算处理，而是逐个地检测发光粒子，因此即使在要观测的粒子的浓度低至无法通过FCS、FIDA等以足够的精度进行分析的程度的样本溶液中，也能够获取与粒子的浓度或数密度有关的信息。

2．时序光强度数据的简化处理的原理

如已经记述的那样，在通过上述的扫描分子计数法由光检测器16经时获取到的光强度的数据(时序光强度数据)中，存在发光粒子的信号的区域是整个区域的一部分，在不存在发光粒子的信号的区域中，只存在因光检测器的热噪声、背景光等引起的噪声。因而，在本发明中，从时序光强度数据中去除时序光强度数据中的不存在发光粒子的信号的区域，能够减小时序光强度数据的大小。此外，在本说明书中，将减小时序光强度数据的大小的处理在下面称为“简化处理”。

(i)在简化处理后进行发光粒子的信号的检测的情况

在时序光强度数据的简化处理的一个方式中，检测在时序光强度数据上不存在发光粒子的信号的区域，调制出从时序光强度数据中去除所述区域后的光强度数据(简化光强度数据)，在简化光强度数据上执行发光粒子的信号的个别检测。具体地说，为了区分存在发光粒子的信号的区域和不存在发光粒子的信号的区域，首先如图2的(C)的上部所示那样，在时序光强度数据上，针对每个规定宽度的时间区间(例如在图中，针对区域A～D的每一个)，使用各时间区间内的光强度值(光子数)计算表示有无来自发光粒子的光的光强度的特性值。如已经提及的那样，在时序光强度数据中，在存在发光粒子的信号的区域存在脉冲状的信号，在不存在发光粒子的信号的区域只有噪声，存在发光粒子的信号的区域和不存在发光粒子的信号的区域在光强度值方面具有互不相同的特性。因而，在时序光强度数据上，针对每个规定宽度的时间区间估算表示有无来自发光粒子的光的任意的光强度的特性值，根据所述特性值，能够决定与不存在发光粒子的信号的区域对应的时间区间。

作为表示有无来自发光粒子的光的光强度的特性值，能够采用存在来自发光粒子的光的规定宽度的时间区间内的特性值的大小大于不存在来自发光粒子的光的规定宽度的时间区间内的大小的任意的值。在这种情况下，在光强度的特性值大于规定的阈值时，判断为在规定宽度的时间区间内存在来自发光粒子的信号。这样的特性值例如可以是规定宽度的时间区间内的光强度的累加值、光强度的中央值、光强度的平均值、光强度的标准偏差、光强度的方差、光强度的熵、光强度的最大值以及根据将光强度的自相关函数的相关时间设为0时的值估算的粒子数中的任一个。此外，典型的是，光检测部通过光子计数检测来自光检测区域的光，在这种情况下，按时间序列的光强度数据为按时间序列的光子计数数据。因而，光强度的特性值可以是从规定宽度的时间区间内的光子数的合计值、光子数的中央值、光子数的平均值、光子数的标准偏差、光子数的方差、光子数的熵、光子数的最大值以及根据将相关时间设为0的光子数的自相关函数值估算的粒子数的群中选择的值。(在图2的(C)中，作为特性值，采用各时间区间内的光子数的总和。)

这样，当决定出各时间区间内的特性值时，参照所述特性值，例如参照特性值是否超过了规定的阈值，来决定在各时间区间是否存在发光粒子的信号，选择性地抽出与存在发光粒子的信号的时间区间对应的区域(在图中，为区域B、D)，如图2的(C)的下部那样，调制出去除了与不存在发光粒子的信号的时间区间对应的区域(图中为区域A、C)的简化光强度数据。然后，在这样调制出的简化光强度数据上，例如以后面详细说明的方式检测发光粒子的信号。根据所述方式，作为发光粒子的信号的检测处理对象的数据大小变小，不需要针对无用的区域进行数据处理，因此能够期待数据处理中的负荷和处理时间的缩短。另外，在将所测量的数据保存到存储装置时，通过保存简化光强度数据，能够节省存储装置的存储容量。

此外，在上述处理中，可以任意地设定时间区间的规定宽度和用于特性值的阈值。然而，如后面的实施例所说明的那样，发光粒子信号的检测精度和数据的压缩率(简化光强度数据的大小/时序光强度数据的大小)根据时间区间的规定宽度和用于特性值的阈值的设定而改变，因此优选的是使用预备实验等的结果来设定为适当的值。

