CN104568884B - 基于焦点调制的荧光显微系统及方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种基于焦点调制的荧光显微系统及方法，该荧光显微系统包括光源组件、光路调制组件、聚光组件及光电检测组件；光源组件产生入射光束；光路调制组件将所述光束分离为非调制光束和待调制光束；非调制光束通过聚光组件形成的初始显微光路后聚焦照射至样品目标区域；光路调制组件为待调制光束提供一与该初始显微光路共轭的一共轭光路，且光路调制组件能够周期性调制所述共轭光路的共轭位置，调制光束进入所述初始显微光路，调制光束和非调制光束在成像物镜焦点处发生干涉；光电检测组件接收样品目标区域产生的光信号，并将光信号转换为电信号。本发明实施例可以提高荧光显微镜的纵向分辨率、信噪比及成像探测深度。

Description

基于焦点调制的荧光显微系统及方法

技术领域

本发明涉及光学技术领域，特别涉及一种基于焦点调制的荧光显微系统及方法。

背景技术

在活体生物组织的荧光成像技术领域中，荧光显微镜(例如双光子显微镜)已成为一种必不可少的成像工具，与单光子技术相比，它最重要的一个优点是能够对厚生物组织样品进行三维成像。由于对散射生物组织样品具有亚细胞横向分辨率，双光子显微镜成为目前最受欢迎的显微技术之一。但是，双光子显微镜的纵向分辨率受光学成像限制较多，目前仅为2微米左右，无法纵向分辨更细微的生物组织样品。

由于生物组织样品对入射光具有吸收、散射作用，随着探测深度的增加，激发光在焦点处的功率呈现指数衰减，信号减弱，在非焦点处的噪声增强，这使得成像信噪比(即焦点处的信号与非焦点处的噪声的比值)变差。经过某一特定探测深度后，噪声强度最终超过信号强度，此时再无法分辨信号和噪声，这个探测深度即为成像系统的极限成像深度。从这个角度讲，提高成像信噪比将是增加成像深度的关键。

最近，出现了一些焦点调制技术，用于增加显微系统的分辨率和成像深度。其中一种是双光束焦点调制技术(Opt.Express,16(2008)18764)，被用于共聚焦显微系统上，该技术调制两D型光束的相对相位使其在物镜焦点处形成干涉，并通过提取焦点处与调制信号同相的信号作为焦点信号，以增加显微系统的分辨率和成像深度；另一种是脉冲时间聚焦调制技术(Proc.Of SPIE,8588(2013)858824)，该技术通过色散介质使脉冲光发生空间色散，使得仅在物镜的焦平面产生时间较短的脉冲光，而在焦平面的前部与后部得到时间展宽的脉冲，如此以来，入射光子只在焦平面处得到有效聚集，这使焦平面处的荧光强度达到最大。

尽管如此，现有技术对纵向分辨率的提高仍非常有限，到目前为止还没有方法可通过做纵向焦点调制来提高纵向分辨率和增加成像深度。

发明内容

本发明提供一种基于焦点调制的荧光显微系统及方法，该荧光显微系统通过纵向焦点调制提高成像深度和信噪比，并进一步改善空间分辨率。

本发明实施例提供一种基于焦点调制的荧光显微系统，所述荧光显微系统包括光源组件、光路调制组件、聚光组件及光电检测组件；其中，所述光源组件包含激光器，以产生照射至样品目标区域的光束；所述光路调制组件将所述光束分离为非调制光束和待调制光束；所述聚光组件位于所述光路调制组件下游，从所述光路调制组件出射的所述非调制光束通过所述聚光组件形成的初始显微光路后聚焦照射至所述样品目标区域；所述光路调制组件为所述待调制光束提供一与该初始显微光路共轭的一共轭光路，且所述光路调制组件能够周期性调制所述共轭光路的共轭位置，所述待调制光束经所述光路调制组件后形成调制光束，该调制光束进入所述初始显微光路，所述调制光束和所述非调制光束在所述荧光显微系统的成像物镜焦点处发生干涉，通过周期性调制所述共轭光路的共轭位置而纵向调制照射至样品目标区域的光束在所述成像物镜焦点处的焦点；所述光电检测组件接收所述样品目标区域产生的光信号，并将所述光信号转换为电信号。

