JP2014199179A - 共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いた光分析装置及び光分析方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いた光分析技術に於いて、発光粒子濃度の低い試料溶液の計測のために、背景光強度の増大をできるだけ抑制できる態様にてコンフォーカル・ボリュームの拡大による単位時間当たりの発光粒子の検出数の増大を図ること。【解決手段】 本発明の光分析技術では、顕微鏡の光学系に於いて、試料溶液内に光学系の光検出領域を少なくとも二つ形成する分割光学系が設けられる。これにより、コンフォーカル・ボリュームの数を増やすことによりコンフォーカル・ボリュームの体積を拡大すると、一つのコンフォーカル・ボリュームの径を増大してコンフォーカル・ボリュームの体積を拡大する場合よりも背景光強度の増大を抑制できる。【選択図】図２

Description

本発明は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いて、溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はこれらの凝集体（以下、これらを「粒子」と称する。）、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の対象物、或いは、非生物学的な粒子からの光を検出して、それらの状態（相互作用、結合・解離状態など）の分析又は解析に於いて有用な情報を取得することが可能な光分析技術に係り、より詳細には、上記の如き光学系を用いて発光する粒子からの光を検出して種々の光分析を可能にする光分析装置及び光分析方法に係る。なお、本明細書に於いて、光を発する粒子（以下、「発光粒子」と称する。）は、それ自身が光を発する粒子、又は、任意の発光標識若しくは発光プローブが付加された粒子のいずれであってもよく、発光粒子から発せられる光は、蛍光、りん光、化学発光、生物発光、散乱光等であってよい。

近年の光計測技術の発展により、共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング（１光子検出）も可能な超高感度の光検出技術とを用いて、一光子又は蛍光一分子レベルの微弱光の検出・測定が可能となっている。そこで、そのような微弱光の計測技術を用いて、生体分子等の特性、分子間相互作用又は結合・解離反応の検出を行う装置又は方法が種々提案されている。例えば、蛍光相関分光分析（Fluorescence Correlation Spectroscopy：ＦＣＳ。例えば、特許文献１−３、非特許文献１−３参照）に於いては、レーザー共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術を用いて、試料溶液中の微小領域（顕微鏡のレーザー光が集光された焦点領域−コンフォーカル・ボリュームと称される。）内に出入りする蛍光分子又は蛍光標識された分子（蛍光分子等）からの蛍光強度の測定が為され、その測定された蛍光強度の自己相関関数の値から決定される微小領域内に於ける蛍光分子等の平均の滞留時間（並進拡散時間）及び滞留する分子の数の平均値に基づいて、蛍光分子等の運動の速さ又は大きさ、濃度といった情報の取得、或いは、分子の構造又は大きさの変化や分子の結合・解離反応又は分散・凝集といった種々の現象の検出が為される。また、蛍光強度分布分析(Fluorescence-Intensity Distribution Analysis：ＦＩＤＡ。例えば、特許文献４、非特許文献４)やフォトンカウンティングヒストグラム（Photon Counting Histogram：ＰＣＨ。例えば、特許文献５）では、ＦＣＳと同様に計測されるコンフォーカル・ボリューム内に出入りする蛍光分子等の蛍光強度のヒストグラムが生成され、そのヒストグラムの分布に対して統計的なモデル式をフィッティングすることにより、蛍光分子等の固有の明るさの平均値とコンフォーカル・ボリューム内に滞留する分子の数の平均値が算定され、これらの情報に基づいて、分子の構造又は大きさの変化、結合・解離状態、分散・凝集状態などが推定されることとなる。またその他に、特許文献６、７に於いては、共焦点顕微鏡の光学系を用いて計測される試料溶液の蛍光信号の時間経過に基づいて蛍光性物質を検出する方法が提案されている。特許文献８は、フローサイトメータに於いて流通させられた蛍光微粒子又は基板上に固定された蛍光微粒子からの微弱光をフォトンカウンティング技術を用いて計測してフロー中又は基板上の蛍光微粒子の存在を検出するための信号演算処理技術を提案している。

特に、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術とを用いた微小領域の蛍光測定技術を用いた方法によれば、測定に必要な試料は、従前に比して極めて低濃度且微量でよく（一回の測定で使用される量は、たかだか数十μＬ程度）、測定時間も大幅に短縮される（一回の測定で秒オーダーの時間の計測が数回繰り返される。）。従って、これらの技術は、特に、医学・生物学の研究開発の分野でしばしば使用される希少な或いは高価な試料についての分析を行う場合や、病気の臨床診断や生理活性物質のスクリーニングなど、検体数が多い場合に、従前の生化学的方法に比して、低廉に、或いは、迅速に実験又は検査が実行できる強力なツールとなることが期待されている。

特開２００５−０９８８７６ 特開２００８−２９２３７１ 特開２００９−２８１８３１ 特許第４０２３５２３号 国際公開２００８−０８０４１７ 特開２００７−２０５６５ 特開２００８−１１６４４０ 特開平４−３３７４４６号公報

金城政孝、蛋白質 核酸 酵素 Vol.４４、No.９、１４３１−１４３８頁 １９９９年 エフ・ジェイ・メイヤー・アルムス（F.J.Meyer-Alms）、フルオレセンス・コリレーション・スペクトロスコピー（Fluorescence Correlation Spectroscopy）、アール・リグラー編（R.Rigler）、スプリンガー（Springer）、ベルリン、２０００年、２０４−２２４頁 加藤則子外４名、遺伝子医学、Vol.６、No.２、２７１−２７７頁 カスク他３名、米国科学アカデミー紀要 １９９９年、９６巻、13756‐13761頁（P. Kask, K. Palo, D. Ullmann, K. Gall PNAS 96, 13756-13761 (1999)）

上記のＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術を用いた光分析技術では、計測される光は、蛍光一分子又は数分子から発せられた光であるが、その光の解析に於いて、時系列に測定された蛍光強度データの自己相関関数の演算又はヒストグラムに対するフィッティングといった蛍光強度のゆらぎの算出等の統計的処理が実行され、個々の蛍光分子等からの光の信号を個別に参照又は分析するわけではない。即ち、これらの光分析技術に於いては、複数の蛍光分子等からの光の信号が統計的に処理され、蛍光分子等について統計平均的な特性が検出されることとなる。従って、これらの光分析技術に於いて統計的に有意な結果を得るためには、試料溶液中の観測対象となる蛍光分子等の濃度又は数密度は、平衡状態に於いて、一回の秒オーダーの長さの計測時間のうちに統計的処理が可能な数の蛍光分子等が微小領域内を入出するレベル、好適には、微小領域内に常に一個程度の蛍光分子等が存在しているレベルである必要がある。実際、コンフォーカル・ボリュームの体積は、１ｆＬ程度となるので、上記の光分析技術に於いて使用される試料溶液中の蛍光分子等の濃度は、典型的には、１ｎＭ程度若しくはそれ以上であり、１ｎＭを大幅に下回るときには、蛍光分子等がコンフォーカル・ボリューム内に存在しない時間が生じて統計的に有意な分析結果が得られないこととなる。一方、特許文献６〜８に記載の蛍光分子等の検出方法では、蛍光強度のゆらぎの統計的演算処理が含まれておらず、試料溶液中の蛍光分子等が１ｎＭ未満であっても蛍光分子等の検出が可能であるが、溶液中でランダムに運動している蛍光分子等の濃度又は数密度を定量的に算出するといったことは達成されていない。

そこで、本願出願人は、特願２０１０−０４４７１４及びＰＣＴ／ＪＰ２０１１／５３４８１に於いて、観測対象となる発光粒子の濃度又は数密度が、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の統計的処理を含む光分析技術で取り扱われるレベルよりも低い試料溶液中の発光粒子の状態又は特性を定量的に観測することを可能にする新規な原理に基づく光分析技術を提案した。かかる新規な光分析技術に於いては、端的に述べれば、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等と同様に共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いるところ、試料溶液内に於いて光の検出領域である微小領域（以下、「光検出領域」と称する。）の位置を移動させながら、即ち、光検出領域により試料溶液内を走査しながら、光検出領域が試料溶液中に分散してランダムに運動する発光粒子を包含したときに、その発光粒子から発せられる光を検出し、これにより、試料溶液中の発光粒子の一つ一つを個別に検出して、発光粒子のカウンティングや試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度に関する情報の取得を可能にする。この新規な光分析技術（以下、「走査分子計数法」と称する。）によれば、測定に必要な試料がＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の光分析技術と同様に微量（例えば、数十μＬ程度）であってもよく、また、測定時間が短く、しかも、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の光分析技術の場合に比して、より低い濃度又は数密度の発光粒子の存在を検出し、その濃度、数密度又はその他の特性を定量的に検出することが可能となる。

