CN104677884A - 高空间分辨激光分光瞳差动共焦质谱显微成像方法与装置 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高空间分辨激光分光瞳差动共焦质谱显微成像方法与装置，属于共焦显微成像技术和质谱成像技术领域。本发明将分光瞳差动共焦显微成像技术和质谱成像技术相结合，利用高空间分辨分光瞳差动共焦显微系统的聚焦光斑对样品进行轴向定焦与成像、利用高空间分辨分光瞳差动共焦显微系统的同一聚焦光斑对样品进行解吸电离来进行质谱成像，进而实现样品微区图像与组分的高空间分辨成像。本发明可实现样品微区的高空间分辨质谱探测和微区显微成像，有效地发挥分光瞳差动共焦系统高空间分辨的潜能，提高了激光质谱仪的空间分辨能力，抗杂散光能力强。本发明可为生物质谱高分辨成像提供一个全新的有效技术途径。

Description

高空间分辨激光分光瞳差动共焦质谱显微成像方法与装置

技术领域

本发明属于共焦显微成像技术和质谱成像技术领域，将分光瞳共焦显微成像技术和质谱成像技术相结合，涉及一种高空间分辨激光分光瞳差动共焦质谱显微成像方法与装置，可用于生物质谱的高分辨成像。

技术背景

质谱仪(Mass Spectrometry)是将样品中的组分发生电离，使生成的不同荷质比的带电原子、分子或分子碎片在电场和磁场的作用下分别聚焦而得到按质荷比大小顺序排列的图谱仪器。质谱成像是对样品二维区域内多个微小区域分别进行质谱分析来检测特定质荷比(m/z)物质的分布。

自上世纪80年代中期基质辅助激光解吸电离这种高灵敏度和高质量检测范围生物质谱成像技术的出现，开拓了质谱学一个崭新的领域—生物质谱，促使质谱技术应用范围扩展到生命科学研究的众多领域，特别是质谱在蛋白质、核酸、糖蛋白分析等方面的应用，不仅为生命科学研究提供了新手段，而且也促进了质谱技术自身的发展。

但现有基质辅助激光解吸电离质谱仪存在以下突出问题：

1)由于利用简单的激光聚焦来解吸电离样品，因而其仍存在激光聚焦光斑大、质谱探测空间分辨力不高等问题；

2)质谱成像所需时间长，激光质谱仪聚焦光斑轴向位置相对被测样品常发生漂移问题。

而生物样品“微区”质谱信息的准确获取对于生命科学研究具有极其重要的意义。事实上，目前如何高灵敏地探测微区质谱信息是生物质谱领域亟待研究的重要技术问题。

激光共焦显微镜“点照明”和“点探测”的成像探测机制，不仅使其横向分辨力较同等参数的光学显微镜改善1.4倍，而且还使共焦显微镜极便于与超分辨光瞳滤波技术、径向偏振光紧聚焦技术等结合来压缩聚焦光斑，进一步实现高空间分辨显微成像。

基于此，本发明提出一种高空间分辨激光分光瞳差动共焦质谱显微成像方法与装置，其将激光分光瞳差动共焦显微镜聚焦光斑的探测功能与激光聚焦解吸电离功能相融合，利用经超分辨技术处理的分光瞳差动共焦显微镜的微小聚焦光斑对样品进行高空间分辨成像，利用分光瞳差动共焦显微镜同一聚焦光斑对样品进行解吸电离供质谱探测系统进行成像，继而实现被测样品微区的高空间分辨图像成像和高空间分辨质谱显微成像。

本发明提出一种高空间分辨激光分光瞳差动共焦质谱显微成像方法与装置可为生物质谱高分辨成像提供一种全新的有效技术途径。

发明内容

本发明的目的是质谱成像的空间分辨能力、抑制成像过程中聚焦光斑相对样品的漂移，提出一种高空间分辨激光分光瞳差动共焦质谱显微成像方法与装置，以期同时获得被测对象成分空间信息和功能信息。

本发明的目的是通过下述技术方案实现的。

本发明的一种高空间分辨激光分光瞳差动共焦质谱显微成像方法，其利用高空间分辨分光瞳差动共焦显微系统的聚焦光斑对样品进行定焦与成像，利用高空间分辨分光瞳差动共焦显微系统的同一聚焦光斑对样品进行解吸电离来进行质谱成像，进而实现样品微区图像与组分的高空间分辨成像，包括以下步骤：