一个实施例中，所述非调制光束经过所述聚光组件聚焦得到第一焦点，所述调制光束经过所述聚光组件聚焦得到第二焦点，所述第二焦点沿光轴方向在所述第一焦点前后来回扫动；以及所述光电检测组件解调所述电信号以提取当所述第一焦点和所述第二焦点重合时的所述电信号。

一个实施例中，所述光路调制组件包括分光元件、第一反光元件和调制元件组；其中，所述分光元件将所述光束分离为所述非调制光束和所述待调制光束；所述第一反光元件用于使所述非调制光束直接进入所述初始显微光路；所述调制元件组用于对所述待调制光束进行调制形成周期性变化的所述调制光束，并使其进入所述初始显微光路；以及所述分光元件为分光片、光栅或三棱镜，所述第一反光元件为反光镜。

一个实施例中，所述调制元件组包括共轭物镜、第二反光镜和压电陶瓷；其中，所述共轭物镜用于聚焦所述待调制光束；所述第二反光镜固定在沿所述共轭物镜的光轴方向周期扫动的所述压电陶瓷上，以反射调制后的所述待调制光束；以及所述调制光束经所述第二反光镜反射后，依次返回所述共轭物镜和所述分光元件后进入所述初始显微光路。

一个实施例中，所述压电陶瓷在非工作状态时，所述待调制光束经所述共轭物镜聚焦得到的第三焦点落在所述第二反光镜上，所述第三焦点和所述第二焦点共轭，所述调制光束和非调制光束到达所述成像物镜焦点位置的光程相等。

一个实施例中，所述聚光组件包括第三反光元件、第一聚焦透镜、第二聚焦透镜、二向色镜以及所述成像物镜；其中，所述非调制光束和所述调制光束分别经过所述第三反光元件反射后，依次经由所述第一聚焦透镜和所述第二聚焦透镜聚焦以被扩束，然后经过所述二向色镜进入所述成像物镜聚焦；所述第三反光元件为二维扫描振镜或可变形微反射镜阵列；以及所述第一焦点位于所述成像物镜的焦平面上。

一个实施例中，所述光电检测组件包括第三聚焦透镜、光电倍增管及锁相放大器；其中，所述样品目标区域产生的光信号经过所述成像物镜收集后，经由所述二向色镜入射至所述第三聚焦透镜，所述光电倍增管接收通过所述第三聚焦透镜聚焦的所述光信号并将其转换为电信号，所述锁相放大器解调所述电信号以提取所述第一焦点和所述第二焦点重合时的所述电信号。

本发明实施例还提供一种基于焦点调制的荧光显微方法，适用于荧光显微系统，所述荧光显微方法包括步骤：通过分光镜将照射至样品目标区域的入射光束分为非调制光束和待调制光束，所述非调制光束依次经过第一反光元件及所述分光镜反射后直接入射至初始显微光路；所述待调制光束入射至与所述初始显微光路共轭的共轭光路，形成周期性变化的调制光束，之后进入所述初始显微光路，入射到所述初始显微光路的成像物镜，且所述调制光束在所述成像物镜的后向孔径上的入射角周期性地变化，所述调制光束与所述非调制光束在所述成像物镜焦点处发生干涉，所述调制光束的焦点和非调制光束的焦点在纵向方向上周期性的重合与分离，使得所述样品目标区域产生荧光强度周期性变化的光信号；接收所述样品目标区域产生的光信号，并将所述光信号转换为电信号。

一个实施例中，在所述荧光显微系统中，激光器产生所述入射光束；所述非调制光束和所述调制光束经所述成像物镜聚焦分别得到第一焦点和第二焦点，且所述第二焦点沿光轴方向在所述第一焦点前后来回扫动；通过光电倍增管接收所述样品目标区域产生的光信号，并将所述光信号转换为所述电信号，并通过锁相放大器解调所述电信号以提取当所述第一焦点和所述第二焦点重合时的所述电信号。

一个实施例中，使所述第二焦点沿光轴方向在所述第一焦点前后来回扫动的步骤包括：使所述待调制光束由共轭物镜聚焦得到的第三焦点落在第二反光镜上；及使所述第二反光镜随压电陶瓷沿所述第三焦点的光轴方向作周期扫动。