ところで、上記の如き走査分子計数法、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨ等の、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、その光学系のコンフォーカル・ボリューム（即ち、光検出領域）に進入する発光粒子から発せられる光を検出する光分析技術に於いて、試料溶液中の発光粒子の濃度が低い場合、検出光量（フォトンカウンティングの場合には、光子数）が低減し、良好な精度にて計測結果を得ることが困難となり得る。既に述べた如く、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ又はＰＣＨの場合、試料溶液中の発光粒子濃度が、光の計測の時間中に一個以上の発光粒子がコンフォーカル・ボリュームに存在する程度を下回ると、統計的に有意な結果を得ることが困難となる。また、走査分子計数法の場合、試料溶液中の発光粒子濃度が低いほど、コンフォーカル・ボリュームの走査中の単位時間当たりの粒子の検出数が低くなるので、十分な精度の結果を得るためには、長い計測時間が必要となる。

上記の如き、試料溶液中の発光粒子の濃度が低く、コンフォーカル・ボリュームへ進入する単位時間当たりの発光粒子数が少ないことに起因する問題は、コンフォーカル・ボリュームの拡大により、解決可能である。即ち、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の対物レンズから出射される励起光の焦点領域の大きさの拡大やピンホールの口径の拡大（共焦点顕微鏡の場合）により、一時に光の検出される領域であるコンフォーカル・ボリュームが拡大されれば、発光粒子がコンフォーカル・ボリュームへ進入する機会が増え、従って、単位時間当たりの発光粒子の検出数が増大して、計測時間が比較的短くても高精度の計測結果が得られることが期待される。この点に関し、観測される発光粒子が励起光により励起されて光を放出する粒子である場合、単に、励起光の焦点領域の大きさの拡大を行うと、コンフォーカル・ボリューム内の励起光密度が低下し、一つの発光粒子当たりの検出光量が低下する。従って、コンフォーカル・ボリュームの拡大により単位時間当たりの発光粒子の検出数の増大を図る際には、コンフォーカル・ボリュームの拡大と共に、対物レンズの励起光の出射強度を高くして、一つの発光粒子当たりの検出光量の低下を回避することが好ましい。

しかしながら、単に、コンフォーカル・ボリューム内の励起光密度の増大のために対物レンズの励起光の出射強度を増大すると、発光粒子からの光（蛍光、りん光）に対する背景光の大きさ又は量の比が増大し、Ｓ／Ｎ比が悪化することとなる。後の実施形態の欄に於いても詳細に説明される如く、一般に、一つの発光粒子から放出される蛍光又はりん光の強度は、或る程度までは、励起光強度の増大と共に増大するが、更に励起光の強度が高くなると、飽和状態となり、殆ど増大しなくなることが分かっている。一方、背景光は、励起光の迷光や水のラマン散乱等の散乱光等であるので、励起光強度の増大と共に、飽和することなく増大し続ける。従って、或る程度以上に励起光強度が高くなると、検出光に於いて、発光粒子の光強度に対して背景光強度が無視できないほど高くなる。

かくして、本発明の主な目的は、上記の如き走査分子計数法、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨ等の、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いた光分析技術に於いて、背景光強度の増大をできるだけ抑制できる態様にてコンフォーカル・ボリュームの体積の増大による単位時間当たりの発光粒子の検出数の増大が図られる新規な手法を提案することである。

この点に関し、本発明の発明者による研究によれば、コンフォーカル・ボリュームの数を増やすことによりコンフォーカル・ボリュームの体積を増大する場合には、一つのコンフォーカル・ボリュームの径を増大してコンフォーカル・ボリュームを拡大する場合よりも背景光強度の増大を抑制できることを見出した。本発明に於いては、上記の知見が採用される。

本発明によれば、上記の課題は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出し分析する光分析装置であって、顕微鏡の光学系が試料溶液内に於いて顕微鏡の光学系の光検出領域を少なくとも二つ形成する分割光学系を有することを特徴とする装置によって達成される。かかる構成に於いて、「試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子」とは、試料溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はそれらの凝集体などの、光を発する粒子であって、基板などに固定されず、溶液中を自由にブラウン運動している粒子であれば任意の粒子であってよい。かかる発光粒子は、典型的には、蛍光性粒子であるが、励起光の照射により発光するその他の粒子（りん光性粒子など）であってもよい。共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の「光検出領域」とは、コンフォーカル・ボリューム、即ち、顕微鏡に於いて光が検出される微小領域であり、対物レンズから励起光が与えられる場合には、その励起光が集光された領域に相当する。「分割光学系」とは、一つの光源から伝播してきた励起光光線が試料溶液内に於いて少なくとも二つの点領域に焦点を結ぶように、該励起光光線に分割する任意の光学系又は光学素子であり、例えば、楔型ハーフミラーや回折光学素子などが採用される。なお、本明細書に於いて、「信号」という場合には、特に断らない限り、発光粒子からの光を表す信号を指すものとする。

上記の構成によれば、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて発光粒子からの光を検出する光分析装置、例えば、走査分子計数法、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨといった光分析技術を実行する装置に於いて、試料溶液中に少なくとも二つの光検出領域、即ち、コンフォーカル・ボリュームが形成され、これにより、光検出領域の体積が増大される。その場合、顕微鏡の検出光にて現れる背景光の強さは、一つの光検出領域の径を大きくした場合に比して、励起光密度を同一にしても、相対的に低くなる。即ち、一つの光検出領域の径を大きくするのではなく、光検出領域の数を増やすことによって光検出領域（コンフォーカル・ボリューム）を拡大し、これと共に励起光強度（対物レンズの出射強度）を増大することによって、一つの発光粒子当たりの検出光量を大幅に低下させず、且つ、背景光強度を大幅に増大させずに、精度よく、単位時間当たりの発光粒子の検出数を増大することが可能となる。なお、一つの光検出領域の寸法は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系に於いて標準的に設定される大きさであってよい（典型的には、励起光及び検出光の波長程度である。）。

上記の構成に於いて、より好適には、分割光学系により形成された少なくとも二つの光検出領域からの光が一つの光検出器にて受光されるようになっていてよい。このことにより、光検出領域の体積及び励起光強度が増大しても、検出光の計測値上に本来的に発生する光検出器自体のノイズの増大は回避される。なお、光検出器としては、典型的には、フォトダイオード、好適には、ＡＰＤが用いられる。

また、上記の本発明の装置に於いて、分割光学系は、計測に於いて、光検出領域の拡大が所望されるときに選択的に使用され、光検出領域の拡大が所望されないときには使用されず、従って、一つの光検出領域のみが形成されるようになっていてよい。例えば、装置は、試料溶液中の発光粒子が比較的高い場合には、一つの光検出領域のみが形成され、試料溶液中の発光粒子が比較的低い場合には、二つ以上の光検出領域が形成されるよう構成されていることが好ましい。かくして、上記の本発明の装置は、顕微鏡の光学系に於いて、分割光学系を用いて少なくとも二つの光検出領域を形成する構成と分割光学系を用いずに一つの光検出領域を形成する構成とが選択可能であってよい。具体的には、使用者の要求によって、励起光光路に楔型ハーフミラーや回折光学素子などの分割光学系が着脱可能に挿入されるようになっていてよい。かかる構成によれば、計測される試料溶液の状態に応じて、適宜、光検出領域の体積が選択でき、また、効率良く又高精度にて計測可能な試料溶液中の発光粒子濃度の範囲が従前に比して拡大されることとなる。

上記の本発明は、「走査分子計数法」を実行する装置に適用されてよい。従って、本発明の一つの態様に於いて、上記の本発明の装置は、更に、顕微鏡の光学系の光路を変更することにより試料溶液内に於いて光学系の光検出領域の位置を移動する光検出領域移動部と、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動させながら光検出器にて検出された発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出する信号処理部とを含んでいてよい。

