CN101915754A - 一种双路频分复用荧光共焦显微成像系统及实现方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种双路频分复用荧光共焦显微成像系统，包括双路频分复用荧光共焦显微镜和信号采集处理系统，双路频分复用荧光共焦显微镜采集的信号先经采集信号处理系统中电压放大电路，后经数据采集卡进行信号放大、模数转换，最后输入电脑处理得到信息。此共焦显微成像系统具有高的空间分辨率和时间分辨率，并且实现双点荧光信号的同时探测。尤其在生物医药学方面有诸多应用，如可对活体细胞进行实时观测，获取活细胞内的信息，并对所获得的信息进行定量分析，因此具有便捷和实用的应用特点。

Description

一种双路频分复用荧光共焦显微成像系统及实现方法

技术领域

本发明涉及一种成像技术，特别涉及一种双路频分复用荧光共焦显微成像系统及实现方法。

背景技术

Marvin Minsky于1957年首次提出了共焦成像的概念，希望克服传统荧光显微镜的一些局限性。共焦显微镜采用点光源照明，并用探测器之前的与光源成共轭关系的孔径来滤去焦外信号——“共焦”一词也正基于此。随后，各类共焦显微镜层出不穷，如1970年的第一台单光束的共聚焦激光扫描显微镜，1990年的双光子激光扫描显微镜等。过去十几年间又相继涌现出了三维数字共焦拉曼显微镜、光纤耦合多路复用共焦显微镜以及使用光子晶体光纤产生的超白光作激励光源的彩色共焦显微镜等新型共焦显微镜。这些显微镜在继承和发展共焦显微成像技术的同时，提高了共焦显微成像的性能，如横向和纵向分辨率，扫描探测速度等性质。继波分复用荧光共焦成像概念被提出以后，2006年由美国宾夕法尼亚州州立大学电子工程系Shizhuo(Stuart)Yin教授课题组提出了多点并行探测的频分复用荧光共焦显微成像的概念。也就是利用频分复用技术和荧光共焦技术的结合实现多点并行快速多通道实时细胞探测。

发明内容

本发明是针对现有传统的共焦显微镜时间分辨率低，扫描速度慢的问题，提出了一种双路频分复用荧光共焦显微成像系统及实现方法，此共焦显微成像系统具有高的空间分辨率和时间分辨率，并且实现双点荧光信号的同时探测。

本发明的技术方案为：一种双路频分复用荧光共焦显微成像系统，包括双路频分复用荧光共焦显微镜和信号采集处理系统，双路频分复用荧光共焦显微镜采集的信号先经采集信号处理系统中电压放大电路，后经数据采集卡进行信号放大、模数转换，最后输入电脑处理得到信息。

所述双路频分复用荧光共焦显微镜包括显微物镜、三个分光棱镜、一个二向色镜组、光电倍增管、成像透镜、CMOS摄像机、两个反射镜、两个斩波器，激光光束首先通过第一反射镜和第一分光棱镜被分成强度相同的两束，送入两个调制频率不同的斩波器分别进行调制，然后再通过第二反射镜和第二分光棱镜(8)将两束光合成一束，将合成光束通过第三分光棱镜，得到两束激发光照射到位于显微物镜焦平面上的生物样品上，生物样品产生两束荧光随后反向通过显微物镜聚光，再次通过二向色镜组，进入第三分光棱镜，分为强度相同的两束，其中一束通过消色差成像透镜，聚焦后进入位于透镜的焦平面位置上的CMOS摄像机，另一束则进入光电倍增管。

一种双路频分复用荧光共焦显微成像实现方法，包括双路频分复用荧光共焦显微成像系统，方法具体包括如下步骤：

1)将准直半导体激光器发出的紫色405nm激光光束通过扩束镜扩束形成直径为10mm的平行光束，再通过第一分光棱镜，把光束分为两束等强度光束，其中一束为透射光，另外一束经过第一反射镜反射，调节第一反射镜的位置，使反射光与透射光束平行；