步骤一、使平行光束通过沿入射光轴方向的压缩聚焦光斑系统、D型照明收集镜中的D型照明光瞳聚焦到被测样品上解吸电离产生等离子体羽；

步骤二、使计算机控制三维工作台带动被测样品沿测量面法线方向在D型照明收集镜焦点附近上下移动，利用沿采集光轴方向的D型收集光瞳、采集透镜、中继放大透镜和位于中继放大透镜焦面并关于采集光轴对称放置的第一光强点探测器和第二光强点探测器对放大艾里斑进行分割探测，得到艾里斑第一微区和艾里斑第二微区的强度特性曲线分别为第一离轴共焦轴向强度曲线和第二离轴共焦轴向强度曲线；

步骤三、将第一离轴共焦轴向强度曲线和第二离轴共焦轴向强度曲线相减处理得到双轴差动共焦轴向强度曲线；

步骤四、计算机依据双轴差动共焦轴向强度曲线的零点位置z_A值控制三维工作台带动被测样品沿测量面法线方向运动，使D型照明收集镜的聚焦光斑聚焦到被测样品上；

步骤五、利用电离样品吸管将聚焦光斑解吸电离被测样品产生的等离子体羽中的分子、原子和离子吸入质谱探测系统中进行质谱成像，测得对应聚焦光斑区域的质谱信息；

步骤六、利用由D型照明收集镜、D型收集光瞳、采集透镜、中继放大透镜、第一光强点探测器、第二光强点探测器和三维工作台构成的激光分光瞳差动共焦探测系统对聚焦到被测样品的微区进行成像，测得对应聚焦光斑区域的形态信息；

步骤七、计算机将激光分光瞳差动共焦探测系统测得的激光聚焦微区形态信息与质谱探测系统同时测得的激光聚焦微区的质谱信息进行融合处理，继而得到聚焦光斑微区的形态和质谱信息；

步骤八、计算机控制三维工作台使D型照明收集镜焦点对准被测样品的下一个待测区域，然后按步骤二～步骤七进行操作，得到下一个待测聚焦区域的形态和质谱信息；

步骤九、重复步骤八直到被测样品上的所有待测点均被测到，然后利用计算机进行处理即可得到被测样品形态信息和质谱信息。

本发明高空间分辨激光分光瞳差动共焦质谱显微成像方法中，包括步骤一可为使平行光束通过沿入射光轴方向放置的矢量光束发生系统、光瞳滤波器后整形为环形光束，该环形光束再经圆形照明收集镜的圆形照明光瞳聚焦到被测样品上解吸电离产生等离子体羽。

本发明高空间分辨激光分光瞳差动共焦质谱显微成像方法中，包括D型照明收集镜中D型照明光瞳和D型收集光瞳的照明、收集功能可以通过圆形照明收集镜中圆形照明光瞳和圆形收集光瞳来完成。

本发明的一种高空间分辨激光分光瞳差动共焦质谱显微成像装置，包括点光源、沿入射光轴方向放置的准直透镜、压缩聚焦光斑系统、聚焦光斑到被测样品的D型照明收集镜和D型照明光瞳，包括D型收集光瞳、采集透镜、中继放大透镜和位于中继放大透镜焦面并关于采集光轴对称放置的第一光强点探测器和第二光强点探测器，以及用于D型照明收集镜聚焦光斑解吸电离的离子体羽组分的电离样品吸管和质谱探测系统，入射光轴和采集光轴之间的夹角为2α，并关于测量面法线对称。

本发明的一种高空间分辨激光分光瞳差动共焦质谱显微成像装置中，包括压缩聚焦光斑系统可以用沿入射光轴方向放置的产生矢量光束的矢量光束发生系统和光瞳滤波器替代。

本发明的一种高空间分辨激光分光瞳差动共焦质谱显微成像装置中，包括D型照明收集镜可替换为圆形型照明收集镜。

本发明的一种高空间分辨激光分光瞳差动共焦质谱显微成像装置中，包括第一光强点探测器和第二光强点探测器可以用一个CCD探测器替代。

有益效果

本发明对比已有技术，具有以下优点：

1)将具有高空间分辨能力的分光瞳差动共焦显微技术与质谱探测技术相融合，使分光瞳差动共焦显微成像系统的光斑实现聚焦探测和样品解吸电离双重功能，可实现样品微区质谱的高空间质谱显微成像；

2)利用分光瞳差动共焦曲线的过零点进行样品预先定焦，使最小聚焦光斑聚焦到样品表面，可实现样品微区高空间分辨质谱探测和微区显微成像，有效地发挥分光瞳差动共焦系统高空间分辨的潜能；