かかる本発明の装置の基本的な構成に於いては、まず、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動しながら、即ち、試料溶液内を光検出領域により走査しながら、逐次的に、光の検出が行われる。そうすると、移動する光検出領域が、ランダムに運動している発光粒子を包含したときには、発光粒子からの光が光検出器にて検出され、これにより、一つの発光粒子の存在が検出されることとなる。そして、装置の信号処理部は、逐次的に検出される光検出器からの信号に於いて発光粒子からの光を表す信号を検出して、これにより、発光粒子の存在を一つずつ個別に逐次的に検出し、発光粒子の溶液内での状態に関する種々の情報が取得されることとなる。具体的には、例えば、上記の本発明の装置に於いて、信号処理部が、個別に検出された発光粒子からの光を表す信号の数を計数して光検出領域の位置の移動中に検出された発光粒子の数を計数するようになっていてよい（発光粒子のカウンティング）。かかる構成によれば、発光粒子の数と光検出領域の位置の移動量と組み合わせることにより、試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度に関する情報が得られることとなる。特に、任意の手法により、例えば、所定の速度にて光検出領域の位置を移動するなどして、光検出領域の位置の移動軌跡の全体積を特定すれば、発光粒子の数密度又は濃度が具体的に算定できることとなる。勿論、絶対的な数密度値又は濃度値を直接的に決定するのではなく、複数の試料溶液又は濃度又は数密度の基準となる標準試料溶液に対する相対的な数密度又は濃度の比を算出するようになっていてもよい。また、上記の本発明に於いては、光学系の光路を変更して光検出領域の位置を移動するよう構成されていることにより、光検出領域の移動は、速やかであり、且つ、試料溶液に於いて機械的振動や流体力学的な作用が実質的に発生しないので、検出対象となる発光粒子が力学的な作用の影響を受けることなく安定した状態にて、光の計測が可能である（試料溶液中に振動や流れが作用すると、粒子の物性的性質が変化する可能性がある。）。そして、試料溶液を流通させるといった構成が必要ではないので、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の場合と同様に微量（１〜数十μＬ程度）の試料溶液にて計測及び分析が可能である。

また、上記の走査分子計数法を実行する装置の信号処理部の処理に於いて、逐次的な光検出部からの検出値の信号から１つの発光粒子が光検出領域に入ったか否かの判定は、光検出部にて検出された時系列の光を表す信号の形状に基づいて為されてよい。実施の形態に於いて、典型的には、所定の閾値より大きい強度を有する信号が検出されたときに、１つの発光粒子が光検出領域に入ったと検出されるようになっていてよい。より具体的には、後の実施形態の欄にて説明される如く、通常、発光粒子からの光を表す信号は、光検出部の時系列の検出値、即ち、光強度データに於いて、或る程度以上の強度を有する釣鐘型のパルス状の信号として現れ、発光粒子以外の光、即ち、背景光やその他のノイズ（光検出器の熱的又は電気的なノイズ）は、釣鐘型のパルス状ではないか、強度の小さい信号として現れる。そこで、本発明の装置は、光検出部が、偏光成分の強度を測定して光強度データを生成し、信号処理部が光強度データ上に於いて所定閾値を超える強度を有するパルス状信号を単一の発光粒子からの光を表す信号として検出するよう構成されていてよい。「所定閾値」は、実験的に適当な値に設定することが可能である。かかる構成によれば、光検出部により逐次的に計測された光強度に於いて、発光粒子の信号と背景光又はノイズとが互いに識別され、発光粒子の信号の個別の検出を有利に実行することが可能となる。

なお、本発明の装置の検出対象は、単一の発光粒子からの光であるため、光強度は、非常に微弱である。従って、好適には、光検出部は、フォトンカウンティングにより光検出領域からの光を検出する。その場合、時系列の光強度データが時系列のフォトンカウントデータとなる。また、一つの発光粒子が、蛍光一分子又は数分子などである場合、発光粒子の発する光は確率的に放出されるものであり、微小な時間に於いて信号の値の欠落が生じる可能性がある。そして、そのような欠落が生ずると、一つの発光粒子の存在に対応する信号の特定が困難となる。そこで、信号処理部は、時系列の光強度データを平滑化し、微小な時間に於ける信号値の欠落を無視できるようにデータを加工した後、平滑化された時系列の光強度データに於いて所定閾値を超える強度を有する釣鐘型のパルス状信号を単一の発光粒子からの光を表す信号として検出するよう構成されていてよい。

更に、上記の装置に於いて、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、発光粒子の特性又は試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて適宜変更となっていてよい。当業者に於いて理解される如く、発光粒子から検出される光の態様は、発光粒子の特性又は試料溶液中の数密度又は濃度によって変化し得る。特に、光検出領域の移動速度が速くなると、一つの発光粒子から得られる光量は低減することとなるので、一つの発光粒子からの光が精度よく又は感度よく計測できるように、光検出領域の移動速度は、適宜変更となっていることが好ましい。

また、更に、上記の装置に於いて、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、好適には、検出対象となる発光粒子の拡散移動速度（ブラウン運動による粒子の平均の移動速度）よりも高く設定される。上記に説明されている如く、本発明の装置は、走査分子計数法を実行する場合、光検出領域が発光粒子の存在位置を通過したときにその発光粒子から発せられる光を検出して、発光粒子を個別に検出する。しかしながら、発光粒子が溶液中でブラウン運動することによりランダムに移動して、複数回、光検出領域を出入りする場合には、１つの発光粒子から複数回、（発光粒子の存在を表す）信号が検出されてしまい、検出された信号と１つの発光粒子の存在とを対応させることが困難となる。そこで、上記の如く、光検出領域の移動速度を発光粒子の拡散移動速度よりも高く設定し、これにより、１つの発光粒子を一つの（発光粒子の存在を表す）信号に対応させることが可能となる。なお、拡散移動速度は、発光粒子によって変わるので、上記の如く、発光粒子の特性（特に、拡散定数）に応じて、本発明の装置は、光検出領域の移動速度が適宜変更可能であるよう構成されていることが好ましい。

光検出領域の位置の移動のための光学系の光路の変更は、任意の方式で為されてよい。例えば、レーザー走査型光学顕微鏡に於いて採用されているガルバノミラーを用いて光路を変更して光検出領域の位置が変更されるようになっていてよい。光検出領域の位置の移動軌跡は、任意に設定されてよく、例えば、円形、楕円形、矩形、直線及び曲線のうちから選択可能であってよい。

更に、上記の本発明の装置によれば、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出し分析する光分析方法であって、試料溶液内に於いて顕微鏡の光学系の光検出領域を少なくとも二つ形成する分割光学系を用いることを特徴とする方法が提供される。かかる方法に於いても、顕微鏡の光学系に於いて、分割光学系を用いて少なくとも二つの光検出領域を形成する構成と分割光学系を用いずに一つの光検出領域を形成する構成とを選択可能であってよく、好適には、分割光学系により形成された少なくとも二つの光検出領域からの光が一つの光検出器にて受光される。

また、本発明の方法が走査分子計数法に適用される場合、本発明の方法は、前記の光学系の光路を変更することにより光学系の光検出領域の試料溶液内に於ける位置を移動する過程と、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動させながら光検出領域からの光を検出する過程と、検出された光から個々の発光粒子からの光信号を個別に検出する過程とを含むことを特徴とする。

かかる方法に於いても、個別に検出された発光粒子からの光信号の数を計数して光検出領域の位置の移動中に検出された発光粒子の数を計数する過程及び／又は検出された発光粒子の数に基づいて、試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度を決定する過程が含まれていてよい。また、光検出領域の位置を移動する過程に於いて、光検出領域の位置が所定の速度にて或いは発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動されるようになっていてよく、光検出領域の位置の移動速度は、発光粒子の特性又は試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて設定されるようになっていてよい。更に、信号処理過程に於いては、１つの発光粒子が光検出領域に入ったことは、検出された時系列の光信号の形状に基づいて、例えば、所定の閾値より大きい強度を有する光信号が検出したときに判定されてよい。

