CN103616355B - 超分辨共聚焦光学显微镜与二次离子质谱联用系统 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种超分辨共聚焦光学显微镜与二次离子质谱联用系统。激光器a输出的激光经二向色性滤光片a滤光后汇聚至显微物镜，激光器b输出的激光依次经位相板和二向色性滤光片b滤光后汇聚至所述显微物镜；经显微物镜汇聚的激光照射至样品台，得到待测样品的荧光信号又经所述显微物镜汇聚后经收集透镜a收集后入射至光电探测器，光电探测器输出的光电信号输入至光学信号采集器；离子束发生器轰击待测样品得到二次离子，二次离子经拉出电极获得动能后，再经离子门筛选后由反射探测器探测，反射探测器输出的信号输入至SIMS信号采集器；离子束发生器和样品台均与位移控制器相连接。由超分辨的光学成像引导SIMS成像和分析，由于超分辨的共聚焦光学显微镜分辨率可接近SIMs的分辨率，可以实现更高精度的靶点定位。
Description
技术领域
本发明涉及一种超分辨共聚焦光学显微镜与二次离子质谱联用系统，属于扫描显微成像领域。
背景技术
在材料科学领域，大量研究结果表明物质在纳米尺度的尺寸效应、量子效应、表面效应等使得纳米材料与纳米器件展现出非常优异的性能。只有在纳米尺度深入研究纳米功能器件中表面与界面的物理化学过程以及不同表界面分子结构和性质的变化，了解纳米功能器件的工作机制，才能实现人工设计、制备具有特定性能纳米器件的科学目标。
生命科学中生化反应和生物分子结构与性能的研究更是如此，由于生物分子结构（如构象）的多样性、生化反应的非同步性和所处环境的非均一性，在纳米尺度实现生理条件下蛋白质、核酸等单个生物分子成像表征，对揭示生命的奥秘、提高疾病的预防、诊断、治疗水平具有重要意义。
光学成像是最常用的成像表征技术，但是由于光学衍射原理的限制，传统光学显微镜只能达到波长量级的空间分辨率（一般在200nm～500nm），限制了它在纳米尺度对分子结构和功能研究中的应用。2006年以来各国研究人员提出了光活化定位显微镜（PALM）、随机光学重构显微镜（STORM）、受激辐射耗尽（Stimulated emissiondepletion-STED）显微镜等几种突破衍射极限的荧光成像新原理，其中STED显微镜以其时间分辨的优势在对动态过程的成像应用中具有很大的前景。
STED显微镜作为一种超分辨的共聚焦光学显微镜，是一种扫描成像技术，它是在传统共聚焦显微镜的基础上，添加一路STED光束，通过调制STED光束波前在物镜焦平面上形成空壳形状焦斑，将激发光衍射光斑周围的荧光分子转换为非辐射态，实现了好于50纳米的空间分辨率。目前超分辨的共聚焦光学显微镜的研究还处于起步阶段，与其他成像技术的联用尚未开展。
质谱分析是将样品转化为运动的带电离子碎片，通过测量其核质比来进行化学组分分析的一种分析方法。而质谱成像可以对样品不同位置的化学组分进行质谱分析，是一种新的分子成像技术，利用该技术可在分子水平上实现对表界面材料、生物组织、甚至细胞内的分子“直接”扫描和信号采集，获得分子的定位、定性和定量的信息。
采用一次离子束轰击的二次离子质谱SIMS最大的特点是具有高空间分辨率，并且样品处理简单，不需要添加基质，还能对纳米材料、生物医学材料进行纳米尺度的三维成像分析。
现有的飞行时间二次离子质谱仪系统中整合有光学显微镜，用于整体观测样品形貌。但是，所整合的光学显微镜的分辨率在微米级，与二次离子质谱的分辨率（<100nm）不匹配，无法同步观察材料表面形貌和化学组成的关系，特别是进行二次离子质谱（SIMS）三维深度成像分析时，经过一次离子的逐层轰击剥离，样品形貌在发生着细微的变化，用商品化二次离子质谱仪是无法观测此过程的。
