CN103229042B - 利用单个发光粒子的光的波长特性的光分析装置和光分析方法 - Google Patents

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Abstract

按照本发明的使用利用共焦显微镜或多光子显微镜进行光计量的扫描分子计数法对来自发光粒子的光进行检测并分析的技术的特征在于，一边通过变更显微镜的光学系统的光路来使光学系统的光检测区域的位置在样本溶液内移动，一边检测来自光检测区域的光的多个波长频带的成分的强度，在检测出的光的多个波长频带的成分的强度中个别地检测来自各个发光粒子的光的信号，根据检测出的发光粒子的光的信号的多个波长频带的成分的强度来识别发光粒子的种类。

Description

利用单个发光粒子的光的波长特性的光分析装置和光分析方法
技术领域
本发明涉及一种光分析装置和方法，能够使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统等可检测来自溶液中的微小区域的光的光学系统检测来自分散或溶解在溶液中的原子、分子或它们的聚合体(以下将它们称为“粒子”)、例如蛋白质、肽、核酸、脂质、糖链、氨基酸或它们的聚合体等生物体分子、病毒、细胞等粒子状的对象物、或非生物学粒子的光，来获取在分析或解析它们的状态(相互作用、结合/离解状态等)时有用的信息，更详细地说，涉及一种能够使用如上所述的光学系统个别检测来自单个发光的粒子的光并进行各种光分析的装置和方法。此外，在本说明书中，发出光的粒子(以下称为“发光粒子”)可以是其自身发出光的粒子以及附加了任意的发光标识或发光探针的粒子中的任意一个，从发光粒子发出的光可以是荧光、磷光、化学发光、生物发光等。
背景技术
由于近年来的光计量技术的发展，使用共焦显微镜的光学系统和还能够进行光子计数(单光子检测)的超高灵敏度的光检测技术，能够检测/测量单光子或荧光单分子水平的微弱光。因此，提出了各种使用这样的微弱光的计量技术对生物体分子等的特性、分子间相互作用或结合/离解反应进行检测的装置或方法。例如，在荧光相关光谱分析(FluorescenceCorrelationSpectroscopy：FCS。例如参照专利文献1-3、非专利文献1-3)中，利用激光共焦显微镜的光学系统和光子计数技术，测量来自出入样本溶液中的微小区域(被称为显微镜的激光会聚到的焦点区域-共焦区组织)内的荧光分子或被进行了荧光标识的分子(荧光分子等)的荧光强度，根据由进行该测量得到的荧光强度的自相关函数的值所确定的荧光分子等在微小区域内的平均滞留时间(平移扩散时间)和滞留的分子的个数的平均值，来获取荧光分子等的运动的速度或大小、浓度之类的信息，或检测分子的构造或大小的变化、分子的结合/离解反应或分散/聚合之类的各种现象。另外，在荧光强度分布分析(Fluorescence-IntensityDistributionAnalysis：FIDA。例如专利文献4、非专利文献4)、光子计数直方图(PhotonCountingHistogram：PCH。例如专利文献5)中，生成与FCS同样地计量出的出入共焦区组织内的荧光分子等的荧光强度的直方图，使统计性的模型公式拟合该直方图的分布，由此估算荧光分子等的固有的亮度的平均值和滞留在共焦区组织内的分子的个数的平均值，根据这些信息估计分子的构造或大小的变化、结合/离解状态、分散/聚合状态等。另外，除此以外，在专利文献6、7中，提出了根据利用共焦显微镜的光学系统计量出的样本溶液的荧光信号的时间经过来检测荧光性物质的方法。专利文献8提出了一种信号运算处理技术，其用于使用光子计数技术计量来自流通于流式细胞仪的荧光微粒子或固定在基板上的荧光微粒子的微弱光，来检测流体中或基板上的荧光微粒子的存在。
特别是，根据FCS、FIDA等使用了利用共焦显微镜的光学系统和光子计数技术的微小区域的荧光测量技术的方法，进行测量所需要的样本与以前相比可以是极低浓度且极微量(在一次测量中使用的量至多为几十μL左右)，测量时间也大幅缩短(在一次测量中多次反复进行秒级时间的计量)。因而，期待这些技术特别是在对医学、生物学的研究开发领域中经常使用的稀少或昂贵的样本进行分析的情况下，或在疾病的临床诊断、生理活性物质的筛选等检体数多的情况下，成为与以前的生物化学方法相比能够廉价或迅速地执行实验或检查的强力工具。
专利文献1：日本特开2005-098876
专利文献2：日本特开2008-292371
专利文献3：日本特开2009-281831
专利文献4：专利第4023523号
专利文献5：国际公开2008-080417
专利文献6：日本特开2007-20565
专利文献7：日本特开2008-116440
专利文献8：日本特开平4-337446号公报
非专利文献1：金城政孝、蛋白质核酸酶Vol.44、No.9、1431-1438页1999年
非专利文献2：F.J.Meyer-Alms、荧光相关谱(FluorescenceCorrelationSpectroscopy)、R.Rigler编、Springer、柏林、2000年、204-224页
非专利文献3：加藤则子及其他4名、遗传医学、Vol.6、No.2、271-277页
非专利文献4：卡斯柯(Kask)及其他3名、美国科学学院纪要、1999年、96卷、13756-13761页(P.Kask,K.Palo,D.Ullmann,K.GallPNAS96,13756-13761(1999))
发明内容
发明要解决的问题
在上述的FCS、FIDA等使用了共焦显微镜的光学系统和光子计数技术的光学分析技术中，所计量的光是从荧光单分子或多分子发出的光，但在该光的解析中，执行按时间序列测量出的荧光强度数据的自相关函数的运算或对直方图拟合之类的荧光强度的波动的计算等统计性的处理，并非个别地参照或分析来自各个荧光分子等的光的信号。即，在这些光分析技术中，对来自多个荧光分子等的光的信号统计性地进行处理，针对荧光分子等检测统计平均性的特性。因而，为了在这些光分析技术中得到统计上有意义的结果，样本溶液中的作为观测对象的荧光分子等的浓度或数密度需要是在平衡状态下在一次秒级长度的计量时间内能够进行统计性处理的个数的荧光分子等出入微小区域内的水平，优选的是在微小区域内始终存在一个左右的荧光分子等的水平。实际上，共焦区组织的体积为1fL左右，因此，在上述的光分析技术中使用的样本溶液中的荧光分子等的浓度典型地是1nM左右或其以上，在大幅低于1nM时，产生在共焦区组织内不存在荧光分子等的时间而无法得到统计上有意义的分析结果。另一方面，在专利文献6～8所记载的荧光分子等的检测方法中，不包括荧光强度的波动的统计性的运算处理，即使样本溶液中的荧光分子等小于1nM也能够对荧光分子等进行检测，但无法达成定量地计算出在溶液中随机运动的荧光分子等的浓度或数密度之类的内容。
