CN111239993B - 基于极性散射的超分辨全内反射显微成像装置及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于极性散射的超分辨全内反射显微成像装置及方法，该装置包括偏振照明模块、光束扫描模块和检偏探测模块，偏振照明模块、光束扫描模块和检偏探测模块沿光线传播方向依次布置；偏振照明模块沿光线传播方向依次设有激光器、第一偏振片以及四分之一玻片；光束扫描模块沿光线传播方向依次设有二维扫描振镜、扫描透镜、第一管镜、圆锥反射镜以及圆锥透镜；检偏探测模块沿光线传播方向依次设有物镜、第二偏振片、第二管镜以及相机。该装置以及方法不需要荧光染色即可实现超分辨成像，可以更加真实观测样品动态，无类似荧光成像的漂白特性，可以长时间成像，无需标记即可超分辨，根据不同阶数m可得到m倍分辨率提升。

Description

基于极性散射的超分辨全内反射显微成像装置及方法

技术领域

本发明涉及显微成像技术领域，更具体的说是涉及一种基于极性散射的超分辨全内反射显微成像装置及方法。

背景技术

目前，在常规超分辨显微镜中，通常需要荧光标记，传统的荧光超分辨显微技术是利用荧光颗粒的非线性效应而将距离很近的结构分辨开来，达到超分辨的效果。基于荧光标记样品的超分辨成像方法对荧光颗粒和成像样品都有着较为严格的要求，普适性不强，标记样本由于其光漂白特性无法长时间成像，且易引起生物体排异反应，影响生物特性运动影响理论研究。

相比而言，非荧光标记的超分辨显微方法在活体成像、多类样品成像和快速成像等方面具有天然的优势。但是，该方法需要克服光学中衍射极限的根本性物理瓶颈，故发展非常缓慢，且现有的非荧光标记超分辨显微技术实时性差、视场狭窄，并不能很好的解决荧光超分辨显微技术普适性差、成像时间短等问题。

因此，如何提供一种无需荧光标记即可实现超分辨成像的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种基于极性散射的超分辨全内反射显微成像装置及方法，该装置以及方法不需要荧光染色即可实现超分辨成像，可以更加真实的观测样品动态，且成像时间更长。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一方面，本发明提供了一种基于极性散射的超分辨全内反射显微成像装置，该装置包括偏振照明模块、光束扫描模块和检偏探测模块，所述偏振照明模块、光束扫描模块和检偏探测模块沿光线传播方向依次布置；

所述偏振照明模块沿光线传播方向依次设有激光器、第一偏振片以及四分之一玻片；

所述光束扫描模块沿光线传播方向依次设有二维扫描振镜、扫描透镜、第一管镜、圆锥反射镜以及圆锥透镜，所述扫描透镜的工作面置于所述第一管镜的前焦面位置，经所述圆锥反射镜反射的光线与所述圆锥透镜的入射面垂直；

所述检偏探测模块沿光线传播方向依次设有物镜、第二偏振片、第二管镜以及相机。

进一步地，所述二维扫描振镜的偏转角度范围由扫描振镜的偏摆电压决定，最大偏转角度范围为-12°～12°。

进一步地，所述圆锥反射镜为中空环形，所述圆锥反射镜的中心与光轴重合。

另一方面，本发明还提供了一种基于极性散射的超分辨全内反射显微成像方法，该方法包括：

步骤1：激光器发出平行激光光束，第一偏振片和四分之一玻片将所述平行激光束处理为圆偏振光束，所述圆偏振光束经二维扫描振镜反射，并通过扫描透镜聚焦至第一管镜的前焦面处，所述第一管镜发出平行光入射到圆锥反射镜上，经所述圆锥反射镜反射后的平行光束进入圆锥透镜，并在圆锥透镜与样品交界面处产生倏逝场；

步骤2：样品经过倏逝场照明后所产生的散射光通过物镜、第二偏振片和第二管镜后被相机接收；

步骤3：控制二维扫描振镜，对样品进行360°圆周扫描，获得不同照明方位角下的待测样品散射光强图像集；

步骤4：对步骤3所得到的N张不同照明方位角下的待测样品散射光强分布图像的每个相同位置像素点进行m阶自相关量的计算，得到1张分辨率提升的超分辨图像；

步骤5：对步骤4得到的超分辨图像进行迭代去卷积运算，然后取

次方消除非线性效应，得到分辨率提升m倍的图像，完成超分辨。

进一步地，光束射入圆锥透镜后与光学系统主光轴的夹角大于全内反射临界角。

进一步地，所述全内反射临界角的计算公式为：

θ_c＝arcsin(n)