(ii)在发光粒子的信号的检测之后进行简化处理的情况

在时序光强度数据的简化处理的另一个方式中，在时序光强度数据上，首先如图2的(D)的上部示意性地表示的那样，例如在通过包含(如后述那样)吊钟型函数的拟合处理等处理执行了发光粒子的信号的检测之后，去除与不存在发光粒子的信号的时间区间对应的区域，只选择与存在发光粒子的信号的时间区间对应的区域来调制简化光强度数据(参照图2的(D))。在这种情况下，关于发光粒子的信号的检测处理，与(i)的情况相比负荷和处理时间变大，但是通过将所保存的数据形成为简化光强度数据，能够节省存储装置的存储容量。时间区间的规定宽度影响数据的压缩率，因此优选的是使用预备实验等的结果设定为适当的值。(参照后述的实施例)

扫描分子计数法处理操作过程

在依照使用了图1的(A)所例示的光分析装置1的本发明的扫描分子计数法的实施方式中，具体地说，执行以下的处理，(1)包含发光粒子的样本溶液的调制，(2)样本溶液的光强度的测量处理以及(3)测量出的光强度的分析处理。图3示出了以流程图的形式表示的本实施方式中的处理。此外，(A)是在简化处理后进行发光粒子的信号的检测时的处理，(B)表示在发光粒子的信号的检测后进行简化处理时的处理。另外，(C)示出了发光粒子的信号的检测处理的例子。

(1)样本溶液的调制

作为本发明的光分析技术的观测对象物的粒子，如果是溶解的分子等在样本溶液中分散并在溶液中随机运动的粒子，则可以是任意的，例如可以是蛋白质、肽、核酸、脂质、糖链、氨基酸或它们的聚合体等生物体分子、病毒、细胞、或金属胶体、其它非生物学分子等。在作为观测对象物的粒子不是发光的粒子的情况下，使用以任意的方式对作为观测对象物的粒子附加了发光标识(荧光分子、磷光分子、化学、生物发光分子)的粒子。样本溶液典型的是水溶液，但是不限定于此，可以是有机溶剂及其它任意的液体。

(2)样本溶液的光强度的测量(图3的(A)、(B)的步骤10)

本实施方式的利用扫描分子计数法的光分析中的光强度的测量除了在测量过程中驱动反射镜偏转器17或台位置变更装置17a来进行样本溶液内的光检测区域的位置的移动(样本溶液内的扫描)以外，还可以通过与FCS或FIDA中的光强度的测量过程相同的方式执行。在操作处理中，典型的是，在向微板9的皿10注入样本溶液并载置在显微镜的台上后，在使用者向计算机18输入开始测量的指示时，计算机18依照存储在存储装置(未图示)中的程序(使光检测区域的位置在样本溶液内移动的步骤和在光检测区域的位置的移动过程中检测来自光检测区域的光并生成按时间序列的光强度数据的步骤)，开始样本溶液内的光检测区域中的激励光的照射以及光强度的测量。在所述测量中，在依照计算机18的程序的处理动作的控制下，反射镜偏转器17或台位置变更装置17a驱动反射镜7(检电镜)或显微镜的台上的微板9，来执行皿10内的光检测区域的位置的移动，与此同时地，光检测器16将依次检测出的光变换为电信号并发送到计算机18，在计算机18中，通过任意的方式，根据所发送的信号生成按时间序列的光强度数据并保存。此外，典型的是，光检测器16是能够检测单光子的到来的超高灵敏度光检测器，因此在光的检测利用光子计数的情况下，时序光强度数据可以是按时间序列的光子计数数据。

光强度的测量过程中的光检测区域的位置的移动速度是任意地、例如是通过实验或为了符合分析目的而设定的规定的速度。在根据所检测出的发光粒子的个数获取与其数密度或浓度有关的信息的情况下，需要光检测区域所通过的区域的大小或体积，因此以掌握移动距离的方式执行光检测区域的位置的移动。此外，测量过程中的经过时间和光检测区域的位置的移动距离具有比例关系容易解释测量结果，因此优选的是移动速度基本上是固定速度，但是不限定于此。

另外，关于光检测区域的位置的移动速度，为了定量地高精度地执行根据测量出的按时间序列的光强度数据的个别发光粒子的检测、或者发光粒子的个数的计数，优选的是将所述移动速度设定为比发光粒子的随机运动、即布朗运动所引起的移动速度快的值。本发明的光分析技术的观测对象粒子是在溶液中分散或溶解并自由且随机运动的粒子，因此由于布朗运动，位置随着时间而移动。因而，在光检测区域的位置的移动速度比粒子的布朗运动所引起的移动慢的情况下，如图4的(A)示意性地描绘的那样，粒子在区域内随机地移动，由此光强度随机地变化(如已经提及的那样，光检测区域的激励光强度以区域的中心为顶点向外方降低。)，难以确定与各个发光粒子对应的有意义的光强度的变化。因此，优选的是将光检测区域的位置的移动速度设定得比粒子因布朗运动引起的平均移动速度(扩散移动速度)快，使得如图4的(B)所描绘的那样粒子大致直线地横穿光检测区域，由此在按时间序列的光强度数据中，如图4的(C)最上部所例示的那样与各个发光粒子对应的光强度的变化的轮廓大致一致(在发光粒子大致直线地通过光检测区域的情况下，光强度的变化的轮廓与激励光强度分布大致相同。)，而能够容易地确定各个发光粒子与光强度之间的对应。