因此，本申请的申请人在日本特愿2010-044714和PCT/JP2011/53481中，提出了基于以下的新原理的光分析技术，即能够定量地观测作为观测对象的发光粒子的浓度或数密度低于利用FCS、FIDA等包含统计性处理的光分析技术进行处理的水平的样本溶液中的发光粒子的状态或特性。在所述新的光分析技术中，如果清楚地进行描述，则与FCS、FIDA等同样地，在使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统等能够检测来自溶液中的微小区域的光的光学系统的情况下，一边使作为光的检测区域的微小区域(以下称为“光检测区域”)的位置在样本溶液内移动、即一边通过光检测区域对样本溶液内进行扫描，一边在光检测区域中包含在样本溶液中分散且随机地运动的发光粒子时检测从该发光粒子发出的光，由此，能够对样本溶液中的发光粒子逐个地进行个别检测，来获取与发光粒子的计数、样本溶液中的发光粒子的浓度或数密度有关的信息。根据该新的光分析技术(以下称为“扫描分子计数法”)，与FCS、FIDA等光分析技术同样地，进行测量所需的样本可以是微量的(例如几十μL左右)，另外，测量时间短，并且与FCS、FIDA等光分析技术的情况相比，能够检测更低浓度或数密度的发光粒子的存在，定量地检测其浓度、数密度或其它特性。
另外，一般来说对发光粒子或作为观测对象的粒子附加的发光标识分别具有固有的发光波长特性(发光光谱)，因此如果以捕捉各发光粒子或发光标识的发光波长特性的特征的方式对来自发光粒子或发光标识的光进行检测，则能够识别发光粒子或发光标识的种类。因而，在上述扫描分子计数法中，如果以能够检测发光粒子的发光波长特性的特征的方式对来自发光粒子的光进行检测，则能够识别被个别检测出的各个单个发光粒子的种类，这一点是有利的。
这样，本发明的主要课题在于，为了进一步扩展在上述的日本特愿2010-044714以及PCT/JP2011/53481中提出的新的光分析技术，而特别提供一种通过对检测出的单个发光粒子的发光波长特性的特征进行检测而能够识别单个发光粒子的种类的新的光分析装置和方法。
用于解决问题的方案
根据本发明，通过以下的装置达成上述的课题，该装置是一种光分析装置，其使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测来自在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子的光并进行分析，该光分析装置的特征在于，包括：光检测区域移动部，其通过变更显微镜的光学系统的光路，使光学系统的光检测区域的位置在样本溶液内移动；光检测部，其检测来自光检测区域的光的多个波长频带的成分的强度；以及信号处理部，其在一边使光检测区域的位置在样本溶液内移动一边由光检测部检测出的光的多个波长频带的成分的强度中个别检测来自各个发光粒子的光的信号，根据检测出的发光粒子的光的信号的多个波长频带的成分的强度来识别检测出的发光粒子的种类。在所述结构中，“在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子”是指在样本溶液中分散或溶解的原子、分子或它们的聚合体等发出光的粒子，只要是不固定在基板等上而在溶液中自由地进行布朗运动的粒子，就可以是任意的粒子。所述发光粒子典型地是荧光性粒子，但也可以是通过磷光、化学发光、生物发光等而发出光的粒子。共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统的“光检测区域”是指在这些显微镜中检测光的微小区域，在从物镜提供照明光的情况下，相当于该照明光会聚到的区域(在共焦显微镜中，特别地根据物镜和针孔之间的位置关系来确定。在发光粒子不通过照明光而进行发光的情况下、例如在是通过化学发光或生物发光进行发光的粒子的情况下，在显微镜下不需要照明光。)。此外，在本说明书中，在称为“信号”时，只要没有特别限定，是指表示来自发光粒子的光的信号。
在上述本发明的装置中，与扫描分子计数法同样地，在基本的结构中一边使光检测区域的位置在样本溶液内移动、即一边通过光检测区域对样本溶液内进行扫描，一边依次进行来自光检测区域的光的检测。这样，在移动的光检测区域包含随机运动的发光粒子时，检测出来自发光粒子的光，由此检测出一个发光粒子的存在。在所述结构中，本发明特别地测量来自光检测区域的光中的多个波长频带的成分的强度。如已经记述的那样，发光粒子或对作为观测对象的粒子付加的发光标识分别具有固有的发光波长特性，如果参照所发出的光中的多个波长频带的成分的强度则能够掌握所述发光波长特性的特征，因此能够根据如上述那样测量出的多个波长频带的成分的强度来识别并确定各个发光粒子的种类。这样，根据所述结构，如果发光粒子进入光检测区域的移动路径，则能够根据其发光波长特性的特征来个别识别发光粒子或发光标识的种类，而且，即使在样本溶液中的发光粒子浓度低于通过FCS、FIDA等光分析技术获得良好的测量结果所需要的水平的情况下，也能够进行这样的发光粒子的检测及其种类的识别，在这一点上是有利的。
在上述结构中，更具体地说，通过参照多个波长频带的成分的强度的分布比例或强度之比，能够识别发光粒子的种类。因此，在一个实施方式中，信号处理部也可以构成为根据发光粒子的光的信号的多个波长频带的成分的强度之比来识别发光粒子的种类。此外，从光检测中的波长选择、信号处理的容易性方面考虑，要检测的波长频带少是有利的，因此上述本发明的装置典型地可以构成为光检测部检测来自光检测区域的光的两个波长频带的成分的强度，信号处理部根据两个波长频带的成分的强度之比来识别发光粒子的种类。要检测的波长频带可以考虑作为观测对象的发光粒子或发光标识的发光波长特性、检测灵敏度等来适当地选择以能够尽可能显著地掌握发光波长特性的特征。
