CN111399204B - 一种基于后瞳面成像的环状扫描成像系统校正方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供的一种基于后瞳面成像的环状扫描成像系统校正方法，包括以下步骤：通过环状扫描成像系统获取不同方位角和不同入射角的后瞳面图像并统计其强度，生成相应光强曲线；若光强曲线与理论变化趋势吻合，提取每个方位角下的图像强度最大值，若不吻合，调整系统参数重新获取后瞳面图像；最后比较各个方位角下的图像强度最大值对应的控制电压，计算其误差范围是否满足需求，若满足，校正结束；若不满足，调整环状扫描方式，重新获取后瞳面图像并进行分析，直到误差范围满足需求，则校正结束。本发明可实现激发光在不同方位角下以相同入射角照明样品，解决普通环状扫描成像系统中不同方位角下照明深度不一致的问题，提升了系统的成像能力。

Description

一种基于后瞳面成像的环状扫描成像系统校正方法
技术领域
本发明涉及光学显微成像领域，具体地说，涉及一种基于后瞳面成像的环状扫描成像系统校正方法。
背景技术
常规的宽场荧光显微成像技术中，照明光都是沿着主光轴正入射经过各个光学元件，最终聚焦到物镜后瞳面中央，然后变成平行光垂直入射到样品表面。这种照明方式会激发整个照明深度内的荧光分子，因此一个曝光时间内获取的二维图像是样品三维荧光分布的强度信息叠加。但是这些信息中只有焦面部分是研究者想要获取的，其他的离焦部分都贡献了背景信号，导致图像背景太高，对比度太差，细节信息太模糊。
为了解决这个问题，研究者提出了斜入射照明方法。与宽场显微镜中入射光沿主光轴聚焦到物镜后瞳面中央不同，斜入射显微镜中照明光平行于主光轴入射聚焦到后瞳面边缘位置，这样从物镜出来的平行光不再是垂直照明整个三维深度范围内的荧光分子，而是以一定入射角度斜照明，有选择性的激发部分荧光分子。相比宽场照明，斜入射激发的荧光分子更少，因此图像信背比和对比度可以得到很好的提升。根据入射光远离后瞳面圆心的距离，即入射角度大小，斜入射显微镜又可以分为光切片显微镜和全内反射荧光显微镜。其中光切片显微镜的照明光束聚焦在物镜后瞳面全内反射环以内，即入射角小于全反射角。而全内反射荧光显微镜则是照明光束聚焦在物镜后瞳面全内反射环以外，最大数值孔径环以内，即入射角大于全反射角。两种照明方案的效果区别是，前者的照明深度约微米级别，成像深度较深，而后者的照明深度只有倏逝场范围，一般在百纳米量级，成像深度更浅，因此很适用于对细胞膜附近的亚细胞结构和动态过程进行高信背比和高对比度成像。
但是常规的斜入射显微镜，光束都是聚焦到物镜后瞳面的一个点上，因此照明是沿着单个方位角入射。这种单方位角照明方式会产生严重的光强分布不均匀、不对称、有阴影等问题。再加上由于一般使用具有强相干性的激光照明，入射激光在各个光学元件上的反射和折射会产生干涉条纹。这些都会影响图像的定量分析。解决这个问题的一种通用方案是使用环状照明，即入射光束在物镜后瞳面上进行环状扫描(或多点照明)，因此该环状扫描成像方案下获取的一幅二维图像相当于整个曝光时间内不同方位角的荧光信号的平均。虽然环状扫描可以解决单方位角斜入射照明中的图像强度分布不均匀问题，但一套理想的环状扫描系统很难实现。因为人为光路调节时极难保证光束在不同方位角下均具有相同的入射角，而不同入射角入射会带来照明深度的不同，导致最终的图像难以精确解释。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于后瞳面成像的环状扫描成像系统校正方法，可大大提高环状扫描成像系统的实用性。
为了实现上述目的，本发明提供的一种基于后瞳面成像的环状扫描成像系统校正方法，该方法包括以下步骤：
1)环状扫描成像系统初始化之后，改变入射光的方位角和入射角，获取一系列不同方位角和不同入射角下的后瞳面图像；
