CN105593667A - 利用单个发光粒子检测的光分析装置、光分析方法以及光分析用计算机程序 - Google Patents

利用单个发光粒子检测的光分析装置、光分析方法以及光分析用计算机程序 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种在使用了共焦显微镜或多光子显微镜的光测量的扫描分子计数法中估算浓度随时间变化的发光粒子浓度或者检测浓度变化速度或反应速度的方法。在本发明的检测样本溶液中的发光粒子的光的光分析技术中，生成一边使显微镜的光检测区域的位置在样本溶液内移动一边检测出的来自光检测区域的光的时序光强度数据，在按时间序列的光强度数据中依次测量所检测出的发光粒子的信号的产生时间的间隔，使用依次测量出的信号产生时间间隔来确定发光粒子的浓度或浓度变化速度。

Description

利用单个发光粒子检测的光分析装置、光分析方法以及光分析用计算机程序
技术领域
本发明涉及一种光分析技术，能够使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统等能够检测来自溶液中的微小区域的光的光学系统，检测来自分散或溶解在溶液中的原子、分子或它们的聚合体(以下将它们称为“粒子”)、例如蛋白质、肽、核酸、脂质、糖链、氨基酸或它们的聚合体等生物体分子、病毒、细胞等粒子状的对象物、或非生物学粒子的光，来获取在分析或解析它们的状态(相互作用、结合/离解状态等)时有用的信息，更详细地说，涉及一种能够使用如上所述的光学系统逐个检测来自单个发光的粒子的光并进行各种光分析的光分析装置、光分析方法以及光分析用计算机程序。此外，在本说明书中，发光的粒子(以下称为“发光粒子”)可以是其自身发光的粒子、或附加了任意的发光标识或发光探针的粒子，从发光粒子发出的光可以是荧光、磷光、化学发光、生物发光、散射光等。
背景技术
由于近年来的光测量技术的发展，使用共焦显微镜的光学系统和还能够进行光子计数(单光子检测)的超高灵敏度的光检测技术，能够检测/测定单光子或荧光单分子水平的微弱光。因此，提出了各种使用这样的微弱光的测量技术对生物体分子等的特性、分子间相互作用、或结合/离解反应进行检测的光分析技术。作为这样的光分析技术，例如已知有荧光相关光谱分析(FluorescenceCorrelationSpectroscopy：FCS。例如参照专利文献1-3)、荧光强度分布分析(Fluorescence-IntensityDistributionAnalysis：FIDA。例如专利文献4)、光子计数直方图(PhotonCountingHistogram：PCH。例如专利文献5)等。另外，在专利文献6～8中，提出了根据利用共焦显微镜的光学系统测量出的样本溶液的荧光信号的时间经过来检测荧光性物质的方法。
并且，本申请的申请人在专利文献9～12中提出了一种利用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统等能够检测来自溶液中的微小区域的光的光学系统的光分析技术，是基于与FCS、FIDA等光分析技术不同的原理的新的光分析技术。在所述新的光分析技术(以下称为“扫描分子计数法”。)中，一边使作为光的检测区域的微小区域(以下称为“光检测区域”。在使用激励光的情况下，与激励光的聚光区域大致一致。)的位置在样本溶液内移动、即一边利用光检测区域扫描样本溶液内，一边逐个检测在光检测区域包含在样本溶液中分散并随机运动的发光粒子时从该发光粒子发出的光，由此能够对样本溶液中的发光粒子逐一进行检测，来获取与发光粒子的计数、样本溶液中的发光粒子的浓度或数密度有关的信息。
专利文献1：日本特开2005-098876
专利文献2：日本特开2008-292371
专利文献3：日本特开2009-281831
专利文献4：日本特许第4023523号
专利文献5：国际公开2008-080417
专利文献6：日本特开2007-20565
专利文献7：日本特开2008-116440
专利文献8：日本特开平4-337446号公报
专利文献9：国际公开第2011/108369
专利文献10：国际公开第2011/108370
专利文献11：国际公开第2011/108371
专利文献12：国际公开第2012/099234
发明内容
发明要解决的问题
另外，在检测或分析溶液中的粒子的浓度或其它状态(相互作用、结合/离解状态等)时，粒子浓度的变化速度或粒子的相关反应的反应速度成为有用的信息。然而，在目前为止的扫描分子计数法中，在成为样本溶液中的观察对象的发光粒子的浓度随时间变化的情况下，有时很难高精度地检测所述发光粒子浓度或其变化速度。
如上述的文献所记载的那样，在目前为止的扫描分子计数法中，典型地，作为一个方式，在任意设定的测量时间内一边使光检测区域在样本溶液中移动一边进行光测量，对在所得到的按时间序列的光强度值的数据(时序光强度数据)中检测出的发光粒子的信号进行计数(专利文献9～11)，或者，作为其它的方式，执行一边使光检测区域在样本溶液中移动一边进行的光测量以及时序光强度数据中的发光粒子的信号的检测和计数，直到能够得到任意设定的粒子的检测数为止(专利文献12)。而且，在前者的方式的情况下，基于所设定的测量时间内的检测数来估算发光粒子的浓度，在后者的情况下，基于检测所设定的粒子数需要的测量时间来估算发光粒子的浓度。
然而，在成为观察对象的发光粒子的浓度未知的情况下或随时间变化的情况下，在固定的测量时间内执行光测量或执行光测量直到固定检测数为止的方式中，依赖于所设定的测量时间或信号检测数，有时对于基于检测结果估算出的浓度值或变化速度无法获得充分的精度。
例如图9所示，在固定的测量时间内进行光测量的方式中，在所设定的测量时间比较短时(T1)，对于浓度的增加快的发光粒子(A、B、C)，由于浓度变得足够高，因此能够检测，但是对于浓度的增加慢的发光粒子(D)，浓度过低而可能很难检测。因此，如果将测量时间设定得比较长(T2)，则浓度的增加慢的发光粒子(D)的浓度增大至可检测的水平，但是导致对浓度的增加快的发光粒子在超过需要的长时间内执行光测量。另外，在浓度的增加特别快的发光粒子(A、B)的情况下，由于浓度增加达到了饱和状态，因此无法捕捉发光粒子浓度的时间变化。另一方面，在进行光测量直到能够获得固定的检测数为止的方式中，在所设定的检测数比较大时(P1)，对于浓度的增加快的发光粒子(A、B、C)，能够以比较短的时间完成测量，但是对于浓度的增加慢的发光粒子(D)，检测需要的测量时间可能非常长。因此，在减少所设定的检测数时(P2)，对于浓度的增加慢的发光粒子(D)，检测需要的测量时间非常长从而能够获得有意义的值，但是对于浓度的增加快的发光粒子(A、B、C)，检测需要的测量时间过短而可能难以高精度地获得值。另外，对于浓度的增加慢的发光粒子(D)与浓度的增加快的发光粒子(A、B、C)的浓度变化速度的差异，由于检测需要的测量时间的差为非常大的值而能够有意义地检测，但是对于浓度的增加快的发光粒子(A、B、C)之间的浓度变化速度，检测需要的测量时间过短而难以高精度地检测其差异。
即，在扫描分子计数法中如上述那样在固定的测量时间内执行光测量或执行光测量直到固定检测数为止的情况下，期望在某种程度上预测成为观测对象的发光粒子的浓度来预先设定适当长度的测量时间或适当大小的信号检测数，但是在发光粒子浓度变化的系统中，难以设定适当的测量时间或信号检测数来进行浓度的检测，并且，也难以检测浓度变化速度或反应速度。另外，在光测量的执行中浓度变化速度或反应速度发生变化的发光粒子的情况下，在固定的测量时间内执行光测量或执行光测量直到固定检测数为止的方式中，更难高精度地检测发光粒子的浓度或其变化。
这样，本发明的主要课题在于提供一种在成为观测对象的发光粒子的浓度随时间变化的情况下也能够进行发光粒子浓度的估算或者浓度变化速度或反应速度的检测的基于扫描分子计数法的新的光分析技术。
用于解决问题的方案
根据本发明的一个方式，通过以下的装置来达成上述的课题，该装置是使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统来检测来自在样本溶液中分散并随机运动的发光粒子的光的光分析装置，该光分析装置包括：光检测区域移动部，其使显微镜的光学系统的光检测区域的位置在样本溶液内移动；光检测部，其检测来自光检测区域的光；以及信号处理部，其生成一边使光检测区域的位置在样本溶液内移动一边由光检测部检测出的来自光检测区域的光的按时间序列的光强度数据，在按时间序列的光强度数据中逐个检测各个发光粒子的信号，其中，信号处理部沿着按时间序列的光强度数据中的时间的经过，在按时间序列的光强度数据中依次测量所检测出的发光粒子的信号的产生时间的间隔，使用依次测量出的多个信号产生时间间隔来确定表示发光粒子的浓度的指标值。
在所述结构中，“在样本溶液中分散并随机运动的发光粒子”是指在样本溶液中分散或溶解的原子、分子或它们的聚合体等发出光的粒子，只要是不固定在基板等上而自由地在溶液中进行布朗运动的粒子，则可以是任意的粒子。所述发光粒子典型的是荧光性粒子，但也可以是通过磷光、化学发光、生物发光、光散射等来发出光的粒子。另外，特别地，在本发明中设为观察对象的发光粒子也可以是浓度随着时间的经过而发生变化的粒子。共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统的“光检测区域”是指这些显微镜中检测光的微小区域，在从物镜提供照明光的情况下，相当于该照明光会聚到的区域(在共焦显微镜中，特别地根据物镜和针孔之间的位置关系来确定。在发光粒子是没有照明光而发光的情况下，例如通过化学发光或生物发光来发光的粒子的情况下，在显微镜中不需要照明光。)。另外，典型的是，光检测部通过对每隔规定的测量单位时间(BINTIME)来到的光子数进行计数的光子计数，检测来自光检测区域的光，在该情况下，按时间序列的光强度数据为按时间序列的光子计数数据。此外，在本说明书中，在称为“发光粒子的信号”的情况下，只要没有特别限定，是指表示来自发光粒子的光的信号。
