CN108982456A - 基于倏逝波照明的三维活细胞超分辨显微成像方法和装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于倏逝波照明的三维活细胞超分辨显微成像方法和装置，属于光学超分辨显微成像领域，包括：以大于全反射临界角的入射光单角度入射样品，获取一系列横向超分辨重构原始图像，对所有横向超分辨原始图像进行重构，得到样品的横向超分辨图像；以大于全反射临界角的入射光在任意两个入射角度下入射照明样品，同时进行环形扫描，获取相应的两张轴向超分辨重构原始图像；对轴向超分辨重构原始图像进行减背景预处理，同时以单张轴向重构原始图像和横向超分辨图像为模板分别进行信息提取，并对提取后的图像分别进行轴向超分辨重构和三维超分辨重构，得到轴向超分辨图像和三维超分辨图像。

Description

基于倏逝波照明的三维活细胞超分辨显微成像方法和装置

技术领域

本发明涉及光学超分辨显微成像领域，具体地说，涉及一种基于倏逝波照明的三维活细胞超分辨显微成像方法和装置。

背景技术

观察和研究细胞结构及功能是生物学分支学科。细胞是组成有机体的形态和功能的基本单位，自身又是由许多部分构成的。关于结构的研究不仅要知道它是由哪些部分构成的，而且要进一步搞清每个部分的组成。相应地，关于功能不仅要知道细胞作为一个整体的功能，而且要了解各个部分在功能上的相互关系。长期以来，受到光学衍射极限的限制，传统的光学显微镜无法分辨200nm横向范围和600nm轴向范围内的物体细节信息，这严重限制了光学显微镜在生物学等领域的发展和应用。

为了解决这一问题，科学家们提出了一系列的超分辨显微成像技术打破了衍射极限，从而实现了对组织结构的纳米级别观察。作为代表性的一种技术，结构光照明显微镜使用两束光在待测样品表面相互干渉产生摩尔条纹，调制样品的空间频率，将通常不可见的高频信息移动到可观测到的低频范围内，相当于将光学传递函数的截止频率提高了两倍，实现了超分辨成像。超分辨荧光显微成像技术的发展大力推动了相关应用领域的发展，将光学显微镜推动到新的高度。

但是，对活细胞进行快速三维超分辨成像、观察精细结构的三维运动对生物学研究来说至关重要。目前三维活细胞超分辨成像仍然面临诸多问题，其中最重要的两个问题：一是如何实现三维超分辨成像，观察细胞的精细结构；二是如何在不牺牲空间分辨率的前提下，提高时间分辨率，追踪细胞的实时运动。

作为生物样品成像最快的技术之一，全内反射荧光显微镜形成的照明倏逝波呈轴向指数衰减，从而只对薄层样品进行照明，具有很高的信噪比和轴向分辨率，目前已被广泛应用于观察与细胞膜结构有关的动态过程。通过进一步改变照明光束的入射角，从而改变倏逝波的穿透深度，可以建立起照明光场与获取图像之间的对应关系，进一步通过逆问题求解能够定量重建样品的轴向超分辨分布，这被称为多角度全内反射荧光显微镜。但该方法需要获取数十张原始图像才能得到数十纳米的轴向分辨率，这在一定程度上丢失了全内反射荧光显微镜的最大优点，限制了它在活细胞实时成像中的应用。