更に、１つの発光粒子が光検出領域に入ったことは、検出された時系列の光信号の形状に基づいて、例えば、所定の閾値より大きい強度を有する光信号が検出したときに判定されてよい。具体的には、光強度データ上に於いて所定閾値を超える強度を有する釣鐘型のパルス状信号が単一の発光粒子からの光を表す信号として検出されてよい。そして、光検出過程に於いて、フォトンカウンティングにより光検出領域からの光が検出され、時系列の光強度データが時系列のフォトンカウントデータである場合には、分析過程に於いて、時系列の光強度データが平滑化され、平滑化された時系列の光強度データに於いて所定閾値を超える強度を有する釣鐘型のパルス状信号が単一の発光粒子からの光を表す信号として検出されてよい。

本発明による光分析技術は、典型的には、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の生物学的な対象物の溶液中の状態の分析又は解析の用途に用いられるが、非生物学的な粒子（例えば、原子、分子、ミセル、金属コロイドなど）の溶液中の状態の分析又は解析に用いられてもよく、そのような場合も本発明の範囲に属することは理解されるべきである。

総じて、本発明によれば、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いた走査分子計数法、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨ等の光分析技術に於いて、複数の光検出領域を形成することにより、光検出領域の総体積を拡大し、単位時間当たりの発光粒子の光検出領域への進入する数を増やし、これにより、より効率的な光の計測を可能にする。この場合、光検出領域の径を大きくして光検出領域の体積を拡大する場合に比して背景光強度の増大が抑えられるため、良好なＳ／Ｎ比の検出結果が得られ、より高精度の分析結果が得られることとなる。また、複数の光検出領域を形成するための分割光学系は、比較的廉価に且つ簡単な構成で達成可能である。かくして、かかる構成によれば、発光粒子濃度の低い試料溶液の計測の際の、光検出領域（コンフォーカル・ボリューム）の拡大による計測時間の短縮、計測結果の精度の向上等が廉価に達成可能となる。

本発明のその他の目的及び利点は、以下の本発明の好ましい実施形態の説明により明らかになるであろう。

図１（Ａ）は、本発明を実現する光分析装置の内部構造の模式図である。図１（Ｂ）は、コンフォーカル・ボリューム（共焦点顕微鏡の観察領域）の模式図である。図１（Ｃ）は、ミラー７の向きを変更して試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動する機構の模式図である。 図２（Ａ）は、分割光学系として楔型ハーフミラーを用いた場合の顕微鏡内の光学系の模式図であり、図２（Ｂ）は、楔型ハーフミラーの例の模式図である。図２（Ｃ）は、一つの光線を複数に分割し複数の光線を一つに合成する分割光学系を用いた場合の顕微鏡内の光学系の模式図である。図２（Ｄ）〜（Ｅ）は、分割光学系として回折光学素子等の励起光を分割する素子を用いた場合の顕微鏡内の光学系の模式図である。 図３（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、本発明の一部を構成する走査分子計数法に於ける光検出の原理を説明する模式図及び計測される光強度の時間変化の模式図である。 図４は、本発明が適用される走査分子計数法の処理手順をフローチャートの形式で表した図である。 図５（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、走査分子計数法に於いて、発光粒子がブラウン運動をしながら光検出領域を横切る場合及び試料溶液内の光検出領域の位置を発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動することにより発光粒子が光検出領域を横切る場合の粒子の運動の態様を表すモデル図である。図５（Ｃ）は、走査分子計数法に従って、計測された時系列光強度データ（フォトンカウントの時間変化）から発光粒子の存在を検出するための処理手順に於ける検出信号の信号処理過程の例を説明する図である。 図６は、計測されたフォトンカウントデータの実測例（棒グラフ）と、データをスムージングして得られる曲線（点線）と、パルス存在領域にてフィッティングされたガウス関数（実線）を示している。図中、「ノイズ」と付された信号は、ノイズ又は異物による信号であるとして無視される。 図７（Ａ）は、図７（Ｂ）に模式的に描かれている如く一つの半径約０．５μｍの光検出領域を形成した場合のＦＣＳ計測に於ける励起光強度に対する１分子当たりの蛍光強度（ＣＣＰ）と背景光強度（ＢＧ）を示している。 図８（Ａ）は、図８（Ｂ）に模式的に描かれている如く一つの半径約２．０μｍの光検出領域を形成した場合のＦＣＳ計測に於ける背景光強度（ＢＧ）を示している。（この場合、１分子当たりの蛍光強度（ＣＣＰ）は、計測不能であった。） 図９（Ａ）は、図９（Ｂ）に模式的に描かれている如く二つの半径約０．５μｍの光検出領域を形成した場合のＦＣＳ計測に於ける励起光強度に対する１分子当たりの蛍光強度（ＣＣＰ）と背景光強度（ＢＧ）を示している。

１…光分析装置（共焦点顕微鏡）
２…光源
３…シングルモードオプティカルファイバー
４…コリメータレンズ
５…ダイクロイックミラー
６、７、１１…反射ミラー
８…対物レンズ
９…マイクロプレート
１０…ウェル（試料溶液容器）
１２…コンデンサーレンズ
１２ａ…リレーレンズ
１３、１３ａ…ピンホール
１４…バリアフィルター
１５…マルチモードオプティカルファイバー
１５ａ…マルチモードオプティカルファイバーのコア
１６…光検出器
１７…ミラー偏向器
１７ａ…ステージ位置変更装置
１８…コンピュータ
３１…回折格子（回折光学素子）
３４…楔型ハーフミラー

以下、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。

光分析装置の基本構成
本発明による光分析技術を実現する光分析装置は、基本的な構成に於いて、図１（Ａ）に模式的に例示されている如き、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等が実行可能な共焦点顕微鏡の光学系と光検出器とを組み合わせてなる装置であってよい。同図を参照して、光分析装置１は、光学系２〜１７と、光学系の各部の作動を制御すると共にデータを取得し解析するためのコンピュータ１８とから構成される。光分析装置１の光学系は、通常の共焦点顕微鏡の光学系と同様であってよく、そこに於いて、光源２から放射されシングルモードファイバー３内を伝播したレーザー光（Ｅｘ）が、ファイバーの出射端に於いて固有のＮＡにて決まった角度にて発散する光となって放射され、コリメーター４によって平行光となり、ダイクロイックミラー５、反射ミラー６、７にて反射され、対物レンズ８へ入射される。対物レンズ８の上方には、典型的には、１〜数十μＬの試料溶液が分注される試料容器又はウェル１０が配列されたマイクロプレート９が配置されており、対物レンズ８から出射したレーザー光は、試料容器又はウェル１０内の試料溶液中で焦点を結び、光強度の強い領域（励起領域）が形成される。試料溶液中には、観測対象物である発光粒子、典型的には、蛍光性粒子又は蛍光色素等の発光標識が付加された粒子が分散又は溶解されており、かかる発光粒子が励起領域に進入すると、その間、発光粒子が励起され光が放出される。放出された光（Ｅｍ）は、対物レンズ８、ダイクロイックミラー５を通過し、ミラー１１にて反射してコンデンサーレンズ１２にて集光され、ピンホール１３を通過し、バリアフィルター１４を透過して（ここで、特定の波長帯域の光成分のみが選択される。）、マルチモードファイバー１５に導入されて、光検出器１６に到達し、時系列の電気信号に変換された後、コンピュータ１８へ入力され、後に説明される態様にて光分析のための処理が為される。なお、当業者に於いて知られている如く、上記の構成に於いて、ピンホール１３は、対物レンズ８の焦点位置と共役の位置に配置されており、これにより、図１（Ｂ）に模式的に示されている如きレーザー光の焦点領域、即ち、励起領域内から発せられた光のみがピンホール１３を通過し、励起領域以外からの光は遮断される。図１（Ｂ）に例示されたレーザー光の焦点領域は、通常、１〜１０ｆＬ程度の実効体積を有する本光分析装置に於ける光検出領域であり（典型的には、光強度が領域の中心を頂点とするガウス様分布となる。実効体積は、光強度が１／ｅ^２となる面を境界とする略楕円球体の体積である。）、コンフォーカル・ボリュームと称される。また、本発明では、１つの発光粒子からの光、例えば、一つの蛍光色素分子からの微弱光が検出されるので、光検出器１６としては、好適には、フォトンカウンティングに使用可能な超高感度の光検出器が用いられる。光の検出がフォトンカウンティングによる場合、光強度の測定は、所定時間に亘って、逐次的に、所定の単位時間毎（ＢＩＮ ＴＩＭＥ）に、光検出器に到来するフォトンの数を計測する態様にて実行される。従って、この場合、時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータである。