2)在这两束光传播过程中，引入双通道光斩波器，每个通道分别用不同的斩波频率调制斩波，然后继续将其中一束使用第二反射镜将光束转折90°传播，两束光从两个垂直方向同时通过第二分光棱镜合光得到重合的一束激光；

3)从第二分光棱镜中出射的一束光进入二向色镜组中，二向色镜组由二向色镜、荧光滤色片和激发光滤色片组成，能分别使激光器发出的405nm激光和荧光，单方向从二相色镜出射，将被调频的双路激发激光通过40倍的无限远显微物镜聚焦后照射在样品上，产生双点激发荧光信号，将生物样品固定在三维调节架的平台上，通过调整三维调节架调整样品与显微物镜的距离，使样品恰好处于光焦点所在位置并且保持显微物镜与样品的垂直关系；

4)从样品中发出的双点荧光信号具有同各自的激发激光束相同的频率，再通过二向色镜组将发射回来的激发激光过滤后，出射的荧光信号进入第三分光棱镜，其中一束荧光耦合入消色差成像透镜后进入位于透镜焦点处的彩色CMOS摄像头；另一束荧光进入光电倍增管，然后接入电压放大电路，通过数据采集卡将采得的信号送入计算机中进行采集和处理；

5)信号处理的步骤是首先对采集信号进行傅立叶变换，得到频谱信息，然后进行选频滤波，根据调制信号频率将两束荧光信号的频谱信息挑选出来，然后再进行傅立叶逆变换得到解调的双路荧光随时间变化信息。

所述步骤2)中两个斩波通道分别设定一定的载波频率值，每个频率值均应满足奈奎斯特抽样定理，不得高于采样频率的一半，同时，两个信号的载波频率及它们的差必须要大于或等于最高信号频率的两倍，即载波频率ω₁和ω₂需要满足：ω₁-ω₂≥2ω_H，其中ω_H是最高荧光信号变化频率，以确保两路信号不发生相互串扰。

本发明的有益效果在于：本发明一种双路频分复用荧光共焦显微成像系统及实现方法，具有横向分辨率、纵向分辨率、时间分辨率高的特点，并且实现了双点同时探测。尤其在生物医药学方面有诸多应用，如可对活体细胞进行实时观测，获取活细胞内的信息，并对所获得的信息进行定量分析，因此具有便捷和实用的应用特点。

附图说明

图1为本发明双路频分复用荧光共焦显微成像系统的光路示意图；

图2为本发明双路频分复用荧光共焦显微成像系统的工作流程示意图；

图3为本发明双路频分复用荧光共焦显微成像系统对老鼠神经细胞显微探测成像图；

图4为本发明双路频分复用荧光共焦显微成像系统采集的老鼠神经细胞荧光信号模拟信号图；

图5为本发明双路频分复用荧光共焦显微成像系统采集的老鼠神经细胞荧光信号实验测量图；

图6为本发明双路频分复用荧光共焦显微成像系统采集荧光信号的傅立叶变换频谱域图；

图7为本发明双路频分复用荧光共焦显微成像系统频率选择图；

图8为本发明双路频分复用荧光共焦显微成像系统解调的双点荧光信号随时间变化图。

具体实施方式

双路频分复用荧光共焦显微成像系统由双路频分复用荧光共焦显微镜和信号采集处理两大部分构成，通过双路频分复用荧光共焦显微镜采集的信号先经采集信号处理中电压放大电路，后经数据采集卡进行信号放大、模数转换，最后输入电脑处理得到信息。