另外，特别是在发光粒子是通过激励光的照射而发光的粒子的情况下，在装置中设置用于向光检测区域照射激励光的光照射部时，在该情况下可以是光照射部照射一个波长频带的激励光，光检测部对通过所述一个波长频带的激励光的照射而发出的来自光检测区域的光的多个波长频带的成分的强度进行检测。通常在共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统中进行光的测量时，装置被设定成针对一个波长频带的激励光的照射来检测一个波长频带的光，在对多个种类的发光粒子的光的种类进行识别并且对该光进行测量的情况下，执行多个波长频带的激励光的照射。在这种情况下，使波长频带互不相同的激励光的聚光区域一致以及调整多个波长频带的激励光的强度的均衡是比较困难的，因而基于多个波长频带的成分的强度决定表示发光粒子的发光波长特性的特征的值的处理变得繁杂(需要用于对激励光的聚光区域的位置偏移进行校正的处理、用于对激励光的强度的均衡进行校正的处理等。)。然而，如果激励光是一个波长频带的光，则能够使表示发光粒子的发光波长特性的特征的值的决定处理变得简单，从而是有利的。另外，在照射一个波长频带的激励光的情况下，依赖于发光粒子的激励波长特性而有可能发光强度变得比较低，但是在本发明的情况下，由于参照发光粒子的发光波长特性的特征(更具体地说，发光粒子的光中的多个波长频带的成分的强度的分布比例)来识别发光粒子的种类，因此应该理解为如果能够保证各个成分的强度的分布比例的精确度，则强度的绝对值下降不会成为问题。
关于上述的本发明的结构中的光检测区域的位置的移动，可以根据发光粒子的特性或样本溶液中的数密度或浓度适当地变更样本溶液内的光检测区域的位置的移动速度。特别是当光检测区域的移动速度变快时，从一个发光粒子所能得到的光量降低，因此优选的是适当地变更光检测区域的移动速度，使得能够高精确度或高灵敏度地计量来自一个发光粒子的光。
并且，关于上述的光检测区域的位置的移动，优选的是将样本溶液内的光检测区域的位置的移动速度设定得比发光粒子的扩散移动速度(由布朗运动造成的粒子的平均移动速度)高。如上述说明的那样，在本发明的装置中，对从光检测区域所包含的一个发光粒子发出的光进行检测来个别检测发光粒子。然而，发光粒子由于在溶液中进行布朗运动而随机地移动，在多次出入光检测区域的情况下，有可能从一个发光粒子多次检测出(表示其存在的)信号，难以使检测出的信号与一个发光粒子的存在对应起来。因此，如上所述，将光检测区域的移动速度设定得比发光粒子的扩散移动速度高，由此能够使一个发光粒子与一个信号相对应。此外，扩散移动速度因发光粒子的不同而变化，因此如上所述，优选的是根据发光粒子的特性适当地变更光检测区域的移动速度。
可以通过任意的方式进行光学系统的光路的变更以移动光检测区域的位置。例如可以使用在激光扫描型光学显微镜中采用的检电镜变更光路来变更光检测区域的位置。可以任意地设定光检测区域的位置的移动路径，例如可以从圆形、椭圆形、矩形、直线以及曲线中选择。此外，在本发明中，构成为变更光学系统的光路使光检测区域的位置移动，由此光检测区域的移动迅速并且在样本溶液中实质上不发生机械振动、流体动力的作用，因此样本溶液中的发光粒子不会受到动力作用的影响，能够在(没有伪像的状态且)稳定的状态下进行光的计量(例如在使样本流动的情况下，难以始终赋以一样的流速并且装置结构复杂，另外所需要的样本量大幅增加并且由于流动所造成的流体动力的作用而溶液中的发光粒子或其它物质有可能改质或改性。)。而且，不需要使样本溶液流通的结构，因此能够与FCS等的情况同样地以微量(1μL～几十μL左右)的样本溶液进行计量和分析。
另外，在实施方式中，本发明的光分析装置可以对信号处理部个别检测出的发光粒子的信号的个数进行计数来对在光检测区域的位置移动过程中所检测出的发光粒子的个数进行计数。由此，能够按发光粒子的种类获取关于发光粒子的数密度或浓度的信息。
根据上述本发明的装置，能够实现一边使光检测区域的位置在样本溶液内移动一边以能够识别发光粒子的种类的方式检测各个发光粒子的光的新的光分析方法。因而，根据本发明，提供一种光分析方法，其使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测来自在样本溶液中分散且随机地运动的发光粒子的光并进行分析，该光分析方法的特征在于，包括以下步骤：通过变更显微镜的光学系统的光路以使光学系统的光检测区域的位置在样本溶液内移动；一边使光检测区域的位置在样本溶液内移动，一边检测来自光检测区域的光的多个波长频带的成分的强度；以及在检测出的光的多个波长频带的成分的强度中个别检测来自各个发光粒子的光的信号，根据检测出的发光粒子的光的信号的多个波长频带的成分的强度来识别发光粒子的种类。
在上述方法中，也可以根据发光粒子的光的信号的多个波长频带的成分的强度之比来识别发光粒子的种类，特别是可以检测来自光检测区域的光的两个波长频带的成分的强度，根据所述两个波长频带的成分的强度之比来识别发光粒子的种类。另外，在发光粒子是通过一个波长频带的激励光的照射而进行发光的粒子的情况下，执行向光检测区域照射所述一个波长频带的激励光的步骤，在光检测步骤中，可以检测通过激励光的照射而发出的来自光检测区域的光的多个波长频带的成分的强度。并且，在上述方法中，也可以包括以下步骤：对个别检测出的来自发光粒子的光信号的个数进行计数来对在光检测区域的位置移动过程中检测出的发光粒子的个数进行计数；和/或根据检测出的发光粒子的个数来确定样本溶液中的发光粒子的数密度或浓度。另外，在变更光学系统的光路以使光检测区域的位置移动的步骤中，可以使光检测区域的位置以规定的速度或比发光粒子的扩散移动速度快的速度移动，可以根据发光粒子的特性或样本溶液中的数密度或浓度来设定光检测区域的位置的移动速度。
应该理解为本发明的光分析技术典型地用于分析或解析蛋白质、肽、核酸、脂质、糖链、氨基酸或它们的聚合体等生物体分子、病毒、细胞等粒子状的生物学对象物在溶液中的状态的用途，但也可以用于分析或解析非生物学的粒子(例如原子、分子、胶束(micelles)、金属胶体等)在溶液中的状态，这样的情况也属于本发明的范围。
发明的效果
总之，根据本发明，在一种扫描分子计数法中，通过在共焦显微镜或多光子显微镜下利用其光检测区域在样本溶液中进行扫描来个别检测发光粒子的存在，通过以能够掌握该发光粒子的发光波长特性的特征的方式检测发光粒子的光，能够识别各个发光粒子的种类。根据所述本发明的结构，即使多个种类的发光粒子混合存在于样本溶液中，也能够确定各个发光粒子的种类，因此能够得到多个种类的粒子等混合存在的系统中的与各粒子的状态、数密度或浓度有关的信息，并且能够根据它们的变化检测并分析粒子的结合/离解反应或分散/聚合之类的各种现象。另外，在本发明中，由于个别检测发光粒子并进行其种类的识别，因此即使是在样本溶液中浓度相对较低且其光在以前的方法中埋没于来自其它发光粒子的光的发光粒子，也能够检测出，能够观测该发光粒子的存在。也期待将所述特征应用于反应率比较低的反应的产物、数量相对较少的中间产物的检测。
本发明的其它目的以及优点通过以下的本发明的优选实施方式的说明将变得清楚。
附图说明