具体地说，具有扩散系数D的发光粒子由于布朗运动而通过半径Wo的光检测区域(共焦区组织)时所需要的时间Δt根据以下的平均平方位移的关系式，

(2Wo)²=6D·Δt    …(1)

成为

Δt=(2Wo)²/6D    …(2),

因此，发光粒子因布朗运动而移动的速度(扩散移动速度)Vdif大致为

Vdif=2Wo/Δt=3D/Wo    …(3)。

因此，光检测区域的位置的移动速度可以参照所述Vdif设定为与其相比充分快的值。例如在预想观测对象粒子的扩散系数是D=2.0×10^-10m²/s左右的情况下，在设Wo为0.62μm左右时，Vdif为1.0×10^-3m/s，因此，可以将光检测区域的位置的移动速度设定为其10倍以上的15mm/s。此外，在观测对象粒子的扩散系数未知的情况下，可以设定各种光检测区域的位置的移动速度，反复执行用于找到光强度的变化的轮廓为预想的轮廓(典型的是与激励光强度分布大致相同)的条件的预备实验，来决定适合的光检测区域的位置的移动速度。

(3)光强度的分析

当通过上述处理得到时序光强度数据时，在计算机18中，通过依照存储在存储装置中的程序的处理，执行发光粒子的信号的检测、发光粒子的计数、浓度计算等各种分析。另外，如已经记述的那样，特别是在本发明中，在发光粒子的信号的检测之前或之后执行时序光强度数据的简化处理。下面，分别说明(i)在发光粒子的信号检测之前进行简化处理的情况(图3的(A))以及(ii)在发光粒子的信号检测之后进行简化处理的情况(图3的(B))。

(i)在发光粒子的信号检测之前进行简化处理的情况

(a)简化处理(图3的(A)的步骤20)

在发光粒子的信号检测之前进行简化处理时的简化处理中，如已经提及的那样，在通过步骤10获得的时序光强度数据中，针对每个规定宽度的时间区间计算光强度的特性值。作为光强度的特性值，在按时间序列的光强度数据是按时间序列的光子计数数据的情况下，如上所述，可以是从规定宽度的时间区间内的光子数的合计值、光子数的中央值、光子数的平均值、光子数的标准偏差值、光子数的方差值、光子数的熵值、光子数的最大值以及根据将相关时间设为0的光子数的自相关函数值估算的粒子数的群中选择的值。

关于各特性值，更详细地说，光子数的合计值(总和)是规定宽度的时间区间内的光子数的合计值。存在发光粒子的信号的时间区间的合计值与其它时间区间的合计值相比增大了与来自发光粒子的光子数相应的部分，因此在某时间区间的合计值的大小大于规定的阈值时，判断为在该时间区间内存在发光粒子的信号。

光子数的中央值、最大值分别是在规定宽度的时间区间内出现的光子数的中央值、最大值。在发光粒子的光到达光检测器的期间，与只产生通常的噪声的情况相比光子数变大，因此存在发光粒子的信号的时间区间的中央值、最大值也增大。因而，在某时间区间的中央值或最大值的大小大于规定的阈值时，判断为在该时间区间存在发光粒子的信号。

光子数的平均值是规定宽度的时间区间内的光子数的时间平均值。如上述那样，存在发光粒子的信号的时间区间的合计值与其它时间区间的合计值相比增大了与来自发光粒子的光子数相应的部分，因此规定宽度的时间区间内的光子数的时间平均值也增大。因而，在某时间区间的平均值的大小大于规定的阈值时，判断为在该时间区间存在发光粒子的信号。

光子数的标准偏差值、方差值以及熵值分别是规定宽度的时间区间内的光子数的时间平均下的标准偏差值、方差值以及信息量的熵值，是表示在规定宽度的时间区间内出现的光子数的时间变化的偏差程度的特性值。在某时间区间存在发光粒子的信号的情况下，与其它时间区间相比，光子数的时间变化变得剧烈。因而，存在发光粒子的信号的时间区间的光子数的标准偏差值、方差值、熵值与其它时间区间的各值相比增大，因此在某时间区间的各值大于规定的阈值时，判断为在该时间区间存在发光粒子的信号。此外，光子数的熵值是在某时刻(BIN TIME)时的光子数为x个的概率是px时、使用在某时间区间内光子数为x个的时刻的个数ix通过下式给出的值。