また、上記の光分析装置の光学系に於いて、特に、後により詳細に説明される走査分子計数法を実行する場合には、更に、光学系の光路を変更して試料溶液内を光検出領域により走査する、即ち、試料溶液内に於いて焦点領域（即ち、光検出領域）の位置を移動するための機構が設けられる。かかる光検出領域の位置を移動するための機構としては、例えば、図１（Ｃ）に模式的に例示されている如く、反射ミラー７の向きを変更するミラー偏向器１７が採用されてよい。かかるミラー偏向器１７は、通常のレーザー走査型顕微鏡に装備されているガルバノミラー装置と同様であってよい。また、所望の光検出領域の位置の移動パターンを達成するべく、ミラー偏向器１７は、コンピュータ１８の制御の下、光検出器１６による光検出と協調して駆動される。光検出領域の位置の移動経路は、円形、楕円形、矩形、直線、曲線又はこれらの組み合わせから任意に選択されてよい（コンピュータ１８に於けるプログラムに於いて、種々の移動パターンが選択できるようになっていてよい。）。なお、図示していないが、対物レンズ８を上下に移動することにより、光検出領域の位置が上下方向に移動されるようになっていてもよい。上記の如く、試料溶液を移動するのではなく、光学系の光路を変更して光検出領域の位置を移動する構成によれば、試料溶液内に機械的な振動や流体力学的な作用が実質的に発生することがなくなり、観測対象物に対する力学的な作用の影響を排除することが可能となり、安定的な計測が達成される。

なお、追加的な構成として、顕微鏡のステージ（図示せず）には、観察するウェル１０を変更するべく、マイクロプレート９の水平方向位置を移動するためのステージ位置変更装置１７ａが設けられていてよい。ステージ位置変更装置１７ａの作動は、コンピュータ１８により制御されてよい。かかる構成により、検体が複数在る場合にも、迅速な計測が達成可能となる。

発光粒子が多光子吸収により発光する場合には、上記の光学系は、多光子顕微鏡として使用される。その場合には、励起光の焦点領域（光検出領域）のみで光の放出があるので、ピンホール１３は、除去されてよい。発光粒子がりん光により発光する場合には、上記の共焦点顕微鏡の光学系がそのまま用いられる。更に、光分析装置１に於いては、図示の如く、複数の励起光源２が設けられていてよく、発光粒子を励起する光の波長によって適宜、励起光の波長が選択できるようになっていてよい。

複数のコンフォーカル・ボリュームを形成するための構成
本発明に於いては、図１（Ａ）の基本構成に於いて、試料溶液中に複数のコンフォーカル・ボリュームを形成するための構成の修正が加えられる。図２に於いて、複数のコンフォーカル・ボリュームの形成のための光学系（分割光学系）の例が模式的に示されている。

図２（Ａ）を参照して、分割光学系の第一の態様としては、図示の如く、励起光光路Ｅｘと検出光光路Ｅｍとが重なる光路に於いて、楔型ハーフミラー３４が挿入される。楔型ハーフミラーは、一般的には、該楔型ハーフミラーに対して光線を入射すると、入射光の一部が表面で反射し、他の一部は、屈折して入射光の入射角とは異なる角度にてミラーの裏面から透過するよう構成されたものであるが、本発明に於いては、楔型ハーフミラー３４は、入射光の一部が表面で反射し、他の一部がミラーの裏面にて反射して、表面で反射した光とは異なる方向に屈折して入射表面を透過するよう構成されたものである。後の実施例にて使用される楔型ハーフミラー３４は、例えば、図２（Ｂ）により詳細に例示されている如く、入射光線の３６％（Ｒ１）が、入射側表面で反射され、入射側表面を透過した残りの光線（Ｒ２）が入射側と反対の側の表面（裏面）で透過せずに反射して、入射側表面から入射光線の３６％の強度にてＲ１に対して約１．２度ずれて出射するよう構成した。この楔型ハーフミラー３４を、図１（Ａ）のミラー７に置き換えて配置した場合、図２（Ａ）の如く、対物レンズ８の焦点面に於いて、互いにずれた位置に二つのコンフォーカル・ボリュームＣＶが形成される（図２（Ｂ）の場合、対物レンズが４０倍の水浸レンズのとき、約１００μｍの距離を置いて二つのコンフォーカル・ボリュームＣＶが形成された。）。そして、二つのコンフォーカル・ボリュームＣＶ内から放出される光は、楔型ハーフミラー３４にて反射して、光検出器１６へ向かって伝播することとなる。なお、図２（Ｃ）に示されている如く、楔型ハーフミラーによらず、ダイクロイックミラー５と対物レンズ８との間に設けられ、対物レンズ８側へ向かう一つの光線を複数に分割し、対物レンズ８からダイクロイックミラー５へ向かう複数の光線を一つに合成することが可能な任意の光学系が分割光学系３４として用いられてよいことは理解されるべきである。

分割光学系の第二の態様としては、図２（Ｄ）〜（Ｅ）に模式的に描かれている如く、励起光光路に励起光光線を複数に分割する分割光学系３１が挿入される。この場合、分割光学系３１で分割された複数の光線がダイクロイックミラー５にて反射され、対物レンズ８を透過すると、対物レンズ８の焦点面に於いて、互いにずれた位置に複数のコンフォーカル・ボリュームＣＶが形成される。そして、複数のコンフォーカル・ボリュームＣＶから放出された光は、ダイクロイックミラー５を透過して光検出器１６へ向かうこととなる。この場合、複数のコンフォーカル・ボリュームＣＶから放出された光は、コンデンサーレンズ１２の通過後に互いにずれた位置にて結像するので、図示の如く、各々のコンフォーカル・ボリュームＣＶの結像位置にピンホール１３が設けられる。また、各々のコンフォーカル・ボリュームＣＶに対応するピンホール１３を通過した光は、別々の光検出器にて受光されてもよく（図２（Ｄ））、或いは、図２（Ｅ）の如くリレーレンズ１２ａを用いて、単一のマルチモードオプティカルファイバー１５に重ねて連結されるようになっていてもよい。リレーレンズ１２ａは、複数のピンホール１３を通過した光の各々が平行光となってマルチモードオプティカルファイバーのコア１５ａに受容されるよう調整される。なお、励起光光線を複数に分割する分割光学系３１としては、回折格子（回折光学素子）などが採用可能である。

上記の分割光学系（楔型ハーフミラー、回折格子）は、複数のコンフォーカル・ボリュームＣＶの形成が所望されるときに適宜光路に着脱可能に挿入されてよい。楔型ハーフミラーは、その使用時に於いて、図１（Ａ）に於けるミラー６又は７に置き換えて配置されてよい。また、回折格子は、その使用時に於いて、図１（Ａ）に於ける符号４ａが付された位置に挿入されてよい。（分割光学系が除去されている状態では、単一のコンフォーカル・ボリュームＣＶが形成される。）複数のコンフォーカル・ボリュームＣＶの形成によりコンフォーカル・ボリュームＣＶの総体積が増大するので、試料溶液中の発光粒子濃度が低い場合に、効率的に（短い測定時間にて高感度に）光の計測が可能となる点で有利である。

走査分子計数法
本発明の構成は、既に述べた如く、走査分子計数法、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨといった光分析技術を実行する装置に於いて適用される。本明細書に於いては、走査分子計数法に適用した場合について説明する。以下、「走査分子計数法」の原理及び具体的操作について概説する。

１.走査分子計数法の原理
ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の分光分析技術は、従前の生化学的な分析技術に比して、必要な試料量が極めて少なく、且つ、迅速に検査が実行できる点で優れている。しかしながら、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の分光分析技術では、原理的に、発光粒子の特性は、蛍光強度のゆらぎに基づいて算定されるので、精度のよい測定結果を得るためには、試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度が、蛍光強度の計測中に常に一個程度の発光粒子が光検出領域ＣＶ内に存在するレベルであり、計測時間中に常に有意な光強度が検出されることが要求される。もし発光粒子の濃度又は数密度がそれよりも低い場合、発光粒子がたまにしか光検出領域ＣＶ内へ進入しないレベルである場合には、有意な光強度の信号が、計測時間の一部にしか現れないこととなり、精度のよい光強度のゆらぎの算定が困難となる。また、計測中に常に一個程度の発光粒子が光検出領域内に存在するレベルよりも発光粒子の濃度が大幅に低い場合には、光強度のゆらぎの演算に於いて、バックグラウンドの影響を受けやすくなると共に、演算に十分な量の有意な光強度データを得るために計測時間が長くなる。