图1的(A)是实现本发明的光分析技术的光分析装置的内部构造的示意图。图1的(B)是共焦区组织(共焦显微镜的观察区域)的示意图。图1的(C)是变更反射镜7的朝向使光检测区域的位置在样本溶液内移动的机构的示意图。
图2的(A)、(B)分别是说明构成本发明的光分析技术的一部分的扫描分子计数法中的光检测的原理的示意图和所计量的光强度的时间变化的示意图。图2的(C)是说明依照本发明能够通过检测多个波长频带的光成分的强度来根据发光粒子的发光波长特性的差异识别其种类的原理的图。上图示出了各种具有互不相同的发光波长特性的发光粒子α、β、γ、δ的发光波长特性(发光光谱)(实线曲线图)以及分开进行检测的多个波长频带的范围(观测窗-横轴之下的附加为有ch1～ch5的四角框)。下图的直方图表分别示意性地示出了发光粒子α、β、γ、δ信号中的在各观测窗中被检测出的光的强度。图2的(D)是说明在检测两个波长频带的光成分的情况下能够识别发光粒子的种类的情形的、与图2的(C)相同的图。
图3是以流程图的形式表示依照本发明执行的光检测/分析的处理过程的图。
图4的(A)、(B)分别是表示发光粒子一边进行布朗运动一边横穿光检测区域时以及在由于以比发光粒子的扩散移动速度快的速度使样本溶液内的光检测区域的位置移动而发光粒子横穿光检测区域时的粒子的运动方式的模型图。图4的(C)是说明用于依照扫描分子计数法根据计量出的时序光强度数据(光子计数的时间变化)检测发光粒子的存在的处理过程中的检测信号的信号处理过程的例子的图。
图5示出计量出的光子计数数据的实测例子(直方图表)、对数据进行平滑处理而得到的曲线(虚线)以及在脉冲存在区域中进行拟合得到的高斯函数(实线)。在图中，附加为“噪声”的信号作为噪声或异物的信号而被忽略。
图6的(A)是关于包含荧光色素ATTO565的溶液和包含荧光色素ATTO590的溶液，相对于依照本发明检测出的各个发光粒子的第一波长频带的光强度(光子计数)Ich1绘制第二波长频带的光强度(光子计数)Ich2得到的图。在图中，各点为一个发光粒子的强度。图6的(B)示出了荧光色素ATTO565和荧光色素ATTO590的两个波长频带的光强度之比Ich1/Ich2的平均值(直方图表)和标准偏差(误差条(errorbar))。
图7是在以往的计算荧光强度的波动的光分析技术中获得的光子计数(光强度)的时间变化的例子，(A)是样本内的粒子的浓度为能够提供充分的计量精确度的程度的情况，(B)是样本内的粒子的浓度大幅地低于(A)的情况的情况。
附图标记说明
1：光分析装置(共焦显微镜)；2：光源；3：单模光纤(single-modeopticalfiber)；4：准直透镜；5：分色镜；6、7、11：反射镜；8：物镜；9：微板；10：皿(样本溶液容器)；12：聚光镜(condenserlens)；13：针孔；14a、b：屏障滤波器(barrierfilter)；14x：检测光用分色镜；15：多模光纤(multi-modeopticalfiber)；16a、b：光检测器；17：反射镜偏转器；17a：台位置变更装置；18：计算机。
具体实施方式
下面，详细说明本发明的优选实施方式。
光分析装置的结构
本发明能够通过如下的光分析装置来实现：在基本结构中组合如图1的(A)示意性地例示那样能够执行FCS、FIDA等的共焦显微镜的光学系统和光检测器而成。参照图1的(A)，光分析装置1由光学系统2～17以及用于控制光学系统的各部分的动作并且获取并解析数据的计算机18构成。光分析装置1的光学系统可以与通常的共焦显微镜的光学系统相同，在此，使从光源2发射并在单模光纤3内传播的激光(Ex)在光纤的出射端成为以由固有的NA决定的角度发散的光而被发射，通过准直器4成为平行光，被分色镜5、反射镜6、7反射，入射到物镜8。典型地是在物镜8的上方配置有微板9，该微板9上排列有注入了1μL～几十μL的样本溶液的样本容器或皿10，从物镜8射出的激光在样本容器或皿10内的样本溶液中形成焦点，形成光强度强的区域(激励区域)。作为观测对象物的发光粒子、典型地是附加有荧光色素等发光标识的分子分散或溶解于样本溶液中，当发光粒子进入到激励区域时，在其间发光粒子被激励而释放出光。所释放的光(Em)通过物镜8、分色镜5，被反射镜11反射而在聚光镜12聚光，通过针孔13。此外，如本领域技术人员所了解的那样，针孔13配置在与物镜8的焦点位置共轭的位置处，由此仅从如图1的(B)示意性地表示的从激光的焦点区域、即激励区域内发出的光通过针孔13，来自焦点面以外的光被遮断。图1的(B)所例示的激光的焦点区域通常是具有1fL～10fL左右的有效体积的本光分析装置中的光检测区域，被称为共焦区组织。在共焦区组织中，典型地是光强度以区域中心为顶点的高斯型分布或洛仑兹型分布，其有效体积是以光强度为1/e2的面为边界的大致椭圆球体的体积。这样，通过了针孔13的光在分色镜14x中被分割为多个波长频带(图中被分割为两个波长频带，但是也可以是两个以上。)，使分割后的光的成分分别透过对应的屏障滤波器14a、14b，在此只特定波长频带的光成分被选择，之后被导入到多模光纤15，到达对应的光检测器16a、16b(在图中，装备有两个光检测器，但是可以与波长频带的个数相应地装备光检测器，使它们分别接收一个检测波长频带的成分。)。根据该结构，在图1的(A)的装置中，来自光检测区域的光的多个波长频带的成分分开且同时被检测到，能够捕捉发光粒子的发光波长特性的特征。光检测器16a、16b将依次到来的光的强度转换为按时间序列的电信号后发送到计算机18，这样以后面要说明的方式进行用于光分析的处理。作为光检测器16a、16b，优选的是使用能够在光子计数中使用的超高灵敏度的光检测器，由此，能够检测来自一个发光粒子的光、例如来自一个或多个荧光色素分子的微弱光。
另外，在上述的光分析装置的光学系统中，还设置有用于变更光学系统的光路来通过光检测区域扫描样本溶液内、即使焦点区域(即，光检测区域)的位置在样本溶液内移动的机构。作为所述的用于使光检测区域的位置移动的机构，例如图1的(C)示意性地例示的那样，可以采用变更反射镜7的朝向的反射镜偏转器17。所述反射镜偏转器17可以与在通常的激光扫描型显微镜中装备的检电镜装置相同。另外，为了实现所期望的光检测区域的位置的移动图案，在计算机18的控制下与光检测器16所进行的光检测协作来驱动反射镜偏转器17。可以从圆形、椭圆形、矩形、直线、曲线或它们的组合中任意地选择光检测区域的位置的移动路径(可以设为能够在计算机18的程序中选择各种移动图案。)。此外，虽然没有图示，但也可以通过使物镜8上下移动来使光检测区域的位置在上下方向上移动。如上所述，根据不是移动样本溶液而是变更光学系统的光路使光检测区域的位置移动的结构，在样本溶液内不会实质地产生机械振动、流体动力的作用，能够排除动力作用对观测对象物的影响，实现稳定的计量。