双路频分复用荧光共焦显微镜制作的方案是首先搭建光路。如附图1所示光路示意图，激光光束首先通过反射镜12(L1)和分光棱镜11(BS1)被分成强度相同的两束，送入两个调制频率不同的斩波器10分别进行调制，然后再利用反射镜9(L2)和分光棱镜8(BS2)将两束光合成一束。随后将合成光束通过二向色镜组3(BS3)。经过二向色镜组3(BS3)，405nm的激发光和绿色的荧光信号都具有单方向的传输特性。405nm的两束激发光照射到位于显微物镜2焦平面上的生物样品1上。生物样品1产生了波长为520nm-540nm的荧光，这两束荧光随后反向通过显微物镜2聚光，通过二向色镜组3(BS3)，再进入分光棱镜5(BS4)，分为强度相同的两束。其中一束通过消色差成像透镜6，聚焦后进入位于透镜6的焦平面位置上的CMOS摄像机7。而另一束则进入光电倍增管4(PMT)。

对于荧光共焦显微镜光路中的斩波器10，其两路的调制信号频率必需满足一定的要求。首先，为满足奈奎斯特抽样定理，数据采集卡的采样频率必需大于等于调制频率的两倍，实验系统中数据采集卡采样频率为250KHz，即应小于等于125KHz。其次，为防止两路光信号的频率出现重叠的现象致使两路信号相互串扰，两个相邻信号的载波频率及它们的差必须要大于或等于最高荧光信号变化频率的两倍。

基于频分复用技术的双路频分复用荧光共焦显微成像方法实现步骤如下：

一：搭建双通道双频调制激光光路：

将激光器、反射镜、分光棱镜、显微物镜等按照如图1所示的光路搭建起来。在此过程中需注意光束应尽量从各器件的中心通过并与平台始终保持水平。首先将由10mw准直半导体激光器发出的波长为405nm的光束耦合入扩束镜。选用何种波长的激光器取决于生物样品中的荧光标签。在本实验中生物样本对蓝紫光的敏感度较高，能激发出波长范围在520nm-540nm的绿色荧光。使从扩束器出射的光束通过分光棱镜11(BS1)，将光束分为强度相同的两束，通过反射镜12(L1)调整其中一束的传播方向，使两束激发光分别入射载波频率不同的两个光斩波器10进行调制。入射光斩波器的两束光应尽量互相平行并垂直入射斩波器10，以保证斩波后的调制效果。斩波器的作用在于将连续强度的光信号调制为方波信号。本实验中，经过调制的激发光能从生物样品1的荧光标签激发出经过同样载波频率调制的荧光，从而使荧光信号具有了一定的频率特征，两个斩波通道分别设定一定的载波频率值。每个频率值均应满足奈奎斯特抽样定理，不得高于采样频率的一半，如上文所述即不得高于125KHz。同时，两个信号的载波频率及它们的差必须要大于或等于最高信号频率的两倍以确保解调的两路信号能够解调开，即载波频率ω₁和ω₂需要满足：ω₁-ω₂≥2ω_H(ω_H是最高荧光信号变化频率)，以确保两路信号不发生相互串扰。经过斩波器调制后的光波信号占空比为1∶1，可以展开成以下傅里叶级数：