一个实施例中，所述压电陶瓷在非工作状态时，所述调制光束和所述非调制光束在所述荧光显微系统中经过的光程相等，且所述第三焦点与所述第二焦点共轭。

本发明实施例对荧光显微系统进行了纵向焦点调制，并通过提取样品目标区域被入射光束(调制光束和非调制光束)照射时所产生的光信号，以提高荧光显微系统的分辨率和信噪比，从而可以增加成像系统的探测深度。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。在附图中：

图1为本发明实施例的基于焦点调制的荧光显微系统的结构示意图；

图2为本发明实施例的基于焦点调制的荧光显微系统的光路示意图；

图3为光束经图2的荧光显微系统后得到调制光束的焦点在非调制光束的焦点附近上下扫动的光路示意图。

符号说明：

1分光元件

2共轭物镜

3第二反光镜

4压电陶瓷

5第一反光元件

6扫描镜

7第一聚焦透镜

8第二聚焦透镜

9二向色镜

10成像物镜

11样品目标区域

12第三聚焦透镜

13光电倍增管

14焦平面

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合图1至图3对本发明实施例做进一步详细说明。在此，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但并不作为对本发明的限定。

本发明实施例的基于焦点调制的荧光显微系统可以用于多种不同成像仪器或成像系统，例如单光子、双光子或多光子显微镜。它通过纵向焦点调制提高荧光显微系统的信噪比、成像深度及分辨率。

图1为本发明实施例的基于焦点调制的荧光显微系统的结构示意图。如图1所示，荧光显微系统包括光源组件101、光路调制组件102、聚光组件103及光电检测组件104。

本发明实施例中，光源组件101包含激光器，以产生照射至样品目标区域的入射光束。光路调制组件102将该光束分离为非调制光束和待调制光束。聚光组件103位于光路调制组件102下游，从光路调制组件102出射的该非调制光束通过聚光组件103形成的初始显微光路后聚焦照射至样品目标区域，而光路调制组件102为待调制光束提供一条与该初始显微光路共轭的共轭光路，且光路调制组件102能够周期性调制该共轭光路的共轭位置，以使待调制光束经光路调制组件102后形成调制光束，该调制光束进入该初始显微光路。

上述调制光束和非调制光束在荧光显微系统的成像物镜焦点处产生干涉，并通过周期性调制上述共轭光路的共轭位置而纵向(成像物镜的光轴方向)调制照射至样品目标区域的光束在上述成像物镜焦点处的焦点。最后，该光电检测组件接收上述样品目标区域产生的光信号(激发光信号，例如荧光信号)，并将该光信号转换为电信号。

本发明实施例的入射光束是准直性较佳地的平行激光光束，还可以是经过扩束及/或分光等处理的光束。激光光束具有较高能量，能够在样品目标区域激发荧光或其它激发光。

本发明实施例中，光路调制组件102可以包括分光元件、第一反光元件和调制元件组。分光元件可以是各种具有分光作用的分光镜，例如分光片、光栅、三棱镜等。第一反光元件可以是反光镜。第一反光元件使上述非调制光束直接进入聚光组件103形成的初始显微光路；而该调制元件组对待调制光束进行调制形成周期性变化(例如光程周期性变化)的调制光束，并使其进入该初始显微光路。

一个实施例中，光路调制组件102中的调制元件组可以包括共轭物镜、第二反光镜和压电陶瓷。其中，该共轭物镜用于聚焦待调制光束；该第二反光镜固定在沿该共轭物镜的光轴方向周期扫动的压电陶瓷上，以反射调制后的待调制光束(调制光束)；该调制光束经该第二反光镜反射后，依次返回该共轭物镜和该分光元件后进入聚光组件103形成的初始显微光路。

当上述调制元件组中的压电陶瓷在非工作状态时，待调制光束经该共轭物镜聚焦得到的第三焦点落在上述第二反光镜上，该第三焦点和上述第二焦点(调制光束经成像物镜聚焦的焦点)相互共轭，该调制光束和该非调制光束到达所述成像物镜焦点位置的光程相等(此处光程可指调制光束和非调制光束从分光元件分离后在荧光显微系统中经历的全部光程，“调制光束”的概念并不排除“待调制光束”所经历的光程)。