如从上述理解的那样，在作为本发明的基本结构的扫描分子计数法中，首先，一边使光检测区域的位置在样本溶液内移动、即一边通过光检测区域扫描样本溶液内，一边依次进行光的检测。这样，在样本溶液内移动的光检测区域包含了随机运动的发光粒子时，检测到来自发光粒子的光，由此，检测出一个发光粒子的存在。因而，在依次检测出的光强度数据中逐个检测来自发光粒子的光的信号，由此逐个地逐一依次检测粒子的存在，能够获取与粒子在溶液内的状态有关的各种信息。在所述结构中，关于在按时间序列的光强度数据中依次检测出的发光粒子的信号，如在后面更详细地说明的那样，样本溶液内的发光粒子的在此时的浓度越高，依次产生的发光粒子的信号的产生时间的间隔越短。即，当在光测量的执行中样本溶液内的发光粒子的浓度发生变化时，与其对应地，发光粒子的信号的产生时间的间隔发生变化。因此，在上述的本发明中，进一步在信号处理部中，沿着按时间序列的光强度数据中的时间的经过，在按时间序列的光强度数据中依次测量所检测出的发光粒子的信号的产生时间的间隔，使用依次测量出的多个信号产生时间间隔来确定表示发光粒子的浓度的指标值。在此，“表示发光粒子的浓度的指标值”可以是浓度值本身或能够换算为浓度的任意的值。根据所述结构，即使在设为观察对象的发光粒子的浓度随时间变化的情况下，也能够时时刻刻地追踪发光粒子的浓度或其指标值。
另外，根据上述的结构，能够追踪发光粒子的浓度或其指标值的时间变化。因而，在上述的本发明的装置中，也可以构成为信号处理部使用依次测量出的多个信号产生时间间隔来确定表示发光粒子的浓度的变化速度的指标值。此外，“表示浓度的变化速度的指标值”可以是变化速度值本身或能够换算为变化速度值的任意的值。根据所述结构，能够获取粒子的相关的各种现象、例如构造变化、相互作用、结合/离解反应等中的粒子浓度的变化速度或粒子的相关的反应的反应速度的值，成为在粒子的相关的现象的检测或分析中有用的信息。
并且，通过使用利用依次测量出的多个信号产生时间间隔而获得的时时刻刻的发光粒子的浓度值或其指标值或者浓度的变化速度值或其指标值，能够估计或确定成为观测对象的发光粒子的任意的时间中的浓度值或其指标值、例如反应或浓度变化的初浓度或饱和浓度等。因而，在上述的本发明的装置中，信号处理部也可以构成为使用依次测量出的多个信号产生时间间隔来确定任意时间中的表示发光粒子的浓度的指标值。
此外，在上述的结构中，依次测量出的发光粒子的信号的产生时间的间隔可以是产生任意设定的个数的发光粒子的信号的间隔。例如发光粒子的信号产生时间间隔可以是产生一个信号至产生下一个信号为止的时间间隔，或者也可以是产生一个信号至产生多个信号为止的时间间隔。对于任意设定的个数，只要能够掌握其个数即可，也可以使其在一次的光测量中变化。
在上述的本发明的装置中，通过通用的计算机也能够实现光分析技术的处理，该光分析技术是一边使样本溶液内的光检测区域的位置移动一边进行光检测并逐个检测来自发光粒子的信号的光分析技术，并且依次测量发光粒子的信号的产生时间的间隔，使用依次测量出的信号产生时间间隔来确定发光粒子的浓度或浓度变化速度。因而，根据本发明的另一个方式，提供一种用于使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统来检测来自在样本溶液中分散并随机运动的发光粒子的光的光分析用计算机程序，该光分析用计算机程序使计算机执行以下过程：使显微镜的光学系统的光检测区域的位置在样本溶液内移动；一边使光检测区域的位置在样本溶液内移动一边测定来自光检测区域的光的强度，来生成按时间序列的光强度数据；在按时间序列的光强度数据上逐个检测各个发光粒子的信号；沿着按时间序列的光强度数据中的时间的经过，在按时间序列的光强度数据中依次测量所检测出的发光粒子的信号的产生时间的间隔；以及使用依次测量出的多个信号产生时间间隔来确定表示发光粒子的浓度的指标值。此外，计算机程序通过存储到计算机可读取的存储介质中来提供。计算机通过读出存储在存储介质中的程序来执行信息的加工、运算处理，由此执行上述的过程。在此，计算机可读取的存储介质可以是磁盘、磁光盘、CD-ROM、DVD-ROM、半导体存储器等。并且，上述的程序也可以通过通信线路被传送到计算机，由接收到该传送的计算机执行程序。
在所述结构中，也可以设置以下过程：使用依次测量出的多个信号产生时间间隔来估算表示发光粒子的浓度的变化速度的指标值，在确定表示发光粒子的浓度的指标值的过程中，可以使用依次测量出的多个信号产生时间间隔来确定按时间序列的光强度数据中的任意时间的表示发光粒子的浓度的指标值。另外，发光粒子的信号的产生时间的间隔可以是产生规定数量的发光粒子的信号的时间间隔。
并且，根据上述的本发明的装置或计算机程序，实现如下一种光分析方法，该光分析方法是一边使光检测区域的位置在样本溶液内移动一边进行光检测并逐个检测来自发光粒子的信号的光分析方法，该光分析方法依次测量发光粒子的信号的产生时间的间隔，使用依次测量出的信号产生时间间隔来确定发光粒子的浓度或浓度变化速度。这样，根据本发明，还提供一种使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统来检测来自在样本溶液中分散并随机运动的发光粒子的光的光分析方法，该方法包括以下步骤：使显微镜的光学系统的光检测区域的位置在样本溶液内移动；一边使光检测区域的位置在样本溶液内移动一边测定来自光检测区域的光的强度，生成按时间序列的光强度数据；在按时间序列的光强度数据上逐个检测各个发光粒子的信号；沿着按时间序列的光强度数据中的时间的经过，在按时间序列的光强度数据中依次测量所检测出的发光粒子的信号的产生时间的间隔；以及使用依次测量出的多个信号产生时间间隔，来确定表示发光粒子的浓度的指标值。
在所述结构中也可以设置以下步骤：使用依次测量出的多个信号产生时间间隔来估算表示发光粒子的浓度的变化速度的指标值，在确定发光粒子的浓度的步骤中，可以使用依次测量出的多个信号产生时间间隔来确定按时间序列的光强度数据中的任意时间的表示发光粒子的浓度的指标值。另外，发光粒子的信号的产生时间的间隔可以是产生规定数量的发光粒子的信号的时间间隔。
上述的本发明的光分析技术典型地用于分析或解析蛋白质、肽、核酸、脂质、糖链、氨基酸或它们的聚合体等生物体分子、病毒、细胞等粒子状的生物学对象物在溶液中的状态的用途，但是也可以用于分析或解析非生物学粒子(例如原子、分子、胶束(micelles)、金属胶体等)在溶液中的状态，应该理解到这种情况也属于本发明的范围。光检测区域的位置相对于样本溶液的移动方法和方式、基于时序光强度数据中的光强度值抽出或检测各发光粒子的信号的方法和方式、确定用于确定绝对的浓度值的参数的方法和方式等可以与专利文献9～12等所记载的方法和方式相同。
发明的效果
如专利文献9～12等所记载的那样，根据在固定的测量时间内执行光测量或执行光测量直到固定检测数为止的扫描分子计数法，在样本溶液内的发光粒子的浓度处于准静态或稳定状态的情况下，能够高精度地执行发光粒子的计数和/或浓度的确定。另一方面，根据如本发明那样参照依次检测出的发光粒子的信号的产生时间的间隔来依次确定或估计发光粒子的浓度值或浓度变化速度或者它们的指标值的方式，在样本溶液内的发光粒子的浓度随时间变化的系统、即在发光粒子浓度处于动态状态的情况下，能够在时间上追踪发光粒子的浓度的变化或浓度变化速度的变化。另外，在本发明的情况下，由于能够追踪发光粒子的浓度变化的行为，因此实际上还能够估计没有执行光测量的时间中的发光粒子的浓度值或其指标值。并且，在本发明中，不需要预先设定光测量的测量时间或检测数，即使没有预先在某种程度上掌握成为观测对象的发光粒子的浓度，也能够达成发光粒子的浓度值或其指标值的确定或估计，从而降低了进行用于光测量的测量时间或检测数的设定的预备实验或反复试验的必要性，因此在能够节约所使用的样本溶液和发光粒子的量这一点上是有利的。即，本发明的结构也可以应用于样本溶液内的发光粒子的浓度处于准静态或稳定状态的情况，在该情况下，也能够节约在预备实验或反复试验中使用的样本溶液和发光粒子的量。并且，在本发明中，能够检测发光粒子的浓度变化速度或发光粒子的相关的反应的反应速度，因此在粒子的状态的分析中，能够获得目前为止的扫描分子计数法不能容易获得的有用的信息。
本发明的其它目的以及优点通过以下的本发明的优选实施方式的说明将变得清楚。
附图说明
图1的(A)是执行本发明的扫描分子计数法的光分析装置的内部构造的示意图。图1的(B)是共焦区组织(共焦显微镜的观察区域)的示意图。图1的(C)是变更反射镜7的朝向来使光检测区域的位置在样本溶液内移动的机构的示意图。图1的(D)是移动微板的水平方向位置来移动光检测区域在样本溶液内的位置的机构的示意图。
图2的(A)、(B)分别是说明应用本发明的扫描分子计数法的光检测的原理的示意图和所测量出的光强度的时间变化的示意图。图2的(C)是说明测量发光粒子信号的产生时间间隔来确定发光粒子浓度的原理的图。图2的(D)是光检测区域的通过区域的示意图。
图3的(A)是以流程图的形式表示按本发明执行的扫描分子计数法的处理步骤的图，图3的(B)是以流程图的形式表示从光测量直到发光粒子信号的检测为止的处理步骤的图。
图4的(A)、(B)分别是表示在发光粒子一边进行布朗运动一边横穿光检测区域时以及在由于以比发光粒子的扩散移动速度快的速度使样本溶液内的光检测区域的位置移动而发光粒子横穿光检测区域时的粒子的运动方式的模型图。图4的(C)是说明用于依照扫描分子计数法根据所测量的时序光强度数据(光子计数的时间变化)检测发光粒子的存在的处理步骤中的、检测信号的信号处理过程的例子的图。
图5示出了所测量的光子计数数据的实测例子(直方图表)、对数据进行平滑处理而得到的曲线(虚线)以及在脉冲存在区域中拟合的高斯函数(实线)。在图中，附加为“噪声”的信号作为由噪声或异物造成的信号而被忽略。
图6是在实施例1中使用的发光粒子的反应的模型图。