3)利用分光瞳差动共焦曲线过零点进行样品预先定焦处理，可抑制现有质谱仪因长时间质谱成像中聚焦光斑相对被测样品的漂移问题；

4)利用压缩聚焦光斑技术，提高了激光质谱仪的空间分辨能力；

5)利用双轴结构光束斜入射探测，克服了现有共焦显微成像技术无法抑制焦面杂散光干扰的缺陷，抗杂散光能力强。

附图说明

图1为高空间分辨激光分光瞳差动共焦质谱显微成像方法示意图；

图2为实施例1的高空间分辨激光分光瞳差动共焦质谱显微成像方法与装置；

图3为实施例2的高空间分辨激光分光瞳差动共焦质谱显微成像方法与装置。

其中：1-点光源、2-准直透镜、3-平行光束、4-压缩聚焦光斑系统、5-D型照明收集镜、6-D型照明光瞳、7-D型收集光瞳、8-入射光轴、9-被测样品、10-测量面法线、11-等离子体羽、12-采集光轴、13-采集透镜、14-中继放大透镜、15-焦面、16-放大艾里斑、17-第一光强点探测器、18-第二光强点探测器、19-艾里斑第一微区、20-艾里斑第二微区、21-第一离轴共焦轴向强度曲线、22-第二离轴共焦轴向强度曲线、23-差动共焦轴向强度曲线、24-计算机、25-三维工作台、26-电离样品吸管、27-质谱探测系统、28-矢量光束发生系统、29-光瞳滤波器、30-圆形照明收集镜、31-圆形照明光瞳、32-圆形收集光瞳、33-CCD探测器、34-出射光束衰减器、35-探测光束衰减器、36-脉冲激光器、37-聚光透镜、38-传光光纤。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

本发明的核心方法如图1所示，其中，由压缩聚焦光斑系统4和D型照明收集镜5的D型照明光瞳6构成的环形光横向超分辨系统，用于压缩聚焦光斑横向尺寸。

以下实施例均是在图1基础上实现的。

实施例1

如图2所示的高空间分辨激光分光瞳差动共焦质谱显微成像装置中，压缩聚焦光斑系统4由矢量光束发生系统28、光瞳滤波器29替代，D型照明收集镜5可由圆形照明收集镜30替代，第一强度点探测器17和第二强度点探测器18由CCD探测器33替代。

如图2所示的高空间分辨激光分光瞳差动共焦质谱显微成像装置包括点光源1、沿入射光轴8方向放置的准直透镜2、矢量光束发生系统28、光瞳滤波器29和聚焦光斑到被测样品9的圆形照明收集镜30的圆形照明光瞳31，还包括圆形照明收集镜24的圆形收集光瞳32、位于采集光轴12方向的采集透镜13、中继放大透镜14和位于中继放大透镜14焦面15上的CCD探测器33，以及用于圆形照明收集镜30聚焦光斑解析电离的离子体羽11组分的电离样品吸管26和质谱探测系统27，入射光轴8和采集光轴12之间的夹角为2α，并关于测量面法线10对称。

主要构成的功能如下：

由点光源1、沿入射光轴8放置的准直透镜2、矢量光束发生系统28、光瞳滤波器29、聚焦光斑到被测样品9的圆形照明收集镜30的圆形照明光瞳31构成的激光聚焦系统用于产生超过衍射极限的微小聚焦光斑，该超衍射微小尺寸光斑具有测量样品表面和产生表面等离子体的双重功能。

由沿采集光轴12方向的圆形照明收集镜30的圆形收集光瞳32、采集透镜13、中继放大透镜14、位于中继放大透镜14焦面15上的CCD探测器33构成的激光分光瞳差动共焦探测系统对被测样品9进行精密定焦，并对圆形照明收集镜30聚焦到被测样品9的微区进行成像，测得对应聚焦光斑区域的形态信息；

由电离样品吸管26和质谱探测系统27构成的质谱探测系统基于飞行时间法(TOF)探测等离子体羽11中的带电原子、分子等，来进行飞行时间质谱探测。

由矢量光束发生系统28、光瞳滤波器29和圆形照明收集镜30的圆形照明光瞳31构成的径向偏振光纵向场紧聚焦系统用于压缩聚焦光斑横向尺寸。

由计算机24、三维工作台25构成的三维运动系统可对被测样品9进行轴向定焦定位和三维扫描。

对被测样品进行高分辨质谱成像的过程主要包括以下步骤：

步骤一、点光源1出射的光束经准直透镜2后准直为平行光束3，该平行光束3经矢量光束发生系统28、光瞳滤波器29生成环形光束，该环形光束再经圆形照明收集镜30的圆形照明光瞳31聚焦为超过衍射极限的微小光斑照射在被测样品9上；

