JPWO2012070414A1 - 単一発光粒子の光の波長特性を用いた光分析装置及び光分析方法 - Google Patents
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Abstract
Description
2…光源
3…シングルモードオプティカルファイバー
4…コリメータレンズ
5…ダイクロイックミラー
6、7、11…反射ミラー
8…対物レンズ
9…マイクロプレート
10…ウェル(試料溶液容器)
12…コンデンサーレンズ
13…ピンホール
14a、b…バリアフィルター
14x…検出光用ダイクロイックミラー
15…マルチモードオプティカルファイバー
16a、b…光検出器
17…ミラー偏向器
17a…ステージ位置変更装置
18…コンピュータ
本発明は、基本的な構成に於いて、図1(A)に模式的に例示されている如き、FCS、FIDA等が実行可能な共焦点顕微鏡の光学系と光検出器とを組み合わせてなる光分析装置により実現可能である。図1(A)を参照して、光分析装置1は、光学系2〜17と、光学系の各部の作動を制御すると共にデータを取得し解析するためのコンピュータ18とから構成される。光分析装置1の光学系は、通常の共焦点顕微鏡の光学系と同様であってよく、そこに於いて、光源2から放射されシングルモードファイバー3内を伝播したレーザー光(Ex)が、ファイバーの出射端に於いて固有のNAにて決まった角度にて発散する光となって放射され、コリメーター4によって平行光となり、ダイクロイックミラー5、反射ミラー6、7にて反射され、対物レンズ8へ入射される。対物レンズ8の上方には、典型的には、1〜数十μLの試料溶液が分注される試料容器又はウェル10が配列されたマイクロプレート9が配置されており、対物レンズ8から出射したレーザー光は、試料容器又はウェル10内の試料溶液中で焦点を結び、光強度の強い領域(励起領域)が形成される。試料溶液中には、観測対象物である発光粒子、典型的には、蛍光色素等の発光標識が付加された分子が分散又は溶解されており、発光粒子が励起領域に進入すると、その間、発光粒子が励起され光が放出される。放出された光(Em)は、対物レンズ8、ダイクロイックミラー5を通過し、ミラー11にて反射してコンデンサーレンズ12にて集光され、ピンホール13を通過する。なお、当業者に於いて知られている如く、ピンホール13は、対物レンズ8の焦点位置と共役の位置に配置されており、これにより、図1(B)に模式的に示されている如きレーザー光の焦点領域、即ち、励起領域内から発せられた光のみがピンホール13を通過し、焦点面以外からの光は遮断される。図1(B)に例示されたレーザー光の焦点領域は、通常、1〜10fL程度の実効体積を有する本光分析装置に於ける光検出領域であり、コンフォーカル・ボリュームと称される。コンフォーカル・ボリュームに於いては、典型的には、光強度が領域の中心を頂点とするガウス型分布又はローレンツ型分布となり、その実効体積は、光強度が1/e2となる面を境界とする略楕円球体の体積である。かくして、ピンホール13を通過した光は、ダイクロイックミラー14xに於いて、複数の波長帯域に分割され(図では、二つの波長帯域に分割されているが、二つ以上であってもよい。)、分割された光の成分は、それぞれ、対応するバリアフィルター14a、bを透過し、そこに於いて特定の波長帯域の光成分のみに選択された後、マルチモードファイバー15に導入されて、対応する光検出器16a、bに到達する(図では、二つの光検出器が装備されているが、光検出器は、検出波長帯域の数だけ装備され、それぞれ、1つの検出波長帯域の成分を受光するようになっていてよい。)。この構成により、図1(A)の装置では、光検出領域からの光の複数の波長帯域の成分が別々に且つ同時に検出され、発光粒子の発光波長特性の特徴を捉えることが可能となる。光検出器16a、bは、逐次到来する光の強度を時系列の電気信号に変換して、コンピュータ18へ送信し、かくして、後に説明される態様にて光分析のための処理が為される。光検出器16a、bとしては、好適には、フォトンカウンティングに使用可能な超高感度の光検出器が用いられ、これにより、1つの発光粒子からの光、例えば、一個又は数個の蛍光色素分子からの微弱光が検出可能となる。
「発明の概要」の欄に記載されている如く、本発明の光分析技術によれば、端的に述べれば、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光検出領域の位置を試料溶液内にて移動しながら、試料溶液中にて分散する発光粒子が光検出領域内に包含される際に放出する光を検出して発光粒子の存在を個別に検知する「走査分子計数法」に於いて、発光粒子の光の複数の波長帯域の成分を別々に計測し、発光粒子の発光波長特性の特徴の検出が試みられる。かかる構成によれば、個別に検出される発光粒子の発光波長特性の特徴から発光粒子の種類の識別が可能となるので、複数の種類の発光粒子が混在する系に於いて、個々の種類の発光粒子の存在の検出、各種類の発光粒子の存在比(濃度比)の検出、各種類の発光粒子の数密度又は濃度等の情報の取得が可能となる。以下、走査分子計数法及び本発明による発光波長特性の特徴の検出の原理について説明する。