图7的(A)是在实施例1中获得的发光粒子信号的产生时间间隔(单个粒子的产生时间的间隔)的时间变化，图7的(B)是从发光粒子信号的产生时间间隔换算得到的发光粒子浓度的时间变化。
图8的(A)是在实施例1中获得的发光粒子信号的产生时间间隔(50个粒子的产生时间的间隔)的时间变化，图8的(B)是从发光粒子信号的产生时间间隔换算得到的发光粒子浓度的时间变化。此外，在图8的(A)中，纵轴的产生时间的间隔表示测量出的50个粒子的产生时间的间隔的1/50的值。
图9是示意性地表示浓度随时间变化的发光粒子的浓度的时间变化的图，说明了在扫描分子计数法中以在固定的测量时间(T1、T2)内执行光测量或执行光测量直到固定检测数(P1、P2)为止的方式检测出的结果的状态。
附图标记说明
1：光分析装置(共焦显微镜)；2：光源；3：单模光纤(single-modeopticalfiber)；4：准直透镜；5：分色镜；6、7、11：反射镜；8：物镜；9：微板；10：皿(样本溶液容器)；12：聚光镜(condenserlens)；13：针孔；14：屏蔽滤波器；14a：分色镜或偏振分束器；15：多模光纤(multi-modeopticalfiber)；16：光检测器；17：反射镜偏转器；17a：台位置变更装置；18：计算机。
具体实施方式
以下，详细地说明本发明的优选的实施方式。
光分析装置的结构
实现本发明的光分析技术的光分析装置的基本结构可以是如图1的(A)示意性地例示的那样将专利文献9～12所记载的能够执行扫描分子计数法或FCS、FIDA等的共焦显微镜的光学系统与光检测器组合所形成的装置。参照该图，光分析装置1由光学系统2～17以及用于控制光学系统的各部分的动作并且获取并解析数据的计算机18构成。光分析装置1的光学系统可以与普通的共焦显微镜的光学系统相同，在此，使从光源2发射并在单模光纤3内传播的激光(Ex)在光纤的出射端成为以由固有的NA决定的角度发散的光而被发射，通过准直器4成为平行光，被分色镜5、反射镜6、7反射，入射到物镜8。典型的是，在物镜8的上方配置有微板9，该微板9排列有注入了1μL～几十μL的样本溶液的样本容器或皿10，从物镜8射出的激光在样本容器或皿10内的样本溶液中形成焦点，形成光强度强的区域(激励区域)。在样本溶液中分散或溶解有作为观测对象物的发光粒子、典型的是附加有荧光性粒子或荧光色素等发光标识的粒子，当所述发光粒子进入到激励区域时，在其间发光粒子被激励而释放出光。所释放的光(Em)通过物镜8、分色镜5，被反射镜11反射而在聚光镜12聚光，通过针孔13，透过屏蔽滤波器14(在此，只选择特定的波长频带的光成分。)，被导入到多模光纤15，到达光检测器16，在被转换为按时间序列的电信号之后输入到计算机18，以后面说明的方式进行用于光分析的处理。此外，如本领域技术人员所了解的那样，在上述的结构中，针孔13配置在与物镜8的焦点位置共轭的位置，由此仅从如图1的(B)示意性地表示的激光的焦点区域、即激励区域内发出的光通过针孔13，来自激励区域以外的光被遮断。图1的(B)所例示的激光的焦点区域通常是具有1fL～10fL左右的有效体积的本光分析装置中的光检测区域(典型的是光强度以区域中心为顶点的高斯型分布。有效体积是以光强度为中心光强度的1/e2的面为边界的大致椭圆球体的体积。)，被称为共焦区组织。另外，在本发明中，由于能够检测来自一个发光粒子的光、例如来自一个荧光色素分子的微弱光，因此作为光检测器16，优选的是使用能够在光子计数中使用的超高灵敏度的光检测器。在光的检测通过光子计数来进行的情况下，以在规定时间内按每个测量单位时间(BINTIME)依次测量来到光检测器的光子的个数的方式执行光强度的测定。因而，在该情况下，按时间序列的光强度的数据是按时间序列的光子计数数据。另外，在显微镜的台(未图示)设置用于移动微板9的水平方向位置以变更要观察的皿10的台位置变更装置17a。可以由计算机18控制台位置变更装置17a的动作。根据所述结构，在存在多个检体的情况下也能够达成迅速的测量。
并且，在上述的光分析装置的光学系统中，设置通过光检测区域扫描样本溶液内、即用于使焦点区域即光检测区域的位置在样本溶液内移动的机构。作为所述的用于移动光检测区域的位置的机构，例如图1的(C)示意性地例示的那样，可以采用变更反射镜7的朝向的反射镜偏转器17(移动光检测区域的绝对位置的方式)。所述反射镜偏转器17可以与普通的激光扫描型显微镜中装配的检电镜装置相同。或者，作为其它的方式，如图1的(D)所例示的那样，也可以使台位置变更装置17a进行动作以移动注入了样本溶液的容器10(微板9)的水平方向的位置，使样光检测区域在本溶液内的相对位置移动(移动样本溶液的绝对位置的方式)。另外，也可以与上述的通过变更光路来移动光检测区域的绝对位置的方式使光检测区域沿着扫描轨道绕转移动同时地，通过移动样本溶液的位置的方式使样本溶液内的光检测区域的扫描轨道的位置沿着规定的移动路径移动。无论在哪种方式的情况下，都在计算机18的控制下，与光检测器16的光检测协调地驱动反射镜偏转器17或台位置变更装置17a以达成所期望的光检测区域的位置的移动图案。光检测区域的位置的扫描轨道可以是圆形、椭圆形等封闭的循环路径，可以从圆形、椭圆形、直线、曲线或它们的组合中任意地选择样本溶液的位置的移动轨迹(可以设为在计算机18中的程序中能够选择各种移动图案。)。此外，虽然没有图示，但也可以通过使物镜8或台上下移动来使光检测区域的位置在上下方向上移动。
在作为观测对象物的发光粒子通过多光子吸收而发光的情况下，上述光学系统被用作多光子显微镜。在这种情况下，只在激励光的焦点区域(光检测区域)释放光，因此可以去除针孔13。另外，在作为观测对象物的发光粒子不通过激励光而通过化学发光、生物发光现象发光的情况下，可以省略用于生成激励光的光学系统2～5。在发光粒子通过磷光或散射而发光的情况下，能够直接使用上述的共焦显微镜的光学系统。并且，可以在光分析装置1中如图示那样设置多个激励光源2，可以设为能够根据发光粒子的激励波长而适当地选择激励光的波长。同样地，也可以具备多个光检测器16，在样本中包含有波长不同的多种发光粒子的情况下，可以设为能够根据其波长分别检测来自它们的光。
计算机18具备CPU和存储器，通过CPU执行各种运算处理来执行本发明的步骤。此外，各步骤也可以由硬件构成。本实施方式中说明的处理的全部或一部分可以由计算机18使用存储有用于实现那些处理的程序的计算机可读取的存储介质来执行。即，计算机18可以通过读出存储在存储介质中的程序来执行信息的加工、运算处理，由此实现本发明的处理步骤。在此，计算机可读取的记录介质可以是磁盘、磁光盘、CD-ROM、DVD-ROM、半导体存储器等，或者也可以将上述的程序通过通信线路传送到计算机并由接收到该传送的计算机执行程序。
本发明的光分析技术的原理
如“发明内容”一栏所记载的那样，如果清楚地进行描述，则在本发明的光分析技术中，在扫描分子计数法中，在按时间序列的光强度数据中依次测量发光粒子的信号的产生时间的间隔，使用依次测量出的信号产生时间间隔来确定发光粒子浓度或浓度变化速度或它们的指标值。以下，对本发明的扫描分子计数法以及使用信号产生时间间隔来确定发光粒子浓度或浓度变化速度或它们的指标值的原理进行说明。
1.扫描分子计数法的原理
在“扫描分子计数法”(专利文献9～12)中，基本上，驱动用于使光检测区域的位置移动的机构(反射镜偏转器17)来变更光路，或者移动注入了样本溶液的容器10(微板9)的水平方向的位置，从而如图2的(A)示意性地描述的那样，一边使光检测区域CV的位置在样本溶液内移动、即一边通过光检测区域CV扫描样本溶液内，一边执行光检测。这样，例如在光检测区域CV移动的期间(图中为时间t0～t2)，在通过存在一个发光粒子的区域时(t1)，从发光粒子释放出光，如在图2的(B)中所描绘的那样，在按时间序列的光强度数据上出现有意义的光强度(Em)的脉冲状的信号。这样，执行上述的光检测区域CV的位置的移动和光检测，逐一检测其间出现的如图2的(B)所例示的脉冲状的信号(有意义的光强度)，由此逐个检测发光粒子，通过对其个数进行计数，能够获取在所测量的区域内存在的发光粒子的个数、或者与浓度或数密度有关的信息。在所述的扫描分子计数法的原理中，不进行如荧光强度的波动的计算那样的统计性的运算处理，而是逐个地检测发光粒子，因此即使在要观测的粒子的浓度低至无法通过FCS、FIDA等以足够的精度进行分析的程度的样本溶液中，也能够获取与粒子的浓度或数密度有关的信息。
2.使用信号产生时间间隔的发光粒子浓度的确定
与图9关联地，如已经记述的那样，在专利文献9～12所记载的扫描分子计数法中，如上述的那样在固定的测量时间内执行光测量或者执行光测量直到固定的检测数为止，基于固定的测量时间内的检测数或固定的检测数的检测需要的测量时间来估算样本溶液内的发光粒子的浓度值或其指标值。在所述结构中，为了高精度地或有效地进行光测量以及发光粒子的浓度检测，优选的是发光粒子的浓度是准静态或稳定的，且能够在某种程度上预测样本溶液内的发光粒子的浓度值。
另外，如图2的(C)示意性地描绘的那样，在通过扫描分子计数法获得的时序光强度数据中，发光粒子浓度越高，则发光粒子的信号的产生频率越大，因此信号的产生时间的间隔越窄。即，例如在发光粒子浓度随时间增大的情况下，如图示那样，信号产生时间间隔Tj为
Ti＞Tii＞Tiii＞Tiv＞Tv……(1)。
因而，通过使用发光粒子的信号的产生时间的间隔，能够进行发光粒子浓度的计算，并且通过依次追踪信号的产生时间的间隔，还能够追踪发光粒子浓度的变化。具体地说，如下述那样赋予发光粒子浓度与信号产生时间间隔的关系。即，如图2的(D)示意性地描绘的那样，在样本溶液中的发光粒子浓度为C时，在与扫描方向垂直的方向的截面积S的光检测区域CV以速度u移动时间τ的期间，被光检测区域CV包含的(即，检测出的)发光粒子的个数P为
P＝CSuτ＝Cπr2uτ…(2)。
在此，光检测区域CV的截面近似为半径r的圆。因而，检测一个发光粒子的信号需要的时间τ/P、即在检测出一个发光粒子之后直至检测出下一个发光粒子为止的时间间隔(单个粒子的信号产生时间间隔)Tj(＝τ/P)通过下式给出。