2)统计每一张步骤1)获取的后瞳面图像的强度，利用同一方位角下的变入射角图像生成相应的光强曲线；
3)分析每个方位角下的光强曲线是否与理论变化趋势吻合，若吻合，提取每个方位角下的图像强度最大值，若不吻合，调整环状扫描成像系统参数重新获取后瞳面图像；
4)比较各个方位角下的图像强度最大值对应的控制电压，计算其误差范围是否满足需求，若满足，校正结束；若不满足，利用得到的不同方位角下的电压值进行椭圆拟合，拟合后的椭圆参数作为反馈输入系统，调整环状扫描方式，重新获取后瞳面图像并重复步骤2)到步骤4)，直到最终误差范围满足需求，则校正结束。
进一步地，所述步骤1)中，方位角的变化范围是360°，步距需要根据实际情况进行调节，步距缩小，拟合精度提高，但数据获取时间延长；步距增大，数据获取时间缩短，但拟合精度下降。
进一步地，扫描步距可设置在20°-40°之间。
进一步地，入射角的范围和步距需要根据实际情况进行调节，与方位角变化类似，入射角步距缩小则精度提高时间延长，步距增大则时间缩短精度下降。
进一步地，所述步骤2)中，生成的光强曲线反映入射角与图像强度的变化关系。
进一步地，所述步骤3)中，光强曲线理论变化趋势指的是在入射角小于全反射临界角时，图像光强应随着入射角的增大而逐渐增大，并在全反射临界角处达到最大值(突变点)；当入射角大于全反射临界角时，图像光强则随入射角的增大呈指数式下降。
进一步地，所述步骤4)中，误差范围指的是不同方位角下得到的全反射临界角对应的控制电压之间的差别。
一种基于后瞳面成像的环状扫描成像系统，该系统分为激发光路和探测光路两部分：
激发光路：激发光路包括依次放置的激光器、扩束器、光束控制器、4f透镜组、汇聚透镜、二向色镜、显微物镜、和待测样品；
所述激光器用于发出激光；所述扩束器用于准直和扩束；所述光束控制器用于改变激发光的入射角和方位角；所述4f透镜组包括第一透镜和第二透镜，用于转移像面；所述汇聚透镜用于将平行入射光汇聚到物镜后瞳面处；所述二向色镜用于透射激光、反射荧光；所述显微物镜用于产生大角度入射光；
探测光路：样品发出的荧光信号依次被相同的激发物镜收集，被二向色镜反射，被管镜聚焦到样品面成像相机上，在管镜后加入一个反射镜，反射光再经过第三透镜进入后瞳面成像相机上，用于对后瞳面进行成像。
进一步地，该系统还包括计算机，用于控制光束控制器和两个成像相机。
进一步地，所述激发光路中的光束控制器为能实现对光束入射角和方位角的调控的器件，可以是二维扫描振镜、空间光调制器、数字微镜阵列、声光调制器和电光调制器等；所述显微物镜的孔径数值一般大于1.4，数值孔径越大，激发光的可变入射角范围也越大，越容易发生全反射现象；所述探测光路中的两个相机分别与样品面和物镜后瞳面共轭，从而实现对样品面和后瞳面的成像。
本发明的有益效果：本发明提出了一套基于后瞳面成像的环状扫描成像系统矫正方法，可实现激发光在不同方位角下以相同入射角照明样品，从而解决了普通环状扫描成像系统中不同方位角下照明深度不一致的问题，大大提升了该系统的成像能力，将在图像定量分析等对数据获取条件要求较严苛的领域产生更广泛的应用。
附图说明
图1为本发明实施例的基于后瞳面成像的环状扫描成像系统校正方法流程图；
图2为本发明实施例的一种环状扫描成像系统示意图；
图3为本发明实施例的成像系统后瞳面图像；
图4为本发明实施例的后瞳面图(a)和样品面图(b)光强曲线变化；
图5为本发明实施例的后瞳面方法校正前(a)后(b)光强曲线变化。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，以下结合实施例及其附图对本发明作进一步说明。
参见图1，本实施例的基于后瞳面成像的环状扫描成像系统校正方法，具体过程如下：
1)环状扫描成像系统初始化之后，改变入射光的方位角和入射角，获取一系列不同方位角和不同入射角下的后瞳面图像；