实际上，我们所需要的是余弦调制，但在调制光波信号中除了基次谐波，还包含其他高次谐波，当然也包含噪声。

二：搭建双路频分复用荧光共焦显微镜的荧光激发部分光路

通过反射镜9(L2)，将从斩波器10的两个通道出射的两束光的传播方向调整为垂直关系，同时入射到分光棱镜8(BS2)中进行合光。由分光棱镜11(BS1)、8(BS2)和反射镜12(L1)、9(L2)所构成的这一部分光路相当于一个马赫-曾得干涉仪，因此在调整反射镜和分光棱镜使两束光重后，合成光束中应能明显地看到干涉条纹。条纹间距e＝λ/ω，其中λ表示波长，ω表示两束光的会聚角。会聚角越小，条纹间距就越大，那么两束光的重合度就越好。若需调整两束光的会聚角，只需适当调整两面反射镜和分光棱镜BS2即可。完成合光过程后，使叠加光束入射到二向色镜组3(BS3)中，405nm的激发光将耦合入放大倍率为40倍，数值孔径为0.65的无限远油浸显微物镜。耦合过程中需要注意将光束的传播方向与显微物镜2的中心轴方向调整得尽量一致，以确保激发光束垂直入射显微物镜2。将生物样品1摆放于三维调整架之上，调整三维调整架的旋钮以改变生物样品1与显微物镜2间的距离，使样品恰好处于显微物镜焦平面上。光束将在物镜2的作用下在生物样品上聚焦为两个光点，激发出荧光。若需调整这两个光点的间距，只需适当调整两面反射镜和分光棱镜8(BS2)，以对两束光的角度进行微调即可。此时，光源405nm准直半导体激光器和生物样本就形成了一对共焦关系。

假设两点荧光的光照强度作为时间函数分别为f₁(t)和f₂(t)，则通过本专利申请的实施范例中的系统所激发出的两束荧光的光照强度g₁(t)、g₂(t)应该分别为：

$g_1\left(t\right)=f_1\left(t\right)\×\frac{2A}{\mathrm{\π}}(\cos {\mathrm{\ω}}_{1}t-\frac{1}{3}\cos {3\mathrm{\ω}}_{1}t+\frac{1}{5}\cos {5\mathrm{\ω}}_{1}t-\mathrm{\Λ})$

$g_2\left(t\right)=f_2\left(t\right)\×\frac{2A}{\mathrm{\π}}(\cos {\mathrm{\ω}}_{2}t-\frac{1}{3}\cos {3\mathrm{\ω}}_{2}t+\frac{1}{5}\cos {5\mathrm{\ω}}_{2}t-\mathrm{\Λ})$

两路叠加后的荧光信号g(t)为：

$g\left(t\right)=g_1\left(t\right)+g_2\left(t\right)=f_1\left(t\right)\×\frac{2A}{\mathrm{\π}}(\cos {\mathrm{\ω}}_{1}t-\frac{1}{3}\cos 3{\mathrm{\ω}}_{1}t+\frac{1}{5}\cos 5{\mathrm{\ω}}_{1}t-\mathrm{\Λ})$

$+f_2\left(t\right)\×\frac{2A}{\mathrm{\π}}(\cos {\mathrm{\ω}}_{2}t-\frac{1}{3}\cos 3{\mathrm{\ω}}_{2}t+\frac{1}{5}\cos 5{\mathrm{\ω}}_{2}t-\mathrm{\Λ})$

其中我们所关心的仅是其中的基次谐波部分s(t)，忽略系数可得：

s(t)＝f₁(t)cos(ω₁t)+f₂(t)cos(ω₂t)在本专利申请的实施范例中，我们所使用的斩波器的两路调制频率由于所选用的双通道机械斩波器的原因，存在以下关系：ω₁＝5ω₂，如斩波频率为213HZ和1065HZ，因此，两路叠加后的荧光信号g′(t)就应为 $g^{\′}\left(t\right)=f_1\left(t\right)\×\frac{2A}{\mathrm{\π}}(\cos 5{\mathrm{\ω}}_{2}t-\frac{1}{3}\cos 3.5{\mathrm{\ω}}_{2}t+\frac{1}{5}5.5{\mathrm{\ω}}_{2}t-\mathrm{\Λ})$ $+f_2\left(t\right)\×\frac{2A}{\mathrm{\π}}(\cos {\mathrm{\ω}}_{2}t-\frac{1}{3}\cos 3{\mathrm{\ω}}_{2}t+\frac{1}{5}{\mathrm{\ω}}_{2}t-\mathrm{\Λ})$ 可以看到，此时f₁(t)和f₂(t)中均含有cos5ω₂t部分，产生相互串扰的现象。因此在进行解调时就应作相应的处理来排除串扰所带来的影响。