FCS等の分光分析技術は、従前の生化学的な分析技術に比して、必要な試料量が極めて少なく、且つ、迅速に検査が実行できる点で優れている。しかしながら、FCS等の分光分析技術では、原理的に、発光粒子の特性は、蛍光強度のゆらぎに基づいて算定されるので、精度のよい測定結果を得るためには、試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度が、図7(A)に模式的に描かれているように、蛍光強度の計測中に常に一個程度の発光粒子が光検出領域CV内に存在するレベルであり、同図の右側に示されている如く、計測時間中に常に有意な光強度(フォトンカウント)が検出されることが要求される。もし発光粒子の濃度又は数密度がそれよりも低い場合、例えば、図7(B)に描かれているように、発光粒子がたまにしか光検出領域CV内へ進入しないレベルである場合には、同図の右側に例示されている如く、有意な光強度の信号(フォトンカウント)が、計測時間の一部にしか現れないこととなり、精度のよい光強度のゆらぎの算定が困難となる。また、計測中に常に一個程度の発光粒子が光検出領域内に存在するレベルよりも発光粒子の濃度が大幅に低い場合には、光強度のゆらぎの演算に於いて、バックグラウンドの影響を受けやすく、演算に十分な量の有意な光強度データを得るために計測時間が長くなる。
上記の走査分子計数法に於いて、発光粒子又は発光標識の発光波長特性の特徴を検出するために、本発明では、特に、光検出領域からの光が複数の波長帯域に分けられて検出される。例えば、試料溶液中に図2(C)上に例示されている如き発光波長特性(発光スペクトル)をそれぞれ有する発光粒子α、β、γ、δが存在している場合に、光検出領域からの光を適当な数の波長帯域に分けて、例えば、5つの観測窓ch1〜ch5に分けて、各成分をそれぞれ別々の光検出器により計測すれば、発光波長特性をそれぞれ有する発光粒子α、β、γ、δのそれぞれのch1〜ch5の強度の配分は、図2(C)の下方に模式的に描かれている如く、それぞれの発光波長特性のプロファイルの特徴を反映して互いに異なる配分となる。従って、ch1〜ch5の強度の配分を参照すれば、例えば、各観測窓に於ける強度の比Ich1:Ich2:Ich3:Ich4:Ich5を参照すれば、個々の発光粒子がいずれの発光波長特性を有する粒子であるかが分かり、発光粒子の種類の識別が可能となる。例えば、或る発光粒子の信号のch1〜ch5の強度の配分が、図2(C)の下方の「γ」と付されたグラフの配分であったときには、その発光粒子の種類は、γの発光波長特性を有する粒子であると識別できることとなる。
図1(A)に例示の光分析装置1を用いた本発明による光分析の実施形態に於いては、具体的には、(1)発光粒子を含む試料溶液の調製過程、(2)試料溶液の光強度の測定処理過程、及び(3)測定された光強度の分析処理過程が実行される。図3は、フローチャートの形式にて表した本実施形態に於ける処理過程を示している。
本発明の光分析技術に於いて観測対象となる粒子は、溶解された分子等の、試料溶液中にて分散し溶液中にてランダムに運動する粒子であれば、任意のものであってよく、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞、或いは、金属コロイド、その他の非生物学的粒子などであってよい(試料溶液は、典型的には水溶液であるが、これに限定されず、有機溶媒その他の任意の液体であってよい。)。また、観測対象となる粒子は、それ自体が発光する粒子であってもよく、或いは、発光標識(蛍光分子、りん光分子、化学・生物発光分子)が任意の態様にて付加された粒子であってよい。
本実施形態の走査分子計数法による光強度の測定処理過程では、ミラー偏向器17を駆動して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動(試料溶液内の走査)を行いながら、光強度の測定が為される(図3−ステップ100)。操作処理に於いて、典型的には、マイクロプレート9のウェル10に試料溶液を注入して顕微鏡のステージ上に載置した後、使用者がコンピュータ18に対して、測定の開始の指示を入力すると、コンピュータ18は、記憶装置(図示せず)に記憶されたプログラム(試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動するべく光路を変更する手順、励起光を光検出領域に照射する手順(必要な場合のみ)及び光検出領域の位置の移動中に光検出領域からの光を検出する手順)に従って、試料溶液内の光検出領域に於ける励起光の照射(必要な場合のみ)及び光強度の計測が開始される。計測が開始されると、まず、コンピュータ18のプログラムに従った処理動作の制御下、光源2から、試料溶液中の発光粒子の励起波長の光が出射されると共に、ミラー偏向器17がミラー7(ガルバノミラー)を駆動して、ウェル10内に於いて光検出領域の位置の移動を実行し、これと同時に光検出器16a、bは、それぞれ、逐次的に受光した光を電気信号に変換してコンピュータ18へ送信し、コンピュータ18は、任意の態様にて、送信された信号から時系列の光強度データを生成して保存する。典型的には、光検出器16a、bは、一光子の到来を検出できる超高感度光検出器であるので、光の検出は、所定時間に亘って、逐次的に、所定の単位時間毎(BIN TIME)に、例えば、10μ秒毎に光検出器に到来するフォトンの数を計測する態様にて実行されるフォトンカウンティングであり、時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータであってよい。