-log₂(p0ⁱ⁰·p1ⁱ¹·…·px^ix·…·pnⁱⁿ)    …(4)

通常光子数为x个的概率px为p0>p1>p2>…>px…>pn。只存在噪声的区间的熵值是-log₂(p0ⁱ⁰·p1ⁱ¹·p2ⁱ²)左右，但是在存在发光粒子的信号的区间，为-log₂(p0ⁱ⁰·p1ⁱ¹·p2ⁱ²·p3ⁱ³·p4ⁱ⁴)等，值增大。

规定宽度的时间区间内的根据将相关时间设为0的光子数的自相关函数值估算的粒子数是与该时间区间内的粒子数相当的量。根据FCS的理论，光强度的自相关函数C(τ)通过下式给出

[式1]

$C\left(\mathrm{\τ}\right)=1+\frac{1}{N}{(1+\frac{\mathrm{\τ}}{\mathrm{\τD}})}^{-1}{(1+\frac{\mathrm{\τ}}{{\mathrm{AR}}^2\mathrm{\τD}})}^{-1/2}...\left(5\right)$

(在此，τD是平移扩散时间，AR是结构参数，N是粒子数。)。在上述的式子中，根据相关时间τ=0时的C(0)，粒子数N通过1/(C(0)-1)给出。该粒子数被认为是在每个时间区间出现的粒子数，因此与上述的特性值同样地，在大于规定的阈值时，判断为在该时间区间存在发光粒子的信号。

这样，在时序光强度数据上的各时间区间内估算上述任一个特性值，选择具有超过规定的阈值的特性值的时间区间作为存在发光粒子的信号的区域，将具有低于规定的阈值的特性值的时间区间确定为不存在发光粒子的信号的区域而去除，如图2的(C)下部所例示的那样调制简化光强度数据。

(b)发光粒子的信号的个别检测(参照图3的(A)的步骤30、图3的(C))

当通过上述处理调制简化光强度数据时，执行在所述光强度数据上个别地检测发光粒子的信号的处理。如已经提及的那样，在通过一个发光粒子的光检测区域时的轨迹如图4的(B)所示那样是大致直线状的情况下，与该粒子对应的信号中的、在光强度数据上的光强度的变化具有反映由光学系统决定的光检测区域内的光强度分布的大致吊钟状的轮廓。因而，在扫描分子计数法中，基本上可以在光强度数据上超过适当设定的阈值Ith的光强度值所持续的时间宽度Δτ处于规定的范围时，判断为具有该光强度的轮廓的信号与一个粒子通过光检测区域的情况对应，进行一个发光粒子的检测。而且，光强度不超过阈值、或者时间宽度Δτ不在规定的范围内的信号被判定为噪声或异物的信号。另外，在能够将光检测区域的光强度分布假定为高斯分布，即

I=A·exp(-2t²/a²)    …(6)时，

在使式(6)拟合有意义的光强度的轮廓(能够明确地判断为不是背景的轮廓)而计算出的强度A和宽度a处于规定的范围内时，可以将该光强度的轮廓判定为与一个粒子通过光检测区域的情况对应，进行一个发光粒子的检测。(强度A和宽度a处于规定的范围外的信号被判定为噪声或异物的信号，在其后的分析等中可以忽略。)

在光强度数据上的信号的检测处理的一个例子中，首先，对光强度数据(图4的(C)、最上部“检测结果(未处理)”)进行平滑(平滑化)处理(图3的(C)-步骤110、图4的(C)的中上部“平滑”)。发光粒子所发出的光是概率性地释放的，在微小的时间内可能产生数据值的缺失，因此通过所述平滑处理，能够忽略如上所述的数据值的缺失。例如可以通过移动平均法进行平滑处理。此外，也可以根据获取光强度数据时的光检测区域的位置的移动速度(扫描速度)、BIN TIME，适当地设定执行平滑处理时的参数、例如在移动平均法中进行一次平均的数据个数、移动平均的次数等。

接着，在平滑处理后的时序光强度数据中，为了检测有意义的脉冲状的信号(以下称为“脉冲信号”)所存在的时间区域(脉冲存在区域)，对平滑处理后的光强度数据的时间计算一次微分值(步骤120)。光强度数据的时间微分值如图4的(C)的中下部“时间微分”所例示的那样，在信号值变化的时刻值的变化大，因此通过参照所述时间微分值，能够有利地决定有意义的信号的起点和终点。