式中，n为圆锥透镜折射率，θ_c为全内反射临界角。

进一步地，所述步骤3具体包括：

步骤301：控制二维扫描振镜偏转角度(通过二维扫描振镜控制程序的编写，使得二维扫描振镜偏转角度能控制照明角度)，使圆偏振态照明光束在指定半径的圆周上移动；

步骤302：每移动一次，相机拍摄一次图像，每次移动360°/N；

步骤303：扫描一圈后得到待测样品散射光强图像集，即获得三维数据集{I_i(x,y),i＝1,2,3,…,N；x＝1,2,3,…,P_x；y＝1,2,3,…,P_y,}，其中x,y为图像像素的行号和列号，P_x为图像每行的总像素数，P_y为图像每列的总像素数。

进一步地，所述步骤4还包括：对得到的N张不同照明方位角下的待测样品散射光强分布图像进行m阶自相关量计算之前，进行反卷积去噪预处理。

进一步地，所述步骤4中，对所得到的N张待测样品散射光强分布图像的每个相同位置像素点进行m阶自相关量的计算时，计算公式如下：

其中，x,y代表像素位置，I_i代表图像采集模块在不同照明方位角下所获取的图像，N为一次360°圆周扫描所获取的图像数量，m代表计算阶数，m为不大于4的正整数。

进一步地，所述步骤5中，对分辨率提升的超分辨图像C_m进行去卷积运算，计算公式为：

式中，h为系统点扩散函数，y为去卷积运算后的图像，第一次迭代时，y¹＝C_m，FFT与iFFT分别为快速傅里叶变换和快速逆傅里叶变换，j为迭代次数，j的最大值为100。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种基于极性散射的超分辨全内反射显微成像装置及方法，该装置以及方法不需要荧光染色即可实现超分辨成像，可以更加真实的观测样品动态，无类似荧光成像的漂白特性，可以长时间成像，无需标记即可超分辨，根据不同阶数m可得到m倍分辨率提升。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明提供的一种基于极性散射的超分辨全内反射显微成像装置的结构示意图；

图2附图为本发明提供的一种基于极性散射的超分辨全内反射显微成像方法的流程示意图。

图中：1、激光器，2、第一偏振片，3、四分之一玻片，4、二维扫描振镜，5、扫描透镜，6、第一管镜，7、圆锥反射镜，8、圆锥透镜，9、样品，10、物镜，11、第二偏振片，12、第二管镜，13、相机。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一方面，参见附图1，本发明实施例公开了一种基于极性散射的超分辨全内反射显微成像装置，该装置包括偏振照明模块、光束扫描模块和检偏探测模块，偏振照明模块、光束扫描模块和检偏探测模块沿光线传播方向依次布置；

偏振照明模块沿光线传播方向依次设有激光器1、第一偏振片2以及四分之一玻片3；

光束扫描模块沿光线传播方向依次设有二维扫描振镜4、扫描透镜5、第一管镜6、圆锥反射镜7以及圆锥透镜8，扫描透镜5的工作面置于第一管镜6的前焦面位置，经圆锥反射镜7反射的光线与圆锥透镜8的入射面垂直；

检偏探测模块沿光线传播方向依次设有物镜10、第二偏振片11、第二管镜12以及相机13。

在一个具体的实施例中，二维扫描振镜4的偏转角度范围为-12°～12°。

在一个具体的实施例中，圆锥反射镜7为中空环形，圆锥反射镜7的中心与光轴重合。

另一方面，参见附图2，本发明还提供了一种基于极性散射的超分辨全内反射显微成像方法，该方法包括：

S1：基于极性散射的超分辨全内反射显微成像装置发出平行激光束并经偏振照明模块和光束扫描模块处理后产生倏逝场。

具体过程为：激光器1所发出的平行激光光束，经过第一偏振片2和四分之一玻片3之后形成圆偏振光束，光束经过二维扫描振镜4反射，通过扫描透镜5聚焦至第一管镜6的前焦面处，第一管镜6发出平行光入射到圆锥反射镜7上，反射出大角度平行光束进入圆锥透镜8并在其与样品9交界面出产生倏逝场；

S2：样品经过倏逝场照明后所产生的散射光被检偏探测模块进一步处理和接收。

具体过程为：通过物镜10、第二偏振片11和第二管镜12后被相机13接收；

S3：控制二维扫描振镜4，实现对样品的360°圆周扫描，获得不同照明方位角下的待测样品散射光强图像集。具体过程为：控制二维扫描振镜偏转角度，使照明光束在指定半径的圆周上移动，每移动一次，相机13拍摄一次图像，每次移动360°/N，扫描一圈后得到N张图像，可以表示为{I_i(x,y),i＝1,2,3,…,N；x＝1,2,3,…,P_x；y＝1,2,3,…,P_y,}，其中x,y为图像像素的行号和列号，P_x为图像每行的总像素数，P_y为图像每列的总像素数；

S4：得到的N张不同照明方位角下的待测样品散射光强分布图像的每个相同位置像素点进行m阶自相关量的计算，得到分辨率提升的超分辨图像C_m，计算公式为：

其中，x,y代表像素位置，I_i代表图像采集模块6在不同照明方位角下所获取的图像，N为一次360°圆周扫描所获取的图像数量，m代表计算阶数，m为不大于4的正整数；