(2r)2=6D・Δτ …(1)
から、
Δτ=(2r)2/6D …(2)
となるので、発光粒子がブラウン運動により移動する速度(拡散移動速度)Vdifは、概ね、
Vdif=2r/Δτ=3D/r …(3)
となる。そこで、光検出領域の位置の移動速度は、かかるVdifを参照して、それよりも十分に早い値に設定されてよい。例えば、発光粒子の拡散係数が、D=2.0×10−10m2/s程度であると予想される場合には、rが、0.62μm程度だとすると、Vdifは、1.0×10−3m/sとなるので、光検出領域の位置の移動速度は、その10倍以上の15mm/sと設定されてよい。なお、発光粒子の拡散係数が未知の場合には、光検出領域の位置の移動速度を種々設定して光強度の変化のプロファイルが、予想されるプロファイル(典型的には、励起光強度分布と略同様)となる条件を見つけるための予備実験を繰り返し実行して、好適な光検出領域の位置の移動速度が決定されてよい。
上記の処理により試料溶液中の発光粒子の時系列の光強度データが得られると、コンピュータ18に於いて、記憶装置に記憶されたプログラムに従った処理により、光強度データ上に於ける発光粒子からの光に対応する信号の検出及び各発光粒子の種類の識別が実行される。
時系列の光強度データに於いて、一つの発光粒子の光検出領域を通過する際の軌跡が、図4(B)に示されている如く略直線状である場合、その粒子に対応する信号に於ける光強度の変化は、(光学系により決定される)光検出領域内の光強度分布を反映した略釣鐘状のプロファイルを有する(図4(C)最上段参照)。従って、走査分子計数法では、基本的には、適宜設定される閾値を超える光強度が継続する時間幅が所定の範囲にあるとき、その光強度のプロファイルを有する信号が一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されるようになっていてよい。そして、閾値を超える光強度が継続する時間幅が所定の範囲にない信号は、ノイズ又は異物の信号として判定される。また、光検出領域の光強度分布が、ガウス分布:
I=A・exp(−2t2/a2) …(4)
であると仮定できるときには、有意な光強度のプロファイル(バックグラウンドでないと明らかに判断できるプロファイル)に対して式(4)をフィッティングして算出された強度A及び幅aが所定の範囲内にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されてよい。(強度A及び幅aが所定の範囲外にある信号は、ノイズ又は異物の信号として判定され、その後の分析等に於いて無視されてよい。)
かくして、複数の検出波長帯域の各々の時系列光強度データに於いて、発光粒子の信号が検出されると、発光粒子毎に、複数の検出波長帯域の光強度を参照して、それらの配分に基づいて、発光粒子の種類が判定される。各成分の光強度としては、ステップ130〜160に於いて検出された発光粒子の信号のピーク強度、フォトンカウントの積算値、或いは、フィッティングされた釣鐘型関数の時間積分値などが採用されてよい。例えば、図2(C)の如く、検出波長帯域が3つ以上であるときには、それらの強度比、(Ich1/Io):(Ich2/Io):(Ich3/Io):…を参照して、その比の配分に基づいて発光粒子の種類の識別が為されてよい(Ioは、複数の検出波長帯域の成分の強度の総和である。)。また、図2(D)の如く、検出波長帯域が2つであるときには、それらの強度比の値Ich1/Ich2が算出され、その算出値によって発光粒子の種類の識別が為されてもよい。そして、予め複数の検出波長帯域の成分の強度の比が既知である発光粒子については、上記にて算出された強度比からその種類の同定が可能となる。
Vt=N/C …(5)
により与えられる。また、対照溶液として、発光粒子の複数の異なる濃度の溶液が準備され、それぞれについて測定が実行されて、算出されたVtの平均値が光検出領域の通過した領域の総体積Vtとして採用されるようになっていてよい。そして、Vtが与えられると、発光粒子のカウンティング結果がnの試料溶液の発光粒子の濃度cは、
c=n/Vt …(6)
により与えられる。なお、光検出領域の体積、光検出領域の通過した領域の総体積は、上記の方法によらず、任意の方法にて、例えば、FCS、FIDAを利用するなどして与えられるようになっていてよい。また、本実施形態の光分析装置に於いては、想定される光検出領域の移動パターンについて、種々の標準的な発光粒子についての濃度Cと発光粒子の数Nとの関係(式(5))の情報をコンピュータ18の記憶装置に予め記憶しておき、装置の使用者が光分析を実施する際に適宜記憶された関係の情報を利用できるようになっていてよい。なお、本発明では、発光粒子の種類が識別可能なので、発光粒子の種類毎に数密度又は濃度が決定可能である。