然后，在光强度数据上依次检测有意义的脉冲信号(步骤130～160)。具体地说，首先在光强度数据的时间微分值数据上，参照时间微分值依次搜索并决定一个脉冲信号的起点和终点，确定脉冲存在区域(步骤130)。当确定了一个脉冲存在区域时，针对该脉冲存在区域中的平滑后的光强度数据进行吊钟型函数的拟合(图4的(C)的下部“吊钟型函数拟合”)，计算吊钟型函数的脉冲的峰值(最大值)的强度Ipeak、脉冲宽度(半峰全宽)Wpeak、拟合时的(最小二乘法的)相关系数等参数(步骤140)。此外，拟合的吊钟型函数典型的是高斯函数，但也可以是洛仑兹型函数。而且，判断计算出的吊钟型函数的参数是否处于对针对一个发光粒子通过光检测区域时检测出的脉冲信号所描绘的吊钟型轮廓的参数所设想的范围内，即脉冲的峰值强度、脉冲宽度、相关系数是否分别处于规定范围内等(步骤150)。这样，如图5的左边所示那样，将被判断为计算出的吊钟型函数的参数处于针对与一个发光粒子对应的信号设想的范围内的信号判定为是与一个发光粒子对应的信号，由此，检测出一个发光粒子。另一方面，如图5的右边所示那样，计算出的吊钟型函数的参数不在设想的范围内的脉冲信号作为噪声而被忽略。此外，可以在检测发光粒子的信号的同时执行信号数的计数、即发光粒子的计数。

可以在光强度数据的整个区域中反复执行上述步骤130～150的处理中的脉冲信号的搜索和判定(步骤160)。此外，根据光强度数据个别地检测发光粒子的信号的处理不限于上述的步骤，可以通过任意的方法执行。

(ii)在发光粒子的信号检测之后进行简化处理的情况

如图3的(B)所示那样，在发光粒子的信号的检测处理(步骤20)之后执行简化处理(步骤30)的情况下，首先在通过步骤10获得的时序光强度数据中，直接依照例如式(6)的拟合或图3的(C)所示的处理，与上述同样地执行发光粒子的信号的检测。此时，可以在检测发光粒子的信号的同时执行信号数的计数、即发光粒子的计数。然后，选择时序光强度数据中与存在发光粒子的信号的规定宽度的时间区间对应的区域，如图2的(D)示意性地描绘的那样去除不存在发光粒子的信号的时间区间，调制简化光强度数据。

(iii)发光粒子浓度的决定

在对检测出的发光粒子的信号的个数进行计数来决定发光粒子的个数的情况下，如果通过任意的方法估算光检测区域所通过的区域的总体积，则根据其体积值和发光粒子的个数决定样本溶液中的发光粒子的数密度或浓度(步骤40)。

光检测区域所通过的区域的总体积可以根据激励光或检测光的波长、透镜的数值孔径、光学系统的调整状态在理论上进行估算，但是也可以根据通过实验、例如针对发光粒子的浓度已知的溶液(对照溶液)以与要检查的样本溶液的测量相同的条件进行上述所说明的光强度的测量、发光粒子的检测以及计数所检测出的发光粒子的个数和对照溶液的发光粒子的浓度来决定。具体地说，例如当针对发光粒子的浓度C的对照溶液，将对照溶液的发光粒子的检测数设为N时，光检测区域所通过的区域的总体积Vt通过下式给出。

Vt=N/C    …(6)

另外，可以准备发光粒子的浓度不同的多个溶液作为对照溶液，针对多个溶液分别执行测量，采用计算出的Vt的平均值作为光检测区域所通过的区域的总体积Vt。而且，当给出Vt时，发光粒子的计数结果为n的样本溶液的发光粒子的浓度c通过下式给出。

c=n/Vt    …(7)

此外，可以不依据上述的方法而通过任意的方法、例如通过利用FCS、FIDA等给出光检测区域的体积、光检测区域所通过的区域的总体积。另外，在本实施方式的光分析装置中，关于所设想的光检测区域的移动图案，可以针对各种标准的发光粒子将浓度C与发光粒子的个数N之间的关系(式(6))的信息预先存储到计算机18的存储装置中，在装置的使用者实施光分析时能够适当地利用所存储的关系的信息。

(iv)数据的保存、显示、读入

在本发明中，如上述那样，调制从时序光强度数据中去除了不存在发光粒子的信号的区域的简化光强度数据，因此优选的是在计算机18的存储装置(未图示)中进行数据的保存的情况下，保存简化光强度数据。如后面的实施例所示的那样，通过适当地设定上述规定宽度的时间区间，简化光强度数据的大小与时序光强度数据的大小相比大幅降低，因此能够大幅地节省存储装置中的存储区域。另外，可以将简化光强度数据显示在计算机18的显示装置上。并且，可以在测量光强度之后隔开时间进行测量结果的各种分析、显示时，读出保存在存储装置中的简化光强度数据。在这种情况下，与时序光强度数据的情况相比，能够以更短的时间完成数据的显示、读入。