Tj＝1/(Cπr2u)…(3)
因此，通过测量信号产生时间间隔Tj，发光粒子浓度C被估算为
C＝1/(Tjπr2u)…(4)。
此外，发光粒子的检测过程、即信号的产生过程是概率性的，在单个粒子的信号产生时间间隔的偏差变大时，如图2的(C)所示那样，依次执行信号产生时间间隔Tj的测量以及向发光粒子的浓度值的换算，通过参照依次得到的发光粒子的浓度值能够在某种程度上抵消执行光测量的期间的发光粒子的浓度值和其时间变化的行为中的偏差。另外，信号产生时间间隔也可以是产生规定数量的粒子的信号的时间的间隔。即，可以是从某个粒子的信号产生时间直到第k个粒子的信号产生时间为止的时间间隔TKj，在该情况下，发光粒子浓度C通过下式给出。
C＝k/(TKjπr2u)…(4a)
在式(4a)的情况下，时间分辨率下降，但是能够期待抑制值的偏差。K可以是例如2～50等的整数。
如上所述，根据依次测量信号产生时间间隔来估算发光粒子浓度的值的方式，首先，能够掌握发光粒子浓度的时间变化的行为。因而，在发光粒子浓度随时间变化的系统中，能够沿着时间的经过追踪发光粒子浓度。由此，使用对追踪所得到的发光粒子浓度值进行拟合等处理能够确定发光粒子浓度的变化速度或发光粒子的相关的反应的反应速度。所述的浓度变化速度或反应速度在与发光粒子浓度变化的机理有关的分析或考察中是有用的信息。
另外，根据上述的方式，能够掌握发光粒子浓度的时间变化的行为，因此应该理解到不需要预先掌握发光粒子的浓度水平来设定用于光测量的固定的测量时间或固定的检测数。即，可以通过以下的处理步骤进行发光粒子浓度值的测量：在光测量中实时地执行信号产生时间间隔的测量或向浓度值的换算，在参照信号产生时间间隔或浓度值能够在某种程度上掌握发光粒子浓度的时间变化的行为的阶段结束光测量。在该情况下，在执行光测量直到能够在某种程度上掌握发光粒子浓度的时间变化的行为为止的阶段，通过参照该发光粒子浓度的时间变化的行为，能够判断发光粒子浓度是准静态或稳定的还是动态的，在该时点，即使不等待固定的测量时间或固定数量的检测完成而结束光测量，也能够期待基于发光粒子浓度的时间变化的行为以某种程度的精度确定发光粒子浓度值。换言之，根据参照依次测量出的信号产生时间间隔的上述方式，即使不预先掌握发光粒子的浓度值或浓度变化速度的水平，也能够以适当水平的精度通过扫描分子计数法确定发光粒子浓度。
并且，根据上述方式，能够掌握发光粒子浓度的时间变化的行为，因此也能够估计实际没有进行光测量的时间中的发光粒子浓度。即，例如能够基于所掌握的发光粒子浓度的时间变化的行为(浓度变化速度等)估计任意的反应中的反应开始时的发光粒子浓度或者经过足够时间之后或反应达到饱和时的发光粒子浓度。并且，应该理解，即使在发光粒子的浓度变化速度随时间变化的情况下，也能够根据所掌握的发光粒子浓度的时间变化的行为，来估计时时刻刻的发光粒子浓度值。
处理操作过程
在使用图1的(A)所例示的光分析装置1的本发明的光分析的实施方式中，具体地说，执行(1)含有发光粒子的样本溶液的调制、(2)样本溶液的光强度的测定和发光粒子的检测、计数处理以及(3)浓度、反应速度系数的计算等分析。
(1)样本溶液的调制
在本发明的光分析技术中，成为观测对象的粒子如果是溶解的分子等在样本溶液中分散并在溶液中随机运动的粒子，则可以是任意的，例如可以是蛋白质、肽、核酸、脂质、糖链、氨基酸或它们的聚合体等生物体分子、病毒、细胞、或金属胶体、其它非生物学粒子等(样本溶液典型的是水溶液，但是不限定于此，可以是有机溶剂及其它任意的液体。)。另外，作为观测对象的粒子可以是其自身发光的粒子，或者，也可以是以任意方式附加了发光标识(荧光分子、磷光分子、化学、生物发光分子)的粒子。另外，在本发明中，由于能够追踪发光粒子浓度的时间变化的行为，因此例如浓度因结合离解反应、分子间相互作用而变化的发光粒子、或发光特性因构造变化而变化的发光粒子能够用作观测对象的粒子。
(2)样本溶液的光强度的测定和发光粒子的检测
图3的(A)～(B)以流程图的形式表示使用图1的(A)所例示的光分析装置1执行的本实施方式中的样本溶液的光强度的测定和发光粒子的检测以及信号产生时间间隔的测量的处理的一个例子。在该图的例子中，如果清楚地描述，则按每个任意设定(设定得比较短)的解析时间间隔t执行光检测区域的位置的移动、来自光检测区域的光的检测以及来自发光粒子的信号的检测的一系列处理，在检测出发光粒子的信号的情况下，进行该时间与此前检测出发光粒子的信号的时间之间的时间间隔(信号产生时间间隔Tn或TKn)的测量，优选的是，实时地显示信号产生时间间隔Tn或TKn或者基于其值换算出的发光粒子浓度值或其指标值。而且，在任意的时间内连续地反复执行所述处理。此外，应该理解，下面记述的一系列的处理和结构能够通过计算机18的处理动作实现。
(i)初始设定
参照图3的(A)，在具体的操作处理中，首先，在向微板9的皿10注入样本溶液并载置在显微镜的台上之后，当使用者对计算机18输入光强度的测定、发光粒子的检测以及信号产生时间间隔的测量的开始指示时，计算机18进行在信号产生时间间隔的测量中所参照的粒子数[间隔测量粒子数K](步骤10)和解析时间间隔t的读入(步骤20)。间隔测量粒子数K可以是1以上的任意的整数。考虑到光检测区域的移动速度(u)和尺寸(2r)，可以将解析时间间隔t适当地设定为与一个发光粒子的信号的长度相比足够长的任意的时间(>2r/u)。(为了尽可能地避免一个发光粒子的信号在两个以上的解析时间间隔t出现。)间隔测量粒子数K和解析时间间隔t可以是以任意方式由使用者输入的值或在计算机18中适当设定的值。
(ii)发光粒子数的检测
这样，当进行了间隔测量粒子数K和解析时间间隔t的读入时，如以下那样，按每个解析时间间隔t反复执行以下处理：在解析时间间隔t内利用扫描分子计数法测定光强度，基于所测定出的光强度数据检测发光粒子的信号及记录信号产生时间(步骤30)；以及估算在步骤30中检测出的发光粒子信号的产生时间间隔(步骤40)。此外，优选的是，可以以使用者能够视觉识别相对于时间经过的变化的方式(例如表示相对于时间的变化的曲线图显示等)实时地将在步骤40中估算出的信号产生时间间隔或基于该信号产生时间间隔换算出的发光粒子浓度值或其指标值显示在计算机18的显示器上(步骤45)。以下，详细说明步骤30～45的处理。
(a)光强度的测定
图3的(B)是以流程图的形式表示步骤30中的处理过程的例子。参照该图，在步骤30的处理过程中，首先一边驱动反射镜偏转器17或台位置变更装置17a进行光检测区域的位置在样本溶液内的移动(样本溶液内的扫描)，一边在解析时间间隔t内进行光强度的测定(步骤100)。在所述处理中，典型的是，依照存储在存储装置(未图示)中的程序(使光检测区域的位置在样本溶液内移动的过程、向光检测区域照射激励光的过程(仅在需要时)以及在光检测区域的位置的移动中检测来自光检测区域的光的过程)，开始进行样本溶液内的光检测区域处的激励光的照射(仅在需要时)和光强度的测定。当开始测定时，首先，在计算机18依照程序进行的处理动作的控制下，从光源2射出样本溶液中的发光粒子的激励波长的光，并且反射镜偏转器17驱动反射镜7(检电镜)或者台位置变更装置17a驱动台来执行光检测区域的位置在皿10内的移动，与此同时，光检测器16将依次接收到的光转换为电信号后发送到计算机18，计算机18按照任意的方式根据发送来的信号生成按时间序列的光强度数据并保存。典型的是光检测器16是能够检测一个光子的到来的超高灵敏度光检测器，因此，光的检测是以每隔规定的单位时间(BINTIME)、例如每隔10μs依次测量来到光检测器的光子的个数的方式执行的光子计数，按时间序列的光强度的数据可以是按时间序列的光子计数数据。
关于光检测区域的位置的移动速度，在扫描分子计数法中，为了定量地高精度地执行根据测量出的按时间序列的光强度数据逐个检测发光粒子的检测，优选的是将光强度的测量过程中的光检测区域的位置的移动速度设定为比发光粒子的随机运动、即布朗运动所引起的移动速度快的值。在光检测区域的位置的移动速度比粒子的因布朗运动而进行的移动慢的情况下，如图4的(A)示意性地描绘的那样，粒子在区域内随机地移动，由此，光强度随机地变化(光检测区域的激励光强度以区域的中心为顶点向外方降低。)，难以确定与各个发光粒子对应的有意义的光强度的变化(表示来自发光粒子的光的信号)。因此，优选的是如图4的(B)所描绘的那样，粒子大致直线地横穿光检测区域CV，由此，在按时间序列的光强度数据中，与各个粒子对应的光强度的变化的轮廓是与图4的(C)最上部所例示那样的激励光强度分布大致相同的大致吊钟状，将光检测区域的位置的移动速度设定得比粒子因布朗运动而进行移动的平均移动速度(扩散移动速度)快，使得能够容易地确定各个发光粒子与光强度之间的对应。
具体地说，具有扩散系数D的发光粒子由于布朗运动而通过半径r的光检测区域(共焦区组织)时所需要的时间Δτ根据以下的平均平方位移的关系式，
(2r)2＝6D·Δτ…(5)
成为
Δτ＝(2r)2/6D…(6)
因此，发光粒子因布朗运动而移动的速度(扩散移动速度)Vdif大致为
Vdif＝2r/Δτ＝3D/r…(7)。
因此，光检测区域的位置的移动速度可以参照所述Vdif设定为与其相比充分快的值。例如在预想发光粒子的扩散系数是D＝2.0×10-10m2/s左右的情况下，在设r为0.62μm左右时，Vdif为1.0×10-3m/s，因此，可以将光检测区域的位置的移动速度设定为其10倍以上的例如15mm/s。此外，在发光粒子的扩散系数未知的情况下，可以设定各种光检测区域的位置的移动速度，反复执行用于找到光强度的变化的轮廓为预想的轮廓(典型的是与激励光强度分布大致相同)的条件的预备实验，来决定适合的光检测区域的位置的移动速度。
(b)与发光粒子对应的信号的检测
当通过上述的处理得到解析时间间隔t的样本溶液中的发光粒子的按时间序列的光强度数据时，通过计算机18依照被存储在存储装置中的程序进行处理，来执行光强度数据上的与来自发光粒子的光对应的信号的检测。