本发明实施例中，聚光组件103位于光路调制组件102的下游，并通过其形成的初始显微光路将上述调制光束和非调制光束会聚至样品目标区域。该非调制光束经过聚光组件103聚焦得到第一焦点，该调制光束经过聚光组件103聚焦得到第二焦点，该第二焦点沿光轴(聚光组件的成像物镜的光轴)方向在该第一焦点前后(两侧)来回扫动。

一个实施例中，聚光组件103可以包括第三反光元件、第一聚焦透镜、第二聚焦透镜、二向色镜以及前述成像物镜。该第三反光元件可以是二维扫描振镜或可变形微反射镜阵列。该调制光束和该非调制光束经过该第三反光元件反射后，依次经由第一聚焦透镜和第二聚焦透镜聚焦以被扩束(例如从较窄平行光束转换成较宽平行光束)，然后经过二向色镜进入该成像物镜聚焦。其中，该非调制光束被该成像物镜聚焦后的第一焦点位于该成像物镜的焦平面上。

本发明实施例中，光电检测组件104接收该样品目标区域受聚焦后的入射光束(调制光束和非调制光束)照射后产生的光信号(例如荧光信号)，并将该光信号转换为电信号。当调制光束的第二焦点和非调制光束的第一焦点重合时，调制光束和非调制光束相位相同，通过光电检测组件104的作用提取此时的电信号，最终由图像显示装置显示样品目标区域扫描点的图像。

一个实施例中，光电检测组件104可以包括第三聚焦透镜、光电倍增管及锁相放大器；其中样品目标区域产生的光信号被前述成像物镜收集后，由该二向色镜反射至该第三聚焦透镜，该光电倍增管接收经过该第三聚焦透镜会聚的光信号并将其转换为电信号，锁相放大器解调该电信号以提取出上述第一焦点和上述第二焦点重合时的所述电信号。

图2为本发明实施例的基于焦点调制的荧光显微系统的光路示意图。如图2所示，光源组件(未图示)出射的光束(例如平行激光光束)入射到光路调制组件102，入射光束分离为两束光(非调制光束和待调制光束)。

之后，在光路调制组件102中，分离出的非调制光束继续向前传输，由第一反光元件5(例如反光镜)反射后，再次入射至分光元件1，并被反射(或透射)进入聚光组件103(初始显微光路)；同时，调制光束入射到共轭物镜2，并聚焦为一个焦点(第三焦点)，该第三焦点落在第二反光镜3上，经过第二反光镜3的反射，经共轭物镜2原路返回至分光元件1，并继续传输进入聚光组件103(初始显微光路)。第二反光镜3固定在压电陶瓷4上，在压电陶瓷4工作状态下，第二反光镜3随压电陶瓷4在轴向(第三焦点处的光轴方向)来回振动/扫动。当压电陶瓷4处于非工作状态时，该第三焦点可以位于第二反光镜3的反射面上。当系统不工作时，调节第一反光元件5的位置，使调制光束和非调制光束到达聚光组件103的成像物镜10焦点处的光程相等(即调制光束和非调制光束在整个荧光显微系统中的光程相等)。

本发明实施例，在光路调制组件102中，待调制光束被分光元件反射而被分离出来，而非调制光束透射该分光元件而被分离出来。在另一实施例中，待调制光束可以透射该分光元件，而非调制光束被该分光元件反射，相应的，调制光束和非调制光束可以分别经过分光元件1的反射和透射进入聚光组件103。在其他实施例中，调制光束和非调制光束可以不经过返回分光元件1而进入聚光组件103，而是经过其他光学组件搭建的光路进入聚光组件103。

接着，调制光束和非调制光束一起进入聚光组件103(初始显微光路)。调制光束和非调制光束入射至扫描镜6(例如二维扫描振镜或可变形微反射镜阵列)，并被反射进入一般光学显微系统。然后，经由第一聚焦透镜7(例如扫描透镜)和第二聚焦透镜8(例如镜筒透镜)扩束。之后，穿过二向色镜9由成像物镜10最终聚焦至样品目标区域11上。