此外，作为追加的结构，也可以在显微镜的台(未图示)上设置用于移动微板9的水平方向位置的台位置变更装置17a以变更所观察的皿10。可以由计算机18控制台位置变更装置17a的动作。
在发光粒子通过多光子吸收而发光的情况下，上述光学系统被用作多光子显微镜。在这种情况下，只在激励光的焦点区域(光检测区域)释放光，因此可以去除针孔13。在发光粒子通过磷光而发光的情况下，能够直接使用上述的共焦显微镜的光学系统。另外，在发光粒子不通过激励光而通过化学发光、生物发光现象发光的情况下，可以省略用于生成激励光的光学系统2～5。并且，可以在光分析装置1中如图示那样设置多个激励光源2，可以设为能够根据激励发光粒子的光的波长而适当地选择激励光的波长。优选的是暂时照射的激励光是一个波长频带的光，但是也可以根据实验条件而暂时将多个波长频带的光用作激励光。
本发明的原理
如“发明内容”一栏所记载的那样，根据本发明的光分析技术，如果清楚地进行描述则如下，即，“扫描分子计数法”一边使共焦显微镜或多光子显微镜的光检测区域的位置在样本溶液内移动一边检测在样本溶液中分散的发光粒子被包含在光检测区域内时所释放出的光来个别地检测发光粒子的存在，在该“扫描分子计数法”中，个别地计量发光粒子的光的多个波长频带的成分，并尝试检测发光粒子的发光波长特性的特征。根据所述的结构，能够根据个别检测出的发光粒子的发光波长特性的特征来识别发光粒子的种类，因此能够在多个种类的发光粒子混合存在的系统中检测各个种类的发光粒子的存在、检测各种发光粒子的存在比(浓度比)、获取各种发光粒子的数密度或浓度等信息。下面，对扫描分子计数法和本发明的发光波长特性的特征的检测原理进行说明。
1．扫描分子计数法的原理
FCS等光谱分析技术与现有的生物化学的分析技术相比，其优点在于所需要的样本量极少且能够迅速地执行检查。然而，在FCS等光谱分析技术中，在原理上，根据荧光强度的波动来估算发光粒子的特性，因此为了得到高精确度的测量结果，要求如图7的(A)示意性地描绘的那样样本溶液中的发光粒子的浓度或数密度为在荧光强度的计量中在光检测区域CV内始终存在一个左右的发光粒子的水平，如该图的右侧所示那样在计量时间中始终检测到有意义的光强度(光子计数)。如果发光粒子的浓度或数密度低于该水平，例如图7的(B)所描绘的那样在发光粒子只是偶尔进入到光检测区域CV内的水平的情况下，如该图的右侧所例示的那样，只在计量时间的一部分出现有意义的光强度的信号(光子计数)，难以高精确度地估算光强度的波动。另外，在发光粒子的浓度与计量中在光检测区域内始终存在一个左右的发光粒子的水平相比大幅降低的情况下，在光强度的波动的运算中容易受到背景的影响，且为了得到足够进行运算的量的有意义的光强度数据而计量时间变长。
因此，本申请的申请人在日本特愿2010-044714和PCT/JP2011/53481中提出了“扫描分子计数法”，其基于以下的新原理：即使在发光粒子的浓度低于如上所述的在FCS、FIDA等光谱分析技术中要求的水平的情况下也能够检测发光粒子的特性。
作为在扫描分子计数法中执行的处理，如果清楚地描述，则驱动用于使光检测区域的位置移动的机构(反射镜偏转器17)来变更光路，如在图2的(A)中示意性地描绘的那样，一边使光检测区域CV的位置在样本溶液内移动、即一边通过光检测区域CV扫描样本溶液内，一边执行光检测。这样，例如图2的(A)那样，在光检测区域CV移动的期间(图中为时间t0～t2)，在通过存在一个发光粒子的区域时(t1)，从发光粒子释放出光，如在图2的(B)中所描绘的那样，在按时间序列的光强度数据上出现有意义的光强度(Em)的脉冲状的信号。这样，通过执行上述的光检测区域CV的位置的移动和光检测并逐个地检测其间出现的如图2的(B)所例示的脉冲状的信号(有意义的光强度)，能够个别检测发光粒子，获取与发光粒子的特性有关的信息。在所述的扫描分子计数法的原理中，不进行如荧光强度的波动的计算那样的统计性的运算处理而是逐个地检测发光粒子，因此即使在要被观测的粒子的浓度低至通过FCS、FIDA等无法以足够的精确度进行分析的程度的样本溶液中，也能够获取与粒子的特性有关的信息。
2．本发明的发光粒子的发光波长特性的特征的检测原理
在上述扫描分子计数法中，为了检测发光粒子或发光标识的发光波长特性的特征，在本发明中特别地将来自光检测区域的光分开为多个波长频带进行检测。例如在样本溶液中存在分别具有在图2的(C)的上方所例示的那样的发光波长特性(发光光谱)的发光粒子α、β、γ、δ的情况下，如果将来自光检测区域的光分开为适当个数的波长频带、例如分开为五个观测窗ch1～ch5来通过各个光检测器分别计量各成分，则分别具有发光波长特性的发光粒子α、β、γ、δ各自的ch1～ch5的强度分布如图2的(C)的下方示意性地描绘的那样为反映各个发光波长特性的轮廓的特征而互不相同的分布。因而，如果参照ch1～ch5的强度分布、例如参照各观测窗中的强度之比Ich1:Ich2:Ich3:Ich4:Ich5，则可知各个发光粒子是具有哪个发光波长特性的粒子，从而能够识别发光粒子的种类。例如在某发光粒子的信号的ch1～ch5的强度的分布是图2的(C)的下方的附加为“γ”的曲线图的分布时，能够识别为该发光粒子的种类是具有γ的发光波长特性的粒子。
此外，观测窗的个数、即个别检测的波长频带数越多，越是能够详细地检测各发光粒子的发光波长特性的特征，但是装置1的对检测光进行分割的部分的光学系统(分色镜14x、屏障滤波器14a、14b等)的结构变得复杂，调整麻烦增加并且各观测窗中的强度减少，可能使测量出的各个强度值的精确度变差。因此，优选的是可以如图2的(D)那样将观测窗的个数设为两个，调节各观测窗的检测波长频带使得能够在两个观测窗的强度分布中适当地反映各发光粒子的发光波长特性的特征，根据这两个观测窗中的强度的均衡实现作为观测对象的发光粒子的按种类的区别。在这种情况下，可以根据两个观测窗的强度比Ich1:Ich2、Ich1/Ich2等进行发光粒子的种类的识别。
处理操作过程
在利用图1的(A)所例示的光分析装置1的本发明的光分析的实施方式中，具体地说执行以下的过程：(1)包含发光粒子的样本溶液的制备过程，(2)样本溶液的光强度的测量处理过程，以及(3)测量出的光强度的分析处理过程。图3示出用流程图的形式表示的本实施方式中的处理过程。
(1)制备样本溶液