在按时间序列的光强度数据中，在一个发光粒子通过光检测区域时的轨迹如图4的(B)所示那样是大致直线状的情况下，与该粒子对应的信号的光强度的变化具有反映(由光学系统决定的)光检测区域内的光强度分布的大致吊钟状的轮廓(参照图4的(C)最上部)。因而，在扫描分子计数法中，基本上可以在超过适当设定的阈值的光强度所持续的时间宽度处于规定的范围内时，判定为具有该光强度的轮廓的信号与一个粒子通过光检测区域的情况对应，进行一个发光粒子的检测。而且，超过阈值的光强度所持续的时间宽度不在规定的范围内的信号被判定为噪声或异物的信号。另外，在能够将光检测区域的光强度分布假定为高斯分布时，即
I＝A·exp(-2t2/a2)…(8)
在使式(8)拟合有意义的光强度的轮廓(能够明确地判断为不是背景的轮廓)而计算出的强度A和宽度a处于规定的范围内时，可以将该光强度的轮廓判定为与一个粒子通过光检测区域的情况对应，进行一个发光粒子的检测。(强度A和宽度a处于规定的范围外的信号被判定为噪声或异物的信号，可以在其后的分析等中忽略。)
作为根据时序光强度数据进行发光粒子的检测的处理的更具体的方法的一个例子，首先对时序光强度数据(图4的(C)、最上部“检测结果(未处理)”)进行平滑(平滑化)处理(图3的(B)-步骤110、图4的(C)的中上部“平滑”)。发光粒子所发出的光是概率性地释放的，在微小的时间内可能产生数据值的缺失，因此通过所述平滑处理，能够忽略如上所述的数据值的缺失。例如可以通过移动平均法进行平滑处理。此外，也可以根据获取光强度数据时的光检测区域的位置的移动速度(扫描速度)、BINTIME，适当地设定执行平滑处理时的参数，例如在移动平均法中进行一次平均的数据个数、移动平均的次数等。
接着，在平滑处理后的时序光强度数据中，为了检测有意义的脉冲状的信号(以下称为“脉冲信号”)所存在的时间区域(脉冲存在区域)，对平滑处理后的时序光强度数据计算时间的一次微分值(步骤120)。时序光强度数据的时间微分值如图4的(C)的中下部“时间微分”所例示的那样，在信号值变化的时点值的变化大，因此通过参照所述时间微分值，能够有利地确定有意义的信号的起点和终点。
然后，在时序光强度数据上，依次检测有意义的脉冲信号，判断检测出的信号是否是与发光粒子对应的信号。具体地说，首先在时序光强度数据的按时间序列的时间微分值数据上，参照时间微分值依次搜索并确定一个脉冲信号的起点和终点，确定脉冲存在区域(步骤130)。当确定了一个脉冲存在区域时，针对该脉冲存在区域中的平滑后的时序光强度数据进行吊钟型函数的拟合(图4的(C)的下部的“吊钟型函数拟合”)，计算吊钟型函数的脉冲的峰值(最大值)的强度Ipeak、脉冲宽度(半峰全宽)Wpeak、拟合时的(最小二乘法的)相关系数等参数(步骤140)。此外，拟合的吊钟型函数典型的是如式(8)那样的高斯函数，但也可以是洛仑兹型函数。然后，判断计算出的吊钟型函数的参数是否处于针对一个发光粒子通过光检测区域时检测出的脉冲信号所描绘的吊钟型的轮廓的参数所设想的范围内，即脉冲的峰值强度、脉冲宽度、相关系数是否分别处于规定范围内等(步骤150)。这样，如图5的左边所示那样，将被判定为计算出的吊钟型函数的参数处于针对与一个发光粒子对应的信号设想的范围内的信号判定为是与一个发光粒子对应的信号，由此，检测出一个发光粒子，检测该信号的产生时间tpn(例如在峰值时)并进行记录。另一方面，如图5的右边所示那样，计算出的吊钟型函数的参数不在设想的范围内的脉冲信号作为噪声而被忽略。另外，由于还存在一个解析时间间隔t的时序光强度数据上产生两个以上的发光粒子信号的情况，因此也可以对检测出的发光粒子的信号的个数进行计数(步骤160)。
可以在解析时间间隔t内的时序光强度数据的整个区域中反复执行上述步骤130～160的处理中的脉冲信号的搜索、判定以及产生时间的记录(步骤170)。此外，根据时序光强度数据逐个检测发光粒子的信号的处理不限于上述的过程，可以通过任意的方法执行。当在解析时间间隔t内的所有时序光强度数据中脉冲信号的搜索结束时，步骤30结束，执行步骤40。
(iii)信号产生时间间隔的计算(以及显示、更新)
这样，当进行解析时间间隔t内的时序光强度数据中的发光粒子信号的检测处理时，估算所检测出的信号的产生时间间隔Tn。在信号产生时间间隔Tn中，在间隔测量粒子数K＝1时，将在前一个步骤30中检测出的发光粒子信号的产生时间tpn与前次检测出的发光粒子信号产生时间tp(n-1)的差tpn-tp(n-1)估算为Tn(tpn)。此外，在一次的测定中，关于最初检测出的发光粒子信号，可以不估算信号产生时间间隔Tn。另外，当在前一个步骤30中在解析时间间隔t检测出两个以上的发光粒子信号的情况下，关于各个发光粒子信号，估算基于前一个产生的发光粒子信号的产生时间而测量出的发光粒子信号产生时间。在间隔测量粒子数K>1时，关于信号产生时间间隔Tn，可以在每次发光粒子信号的检测数达到K时估算信号产生时间间隔TKn。即，在从最初检测出的发光粒子信号的产生或进行了信号产生时间间隔TKn的估算的信号的产生起产生了第K个信号时，将其产生时间tpn与最初检测出的发光粒子信号或进行了信号产生时间间隔的估算的信号的产生时间tp(n-1)的差估算为信号产生时间间隔TKn。
当如上述那样估算出信号产生时间间隔Tn或TKn时，如已经提及的那样，所述的值可以被显示在计算机18的显示器上。优选的是，显示是横轴为从测量开始起的经过时间、纵轴为信号产生时间间隔以能够容易地掌握信号产生时间间隔的时间变化的曲线图形式，但是不限定于此。也可以进一步，用曲线图形式显示使用式(4)或(4a)将信号产生时间间隔换算为发光粒子浓度C得到的值或能够掌握发光粒子浓度C的时间变化的任意的指标值(例如信号产生时间间隔的倒数等)。
(d)测定的结束
如已经提及的那样，步骤10～45中的处理可以在任意的时间内按每个解析时间间隔t反复地执行。关于该点，优选的是，在从测量的开始到结束为止在执行步骤100以外的信号处理步骤的过程中也连续地执行图3的(B)的步骤100的光强度的测定。即，在图3的处理循环中，当一个循环的解析时间间隔t内的步骤100的光强度的测定完成时，直接连续地执行下一循环的解析时间间隔t内的步骤100的光强度的测定，同时在计算机18中根据在所完成的循环的解析时间间隔t内获取到的光强度数据执行发光粒子的信号的检测、信号产生时间间隔的确定的处理。由此，达成实时地进行发光粒子的检测、信号产生时间间隔的确定。
如上所述，根据在光测定中能够实时地掌握信号产生时间间隔或发光粒子浓度的时间变化的方式，也可以参照所述的时间变化适当地变更间隔测量粒子数K和解析时间间隔t。另外，一系列的处理可以在任意的时点结束。如果在光测定中能够实时地掌握信号产生时间间隔或发光粒子浓度的时间变化，则使用者可以参照所述时间变化在任意的时点对装置1指示测定的结束，由此结束测定(步骤50)。另一方面，在使用者未给出测定的结束指示的情况下，也可以在固定的时间经过后或信号的检测数达到固定值之后自动结束。应该理解的是，在本发明中，由于能够观测到发光粒子浓度的时间变化，因此可以在能够获得能掌握发光粒子浓度变化的动态行为的结果的时点结束测定。
(3)浓度值或浓度变化速度值的计算等分析
如上所述，通过在光测定中随着时间的经过测量信号产生时间间隔，能够观测发光粒子的浓度的时间变化，因此能够基于所述测量结果估算浓度变化速度。发光粒子浓度的时间变化的方式根据发光粒子的相关的现象(构造变化、结合/离解反应等)的机理而不同，因此通过使基于适当选择的机理设想的模型式(作为时间函数的浓度值的式等)拟合观测到的发光粒子的浓度的时间变化，来计算浓度变化速度值、变化速度系数等。另外，在能够找出适合于观测到的发光粒子的浓度的时间变化的、发光粒子的相关的现象的机理的情况下，能够估计没有执行光测量的时间区域中的发光粒子浓度值和/或浓度变化速度值。并且，在发光粒子浓度变化是准静态或稳定的情况下，信号产生时间间隔实质不发生变化，因此能够期待能够基于执行光测量期间中的信号产生时间间隔的平均值或从信号产生时间间隔换算得到的浓度值的平均值高精度地确定发光粒子浓度值。
另外，在从信号产生时间间隔向发光粒子浓度换算的式(4)或(4a)中，可以根据激励光或检测光的波长、透镜的数值孔径、光学系统的调整状态，在理论上估算光检测区域的通过区域的截面半径r，或者根据通过如下方法检测出的发光粒子的个数和对照溶液的发光粒子的浓度来进行确定，该方法是通过实验，例如针对发光粒子的浓度已知的溶液(对照溶液)以与要检查的样本溶液的测定相同的条件进行上述所说明的光强度的测定、发光粒子的检测、计数。具体地说，例如针对发光粒子的浓度C的对照溶液，当设以移动速度uo在某时间τo内执行的光强度的测定中发光粒子的检测数为N时，通过下式给出光检测区域的通过区域的截面积S(在此，NA为阿伏伽德罗常数。)。
S＝N/(C·NA·uo·τo)…(9)
另外，作为对照溶液，可以准备发光粒子的多个不同浓度的溶液，针对各个溶液执行测定，并采用所计算出的S的平均值作为光检测区域的截面积S。此外，也可以不依据上述的方法而通过任意的方法、例如通过利用FCS、FIDA等给出光检测区域的截面积S。另外，在本实施方式的光分析装置中，关于所设想的光检测区域的移动模式，可以将关于各种标准的发光粒子的浓度C与发光粒子的个数N之间的关系(式(9))的信息预先存储到计算机18的存储装置中，在装置的使用者实施光分析时能够适当地利用所存储的关系的信息。
为了验证上述说明的本发明的有效性，如下那样进行了实验。此外，应该理解为以下的实施例用于例示本发明的有效性，而并不是限定本发明的范围。
实施例1
使用被构成为由于酶所引起的消化反应而发光强度增大的附加有发光标识的核酸作为观察对象粒子来执行扫描分子计数法，验证此时参照信号的产生时间间隔能够追踪发光粒子(发光强度增大的核酸分子)的浓度的时间变化。