2)统计每一张步骤1)获取的后瞳面图像的强度，利用同一方位角下的变入射角图像生成相应的光强曲线；
3)分析每个方位角下的光强曲线是否与理论变化趋势吻合，若吻合，提取每个方位角下的图像强度最大值，若不吻合，调整环状扫描成像系统参数重新获取后瞳面图像；
4)比较各个方位角下的图像强度最大值对应的控制电压，计算其误差范围是否满足需求，若满足，校正结束；若不满足，利用得到的不同方位角下的电压值进行椭圆拟合，拟合后的椭圆参数作为反馈输入系统，调整环状扫描方式，重新获取后瞳面图像并重复步骤2)到步骤4)，直到最终误差范围满足需求，则校正结束。
在步骤1)中，方位角的变化范围是360°，步距需要根据实际情况进行调节，步距缩小，拟合精度会略有提高，但数据获取时间会延长；步距增大，数据获取时间缩短，但拟合精度略有下降。作为优选的，扫描步距可设置在20°到40°之间。另外，入射角的范围和步距也需要根据实际实验情况进行调节。与方位角变化类似，入射角步距缩小精度提高时间延长，步距增大则时间缩短精度下降。典型的一张后瞳面图像如图3所示。
在步骤2)中，统计每一张图像的归一化总强度，最终生成的曲线应该反映入射角与强度的变化关系，如图4(a)和图4(b)所示。
在步骤3)中，光强曲线理论变化趋势指的是在小于全反射临界角时，图像光强应随着入射角的增大而逐渐增大，并在全反射临界角处达到最大值(突变点)。当大于全反射临界角时，图像光强则随入射角的增大呈指数式下降。一个符合该变化趋势的例子如图4(a)所示，该曲线是在固定方位角下获取一系列不同入射角的后瞳面图像统计得到的。而图4(b)中的曲线虽然整体仍保持有类似理论变化趋势，但在个别位置处不符合趋势，尤其是光强最强处不再是一个突变点，而是一段波动值，导致难以判断全反射临界角位置。这是因为该曲线是对样品面成像获取的，样品分布的均匀性、厚度和极性等也会影响强度变化。
在步骤4)中，误差范围指的是不同方位角下得到的全反射临界角对应的控制电压之间的差别。如图5(a)所示，是校正前的光强分布曲线图，可以看到不同方位角下的临界角具有较大差异。图5(b)是使用本方法矫正之后获取的光强分布曲线，此时所有方位角下的全反射临界角都相同，即表示在环状扫描过程中，不同方位角对应的入射角都相同，矫正成功。
参见图2，为了实现上述方法，本发明提供了一套环状扫描成像系统，该系统可以分为激发光路和探测光路两部分：
激发光路：激发光路包括依次放置的激光器1，用于发出激光；扩束器2，用于准直和扩束；光束控制器3，用于改变激发光的入射角和方位角；4f透镜组，包括第一透镜4和第二透镜5，用于转移像面；汇聚透镜6，用于将平行入射光汇聚到物镜后瞳面处；二向色镜7，用于透射激光，反射荧光；显微物镜8，用于产生大角度入射光；以及待测样品9。
探测光路：样品发出的荧光信号依次被相同的激发物镜收集，被二向色镜7反射，被管镜10聚焦到样品面成像相机上12。若要对后瞳面进行成像，则需要在管镜10后加入一个反射镜11，反射光再经过第三透镜13进入后瞳面成像相机14上。
另外，该系统还包括计算机，用于控制光束控制器和两个成像相机。
其中激发光路中的光束控制器只要是能实现对光束入射角和方位角的调控的器件均可，典型例子如二维扫描振镜、空间光调制器、数字微镜阵列、声光调制器和电光调制器。
显微物镜一般应选择具有较大数值孔径的，一般大于1.4。数值孔径越大，激发光的可变入射角范围也越大，越容易发生全反射现象。
探测光路中的两个相机本质上是分别与样品面和物镜后瞳面共轭，从而实现对样品面和后瞳面的成像。
以上所述仅为本发明的较佳实施举例，并不用于限制本发明，凡在本发明精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种基于后瞳面成像的环状扫描成像系统校正方法，其特征在于，该方法基于后瞳面成像的环状扫描成像系统实现，所述系统分为激发光路和探测光路两部分：