在本发明的光分析技术中，作为观测对象的粒子只要是溶解的分子等在样本溶液中分散并在溶液中随机运动的粒子，就可以是任意的，例如可以是蛋白质、肽、核酸、脂质、糖链、氨基酸或它们的聚合体等生物体分子、病毒、细胞、或金属胶体、其它非生物学粒子等(样本溶液典型地是水溶液，但并不限于此，可以是有机溶剂之类的其它任意的液体。)。另外，作为观测对象的粒子可以是其自身发光的粒子，或者，也可以是以任意方式附加了发光标识(荧光分子、磷光分子、化学/生物发光分子)的粒子。
(2)测量样本溶液的光强度
在本实施方式的扫描分子计数法的光强度的测量处理过程中，一边驱动反射镜偏转器17进行光检测区域的位置在样本溶液内的移动(样本溶液内的扫描)一边进行光强度的测量(图3的步骤100)。在操作处理中，典型地是在向微板9的皿10注入样本溶液并载置在显微镜的台上后，当使用者向计算机18输入开始测量的指示时，计算机18依照存储在存储装置(未图示)中的程序(为了使光检测区域的位置在样本溶液内移动而变更光路的过程、向光检测区域照射激励光的过程(仅在需要的情况下)以及在光检测区域的位置的移动中检测来自光检测区域的光的过程)，开始进行样本溶液内的光检测区域处的激励光的照射(仅在需要的情况下)和光强度的计量。在开始计量时，首先在依照计算机18的程序的处理动作的控制下，从光源2射出样本溶液中的发光粒子的激励波长的光，并且反射镜偏转器17驱动反射镜7(检电镜)，在皿10内执行光检测区域的位置的移动，与此同时，光检测器16a、16b分别将依次接收到的光转换为电信号并发送到计算机18，计算机18按照任意的方式根据所发送的信号生成按时间序列的光强度数据并保存。典型地是光检测器16a、16b是能够检测一个光子的到来的超高灵敏度光检测器，因此，光的检测是以在规定时间内每隔规定的单位时间(BINTIME)、例如每隔10μs依次计量来到光检测器的光子的个数的方式执行的光子计数，按时间序列的光强度的数据可以是按时间序列的光子计数数据。
关于光检测区域的位置的移动速度，在扫描分子计数法中，为了定量地高精确度地执行基于计量出的按时间序列的光强度数据的发光粒子的个别检测，优选的是将光强度的计量过程中光检测区域的位置的移动速度设定为比发光粒子的随机运动、即布朗运动的移动速度快的值。在光检测区域的位置的移动速度比因粒子的布朗运动而进行的移动慢的情况下，如图4的(A)示意性地描绘的那样，粒子在区域内随机地移动，由此，光强度随机地变化(光检测区域的激励光强度以区域的中心为顶点向外方降低)，难以确定与各个发光粒子对应的有意义的光强度的变化(表示来自发光粒子的光的信号)。因此，优选的是如图4的(B)所描绘的那样，将光检测区域的位置的移动速度设定得比粒子的布朗运动的平均移动速度(扩散移动速度)快，使得粒子大致直线地横穿光检测区域CV，由此在按时间序列的光强度数据中与各个粒子对应的光强度的变化的轮廓是与图4的(C)的最上部所例示的那样的激励光强度分布大致相同的吊钟状，从而能够容易地确定各个发光粒子与光强度之间的对应。
具体地说，具有扩散系数D的发光粒子由于布朗运动而通过半径r的光检测区域(共焦区组织)时所需要的时间Δτ根据以下的平均平方位移的关系式，
(2r)2=6D×Δτ…(1)
成为Δτ=(2r)2/6D…(2)
因此，发光粒子因布朗运动而移动的速度(扩散移动速度)Vdif大致为
Vdif=2r/Δτ=3D/r…(3)。
因此，光检测区域的位置的移动速度可以参照所述Vdif设定为比其充分快的值。例如在预想发光粒子的扩散系数是D=2.0×10-10m2/s左右的情况下，在r为0.62μm左右时，Vdif为1.0×10-3m/s，因此，可以将光检测区域的位置的移动速度设定为其10倍以上的15mm/s。此外，在发光粒子的扩散系数未知的情况下，可以设定各种光检测区域的位置的移动速度，反复执行用于找到使光强度的变化的轮廓为预想的轮廓(典型地是与激励光强度分布大致相同)的条件的预备实验，来确定适合的光检测区域的位置的移动速度。
(3)分析光强度
在通过上述的处理得到样本溶液中的发光粒子的按时间序列的光强度数据时，在计算机18中，通过依照存储在存储装置中的程序的处理，来执行光强度数据上的与来自发光粒子的光对应的信号的检测以及各发光粒子的种类的识别。
(i)检测与发光粒子对应的信号
在按时间序列的光强度数据中，在一个发光粒子通过光检测区域时的轨迹如图4的(B)所示那样是大致直线状的情况下，与该粒子对应的信号中的光强度的变化具有反映(由光学系统决定的)光检测区域内的光强度分布的大致吊钟状的轮廓(参照图4的(C)的最上部)。因而，在扫描分子计数法中，基本上可以在超过适当设定的阈值的光强度所持续的时间宽度处于规定的范围内时，判定为具有该光强度的轮廓的信号与一个粒子通过光检测区域的情况对应，进行一个发光粒子的检测。而且，超过阈值的光强度所持续的时间宽度不在规定的范围内的信号被判定为噪声或异物的信号。另外，在能够将光检测区域的光强度分布假定为高斯分布时，即
I=A×exp(-2t2/a2)…(4)
在使式(4)拟合有意义的光强度的轮廓(能够明确地判断为不是背景的轮廓)而计算出的强度A和宽度a处于规定的范围内时，可以将该光强度的轮廓判定为与一个粒子通过光检测区域的情况对应，进行一个发光粒子的检测(强度A和宽度a处于规定的范围外的信号被判定为噪声或异物的信号，可以在其后的分析等中忽略。)。
作为根据时序光强度数据进行发光粒子的统一的检测的处理方法的一个例子，首先对时序光强度数据(图4的(C)、最上部“检测结果(未处理)”)进行平滑(平滑化)处理(图3的步骤110、图4的(C)的中上部“平滑”)。发光粒子所发出的光是概率性地释放的，在微小的时间内可能产生数据值的缺失，因此通过所述平滑处理，能够忽略如上所述的数据值的缺失。例如可以通过移动平均法进行平滑处理。此外，也可以根据获取光强度数据时的光检测区域的位置的移动速度(扫描速度)、BINTIME来适当地设定执行平滑处理时的参数、例如在移动平均法中进行一次平均的数据个数、移动平均的次数等。
接着，在平滑处理后的时序光强度数据中，为了检测有意义的脉冲状信号(以下称为“脉冲信号”)所存在的时间区域(脉冲存在区域)，对平滑处理后的时序光强度数据的时间计算一次微分值(步骤120)。时序光强度数据的时间微分值如图4的(C)的中下部“时间微分”所例示的那样，在信号值的变化时刻值的变化变大，因此通过参照所述时间微分值，能够有利地确定有意义的信号的起点和终点。