因为荧光成像可以定位特定的靶分子，将荧光成像技术与SIMS技术联用，通过荧光成像引导SIMS离子束在样品表面特定位置进行轰击，既可以获得单分子的光学信号和形貌图像，又可以获得单分子质谱信息。但是由于光学衍射极限的限制，现有的激光共聚焦显微镜空间分辨率只能达到250nm～300nm，难以实现复杂体系中纳米级光学成像，对SIMS离子束引导定位也不够精确。
发明内容
本发明的目的是提供一种超分辨共聚焦光学显微镜与二次离子质谱联用系统，通过在共聚焦光学显微镜中加入第二路调制光，实现超分辨的共聚焦光学显微成像，突破传统的光学衍射极限的限制；本发明通过将SIMS与超分辨的共聚焦光学显微系统结合，由于超分辨的共聚焦光学显微镜分辨率可接近SIMS的分辨率，在获得单分子的光学信号和形貌图像的同时，可以获得分子质谱信息，实现在纳米尺度和分子水平对复杂体系多参量成像和分析，还可以首先进行超分辨的光学显微成像，然后利用该高分辨的光学显微图像对SIMS离子束进行纳米级精确引导定位，实现特定靶点的SIMS分析。
本发明所提供的一种超分辨共聚焦光学显微镜与二次离子质谱联用系统，激光器a输出的激光经二向色性滤光片a滤光后汇聚至显微物镜，激光器b输出的激光依次经位相板和二向色性滤光片b滤光后汇聚至所述显微物镜；经所述显微物镜汇聚的激光照射至样品台，得到待测样品的荧光信号又经所述显微物镜汇聚后经收集透镜a收集后入射至光电探测器，所述光电探测器输出的光电信号输入至光学信号采集器；
离子束发生器轰击待测样品得到二次离子，所述二次离子经拉出电极获得动能后，再经离子门筛选后由反射探测器探测，所述反射探测器输出的信号输入至SIMS信号采集器；
所述离子束发生器和样品台均与一位移控制器相连接。
上述的联用系统中，所述激光器a输出激光与所述激光器b输出的激光在汇聚至所述显微物镜之前均经一反射镜，以调整光路对准
上述的联用系统中，所述待测样品的荧光信号在入射至所述收集透镜a之前经过一反射镜，用于对准光路；所述待测样品的荧光信号在入射至所述收集透镜a之前经过一滤波片，用于滤除激发光。
上述的联用系统中，所述二次离子经所述离子门筛选后再经一弯曲反射场反射后由所述反射探测器探测。
本发明的联用系统中，所述光学信号采集器和SIMS信号采集器均由同一数据采集系统进行数据采集和处理。
本发明提供的超分辨共聚焦光学显微镜与二次离子质谱联用系统具有以下有益效果：
1、在一套成像平台上同时实现光学成像与SIMS成像，在获得单分子的光学信号和形貌图像的同时，可以获得单分子化学组分的等其它参量信息。
2、同时成像克服了二次成像带来的定位不准和信息变化的缺点。
3、由超分辨的光学成像引导SIMS成像和分析，由于超分辨的共聚焦光学显微镜分辨率可接近SIMs的分辨率，可以实现更高精度的靶点定位。
附图说明
图1为本发明提供的联用系统的结构示意图。
图2为使用本发明提供的联用系统对荧光标记的硅球的超分辨共聚焦显微图像（左图）和SIMS质谱成像（右图）。
图中各标记如下：1激光器a、2二向色性滤光片a、3，9反射镜、4显微物镜、5激光器b、6位相板、7二向色性滤光片b、8样品台、10滤波片、11收集透镜a、12光电探测器、13光学信号采集器、14拉出电极、15离子门、16弯曲反射场、17反射探测器、18SIMS信号采集器、19位移控制器、20离子束发生器。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不局限于以下实施例。