三：搭建双路频分复用荧光共焦显微镜的显微成像

由生物样品表面激发的520nm-540nm绿色荧光在样品1与显微物镜2相互垂直的条件下将与激发光沿同一直线，反向通过显微物镜2，成为平行光束，达到二向色镜3(BS3)。荧光全部从二向色镜3(BS3)透射出去。将这束荧光入射分光棱镜5(BS4)进行第二次分光，得到强度相同的两束。其中一束由消色差透镜6会聚，并将CMOS摄像机7放置于透镜6的焦平面上，即放置于透镜焦距处，使荧光光束信号能被CMOS摄像机7探测到，在电脑显示屏上显示观察生物样品的显微成像。同时使从分光棱镜5(BS4)的另一个表面出射的荧光入射到光电倍增管4(PMT)中。这一系统的空间分辨率与普通的荧光共焦显微系统相同，横向分辨率Δr和轴向分辨率Δz分别表示为：

$\mathrm{\Δr}=0.61\frac{\mathrm{\λ}}{\mathrm{Na}}$ $\mathrm{\Δz}=0.5\frac{\mathrm{\λ}}{{\mathrm{NA}}^2},$

其中，λ为所激发出的荧光的波长，NA表示显微物镜的数值孔径。假定激发出的荧光波长为530nm，显微物镜的数值孔径NA为0.65，则横向分辨率Δr为0.5

μm，轴向分辨率Δz为0.65μm。时间分辨率受数据采集卡的采样频率和所选用的斩波频率的限制。本实验中使用的数据采集卡的采样频率为250KHz，斩波频率为213HZ和1065HZ，其最低频率为213HZ，因此，时间分辨率为106.5HZ，即9.3ms。图2显示了整个系统的实现步骤框图。图3是系统对老鼠神经细胞荧光显微成像拍摄的成像图片。

四：信号采集与处理部分的实现

光电倍增管4(PMT)将根据生物样品中激发得到的两个荧光点处的荧光强度的大小，将荧光点处的图像信号，通过光电转换，以电信号的形式输出。将光电倍增管PMT的输出端接电压放大电路。电压放大电路由LH05-10A05交流/直流转换器和OP07低偏移电压动态放大器组成，其作用在于将4(PMT)采集到的微弱信号进行电压放大。随后，再将电压放大电路的输出接入数据采集卡，最后由USB接口将信号数据送入计算机。通过Matlab软件，编写程序，将调制荧光信号通过滤波器滤去高次谐波和部分噪音，并将两路经过调制的荧光信号相分离。分别将这两路信号按各自的调制频率进行解调后获取原始荧光信号，得到所需的样品信息。解调的具体过程为，先将调制信号与具有相同载波频率的余弦信号相乘，再通过低通滤波器滤去多余的频谱，即可得到原始信号。

五：双路频分复用荧光共焦显微成像系统的实现

将搭建好的双路频分复用荧光共焦显微镜和相应的采集信号处理系统配合、连接，实现对生物样品同一层不同点的成像和信号采集功能。附图3所示是双路频分复用荧光共焦显微成像系统的工作流程示意图。用该系统实现对两路荧光信号分别以某一载波频率调制后，对生物样品进行两点同时成像和采集信号的功能。图4、5是双路调频荧光信号的模拟和实验结果图。实验中采用了213hz和1065HZ调频信号为例。然后对图4、5所采集的双路荧光信号进行傅立叶变换，得到频率域的频谱分布，如图6所示。再通过对所需要频率信号的挑选滤波，得到213HZ和1065HZ频谱信息如图7所示。图8则是对挑选滤波后的信息进行反傅立叶变换并解调得到的双点荧光随时间变化曲线。

Claims (4)

1.一种双路频分复用荧光共焦显微成像系统，其特征在于，包括双路频分复用荧光共焦显微镜和信号采集处理系统，双路频分复用荧光共焦显微镜采集的信号先经采集信号处理系统中电压放大电路，后经数据采集卡进行信号放大、模数转换，最后输入电脑处理得到信息。