步骤二、利用计算机24控制三维工作台25使由圆形收集光瞳32、中继放大透镜14和位于中继放大透镜14焦面15上的CCD探测器33构成的激光分光瞳差动共焦探测系统对被测样品9进行轴向扫描，对放大艾里斑16进行分割探测，得到艾里斑第一微区19和艾里斑第二微区20的强度特性曲线分别为第一离轴共焦轴向强度曲线21和第二离轴共焦轴向强度曲线22；

步骤三、将第一离轴共焦轴向强度曲线21和第二离轴共焦轴向强度曲线22相减处理得到双轴差动共焦轴向强度曲线23；

步骤四、计算机24依据双轴差动共焦轴向强度曲线23的零点位置z_A值控制三维工作台25带动被测样品9沿测量面法线10方向运动，使圆形照明收集镜30的聚焦光斑聚焦到被测样品9上，实现对被测样品9的初始定焦；

步骤五、利用电离样品吸管26将聚焦光斑解吸电离被测样品9产生的等离子体羽11中的分子、原子和离子吸入质谱探测系统27中进行质谱成像，测得对应聚焦光斑区域的质谱信息；

步骤六、利用由沿采集光轴12方向的圆形收集光瞳26、采集透镜13、中继放大透镜14、中继放大透镜14焦点处的CCD探测器33构成的激光分光瞳差动共焦探测系统同时对被测样品9表面等离子体羽11对应的微区形态进行成像，测得区域形态信息；

步骤七、计算机24将激光分光瞳差动共焦探测系统测得的激光聚焦微区形态信息与质谱探测系统27同时探测的激光聚焦微区质谱信息进行融合处理，得到该聚焦微区的形态和质谱信息；

步骤八、计算机24控制三维工作台24使圆形照明收集镜30对准被测样品的下一个待测区域，然后按步骤二～步骤七进行操作，得到下一个待测聚焦区域的形态和质谱信息；

步骤九、重复步骤八直到被测样品9上的所有待测点均被测到，然后利用计算机18进行数据融合和图像重构处理，即可得到被测样品形态信息和质谱信息。

实施例2

如图3所示的高空间分辨激光分光瞳差动共焦质谱显微成像装置中，点光源1由脉冲激光器36、聚光透镜37、聚光透镜37焦点处的传光光纤38替代，D型照明收集镜5由圆形照明收集镜30替代，第一强度点探测器17和第二强度点探测器18由CCD探测器33替代。同时，在激光聚焦系统中引入出射光束衰减器34，在激光分光瞳差动共焦探测系统中引入探测光束衰减器35。

由出射光束衰减器34和探测光束衰减器35构成光强调节系统，用于衰减聚焦光斑和CCD探测器33探测的光斑强度，以适应样品表面定位时的光强强度需求。

对被测样品进行高分辨质谱成像的过程主要包括以下步骤：

实施例1中的步骤五为、调节出射光束衰减器34来增强圆形照明收集镜30的聚焦光斑强度使被测样品9表面产生等离子体，利用电离样品吸管26将聚焦光斑解吸电离被测样品9产生的等离子体羽11中的分子、原子和离子吸入质谱探测系统27中进行质谱成像，测得对应聚焦光斑区域的质谱信息；

步骤六、利用由沿采集光轴12方向的圆形收集光瞳32、探测光束衰减器35、采集透镜13、中继放大透镜14焦点处的CCD探测器33构成的激光分光瞳差动共焦探测系统同时对被测样品9表面等离子体羽11对应的微区形态进行成像，测得区域形态信息；调节探测光束衰减器35，用于衰减光强以避免CCD探测器33过饱和探测；

其余成像方法与过程与实施例1相同。

以上结合附图对本发明的具体实施方式作了说明，但这些说明不能被理解为限制了本发明的范围。

本发明的保护范围由随附的权利要求书限定，任何在本发明权利要求基础上的改动都是本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种高空间分辨激光分光瞳差动共焦质谱显微成像方法，其特征在于：利用高空间分辨分光瞳差动共焦显微系统的聚焦光斑对样品进行定焦与成像，利用高空间分辨分光瞳差动共焦显微系统的同一聚焦光斑对样品进行解吸电离来进行质谱成像，进而实现样品微区图像与组分的高空间分辨成像，包括以下步骤：

步骤一、使平行光束(3)通过沿入射光轴(8)方向的压缩聚焦光斑系统(4)、D型照明收集镜(5)中的D型照明光瞳(6)聚焦到被测样品(9)上解吸电离产生等离子体羽(11)；