然后，在时序光强度数据上，依次检测有意义的脉冲信号，判断检测出的信号是否是与发光粒子对应的信号。具体地说，首先在时序光强度数据的按时间序列的时间微分值数据上，依次参照时间微分值来搜索并确定一个脉冲信号的起点和终点，确定脉冲存在区域(步骤130)。在确定了一个脉冲存在区域时，针对该脉冲存在区域中的平滑后的时序光强度数据进行吊钟型函数的拟合(图4的(C)的下部的“吊钟型函数拟合”)，计算吊钟型函数的脉冲的峰值(最大值)的强度Ipeak、脉冲宽度(半峰全宽)Wpeak、拟合时的(最小二乘法的)相关系数等参数(步骤140)。此外，拟合的吊钟型函数典型地是高斯函数，但也可以是洛仑兹型函数。而且，判断计算出的吊钟型函数的参数是否处于针对一个发光粒子通过光检测区域时被检测出的脉冲信号所描绘的吊钟型轮廓的参数所设想的范围内，即判断脉冲的峰值强度、脉冲宽度、相关系数是否分别处于规定范围内等(步骤150)。这样，如图5的左边所示那样，将被判定为计算出的吊钟型函数的参数处于针对与一个发光粒子对应的信号设想的范围内的信号判定为是与一个发光粒子对应的信号，由此检测出一个发光粒子。另一方面，如图5的右边所示那样，计算出的吊钟型函数的参数不在设想的范围内的脉冲信号作为噪声而被忽略。
可以在多个检测波长频带成分各自的时序光强度数据的整个区域中反复执行上述步骤130～150的处理中的脉冲信号的搜索和判断(步骤160)。另外，在本实施方式的情况下，一个发光粒子的光出现在多个检测波长频带的时序光强度数据中，因此各发光粒子的信号由多个检测波长频带的时序光强度数据中的信号的组构成。关于该点，如从图2的(C)或(D)的下图理解的那样，既存在一个发光粒子的光在多个检测波长频带的时序光强度数据中都出现的情况，也存在一个发光粒子的光仅在它们中的某一个中出现的情况。因而，发光粒子的信号在多个检测波长频带的时序光强度数据中的至少一个中出现的情况下，可以设为在该信号出现的时间内在其它的检测波长频带的时序光强度数据中存在发光粒子的信号来进行处理。可以通过参照脉冲存在区域的时间值来进行多个检测波长频带成分的时序光强度数据上的信号的对应。另外，作为其它的方式，可以设为对多个检测波长频带成分中的一个检测波长频带成分，在其时序光强度数据上检测发光粒子的信号，设为在被检测出的这些信号的产生时间内在其它的检测波长频带成分的时序光强度数据上也存在发光粒子的信号来进行处理。此外，根据时序光强度数据个别检测发光粒子的信号的处理不限于上述的过程，可以通过任意的方法执行。
(ii)各发光粒子的光强度比计算以及种类的识别(图3的步骤170、180)
这样，当在多个检测波长频带各自的时序光强度数据中检测发光粒子的信号时，针对每个发光粒子，参照多个检测波长频带的光强度，根据它们的分布来判断发光粒子的种类。作为各成分的光强度，可以采用在步骤130～160中检测出的发光粒子的信号的峰值强度、光子计数的累积值、或者拟合的吊钟型函数的时间积分值等。例如在如图2的(C)那样检测波长频带为三个以上时，可以参照它们的强度比、(Ich1/Io):(Ich2/Io):(Ich3/Io):…，根据其比的分布来识别发光粒子的种类(Io是多个检测波长频带的成分的强度的总和。)。另外，在如图2的(D)那样检测波长频带是两个时，也可以计算它们的强度比的值Ich1/Ich2，根据其计算值识别发光粒子的种类。而且，关于多个检测波长频带的成分的强度比预先已知的发光粒子，能够根据上述计算出的强度比来进行其种类的同定。
并且，也可以对检测出的发光粒子的信号的个数进行计数来确定发光粒子的个数(发光粒子的计数)。在这种情况下，在本发明中，由于能够识别发光粒子的种类，因此可以按每个种类确定发光粒子的个数。并且，如果通过任意的方法估算出光检测区域通过的区域的总体积，则根据其体积值和发光粒子的个数来确定样本溶液中的发光粒子的数密度或浓度。
也可以根据激励光或检测光的波长、透镜的数值孔径、光学系统的调整状态来在理论上估算光检测区域通过的区域的总体积，但是可以通过实验，例如针对发光粒子的浓度已知的溶液(对比溶液)，以与要检查的样本溶液的测量相同的条件进行上述已说明的光强度的测量、发光粒子的检测以及计数，根据由此检测出的发光粒子的个数和对比溶液的发光粒子的浓度来进行确定。具体地说，例如对于发光粒子的浓度C的对比溶液，当设对比溶液的发光粒子的检测数为N时，光检测区域通过的区域的总体积Vt能够通过下式给出。
Vt=N/C…(5)
另外，可以作为对比溶液而准备发光粒子的多个不同浓度的溶液，对各个溶液分别执行测量，采用计算出的Vt的平均值作为光检测区域通过的区域的总体积Vt。而且，当提供了Vt时，发光粒子的计数结果为n的样本溶液的发光粒子的浓度c能够通过下式给出。
c=n/Vt…(6)
此外，光检测区域的体积、光检测区域通过的区域的总体积可以不通过上述的方法而通过任意的方法、例如利用FCS、FIDA等给出。另外，在本实施方式的光分析装置中，关于所设想的光检测区域的移动图案，可以将各种标准的发光粒子的浓度C与发光粒子的个数N的关系(式(5))的信息预先存储到计算机18的存储装置中，以使装置的使用者在实施光分析时能够适当利用所存储的关系的信息。此外，在本发明中，能够识别发光粒子的种类，因此能够按发光粒子的每个种类确定数密度或浓度。
这样，根据上述的本发明，在通过光检测区域在样本溶液中进行扫描来个别检测发光粒子的扫描分子计数法中，在多个检测波长频带中个别检测发光粒子的光，通过参照反映出该发光粒子的发光波长特性的特征的强度分布或强度之比，能够识别检测出的各发光粒子的种类。
为了验证上述已说明的本发明的有效性而进行了如下的实验。此外，应该理解为下面的实施例是例示本发明的有效性而并非限定本发明的范围。
实施例1
通过本发明验证了能够在扫描分子计数法中识别发光粒子的种类。
作为样本溶液，分别制备出将荧光色素ATTO565(荧光波长峰值592nm)、ATTO590(荧光波长峰值624nm)以浓度为100pM的方式溶解于磷酸缓冲液(包含0.05%Tween20)中所得到的溶液(以下称为ATTO565溶液、ATTO590溶液)。在光测量中，作为光分析装置，使用具备共焦荧光显微镜的光学系统和光子计数系统的单分子荧光测量装置MF-20(奥林巴斯株式会社)，依照在上述的“(2)测量样本溶液的光强度”中说明的方式，针对上述各个样本溶液获取到时序光强度数据(光子计数数据)。这时，激励光使用500μW的543nm的激光，使用带通滤波器测量大约565nm-595nm的波长频带的光(第一波长频带-ch1)和660nm-710nm的波长频带(第二波长频带-ch2)的光，对各个波长频带生成时序光强度数据。使样本溶液中的光检测区域以15mm/秒的移动速度移动。另外，将BINTIME设为10μ秒、将测量时间设为2秒钟。