S5：对分辨率提升的超分辨图像C_m进行去卷积运算，计算公式为：

式中，h为系统点扩散函数，y为去卷积运算后的图像，第一次迭代时，y¹＝C_m，FFT与iFFT分别为快速傅里叶变换和快速逆傅里叶变换，j为迭代次数，j的最大值为100。得到非线性下待测样品信息，然后取

次方消除非线性效应得到分辨率提升的图像，完成超分辨。

在一个具体的实施例中，光束射入圆锥透镜后与光学系统主光轴的夹角大于全内反射临界角。

在一个具体的实施例中，全内反射临界角的计算公式为：

θ_c＝arcsin(n)

式中，n为圆锥透镜折射率，θ_c为全内反射临界角。

在一个具体的实施例中，步骤S4还包括：对得到的N张不同照明方位角下的待测样品散射光强分布图像进行m阶自相关量计算之前，进行反卷积去噪预处理。

综上所述，本发明公开的基于极性散射的超分辨全内反射显微成像装置及方法，与现有技术相比，具有如下优点：

1、对观测生命体除无光照外，例如染色等干预，不需要荧光染色即可实现超分辨成像，可以更加真实观测样品动态。

2、无类似荧光成像的漂白特性，可以长时间成像。

3、无需标记即可超分辨，根据不同阶数m可得到m倍分辨率提升。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (6)

1.一种基于极性散射的超分辨全内反射显微成像方法，其特征在于，包括：

步骤1：激光器发出平行激光光束，第一偏振片和四分之一玻片将所述平行激光束处理为圆偏振光束，所述圆偏振光束经二维扫描振镜反射，并通过扫描透镜聚焦至第一管镜的前焦面处，所述第一管镜发出平行光入射到圆锥反射镜上，经所述圆锥反射镜反射后的平行光束进入圆锥透镜，并在圆锥透镜与样品交界面处产生倏逝场；

步骤2：样品经过倏逝场照明后所产生的散射光通过物镜、第二偏振片和第二管镜后被相机接收；

步骤3：控制二维扫描振镜，对样品进行360°圆周扫描，获得不同照明方位角下的待测样品散射光强图像集；

步骤4：对步骤3所得到的N张不同照明方位角下的待测样品散射光强分布图像的每个相同位置像素点进行m阶自相关量的计算，得到1张分辨率提升的超分辨图像；

步骤5：对步骤4得到的超分辨图像进行迭代去卷积运算，然后取

次方消除非线性效应，得到分辨率提升m倍的图像，完成超分辨；

所述步骤4中，对N张不同照明方位角下的待测样品散射光强分布图像的每个相同位置像素点进行m阶自相关量的计算，计算公式如下：

其中，x,y代表像素位置，I_i代表图像采集模块在不同照明方位角下所获取的图像，N为一次360°圆周扫描所获取的图像数量，m代表计算阶数，m为不大于4的正整数。

2.根据权利要求1所述一种基于极性散射的超分辨全内反射显微成像方法，其特征在于，光束射入圆锥透镜后与光学系统主光轴的夹角大于全内反射临界角。

3.根据权利要求2所述一种基于极性散射的超分辨全内反射显微成像方法，其特征在于，所述全内反射临界角的计算公式为：

θ_c＝arcsin(n)

式中，n为圆锥透镜折射率，θ_c为全内反射临界角。

4.根据权利要求3所述一种基于极性散射的超分辨全内反射显微成像方法，其特征在于，所述步骤3具体包括：

步骤301：控制二维扫描振镜偏转角度，使照明光束在指定半径的圆周上移动；

步骤302：每移动一次，相机拍摄一次图像，每次移动360°/N；

步骤303：扫描一圈后得到待测样品散射光强图像集，即获得三维数据集{I_i(x,y),i＝1,2,3,…,N；x＝1,2,3,…,P_x；y＝1,2,3,…,P_y,}，其中x,y为图像像素的行号和列号，P_x为图像每行的总像素数，P_y为图像每列的总像素数。

5.根据权利要求1所述一种基于极性散射的超分辨全内反射显微成像方法，其特征在于，所述步骤4还包括：对得到的N张不同照明方位角下的待测样品散射光强分布图像进行m阶自相关量计算之前，进行反卷积去噪预处理。

6.根据权利要求1所述一种基于极性散射的超分辨全内反射显微成像方法，其特征在于，所述步骤5中，对分辨率提升的超分辨图像C_m进行去卷积运算，计算公式为：

式中，h为系统点扩散函数，y为去卷积运算后的图像，第一次迭代时，y¹＝C_m，FFT与iFFT分别为快速傅里叶变换和快速逆傅里叶变换，j为迭代次数，j的最大值为100。

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