另一方面，全内反射荧光显微镜只是提高了系统的轴向分辨率，其横向分辨率仍然受到衍射极限的限制，难以突破半波长量级，无法用于观察样品的三维精细结构。

发明内容

本发明的目的为提供一种基于倏逝波照明的三维活细胞超分辨显微成像方法，可同时提高系统的轴向分辨率和横向分辨率，并实现三维实时多色超分辨显微成像。

本发明的另一目的为提供基于倏逝波照明的三维活细胞超分辨显微成像装置，该装置可用于实现上述三维活细胞超分辨显微成像方法。

为了实现上述目的，本发明提供的基于倏逝波照明的三维活细胞超分辨显微成像方法包括：

以大于全反射临界角的入射光单角度入射样品，获取一系列横向超分辨重构原始图像，对所有横向超分辨原始图像进行重构，得到样品的横向超分辨图像；

以大于全反射临界角的入射光在任意两个入射角度下入射照明样品，同时进行环形扫描，获取相应的两张轴向超分辨重构原始图像；

对轴向超分辨重构原始图像进行减背景预处理，同时以单张轴向重构原始图像和横向超分辨图像为模板分别进行信息提取，并对提取后的图像分别进行轴向超分辨重构和三维超分辨重构，得到轴向超分辨图像和三维超分辨图像。

上述技术方案中，轴向超分辨重构原始图像可在两个大于全反射角的入射角度下获取，每个角度下的原始图像通过环形照明方位角平均得到。其中不同入射角度下产生的疏逝波的穿透深度不同，可实现不同深度信息的获取。环形照明可以对单方位角照明图像进行矫正，消除图像散斑的影响，方便进行定量分析。入射光偏振采用径向偏振、切向偏振或圆偏振。同时两张轴向重构原始图像可在任意两个大于全反射角的入射角度下获取。

具体的方案为横向超分辨重构原始图像以大于全反射临界角的入射光单角度入射样品得到。以大于全反射角入射可获取较高信噪比的图像。

另一个具体的方案为轴向超分辨图像和三维超分辨图像的重构方法包括如下步骤：

(1)根据疏逝波照明光场分布，建立照明光强与样品深度分布之间的关系；

(2)根据入射光偏振状态和入射角度确定界面处的入射光强，进而确定照明光强；

(3)将两张轴向超分辨重构原始图像对应的像素强度值相除得到样品深度与照明光强之间的关系；

(4)根据上述关系重构出每个像素的实际深度分布；

(5)用伪彩色表示每个像素的深度值，即可得到成像样品的轴向超分辨和三维超分辨结果。

另一个具体的方案为横向超分辨图像利用超分辨径向波动算法(SRRF)进行重构。

为了实现上述另一目的，本发明提供的基于倏逝波照明的三维活细胞超分辨显微成像装置包括激发光路模块、探测光路模块和处理模块；

激发光路模块包括沿光路依次设置的：

光源，产生照明光束；

1/4波片和半波片，产生特定方向的偏振光；

扫描振镜，控制光束的入射角度和方位角，实现倏逝波照明下的多角度原始图像的获取；

探测光路模块包括：

显微物镜，用于收集样品发出的荧光信号；

二向色镜，用于透射入射激光，反射样品产生的荧光；

相机，接收二向色镜反射的样品荧光并获取样品图像，同时将样品图像传输给所述处理模块；

处理模块控制扫描振镜进行单角度成像和环形多角度成像以分别获取横向超分辨重构原始图像和轴向超分辨重构原始图像，同时控制相机获取样品图像，并进行后期重构处理得到相应的超分辨结果。

本发明的扫描振镜采用反射式、透射式、单振镜或双振镜系统均可。物镜采用较大数值孔径，以获取尽可能大的空间分辨率。通过该装置可实现上述基于倏逝波照明的三维活细胞超分辨显微成像方法，并同时提高系统的轴向分辨率和横向分辨率，并实现三维实时多色超分辨显微成像。

具体的方案为扫描振镜后设置有扫描透镜，用于接收大角度下的扫描光束。

另一个具体的方案为扫描透镜的焦点处设置有偏振旋转器，在特定水平线偏振光入射条件下，根据偏振旋转器快轴方向的不同可产生径向或切向线偏振光。

另一个具体的方案为二向色镜的反射光路上设有用于滤除杂散光的滤光镜。

本发明在滤光块后设置有场镜，用于将产生的荧光信号聚焦到相机上。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明的装置基于普通的宽场光学显微成像系统，结构简单，易于操作，应用性强；本发明的方法可实现三维快速超分辨成像，特别适用于对活细胞进行三维多色超分辨成像。