在样本中，作为观察对象粒子，将在5’末端附加荧光色素ATTO647N、在3’末端附加有作为消光分子的BHQ3的5碱基的poly-T以10pM溶解在反应缓冲液(40mMTris-HClpH7.5,8mMMgCl2,5mMDTT)中来形成样本溶液。上述的poly-T具有碱基序列：ATTO647N-TTTTT-BHQ3，在所述粒子中，在未反应的状态中，如图6的左边示意性地描绘的那样，从ATTO647N(FD)释放出的光Em被BHQ3(Q)吸收，因此实质上不向外部释放光，但是如图6的右边示意性地描绘的那样，当通过DNA消化酶(DNaseI)切断碱基链时，从ATTO647N释放的光Em不被吸收而被释放到外部，因此能够作为发光粒子观测到。此外，poly-T是委托シグマジェノシス社合成的。
在测定中，作为光分析装置，使用具备共焦荧光显微镜的光学系统和光子计数系统的单分子荧光测定装置MF20(奥林巴斯株式会社)，在对36μL的上述的样本溶液添加了40U的DNaseI(TAKARA公司)之后快速搅拌，按上述的扫描分子计数法开始光强度的测量。在光强度的测量中，激励光使用642nm的激光(输出1mW)，检测光波长频带通过带通滤波器而被设为660nm～710nm。样本溶液中的光检测区域通过反射镜偏转器而沿着圆轨道以扫描速度69mm/s移动。另外，光子计数的BINTIME设为10μ秒。
并且，在通过光强度的测定获取到的按时间序列的光子计数数据中的发光粒子的信号的检测处理中，首先进行平滑处理(按Savisky-Golay法重复进行5次以13个数据点取得移动平均的处理。)，使用平滑后的数据的一阶微分值确定存在脉冲状信号的区域(脉冲存在区域)。然后，通过最小二乘法使高斯函数拟合确定出的所述脉冲存在区域，决定(高斯函数中的)峰值强度、脉冲宽度(半峰全宽)、相关系数，将满足下述条件的脉冲状信号判别为具有发光粒子的信号的特征的信号。
20μs<脉冲宽度<200μs
峰值强度>1(光子/10μs)
相关系数>0.95
图7的(A)和图8的(A)分别是相对于开始测量后的经过时间对以上述的要点检测出的时序光强度数据上的发光粒子的信号的产生时间间隔进行绘制得到的曲线图。图7的(A)是每一个粒子的信号产生时间间隔(K＝1)，图8的(A)是每50个粒子的信号产生时间间隔(K＝50)。在该图中，示出进行了DNaseI的添加的情况(DNaseI+)和未进行DNaseI的添加的情况的(DNaseI-)信号产生时间间隔。此外，在图示的实验中，在进行了DNaseI的添加的情况(DNaseI+)下，从DNaseI的添加起至进行搅拌所需要的时间为大约15秒。另外，图7的(B)和图8的(B)分别示出了使用式(4)和(4a)从图7的(A)和图8的(A)中的信号产生时间间隔换算得到的发光粒子浓度值的时间变化。
如参照图7的(A)和图8的(A)所理解的那样，在未进行DNaseI的添加的情况(DNaseI-)下，信号产生时间间隔虽然波动大，但是观察不到随着时间的经过而长度向一个方向变化的倾向。另一方面，在进行了DNaseI的添加的情况(DNaseI+)下，观察到在紧接着测量开始之后信号产生时间间隔为0.2秒～0.25秒、但是随着时间的经过而逐渐减少的倾向(在测量开始后的6000秒时为大约0.07秒)。另外，如从图7的(B)和图8的(B)所理解的那样，与信号产生时间间隔的时间变化对应地，在未进行DNaseI的添加的情况(DNaseI-)下，观察不到发光粒子浓度值的实质变化，但是在进行了DNaseI的添加的情况(DNaseI+)下，观察到发光粒子浓度值的有意义的增加。这些结果如与图6关联地说明的那样，示出了以下情况：通过DNaseI的消化而poly-T被切断，荧光色素ATTO647N与消光分子BHQ3相互分离，由此，荧光色素ATTO647N的光不被吸收而释放到外部；而且，所述DNaseI的消化反应随着时间的经过而发展，所检测出的poly-T(发光粒子)的浓度增大了。即，按照本发明的教导，示出了通过参照在利用扫描分子系数法获得的时序光强度数据上检测出的发光粒子的信号的产生时间间隔，能够观测发光粒子的浓度的变化。另外，当将图7的(A)、(B)与图8的(A)、(B)的曲线图进行比较时，能够观察到与前者相比，后者的值的偏差更小。该情形表示，在测量信号产生时间间隔时，通过以能够掌握信号产生时间间隔的时间变化的程度将信号产生时间间隔设为多个信号的产生时间的间隔，能够抑制值的偏差。
并且，使用上述的结果(图8的(B))验证了测量出的发光粒子浓度值的时间变化是否与基于DNaseI的核酸的消化反应的机理一致。在基于DNaseI的核酸的消化反应中，我们认为DNaseI浓度(酶浓度)[E]、核酸浓度(基质浓度)[S]、浓度[ES]以及反应生成物浓度[P]按照下述的反应式。
[E]+[S]＜-＞[ES]→[P]…(10)
在所述反应式中，设想DNaseI-核酸结合体向反应生成物变化的反应速度通过下式给出，
d[P]/dt＝k[ES]…(11)
[P]通过下式给出。
[P]＝k[ES]t+C
在此，t为经过时间，k为反应速度系数，C为积分常数(反应生成物的初浓度)。此外，在本实验的条件下，我们认为DNaseI-核酸结合体浓度[ES]高，几乎不存在其变化，因此结果是d[P]/dt实质是固定的，反应生成物浓度[P]、即检测出的发光粒子浓度能够通过下式近似为直线(v为浓度变化速度。)。
[P]＝vt+C…(12)
这样，当使式(12)拟合图8的(B)的结果时，如图中的直线FL所示的那样，测量出的发光粒子浓度的时间变化几乎与式(12)一致，近似直线分别如下述那样。
DNaseI-：[P]＝2.99+2.27×10-5t
DNaseI+：[P]＝3.44+0.00129t
即，基于DaseI的消化反应速度为0.00129[fM/s]，在没有添加DNaseI的情况下，观察到没有实质的浓度变化。该结果强烈暗示了，本实验的发光粒子浓度值适合于通过式(12)提供的浓度值，检测出的信号是表示发光粒子的光的信号。另外，在本实验的条件中，认为DNaseI的量比核酸高，[ES]与[S]的初浓度[S]0实质相等，因此[P]通过下式给出。
[P]＝k[ES]t+C＝k[S]0t+C…(13)
因而，通过计算反应速度(浓度变化速度)，在初浓度[S]0已知的情况下，能够估算速度系数k。另一方面，在速度系数k已知的情况下，能够估算基质初浓度[S]0。并且，如上述那样，应该理解的是，在能够确认适合的反应的机理的情况下，还能够基于上述的反应式(11)或(13)估计实际没有进行光测量的时间的发光粒子浓度。
这样，如从上述的实施例的结果所理解的那样，按照本发明的教导，示出了通过在扫描分子计数法中依次测量信号产生时间间隔，能够追踪发光粒子的浓度的时间变化，由此对于发光粒子的浓度随时间变化的系统、即发光粒子浓度处于动态状态的情况，也能够估计发光粒子的浓度值或其指标值，能够检测发光粒子的浓度变化速度或发光粒子的相关的反应的反应速度。另外，对于发光粒子浓度处于准静态或稳定的状态的情况，即使发光粒子浓度的概算值是未知的，如果通过参照信号产生时间间隔的时间变化而判别发光粒子浓度是准静态或稳定的状态，则即使预先没有发光粒子浓度的估计值，也能够对范围比较大的发光粒子浓度高精度地检测其值。

Claims (12)

1.一种光分析装置，使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测来自在样本溶液中分散并随机运动的发光粒子的光，该光分析装置包括：
光检测区域移动部，其使所述光学系统的光检测区域的位置在所述样本溶液内移动；
光检测部，其检测来自所述光检测区域的光；以及
信号处理部，其生成一边使所述光检测区域的位置在所述样本溶液内移动一边由所述光检测部检测出的来自所述光检测区域的光的按时间序列的光强度数据，在所述按时间序列的光强度数据中逐个检测各个所述发光粒子的信号，
其中，所述信号处理部沿着所述按时间序列的光强度数据中的时间的经过，在所述按时间序列的光强度数据中依次测量所检测出的所述发光粒子的信号的产生时间的间隔，使用依次测量出的多个信号产生时间间隔来确定表示所述发光粒子的浓度的指标值。
2.根据权利要求1所述的光分析装置，其特征在于，
所述信号处理部使用依次测量出的所述多个信号产生时间间隔来确定表示所述发光粒子的浓度的变化速度的指标值。
3.根据权利要求1或2所述的光分析装置，其特征在于，
所述信号处理部使用依次测量出的所述多个信号产生时间间隔来确定任意时间中的表示所述发光粒子的浓度的指标值。
4.根据权利要求1、2或3所述的光分析装置，其特征在于，
所述发光粒子的信号的产生时间的间隔是产生规定数量的发光粒子的信号的间隔。
5.一种光分析方法，使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测来自在样本溶液中分散并随机运动的发光粒子的光，该光分析方法包括以下步骤：
使所述光学系统的光检测区域的位置在所述样本溶液内移动；
一边使所述光检测区域的位置在所述样本溶液内移动一边测定来自所述光检测区域的光的强度，来生成按时间序列的光强度数据；
在所述按时间序列的光强度数据上逐个检测各个发光粒子的信号；
沿着所述按时间序列的光强度数据中的时间的经过，在所述按时间序列的光强度数据中依次测量所检测出的所述发光粒子的信号的产生时间的间隔；以及
使用依次测量出的多个信号产生时间间隔来确定表示所述发光粒子的浓度的指标值。
6.根据权利要求5所述的光分析方法，其特征在于，还包括以下步骤：
使用依次测量出的所述多个信号产生时间间隔来确定表示所述发光粒子的浓度的变化速度的指标值。
7.根据权利要求5或6所述的光分析方法，其特征在于，
在确定所述发光粒子的浓度的步骤中，使用依次测量出的所述多个信号产生时间间隔来确定任意时间中的表示所述发光粒子的浓度的指标值。
8.根据权利要求5、6或7所述的光分析方法，其特征在于，
所述发光粒子的信号的产生时间的间隔是产生规定数量的发光粒子的信号的间隔。
9.一种光分析用计算机程序，用于使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测来自在样本溶液中分散并随机运动的发光粒子的光，该光分析用计算机程序使计算机执行以下过程：