20μ秒<パルス幅<400μ秒
ピーク強度>1.0[pc/10μs] …(A)
相関係数>0.95
を満たすパルス信号のみを発光粒子に対応する信号であると判定する一方、上記の条件を満たさないパルス信号はノイズとして無視した。次いで、ch2の時系列光強度データ上において発光粒子の信号として判定された信号発生期間(パルス存在領域)に於けるch1の時系列光強度データ上のフォトンカウントの積算値及びch2の時系列光強度データ上のフォトンカウントの積算値を、それぞれ、発光粒子の信号のch1の強度値Ich1、ch2の強度値Ich2として算定した。
Claims (12)
- 共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出し分析する光分析装置であって、
前記光学系の光路を変更することにより前記試料溶液内に於いて前記光学系の光検出領域の位置を移動する光検出領域移動部と、
前記光検出領域からの光の複数の波長帯域の成分の強度を検出する光検出部と、
前記試料溶液内に於いて前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出部にて検出された光の複数の波長帯域の成分の強度に於いて前記発光粒子の各々からの光の信号を個別に検出し、前記検出された発光粒子の光の信号の複数の波長帯域の成分の強度に基づいて前記発光粒子の種類を識別する信号処理部とを含むことを特徴とする装置。 - 請求項1の装置であって、前記信号処理部が、前記発光粒子の光の信号の複数の波長帯域の成分の強度の比に基づいて前記発光粒子の種類を識別することを特徴とする装置。
- 請求項1の装置であって、前記光検出部が前記光検出領域からの光の二つの波長帯域の成分の強度を検出し、前記信号処理部が前記二つの波長帯域の成分の強度の比に基づいて前記発光粒子の種類を識別することを特徴とする装置。
- 請求項1の装置であって、更に、1つの波長帯域の励起光を前記光検出領域に照射する光照射部を含み、前記発光粒子が前記1つの波長帯域の励起光の照射により発光する粒子であり、前記光検出部が前記1つの波長帯域の励起光の照射により発せられる前記光検出領域からの光の複数の波長帯域の成分の強度を検出することを特徴とする装置。
- 請求項1の装置であって、前記信号処理部が、前記個別に検出された発光粒子の光の信号の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記発光粒子の数を計数することを特徴とする装置。
- 請求項1乃至5のいずれかの装置であって、前記光検出領域移動部が前記発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて前記光検出領域の位置を移動することを特徴とする装置。
- 共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出し分析する光分析方法であって、
前記光学系の光路を変更することにより前記試料溶液内に於いて前記光学系の光検出領域の位置を移動する過程と、
前記試料溶液内に於いて前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出領域からの光の複数の波長帯域の成分の強度を検出する過程と、
前記検出された光の複数の波長帯域の成分の強度に於いて前記発光粒子の各々からの光の信号を個別に検出し、前記検出された発光粒子の光の信号の複数の波長帯域の成分の強度に基づいて前記発光粒子の種類を識別する過程とを含むことを特徴とする方法。 - 請求項7の方法であって、前記発光粒子の光の信号の複数の波長帯域の成分の強度の比に基づいて前記発光粒子の種類が識別されることを特徴とする方法。
- 請求項7の方法であって、前記光検出領域からの光の二つの波長帯域の成分の強度が検出され、前記二つの波長帯域の成分の強度の比に基づいて前記発光粒子の種類が識別されることを特徴とする方法。
- 請求項7の方法であって、更に、1つの波長帯域の励起光を前記光検出領域に照射する過程を含み、前記発光粒子が前記1つの波長帯域の励起光の照射により発光する粒子であり、前記1つの波長帯域の励起光の照射により発せられる前記光検出領域からの光の複数の波長帯域の成分の強度が検出されることを特徴とする方法。
- 請求項7の方法であって、更に、前記個別に検出された発光粒子の光の信号の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記発光粒子の数を計数する過程を含むことを特徴とする方法。
- 請求項7乃至11のいずれかの方法であって、前記光検出領域の位置を移動する過程に於いて、前記光検出領域の位置が前記発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動されることを特徴とする方法。
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