这样，根据上述本发明，在扫描分子计数法中，调制在时序光强度数据中去除了不存在发光粒子的信号的区域的简化光强度数据，并将所述简化光强度数据用作作为保存、显示、分析的对象的数据，由此实现存储区域的节省、各种数据处理中的处理负荷、处理时间的减少。

为了验证上述说明的本发明的有效性，如下那样进行了实验。此外，应该理解为以下的实施例用于例示本发明的有效性，而并不是限定本发明的范围。

实施例1

基于通过扫描分子计数法的测量获得的时序光强度数据，按照上述记述的方法，调制去除了不存在发光粒子的信号的区域的简化光强度数据，验证了在简化光强度数据中执行发光粒子的信号的检测时的对检测精度的影响、通过简化而减少的数据量的大小。

作为样本溶液，调制出在磷酸缓冲液(包含0.05%Tween20)中包含10pM的荧光色素ATTO633(Sigma-Aldrich公司、Cat.No.18620)作为发光粒子的溶液。在光的测量中，作为光分析装置，利用具备共焦荧光显微镜的光学系统和光子计数系统的单分子荧光测量装置MF20(奥林巴斯株式会社)，依照在上述的“(2)样本溶液的光强度的测量”中所说明的方式，针对上述样本溶液获取了时序光强度数据(光子计数数据)。此时，激励光使用633nm的激光，利用带通滤波器测量660nm-710nm的波长频带的光并生成时序光强度数据。将样本溶液中的光检测区域的位置的移动速度设为30mm/秒，将BIN TIME设为10μs，进行了两秒钟的测量。在这种情况下，时序光强度数据的记录数(数据点的个数)为20万条记录(2/10×10^-6)，大致数据量大约为1MB。

图6的(A)示出了将由光检测器获得的输出按时间序列进行数据化后的时序光强度数据的一部分。在该图中，上部是测量开始后直到50000μs为止的每10μs的光子计数值，下部放大示出了测量开始后直到5000μs为止的每10μs的光子计数值。参照该图可知，在本实验的条件下，发光粒子的信号是光子计数值超过1(图中的圆点线)的脉冲状的信号。因而，如从上部的图中理解的那样，时序光强度数据中的发光粒子的信号实际出现的区域是一部分，除此以外的区域是无用的区域。例如在图6的(A)的下部所示的放大图中，整个区域的光子计数值都低于1，因此在发光粒子的信号检测中是无用的区域。

因此，以上述的简化处理[(i)在发光粒子的信号的检测之前进行简化处理的情况]所记载的要点进行了时序光强度数据的简化。具体地说，将时序光强度数据分割为200μs的时间区间，针对各个时间区间估算光子数的总和作为光强度的特性值。接着，调制出选择了与光子数的总和超过5(特性值的阈值)的时间区间对应的区域、删除了与除此以外的时间区间对应的区域的简化光强度数据。图6的(B)的上部示出了对图6的(A)的时序光强度数据进行简化得到的简化光强度数据(从最初到第5000条记录)，图6的(B)的下部示出了上部的放大图(从最初到第500条记录)。如从图中理解的那样，在简化光强度数据中，低于用于检测发光粒子的信号的阈值1的区域减少，因而在发光粒子的信号的检测中减少了无用的区域。

在使用如上述那样进行简化处理得到的简化光强度数据进行发光粒子的信号的检测的情况下，认为发光粒子的信号的检测精度下降、即无法检测的发光粒子的信号的个数增加。因此，确认了将简化处理中的时序光强度数据进行分割时的时间区间的规定宽度和用于特性值的阈值对发光粒子的信号的检测精度的影响。

具体地说，在将分割时序光强度数据时的时间区间的规定宽度设定为200μs、300μs、500μs、1000μs的各个情况中，使用将特性值的阈值设定为0～20进行简化处理而得到的各个简化光强度数据，进行了发光粒子的信号的个别检测和信号数的计数。关于发光粒子的信号的检测，按照“(b)发光粒子的信号的个别检测”以及图3的(C)所记载的要点，对简化光强度数据实施平滑处理，在平滑后的数据中决定脉冲信号的起点和终点，之后通过最小二乘法使高斯函数拟合各脉冲信号，决定(高斯函数中的)峰值强度、脉冲宽度(半峰全宽)、相关系数。然后，只抽出满足下述的条件的脉冲信号作为发光粒子的信号，

20μs<脉冲宽度<400μs

峰值强度>1[pc/10μs]  …(A)