使所述光学系统的光检测区域的位置在所述样本溶液内移动；
一边使所述光检测区域的位置在所述样本溶液内移动一边测定来自所述光检测区域的光的强度，来生成按时间序列的光强度数据；
在所述按时间序列的光强度数据上逐个检测各个发光粒子的信号；
沿着所述按时间序列的光强度数据中的时间的经过，在所述按时间序列的光强度数据中依次测量所检测出的所述发光粒子的信号的产生时间的间隔；以及
使用依次测量出的多个信号产生时间间隔来确定表示所述发光粒子的浓度的指标值。
10.根据权利要求9所述的光分析用计算机程序，其特征在于，使计算机还执行以下过程：
使用依次测量出的所述多个信号产生时间间隔来估算表示所述发光粒子的浓度的变化速度的指标值。
11.根据权利要求9或10所述的光分析用计算机程序，其特征在于，
在确定所述发光粒子的浓度的过程中，使用依次测量出的所述多个信号产生时间间隔来确定所述按时间序列的光强度数据中的任意时间的表示所述发光粒子的浓度的指标值。
12.根据权利要求9、10或11所述的光分析用计算机程序，其特征在于，
所述发光粒子的信号的产生时间的间隔是产生规定数量的发光粒子的信号的间隔。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108037060A (zh) * 2018-01-26 2018-05-15 中国人民解放军总医院 粒子计数方法、实现所述方法的粒子计数装置和粒子分析仪

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107860691B (zh) * 2017-10-17 2023-10-24 中国矿业大学(北京) 一种基于机器视觉技术的激光矿井煤尘遥测方法
EP3781976A1 (en) 2018-04-18 2021-02-24 Gentex Corporation Confined field of view illumination in surgical microscopy
US11802810B2 (en) * 2020-03-09 2023-10-31 Verizon Patent And Licensing Inc. Systems and methods for determining fiber cable geographic locations

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012050011A1 (ja) * 2010-10-13 2012-04-19 オリンパス株式会社 単一発光粒子検出を用いた粒子の拡散特性値の測定方法
JP2013036765A (ja) * 2011-08-04 2013-02-21 Olympus Corp 単一発光粒子検出を用いた光分析装置、光分析方法及び光分析用コンピュータプログラム
WO2013069504A1 (ja) * 2011-11-10 2013-05-16 オリンパス株式会社 単一発光粒子検出を用いた光分析装置、光分析方法及び光分析用コンピュータプログラム
WO2013121905A1 (ja) * 2012-02-17 2013-08-22 オリンパス株式会社 単一粒子検出を用いた光分析装置、光分析方法及び光分析用コンピュータプログラム
CN103328955A (zh) * 2011-01-20 2013-09-25 奥林巴斯株式会社 利用来自单个发光粒子的光的检测的光分析方法和光分析装置

Family Cites Families (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4251733A (en) 1978-06-29 1981-02-17 Hirleman Jr Edwin D Technique for simultaneous particle size and velocity measurement
JPS63147419A (ja) 1986-12-11 1988-06-20 松下電器産業株式会社 電気湯沸し器
JPH0337446A (ja) 1989-07-04 1991-02-18 Ishikawajima Harima Heavy Ind Co Ltd 同調型動吸振器の同調装置
JPH04337446A (ja) 1991-05-15 1992-11-25 Hitachi Ltd 微粒子計測方法、定量方法および微粒子計測装置
FI98765C (fi) 1995-01-16 1997-08-11 Erkki Soini Virtaussytometrinen menetelmä ja laite
US5866336A (en) 1996-07-16 1999-02-02 Oncor, Inc. Nucleic acid amplification oligonucleotides with molecular energy transfer labels and methods based thereon
EP0836090A1 (en) 1996-10-12 1998-04-15 Evotec BioSystems GmbH Method of analysis of samples by determination of the distribution of specific brightnesses of particles
US6235471B1 (en) 1997-04-04 2001-05-22 Caliper Technologies Corp. Closed-loop biochemical analyzers
US6710871B1 (en) 1997-06-09 2004-03-23 Guava Technologies, Inc. Method and apparatus for detecting microparticles in fluid samples
GB2326229A (en) 1997-06-13 1998-12-16 Robert Jeffrey Geddes Carr Detecting and analysing submicron particles
SE9800360D0 (sv) 1998-02-06 1998-02-06 Goeteborg University Science I Method, apparatus and flow cell for high sensitivity detection of fluorescent molecules
JP4812937B2 (ja) 1998-03-16 2011-11-09 ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・コーポレイション 共焦点顕微鏡イメージングシステム
US6388788B1 (en) 1998-03-16 2002-05-14 Praelux, Inc. Method and apparatus for screening chemical compounds
US20030036855A1 (en) 1998-03-16 2003-02-20 Praelux Incorporated, A Corporation Of New Jersey Method and apparatus for screening chemical compounds
WO2000066985A1 (en) 1999-04-29 2000-11-09 Evotec Biosystems Ag A method of characterizing fluorescent molecules or other particles using generating functions
US6376843B1 (en) 1999-06-23 2002-04-23 Evotec Oai Ag Method of characterizing fluorescent molecules or other particles using generating functions
US8264680B2 (en) 1999-05-28 2012-09-11 Yokogawa Electric Corporation Biochip reader and electrophoresis system
US6965113B2 (en) 2000-02-10 2005-11-15 Evotec Ag Fluorescence intensity multiple distributions analysis: concurrent determination of diffusion times and molecular brightness
US20010035954A1 (en) 2000-03-10 2001-11-01 Rahn John Richard Method and apparatus for measuring particle size distributions using light scattering
DE10035190C5 (de) 2000-07-20 2009-07-16 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Verfahren und Vorrichtung zur Fluoreszenzmessung
US6947133B2 (en) 2000-08-08 2005-09-20 Carl Zeiss Jena Gmbh Method for increasing the spectral and spatial resolution of detectors