そこで、本願出願人は、特願２０１０−０４４７１４及びＰＣＴ／ＪＰ２０１１／５３４８１に於いて、発光粒子の濃度が、上記の如きＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の分光分析技術にて要求されるレベルよりも低い場合でも、発光粒子の特性の検出を可能にする新規な原理に基づく「走査分子計数法」を提案した。

走査分子計数法に於いて実行される処理としては、端的に述べれば、光検出領域の位置を移動するための機構（ミラー偏向器１７）を駆動して光路を変更し、図１（Ｃ）にて模式的に描かれているように、試料溶液内に於いて光検出領域ＣＶの位置を移動しながら、即ち、光検出領域ＣＶにより試料溶液内を走査しながら、光検出が実行される。そうすると、例えば、図３（Ａ）の如く、光検出領域ＣＶが移動する間（図中、時間ｔｏ〜ｔ２）に於いて１つの発光粒子の存在する領域を通過する際（ｔ１）には、発光粒子から光が放出され、図３（Ｂ）に描かれている如き時系列の光強度データ上に有意な光強度（Ｅｍ）のパルス状の信号が出現することとなる。かくして、上記の光検出領域ＣＶの位置の移動と光検出を実行し、その間に出現する図３（Ｂ）に例示されている如きパルス状の信号（有意な光強度）を一つずつ検出することによって、発光粒子が個別に検出され、発光粒子の特性に関する情報が取得できることとなる。かかる走査分子計数法の原理に於いては、蛍光強度のゆらぎの算出の如き統計的な演算処理は行われず、発光粒子が一つずつ検出されるので、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等では十分な精度にて分析ができないほど、観測されるべき粒子の濃度が低い試料溶液でも、粒子の特性に関する情報が取得可能である。

２．走査分子計数法の処理操作過程
図１（Ａ）に例示の光分析装置１を用いた走査分子計数法に於いては、具体的には、（１）発光粒子を含む試料溶液の調製過程、（２）試料溶液の光強度の測定処理過程、及び（３）測定された光強度の分析処理過程が実行される。図４は、フローチャートの形式にて表した本実施形態に於ける処理過程を示している。

（１）試料溶液の調製
本発明に於いて観測対象となる粒子は、溶解された分子等の、試料溶液中にて分散し溶液中にてランダムに運動する粒子であれば、任意のものであってよく、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞、或いは、金属コロイド、その他の非生物学的粒子などであってよい（試料溶液は、典型的には水溶液であるが、これに限定されず、有機溶媒その他の任意の液体であってよい。）。また、観測対象となる粒子は、それ自体が発光する粒子であってもよく、或いは、発光標識（蛍光分子、りん光分子）が任意の態様にて付加された粒子であってよい。

（２）試料溶液の光強度の測定
本実施形態の走査分子計数法による光強度の測定処理過程では、ミラー偏向器１７を駆動して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動（試料溶液内の走査）を行いながら、光強度の測定が為される（図４−ステップ１００）。操作処理に於いて、典型的には、マイクロプレート９のウェル１０に試料溶液を注入して顕微鏡のステージ上に載置した後、使用者がコンピュータ１８に対して、測定の開始の指示を入力すると、コンピュータ１８は、記憶装置（図示せず）に記憶されたプログラムに従って、試料溶液内の光検出領域に於ける励起光の照射及び光強度の計測が開始される。計測が開始されると、まず、コンピュータ１８のプログラムに従った処理動作の制御下、光源２から、試料溶液中の発光粒子の励起波長の光が出射されると共に、ミラー偏向器１７がミラー７（ガルバノミラー）を駆動して、ウェル１０内に於いて光検出領域の位置の移動を実行し、これと同時に光検出器１６は、それぞれ、逐次的に検出された光を電気信号に変換してコンピュータ１８へ送信し、コンピュータ１８は、任意の態様にて、送信された信号から時系列の光強度データを生成して保存する。典型的には、光検出器１６は、一光子の到来を検出できる超高感度光検出器であるので、光の検出は、所定時間に亘って、逐次的に、所定の単位時間毎（ＢＩＮ ＴＩＭＥ）に、例えば、１０μ秒毎に光検出器に到来するフォトンの数を計測する態様にて実行されるフォトンカウンティングであり、時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータであってよい。

光検出領域の位置の移動速度に関して、走査分子計数法に於いて、計測された時系列の光強度データからの発光粒子の個別の検出を、定量的に精度よく実行するために、好適には、光強度の計測中の光検出領域の位置の移動速度は、発光粒子のランダムな運動、即ち、ブラウン運動による移動速度よりも速い値に設定される。光検出領域の位置の移動速度が粒子のブラウン運動による移動に比して遅い場合には、図５（Ａ）に模式的に描かれている如く、粒子が領域内をランダムに移動し、これにより、光強度がランダムに変化し（光検出領域の励起光強度は、領域の中心を頂点として外方に向かって低減する。）、個々の発光粒子に対応する有意な光強度の変化（発光粒子からの光を表す信号）を特定することが困難となる。そこで、好適には、図５（Ｂ）に描かれている如く、粒子が光検出領域ＣＶを略直線に横切り、これにより、時系列の光強度データに於いて、個々の粒子に対応する光強度の変化のプロファイルが、図５（Ｃ）最上段に例示されている如く励起光強度分布と略同様の略釣鐘状となって、個々の発光粒子と光強度との対応が容易に特定できるように、光検出領域の位置の移動速度は、粒子のブラウン運動による平均の移動速度（拡散移動速度）よりも速く設定される。

具体的には、拡散係数Ｄを有する発光粒子がブラウン運動によって半径Ｗｏの光検出領域（コンフォーカルボリューム）を通過するときに要する時間Δτは、平均二乗変位の関係式
（２Ｗｏ）^２＝６Ｄ・Δτ …（１）
から、
Δτ＝（２Ｗｏ）^２／６Ｄ …（２）
となるので、発光粒子がブラウン運動により移動する速度（拡散移動速度）Ｖdifは、概ね、
Ｖdif＝２Ｗｏ／Δτ＝３Ｄ／Ｗｏ …（３）
となる。そこで、光検出領域の位置の移動速度は、かかるＶdifを参照して、それよりも十分に早い値に設定されてよい。例えば、発光粒子の拡散係数が、Ｄ＝２．０×１０^−１０ｍ^２／ｓ程度であると予想される場合には、Ｗｏが、０．６２μｍ程度だとすると、Ｖdifは、１．０×１０^−３ｍ／ｓとなるので、光検出領域の位置の移動速度は、その略１０倍以上の１５ｍｍ／ｓなどと設定されてよい。なお、発光粒子の拡散係数が未知の場合には、光検出領域の位置の移動速度を種々設定して光強度の変化のプロファイルが、予想されるプロファイル（典型的には、励起光強度分布と略同様）となる条件を見つけるための予備実験を繰り返し実行して、好適な光検出領域の位置の移動速度が決定されてよい。

なお、既に述べた如く、試料溶液中の発光粒子濃度が低いほど、単位時間当たりに検出される発光粒子からの光の信号の数が低減することとなる。そうすると、例えば、試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度を精度よく計測しようとする場合、或る程度の数の発光粒子の信号を取得する必要があるところ、試料溶液中の発光粒子濃度が低いときには、かかる数の発光粒子の信号を取得するまでに要する計測時間が長くなる。そこで、本発明に於いては、上記の如く、計測時間の短縮を図るべく、コンフォーカル・ボリューム（光検出領域）の数を増やして、光検出領域の総体積の増大が行われる。

（３）光強度の分析
上記の処理により試料溶液中の発光粒子の時系列の光強度データが得られると、コンピュータ１８に於いて、記憶装置に記憶されたプログラムに従った処理により、光強度データ上に於ける発光粒子からの光に対応する信号の検出、発光粒子濃度の算出等の分析が実行される。