激发光路：激发光路包括依次放置的激光器(1)、扩束器(2)、光束控制器(3)、4f透镜组、汇聚透镜(6)、二向色镜(7)、显微物镜(8)、和待测样品(9)；
所述激光器(1)用于发出激光；所述扩束器(2)用于准直和扩束；所述光束控制器(3)用于改变激发光的入射角和方位角；所述4f透镜组包括第一透镜(4)和第二透镜(5)，用于转移像面；所述汇聚透镜(6)用于将平行入射光汇聚到物镜后瞳面处；所述二向色镜(7)用于透射激光、反射荧光；所述显微物镜(8)用于产生大角度入射光；
探测光路：样品发出的荧光信号依次被相同的激发物镜收集，被二向色镜(7)反射，被管镜(10)聚焦到样品面成像相机(12)上；在管镜(10)后加入一个反射镜(11)，反射光再经过第三透镜(13)进入后瞳面成像相机(14)上，用于对后瞳面进行成像；
校正方法包括以下步骤：
1)环状扫描成像系统初始化之后，改变入射光的方位角和入射角，获取一系列不同方位角和不同入射角下的后瞳面图像；
2)统计每一张步骤1)获取的后瞳面图像的强度，利用同一方位角下的变入射角图像生成相应的光强曲线；
3)分析每个方位角下的光强曲线是否与理论变化趋势吻合，若吻合，提取每个方位角下的图像强度最大值，若不吻合，调整环状扫描成像系统参数重新获取后瞳面图像；
4)比较各个方位角下的图像强度最大值对应的控制电压，计算其误差范围是否满足需求，若满足，校正结束；若不满足，利用得到的不同方位角下的电压值进行椭圆拟合，拟合后的椭圆参数作为反馈输入系统，调整环状扫描方式，重新获取后瞳面图像并重复步骤2)到步骤4)，直到最终误差范围满足需求，则校正结束。
2.根据权利要求1所述的一种基于后瞳面成像的环状扫描成像系统校正方法，其特征在于，所述步骤1)中，方位角的变化范围是360°，步距需要根据实际情况进行调节，步距缩小，拟合精度提高，但数据获取时间延长；步距增大，数据获取时间缩短，但拟合精度下降。
3.根据权利要求2所述的一种基于后瞳面成像的环状扫描成像系统校正方法，其特征在于，扫描步距可设置在20°-40°之间。
4.根据权利要求2所述的一种基于后瞳面成像的环状扫描成像系统校正方法，其特征在于，入射角的范围和步距需要根据实际情况进行调节，与方位角变化类似，入射角步距缩小则精度提高时间延长，步距增大则时间缩短精度下降。
5.根据权利要求1所述的一种基于后瞳面成像的环状扫描成像系统校正方法，其特征在于，所述步骤2)中，生成的光强曲线反映入射角与图像强度的变化关系。
6.根据权利要求1所述的一种基于后瞳面成像的环状扫描成像系统校正方法，其特征在于，所述步骤3)中，光强曲线理论变化趋势指的是在入射角小于全反射临界角时，图像光强应随着入射角的增大而逐渐增大，并在全反射临界角处达到最大值，即突变点；当入射角大于全反射临界角时，图像光强则随入射角的增大呈指数式下降。
7.根据权利要求1所述的一种基于后瞳面成像的环状扫描成像系统校正方法，其特征在于，所述步骤4)中，误差范围指的是不同方位角下得到的全反射临界角对应的控制电压之间的差别。
8.根据权利要求1所述的一种基于后瞳面成像的环状扫描成像系统校正方法，其特征在于，所述系统还包括计算机，用于控制光束控制器和两个成像相机。
9.根据权利要求1所述的一种基于后瞳面成像的环状扫描成像系统校正方法，其特征在于，所述激发光路中的光束控制器为能实现对光束入射角和方位角的调控的器件，包括二维扫描振镜、空间光调制器、数字微镜阵列、声光调制器和电光调制器；所述显微物镜的孔径数值大于1.4，数值孔径越大，激发光的可变入射角范围也越大，越容易发生全反射现象；所述探测光路中的两个相机分别与样品面和物镜后瞳面共轭，从而实现对样品面和后瞳面的成像。
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