2.根据权利要求1所述双路频分复用荧光共焦显微成像系统，其特征在于，所述双路频分复用荧光共焦显微镜包括显微物镜(2)、三个分光棱镜、一个二向色镜组(3)、光电倍增管(4)、成像透镜(6)、CMOS摄像机(7)、两个反射镜、两个斩波器，激光光束首先通过第一反射镜(12)和第一分光棱镜(11)被分成强度相同的两束，送入两个调制频率不同的斩波器(10)分别进行调制，然后再通过第二反射镜(9)和第二分光棱镜(8)将两束光合成一束，将合成光束通过第三分光棱镜(3)，得到两束激发光照射到位于显微物镜(2)焦平面上的生物样品(1)上，生物样品(1)产生两束荧光随后反向通过显微物镜(2)聚光，再次通过二向色镜组(3)，进入第三分光棱镜(5)，分为强度相同的两束，其中一束通过消色差成像透镜(6)，聚焦后进入位于透镜(6)的焦平面位置上的CMOS摄像机(7)，另一束则进入光电倍增管(4)。

3.一种双路频分复用荧光共焦显微成像实现方法，包括双路频分复用荧光共焦显微成像系统，其特征在于，方法具体包括如下步骤：

1)将准直半导体激光器发出的紫色405nm激光光束通过扩束镜扩束形成直径为10mm的平行光束，再通过第一分光棱镜(11)，把光束分为两束等强度光束，其中一束为透射光，另外一束经过第一反射镜(12)反射，调节第一反射镜(12)的位置，使反射光与透射光束平行；

2)在这两束光传播过程中，引入双通道光斩波器(10)，每个通道分别用不同的斩波频率调制斩波，然后继续将其中一束使用第二反射镜(9)将光束转折90°传播，两束光从两个垂直方向同时通过第二分光棱镜(8)合光得到重合的一束激光；

3)从第二分光棱镜(8)中出射的一束光进入二向色镜组(3)中，二向色镜组(3)由二向色镜、荧光滤色片和激发光滤色片组成，能分别使激光器发出的405nm激光和荧光，单方向从二向色镜出射，将被调频的双路激发激光通过40倍的无限远显微物镜(2)聚焦后照射在样品(1)上，产生双点激发荧光信号，两点间距离通过调节反射镜(9)实现，将生物样品(1)固定在三维调节架的平台上，通过调整三维调节架调整样品与显微物镜的距离，使样品(1)恰好处于光焦点所在位置并且保持显微物镜(2)与样品(1)的垂直关系；

4)从样品(1)中发出的双点荧光信号具有同各自的激发激光束相同的频率，再通过二向色镜组(3)将发射回来的激发激光过滤后，出射的荧光信号进入第三分光棱镜(5)，其中一束荧光耦合入消色差成像透镜(6)后进入位于透镜焦点处的彩色CMOS摄像头(7)；另一束荧光进入光电倍增管(4)，然后接入电压放大电路，通过数据采集卡将采得的信号送入计算机中进行采集和处理；

5)信号处理的步骤是首先对采集信号进行傅立叶变换，得到频谱信息，然后进行选频滤波，根据调制信号频率将两束荧光信号的频谱信息挑选出来，然后再进行傅立叶逆变换得到解调的双路荧光随时间变化信息。

4.根据权利要求3所述双路频分复用荧光共焦显微成像实现方法，其特征在于，所述步骤2)中两个斩波通道分别设定一定的载波频率值，每个频率值均应满足奈奎斯特抽样定理，不得高于采样频率的一半，同时，两个信号的载波频率及它们的差必须要大于或等于最高信号频率的两倍，即载波频率ω₁和ω₂需要满足：ω₁-ω₂≥2ω_H，其中ω_H是最高荧光信号变化频率，以确保两路信号不发生相互串扰。

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