相关系数>0.95。

另外，与此同时也确认了简化光强度数据的大小相对于时序光强度数据的大小的比例(数据压缩率)。

下述的表1示出了将分割时序光强度数据时的时间区间的规定宽度(Window Size：窗口大小)设为200μs～1000μs、将用于特性值的阈值(光子数阈值)设为5～20的各个情况的、所检测出的发光粒子的信号的个数(脉冲数)和数据压缩率。此外，光子数阈值=0时是不进行区域去除的情况。

[表1]

参照上述表，示出了规定宽度越小、数据压缩率越小，即能够进一步减少数据量，在本实验例的情况下，规定宽度为200μs最佳。(在本实验例的条件下，发光粒子的光检测区域的通过时间大约为74μs，因此当规定宽度低于200μs时，认为一个发光粒子的信号在不同的时间区间出现的可能性变高而不理想。)另外，在任意规定宽度的情况下，当增大特性值的阈值(光子数阈值)时，检测出的发光粒子的信号数都减少。该情况表示如果将特性值的阈值设定为合适的值则检测出的发光粒子的信号数的减少量被抑制为能够容许的程度。

图7是以图表的形式分别表示上述表1的规定宽度被设定为200μs时的针对特性值的阈值的发光粒子的信号的检测数(脉冲数)和数据压缩率的图。参照该图，在将阈值设定为5时，数据压缩率变小到12%左右，但是几乎没有发现发光粒子的信号的检测数的减少量。另一方面，在将阈值设定为10以上时，数据量具有少许减少的倾向而形成为大致饱和的状态，另一方面发光粒子的信号的检测数大幅减少。该情况暗示了通过简化处理而存在发光粒子的区域的一部分也被去除。这样，在本实验例的条件的情况下，将时序光强度数据分割为规定宽度被设定为200μs的时间区间，将特性值的阈值设定为5，由此能够以最佳的状态执行简化处理。另外，还示出了通过简化处理能够尽可能地抑制发光粒子的信号的检测精度的下降，减少数据量。

实施例2

在通过扫描分子计数法的光测量获得的时序光强度数据中，在进行发光粒子的信号的个别检测之后进行简化处理，调制出简化光强度数据。时序光强度数据使用与实施例1相同的数据，与实施例1同样地执行发光粒子的信号的个别检测。然后，将时序光强度数据分割为规定宽度的时间区间，去除了不存在发光粒子的信号的区域。此外，在本实施例中，在时序光强度数据上进行了发光粒子的信号的检测，因此不产生发光粒子的信号的检测精度的下降。

图8示出了变更时间区间的规定宽度(窗口大小)时的数据压缩率的变化。参照该图，规定宽度越小，数据量越小，在规定宽度200μs的情况下，数据压缩率为7.8%。

这样，如从上述实施例的结果理解的那样，按照本发明的指导，通过从在扫描分子计数法中获取到的时序光强度数据中去除不存在发光粒子的信号的区域，能够在抑制发光粒子的信号的检测精度下降的同时减少数据量。由此，实现存储装置的存储容量的节省、数据处理的负荷以及处理时间的减少，期待扫描分子计数法的利用范围的扩大。

Claims (20)

1.一种光分析装置，使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测来自在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子的光，该光分析装置的特征在于，包括：

光检测区域移动部，其使上述光学系统的光检测区域的位置在上述样本溶液内移动；

光检测部，其检测来自上述光检测区域的光；以及

信号处理部，其生成一边使上述光检测区域的位置在上述样本溶液内移动一边由上述光检测部检测出的来自上述光检测区域的光的按时间序列的光强度数据，在上述按时间序列的光强度数据中个别地检测表示来自各个上述发光粒子的光的信号，

其中，上述信号处理部从上述按时间序列的光强度数据中去除上述按时间序列的光强度数据中的不存在表示来自各个上述发光粒子的光的信号的区域。

2.根据权利要求1所述的光分析装置，其特征在于，

上述信号处理部针对上述按时间序列的光强度数据中每个规定宽度的时间区间计算表示有无来自发光粒子的光的光强度的特性值，使用上述特性值决定不存在表示来自各个上述发光粒子的光的信号的时间区间，将与不存在表示来自各个上述发光粒子的光的信号的时间区间对应的区域从上述按时间序列的光强度数据中去除。

3.根据权利要求1或2所述的光分析装置，其特征在于，

上述信号处理部在通过从上述按时间序列的光强度数据中去除上述按时间序列的光强度数据中的不存在表示来自各个上述发光粒子的光的信号的区域而获得的光强度数据上，个别地检测表示来自各个上述发光粒子的光的信号。

4.根据权利要求1或2所述的光分析装置，其特征在于，

上述信号处理部将通过从上述按时间序列的光强度数据中去除上述按时间序列的光强度数据中的不存在表示来自各个上述发光粒子的光的信号的区域而获得的光强度数据保存到存储装置中。