在测量光强度之后，依照上述的“(3)(i)与发光粒子对应的信号的检测”中所记载的处理过程，针对在ch2中获取到的时序光强度数据实施平滑处理，在被平滑后的数据中确定脉冲信号的起点和终点，之后通过最小二乘法使高斯函数拟合各脉冲信号，确定(高斯函数中的)峰值强度、脉冲宽度(半峰全宽)、相关系数。然后，只将满足下述的条件的脉冲信号判定为与发光粒子对应的信号，
20μs<脉冲宽度<400μs
峰值强度>1.0[pc/10μs]…(A)
相关系数>0.95，
另一方面，将不满足上述条件的脉冲信号作为噪声而忽略。接着，估算ch2的时序光强度数据上被判断为发光粒子的信号的信号产生期间(脉冲存在区域)的、ch1的时序光强度数据上的光子计数的累积值以及ch2的时序光强度数据上的光子计数的累积值，分别作为发光粒子的信号的ch1的强度值Ich1、ch2的强度值Ich2。
图6的(A)是对于ATTO565溶液和ATTO590溶液的各溶液相对于通过上述的光测量和信号检测处理检测出的各个发光粒子的信号的ch1的强度Ich1绘制ch2的强度Ich2而得到的图。如从图中理解的那样，ATTO565的分布(白圆)和ATTO590的分布(黑方块)分别分布在大致直线上，并且，两个分布是相互分离的。该情形示出强度比Ich1/Ich2是反映各个荧光色素的发光波长特性的特征的发光粒子的种类所固有的值，根据强度比能够辨别种类。图6的(B)示出ATTO565的强度比Ich1/Ich2和ATTO590的强度比Ich1/Ich2的各自平均值(直方图表)和标准偏差(误差条)，如从该图理解的那样，示出了以下内容：ATTO565的强度比的平均值和ATTO590的强度比的平均值是有意义且不同的，并且ATTO565的强度比的误差条和ATTO590的强度比的误差条不重复，因此ATTO565的信号和ATTO590的信号能够相互识别出。
这样，如从上述实施例的结果理解的那样，根据上述的本发明，在扫描分子计数法中个别地计量多个检测波长频带的成分，通过参照反映出发光粒子的发光波长特性的特征的多个检测波长频带的成分的强度比，能够根据检测出的发光粒子的种类来区分发光粒子的信号，由此，能够识别出各发光粒子的种类。特别地，本发明通过个别地检测发光粒子的信号，能够识别各发光粒子的种类，因此即使样本溶液中的发光粒子的浓度低于FCS等光分析技术所要求的浓度范围，也能够进行发光粒子的检测，所述特征在对医学、生物学的研究开发领域中经常使用的稀少或昂贵的样本进行分析的情况下是有利的。另外，根据本发明，由于在扫描分子计数法中能够识别发光粒子的种类，因此期待扩大扫描分子计数法的应用范围。

Claims (12)

1.一种光分析装置，其使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测来自在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子的光并进行分析，该光分析装置的特征在于，包括：
光检测区域移动部，其通过变更上述光学系统的光路，使上述光学系统的光检测区域的位置在上述样本溶液内移动；
光检测部，其检测来自上述光检测区域的光的多个波长频带的成分的强度；以及
信号处理部，其在一边使上述光检测区域的位置在上述样本溶液内移动一边由上述光检测部检测出的光的多个波长频带的成分的强度中个别检测来自各个上述发光粒子的光的信号，根据检测出的上述发光粒子的光的信号的多个波长频带的成分的强度来识别上述发光粒子的种类，
其中，上述信号处理部将具有基于通过上述光检测区域内的一个发光粒子设想的轮廓的光强度的时间变化检测为来自各个上述发光粒子的光的信号。
2.根据权利要求1所述的光分析装置，其特征在于，
上述信号处理部根据上述发光粒子的光的信号的多个波长频带的成分的强度之比来识别上述发光粒子的种类。
3.根据权利要求1所述的光分析装置，其特征在于，
上述光检测部检测来自上述光检测区域的光的两个波长频带的成分的强度，上述信号处理部根据上述两个波长频带的成分的强度之比来识别上述发光粒子的种类。
4.根据权利要求1所述的光分析装置，其特征在于，
还包括光照射部，该光照射部向上述光检测区域照射一个波长频带的激励光，上述发光粒子是通过上述一个波长频带的激励光的照射而发光的粒子，上述光检测部对通过上述一个波长频带的激励光的照射而发出的来自上述光检测区域的光的多个波长频带的成分的强度进行检测。
5.根据权利要求1所述的光分析装置，其特征在于，
上述信号处理部对个别检测出的上述发光粒子的光的信号的个数进行计数来对在上述光检测区域的位置移动过程中检测出的上述发光粒子的个数进行计数。
6.根据权利要求1至5中的任一项所述的光分析装置，其特征在于，
上述光检测区域移动部以比上述发光粒子的扩散移动速度快的速度移动上述光检测区域的位置。
7.一种光分析方法，其使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测来自在样本溶液中分散且随机地运动的发光粒子的光并进行分析，该光分析方法的特征在于，包括以下步骤：
通过变更上述光学系统的光路来使上述光学系统的光检测区域的位置在上述样本溶液内移动；
一边使上述光检测区域的位置在上述样本溶液内移动一边检测来自上述光检测区域的光的多个波长频带的成分的强度；
将检测出的上述光的多个波长频带的成分的强度中具有基于通过上述光检测区域内的一个发光粒子设想的轮廓的光强度的时间变化个别检测为来自各个上述发光粒子的光的信号；以及
根据检测出的上述发光粒子的光的信号的多个波长频带的成分的强度来识别上述发光粒子的种类。
8.根据权利要求7所述的光分析方法，其特征在于，
根据上述发光粒子的光的信号的多个波长频带的成分的强度之比来识别上述发光粒子的种类。
9.根据权利要求7所述的光分析方法，其特征在于，
检测来自上述光检测区域的光的两个波长频带的成分的强度，根据上述两个波长频带的成分的强度之比来识别上述发光粒子的种类。
10.根据权利要求7所述的光分析方法，其特征在于，
还包括向上述光检测区域照射一个波长频带的激励光的步骤，其中，上述发光粒子是通过上述一个波长频带的激励光的照射而发光的粒子，对通过上述一个波长频带的激励光的照射而发出的来自上述光检测区域的光的多个波长频带的成分的强度进行检测。
11.根据权利要求7所述的光分析方法，其特征在于，
还包括以下步骤：对个别检测出的上述发光粒子的光的信号的个数进行计数来对在上述光检测区域的位置移动过程中检测出的上述发光粒子的个数进行计数。
12.根据权利要求7至11中的任一项所述的光分析方法，其特征在于，
在移动上述光检测区域的位置的步骤中，以比上述发光粒子的扩散移动速度快的速度移动上述光检测区域的位置。
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