步骤二、使计算机(24)控制三维工作台(25)带动被测样品(9)沿测量面法线(10)方向在D型照明收集镜(5)焦点附近上下移动，利用沿采集光轴(12)方向的D型收集光瞳(7)、采集透镜(13)、中继放大透镜(14)和位于中继放大透镜(14)焦面(15)并关于采集光轴(12)对称放置的第一光强点探测器(17)和第二光强点探测器(18)对放大艾里斑(16)进行分割探测，得到艾里斑第一微区(19)和艾里斑第二微区(20)的强度特性曲线分别为第一离轴共焦轴向强度曲线(21)和第二离轴共焦轴向强度曲线(22)；

步骤三、将第一离轴共焦轴向强度曲线(21)和第二离轴共焦轴向强度曲线(22)相减处理得到双轴差动共焦轴向强度曲线(23)；

步骤四、计算机(24)依据双轴差动共焦轴向强度曲线(23)的零点位置z_A值控制三维工作台(25)带动被测样品(9)沿测量面法线(10)方向运动，使D型照明收集镜(5)的聚焦光斑聚焦到被测样品(9)上；

步骤五、利用电离样品吸管(26)将聚焦光斑解吸电离被测样品(9)产生的等离子体羽(11)中的分子、原子和离子吸入质谱探测系统(27)中进行质谱成像，测得对应聚焦光斑区域的质谱信息；

步骤六、利用由D型照明收集镜(5)、D型收集光瞳(7)、采集透镜(13)、中继放大透镜(14)、第一光强点探测器(17)、第二光强点探测器(18)和三维工作台(25)构成的激光分光瞳差动共焦探测系统对聚焦到被测样品(9)的微区进行成像，测得对应聚焦光斑区域的形态信息；

步骤七、计算机(24)将激光分光瞳差动共焦探测系统测得的激光聚焦微区形态信息与质谱探测系统(27)同时测得的激光聚焦微区的质谱信息进行融合处理，继而得到聚焦光斑微区的形态和质谱信息；

步骤八、计算机(24)控制三维工作台(25)使D型照明收集镜(5)焦点对准被测样品(9)的下一个待测区域，然后按步骤二～步骤七进行操作，得到下一个待测聚焦区域的形态和质谱信息；

步骤九、重复步骤八直到被测样品(9)上的所有待测点均被测到，然后利用计算机(24)进行处理即可得到被测样品形态信息和质谱信息。

2.根据权利要求1所述的一种高空间分辨激光分光瞳差动共焦质谱显微成像方法，其特征在于：包括步骤一可为使平行光束(3)通过沿入射光轴(8)方向放置的矢量光束发生系统(28)、光瞳滤波器(29)后整形为环形光束，该环形光束再经圆形照明收集镜(30)的圆形照明光瞳(31)聚焦到被测样品(9)上解吸电离产生等离子体羽(11)。

3.根据权利要求1所述的一种高空间分辨激光分光瞳差动共焦质谱显微成像方法，其特征在于：包括D型照明收集镜(5)中D型照明光瞳(6)和D型收集光瞳(7)的照明、收集功能可以通过圆形照明收集镜(30)中圆形照明光瞳(31)和圆形收集光瞳(32)来完成。

4.一种高空间分辨激光分光瞳差动共焦质谱显微成像装置，其特征在于：包括点光源(1)、沿入射光轴(8)方向放置的准直透镜(2)、压缩聚焦光斑系统(4)、聚焦光斑到被测样品(9)的D型照明收集镜(5)和D型照明光瞳(6)，包括D型收集光瞳(7)、采集透镜(13)、中继放大透镜(14)和位于中继放大透镜(14)焦面(15)并关于采集光轴(12)对称放置的第一光强点探测器(17)和第二光强点探测器(18)，以及用于D型照明收集镜(5)聚焦光斑解析电离的离子体羽(11)组分的电离样品吸管(26)和质谱探测系统(27)，入射光轴(8)和采集光轴(12)之间的夹角为2α，并关于测量面法线(10)对称。

5.根据权利要求4所述的一种高空间分辨激光分光瞳差动共焦质谱显微成像装置，其特征在于：包括压缩聚焦光斑系统(4)可以用沿入射光轴(8)方向放置的产生矢量光束的矢量光束发生系统(28)和光瞳滤波器(29)替代。

6.根据权利4所述的一种高空间分辨激光分光瞳差动共焦质谱显微成像装置，其特征在于：包括D型照明收集镜(5)可替换为圆形型照明收集镜(24)。

7.根据权利要求4所述的一种高空间分辨激光分光瞳差动共焦光谱—质谱显微成像装置，其特征在于：包括第一光强点探测器(17)和第二光强点探测器(18)可以用一个CCD探测器(33)替代。