如图1所示，本发明提供的超分辨共聚焦光学显微镜与二次离子质谱联用系统，激光器a1输出的激光经二向色性滤光片a2滤光后经反射镜3反射后经显微物镜4汇聚，激光器b5输出的激光依次经位相板6和二向色性滤光片b7滤光后经反射镜3反射后经显微物镜4汇聚；经过显微物镜4汇聚的激光照射至样品台8上，待测样品的荧光信号又经显微物镜4汇聚后经反射镜3、二向色性滤光片a2、二向色性滤光片b7、反射镜9、滤波片10和收集透镜a11收集后入射至光电探测器12，光电探测器12输出的光电信号输入至光学信号采集器13。
离子束发生器20轰击待测样品得到样品碎片，其中包括一次离子和二次离子，，带有正电或者负电，在拉出电极14的作用下，二次离子获得飞行动能，然后经离子门15筛选后，再经过弯曲反射场16反射后由反射探测器17探测，最后反射探测器17输出的信号由SIMS信号采集器18采集。本发明提供的联用系统中，超分辨成像和SIMS探测使用同一个样品台。
本发明提供的联用系统中，激发用激光器a1经过二向色性滤光片a2、反射镜3反射入显微物镜4，经显微物镜4汇聚后，激发样品发射荧光；退激发用激光器b5，经过位相板6调整光束波前，经二向色性滤光片b7和反射镜3反射后，经显微物镜4汇聚后形成空壳型焦斑，将激发光激发的荧光斑周围荧光分子退激发，最后只有小体积的荧光分子自发辐射荧光，实现超分辨光学成像；样品台8在位移控制器19的控制下对样品进行扫描，获得不同位置的光学信号。荧光信号经显微物镜4收集后，经反射镜3和反射镜9反射后，由滤波片10滤除荧光以外的其它光，经收集透镜a11汇聚后，由光电探测器12转换为电信号；由光电探测器12获得的光电信号，经过光学信号采集器13采集后，由计算机进行重构和处理获得超分辨荧光显微图像。
样品台8在位移控制器19的控制下，实现样品的SIMS激发和探测，二次离子经过拉出电极14获得飞行动能，经过离子门15筛选，经过反射电场16反射后由反射探测器17探测，反射探测器产生的信号由SIMS信号采集器18采集后，由计算机进行重构和处理获得SIMS质谱成像。
离子束发生器20由位移控制器19控制实现激发离子束和光学焦斑的对准，然后位移控制器19控制样品台8扫描样品，实现超分辨光学成像和SIMS的同步成像。光学信号采集器13和SIMS信号采集器18由位移控制器19触发，实现同步采集。
使用上述联用系统和专门研制的共定位样品板，准确定位B32区域中的两个HeLa肿瘤细胞，实现了超分辨光学和二次离子质谱的联用成像。红色圆圈内为光学和质谱成像观测到的细胞膜绒毛的精细结构。
Claims (4)
1.一种超分辨共聚焦光学显微镜与二次离子质谱联用系统，其特征在于：
激光器a输出的激光经二向色性滤光片a滤光后汇聚至显微物镜，激光器b输出的激光依次经位相板和二向色性滤光片b滤光后汇聚至所述显微物镜；经所述显微物镜汇聚的激光照射至样品台，得到待测样品的荧光信号又经所述显微物镜汇聚后经收集透镜a收集后入射至光电探测器，所述光电探测器输出的光电信号输入至光学信号采集器；
离子束发生器轰击待测样品得到二次离子，所述二次离子经拉出电极获得动能后，再经离子门筛选后由反射探测器探测，所述反射探测器输出的信号输入至SIMS信号采集器；
所述离子束发生器和样品台均与一位移控制器相连接。
2.根据权利要求1所述的联用系统，其特征在于：所述激光器a输出激光与所述激光器b输出的激光在汇聚至所述显微物镜之前均经一反射镜。
3.根据权利要求1或2所述的联用系统，其特征在于：所述待测样品的荧光信号在入射至所述收集透镜a之前经过一反射镜和一滤波片。
4.根据权利要求1或2所述的联用系统，其特征在于：所述二次离子经所述离子门筛选后再经一弯曲反射场反射后由所述反射探测器探测。
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