附图说明

图1为本发明实施例的三维超分辨显微成像方法流程示意图；

图2为本发明实施例的横向超分辨重构原始图像获取装置示意图；

图3为本发明实施例的轴向超分辨重构原始图像获取装置示意图；

图4为本发明实施例的三维超分辨显微成像步骤示意图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，以下结合实施例及其附图对本发明作进一步说明。

实施例

参见图2和图3，本实施例的三维超分辨显微成像装置包括激发光路模块、探测光路模块和处理模块。

其中激发光路模块包括激光器1、单模保偏光纤2、1/4波片3、半波片4、扫描振镜5、透镜组、偏振旋转器7和显微物镜11。激光器1用于产生照明激光光束，产生的激光光束通过单模保偏光纤2产生单模激光光束，产生的单模激光光束由1/4波片3和半波片4控制偏振方向。通过旋转1/4波片3可使得激光光束在圆偏振光和线偏振光之间转换，旋转半波片4可改变激光光束的偏振主轴。1/4波片3和半波片4的结合可以产生圆偏振光和任意方向的线偏振光。产生的特定方向的偏振光进入扫描振镜5，扫描振镜5可采用反射式、透射式、单振镜或多振镜等结构，用于控制光束的入射角度和方位角实现倏逝波照明下的多角度原始图像的获取。扫描振镜5后放置有扫描透镜6，可接收大角度下的扫描光束。扫描透镜6的焦点处放置有偏振旋转器7，在特定水平线偏振光入射条件下，根据偏振旋转器7快轴方向的不同可产生径向或切向线偏振光。若去掉偏振旋转器7，通过1/4波片3和半波片4可控制产生圆偏振光。该三种不同偏振状态的光束均可用于成像和图像获取。通过偏振旋转器7调制的光束被第一透镜8收集变成平行光束。产生的平行光束经过第二透镜9重新聚焦到显微物镜11的入瞳面。物镜11一般采用较大数值孔径，可产生倏逝波照明激发待成像样品12发出荧光。

探测光路模块包括显微物镜11、二向色镜10、滤光块13、场镜14和成像相机15。显微物镜11用于收集样品12发出的荧光信号。二向色镜10用于透射入射激光，反射样品12产生的荧光。反射荧光通过滤光块13滤除其中的杂散光，被场镜14收集，再被相机15接收。相机15可采用商用sCMOS或EMCCD相机。

处理模块为计算机处理系统16，用于控制扫描振镜5进行单角度成像和环形多角度成像以分别获取横向超分辨重构原始图像和轴向超分辨重构原始图像。同时控制相机10获取样品图像，并进行后期重构处理得到相应的超分辨结果。