本发明实施例中，从分光元件外部开始经过扫描镜6、第一聚焦透镜7及第二聚焦透镜8到成像物镜10的焦平面的光路为前述初始显微光路的一个具体实施例；调制元件组使荧光显微系统为待调制光束搭建了一条与该初始显微光路共轭的共轭光路，以对待调制光束进行调制形成调制光束，其中，从待调制光束被分光元件1分离出来后依次经过共轭物镜2、第二反光镜3、共轭物镜2返回至分光元件1的光路为该初始显微光路的共轭光路的一个具体实施例。在压电陶瓷工作时，当第二反光镜3在共轭物镜2焦平面后方(图2中右边)时，第三焦点为与第二焦点共轭的共轭位置，当第二反光镜3在共轭物镜2焦平面前方(图2中左边)时，会聚光束在第二反光镜3后方的虚焦点为与第二焦点共轭的共轭位置。

本发明实施例通过周期性调制共轭光路的共轭位置，来调制光束和非调制光束在成像物镜的焦平面上干涉后光信号的强度，以达到对成像物镜焦点进行纵向调制的效果。进而通过提取干涉强度最大的光信号，便可得到成像深度大、纵向分辨率高、信噪比强的观测图像。

图3为光束经图2的荧光显微系统后得到调制光束的焦点(第二焦点)在非调制光束的焦点(第一焦点)附近上下扫动的光路示意图。如图3所示，调制光经过第一聚焦透镜7(例如扫描透镜)和第二聚焦透镜8(镜筒透镜)扩束后是平行光束②(光束相对于成像物镜的后向孔径的入射角为90度)，并被成像物镜10聚焦为一点(第二焦点)并落在成像物镜10的焦平面14上。当压电陶瓷4不工作时，与非调制光束相同，调制光束最终会聚至成像物镜10的焦平面14上；当压电陶瓷4沿轴向(第三焦点光轴方向，即图2中水平方向)振动/扫动时，调制光束经过第一聚焦透镜7和第二聚焦透镜8扩束后是扩散光束①或会聚光束③(光束相对于成像物镜的后向孔径的入射角不等于90度)，经成像物镜10聚焦后落在焦平面14的上侧或下侧。因此，第二焦点在包含第一焦点所在位置的范围内扫动。

再次参见图2，样品目标区域11经聚焦的调制光束和非调制光束照射后产生激发光(例如荧光)，该激发光由成像物镜10收集，经由二向色镜9反射，及第三聚焦透镜12(例如收集透镜)聚焦后由光电倍增管(PMT)13所接收，光信号转换为电信号。

当荧光显微系统扫描某一点时，利用压电陶瓷4对第二反光镜3进行周期性调制(如图2中左右振动)，压电陶瓷4将带动第二反光镜3在轴向(共轭物镜2光轴方向)上来回扫动，使得调制后的待调制光束入射到成像物镜10的入射角(即相对于成像物镜入射孔径的入射角)周期性变化，时而汇聚，时而发散(如图2的扩散光束①和会聚光束③所示)。而此时非调制光束的第一焦点将保持不动，这样可以使调制光束的第二焦点和非调制光束的第一焦点在纵向/光轴向方向上周期性重合与分离，从而导致样品目标区域11的样品产生周期性强度的光信号(例如荧光信号)。而在调制光束的第二焦点处，当非调制光束的第一焦点和调制光束的第二焦点重合时，非调制光束将产生与调制光束同相的信号。然后，通过锁相放大器解调该同相信号，提取该同相信号(例如信号幅值)，以获得该扫描点的信号强度，进行成像，从而达到抑制背景噪声的目的。

然后，通过扫描镜6(例如二维扫描振镜)进行栅格扫描(逐点扫描)即可形成样品目标区域11样品的二维图像(横向)。这样在保证图像更高分辨率的同时，也降低了图像的背景噪声，提高成像探测深度。进一步，通过纵向/轴向移动成像物镜10以对不同深度的样品进行二维扫描成像，即可形成目标样品的三维图像。

本发明实施例的基于焦点调制的荧光显微系统利用纵向空间调制技术提高显微系统的性能，能够对厚样品(例如生物样品)组织进行三维成像。在对深层样品组织成像时，可以有效减少入射光束因在样品组织传播过程中非焦点荧光激发的影响，使成像信号得到有效增强，抑制背景噪声，增加信噪比，从而扩大成像深度，并提高了荧光显微镜的纵向分辨率。