5.根据权利要求1或2所述的光分析装置，其特征在于，

上述信号处理部在检测出具有大于规定的阈值的强度的表示光的信号时，检测出一个发光粒子进入了上述光检测区域。

6.根据权利要求1或2所述的光分析装置，其特征在于，

上述光检测区域移动部使上述光检测区域的位置以比上述发光粒子的扩散移动速度快的速度移动。

7.根据权利要求1或2所述的光分析装置，其特征在于，

上述光检测区域移动部通过变更上述光学系统的光路来使上述光学系统的光检测区域的位置在上述样本溶液内移动。

8.根据权利要求1或2所述的光分析装置，其特征在于，

上述信号处理部根据检测出的上述发光粒子的个数来决定上述样本溶液中的发光粒子的数密度或浓度。

9.根据权利要求2所述的光分析装置，其特征在于，

上述光检测部通过光子计数检测来自上述光检测区域的光，上述按时间序列的光强度数据是按时间序列的光子计数数据。

10.根据权利要求9所述的光分析装置，其特征在于，

上述光强度的特性值是从上述规定宽度的时间区间内的光子数的合计值、光子数的中央值、光子数的平均值、光子数的标准偏差、光子数的方差、光子数的熵、光子数的最大值以及根据将相关时间设为0的光子数的自相关函数值估算的粒子数的群中选择的值。

11.一种光分析方法，使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测来自在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子的光，该光分析方法的特征在于，包括以下过程：

使上述光学系统的光检测区域的位置在上述样本溶液内移动；

一边使上述光检测区域的位置在上述样本溶液内移动一边检测来自上述光检测区域的光，生成按时间序列的光强度数据；以及

个别地检测上述按时间序列的光强度数据中的每个表示来自各个发光粒子的光的信号，

其中，该光分析方法还包括以下过程：从上述按时间序列的光强度数据中去除上述按时间序列的光强度数据中的不存在表示来自各个上述发光粒子的光的信号的区域。

12.根据权利要求11所述的光分析方法，其特征在于，

在从上述按时间序列的光强度数据中去除上述按时间序列的光强度数据中的不存在表示来自各个上述发光粒子的光的信号的区域的过程中，针对上述按时间序列的光强度数据中每个规定宽度的时间区间计算表示有无来自发光粒子的光的光强度的特性值，使用上述特性值决定不存在表示来自各个上述发光粒子的光的信号的时间区间，将与不存在表示来自各个上述发光粒子的光的信号的时间区间对应的区域从上述按时间序列的光强度数据中去除。

13.根据权利要求11或12所述的光分析方法，其特征在于，

在个别地检测上述按时间序列的光强度数据中的每个表示来自各个发光粒子的光的信号的过程中，在通过从上述按时间序列的光强度数据中去除上述按时间序列的光强度数据中的不存在表示来自各个上述发光粒子的光的信号的区域而获得的光强度数据上，个别地检测表示来自各个上述发光粒子的光的信号。

14.根据权利要求11或12所述的光分析方法，其特征在于，

还包括以下过程：将通过从上述按时间序列的光强度数据中去除上述按时间序列的光强度数据中的不存在表示来自各个上述发光粒子的光的信号的区域而获得的光强度数据保存到存储装置中。

15.根据权利要求11或12所述的光分析方法，其特征在于，

在个别地检测表示来自各个上述发光粒子的光的信号的过程中，在检测出具有大于规定的阈值的强度的表示光的信号时，检测出一个发光粒子进入了上述光检测区域。

16.根据权利要求11或12所述的光分析方法，其特征在于，

在使上述光检测区域的位置移动的过程中，使上述光检测区域的位置以比上述发光粒子的扩散移动速度快的速度移动。

17.根据权利要求11或12所述的光分析方法，其特征在于，

在使上述光检测区域的位置移动的过程中，通过变更上述光学系统的光路来使上述光学系统的光检测区域的位置在上述样本溶液内移动。

18.根据权利要求11或12所述的光分析方法，其特征在于，

还包括以下过程：根据检测出的上述发光粒子的个数来决定上述样本溶液中的发光粒子的数密度或浓度。

19.根据权利要求12所述的光分析方法，其特征在于，

在检测来自上述光检测区域的光生成按时间序列的光强度数据的过程中，通过光子计数检测来自上述光检测区域的光，上述按时间序列的光强度数据是按时间序列的光子计数数据。

20.根据权利要求19所述的光分析方法，其特征在于，

上述光强度的特性值是从上述规定宽度的时间区间内的光子数的合计值、光子数的中央值、光子数的标准偏差、光子数的方差、光子数的熵、光子数的最大值以及根据将相关时间设为0的光子数的自相关函数值估算的粒子数的群中选择的值。