（ｉ）発光粒子に対応する信号の検出
時系列の光強度データに於いて、一つの発光粒子の光検出領域を通過する際の軌跡が、図５（Ｂ）に示されている如く略直線状である場合、その粒子に対応する信号に於ける光強度の変化は、（光学系により決定される）光検出領域内の光強度分布を反映した略釣鐘状のプロファイルを有する（図５（Ｃ）最上段参照）。従って、走査分子計数法では、基本的には、適宜設定される閾値を超える光強度が継続する時間幅が所定の範囲にあるとき、その光強度のプロファイルを有する信号が一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されるようになっていてよい。そして、閾値を超える光強度が継続する時間幅が所定の範囲にない信号は、ノイズ又は異物の信号として判定される。また、光検出領域の光強度分布が、ガウス分布：
Ｉ＝Ａ・ｅｘｐ（−２ｔ^２／ａ^２） …（４）
であると仮定できるときには、有意な光強度のプロファイル（バックグラウンドでないと明らかに判断できるプロファイル）に対して式（４）をフィッティングして算出された強度Ａ及び幅ａが所定の範囲内にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されてよい。（強度Ａ及び幅ａが所定の範囲外にある信号は、ノイズ又は異物の信号として判定され、その後の分析等に於いて無視されてよい。）

時系列光強度データからの発光粒子の一括的な検出を行う処理方法の一つの例としては、まず、時系列光強度データ（図５（Ｃ）、最上段「検出結果（未処理）」）に対して、スムージング（平滑化）処理が為される（図４−ステップ１１０、図５（Ｃ）中上段「スムージング」）。発光粒子の発する光は確率的に放出されるものであり、微小な時間に於いてデータ値の欠落が生じ得るため、かかるスムージング処理によって、前記の如きデータ値の欠落を無視できることとなる。スムージング処理は、例えば、移動平均法等により為されてよい。なお、スムージング処理を実行する際のパラメータ、例えば、移動平均法に於いて一度に平均するデータ点数や移動平均の回数など、は、光強度データ取得時の光検出領域の位置の移動速度（走査速度）、ＢＩＮ ＴＩＭＥに応じて適宜設定されてよい。

次いで、スムージング処理後の時系列光強度データに於いて、有意なパルス状の信号（以下、「パルス信号」と称する。）が存在する時間領域（パルス存在領域）を検出するために、スムージング処理後の時系列光強度データの時間についての一次微分値が演算される（ステップ１２０）。時系列光強度データの時間微分値は、図５（Ｃ）中下段「時間微分」に例示されている如く、信号値の変化時点に於ける値の変化が大きくなるので、かかる時間微分値を参照することによって、有意な信号の始点と終点を有利に決定することができる。

しかる後、時系列光強度データ上に於いて、逐次的に、有意なパルス信号を検出し、検出された信号が発光粒子に対応する信号であるか否かが判定される。具体的には、まず、時系列光強度データの時系列の時間微分値データ上にて、逐次的に時間微分値を参照して、一つのパルス信号の始点と終点とが探索され決定され、パルス存在領域が特定される（ステップ１３０）。一つのパルス存在領域が特定されると、そのパルス存在領域に於けるスムージングされた時系列光強度データに対して、釣鐘型関数のフィッティングが行われ（図５（Ｃ）下段「釣鐘型関数フィッティング」）、釣鐘型関数のパルスのピーク（最大値）の強度Ｉpeak、パルス幅（半値全幅）Ｗpeak、フィッティングに於ける（最小二乗法の）相関係数等のパラメータが算出される（ステップ１４０）。なお、フィッティングされる釣鐘型関数は、典型的には、ガウス関数であるが、ローレンツ型関数であってもよい。そして、算出された釣鐘型関数のパラメータが、一つの発光粒子が光検出領域を通過したときに検出されるパルス信号が描く釣鐘型のプロファイルのパラメータについて想定される範囲内にあるか否か、即ち、パルスのピーク強度、パルス幅、相関係数が、それぞれ、所定範囲内にあるか否か、例えば、
下記の条件:
２０μ秒＜パルス幅＜４００μ秒
ピーク強度＞１．０［ｐｃ／１０μｓ］ …（Ａ）
相関係数＞０．９５
を満たすか否か等が判定される（ステップ１５０）。かくして、図６左に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが一つの発光粒子に対応する信号に於いて想定される範囲内にあると判定された信号は、一つの発光粒子に対応する信号であると判定され、これにより、一つの発光粒子が検出されたこととなる。一方、図６右に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが想定される範囲内になかったパルス信号は、ノイズとして無視される。

上記のステップ１３０〜１５０の処理に於けるパルス信号の探索及び判定は、時系列光強度データの全域に渡って繰り返し実行されてよい（ステップ１６０）。なお、時系列光強度データから発光粒子の信号を個別に検出する処理は、上記の手順に限らず、任意の手法により実行されてよい。

（ii）発光粒子濃度の決定
更に、検出された発光粒子の信号の数を計数して、発光粒子の数の決定が為されてもよい（発光粒子のカウンティング）。また、任意の手法にて、光検出領域の通過した領域の総体積が算定されれば、その体積値と発光粒子の数とから試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度が決定される（ステップ１７０）。

光検出領域の通過した領域の総体積は、励起光又は検出光の波長、レンズの開口数、光学系の調整状態に基づいて理論的に算定されてもよいが、実験的に、例えば、発光粒子の濃度が既知の溶液（対照溶液）について、検査されるべき試料溶液の測定と同様の条件にて、上記に説明した光強度の測定、発光粒子の検出及びカウンティングを行うことにより検出された発光粒子の数と、対照溶液の発光粒子の濃度とから決定されるようになっていてよい。具体的には、例えば、発光粒子の濃度Ｃの対照溶液について、対照溶液の発光粒子の検出数がＮであったとすると、光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔは、
Ｖｔ＝Ｎ／Ｃ …（５）
により与えられる。また、対照溶液として、発光粒子の複数の異なる濃度の溶液が準備され、それぞれについて測定が実行されて、算出されたＶｔの平均値が光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔとして採用されるようになっていてよい。そして、Ｖｔが与えられると、発光粒子のカウンティング結果がｎの試料溶液の発光粒子の濃度ｃは、
ｃ＝ｎ／Ｖｔ …（６）
により与えられる。なお、光検出領域の体積、光検出領域の通過した領域の総体積は、上記の方法によらず、任意の方法にて、例えば、ＦＣＳ、ＦＩＤＡを利用するなどして与えられるようになっていてよい。また、本実施形態の光分析装置に於いては、想定される光検出領域の移動パターンについて、種々の標準的な発光粒子についての濃度Ｃと発光粒子の数Ｎとの関係（式（５））の情報をコンピュータ１８の記憶装置に予め記憶しておき、装置の使用者が光分析を実施する際に適宜記憶された関係の情報を利用できるようになっていてよい。

かくして、上記の本発明によれば、光検出領域により試料溶液中にて走査して発光粒子を個別に検出する走査分子計数法に於いて、試料溶液中の発光粒子のカウンティング、濃度の決定等が可能となる。

上記に説明した本発明の有効性を検証するために、以下の如き実験を行った。なお、以下の実施例は、本発明の有効性を例示するものであって、本発明の範囲を限定するものではないことは理解されるべきである。

ＦＣＳによる１発光粒子当たりの蛍光強度と背景光強度の計測
ＦＣＳ計測を用いて、コンフォーカル・ボリュームの数を増やした場合とコンフォーカル・ボリュームの径を増やした場合とに於ける１発光粒子当たりの蛍光強度と背景光強度の変化を確認した。