利用上述各实施例荧光显微系统进行焦点调制的方法包括步骤：

(201)通过分光镜将照射至样品目标区域的入射光束分为非调制光束和待调制光束，所述非调制光束依次经过第一反光元件及所述分光镜反射后直接入射(例如光程/光路固定)至初始显微光路；

(202)所述待调制光束入射至与所述初始显微光路共轭的共轭光路，形成周期性变化的调制光束，之后进入所述初始显微光路，入射到所述初始显微光路的成像物镜，且所述调制光束在所述成像物镜的后向孔径(图2中成像物镜的上端入射孔径)上的入射角周期性地变化，所述调制光束与所述非调制光束在所述荧光显微系统的成像物镜焦点处产生干涉，所述调制光束的焦点和非调制光束的焦点在纵向方向上周期性的重合与分离，使得样品产生荧光强度周期性变化的光信号；

(203)接收所述样品目标区域产生的光信号，并将所述光信号转换为电信号。

本发明实施例，在上述步骤201中，由激光器产生该入射光束；在步骤202中，该非调制光束和该调制光束经过该初始显微光路后聚焦分别得到第一焦点和第二焦点，且该第二焦点沿该成像物镜光轴方向在所述第一焦点前后来回扫动；在步骤202中，较佳地，使待调制光束和非调制光束垂直，这使待调制光束经过共轭物镜2和第二反光镜3后形成原路返回分光元件1的调制光束，而使非调制光束经过第一反光元件5反射后原路返回至分光元件1，因而不需搭建额外光路即可使调制光束和非调制光束进入聚光组件103。在步骤203中，通过光电倍增管接收样品目标区域产生的光信号，并将该光信号转换为电信号，并通过锁相放大器解调该电信号以提取当所述第一焦点和所述第二焦点重合时的所述电信号。

进一步，在步骤202中，该第二焦点沿成像物镜光轴方向在该第一焦点前后来回扫动的步骤包括：

(301)使该待调制光束由共轭物镜聚焦得到的第三焦点落在第二反光镜上；及

(302)使所述第二反光镜随压电陶瓷沿所述第三焦点的光轴方向作周期扫动。

在步骤302中，当压电陶瓷处于非工作状态时，该调制光束(非调制光束)和该非调制光束在荧光显微系统中经过的光程相等，且该第三焦点与该第二焦点共轭。

本发明实施例的基于焦点调制的荧光显微系统及方法，对厚样品组织进行三维成像，能使荧光显微系统具有较大的信噪比，能够扩大样品组织成像深度，可以大大提高了荧光显微镜的纵向分辨率。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于焦点调制的荧光显微系统，其特征在于，所述荧光显微系统包括光源组件、光路调制组件、聚光组件及光电检测组件；其中，

所述光源组件包含激光器，以产生照射至样品目标区域的光束；

所述光路调制组件将所述光束分离为非调制光束和待调制光束；

所述聚光组件位于所述光路调制组件下游，从所述光路调制组件出射的所述非调制光束通过所述聚光组件形成的初始显微光路后聚焦照射至所述样品目标区域；所述光路调制组件为所述待调制光束提供一与该初始显微光路共轭的一共轭光路，且所述光路调制组件能够周期性调制所述共轭光路的共轭位置，所述待调制光束经所述光路调制组件后形成调制光束，该调制光束进入所述初始显微光路，所述调制光束和所述非调制光束在所述荧光显微系统的成像物镜焦点处发生干涉，通过周期性调制所述共轭光路的共轭位置而纵向调制照射至样品目标区域的光束在所述成像物镜焦点处的焦点；

所述光电检测组件接收所述样品目标区域产生的光信号，并将所述光信号转换为电信号；

所述非调制光束经过所述聚光组件聚焦得到第一焦点，所述调制光束经过所述聚光组件聚焦得到第二焦点，所述第二焦点沿光轴方向在所述第一焦点前后来回扫动；以及所述光电检测组件解调所述电信号以提取当所述第一焦点和所述第二焦点重合时的所述电信号。

2.如权利要求1所述的基于焦点调制的荧光显微系统，其特征在于，所述光路调制组件包括分光元件、第一反光元件和调制元件组；

其中，所述分光元件将所述光束分离为所述非调制光束和所述待调制光束；所述第一反光元件用于使所述非调制光束直接进入所述初始显微光路；所述调制元件组用于对所述待调制光束进行调制形成周期性变化的所述调制光束，并使其进入所述初始显微光路；以及所述分光元件为分光片、光栅或三棱镜，所述第一反光元件为反光镜。