DE10038528A1 (de) 2000-08-08 2002-02-21 Zeiss Carl Jena Gmbh Verfahren und Anordnung zur Erhöhung der spektralen und räumlichen Detektorauflösung
HU226937B1 (en) 2000-11-17 2010-03-29 Mta Szegedi Biolog Koezpont Method and apparatus for determining polarization amount of material by a laser scanning microscope
WO2002048693A1 (fr) 2000-12-14 2002-06-20 Olympus Optical Co., Ltd. Analyseur fluorometrique et analyse fluorometrique
US6782297B2 (en) 2001-05-24 2004-08-24 Eric Paul Tabor Methods and apparatus for data smoothing
US6750963B2 (en) 2002-05-21 2004-06-15 Agilent Technologies, Inc. Imaging systems for signals on a surface
ES2306900T3 (es) 2002-11-07 2008-11-16 Erasmus Universiteit Rotterdam Sondas fret y metodos para detectar moleculas de interaccion.
US7038848B2 (en) 2002-12-27 2006-05-02 Olympus Corporation Confocal microscope
JP4315794B2 (ja) 2002-12-27 2009-08-19 オリンパス株式会社 共焦点顕微鏡
JP2005098876A (ja) 2003-09-25 2005-04-14 Institute Of Physical & Chemical Research ２成分相互作用分析方法
AU2005290314A1 (en) 2004-09-28 2006-04-06 Singulex, Inc. System and method for spectroscopic analysis of single particles
AU2006210424A1 (en) 2005-01-31 2006-08-10 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Methods and devices for characterizing particles in clear and turbid media
JP4757103B2 (ja) 2005-06-13 2011-08-24 学校法人関西文理総合学園 試料中のウイルスを検出する方法およびシステム
JPWO2007010803A1 (ja) 2005-07-15 2009-01-29 オリンパス株式会社 光測定装置
WO2007118209A2 (en) 2006-04-07 2007-10-18 Kim Laboratories Apparatus and method for rapid detection of analytes
US8445655B2 (en) 2006-06-16 2013-05-21 Cornell Research Foundation, Inc. Functional nucleic acid ligands to fluorescent proteins
WO2008007580A1 (fr) 2006-07-13 2008-01-17 Olympus Corporation Procédé d'analyse de particules fines
US20080052009A1 (en) 2006-08-23 2008-02-28 Washington, University Of Method for deconvolving single-molecule intensity distributions for quantitative biological measurements
GB0618057D0 (en) 2006-09-14 2006-10-25 Perkinelmer Ltd Improvements in and relating to scanning confocal microscopy
JP5473202B2 (ja) 2006-10-13 2014-04-16 滋賀県 試料中の蛍光性物質を検出する方法およびシステム
WO2008080417A1 (en) 2006-12-28 2008-07-10 Flult Biosystems Gmbh A method of determining characteristic properties of a sample containing particles
EP2124085A4 (en) 2007-02-14 2010-04-28 Nikon Corp CONFOCAL SLOTTED SCANNING MICROSCOPE
JP2008292371A (ja) 2007-05-25 2008-12-04 Institute Of Physical & Chemical Research 蛍光相関分光による複数成分相互作用の分析方法及び相互作用制御化合物のスクリーニング方法
JP2009145242A (ja) 2007-12-14 2009-07-02 Olympus Corp 光測定装置
CN101946180B (zh) 2007-12-19 2013-11-13 神谷来克斯公司 单分子检测用扫描分析器和使用方法
US7719682B2 (en) * 2008-03-03 2010-05-18 Agilent Technologies, Inc. Methods and systems for computing a particle size distribution of small particles in a process
JP5139885B2 (ja) 2008-05-21 2013-02-06 浜松ホトニクス株式会社 蛍光解析装置及び解析方法
JP2009288161A (ja) 2008-05-30 2009-12-10 Olympus Corp 光測定装置及び光測定方法
JP5590781B2 (ja) 2008-07-10 2014-09-17 オリンパス株式会社 標的核酸比率推定方法
US20100177190A1 (en) 2008-12-16 2010-07-15 Ann-Shyn Chiang Microscopy system with revolvable stage
JP2011002415A (ja) 2009-06-22 2011-01-06 Olympus Corp 蛍光相関分光装置
CN102869982B (zh) 2010-03-01 2014-04-30 奥林巴斯株式会社 光学分析装置、光学分析方法
JP5856962B2 (ja) * 2010-09-10 2016-02-10 オリンパス株式会社 単一発光粒子の光強度を用いた光分析方法
WO2012141019A1 (ja) 2011-04-13 2012-10-18 オリンパス株式会社 単一発光粒子検出を用いた光分析装置、光分析方法及び光分析用コンピュータプログラム
JP6010033B2 (ja) * 2011-08-26 2016-10-19 オリンパス株式会社 光分析を用いた単一粒子検出装置、単一粒子検出方法及び単一粒子検出用コンピュータプログラム
JP6010114B2 (ja) 2012-04-18 2016-10-19 オリンパス株式会社 光分析を用いた単一粒子検出装置、単一粒子検出方法及び単一粒子検出用コンピュータプログラム

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012050011A1 (ja) * 2010-10-13 2012-04-19 オリンパス株式会社 単一発光粒子検出を用いた粒子の拡散特性値の測定方法
CN103328955A (zh) * 2011-01-20 2013-09-25 奥林巴斯株式会社 利用来自单个发光粒子的光的检测的光分析方法和光分析装置
JP2013036765A (ja) * 2011-08-04 2013-02-21 Olympus Corp 単一発光粒子検出を用いた光分析装置、光分析方法及び光分析用コンピュータプログラム
WO2013069504A1 (ja) * 2011-11-10 2013-05-16 オリンパス株式会社 単一発光粒子検出を用いた光分析装置、光分析方法及び光分析用コンピュータプログラム
WO2013121905A1 (ja) * 2012-02-17 2013-08-22 オリンパス株式会社 単一粒子検出を用いた光分析装置、光分析方法及び光分析用コンピュータプログラム

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN108037060A (zh) * 2018-01-26 2018-05-15 中国人民解放军总医院 粒子计数方法、实现所述方法的粒子计数装置和粒子分析仪
CN108037060B (zh) * 2018-01-26 2019-11-08 中国人民解放军总医院 粒子计数方法、实现所述方法的粒子计数装置和粒子分析仪

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