試料溶液として、リン酸緩衝液（０．１％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７を含む）と、リン酸緩衝液中に、蛍光色素ＡＴＴＯ６３３を、濃度が１ｎＭとなるように、溶解した溶液をそれぞれ調製した。次に、調製した試料溶液３０μＬをマイクロプレートのウェルに分注した。なお、光分析装置として、共焦点蛍光顕微鏡の光学系とフォトンカウンティングシステムを備えた１分子蛍光測定装置ＭＦ２０（オリンパス株式会社）を用いた。励起光は、６３３ｎｍのレーザー光とし、検出波長帯域は、バンドパスフィルターを用いて、６６０−７１０ｎｍの波長帯域とした。また、対物レンズは、４０倍の水浸型のレンズを用いた。コンフォーカル・ボリュームの半径の調整は、入射させるレーザービームの径を調節することにより行った。更に、コンフォーカル・ボリュームの数を増やす場合には、図２（Ｂ）に例示の楔型ハーフミラーを図１（Ａ）のミラー７に置き換えた。そして、光の計測は、励起光出力を種々変更しながら、１０秒間に亘ってフォトンカウンティングにより実行した。そして、色素を含む溶液の場合、フォトンカウンティングデータに於ける１秒当たりのフォトンカウント値の平均値を、フォトンカウンティングデータをＦＣＳに従って解析して得た平均粒子数で除算することにより、１発光粒子当たりの蛍光強度（ＣＣＰ）を算出した。また、色素を含まないリン酸緩衝液の場合、１秒当たりのフォトンカウント値の平均値を背景光強度（ＢＧ）として算出した。

図７〜９（Ａ）は、それぞれ、半径０．５μｍの一つのコンフォーカル・ボリュームを形成した場合（通常の設定−図７（Ｂ））、半径２．０μｍの一つのコンフォーカル・ボリュームを形成した場合（コンフォーカル・ボリューム径を拡大した場合−図８（Ｂ））、半径０．５μｍの二つのコンフォーカル・ボリュームを形成した場合（本発明の場合−図９（Ｂ））のＣＣＰとＢＧとを、コンフォーカル・ボリューム内の励起光パワー密度（図７〜９（Ａ）の横軸の下段）に対してプロットした図を示している（図７〜９（Ａ）の横軸の上段は、対物レンズの出射強度である。）。励起光パワー密度は、［対物レンズの出射強度／コンフォーカル・ボリューム断面積］により算定した。コンフォーカル・ボリューム断面積は、
ｄ＝１．２２（λ／（Ｄ／２ｆ））
（ここで、ｄ：コンフォーカル・ボリューム直径；λ：励起光波長；Ｄ：入射ビーム径；ｆ：対物レンズの焦点距離）
により算定されたコンフォーカル・ボリュームの直径を用いて算出した。対物レンズの出射強度は、対物レンズの先端にてパワーメータを用いて測定した。

まず、図７（通常の設定）を参照して、既に触れた如く、ＣＣＰは、励起光パワー密度が比較的低い領域（６０ｋＷ／ｃｍ^２以下）では、励起光パワー密度の増大と共に増大するが、励起光パワー密度が比較的高い領域（６０ｋＷ／ｃｍ^２以上）では、飽和状態となった。一方、ＢＧは、その大きさは、ＣＣＰの１／１００程度であるが、ＣＣＰが飽和状態となった領域に於いても、励起光パワー密度の増大と共に増大した。このことは、単に、励起光パワー密度を増大すると、ＢＧが相対的に増大し続けることから、Ｓ／Ｎ比が悪化することを示している。

次いで、図８（コンフォーカル・ボリューム径を拡大した場合）を参照して、コンフォーカル・ボリューム半径が通常の設定の４倍の場合には、ＢＧが図７の場合に比して２００〜３００倍に増大し（励起光パワー密度が７６ｋＷ／ｃｍ^２のとき、ＢＧは、図７では、０．２〜０．３ｋＨｚだったのに対し、図８では、約６０ｋＨｚであった。）、ＣＣＰを計測することができなかった（算出結果が異常に小さい値であった。）。図８のコンフォーカル・ボリュームの体積は、図７の場合の約６０倍であるので、ＢＧは、コンフォーカル・ボリュームの体積が増加すると、その体積の増加分以上に増大したこととなる。

一方、図９の如く、半径０．５μｍの二つのコンフォーカル・ボリュームを形成した場合（本発明の場合。図２（Ｂ）の楔型ハーフミラーを光路に挿入した。−図９（Ｂ））、ＢＧは、図７の場合と殆ど変らず、ＣＰＰは、低下したが（楔型ハーフミラーに於ける反射損失であると考えられる。）、良好に計測可能であった。

また、更に、図７（Ｂ）及び図９（Ｂ）の各構成に於いて取得されたフォトンカウントデータについてＦＣＳに従って解析をして得られた並進拡散時間、粒子数、ＣＰＰは、以下の通りとなった（励起光強度を１００μＷとした。）。

上記の表１の結果を参照して、並進拡散時間が図７と図９とで略等しいことから、一つのコンフォーカル・ボリュームの大きさは、略等しいが、図９の粒子数が図７の粒子数の約２倍となっていることから、図９のコンフォーカル・ボリュームの総体積が図７のコンフォーカル・ボリュームの総体積の約２倍であり、二つのコンフォーカル・ボリュームが形成されていることが確認された。（図９のＣＣＰが相対的に低い理由は、既に触れた如く、楔型ハーフミラーにて反射することによる損失であると考えられる。）

かくして、上記の結果によれば、本発明の教示に従って、コンフォーカル・ボリュームの数を増やして光検出領域の総体積を増大することにより、（コンフォーカル・ボリュームの径を拡大する場合に比して）背景光強度の大幅な増大をせずに、単位時間当たりに検出される発光粒子数を増大できることが示された。かかる構成によれば、試料溶液中の発光粒子濃度が低い場合にも、より短い時間にてより多数の発光粒子の光の検出が可能となることが示された。

Claims (14)

1. 共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出し分析する光分析装置であって、
   前記光学系が前記試料溶液内に於いて前記光学系の光検出領域を少なくとも二つ形成する分割光学系を有することを特徴とする装置。
2. 請求項１の装置であって、前記分割光学系により形成された少なくとも二つの光検出領域からの光が一つの光検出器にて受光されることを特徴とする装置。
3. 請求項１又は２の装置であって、前記顕微鏡の光学系に於いて、前記分割光学系を用いて少なくとも二つの光検出領域を形成する構成と前記分割光学系を用いずに一つの光検出領域を形成する構成とが選択可能であることを特徴とする装置。
4. 請求項１乃至３のいずれかの装置であって、前記分割光学系に於いて、楔型ハーフミラーを用いて前記少なくとも二つの光検出領域を形成することを特徴とする装置。
5. 請求項１乃至４のいずれかの装置であって、前記分割光学系に於いて、回折光学素子を用いて前記少なくとも二つの光検出領域を形成することを特徴とする装置。
6. 請求項１乃至５のいずれかの装置であって、更に、
   前記光学系の光路を変更することにより前記試料溶液内に於いて前記光学系の光検出領域の位置を移動する光検出領域移動部と、
   前記試料溶液内に於いて前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出器にて検出された前記発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出する信号処理部と
   を含むことを特徴とする装置。
7. 請求項６の装置であって、前記信号処理部が、前記個別に検出された発光粒子からの光を表す信号の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記発光粒子の数を計数することを特徴とする装置。
8. 請求項６又は７の装置であって、前記光検出領域移動部が前記発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて前記光検出領域の位置を移動することを特徴とする装置。
9. 共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出し分析する光分析方法であって、
   前記試料溶液内に於いて前記光学系の光検出領域を少なくとも二つ形成する分割光学系を用いることを特徴とする方法。
10. 請求項９の方法であって、前記分割光学系により形成された少なくとも二つの光検出領域からの光が一つの光検出器にて受光されることを特徴とする方法。
11. 請求項９又は１０の方法であって、前記顕微鏡の光学系に於いて、前記分割光学系を用いて少なくとも二つの光検出領域を形成する構成と前記分割光学系を用いずに一つの光検出領域を形成する構成とを選択可能であることを特徴とする方法。
12. 請求項９乃至１１のいずれかの方法であって、
    前記光学系の光路を変更することにより前記試料溶液内に於いて前記光学系の光検出領域の位置を移動する過程と、
    前記試料溶液内に於いて前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出器により前記光検出領域からの光を検出する過程と、
    前記検出された光から個々の発光粒子からの光を表す信号を個別に検出する過程と
    を含むことを特徴とする方法。
13. 請求項１２の方法であって、更に、前記個別に検出された発光粒子からの光を表す信号の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記発光粒子の数を計数する過程を含むことを特徴とする方法。
14. 請求項１２又は１３のいずれかの方法であって、前記光検出領域の位置を移動する過程に於いて、前記光検出領域の位置が前記発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動されることを特徴とする方法。

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