3.如权利要求2所述的基于焦点调制的荧光显微系统，其特征在于，所述调制元件组包括共轭物镜、第二反光镜和压电陶瓷；

其中，所述共轭物镜用于聚焦所述待调制光束；所述第二反光镜固定在沿所述共轭物镜的光轴方向周期扫动的所述压电陶瓷上，以反射调制后的所述待调制光束；以及所述调制光束经所述第二反光镜反射后，依次返回所述共轭物镜和所述分光元件后进入所述初始显微光路。

4.如权利要求3所述的基于焦点调制的荧光显微系统，其特征在于，所述压电陶瓷在非工作状态时，所述待调制光束经所述共轭物镜聚焦得到的第三焦点落在所述第二反光镜上，所述第三焦点和所述第二焦点共轭，所述调制光束和非调制光束到达所述成像物镜焦点位置的光程相等。

5.如权利要求1所述的基于焦点调制的荧光显微系统，其特征在于，所述聚光组件包括第三反光元件、第一聚焦透镜、第二聚焦透镜、二向色镜以及所述成像物镜；

其中，所述非调制光束和所述调制光束分别经过所述第三反光元件反射后，依次经由所述第一聚焦透镜和所述第二聚焦透镜聚焦以被扩束，然后经过所述二向色镜进入所述成像物镜聚焦；所述第三反光元件为二维扫描振镜或可变形微反射镜阵列；以及所述第一焦点位于所述成像物镜的焦平面上。

6.如权利要求5所述的基于焦点调制的荧光显微系统，其特征在于，所述光电检测组件包括第三聚焦透镜、光电倍增管及锁相放大器；

其中，所述样品目标区域产生的光信号经过所述成像物镜收集后，经由所述二向色镜入射至所述第三聚焦透镜，所述光电倍增管接收通过所述第三聚焦透镜聚焦的所述光信号并将其转换为电信号，所述锁相放大器解调所述电信号以提取所述第一焦点和所述第二焦点重合时的所述电信号。

7.一种基于焦点调制的荧光显微方法，适用于荧光显微系统，其特征在于，所述荧光显微方法包括步骤：

通过分光镜将照射至样品目标区域的入射光束分为非调制光束和待调制光束，所述非调制光束依次经过第一反光元件及所述分光镜反射后直接入射至初始显微光路；

所述待调制光束入射至与所述初始显微光路共轭的共轭光路，形成周期性变化的调制光束，之后进入所述初始显微光路，入射到所述初始显微光路的成像物镜，且所述调制光束在所述成像物镜的后向孔径上的入射角周期性地变化，所述调制光束与所述非调制光束在所述成像物镜焦点处发生干涉，所述调制光束的焦点和非调制光束的焦点在纵向方向上周期性的重合与分离，使得所述样品目标区域产生荧光强度周期性变化的光信号；

接收所述样品目标区域产生的光信号，并将所述光信号转换为电信号。

8.如权利要求7所述的基于焦点调制的荧光显微方法，其特征在于，在所述荧光显微系统中，

激光器产生所述入射光束；

所述非调制光束和所述调制光束经所述成像物镜聚焦分别得到第一焦点和第二焦点，且所述第二焦点沿光轴方向在所述第一焦点前后来回扫动；

通过光电倍增管接收所述样品目标区域产生的光信号，并将所述光信号转换为所述电信号，并通过锁相放大器解调所述电信号以提取当所述第一焦点和所述第二焦点重合时的所述电信号。

9.如权利要求8所述的基于焦点调制的荧光显微方法，其特征在于，使所述第二焦点沿光轴方向在所述第一焦点前后来回扫动的步骤包括：

使所述待调制光束由共轭物镜聚焦得到的第三焦点落在第二反光镜上；及

使所述第二反光镜随压电陶瓷沿所述第三焦点的光轴方向作周期扫动。

10.如权利要求9所述的基于焦点调制的荧光显微方法，其特征在于，所述压电陶瓷在非工作状态时，所述调制光束和所述非调制光束在所述荧光显微系统中经过的光程相等，且所述第三焦点与所述第二焦点共轭。