参见图2，在横向超分辨重构原始图像获取时，光束以大于全反射临界角入射，以大于全反射角入射可获取较高信噪比的图像。

参见图3，在轴向超分辨重构原始图像获取时，光束可在任意两个大于全反射角的入射角度下获取。每个角度下的原始图像均通过环形照明方位角平均得到。

参见图1和图4，本实施例的基于倏逝波照明的三维超分辨显微成像方法，工作流程如下：

1、通过扫描振镜5控制光束单角度入射，获取一系列横向超分辨重构原始图像；

2、通过扫描振镜5控制光束在任意两个大于全反射角的入射角度下环形入射，获取相同视场范围内的两张轴向超分辨重构原始图像；

3、计算机处理系统16对获取的一系列横向原始图像利用径向波动算法(SRRF)进行重构，得到横向超分辨图像；

4、对轴向重构原始图像减背景等预处理操作；

5、选取想要重构的区域并进行信息提取；

6、对提取后的而原始图像进行轴向超分辨重构和三维超分辨重构，重构方法包括但不限于如下步骤：

(1)根据疏逝波照明光场分布，建立照明光强与样品深度分布之间的关系；

(2)根据入射光偏振状态和入射角度确定界面处的入射光强，进而确定照明光强；

(3)将两张轴向超分辨重构原始图像对应的像素强度值相除得到样品深度与照明光强之间的关系；

(4)根据步骤(3)中的关系重构出每个像素的实际深度分布；

(5)用伪彩色表示每个像素的深度值，即可得到成像样品的轴向超分辨和三维超分辨结果。

以上所述仅为本发明的较佳实施举例，并不用于限制本发明，凡在本发明精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种基于倏逝波照明的三维活细胞超分辨显微成像方法，其特征在于，包括：

以大于全反射临界角的入射光单角度入射样品，获取一系列横向超分辨重构原始图像，对所有横向超分辨原始图像进行重构，得到样品的横向超分辨图像；

以大于全反射临界角的入射光在任意两个入射角度下入射照明样品，同时进行环形扫描，获取相应的两张轴向超分辨重构原始图像；

对轴向超分辨重构原始图像进行减背景预处理，同时以单张轴向重构原始图像和横向超分辨图像为模板分别进行信息提取，并对提取后的图像分别进行轴向超分辨重构和三维超分辨重构，得到轴向超分辨图像和三维超分辨图像。

2.根据权利要求1所述的三维活细胞超分辨显微成像方法，其特征在于：

所述的横向超分辨重构原始图像以大于全反射临界角的入射光单角度入射样品得到。

3.根据权利要求1所述的三维活细胞超分辨显微成像方法，其特征在于：

所述的轴向超分辨图像和三维超分辨图像的重构方法包括如下步骤：

(1)根据倏逝波照明光场分布，建立照明光强与样品深度分布之间的关系；

(2)根据入射光偏振状态和入射角度确定界面处的入射光强，进而确定照明光强；

(3)将两张轴向超分辨重构原始图像对应的像素强度值相除得到样品深度与照明光强之间的关系；

(4)根据上述关系重构出每个像素的实际深度分布；

(5)用伪彩色表示每个像素的深度值，得到成像样品的轴向超分辨和三维超分辨结果。

4.根据权利要求1所述的三维活细胞超分辨显微成像方法，其特征在于：

所述的横向超分辨图像利用超分辨径向波动算法进行重构。

5.一种基于疏逝波照明的三维活细胞超分辨显微成像装置，包括激发光路模块、探测光路模块和处理模块，其特征在于，

所述激发光路模块包括沿光路依次设置的：

光源，产生照明光束；

1/4波片和半波片，产生特定方向的偏振光；

扫描振镜，控制光束的入射角度和方位角，实现倏逝波照明下的多角度原始图像的获取；

所述探测光路模块包括：

显微物镜，用于收集样品发出的荧光信号；

二向色镜，用于透射入射激光，反射样品产生的荧光；

相机，接收所述二向色镜反射的样品荧光并获取样品图像，同时将样品图像传输给所述处理模块；

所述处理模块控制所述扫描振镜进行单角度成像和环形多角度成像以分别获取横向超分辨重构原始图像和轴向超分辨重构原始图像，同时控制相机获取样品图像，并进行后期重构处理得到相应的超分辨结果。

6.根据权利要求5所述的三维活细胞超分辨显微成像装置，其特征在于：

所述的扫描振镜后设置有扫描透镜，用于接收大角度下的扫描光束。

7.根据权利要求5所述的三维活细胞超分辨显微成像装置，其特征在于：

所述的扫描透镜的焦点处设置有偏振旋转器，在特定水平线偏振光入射条件下，根据偏振旋转器快轴方向的不同可产生径向或切向线偏振光。

8.根据权利要求5所述的三维活细胞超分辨显微成像装置，其特征在于：

所述的二向色镜的反射光路上设有用于滤除杂散光的滤光镜。